CN114075574A

CN114075574A - 构建体、溶瘤病毒及其应用

Info

Publication number: CN114075574A
Application number: CN202010839515.6A
Authority: CN
Inventors: 张旭辉; 颜青青; 何亮亮; 冯翠娟; 陈小锋; 李文佳
Original assignee: Sunshine Lake Pharma Co Ltd
Current assignee: Sunshine Lake Pharma Co Ltd
Priority date: 2020-08-19
Filing date: 2020-08-19
Publication date: 2022-02-22
Also published as: WO2022037020A1

Abstract

本发明涉及一种构建体、溶瘤病毒及其应用。本发明通过将I型单纯疱疹病毒的ICP34.5基因、ICP47基因敲除，并在UL23基因上插入免疫检查点调节因子表达序列，构建得到的重组病毒对肿瘤细胞的敏感性提高。

Description

构建体、溶瘤病毒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和基因治疗领域，具体地，本发明涉及一种构建体、溶瘤病毒以及其制药用途。

背景技术

目前国内外已有多家PD1抗体成功上市，作为一种广谱性的免疫检查点调节因子已经在各种癌症临床前研究中取得巨大成功。但是，在临床试验中，由于肿瘤的异质性，单一PD1抗体疗法适用人群有限，仍有很大部分患者未能从中获益。其中，对黑色素瘤的治疗效果最好，也只有30％多的病人可长期生存。

溶瘤病毒具有良好的抗肿瘤效果，其选择性在肿瘤细胞上复制直接裂解杀伤肿瘤细胞，释放的肿瘤相关抗原通过抗原呈递作用，激活了机体抗肿瘤免疫，达到抑制肿瘤生长甚至肿瘤完全消退的效果。由受感染的肿瘤细胞碎片引起的抗肿瘤免疫响应可通过加入免疫刺激因子而被放大。为了进一步提升溶瘤病毒治疗效果，使病毒在肿瘤细胞上复制的同时表达免疫检查点调节因子或抑制剂，可以阻断肿瘤细胞对免疫系统的抑制途径。

将PD1抗体基因插入溶瘤病毒中，构建新型溶瘤病毒，有助于找到新的肿瘤治疗手段和基因疫苗。

发明内容

本申请旨在至少在一定程度上解决上述背景技术中的技术问题之一。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体的载体来源于HSV，所述构建体携带免疫检查点调节因子基因编码框，所述免疫检查点调节因子基因编码框设置于UL23基因位置。发明人在实验中意外而惊喜发现，当免疫检查点调节因子基因编码框设置于UL23基因位置时，构建体可持续高表达免疫检查点调节因子。

根据本发明的实施例，上述构建体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述构建体的ICP47和双拷贝ICP34.5被敲除，

敲除HSV基因组中的复制非必需基因ICP47，可提高被病毒感染的肿瘤细胞表面MHC-I的表达和细胞抗原呈递的能力；敲除双拷贝ICP34.5，可使单纯疱疹病毒(HSV)在正常细胞内复制受限，选择性地在肿瘤细胞中复制，进而提高HSV病毒地用药安全性。

根据本发明的实施例，所述免疫检查点调节因子基因编码框设置于UL23基因序列的第387-521位核苷酸之间位置。需要说明的是，本申请所述的UL23基因序列编码是以UL23基因起始密码子的第一位核苷酸为第1位进行顺序编码的，UL23基因的序列可参考https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_001806.2？report＝genbank&from＝46609& to＝47803&strand＝true。根据本发明的实施例，免疫检查点调节因子基因编码框设置于UL23基因序列的第387-521位核苷酸之间是通过将UL23基因序列的第388-520位核苷酸敲除，之后将免疫检查点调节因子基因编码框插入UL23基因序列的第387-521位核苷酸之间获得的。

根据本发明的实施例，免疫检查点调节因子基因编码框与启动子可操作地连接，所述启动子包括选自CMV、CAG、EF1α、劳斯肉瘤氏病毒长末端重复序列(RSV LTR)、金属硫蛋白I(MTI)的至少之一。

