JP5630769B2 - アポトーシス誘導剤 - Google Patents
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Description
この出願は、その内容の全体が本明細書に援用される、2008年4月11日に出願された米国仮出願第61/044061号に対する利益を主張する。
一態様において、アポトーシス誘導物質は、アポトーシス誘導タンパク質および/またはこれをコードする核酸分子である。
一態様において、アポトーシス誘導タンパク質は、p53ファミリーのタンパク質である。
一態様において、アポトーシス阻害物質は、アポトーシス誘導物質によって誘導される。
一態様において、アポトーシス阻害物質は、細胞周期停止に関与するタンパク質、ユビキチンリガーゼおよびp53ファミリータンパク質のドミナントネガティブ変異体からなる群から選択される。
一態様において、細胞周期停止に関与するタンパク質は、p21、SFN、Gadd45およびp300からなる群から選択される。
一態様において、ユビキチンリガーゼは、MDM2である。
一態様において、アポトーシス阻害物質の発現を阻害する核酸分子は、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマーおよびRNAiエフェクターからなる群から選択される。
一態様において、アポトーシス誘導タンパク質および/またはこれをコードする核酸分子と、アポトーシス阻害物質の発現および/またはの活性を阻害する物質とは、単一物質として存在する。
一態様において、剤、組成物または生成物は、アポトーシス誘導タンパク質をコードする核酸分子と、アポトーシス阻害物質の発現を阻害する核酸分子とを含む単一のベクターまたは単一の核酸構築物として形成される。
一態様において、アポトーシス誘導タンパク質をコードする核酸分子と、アポトーシス阻害物質の発現を阻害する核酸分子とは、単一の一次転写物として発現される。
一態様において、アポトーシス誘導タンパク質をコードする核酸分子と、アポトーシス阻害物質の発現を阻害する核酸分子とは、コシストロニックに発現される。
別の態様において、アポトーシス誘導タンパク質および/またはこれをコードする核酸分子と、アポトーシス阻害物質の発現および/または活性を阻害する物質とは、別々の物質として存在する。
一態様において、剤、組成物または生成物は、増殖性疾患を処置するためのものである。
一態様において、増殖性疾患は、良性腫瘍または悪性腫瘍、過形成、ケロイド、クッシング症候群、原発性アルドステロン症、紅板症、真性多血症、白板症、肥厚性瘢痕、扁平苔癬と黒子症からなる群から選択される。
(a)上記の剤、組成物または生成物を提供すること、および
(b)前記剤、組成物または生成物を細胞内に導入すること
を含む方法を提供する。
一態様において、剤、組成物または生成物は、アポトーシス誘導タンパク質をコードする核酸分子と、アポトーシス阻害物質の発現および/または活性を阻害する核酸分子とを有するベクター、またはアポトーシス誘導タンパク質をコードする核酸分子を有するベクターと、アポトーシス阻害物質の発現および/または活性を阻害する核酸分子を有するベクターとからなる一組のベクターからなる群から選択される。
発現させるタンパク質をコードする核酸分子、および
望まないタンパク質の発現を阻害する核酸分子
を含む核酸構築物を提供する。
一態様において、発現させるタンパク質は、アポトーシス誘導タンパク質である。
一態様において、アポトーシス誘導タンパク質は、p53ファミリーのタンパク質である。
一態様において、望まないタンパク質は、アポトーシス阻害タンパク質である。
一態様において、アポトーシス阻害タンパク質は、細胞周期停止に関与するタンパク質、ユビキチンリガーゼおよびp53ファミリータンパク質のドミナントネガティブ変異体からなる群から選択される。
一態様において、発現させるタンパク質をコードする核酸分子と、望まないタンパク質の発現を阻害する核酸分子とは、同じ制御配列、例えば1または2以上のプロモーターや1または2以上のエンハンサーなどに、作動可能に連結している。
