CN109868263A - 重组单纯疱疹病毒及其制备方法和应用、重组载体的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组单纯疱疹病毒及其制备方法和应用、重组载体的构建方法及其应用。该重组单纯疱疹病毒，所述重组单纯疱疹病毒缺失ICP34.5基因和ICP47基因，且缺失的所述ICP34.5基因的位点与缺失的所述ICP47基因的位点上均插入有可溶性PD‑1片段。上述重组单纯疱疹病毒的安全性较好。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种重组单纯疱疹病毒、重组载体及其制备方法和应用、重组载体的构建方法及其应用。
背景技术
程序性死亡受体1(PD-1)主要表达于活化的T细胞，它与相应受体PD-L1或PD-L2结合后传递负调控信号，导致T细胞的免疫应答关闭。多种肿瘤细胞均高表达PD-L1，这些肿瘤细胞通过其表达的PD-L1与T细胞表面的PD-1结合，诱导肿瘤特异性T细胞凋亡和免疫无能，最终导致肿瘤细胞逃脱T细胞的免疫监视和杀伤。
而溶瘤病毒是一类具有复制能力的肿瘤杀伤型病毒，能够在肿瘤细胞中大量繁殖并杀死肿瘤细胞。其中，HSV-1，Ⅰ型单纯疱疹病毒，是一种长约154kp的双链DNA病毒，可在受染宿主细胞核中复制。HSV-1具有天然的溶瘤特性，被广泛用于细胞生物学、免疫学领域以及肿瘤治疗的创新疫苗和载体的开发。然而，传统的HSV-1的毒性较强，不仅对肿瘤细胞具有杀伤作用，也能够杀伤正常细胞，安全性较差。
发明内容
基于此，有必提供一种安全性较好的重组单纯疱疹病毒。
此外，还提供一种重组单纯疱疹病毒的制备方法和应用、重组载体的构建方法及其应用。
一种重组单纯疱疹病毒，所述重组单纯疱疹病毒缺失ICP34.5基因和ICP47基因，且在缺失的所述ICP34.5基因的位点与缺失的所述ICP47基因的位点上均插入有可溶性PD-1片段。
研究表明，单纯疱疹病毒中的ICP34.5基因可以对抗PKR(双链RNA依赖的蛋白质激酶)引起的应激信号通路因子eIF-2α的失活，使病毒得以正常繁殖，因此，缺失ICP34.5基因的重组单纯疱疹病毒进入正常细胞后，能够引起eIF-2α的失活，使得重组单纯疱疹病毒不能繁殖而不会对正常细胞产生毒性，安全性较高；由于肿瘤细胞内的PKR处于失活状态，缺失ICP34.5基因的重组单纯疱疹病毒能够在肿瘤细胞中正常繁殖，而具有较高的肿瘤靶向性。单纯疱疹病毒中的ICP47基因可以阻碍MHCⅠ类分子介导的抗原递呈，重组单纯疱疹病毒中缺失ICP47基因，有利于增强免疫反应，提高重组单纯疱疹病毒对肿瘤细胞的攻击。同时，上述重组单纯疱疹病毒通过在缺失的ICP34.5基因的位点与缺失的ICP47基因的位点上均插入可溶性PD-1片段，以能够表达可溶性PD-1，以能够竞争性地与肿瘤细胞表达的PD-L1结合，恢复肿瘤特异性T细胞的杀伤功能。经试验验证，上述重组单纯疱疹病毒能够杀伤肿瘤细胞，对正常细胞没有杀伤作用，且能够高效表达能够与PD-L1结合的可溶性PD-1，以提高肿瘤特异性T细胞的杀伤功能。
其中一个实施例中，所述可溶性PD-1片段的序列如SEQ ID No.1所示。
其中一个实施例中，所述重组单纯疱疹病毒的保藏号为CCTCC NO：V201863。
一种重组载体的构建方法，包括如下步骤：
以p galk载体为模板，采用第一同源臂引物对进行PCR扩增，得到ΔICP34.5-galk片段；将所述ΔICP34.5-galk片段转入感受态的第一重组菌中，进行galk正筛选，得到第二重组菌，所述ΔICP34.5-galk片段含有依次连接的ICP34.5基因上游侧翼区序列、galk表达盒及ICP34.5基因下游侧翼区序列，所述第一重组菌中含有携带HSV-1病毒基因组的载体，所述第二重组菌缺失ICP34.5基因，且缺失的所述ICP34.5基因的位点上插入有所述ΔICP34.5-galk片段；
以含有可溶性PD-1表达盒的载体为模板，采用第二同源臂引物对进行PCR扩增，得到ΔICP34.5-hsPD-1片段，将所述ΔICP34.5-hsPD-1片段转入感受态的所述第二重组菌中，进行galk负筛选，得到第三重组菌，所述ΔICP34.5-hsPD-1片段含有依次连接的所述ICP34.5基因上游侧翼区序列、所述可溶性PD-1表达盒及所述ICP34.5基因下游侧翼区序列，所述第三重组菌缺失所述ΔICP34.5-galk片段，且缺失的所述ΔICP34.5-galk片段的位点上插入有所述ΔICP34.5-hsPD-1片段；
以所述p galk载体为模板，采用第三同源臂引物对进行PCR扩增，得到ΔICP47-galk片段，将所述ΔICP47-galk片段转入感受态的所述第三重组菌中，进行galk正筛选，得到第四重组菌，所述ΔICP47-galk片段含有依次连接的ICP47上游侧翼区序列、所述galk表达盒及ICP47基因下游侧翼区序列，所述第四重组菌缺失ICP47基因，且缺失的所述ICP47基因的位点上插入有所述ΔICP47-galk片段；及
以所述含有可溶性PD-1表达盒的载体为模板，采用第四同源臂引物对进行PCR扩增，得到ΔICP47-hsPD-1片段，将所述ΔICP47-hsPD-1片段转入感受态的所述第四重组菌中，进行galk负筛选，得到重组载体，所述ΔICP47-hsPD-1片段含有依次连接的所述ICP47基因上游侧翼区序列、所述可溶性PD-1表达盒及所述ICP47基因下游侧翼区序列，所述重组载体缺失所述ΔICP47-galk片段，且缺失的所述ΔICP47-galk片段的位点上插入有所述ΔICP47-hsPD-1片段。
其中一个实施例中，所述可溶性PD-1表达盒含有可溶性PD-1片段，所述可溶性PD-1片段的序列如SEQ ID No.1所示；
及/或，所述第一重组菌的保藏号为CCTCC NO：M2018944。
其中一个实施例中，所述第一同源臂引物对包括第一同源臂正向引物与第一同源臂反向引物，所述第一同源臂正向引物从5’端到3’端包括所述ICP34.5基因上游侧翼区序列和第一正向引物，所述第一同源臂反向引物从5’端到3’端包括所述ICP34.5基因下游侧翼区序列和第一反向引物，所述第一正向引物与所述第一反向引物用于扩增所述galk表达盒；
及/或，所述第二同源臂引物对包括第二同源臂正向引物与第二同源臂反向引物，所述第二同源臂正向引物从5’端到3’端包括所述ICP34.5基因上游侧翼区序列和第二正向引物，所述第二同源臂反向引物从5’端到3’端包括所述ICP34.5基因下游侧翼区序列和第二反向引物，所述第二正向引物与所述第二反向引物用于扩增所述可溶性PD-1表达盒；
及/或，所述第三同源臂引物对包括第三同源臂正向引物与第三同源臂反向引物，所述第三同源臂正向引物从5’端到3’端包括所述ICP47基因上游侧翼区序列和第三正向引物，所述第三同源臂反向引物从5’端到3’端包括所述ICP47基因下游侧翼区序列和第三反向引物，所述第三正向引物与所述第三反向引物用于扩增所述galk表达盒；
及/或，所述第四同源臂引物对包括第四同源臂正向引物与第四同源臂反向引物，所述第四同源臂正向引物从5’端到3’端包括所述ICP47基因上游侧翼区序列和第四正向引物，所述第四同源臂反向引物从5’端到3’端包括所述ICP47基因下游侧翼区序列和第四反向引物，所述第四正向引物与所述第四反向引物用于扩增所述可溶性PD-1表达盒。
其中一个实施例中，所述ICP34.5基因上游侧翼区序列如SEQ ID No.2所示，所述ICP34.5基因下游侧翼区序列如SEQ ID No.3所示；
及/或，所述ICP47基因上游侧翼区序列如SEQ ID No.4所示，所述ICP47基因下游侧翼区序列如SEQ ID No.5所示。
其中一个实施例中，所述第一正向引物的序列如SEQ ID No.6所示，所述第一反向引物的序列如SEQ ID No.7所示；
及/或，所述第二正向引物的序列如SEQ ID No.8所示，所述第二反向引物的序列如SEQ ID No.9所示。
一种重组单纯疱疹病毒的制备方法，包括如下步骤：
根据上述重组载体的构建方法构建重组载体；
用所述重组载体转染VERO细胞，培养转染后的所述VERO细胞，裂解并收集上清，得到所述重组单纯疱疹病毒。
上述重组单纯疱疹病毒、上述重组载体的制备方法制备的重组载体或者上述重组单纯疱疹病毒的制备方法制备的重组单纯疱疹病毒在制备增强抗肿瘤免疫反应的药物或者制备肿瘤的药物中的应用。
附图说明
图1为一实施方式的重组单纯疱疹病毒的制备原理图；