所述免疫检查点调节因子选自细胞因子、趋化因子、细胞毒性肽、免疫调节多肽、天然受体的可溶结构域、RNAi、反义分子、抗体或蛋白质支架的至少之一。

任选地，所述细胞因子选自白介素(例如IL-2、IL-7、IL-12和IL-15)、干扰素(例如IFNα、IFNβ、IFNγ)、肿瘤坏死因子(例如TNFα、TNFβ)、集落刺激因子(例如GM-CSF)，及其任意组合。

任选地，所述趋化因子选自CCL2、RANTES、CCL7、CCL9、CCL10、CCL12、CCL15、CCL19、CCL21、CCL20、XCL-1，及其任意组合。

任选地，所述细胞毒性肽选自胸苷激酶TK(TK/GCV)、TRAIL、FasL，及其任意组合。

任选地，所述免疫调节多肽选自CD40L、OX40L、可诱导共刺激分子(ICOS)、FTL3L、LIGHT、CD137L、CD70、4-1BB、GITR、CD28，及其任意组合。

任选地，所述抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIGIT抗体、抗BTLA抗体、抗CTLA-4抗体、抗Tim-3抗体、抗Lag-3抗体、抗CD137抗体、抗OX40抗体、抗GITR抗体、抗CD73抗体、抗KIR抗体、抗ICOS抗体、抗CSF1R抗体、抗EGFR抗体、抗VEGFR抗体、抗HER2抗体、抗PDGFR抗体，及其任意组合。

根据本发明的实施例，所述免疫检查点调节因子包含特异性结合PD1的抗体或其结合片段。

根据本发明的实施例，所述启动子为CMV。

根据本发明的实施例，所述抗体为单链抗体scFv-PD1。

经试验验证，当scFv-PD1基因编码框设置于HSV载体的UL23基因位置时，上述构建体可持续高表达scFv-PD1，不仅高选择地在肿瘤细胞内繁殖感染，而且还可具有免疫调节作用，阻断PD1和PD-L1的结合，确保肿瘤细胞被机体自身的免疫反应彻底清除，显现出对肿瘤细胞的高敏感性。

根据本发明的实施例，所述HSV为HSV1或HSV2，或HSV-1/HSV-2嵌合病毒。

其中所述HSV-1选自任何现有HSV毒株，包括F毒株、HF毒株、KOS毒株和17毒株。

根据本发明的实施例，scFv-PD1基因编码框具有如下所示的核苷酸序列，1)SEQID NO:1所示的核苷酸序列；2)与1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的核苷酸序列。

atggaaactgacaccctgctgctgtgggtcctgctgctgtgggtgcctggatccaccggcgatcaggtgcagctggtggagtccggaggaggagtggtgcagccaggcaggagcctgagactggactgcaaggcctccggcatcaccttctctaacagcggaatgcactgggtgaggcaggcacctggcaagggactggagtgggtggccgtgatctggtacgacggctccaagagatactatgccgattctgtgaagggccggttcaccatctctcgcgacaacagcaagaatacactgtttctgcagatgaactctctgagggccgaggataccgccgtgtactattgcgccacaaatgacgattattggggccagggcaccctggtgacagtgagctccggaggaggaggatccggcggaggaggctctggcggcggcggcagcgagatcgtgctgacccagtctccagccacactgtccctgtctcccggcgagagggccacactgagctgtagagccagccagtccgtgtctagctacctggcctggtatcagcagaagccaggacaggcacctaggctgctgatctacgatgcaagcaacagggcaaccggaatcccagcacgcttctctggcagcggctccggcacagactttaccctgacaatctcctctctggagcctgaggatttcgccgtgtactattgtcagcagagctccaattggccacgcacctttggccagggcacaaaggtggagatcaagcaccaccaccaccaccac(SEQ ID NO:1)。

其中，在SEQ ID NO:1中，ggaggaggaggatccggcggaggaggctctggcggcggcggcagc为连接肽linker的核苷酸序列，caccaccaccaccaccac为His-标签的核苷酸序列。

根据本发明的实施例，所述单链抗体scFv-PD1具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的氨基酸序列。

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKHHHHHH(SEQ ID NO:2)。

其中，在SEQ ID NO:2中，QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVI WYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDY WGQGTLVTVSS为重链可变区，GGGGSGGGGSGGGGS为连接肽linker，EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNR ATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK为轻链可变区，HHHHHH为His-标签。