一態様において、発現させるタンパク質をコードする核酸分子と、望まないタンパク質の発現を阻害する核酸分子とは、単一の一次転写産物として発現される。
一態様において、発現されるタンパク質をコードする核酸分子と、望まないタンパク質の発現を阻害する核酸分子とは、コシストロニックに発現される。
別の側面において、本発明は、望まないタンパク質の発現を阻害しながら、細胞内で所望のタンパク質を発現させるための方法であって:
(a)上記の核酸構築物またはベクターを提供すること、および、
(b)前記核酸構築物および/またはベクターを細胞内に導入すること
を含む方法を提供する。
i)前記アポトーシス誘導タンパク質のアミノ酸配列において、1個もしくは2個以上、または1個もしくは数個の変異を有するが、依然アポトーシスを誘導することができるポリペプチド、
ii)前記アポトーシス誘導タンパク質、その相補鎖またはその断片をコードする核酸分子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、アポトーシスを誘導することができるポリペプチド、および、
iii)前記アポトーシス誘導タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%相同であり、アポトーシスを誘導することができるポリペプチド
からなる群から選択されるその機能的変異体を含むものとする。
i)前記アポトーシス誘導タンパク質をコードするヌクレオチド配列において、1個もしくは2個以上、または1個もしくは数個の変異を有するが、依然アポトーシスを誘導することができるポリペプチドをコードする核酸分子、
ii)前記アポトーシス誘導タンパク質をコードする核酸分子、その相補鎖またはその断片とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アポトーシスを誘導することができるポリペプチドをコードする核酸分子、および、
iii)前記アポトーシス誘導タンパク質をコードするヌクレオチド配列と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%相同であり、アポトーシスを誘導することができるポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群から選択されるその機能的変異体を含むものとする。
一態様において、アポトーシス阻害物質の活性を阻害する物質は、限定されずに、アポトーシス阻害物質に結合する物質、例えば、抗体、アポトーシス阻害物質のドミナントネガティブ変異体、アポトーシス阻害物質のアンタゴニスト(例えば、アポトーシス阻害物質の標的やレセプターと結合する物質等)などを含む。
アポトーシス阻害物質の発現および/または活性を阻害する物質の能力は、慣用の手法、例えば、被験物質有りまたは無しでのアポトーシス阻害物質の発現および/または活性を比較することなどによって評価することができ、アポトーシス阻害物質の発現および/または活性が、被験物質の存在下で、被験物質が存在しない場合と比べて増大している場合、当該被験物質はアポトーシス阻害物質の発現および/または活性を阻害する物質とみなされる。
特定のタンパク質のためのmiRNAは、データベースまたはそのアクセッション番号から得たその塩基配列に基づき、InvitrogenからのBLOCK-iT RNAi Designer(https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/)を用いて設計することができる。
i)前記アポトーシス阻害物質の発現を阻害する核酸分子のヌクレオチド配列において、1個もしくは2個以上、または1個もしくは数個の変異を有するが、依然アポトーシス阻害物質の発現を阻害することができる核酸分子、
ii)前記アポトーシス阻害物質の発現を阻害する核酸分子、その相補鎖またはその断片とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アポトーシス阻害物質の発現を阻害することができる核酸分子、および、
iii)前記アポトーシス阻害物質の発現を阻害する核酸分子のヌクレオチド配列と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%相同であり、アポトーシス阻害物質の発現を阻害することができる核酸分子