图2为pGA1-hsPD-1穿梭质粒的结构示意图；
图3为pGA1-hsPD-1穿梭质粒的电泳鉴定图；
图4为pGA1-hsPD-1穿梭质粒的测序比对图；
图5为pGA1-hsPD-1穿梭质粒转染后的细胞培养上清与对照细胞培养上清中hsPD-1的表达量对比图；
图6为p galk质粒的结构示意图；
图7为ΔICP34.5-galk片段的电泳鉴定图；
图8为HSV-1-ΔICP34.5-galk重组质粒的电泳鉴定图；
图9为ΔICP34.5-hsPD-1片段的电泳鉴定图；
图10为HSV-1-ΔICP34.5-hsPD-1重组质粒的电泳鉴定图；
图11为实施例2中第一测序正向引物测定的测序比对图；
图12为实施例2中第一测序反向引物测定的测序比对图；
图13为ΔICP47-galk片段的电泳鉴定图；
图14为HSV-1-ΔICP47-galk重组质粒的电泳鉴定图；
图15为ΔICP47-hsPD-1片段的电泳鉴定图；
图16为rHSV-1-hsPD-1重组质粒的电泳鉴定图；
图17为实施例3中第一测序反向引物对rHSV-1-hsPD-1重组质粒的测序比对图；
图18为实施例3中第三PCR正向引物对rHSV-1-hsPD-1重组质粒的测序比对图；
图19为实施例3中第三PCR反向引物对rHSV-1-hsPD-1重组质粒的测序比对图；
图20为实施例5中第二PCR正向引物和第二PCR反向引物对重组单纯疱疹病毒的病毒基因组的电泳鉴定图；
图21为实施例5中第三PCR正向引物和第三PCR反向引物对重组单纯疱疹病毒的病毒基因组的电泳鉴定图；
图22为重组单纯疱疹病毒和野生型HSV-1病毒对15P-1细胞、FHs 74Int细胞的影响对比图；
图23为不同感染复数的重组单纯疱疹病毒对人咽癌细胞系FaDu、人直肠癌细胞系HT-29和人神经胶质瘤细胞系U-87MG的影响对比图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本发明一实施方式提供了一种重组单纯疱疹病毒，其缺失ICP34.5基因和ICP47基因，且缺失的ICP34.5基因的位点与缺失的ICP47基因的位点上均插入有可溶性PD-1片段。
研究表明，单纯疱疹病毒中的ICP34.5基因可以对抗PKR(双链RNA依赖的蛋白质激酶)引起的应激信号通路因子eIF-2α的失活，使病毒得以正常繁殖，因此，缺失ICP34.5基因的重组单纯疱疹病毒进入正常细胞后，能够引起eIF-2α的失活，使得重组单纯疱疹病毒不能繁殖而不会对正常细胞产生毒性，安全性较高；由于肿瘤细胞内的PKR处于失活状态，缺失ICP34.5基因的重组单纯疱疹病毒能够在肿瘤细胞中正常繁殖，而具有较高的肿瘤靶向性。再者，单纯疱疹病毒中的ICP47基因可以阻碍MHCⅠ类分子介导的抗原递呈，重组单纯疱疹病毒中缺失ICP47基因，有利于增强免疫反应，提高重组单纯疱疹病毒对肿瘤细胞的攻击。此外，删除ICP47基因也能够增加下游US11基因表达，从而提高重组单纯疱疹病毒的复制能力。最后，上述重组单纯疱疹病毒通过在缺失的ICP34.5基因的位点与缺失的ICP47基因的位点上均插入可溶性PD-1片段，以表达可溶性PD-1(sPD-1)，sPD-1是PD1的膜外部分，能够与PD-L1结合而发挥抗体样作用，能够竞争性地与肿瘤细胞表达的PD-L1结合，以抑制PD-1与PD-L1的结合，恢复肿瘤特异性T细胞的杀伤功能，以增强抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤生长。
在其中一个实施例中，重组单纯疱疹病毒缺失两个ICP34.5基因和一个ICP47基因，且缺失的两个ICP34.5基因的位点与缺失的一个ICP47基因的位点上均插入有可溶性PD-1片段。
在其中一个实施例中，可溶性PD-1片段以可溶性PD-1表达盒的形式插入重组单纯疱疹病毒中。进一步地，可溶性PD-1表达盒包括依次连接的CMV启动子、可溶性PD-1片段及BGHpA。其中，BGHpA为牛生长激素多聚腺苷序列。
在其中一个实施例中，可溶性PD-1片段为hsPD-1(即人源化的可溶性PD-1片段)。在一个具体示例中，可溶性PD-1片段的序列如SEQ ID No.1所示。
具体地，如SEQ ID No.1所示的序列为：5’-GCTAAGCTTACCATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGTTCCAATAAATCTAGAGCA-3’。其中，5’端下划线的“AAGCTT”表示HindⅢ酶切位点，3’端下划线的“TCTAGA”表示XbaⅠ酶切位点和。
在一个具体示例中，重组单纯疱疹病毒于2018年11月22日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC NO：V201863，分类命名：单纯疱疹病毒rHSV-1-hsPD-1。该重组单纯疱疹病毒能够特异性靶向肿瘤细胞，对正常细胞无杀伤作用，并且，该重组单纯疱疹病毒能够在肿瘤细胞中高表达hsPD-1，以竞争性地与PD-L1结合，而恢复肿瘤特异性T细胞的杀伤功能。该重组单纯疱疹病毒兼具溶瘤功能和免疫抑制功能。
上述重组单纯疱疹病毒中，通过缺失ICP34.5基因和ICP47基因，提高了重组单纯疱疹病毒的肿瘤靶向性和安全性，并且通过单纯疱疹病毒携带sPD-1基因，能够表达sPD-1，以阻断PD-1与PD-L1的结合，恢复肿瘤特异性T细胞的杀伤功能，以兼具溶瘤功能和免疫抑制功能。
上述重组单纯疱疹病毒能够高效表达sPD-1，且sPD-1与PD-L1的结合能力较强，且该重组单纯疱疹病毒的病毒滴度较高，对肿瘤细胞的杀伤作用较强，能够应用于制备增强抗肿瘤免疫反应的药物或治疗肿瘤的药物中，为肿瘤治疗提供了有利的工具。
如图1所示，本发明一实施方式提供了一种重组单纯疱疹病毒的制备方法。HSV-1基因组DNA由两个共价连接的片段组成，包括独特的L片段(unique long)和独特的S片段(unique short)。这两个片段的两侧均被重复片段包围，位于L片段两端的重复序列命名为RL(repeat long)，位于S片段两端的重复序列命名为RS(repeat short)。图1中，“RL”表示位于L片段两端的重复序列。“RS”表示位于S片段两端的重复序列。“pA”表示BGHpA终止子；“CMV”表示CMV启动子。
具体地，该重组单纯疱疹病毒的制备方法包括如下步骤S110～S150：
S110、以p galk载体为模板，采用第一同源臂引物对进行PCR扩增，得到ΔICP34.5-galk片段，将ΔICP34.5-galk片段转入感受态的第一重组菌中，进行galk正筛选，得到第二重组菌，ΔICP34.5-galk片段含有依次连接的ICP34.5基因上游侧翼区序列、galk表达盒及ICP34.5基因下游侧翼区序列，第一重组菌中含有携带HSV-1病毒基因组的载体，第二重组菌缺失ICP34.5基因，且缺失的ICP34.5基因的位点上插入有ΔICP34.5-galk片段。
galK基因在大肠杆菌中具有双向功能：通过激酶作用利用半乳糖作为碳源进入糖代谢；同时它又能将DOG(D-2-脱氧半乳糖)转化成对大肠杆菌有毒性的物质。感受态的第一重组菌中敲除了galk表达盒。通过引入ΔICP34.5-galk片段，以便于用需要的DNA序列来替换ΔICP34.5-galk片段，以达到不引入外源序列即可精确改造任意DNA的目的。同时，通过引入ΔICP34.5-galk片段替换ICP34.5基因，以提高重组单纯疱疹病毒的肿瘤靶向性和安全性。
在一个具体示例中，p galk载体为Genbank：FR832405的p galk载体。
在一个具体示例中，第一重组菌于2018年12月29日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2018944，分类命名：Escherichia coli SW102-HSV-1，即大肠杆菌SW102-HSV-1。
在其中一个实施例中，第一同源臂引物对包括第一同源臂正向引物与第一同源臂反向引物。第一同源臂正向引物从5’端到3’端包括ICP34.5基因上游侧翼区序列和第一正向引物。第一同源臂反向引物从5’端到3’端包括ICP34.5基因下游侧翼区序列和第一反向引物。第一正向引物与第一反向引物用于扩增galk表达盒。进一步地，第一同源臂正向引物从5’端到3’端包括依次连接的ICP34.5基因上游侧翼区序列和第一正向引物。第一同源臂反向引物从5’端到3’端包括依次连接的ICP34.5基因下游侧翼区序列和第一反向引物。在一个具体示例中，ICP34.5基因上游侧翼区序列如SEQ ID No.2所示，ICP34.5基因下游侧翼区序列如SEQ ID No.3所示。