根据本发明的实施例，所述构建体具有如下所示的核苷酸序列，a)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；b)与a)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的核苷酸序列。

cgtccccgaaagctgtccccaatcctcccgccacgacccgccgccctgcagataccgcaccgtattggcaagcagcccgtaaacgcggcgaatcgcggccaGcatagccaggtcaagccgctcgccggggcgctggcgtttggccaggcggtcgatgtgtctgtcctccggaagggcccccaacacgatgtttgtgccgggcaaggtcggcgggatgagggccacgaacgccagcacggcctggggggtcatgctgcccataaggtatcgcgcgTCttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcatggaaactgacaccctgctgctgtgggtcctgctgctgtgggtgcctggatccaccggcgatcaggtgcagctggtggagtccggaggaggagtggtgcagccaggcaggagcctgagactggactgcaaggcctccggcatcaccttctctaacagcggaatgcactgggtgaggcaggcacctggcaagggactggagtgggtggccgtgatctggtacgacggctccaagagatactatgccgattctgtgaagggccggttcaccatctctcgcgacaacagcaagaatacactgtttctgcagatgaactctctgagggccgaggataccgccgtgtactattgcgccacaaatgacgattattggggccagggcaccctggtgacagtgagctccggaggaggaggatccggcggaggaggctctggcggcggcggcagcgagatcgtgctgacccagtctccagccacactgtccctgtctcccggcgagagggccacactgagctgtagagccagccagtccgtgtctagctacctggcctggtatcagcagaagccaggacaggcacctaggctgctgatctacgatgcaagcaacagggcaaccggaatcccagcacgcttctctggcagcggctccggcacagactttaccctgacaatctcctctctggagcctgaggatttcgccgtgtactattgtcagcagagctccaattggccacgcacctttggccagggcacaaaggtggagatcaagcaccaccaccaccaccacTAAgcggccgctcgagtctagagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtGGATCCCCGGGTACCGAGCTCcccattgttatctgggcgcttgtcattaccaccgccgcgtccccggccgatatctcaccctggtcgaggcggtgttgtgtggtgtagatgttcgcgattgtctcggaagcccccagcacctgccagtaagtcatcggctcgggtacgtagacgatatcgtcgcgcgaacccagggcca(SEQ ID NO:3)。

在一些实施例中，所述构建体还可包含一个或多个非必需基因被缺失或突变。优选地，所述非必需基因选自UL3基因，UL4基因，UL14基因，UL16基因，UL21基因，UL24基因，UL31基因，UL32基因，US3基因，UL51基因，UL55基因，UL56基因，US2基因，US12基因(即，ICP47基因)，LAT基因，对应于JQ673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段，及其任何组合；优选地，UL55基因、US2基因、LAT基因和对应于JQ673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段中的一个或多个被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。

在一些实施例中，所述构建体的必需基因未被缺失，且不包含功能丧失性突变；优选地，一个或多个必需基因(例如，ICP27基因、ICP4基因、VP5基因、gL基因、gH基因、gD基因、gK基因、gB基因、gN基因、UL5基因、UL6基因、UL8基因、UL9基因、UL12基因、UL25基因、UL26基因、UL28基因、UL29基因、UL30基因、UL33基因、UL36基因、UL38基因、UL42基因、UL48基因和/或UL52基因)的原生启动子被替换为肿瘤特异性启动子，例如hTERT、CMV、CAG、EF1α、劳斯肉瘤氏病毒长末端重复序列(RSV LTR)、金属硫蛋白I(MTI)、Egr的至少之一。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种溶瘤病毒。

根据本发明的实施例，所述溶瘤病毒携带前面所述的构建体。

现有技术中，相较于野生型病毒，改造后的病毒往往对肿瘤敏感性会明显降低，例如Mckie E A等的研究显示可降低100倍(Mckie E A,Maclean A R,Lewis A D,etal.Selective in vitro replication of herpes simplex virus type 1(HSV-1)ICP34.5 null mutants in primary human CNS tumours--evaluation of apotentially effective clinical therapy.[J].British Journal of Cancer,1996,74(5):745-752.)。