からなる群から選択されるその機能的変異体を含むものとする。
本発明で用いることのできるビタミンは、限定されずに、VA(レチノール)、VB1(チアミン)、VB2(リボフラビン)、VB3(ナイアシン)、VB5(パントテン酸)、VB6(ピリドキシン)、VB7(ビオチン)、VB9(葉酸)、VB12(シアノコバラミン)、VC(アスコルビン酸)、VD(カルシフェロール)、VE(トコフェロール)およびVK(フィロキノン)、ならびにこれらの誘導体およびアナログを含む。
本発明で用いる遺伝子は1または2以上の遺伝子から構成されてもよく、それが2または3以上の遺伝子から構成される場合、これらの遺伝子は単一の発現ベクターに挿入されてもよいし2または3以上のベクターに別々に挿入されてもよい。
発現ベクターは、ベクターによって形質転換もしくはトランスフェクトされたまたはされていない細胞を同定するために好適な1または2以上のマーカー配列をさらに含んでもよい。マーカーは、例えば、抗生物質または他の化合物に対する耐性もしくは感受性を増大もしくは低減するタンパク質をコードする遺伝子、その活性が当該技術分野で標準的な分析方法により検出可能な酵素(例えばベータガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたはアルカリホスファターゼ)をコードする遺伝子、および形質転換もしくはトランスフェクトされた細胞、宿主、コロニー、またはプラークの表現型に視覚的な影響を与える遺伝子などを含む。好ましい発現ベクターは、自律的な複製、および、ベクターが作動可能に連結しているDNAセグメントに存在する構造遺伝子産物の発現を可能にするベクターである。
本発明の別の側面において、治療有効量のアポトーシス誘導物質と、アポトーシス阻害物質の発現および/または活性を阻害する物質とを、それを必要とする対象に投与する工程を含む、増殖性疾患を処置する方法が提供される。
一態様において、アポトーシス誘導物質と、アポトーシス阻害物質の発現および/または活性を阻害する物質とは、上記で定義した本発明の剤、組成物および生成物のいずれかに含まれている。
投与頻度は、用いる医薬の性状や、上記のような対象の条件によって異なるが、たとえば、1日多数回(すなわち1日2、3、4回または5回以上)、1日1回、数日毎(すなわち2、3、4、5、6、7日毎など)、1週間毎、数週間毎(すなわち2、3、4週間毎など)であってもよい。
発現させるタンパク質をコードする核酸分子、および
望まないタンパク質の発現を阻害する核酸分子
を含む核酸構築物が提供される。
一態様において、発現させるタンパク質は、上記で定義したアポトーシス誘導タンパク質である。一態様において、アポトーシス誘導タンパク質は、好ましくはp53ファミリーのタンパク質である。一態様において、望まないタンパク質は、上記で定義したアポトーシス阻害タンパク質である。一態様において、アポトーシス阻害タンパク質は、上記で定義した、細胞周期停止に関与するタンパク質、ユビキチンリガーゼ、およびp53ファミリータンパク質のドミナントネガティブ変異体からなる群から選択される。一態様において、発現させるタンパク質をコードする核酸分子と、望まないタンパク質の発現を阻害する核酸分子とは、同じ制御配列(例えば、1または2以上のプロモーターおよび1または2以上のエンハンサー等)に、作動可能に連結している。一態様において、発現させるタンパク質をコードする核酸分子と望まないタンパク質の発現を阻害する核酸分子とは、単一の一次転写物として発現される。一態様において、発現させるタンパク質をコードする核酸分子と望まないタンパク質の発現を阻害する核酸分子とは、コシストロニックに発現される。好ましい態様において、核酸分子は、発現が同じプロモーターによって制御されるように、単一の発現カセット内にタンデムに配置してもよい。これらの構成は、いずれか一方の核酸分子のみの発現が有害な作用を有し得る場合に有利である。
発明の別の側面において:
(a)上記で定義した、発現させるタンパク質をコードする核酸分子と、タンパク質の発現を阻害する核酸分子とを含む核酸構築物を含むベクターを提供すること、および