具体地，如SEQ ID No.2所示的序列为：TTGGTGCGGAGCTCCCGGGAGCTCCGCGGAAGACCCAGGCCGCCTCGGGT。如SEQ ID No.3所示的序列为：GAGTTAGACAGGCAAGCACTACTCGCCTCTGCACGCACATGCTTGCCTGT。
在一个具体示例中，第一正向引物如SEQ ID No.6所示，第一反向引物如SEQ IDNo.7所示。具体地，如SEQ ID No.6所示的序列为：CCTGTTGACAATTAATCATCGGCA。如SEQ IDNo.7所示的序列为：TCAGCACTGTCCTGCTCCTTG。
在其中一个实施例中，将转入ΔICP34.5-galk片段后的第一重组菌进行galk正筛选的步骤为：转入ΔICP34.5-galk片段后的第一重组菌置于以半乳糖为碳源的培养基中培养。培养时间为3天～5天。培养温度为32℃。进一步地，半乳糖为碳源的培养基包括15g/L的琼脂、质量百分含量为0.2％的D-半乳糖、1mg/L的D-生物素、45mg/L的L-亮氨酸和12.5μg/mL的氯霉素。
进一步地，转入ΔICP34.5-galk片段后的第一重组菌置于以半乳糖为碳源的培养基中培养之前，还包括如下步骤：将转入ΔICP34.5-galk片段后的第一重组菌置于无抗性的LB培养基中复苏培养；接着用M9溶液清洗转入ΔICP34.5-galk片段后的第一重组菌。更进一步地，复苏培养的时间为1h，培养温度为32℃。用M9溶液清洗的次数为至少两次。M9溶液包括1g/L的NH4Cl、3g/L的KH2PO4、0.5g/L的NaCl和6.8g/L的Na2HPO4。
在其中一个实施例中，在S110之后，还包括验证第二重组菌的步骤。通过验证，以确认HSV-1病毒基因组中的ICP34.5基因是否被ΔICP34.5-galk片段替代。进一步地，验证第二重组菌的方式为PCR反应验证或测序验证。
在一个具体示例中，采用第二PCR正向引物和第二PCR反向引物进行PCR反应验证。第二PCR正向引物的序列如SEQ ID No.12所示。第二PCR反向引物的序列如SEQ ID No.13所示。具体地，如SEQ ID No.12所示的序列为：GCTCCTGCCATCGTCTCTCCGGAGA。如SEQ ID No.13所示的序列为：GGCCGAGACGAGCGAGTTAGACAGG。
S120、以含有可溶性PD-1表达盒的载体为模板，采用第二同源臂引物对进行PCR扩增，得到ΔICP34.5-hsPD-1片段，将ΔICP34.5-hsPD-1片段转入感受态的第二重组菌中，进行galk负筛选，得到第三重组菌，ΔICP34.5-hsPD-1片段含有依次连接的ICP34.5基因上游侧翼区序列、可溶性PD-1表达盒及ICP34.5基因下游侧翼区序列，第三重组菌缺失ΔICP34.5-galk片段，且缺失的ΔICP34.5-galk片段的位点上插入有ΔICP34.5-hsPD-1片段。
由于ΔICP34.5-galk片段含有依次连接的ICP34.5基因上游侧翼区序列、galk表达盒及ICP34.5基因下游侧翼区序列，ΔICP34.5-hsPD-1片段含有依次连接的ICP34.5基因上游侧翼区序列、可溶性PD-1表达盒及ICP34.5基因下游侧翼区序列，将ΔICP34.5-hsPD-1片段转入感受态的第二重组菌中，ΔICP34.5-galk片段与ΔICP34.5-hsPD-1片段同源重组，使得galk表达盒被可溶性PD-1表达盒替换，从而向HSV-1病毒基因组中引入可溶性PD-1表达盒。
在其中一个实施例中，第二同源臂引物对包括第二同源臂正向引物与第二同源臂反向引物。第二同源臂正向引物从5’端到3’端包括ICP34.5基因上游侧翼区序列和第二正向引物。第二同源臂反向引物从5’端到3’端包括ICP34.5基因下游侧翼区序列和第二反向引物。第二正向引物与第二反向引物用于扩增可溶性PD-1表达盒。进一步地，第二同源臂正向引物从5’端到3’端包括依次连接ICP34.5基因上游侧翼区序列和第二正向引物。第二同源臂反向引物从5’端到3’端包括依次连接ICP34.5基因下游侧翼区序列和第二反向引物。
在一个具体示例中，第二正向引物如SEQ ID No.8所示，第二反向引物如SEQ IDNo.9所示。具体地，如SEQ ID No.8所示的序列为：GTTGACATTGATTATTGACTAGTTA。如SEQ IDNo.9所示的序列为：CCTGCTATTGTCTTCCCAATC。
在其中一个实施例中，可溶性PD-1表达盒含有可溶性PD-1片段。进一步地，可溶性PD-1表达盒从5’端到3’端包括CMV启动子、可溶性PD-1片段与BGHpA。
在其中一个实施例中，可溶性PD-1片段为hsPD-1基因(即人源化的可溶性PD-1基因)。进一步地，可溶性PD-1片段的两端分别为不同的酶切位点。更进一步地，可溶性PD-1片段的5’端为HindⅢ酶切位点，3’端为XbaⅠ酶切位点。在一个具体示例中，可溶性PD-1片段的序列如SEQ ID No.1所示。
在其中一个实施例中，将转入ΔICP34.5-hsPD-1片段后的第二重组菌进行galk负筛选的步骤为：转入ΔICP34.5-hsPD-1片段后的第二重组菌置于以DOG(D-2-脱氧半乳糖)和甘油为碳源的培养基中培养。培养时间为3天～5天。培养温度为32℃。进一步地，以DOG和甘油为碳源的培养基包括15g/L的琼脂、质量百分含量为0.2％的DOG、质量百分含量为0.2％的甘油、1mg/L的D-生物素、45mg/L的L-亮氨酸和12.5μg/mL的氯霉素。
进一步地，转入ΔICP34.5-hsPD-1片段后的第二重组菌置于以DOG和甘油为碳源的培养基中培养之前，还包括如下步骤：将转入ΔICP34.5-hsPD-1片段后的第二重组菌置于无抗性的LB培养基中复苏培养；在用M9溶液清洗培养后的转入ΔICP34.5-galk片段后的第二重组菌。更进一步地，复苏培养的时间为4.5h，培养温度为32℃。用M9溶液清洗的次数为至少两次。
在其中一个实施例中，在S120之后，还包括验证第三重组菌的步骤。通过验证，以确认HSV-1病毒基因组中的ΔICP34.5-galk片段是否被ΔICP34.5-hsPD-1片段替代。进一步地，验证第三重组菌的方式为PCR反应验证或测序验证。
在一个具体示例中，采用第二PCR正向引物和第二PCR反向引物进行PCR反应验证。
进一步地，将上述PCR反应验证的PCR产物纯化后，用第一测序正向引物和第一测序反应引物进行测序验证。具体地，第一测序正向引物的序列如SEQ ID No.14所示。第一测序反应引物的序列如SEQ ID No.15所示。具体地，如SEQ ID No.14所示的序列为：GATCCAGCCTCCGGACTCTAG。如SEQ ID No.15所示的序列为：TAGAAGGCACAGTCGAGGCTG。
在其中一个实施例中，在S120之前，还包括如下步骤：构建含有可溶性PD-1表达盒的载体。进一步地，构建含有可溶性PD-1表达盒的载体的步骤包括：构建重组穿梭载体，重组穿梭载体含有可溶性PD-1表达盒。
具体地，以HindⅢ和XbaⅠ酶切位点将可溶性PD-1片段连接至pGA1载体中，构建重组穿梭载体，命名为pGA1-hsPD-1穿梭质粒。重组穿梭载体中hsPD-1基因的5’端为CMV启动子，3’端为BGHpA。
在其中一个实施例中，在构建重组穿梭载体的步骤之后，还包括验证重组穿梭载体的步骤。通过验证以确定可溶性PD-1片段是否转入重组穿梭载体中。进一步地，验证重组穿梭载体的方式为PCR反应验证或测序验证。
具体地，采用第一PCR正向引物和第一PCR反向引物进行PCR反应验证。第一PCR正向引物的序列如SEQ ID No.10所示。第一PCR反向引物的序列如SEQ ID No.11所示。具体地，如SEQ ID No.10所示的序列为：GTGACTTCCACATGAGCGTG。如SEQ ID No.11所示的序列为：CCTGCTATTGTCTTCCCAATC。
S130、以p galk载体为模板，采用第三同源臂引物对进行PCR扩增，得到ΔICP47-galk片段，将ΔICP47-galk片段转入感受态的第三重组菌中，进行galk正筛选，得到第四重组菌，ΔICP47-galk片段含有依次连接的ICP47上游侧翼区序列、galk表达盒及ICP47基因下游侧翼区序列，第四重组菌缺失ICP47基因，且缺失的ICP47基因的位点上插入有ΔICP47-galk片段。