然而，根据本发明实施例的溶瘤病毒，HSV1携带scFv-PD1，不仅增强了病毒株对肿瘤细胞的敏感性，也可通过外源scFv-PD1基因表达scFv-PD1，激活机体抗肿瘤免疫反应。表达scFv-PD1的根据本发明实施例的溶瘤病毒，可通过瘤内注射的方式使病毒在肿瘤复制并在局部持续高表达可结合PD1的抗体，避免通过静脉给药带来的全身性毒副作用。

根据本发明的实施例，所述溶瘤病毒可持续高表达scFv-PD1。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括前面所述的构建体或前面所述的溶瘤病毒。根据本发明的实施例的药物组合物在低剂量就能起效，对于肿瘤细胞杀伤效果佳。

在本发明的第四方面，本发明提出了前面所述的构建体、前面所述的溶瘤病毒或前面所述的药物组合物在制备用于治疗或预防肿瘤的药物中的用途。

根据本发明的实施例，所述药物用于选择性杀伤肿瘤细胞。

优选地，所述细胞为肿瘤细胞，例如肺癌细胞，肝癌细胞，乳腺癌细胞，骨肉瘤细胞，卵巢癌细胞，宫颈癌细胞，前列腺癌细胞，神经胶质瘤细胞，黑色素瘤细胞，结直肠癌细胞，食管癌细胞和胰腺癌细胞。

优选地，所述药物组合物用于治疗肿瘤，例如，肺癌，肝癌，乳腺癌，骨肉瘤，卵巢癌，前列腺癌，神经胶质瘤，黑色素瘤，结直肠癌，食管癌和胰腺癌。

优选地，所述药物组合物为注射液或冻干粉剂。

所述药物组合物以单位剂量形式存在；例如每单位剂量的药物组合物中包含10^2-10^11pfu的重组HSV病毒。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明实施例的pMD18-HOM-scFv-PD1质粒图谱；

图2是根据本发明实施例的构建的重组病毒的PCR凝胶电泳检测图；

图3是根据本发明实施例的构建的重组病毒的测序结构图；

图4是根据本发明实施例的构建的重组病毒的打靶位点的PCR凝胶电泳检测图；

图5是根据本发明实施例的scFv-PD1在Vero细胞中的表达结果图；

图6是根据本发明实施例的24h时HSV1-scFv-hPD1、2K对Fadu肿瘤细胞的抑制曲线；

图7是根据本发明实施例的48h时HSV1-scFv-hPD1、2K对Skmel-28肿瘤细胞的抑制曲线；

图8是根据本发明实施例的24h时HSV1-scFv-hPD1、2K对Hep3B2.1-7肿瘤细胞的抑制曲线。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

需要说明的是，本申请术语“免疫检查点”是指直接或间接参与免疫路径的蛋白质。所述的“免疫检查点调节因子”是指能够以正或负的方式调节免疫检查点蛋白的功能的分子。此术语涵盖能够至少部分地下调抑制性免疫检查点功能的免疫检查点调节因子(拮抗剂)和或能至少部分地上调刺激性免疫检查点功能的免疫检查点调节因子(激动剂)。“免疫检查点调节因子”的实例包括但不限于，多肽、天然受体的可溶结构域、RNAi、反义分子、抗体(例如PD1抗体、PD-L1抗体、CTLA4抗体)或蛋白质支架等等。

本申请所述的“PD1”又称程序性死亡受体1，主要表达于活化的T细胞表面。它与相应受体PD-L1或PD-L2结合后传递负调控信号导致T细胞的免疫应答关闭。多种肿瘤细胞均高表达PD-L1，这些肿瘤细胞通过其表达的PD-L1与T细胞表面的PD1结合，诱导肿瘤特异性T细胞凋亡和免疫无能，最终导致肿瘤细胞逃脱T细胞的免疫监视和杀伤。其中“hPD1”是人来源的PD1或其片段。

本申请所述的“scFv”是指单链抗体，由抗体的重链可变区和轻链可变区通过适当的连接肽linker连接而成的抗体。本申请所述的“scFv-PD1”是指抗PD1的单链抗体。