(b)前記ベクターを細胞に導入すること
を含む、望まないタンパク質の発現を阻害しながら、細胞内で所望のタンパク質を発現させる方法が提供される。
細胞培養
ヒト胎児腎臓細胞系HEK293は、理研細胞バンク(筑波、日本)から得た。結直腸癌細胞系DLD−1およびSW480、および肝細胞癌細胞系Hep3Bは米国タイプカルチャーコレクション(Manassas, VA)から購入した。肝細胞癌細胞系HLFは、Health Science Research Resource Bank(大阪、日本)からのものである。HCT116(p53−/−)細胞は、Bert Vogelstein博士(ジョンズホプキンス大学)によって寄贈された。HEK293細胞は、10%ウシ胎仔血清(FCS)加ダルベッコ改変イーグル培地で培養した。SW480細胞は、10%のFCSを含むLeibovitz L-15培地で培養した。他の全ての細胞系は、10%のFCSを含むRPMI−1640培地で培養した。
ヒトp21mRNAの3’非翻訳領域(UTR)を標的とする3種のpre−miRNA配列は、オンラインツールInvitrogen's RNAi Designer(http://www.invitrogen.com)を用いて設計した。作成したpre−miRNA配列は、内因性のマウスmiR−155の模倣物として設計した。3種の異なるp21特異的pre−miRNAおよび対照配列に対応する二本鎖DNAオリゴヌクレオチドを、親ベクターpcDNA6.2-GW/miR(Invitrogen)に個々にクローニングし、pcDNA6.2-miR-p21A、pcDNA6.2-miR-p21B、pcDNA6.2-miR-p21CおよびpcDNA6.2-miR-controlをそれぞれ生成した。
組換えアデノウイルスは、ViraPower Adenoviral Expression System(Invitrogen)を用いて、メーカーの指示に従って作製した。簡潔に述べると、pcDNA6.2-GW/miRベースの各発現ベクターの組換え領域を、トランスファーベクターpDONR221を用いたin vitro組換え反応で、Gateway Vector pAd/CMV/V5-DESTにトランスファーした。このようにしてpAd/CMV/V5-DESTから生成した組換えアデノウイルスプラスミドで、コンピテントDH5α(東洋紡、東京、日本)を形質転換した。選択後、DH5αの単一のクローンを単離し、拡張した。組換えアデノウイルスプラスミドを精製し、次いで293A細胞にトランスフェクトした。293A細胞に十分な細胞変性効果が認められた後、アデノウイルスをAdeno-X Virus Purification Kit(クロンテック、滋賀、日本)を用いて精製した。組換えアデノウイルスAd-p53/miR-21、Ad-p53/miR-control、Ad-mock/miR-p21およびAd-mock/miR-controlが、pcDNA6.2-p53/miR-21、pcDNA6.2-p53/miR-control、pcDNA6.2-miR-p21およびpcDNA6.2-miR-controlからそれぞれ生成された。全ての挿入配列は、ヌクレオチドシーケンシングにより確認した。組換えアデノウイルスの構築に関する詳細情報は、本発明者らから要求に応じて入手可能である。
抗p21(Ab−1)マウスモノクローナル抗体はCalbiochem(Darmstadt, Germany)から購入し、抗アクチンマウスモノクローナル抗体はChemicon(Billerica, MA)からのものであり、抗FLAG M2マウスモノクローナル抗体はSigma-Aldrich(St. Louis, MO)からのものであり、抗p53(DO−1)マウスモノクローナル抗体はSanta Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)からのものであった。全細胞溶解物を、4℃にてRIPAバッファ(150mMのNaCl、1%のNP40、0.5%のデオキシコール酸ナトリウム、0.1%のSDS、50mMのトリスHCl、pH8.0)で抽出した。サンプルをSDS−PAGEで分画し、Immobilon-Pメンブレン(Millipore, Billerica, MA)にトランスファーした。免疫反応性タンパク質を、増強化学発光(ECL)(Amersham, Piscataway, NJ)を用いて検出した。