通过引入ΔICP47-galk片段，以便于用需要的DNA序列来替换ΔICP47-galk片段，同时，通过引入ΔICP47-galk片段替换ICP47基因，以提高重组单纯疱疹病毒对肿瘤细胞的攻击。
在其中一个实施例中，第三同源臂引物对包括第三同源臂正向引物与第三同源臂反向引物。第三同源臂正向引物从5’端到3’端包括ICP47基因上游侧翼区序列和第三正向引物。第三同源臂反向引物从5’端到3’端包括ICP47基因下游侧翼区序列和第三反向引物。第三正向引物与第三反向引物用于扩增galk表达盒。进一步地，第三同源臂正向引物从5’端到3’端包括依次连接的ICP47基因上游侧翼区序列和第三正向引物。第三同源臂反向引物从5’端到3’端包括依次连接的ICP47基因下游侧翼区序列和第三反向引物。
在一个具体示例中，ICP47基因上游侧翼区序列如SEQ ID No.4所示，ICP47基因下游侧翼区序列如SEQ ID No.5所示。具体地，如SEQ ID No.4所示的序列为：CGTGGGCCCTGGAAATGGCGGACACCTTCCTGGACAACATGCGGGTTGGG，如SEQ ID No.5所示的序列为：AACGGGTTACCGGATTACGGGGACTGTCGGTCACGGTCCCGCCGGTTCTT。
在一个具体示例中，第三正向引物与第一正向引物相同，且其序列如SEQ ID No.6所示；第三反向引物与第一反向引物相同，且其序列如SEQ ID No.7所示。
在其中一个实施例中，将转入ΔICP47-galk片段后的第三重组菌进行galk正筛选的步骤为：转入ΔICP47-galk片段后的第三重组菌置于以半乳糖为碳源的培养基中培养。培养时间为3天～5天。培养温度为32℃。
进一步地，转入ΔICP47-galk片段后的第三重组菌于以半乳糖为碳源的培养基中培养之前，还包括如下步骤：将转入ΔICP47-galk片段后的第三重组菌置于无抗性的LB培养基中复苏培养；接着用M9溶液清洗转入ΔICP47-galk片段后的第三重组菌。更进一步地，复苏培养的时间为1h，培养温度为32℃。用M9溶液清洗的次数为至少两次。
在其中一个实施例中，在S130之后，还包括验证第四重组菌的步骤。通过验证，以确认HSV-1病毒基因组中的ICP47基因是否被ΔICP47-galk片段替代。进一步地，验证第四重组菌的方式为PCR反应验证或测序验证。
具体地，采用第三PCR正向引物和第三PCR反向引物进行PCR反应验证。第三PCR正向引物的序列如SEQ ID No.16所示。第三PCR反向引物的序列如SEQ ID No.17所示。具体地，如SEQ ID No.16所示的序列为：TGCCTTCCCGCAGGAGGAAC。如SEQ ID No.17所示的序列为：CTGGCTCATCTCGAGAGCCA。
S140、以含有可溶性PD-1表达盒的载体为模板，采用第四同源臂引物对进行PCR扩增，得到ΔICP47-hsPD-1片段，将ΔICP47-hsPD-1片段转入感受态的第四重组菌中，进行galk负筛选，得到重组载体，ΔICP47-hsPD-1片段含有依次连接的ICP47基因上游侧翼区序列、可溶性PD-1表达盒及ICP47基因下游侧翼区序列，重组载体缺失ΔICP47-galk片段，且缺失的ΔICP47-galk片段的位点上插入有ΔICP47-hsPD-1片段。
由于ΔICP47-galk片段含有依次连接的ICP47基因上游侧翼区序列、galk表达盒及ICP47基因下游侧翼区序列，ΔICP47-hsPD-1片段含有依次连接的ICP47基因上游侧翼区序列、可溶性PD-1表达盒及ICP47基因下游侧翼区序列，将ΔICP47-hsPD-1片段转入感受态的第四重组菌中，ΔICP47-galk片段与ΔICP47-hsPD-1片段同源重组，使得galk表达盒被可溶性PD-1表达盒替换，从而向HSV-1病毒基因组中引入可溶性PD-1表达盒。
在其中一个实施例中，第四同源臂引物对包括第四同源臂正向引物与第四同源臂反向引物。第四同源臂正向引物从5’端到3’端包括ICP47基因上游侧翼区序列和第四正向引物。第四同源臂反向引物从5’端到3’端包括ICP47基因下游侧翼区序列和第四反向引物。第四正向引物与第四反向引物用于扩增可溶性PD-1表达盒。进一步地，第四同源臂正向引物从5’端到3’端包括依次连接的ICP47基因上游侧翼区序列和第四正向引物。第四同源臂反向引物从5’端到3’端包括依次连接的ICP47基因下游侧翼区序列和第四反向引物。
在一个具体示例中，第四正向引物与第二正向引物相同，且其序列如SEQ ID No.8所示；第四反向引物与第二反向引物相同，且其序列如SEQ ID No.9所示。
在其中一个实施例中，将转入ΔICP47-hsPD-1片段片段后的第四重组菌进行galk负筛选的步骤为：转入ΔICP47-hsPD-1片段片段后的第四重组菌置于以DOG(D-2-脱氧半乳糖)和甘油为碳源的培养基中培养。培养时间为3天～5天。培养温度为32℃。
进一步地，转入ΔICP47-hsPD-1片段后的第四重组菌置于以DOG和甘油为碳源的培养基中培养之前，还包括如下步骤：将转入ΔICP47-hsPD-1片段片段后的第四重组菌置于无抗性的LB培养基中复苏培养；在用M9溶液清洗培养后的转入ΔICP34.5-galk片段后的第四重组菌。更进一步地，复苏培养的时间为4.5h，培养温度为32℃。用M9溶液清洗的次数为至少两次。
在其中一个实施例中，在S140之后，还包括验证重组载体的步骤。通过验证，以确认HSV-1病毒基因组中的ΔICP47-galk片段是否被ΔICP47-hsPD-1片段替代。进一步地，验证重组载体的方式为PCR反应验证或测序验证。
在一个具体示例中，采用第三PCR正向引物和第三PCR反向引物进行PCR反应验证。进一步地，将上述PCR反应验证的PCR产物纯化后，用第一测序反向引物、第三PCR正向引物和第三PCR反向引物进行测序验证。
在其中一个实施例中，在将所述ΔICP47-hsPD-1片段转入感受态的所述第四重组菌中，进行galk负筛选之后，还包括如下步骤：从galk负筛选得到的阳性重组菌中提取重组质粒，即为重组载体。需要说明的是，galk负筛选得到的阳性重组菌能够满足需求时，从galk负筛选得到的阳性重组菌中提取重组质粒的步骤可以省略。此时，galk负筛选得到的阳性重组菌即为重组载体。
S150、用重组载体转染VERO细胞，培养转染后的VERO细胞，裂解并收集上清，得到重组单纯疱疹病毒。
在其中一个实施例中，S150的步骤包括：用重组载体转染VERO细胞，培养转染后的VERO细胞，裂解并收集上清，得到原代病毒；将原代病毒感染VERO细胞并培养，细胞裂解后收集上清，得到二代病毒；将二代病毒感染VERO细胞并培养，细胞裂解后收集上清，得到三代病毒；将三代病毒感染VERO细胞并培养，细胞裂解后收集上清，得到四代病毒；将四代病毒感染VERO细胞并培养，细胞裂解后收集上清，得到五代病毒；及将五代病毒感染VERO细胞并培养，细胞裂解后收集上清，得到重组单纯疱疹病毒。其中，裂解的方式为：将待裂解的细胞在-80℃及37℃反复冻融，得到裂解后的细胞。进一步地，反复冻融的次数为3次。
在其中一个实施例中，将VERO细胞培养至汇合度为40％～50％后，再进行转染。
需要说明的是，若重组载体为galk负筛选得到的阳性重组菌时，在用重组载体转染VERO细胞的步骤包括：从galk负筛选得到的阳性重组菌中提取重组质粒，用重组质粒转染VERO细胞。
上述重组单纯疱疹病毒的制备方法中，通过galk正筛选将HSV-1病毒基因组中的ICP34.5基因与ICP47基因敲除，并通过同源重组向HSV-1病毒基因组中引入sPD-1片段，得到的重组载体和重组单纯疱疹病毒具有较高的肿瘤靶向性和安全性，能够高效表达sPD-1片段，以能够竞争性地与肿瘤细胞表达的PD-L1结合，恢复肿瘤特异性T细胞的杀伤功能，从而使得上述重组载体和重组单纯疱疹病毒能够应用于制备增强抗肿瘤免疫反应的药物或治疗肿瘤的药物中，为肿瘤治疗提供了有利的工具。
以下为具体实施例部分。
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