本申请所述的“scFv-PD1基因编码框”是指能够表达scFv-PD1的核酸序列，也就说，该核酸序列所编码的scFv-PD1区段是能够实现该scFv-PD1功能的区段，或者说，该核酸序列所编码的scFv-PD1区段是scFv-PD1必要功能区。

本申请所述的“ICP47和ICP34.5被敲除”是指ICP47和ICP34.5基因被沉默，这两种基因的表达量相比于未被敲除ICP47和ICP34.5的HSV-1，显著降低。

本申请所述的“UL23基因失活”是指插入失活，也就是说在UL23基因位置插入外源基因后，UL23基因的原有功能丧失。

本申请所述的“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如启动子序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。

以下实施例利用CRISPR/Cas9系统构建重组HSV-1病毒，具体包括重组构建，重组筛选，及病毒鉴定等。重组HSV-1病毒的生物学活性，具体包括scFv-PD1的表达情况，病毒在肿瘤细胞上感染杀伤能力等。

实施例1构建重组单纯疱疹病毒

将编码scFv-hPD1基因序列插入至含UL23基因左右两侧同源臂序列之间，获得pMD18T-HOM-scFv-hPD1质粒，如图1，通过Crisper-Cas9系统在HSV-1/ICP47-/ICP34.5-双敲除KOS病毒株的UL23基因上的LacZ位点替换为治疗性基因scFv-hPD1，构建重组病毒，接下来并用X-gal蓝白斑筛选方法筛选构建成功的病毒。

需要说明的是，由于在病毒的保存和使用过程中，病毒在一些碱基位点会发生变异，本实施例中用到的KOS病毒株相较于野生型KOS病毒株，具有99％的核苷酸序列相似性。

实施例2 HSV-1-UL23-scFv-hPD1重组病毒的筛选纯化

(1)实验材料：

P2代重组病毒2k-HSV-1-UL23-scFv-hPD1(其中，2k表示敲除ICP47和ICP34.5，P2表示病毒代数)。

(2)重组病毒的第三轮筛选纯化

1、Vero细胞铺板(6孔板)

2、病毒感染(6孔板，病毒原液稀释度为5×10⁷)

3、中性红/x-gal染色

4、挑白斑，每孔有1-3个斑

5、vero细胞扩增病毒(24孔板)

6、收取病毒

病毒名称	HSV-1-UL23-scFv-hPD1-mAb-s11-1-1
		挑取p3代病毒斑个数	5

实施例3 HSV-1-UL23-scFv-hPD1重组病毒的PCR验证

对三轮纯化后单一病毒斑HSV-1-UL23-scFv-hPD1进行PCR验证。

实验材料：

P3代重组病毒2k-HSV-1-UL23-scFv-hPD1(S11-1-1-1#、S11-1-1-3#)(其中，2k表示敲除ICP47和ICP34.5，S11表示打靶质粒的代号，1-1是病毒斑的代号，p3表示病毒代数)。(备注：1-1-1和1-1-3为每孔只有一个斑)

1、PCR同源臂外臂

引物为UL23HOM1 left-F2/B48431UL24R；

PCR产物大小：HSV-1-UL23-scFv-hPD1(4873bp)。

引物序列：

UL23HOM1 left-F2	ACCGGAGGGCTGTCGTGCATGGATATCA
		B 48431 UL24 R	ACGAGAACTGCGGTCGTTGTCCTAA

PCR体系：

PCR程序：

98℃，3min；(98℃，10s；60℃，15s；68℃，3min)×35cycles；72℃，5min；12℃，forever。

结果与分析：PCR产物进行凝胶电泳检测，如图2所示，两个p3代重组病毒HSV-1-UL23-scFv-hPD1(S11-1-1-1#、S11-1-1-3#)作为最终筛选出的病毒，分别进行测序，如图3所示，测序验证UL23HOM1以左618bp到UL23HOM2以右500bp序列完整无突变，与p1代结果一致，表明scFv-hPD1已成功插入HSV-1-病毒基因组。