p53(−/−)HCT116細胞を、ポリ‐L‐リジン(PLL)被覆カバースリップ(旭テクノグラス、船橋、日本)で増殖させた。4%のパラホルムアルデヒドで固定後、細胞を抗FLAGウサギポリクローナル抗体(Sigma-Aldrich)および抗p21マウスモノクローナル抗体(Calbiochem)とともに4℃で一晩インキュベートした。Alexa Fluor488標識ヤギ抗マウスIgGおよびAlexa Fluor594標識ヤギ抗ウサギIgG(Invitrogen)とのインキュベーションの後、カバースリップを蛍光顕微鏡(キーエンス、東京、日本)で調査した。
細胞(1×106)を、6穴プレートに播種した。播種の24時間後、1%FCS添加培地1ml中、10分おきに短く撹拌しながら、細胞を精製ウイルスとともにインキュベートした。フローサイトメトリーのため、感染後の種々の時間に、細胞をトリプシン処理により回収し、遠心分離によってペレット化した。ペレット化した細胞を90%の冷エタノールで固定し、RNアーゼA(500単位/ml)で処理し、次いでヨウ化プロピジウム(50mg/ml)で染色した。サンプルを、FACSCaliburフローサイトメーター(BD Bioscience, San Jose, CA)で分析した。実験は少なくとも3反復し、各サンプルにつき50,000イベントを分析した。データは、FlowJoソフトウェア(Tree Star, Ashland, OR)を用いて分析した。併用治療については、感染の24時間後に、細胞を0.5マイクログラム/mlのドキソルビシンで処理し、次いで24時間に、フローサイトメトリーにより上述のとおりに分析した。
総RNAは、細胞系からTrizol試薬を用いてメーカー(Invitrogen)による指示に従って抽出した。cDNAは、2mgの総RNAによる、SuperScript Preamplification System(Invitrogen)を用いた逆転写によって得た。各PCRは94℃、2分の最初の変性工程と、その後の、94℃で30秒、58℃で30秒および72℃で30秒の30サイクル(miRNA、p21用)および25サイクル(GAPDH用)を伴った。オリゴヌクレオチドプライマー配列は以下のとおりであった:
miRNA:5’−CTTGCTGAAGGCTGTATGC−3’(フォワード、配列番号10)、5’−TGGGCCATTTGTTCCATGTG−3’(リバース、配列番号11),
標的A−B:5’−GGGAAGGGACACACAAGAAGAA−3’(フォワード、配列番号12)、5’−CCATCATATACCCCTAACACAGAGATAA−3’(リバース、配列番号13),
標的C:5’−CACTAACGTTGAGCCCCTGG−3’(フォワード、配列番号14)、5’−CTAGGTGGAGAAACGGGAACC−3’(リバース、配列番号15),
ORF:5’−CTGGAGACTCTCAGGGTCGAA−3’(フォワード、配列番号16)、5’−GATGTAGAGCGGGCCTTTGA−3’(リバース、配列番号17)
GAPDH:5’−ACCACAGTCCATGCCATCAC 3’(フォワード、配列番号18)、5’−TCCACCACCCTGTTGCTGTA−3’(リバース、配列番号19)。
PCR産物は、1.5%アガロースゲル上での電気泳動によって分離した。
カスパーゼ3活性は、カスパーゼ3アッセイキット(Biovision, Mountain View, CA)を用いた比色アッセイにより、メーカーの指示に従って決定した。このキットは、pニトロアニリドで標識された合成テトラペプチドを利用する。簡潔に述べると、細胞を、キットとともに提供された細胞溶解バッファで溶解した。上清を収集し、ジチオスレイトールと基質とを含む反応バッファとともに、37℃でインキュベートした。カスパーゼ3活性を、マイクロプレートリーダーを利用して、405nmでの吸光度の変化を測定することにより決定した。