未特别说明，以下实施例中，LB培养基购于生工生物工程(上海)股份有限公司。氯霉素购于生工生物工程(上海)股份有限公司。M9溶液的组成为：1g/L的NH4Cl、3g/L的KH2PO4、0.5g/L的NaCl和6.8g/L的Na2HPO4。半乳糖为碳源的M63低营养培养板的组成为：15g/L的琼脂、质量百分含量为0.2％的D-半乳糖、1mg/L的D-生物素、45mg/L的L-亮氨酸和12.5μg/mL的氯霉素。DOG和甘油为碳源的M63低营养培养板的组成为：15g/L的琼脂、质量百分含量为0.2％的DOG、质量百分含量为0.2％的甘油、1mg/L的D-生物素、45mg/L的L-亮氨酸和12.5μg/mL的氯霉素。
未特别说明，以下实施例中，第一重组菌于2018年12月29日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2018944，分类命名：Escherichia coli SW102-HSV-1，即大肠杆菌SW102-HSV-1。
实施例1
pGA1-hsPD-1穿梭质粒(即重组穿梭质粒)构建与表达活性检测
(1)合成hPD-1胞外段序列(hsPD-1)，5’端为HindⅢ酶切位点，3’端为XbaⅠ酶切位点。hsPD-1的序列如SEQ ID No.1所示。
(2)以HindⅢ和XbaⅠ酶切位点将hsPD-1基因连接至pGA1载体，构建pGA1-hsPD-1穿梭质粒。pGA1-hsPD-1穿梭质粒中hsPD-1基因的5’端为CMV启动子，3’端为BGHpA。pGA1-hsPD-1穿梭质粒的结构示意图如图2所示。图2为pGA1-hsPD-1穿梭质粒的结构示意图。
(3)pGA1-hsPD-1穿梭质粒的PCR鉴定
使用表1中的引物和Phusion高保真DNA聚合酶(购于Thermo公司)对pGA1-hsPD-1穿梭质粒进行PCR反应，并对PCR产物进行电泳测试。其中，PCR反应条件如下：98℃15s，55℃30s，72℃72s。测试结果如图3所示。图3为pGA1-hsPD-1穿梭质粒的电泳鉴定图。从图3可以看出，pGA1-hsPD-1穿梭质粒构建成功。
表1 pGA1-hsPD-1穿梭质粒PCR鉴定的引物
| 第一PCR正向引物 | GTGACTTCCACATGAGCGTG(如SEQ ID No.10所示) |
| 第一PCR反向引物 | CCTGCTATTGTCTTCCCAATC(如SEQ ID No.11所示) |
(4)pGA1-hsPD-1穿梭质粒的测序鉴定
将步骤(3)中PCR鉴定正确的质粒至生工生物工程(上海)股份有限公司测序鉴定，以CMV引物测序。测定结果如图4所示。图4为pGA1-hsPD-1穿梭质粒的测序比对图。
(5)在6孔板中培养293T细胞。当293T细胞的汇合度达到80％时，每孔转入3μL的Lipo 3000(购于Invitrogen公司)和1μg的pGA1-hsPD-1穿梭质粒，继续培养。培养48h后，收集培养上清，即为pGA1-hsPD-1穿梭质粒转染后的细胞培养上清(即为pGA1-hsPD-1)。同时，在6孔板中培养293T细胞。当293T细胞的汇合度达到80％时，每孔转入3μL的Lipo 3000，继续培养。培养48h后，收集培养上清，即为对照细胞培养上清(即为Ctl)。用WB(westernblot)检测pGA1-hsPD-1穿梭质粒转染后的细胞培养上清与对照细胞培养上清中hsPD-1的表达。测定结果如图5所示。图5为pGA1-hsPD-1穿梭质粒转染后的细胞培养上清与对照细胞培养上清中hsPD-1的表达量对比图。同时，采用hPD-1ELISA试剂盒(购于北京义翘神州科技有限公司)检测采用pGA1-hsPD-1穿梭质粒紧张转染后的培养上清中hsPD-1的浓度约600ng/mL。
(6)hsPD-1与配体PD-L1结合能力的测定
在96孔板中，每孔加入100μL、1μg/mL的PD-L1Fc融合蛋白(购于R&D公司)，4℃包被过夜。实验分为实验组和对照组。实验组和对照组均有3个孔。实验组的每孔分别加入100μL、含有23ng的hsPD-1的pGA1-hsPD-1穿梭质粒转染后细胞培养上清。对照组的每孔分别加入100μL的对照细胞培养上清。实验组和对照组均孵育120min。采用hPD-1ELISA试剂盒(购于北京义翘神州科技有限公司)检测两组孵育液的OD450，并计算每组3个孔的OD450的平均值。测定结果详见表2。
表2实验组和对照组的OD450
| 对照组 | 实验组 | |
| OD<sub>450</sub> | 0.075 | 2.478 |
从表2可以看出，对照组的OD450为0.075，说明对照组中未加入pGA1-hsPD-1穿梭质粒转染，没有表达能够与PD-L1结合的hsPD-1。实验组的OD450为2.478，说明pGA1-hsPD-1穿梭质粒表达的hsPD-1能够与PD-L1结合，且结合能力较强。
实施例2
HSV-1-ΔICP34.5-hsPD-1重组质粒构建
(1)以p galk质粒(p galk质粒的结构示意图如图6所示)为模板，使用PrimeSTARHS DNA聚合酶(购于TAKARA公司)和表3中的用第一同源臂引物对进行PCR扩增，得到ΔICP34.5-galk片段。ΔICP34.5-galk片段含有依次连接的ICP34.5基因上游侧翼区序列、galk表达盒及ICP34.5基因下游侧翼区序列。其中，图6中，“galk”表示galk表达盒，“galkpromoter”表示galk表达盒的启动子，“kanamycin resistance”表示卡那霉素抗性基因，“ampicillin resistance”表示氨苄青霉素抗性基因，“ampicillin promoter”表示氨苄青霉素抗性基因的启动子。第一同源臂引物对包括第一同源臂正向引物与第一同源臂反向引物。第一同源臂正向引物从5’端到3’端为依次连接的ICP34.5基因上游侧翼区序列和第一正向引物。第一同源臂反向引物从5’端到3’端为依次连接的ICP34.5基因下游侧翼区序列和第一反向引物。第一正向引物与第一反向引物用于扩增galk表达盒。PCR反应的条件如下：98℃10s，55℃15s，72℃80s；将PCR产物进行电泳测定，测定结果详见图7。图7为ΔICP34.5-galk片段的电泳鉴定图。
表3第一同源臂引物对
(2)在32℃震荡水浴条件下，用LB培养基(该LB培养基含有12.5μg/mL氯霉素)培养第一重组菌至OD600为0.5～0.55，转入42℃震荡水浴诱导15min。立即置于冰上，经ddH2O(即双蒸水)洗涤两遍后，固液分离，收集沉淀细胞，将沉淀细胞制备成感受态的第一重组菌。
(3)将ΔICP34.5-galk片段电转化入感受态的第一重组菌。电转条件如下：1.75KV，200Ω，25μF。将转化后的菌液加入1mL的无抗性LB培养基，32℃震荡水浴条件下复苏1h。用M9溶液洗涤复苏后的细胞两遍。将清洗后的细胞涂布于半乳糖为碳源的M63低营养培养板上，于32℃下培养3天，得到第二重组菌。第二重组菌含有HSV-1-ΔICP34.5-galk重组质粒。HSV-1-ΔICP34.5-galk重组质粒的HSV-1病毒基因组缺失ICP34.5基因，且缺失的ICP34.5基因的位点上插入有ΔICP34.5-galk片段。
(4)使用表4中的第二PCR正向引物和第二PCR反向引物和PrimeSTAR HS DNA聚合酶(购于TAKARA公司)对HSV-1-ΔICP34.5-galk重组质粒进行PCR反应，并对PCR产物进行电泳测试。PCR反应条件为：98℃20s，68℃120s。电泳测试结果如图8所示。图8为HSV-1-ΔICP34.5-galk重组质粒的电泳鉴定图。从图8可以看出，HSV-1-ΔICP34.5-galk重组质粒构建成功。
表4第二PCR正向引物和第二PCR反向引物
| 第二PCR正向引物 | GCTCCTGCCATCGTCTCTCCGGAGA(如SEQ ID No.12所示) |
| 第二PCR反向引物 | GGCCGAGACGAGCGAGTTAGACAGG(如SEQ ID No.13所示) |
(5)以pGA1-hsPD-1穿梭质粒为模板，使用表5中的第二同源臂引物对进行PCR扩增，得到ΔICP34.5-hsPD-1片段。ΔICP34.5-hsPD-1片段含有依次连接的ICP34.5基因上游侧翼区序列、可溶性PD-1表达盒及ICP34.5基因下游侧翼区序列。第二同源臂引物对包括第二同源臂正向引物与第二同源臂反向引物。第二同源臂正向引物从5’端到3’端为依次连接的ICP34.5基因上游侧翼区序列和第二正向引物。第二同源臂反向引物从5’端到3’端为依次连接的ICP34.5基因下游侧翼区序列和第二反向引物。第二正向引物与第二反向引物用于扩增可溶性PD-1表达盒。PCR反应的条件为：98℃20s，68℃120s。将PCR产物进行电泳测定，结果如图9所示。图9为ΔICP34.5-hsPD-1片段的电泳鉴定图。