2、PCR打靶位点的LacZ基因

PCR体系：

PCR程序：

98℃，3min；(98℃，10s；60℃，15s；68℃，1min)×35cycles；72℃，5min；12℃，forever。

测序结果与分析：PCR产物进行凝胶电泳检测，如图4所示，表明病毒较纯，未混有含有LacZ基因的病毒。

以下实施例4～5对多轮纯化后单一病毒斑的HSV-1-scFv-PD1进行蛋白表达验证，并评价HSV1-scFv-PD1在不同肿瘤细胞的细胞毒性。

实施例4蛋白表达鉴定

设计时在scFv-hPD1 cDNA前插入了His-tag标签，因此可用抗His-tag抗体与scFv-hPD1结合，用于蛋白表达鉴定。

(1)实验材料：

实验组HSV1-scFv-hPD1指代2K-scFv-hPD1，阴性对照为HSV-1/2K。

(2)Western blot验证：

样品制备：以Vero(非洲绿猴肾细胞)为宿主细胞。

条件如下：HSV1-scFv-hPD1、HSV-1/2K感染MOI(病毒与细胞数量的比值)为0.01，分别在感染Vero细胞后，24、48、72小时收取培养病毒培养上清。胞内蛋白加入RIPA裂解液后，和上清液一起加入蛋白上样缓冲液，98℃加热10分钟后离心待用。

Western blot：将样品加载到12％的PAGE凝胶上进行电泳，待样品跑到凝胶底部后，80V电压60分钟将样品电转到PVDF膜上。转膜完成后，加入5％BSA封闭1-2小时。而后加入His-tag一抗与目的蛋白结合，再加入带HRP标签二抗孵育。最后加入ECL显影液，选择合适曝光时间进行显影。

(3)scFv-hPD1表达结果：

scFv-hPD1在Vero细胞中的表达及分泌结果如图5所示，在HSV1-scFv-hPD1感染Vero细胞24小时后，即开始在Vero细胞中表达scFv-hPD1，并成功分泌到上清中。48小时后上清液中累积的scFv-hPD1浓度相比24小时有所增加。

实施例5HSV1-scFv-hPD1病毒细胞毒性实验

(1)实验材料：HSV1-scFv-hPD1，HSV1/2K，SKOV3(人卵巢癌细胞)；Fadu(人咽鳞癌细胞)；Hep3B2.1-7(人肝癌细胞)；Skmel-28(人黑色素瘤细胞)；Skmel-28(黑色素瘤细胞)。

(2)细胞杀伤验证：以合适的细胞密度接种于96孔培养板，培养过夜后，分别加入7个梯度浓度(MOI＝10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01)的两种病毒，再分别培养24或48小时，依照CCK8试剂盒说明书进行细胞活力的检测。

(3)细胞杀伤结果：

HSV1-scFv-hPD1，HSV-1/2K对不同肿瘤细胞的毒性如表1所示。

HSV1-scFv-hPD1病毒在较低剂量对Skmel-28肿瘤细胞、Fadu肿瘤细胞、Hep3B2.1-7肿瘤细胞均具有良好的杀伤作用，24h时Hep3B2.1-7肿瘤细胞杀伤力明显强于2K病毒。可以得出本发明所构建的重组溶瘤病毒HSV1-scFv-hPD1在肿瘤细胞上的敏感性有所提高，如图6-8所示。