全ての動物は、特定病原体フリー条件下で維持し、札幌医科大学の動物実験委員会によって定められたガイドラインに従って取り扱った。定着腫瘍を処置する効果を評価するため、24匹の雌性BALB/cヌードマウスに2×106のSW480またはDLD1細胞を両脇腹に皮下注射した(s.c.)。腫瘍サイズが100mm3に達したら、マウスに1×109p.f.u(100マイクロリットルのPBS中)の示したアデノウイルスを、第0日、第1日および第2日の合計3回、直接腫瘍内注射した。各処置群につき3匹のマウスを用いた。マウスにおける腫瘍形成は、4週までモニターした。腫瘍体積は、等式V(mm3)=a×b2/2(式中、「a」は最長径を示し、「b」は垂直直径である)で計算した。
p21mRNAの3’非翻訳領域(UTR)を標的とする3種の異なる人工pre−miRNA配列(miR−p21A、BおよびC)を設計した(図1)。pre−miRNA配列は、内因性のマウスmiR−155の模倣物として設計した。その構造は以下の3つの部分からなる:(i)p21 3’UTRにおける標的部位と完全に相補的な21ヌクレオチドのコア配列、(ii)マウスmiR−155に由来する、ターミナルループを形成するための19ヌクレオチドの配列、および(iii)より効果的なノックダウンをもたらす短い内部ループを形成するために2ヌクレオチド(位置9および10)を取り除いたセンス標的配列。pre−miRNAはプラスミドベクターpcDNA6.2-GW/miRに個々にクローニングし、そこにおいて、作製したpre−miRNAの発現はヒトサイトメガロウイルス(CMV)即時初期プロモーターによって駆動される。
p53および/またはmiR−p21発現プラスミドに基づく複数種のアデノウイルスベクターを作製した。アデノウイルスベクターがプラスミドベクターと同様に機能するか否かを試験するため、p53(−/−)HCT116細胞に、p53のみを発現するアデノウイルス(Ad-p53/miR-control)、または、p53と複数のp21特異的miRNAのクラスターの両方を発現するアデノウイルス(Ad-p53/miR-p21)を感染させた。p53タンパク質レベルは、Ad-p53/miR-controlまたはAd-p53/miR-p21での感染の後、用量依存的に増加した。しかしながら、トランスフェクション実験の結果と同様に、Ad-p53/miR-p21での細胞の感染は、p21誘導の効果的な抑制をもたらした(図8および9)。p53の発現およびp21誘導の抑制はまた、免疫蛍光法染色によっても確認された(図10)。
p53の発現およびp21の抑制のアポトーシスに対するin vitroでの効果がin vivoでの治療効果と相関するか否かを明らかにするために、今回の新規組合わせアデノウイルスベクターの、腫瘍形成の異種移植片モデルにおける活性を検討した。SW480およびDLD1細胞を、ヌードマウスに皮下注射した。腫瘍体積が一定のサイズに達したときに、アデノウイルスを、第0日、第1日および第2日に、腫瘍内に直接注射した(図16、矢印)。調査期間中、Ad-p53/miR-p21を注射したSW480由来の腫瘍およびDLD1由来の腫瘍のいずれも、Ad-p53/miR-controlを注射した腫瘍より体積が小さかった(図16)。また、Ad-mock/miR-p21の注射が、Ad-mock/miR-controlの注射と比較して、SW480由来の腫瘍の腫瘍体積の増大をもたらしたことに注目されたい。これらの結果は、p53の過剰発現がない状態におけるp21の抑制が、ある種のがんにおいて腫瘍進行のリスクを増大させることを示すものであり、効果的で安全ながん治療のためには、腫瘍細胞内で、p21の抑制を、p53の発現と同時に誘導すべきことを示唆している。
Claims (4)
- p53をコードする核酸分子と、p21に対するmiRNAをコードする核酸分子とを含む、単一のベクターまたは単一の核酸構築物。
- 請求項1に記載のベクターまたは核酸構築物を含む、増殖性疾患を処置するための組成物。
- 増殖性疾患が悪性腫瘍である、請求項2に記載の組成物。
- 悪性腫瘍の治療的介入のための、請求項3に記載の組成物。
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