表5第二同源臂引物对
(6)在32℃震荡水浴条件下，采用LB培养基(12.5μg/ml氯霉素)培养第二重组菌至OD600为0.5～0.55，转入42℃震荡水浴诱导15min。立即置于冰上，经ddH2O洗涤两遍后，固液分离，收集沉淀细胞，将沉淀细胞制备成感受态的第二重组菌。
(7)将ΔICP34.5-hsPD-1片段电转入感受态的第二重组菌。电转条件为：1.75KV，200Ω，25μF。将转化后菌液加入10mL的无抗性LB培养基，32℃震荡水浴条件下复苏4.5h。将复苏后的菌经M9溶液洗涤两遍后，涂布于DOG和甘油为碳源的M63低营养培养板上，于32℃培养3天，得到第三重组菌。第三重组菌含有HSV-1-ΔICP34.5-hsPD-1重组质粒。HSV-1-ΔICP34.5-hsPD-1重组质粒缺失ΔICP34.5-galk片段，且缺失的ΔICP34.5-galk片段的位点上插入有ΔICP34.5-hsPD-1片段。
(8)使用表4中第二PCR正向引物和第二PCR反向引物以及PrimeSTAR HS DNA聚合酶(购于TAKARA公司)对HSV-1-ΔICP34.5-hsPD-1重组质粒进行PCR反应，并对PCR产物进行电泳测试。PCR反应条件为：98℃20s，68℃120s。电泳结果如图10所示，图10为HSV-1-ΔICP34.5-hsPD-1重组质粒的电泳鉴定图。纯化PCR产物，采用表6中第一测序正向引物和第一测序反应引物分别进行测序验证。鉴定结果如图11～12所示，图11为第一测序正向引物测定的测序比对图，图12为第一测序反向引物测定的测序比对图。
表6第一测序正向引物和第一测序反应引物
| 第一测序正向引物 | GATCCAGCCTCCGGACTCTAG(如SEQ ID No.14所示) |
| 第一测序反向引物 | TAGAAGGCACAGTCGAGGCTG(如SEQ ID No.15所示) |
从图10～12可以看出，HSV-1病毒基因组中的两个ΔICP34.5基因均被hsPD-1表达和替代，说明HSV-1-ΔICP34.5-hsPD-1重组质粒构建成功。
实施例3
rHSV-1-hsPD-1重组质粒构建
(1)以pgalk质粒为模板，使用Tks Gflex DNA聚合酶和表7中的第三同源臂引物对进行PCR扩增，得到ΔICP47-galk片段。ΔICP47-galk片段含有依次连接的ICP47上游侧翼区序列、galk表达盒及ICP47基因下游侧翼区序列。第三同源臂引物对包括第三同源臂正向引物与第三同源臂反向引物。第三同源臂正向引物从5’端到3’端为依次连接的ICP47基因上游侧翼区序列和第三正向引物。第三同源臂反向引物从5’端到3’端为依次连接的ICP47基因下游侧翼区序列和第三反向引物。第三正向引物与第三反向引物用于扩增galk表达盒。PCR扩增条件为：98℃10s，68℃120s。PCR扩增结果如图13所示。图13为ΔICP47-galk片段的电泳鉴定图。
表7第三同源臂引物对
(2)在32℃震荡水浴条件下，用LB培养基(该LB培养基含有12.5μg/mL氯霉素)培养第三重组菌至OD600为0.5～0.55，转入42℃震荡水浴诱导15min。立即置于冰上，经ddH2O洗涤两遍后，固液分离，收集沉淀细胞，将沉淀细胞制备成感受态的第三重组菌。
(3)将ΔICP47-galk片段电转入感受态的第三重组菌，电转条件为：1.75KV，200Ω，25μF。将转化后菌液加入1mL的无抗性LB培养基，32℃震荡水浴条件下复苏1h。将复苏后的细胞经M9溶液洗涤两遍，涂布于半乳糖为碳源的M63低营养培养板，32℃培养3天，得到第四重组菌。第四重组菌缺失ICP47基因，且缺失ICP47基因的位点插入有ΔICP47-galk片段。
(4)使用Tks Gflex DNA聚合酶和表8中的第三PCR正向引物和第三PCR反向引物对第四重组菌进行PCR反应，并对PCR产物进行电泳测试。PCR反应条件如下：98℃10s，68℃120s。测试结果如图14所示，图14为HSV-1-ΔICP47-galk重组质粒的电泳鉴定图。从图14可以看出，HSV-1病毒基因组中的ICP47基因被ΔICP47-galk片段替代。
表8第三PCR正向引物和第三PCR反向引物
| 第三PCR正向引物 | TGCCTTCCCGCAGGAGGAAC(如SEQ ID No.16所示) |
| 第三PCR反向引物 | CTGGCTCATCTCGAGAGCCA(如SEQ ID No.17所示) |
(5)以PGA1-hsPD-1穿梭质粒为模板，使用表9中的第四同源臂引物对和Tks GflexDNA聚合酶(购于TAKARA公司)进行PCR扩增，得到ΔICP47-hsPD-1片段。ICP47-hsPD-1片段含有依次连接的ICP47基因上游侧翼区序列、可溶性PD-1表达盒及ICP47基因下游侧翼区序列。该引物包括两部分，扩增hsPD-1表达盒的上下游引物和ICP47侧翼同源臂。第四同源臂引物对包括第四同源臂正向引物与第四同源臂反向引物。第四同源臂正向引物从5’端到3’端为依次连接的ICP47基因上游侧翼区序列和第四正向引物。第四同源臂反向引物从5’端到3’端为依次连接的ICP47基因下游侧翼区序列和第四反向引物。第四正向引物与第四反向引物用于扩增可溶性PD-1表达盒。PCR反应的条件如下：98℃20s，68℃120s。PCR扩增结果如图15所示。图15为ΔICP47-hsPD-1片段的电泳鉴定图。
表9第四同源臂引物对
(6)在32℃震荡水浴条件下，采用含有12.5μg/mL的氯霉素的LB培养基培养第四重组菌至OD600为0.5～0.55，转入42℃震荡水浴诱导15min。立即置于冰上，经ddH2O洗涤两遍后，固液分离，收集沉淀细胞，将沉淀细胞制备成感受态的第四重组菌。
(7)将ΔICP47-hsPD-1片段电转入感受态的第四重组菌，电转条件如下：1.75KV，200Ω，25μF。将转化后菌液加入10mL的无抗性LB培养基，32℃震荡水浴条件下复苏4.5h。将复苏后的菌经M9溶液洗涤两遍后，涂布于DOG和甘油为碳源的M63低营养培养板，于32℃培养3天，得到第五重组菌。采用质粒提取试剂盒(即PureLinkTMHiPure Plasmid DNAPurifcation Kit，购于Invitrogen公司)对第五重组菌进行质粒提取，得到rHSV-1-hsPD-1重组质粒。rHSV-1-hsPD-1重组质粒缺失ΔICP47-galk片段，且缺失的ΔICP47-galk片段的位点上插入有ΔICP47-hsPD-1片段。
(8)使用Tks Gflex DNA聚合酶(购于TAKARA公司)和表8中的第三PCR正向引物和第三PCR反向引物对rHSV-1-hsPD-1重组质粒进行PCR反应，并对PCR产物进行电泳测试。PCR反应条件如下：98℃10s，68℃120s。测试结果如图16所示，图16为rHSV-1-hsPD-1重组质粒的电泳鉴定图，其中，HSV-1-ΔICP47-hsPD-1泳道即为rHSV-1-hsPD-1重组质粒。纯化PCR产物，经表6中的第一测序反向引物、表8中的中的第三PCR正向引物和第三PCR反向引物进行测序鉴定。鉴定结果如图17～19所示，图17为第一测序反向引物对rHSV-1-hsPD-1重组质粒的测序比对图，图18为第三PCR正向引物对rHSV-1-hsPD-1重组质粒的测序比对图，图19为第三PCR反向引物对rHSV-1-hsPD-1重组质粒的测序比对图。
从图16～19可以看出，HSV-1病毒基因组中的ICP47基因被hsPD-1表达盒替代。
(9)将rHSV-1-hsPD-1重组质粒送至泽塔生物科技(上海)有限公司进行二代测序。测序结果显示，两个ICP34.5基因和一个ICP47基因均被hsPD-1表达盒替代，三个拷贝的hsPD-1表达盒均插入正确，rHSV-1-hsPD-1重组质粒能够用于病毒学实验。
实施例4
rHSV-1-hsPD-1病毒拯救与滴度检测
(1)在24孔板中将VERO细胞(购于ATCC公司)培养至汇合度达到40％。每孔转入3μL的Lipo 3000(购于Invitrogen公司)和1μg的rHSV-1-hsPD-1重组质粒。培养1周后，大部分VERO细胞发生病变，固液分离，收集培养上清。经3次-80℃与37℃交替反复冻融后，获得P0代病毒液。