表1：

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东东阳光药业有限公司

<120> 构建体、溶瘤病毒及其应用

<130> PP1184

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 786

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> scFv-PD1基因编码框序列

<400> 1

atggaaactg acaccctgct gctgtgggtc ctgctgctgt gggtgcctgg atccaccggc 60

gatcaggtgc agctggtgga gtccggagga ggagtggtgc agccaggcag gagcctgaga 120

ctggactgca aggcctccgg catcaccttc tctaacagcg gaatgcactg ggtgaggcag 180

gcacctggca agggactgga gtgggtggcc gtgatctggt acgacggctc caagagatac 240

tatgccgatt ctgtgaaggg ccggttcacc atctctcgcg acaacagcaa gaatacactg 300

tttctgcaga tgaactctct gagggccgag gataccgccg tgtactattg cgccacaaat 360

gacgattatt ggggccaggg caccctggtg acagtgagct ccggaggagg aggatccggc 420

ggaggaggct ctggcggcgg cggcagcgag atcgtgctga cccagtctcc agccacactg 480

tccctgtctc ccggcgagag ggccacactg agctgtagag ccagccagtc cgtgtctagc 540

tacctggcct ggtatcagca gaagccagga caggcaccta ggctgctgat ctacgatgca 600

agcaacaggg caaccggaat cccagcacgc ttctctggca gcggctccgg cacagacttt 660

accctgacaa tctcctctct ggagcctgag gatttcgccg tgtactattg tcagcagagc 720

tccaattggc cacgcacctt tggccagggc acaaaggtgg agatcaagca ccaccaccac 780

caccac 786

<210> 2

<211> 241

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> scFv-PD1的氨基酸序列

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

130 135 140

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

145 150 155 160

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

165 170 175

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

180 185 190

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

195 200 205

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg

210 215 220

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys His His His His His

225 230 235 240

His

<210> 3

<211> 2208

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 构建体的核苷酸序列

<400> 3

cgtccccgaa agctgtcccc aatcctcccg ccacgacccg ccgccctgca gataccgcac 60

cgtattggca agcagcccgt aaacgcggcg aatcgcggcc agcatagcca ggtcaagccg 120

ctcgccgggg cgctggcgtt tggccaggcg gtcgatgtgt ctgtcctccg gaagggcccc 180

caacacgatg tttgtgccgg gcaaggtcgg cgggatgagg gccacgaacg ccagcacggc 240

ctggggggtc atgctgccca taaggtatcg cgcgtcttcc attgacgtca atgggtggag 300

tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc 360

cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta 420

tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg 480

cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt 540

ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca 600

aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag 660

gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca ctgcttactg gcttatcgaa 720

attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc atggaaactg acaccctgct 780

gctgtgggtc ctgctgctgt gggtgcctgg atccaccggc gatcaggtgc agctggtgga 840

gtccggagga ggagtggtgc agccaggcag gagcctgaga ctggactgca aggcctccgg 900

catcaccttc tctaacagcg gaatgcactg ggtgaggcag gcacctggca agggactgga 960

gtgggtggcc gtgatctggt acgacggctc caagagatac tatgccgatt ctgtgaaggg 1020

ccggttcacc atctctcgcg acaacagcaa gaatacactg tttctgcaga tgaactctct 1080

gagggccgag gataccgccg tgtactattg cgccacaaat gacgattatt ggggccaggg 1140

caccctggtg acagtgagct ccggaggagg aggatccggc ggaggaggct ctggcggcgg 1200

cggcagcgag atcgtgctga cccagtctcc agccacactg tccctgtctc ccggcgagag 1260

ggccacactg agctgtagag ccagccagtc cgtgtctagc tacctggcct ggtatcagca 1320

gaagccagga caggcaccta ggctgctgat ctacgatgca agcaacaggg caaccggaat 1380

cccagcacgc ttctctggca gcggctccgg cacagacttt accctgacaa tctcctctct 1440

ggagcctgag gatttcgccg tgtactattg tcagcagagc tccaattggc cacgcacctt 1500

tggccagggc acaaaggtgg agatcaagca ccaccaccac caccactaag cggccgctcg 1560

agtctagagg gcccgtttaa acccgctgat cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc 1620

catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg 1680

tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc 1740

tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg 1800

ctggggatgc ggtgggctct atggcttctg aggcggaaag aaccagctgg ggctctaggg 1860

ggtatcccca cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca 1920

gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct 1980

ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtg gatccccggg taccgagctc cccattgtta 2040

tctgggcgct tgtcattacc accgccgcgt ccccggccga tatctcaccc tggtcgaggc 2100

ggtgttgtgt ggtgtagatg ttcgcgattg tctcggaagc ccccagcacc tgccagtaag 2160

tcatcggctc gggtacgtag acgatatcgt cgcgcgaacc cagggcca 2208

Claims

1.一种构建体，其特征在于，所述构建体的载体来源于HSV,所述构建体携带免疫检查点调节因子基因编码框，所述免疫检查点调节因子基因编码框设置于UL23基因位置。

2.根据权利要求1所述的构建体，其特征在于，所述构建体的ICP47和双拷贝的ICP34.5基因被敲除。

3.根据权利要求1所述的构建体，其特征在于，免疫检查点调节因子基因编码框设置于UL23基因序列的第387-521位核苷酸之间位置。

4.根据权利要求1所述的构建体，其特征在于，所述免疫检查点调节因子基因编码框与启动子可操作地连接，所述启动子包括选自CMV、CAG、EF1α、RSV LTR、MTI的至少之一，所述免疫检查点调节因子选自细胞因子、趋化因子、细胞毒性肽、免疫调节多肽、天然受体的可溶结构域、RNAi、反义分子、抗体或蛋白质支架的至少之一。

5.根据权利要求4所述的构建体，其特征在于，所述细胞因子选自白介素(例如IL-2、IL-7、IL-12和IL-15)、干扰素(例如IFNα、IFNβ、IFNγ)、肿瘤坏死因子(例如TNFα、TNFβ)、集落刺激因子(例如GM-CSF)，及其任意组合；所述趋化因子选自CCL2、RANTES、CCL7、CCL9、CCL10、CCL12、CCL15、CCL19、CCL21、CCL20、XCL-1，及其任意组合；所述细胞毒性肽选自胸苷激酶TK(TK/GCV)、TRAIL、FasL，及其任意组合；所述免疫调节多肽选自CD40L、OX40L、可诱导共刺激分子(ICOS)、FTL3L、LIGHT、CD137L、CD70、4-1BB、GITR、CD28，及其任意组合；所述抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIGIT抗体、抗BTLA抗体、抗CTLA-4抗体、抗Tim-3抗体、抗Lag-3抗体、抗CD137抗体、抗OX40抗体、抗GITR抗体、抗CD73抗体、抗KIR抗体、抗ICOS抗体、抗CSF1R抗体、抗EGFR抗体、抗VEGFR抗体、抗HER2抗体、抗PDGFR抗体，及其任意组合。

6.根据权利要求4所述的构建体，所述免疫检查点调节因子包含特异性结合PD1的抗体或其结合片段。

7.根据权利要求6所述的构建体，其特征在于，所述抗体为单链抗体scFv-PD1，所述scFv-PD1基因编码框具有如下所示的核苷酸序列，

1)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

2)与1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同源性的核苷酸序列。

8.根据权利要求6所述的构建体，其特征在于，所述构建体具有如下所示的核苷酸序列，

1)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

9.根据权利要求1所述的构建体，其特征在于，所述构建体还具有选自下列的一个或多个特征：

(1)一个或多个非必需基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)；优选地，所述非必需基因选自UL3基因，UL4基因，UL14基因，UL16基因，UL21基因，UL24基因，UL31基因，UL32基因，US3基因，UL51基因，UL55基因，UL56基因，US2基因，US12基因(即，ICP47基因)，LAT基因，对应于JQ673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段，及其任何组合；优选地，UL55基因、US2基因、LAT基因和对应于JQ673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段中的一个或多个被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)；

(2)必需基因未被缺失，且不包含功能丧失性突变；优选地，一个或多个必需基因(例如，ICP27基因、ICP4基因、VP5基因、gL基因、gH基因、gD基因、gK基因、gB基因、gN基因、UL5基因、UL6基因、UL8基因、UL9基因、UL12基因、UL25基因、UL26基因、UL28基因、UL29基因、UL30基因、UL33基因、UL36基因、UL38基因、UL42基因、UL48基因和/或UL52基因)的原生启动子被替换为肿瘤特异性启动子，例如hTERT、CMV、CAG、EF1α、劳斯肉瘤氏病毒长末端重复序列(RSV LTR)、金属硫蛋白I(MTI)、Egr的至少之一。

10.一种溶瘤病毒，其特征在于，携带权利要求1-9任一项所述的构建体。

11.根据权利要求10所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述病毒表达特异性结合PD1的抗体或其结合片段。

12.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1-9任一项所述的构建体或权利要求10-11任一项所述的溶瘤病毒。

13.权利要求1-9任一项所述的构建体、权利要求10-11任一项所述的溶瘤病毒或权利要求12所述的药物组合物在制备用于治疗或预防肿瘤的药物中的用途，任选地，所述药物用于选择性杀伤肿瘤细胞，所述肿瘤为肺癌，肝癌，乳腺癌，骨肉瘤，卵巢癌，前列腺癌，神经胶质瘤，黑色素瘤，结直肠癌，食管癌和胰腺癌。