(2)P0代病毒液再次感染VERO细胞，获得P1代病毒。将P1病毒感染VERO细胞并培养，将培养后的细胞在在-80℃及37℃反复冻融三次，细胞裂解后收集上清，得到P2代病毒；将P2代病毒感染VERO细胞并培养，将培养后的细胞在在-80℃及37℃反复冻融三次，细胞裂解后收集上清，得到P3代病毒；将P3代病毒感染VERO细胞并培养，将培养后的细胞在在-80℃及37℃反复冻融三次，细胞裂解后收集上清，得到P4代病毒；将P4代病毒感染VERO细胞并培养，将培养后的细胞在在-80℃及37℃反复冻融三次，细胞裂解后收集上清，得到P5代病毒；及将P5代病毒感染VERO细胞并培养，将培养后的细胞在在-80℃及37℃反复冻融三次，细胞裂解后收集上清，得到P6代病毒液，即为重组单纯疱疹病毒。
(3)梯度稀释P6代病毒液，分别感染VERO细胞。感染2h后，将培养基更换为含有质量百分含量为0.2％的低熔点琼脂糖完全培养基(该培养基含有质量百分含量为10％的FBS，该培养基购于Gibco公司)。继续培养3天后可见空斑形成。培养5～7天后弃去培养基，用结晶紫染色细胞。统计空斑数目，并及时病毒滴度。经测定，上述P6代病毒液的病毒滴度为4.5×106pfu/mL。
实施例5
重组单纯疱疹病毒的病毒基因组鉴定与蛋白表达检测
(1)提取重组单纯疱疹病毒的病毒基因组，分别用表4中的第二PCR正向引物和第二PCR反向引物、表8中第三PCR正向引物和第三PCR反向引物对该病毒基因组进行PCR反应，并将PCR反应产物进行电泳测定。测定结果详见图20～21。图20为第二PCR正向引物和第二PCR反向引物对重组单纯疱疹病毒的病毒基因组的电泳鉴定图。图21为第三PCR正向引物和第三PCR反向引物对重组单纯疱疹病毒的病毒基因组的电泳鉴定图。
从图20～21可以看出，ICP34.5基因和ICP47基因均被hsPD-1表达盒所替代，重组单纯疱疹病毒的rHSV-1-hsPD-1病毒基因组正确。
(2)在24孔板中将VERO细胞(购于ATCC公司)培养至汇合度达到80％。用重组单纯疱疹病毒感染VERO细胞，培养48h后收集培养上清。用hPD-1ELISA试剂盒检测培养上清中hsPD-1的表达量。
经测定，上述重组单纯疱疹病毒的hsPD-1的表达量为25ng/mL，能够高效地表达hsPD-1，以能够用于制备增强抗肿瘤免疫反应的药物或治疗肿瘤的药物中。
将上述验证正确的重组单纯疱疹病毒进行病毒保藏。该重组单纯疱疹病毒于2018年11月22日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC NO：V201863，分类命名：单纯疱疹病毒rHSV-1-hsPD-1。
实施例6
重组单纯疱疹病毒的溶瘤功能检测
(1)采用重组单纯疱疹病毒(即rHSV-1-hsPD-1)和野生型HSV-1病毒(即WT)分别以MOI＝0.5(MOI为感染复数)感染小鼠正常上皮细胞15P-1(即15P-1细胞，购于中国科学院细胞库与干细胞库公司)，感染时间为2h。同时，采用重组单纯疱疹病毒和野生型HSV-1病毒分别以MOI＝0.5感染人正常上皮细胞FHs 74Int(即FHs 74Int细胞，购于中国科学院细胞库与干细胞库公司)，感染时间为2h。感染结束后，通过结晶紫染色法对感染后的细胞进行测定，测定结果详见图22。图22为重组单纯疱疹病毒和野生型HSV-1病毒对15P-1细胞、FHs74Int细胞的影响对比图。其中，野生型HSV-1病毒的制备方法：采用质粒提取试剂盒(即PureLinkTMHiPure Plasmid DNA Purifcation Kit，购于Invitrogen公司)提取第一重组菌中的HSV-1质粒，将HSV-1质粒且按照实施例4的操作进行病毒拯救，得到野生型HSV-1病毒。
从图22可以看出，野生型HSV-1病毒可以在小鼠正常上皮细胞15P-1中复制，最终杀伤裂解小鼠正常上皮细胞15P-1，并且野生型HSV-1病毒可以在FHs 74Int细胞中复制，最终杀伤裂解FHs 74Int细胞。而重组单纯疱疹病毒对重组小鼠正常上皮细胞15P-1和人正常上皮细胞FHs 74Int均无杀伤作用。
(2)采用重组单纯疱疹病毒以MOI＝0、0.01、0.05感染人咽癌细胞系FaDu(购于ATCC公司)，采用重组单纯疱疹病毒以MOI＝0、0.01、0.05感染人直肠癌细胞系HT-29(购于ATCC公司)，采用重组单纯疱疹病毒以MOI＝0、0.01、0.05感染人神经胶质瘤细胞系U-87MG(购于ATCC公司)。感染时间均为2h。感染结束后，通过结晶紫染色法对感染后的细胞进行测定，测定结果详见图23。图23为不同感染复数的重组单纯疱疹病毒对人咽癌细胞系FaDu、人直肠癌细胞系HT-29和人神经胶质瘤细胞系U-87MG的影响对比图。
从图23可以看出，重组单纯疱疹病毒能够在肿瘤细胞中复制，对肿瘤细胞具有较强的杀伤裂解作用；且随着感染复数的增加，重组单纯疱疹病毒对肿瘤细胞的杀伤作用越强。
综上所述，上述重组单纯疱疹病毒能够特异性地靶向肿瘤细胞，以杀死肿瘤细胞，对正常细胞无杀伤作用。同时，上述重组单纯疱疹病毒能够在肿瘤局部高效表达hsPD-1，以能够竞争性地与肿瘤细胞表达的PD-L1结合，恢复肿瘤特异性T细胞的杀伤功能，从而使得上述重组单纯疱疹病毒能够应用于制备增强抗肿瘤免疫反应的药物或治疗肿瘤的药物中，为肿瘤治疗提供了有利的工具。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳精准医疗科技有限公司
<120> 重组单纯疱疹病毒及其制备方法和应用、重组载体的构建方法及其应用
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 526
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctaagctta ccatgcagat cccacaggcg ccctggccag tcgtctgggc ggtgctacaa 60
ctgggctggc ggccaggatg gttcttagac tccccagaca ggccctggaa cccccccacc 120
ttctccccag ccctgctcgt ggtgaccgaa ggggacaacg ccaccttcac ctgcagcttc 180
tccaacacat cggagagctt cgtgctaaac tggtaccgca tgagccccag caaccagacg 240
gacaagctgg ccgccttccc cgaggaccgc agccagcccg gccaggactg ccgcttccgt 300
gtcacacaac tgcccaacgg gcgtgacttc cacatgagcg tggtcagggc ccggcgcaat 360
gacagcggca cctacctctg tggggccatc tccctggccc ccaaggcgca gatcaaagag 420
agcctgcggg cagagctcag ggtgacagag agaagggcag aagtgcccac agcccacccc 480
agcccctcac ccaggccagc cggccagttc caataaatct agagca 526
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttggtgcgga gctcccggga gctccgcgga agacccaggc cgcctcgggt 50
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagttagaca ggcaagcact actcgcctct gcacgcacat gcttgcctgt 50
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgtgggccct ggaaatggcg gacaccttcc tggacaacat gcgggttggg 50
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aacgggttac cggattacgg ggactgtcgg tcacggtccc gccggttctt 50
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctgttgaca attaatcatc ggca 24
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcagcactgt cctgctcctt g 21
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gttgacattg attattgact agtta 25
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cctgctattg tcttcccaat c 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtgacttcca catgagcgtg 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cctgctattg tcttcccaat c 21
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gctcctgcca tcgtctctcc ggaga 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggccgagacg agcgagttag acagg 25
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gatccagcct ccggactcta g 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tagaaggcac agtcgaggct g 21
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgccttcccg caggaggaac 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctggctcatc tcgagagcca 20
Claims (10)
1.一种重组单纯疱疹病毒，其特征在于，所述重组单纯疱疹病毒缺失ICP34.5基因和ICP47基因，且在缺失的所述ICP34.5基因的位点与缺失的所述ICP47基因的位点上均插入有可溶性PD-1片段。
2.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其特征在于，所述可溶性PD-1片段的序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其特征在于，所述重组单纯疱疹病毒的保藏号为CCTCC NO：V201863。
4.一种重组载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
以p galk载体为模板，采用第一同源臂引物对进行PCR扩增，得到ΔICP34.5-galk片段；将所述ΔICP34.5-galk片段转入感受态的第一重组菌中，进行galk正筛选，得到第二重组菌，所述ΔICP34.5-galk片段含有依次连接的ICP34.5基因上游侧翼区序列、galk表达盒及ICP34.5基因下游侧翼区序列，所述第一重组菌中含有携带HSV-1病毒基因组的载体，所述第二重组菌缺失ICP34.5基因，且缺失的所述ICP34.5基因的位点上插入有所述ΔICP34.5-galk片段；
以含有可溶性PD-1表达盒的载体为模板，采用第二同源臂引物对进行PCR扩增，得到ΔICP34.5-hsPD-1片段，将所述ΔICP34.5-hsPD-1片段转入感受态的所述第二重组菌中，进行galk负筛选，得到第三重组菌，所述ΔICP34.5-hsPD-1片段含有依次连接的所述ICP34.5基因上游侧翼区序列、所述可溶性PD-1表达盒及所述ICP34.5基因下游侧翼区序列，所述第三重组菌缺失所述ΔICP34.5-galk片段，且缺失的所述ΔICP34.5-galk片段的位点上插入有所述ΔICP34.5-hsPD-1片段；
以所述p galk载体为模板，采用第三同源臂引物对进行PCR扩增，得到ΔICP47-galk片段，将所述ΔICP47-galk片段转入感受态的所述第三重组菌中，进行galk正筛选，得到第四重组菌，所述ΔICP47-galk片段含有依次连接的ICP47上游侧翼区序列、所述galk表达盒及ICP47基因下游侧翼区序列，所述第四重组菌缺失ICP47基因，且缺失的所述ICP47基因的位点上插入有所述ΔICP47-galk片段；及
以所述含有可溶性PD-1表达盒的载体为模板，采用第四同源臂引物对进行PCR扩增，得到ΔICP47-hsPD-1片段，将所述ΔICP47-hsPD-1片段转入感受态的所述第四重组菌中，进行galk负筛选，得到重组载体，所述ΔICP47-hsPD-1片段含有依次连接的所述ICP47基因上游侧翼区序列、所述可溶性PD-1表达盒及所述ICP47基因下游侧翼区序列，所述重组载体缺失所述ΔICP47-galk片段，且缺失的所述ΔICP47-galk片段的位点上插入有所述ΔICP47-hsPD-1片段。
5.根据权利要求4所述的重组载体的构建方法，其特征在于，所述可溶性PD-1表达盒含有可溶性PD-1片段，所述可溶性PD-1片段的序列如SEQ ID No.1所示；
及/或，所述第一重组菌的保藏号为CCTCC NO：M2018944。
6.根据权利要求4所述的重组载体的构建方法，其特征在于，所述第一同源臂引物对包括第一同源臂正向引物与第一同源臂反向引物，所述第一同源臂正向引物从5’端到3’端包括所述ICP34.5基因上游侧翼区序列和第一正向引物，所述第一同源臂反向引物从5’端到3’端包括所述ICP34.5基因下游侧翼区序列和第一反向引物，所述第一正向引物与所述第一反向引物用于扩增所述galk表达盒；
及/或，所述第二同源臂引物对包括第二同源臂正向引物与第二同源臂反向引物，所述第二同源臂正向引物从5’端到3’端包括所述ICP34.5基因上游侧翼区序列和第二正向引物，所述第二同源臂反向引物从5’端到3’端包括所述ICP34.5基因下游侧翼区序列和第二反向引物，所述第二正向引物与所述第二反向引物用于扩增所述可溶性PD-1表达盒；
及/或，所述第三同源臂引物对包括第三同源臂正向引物与第三同源臂反向引物，所述第三同源臂正向引物从5’端到3’端包括所述ICP47基因上游侧翼区序列和第三正向引物，所述第三同源臂反向引物从5’端到3’端包括所述ICP47基因下游侧翼区序列和第三反向引物，所述第三正向引物与所述第三反向引物用于扩增所述galk表达盒；
及/或，所述第四同源臂引物对包括第四同源臂正向引物与第四同源臂反向引物，所述第四同源臂正向引物从5’端到3’端包括所述ICP47基因上游侧翼区序列和第四正向引物，所述第四同源臂反向引物从5’端到3’端包括所述ICP47基因下游侧翼区序列和第四反向引物，所述第四正向引物与所述第四反向引物用于扩增所述可溶性PD-1表达盒。
7.根据权利要求4或6所述的重组载体的构建方法，其特征在于，所述ICP34.5基因上游侧翼区序列如SEQ ID No.2所示，所述ICP34.5基因下游侧翼区序列如SEQ ID No.3所示；
及/或，所述ICP47基因上游侧翼区序列如SEQ ID No.4所示，所述ICP47基因下游侧翼区序列如SEQ ID No.5所示。
8.根据权利要求7所述的重组载体的构建方法，其特征在于，所述第一正向引物的序列如SEQ ID No.6所示，所述第一反向引物的序列如SEQ ID No.7所示；
及/或，所述第二正向引物的序列如SEQ ID No.8所示，所述第二反向引物的序列如SEQID No.9所示。
9.一种重组单纯疱疹病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
根据权利要求4～8任一项所述的重组载体的构建方法构建重组载体；
用所述重组载体转染VERO细胞，培养转染后的所述VERO细胞，裂解并收集上清，得到所述重组单纯疱疹病毒。
10.权利要求1～3任一项所述的重组单纯疱疹病毒、权利要求4～8任一项所述的重组载体的制备方法制备的重组载体或者权利要求9所述的重组单纯疱疹病毒的制备方法制备的重组单纯疱疹病毒在制备增强抗肿瘤免疫反应的药物或者制备肿瘤的药物中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190611 |