JP4399654B2 - ｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子及びキメラタンパク - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子並びにキメラタンパクに関する。本発明のキメラ遺伝子は、その優れた特性に基づいて悪性腫瘍とくにｐ５３変異ヒト腫瘍の遺伝子治療に有用であり、またｐ５３ファミリー遺伝子の機能分析において有用なツールとなるものと期待される。
【０００２】
【従来の技術】
ｐ５３はＤＮＡ型腫瘍ウイルスＳＶ４０の大型Ｔ抗原と結合する核内タンパクとして発見され、既にその遺伝子（ｐ５３遺伝子）がクローニングされている。当初ｐ５３遺伝子は、ｒａｓ遺伝子と共に細胞に導入することによって胚由来細胞がトランスフォームされることから癌遺伝子と考えられていたが、その後の研究により当初得られたｐ５３遺伝子のクローンは変異型であり、野生型ｐ５３遺伝子はむしろ変異型のトランスフォーム能を抑制することが明らかになった。ｐ５３遺伝子の欠失若しくは異常が多くのヒト癌細胞で検出されており、また高発癌性遺伝病として知られるＬｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｉ症候群においてｐ５３遺伝子の配偶子変異が発見されたこと等から、今ではｐ５３遺伝子は重要な癌抑制遺伝子と考えられるに至っている〔Ｂａｋｅｒ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，２１７−２２１（１９８９）：Ｎｉｇｒｏ，Ｊ．Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２，７０５−７０８（１９８９）〕。
【０００３】
ヒトｐ５３は、３９３個のアミノ酸からなり、大きくＮ末端ドメイン（１〜１０１位）、コアドメイン（１０２〜２９２位）、及びＣ末端ドメイン（２９３〜３９３位）の３領域に分けられる。Ｎ末端ドメインは、１〜４５位に酸性アミノ酸やプロリンを多く含む転写活性化領域（１〜４５位）を有しており、転写の制御に寄与しているものと考えられる。中央のコアドメインは、３カ所の疎水性部位を含むＤＮＡ結合領域を有している（１１３〜２９０位）。またＣ末端ドメインは、四量体形成に必要なオリゴメリゼーション領域（３１９〜３６３位）及びそのＣ末側に塩基性アミノ酸を多く含む領域を有しており、非特異的ＤＮＡ結合やＤＮＡ損傷の認識並びにトランスフォーム抑制などの役目を担っていると考えられている。
【０００４】
ヒト癌細胞に検出されるｐ５３遺伝子の異常の多くがミスセンス変異で、その殆どがＮ末端から１００〜３００アミノ酸の部位に相当するコアドメイン、特に種を越えて保存されたホット・スポット（Ｈｏｔ Ｓｐｏｔ）と称される領域に集中している。かかるコアドメイン中のホット・スポット領域はｐ５３とＤＮＡとの結合に関与する領域であり、実際、当該領域の変異によってＤＮＡとの特異的結合が障害される。
【０００５】
これらのことから、ｐ５３は、他の遺伝子に特異的に結合して当該遺伝子の発現を調節する転写制御因子としての役割をもつことが明らかとなった。
【０００６】
ｐ５３によって転写が誘発される遺伝子の産物としては、ｐ２１〔ＷＡＦ１或いはＣｉｐ１、或いはＳＤＩ１と言われる（ＥＩ−Ｄａｉｒｙ，Ｗ．Ｓ．，ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，７５，８１７（１９９３））〕、ＭＤＭ２（Ｗｕ．Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，７，１１２６（１９９３）、ＭＣＫ（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４５７０（１９９１）：Ｚａｍｂｅｔｔｉ．Ｇ．Ｐ．，ｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，６，１１４３（１９９２））、ＧＡＤＤ４５〔Ｋａｓｔａｎ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，７１，５８７（１９９２）〕、サイクリンＧ〔Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ：Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｋ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１３，４８１６（１９９４）〕、Ｂａｘ〔Ｍｉｙａｓｈｉｔａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８０，２９３（１９９５）〕、及びインスリン様成長因子結合蛋白３〔ＩＧＦ−ＢＰ３：Ｂｕｃｋｂｉｎｄｅｒ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７７，６４６（１９９５）〕などを例示することができる（Ｓａｍｅｓｈｉｍａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，：Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，７，４５１−４５７（１９９２））。
【０００７】
ｐ２１は、サイクリン−サイクリン−依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の阻害タンパクであり、野生型ｐ５３がｐ２１を介して細胞周期を抑制的に調節することが判明している〔Ｈａｒｐｅｒ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，７５，８０５（１９９３）：Ｘｉｏｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６６，７０７（１９９３）：Ｇｕ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６６，７０１（１９９３）〕。またｐ２１遺伝子は、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）に結合して、直接ＤＮＡの複製を抑制することも報告されている〔Ｗａｇａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６９，５７４（１９９４）〕。更にｐ２１遺伝子は、細胞の老化を誘導し、ＤＮＡ合成を抑制する作用を有するＳＤＩ１遺伝子と同一の遺伝子であることが判明している〔Ｎｏｄａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，２１１，９０（１９９４）〕。
【０００８】
ＭＤＭ２は、ｐ５３に結合して該タンパクの転写制御活性を不活性化することから、負のフィードバック調節因子として作用していると推測されている。
【０００９】
ＩＧＦ−ＢＰ３は、ＩＧＦシグナル化の負の調節因子である。このためｐ５３によるＩＧＦ−ＢＰ３遺伝子の増加は、結果としてｐ５３がＩＧＦ依存性細胞の成長抑制を導く可能性を示唆する。
【００１０】
また、野生型ｐ５３は、骨髄性白血病性細胞のアポトーシスを誘導することが報告されている〔Ｙｏｎｉｓｈ−Ｒｏｕａｃｈ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２，３４５（１９９１）〕。放射線照射による胸腺細胞アポトーシスの誘導はｐ５３欠損マウスには起こらず〔Ｌｏｗｅ，Ｓ．Ｗ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２，８４７（１９９３）：Ｃｌａｒｋｅ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２，８４９（１９９３）〕、またｐ５３タンパクは、水晶体、網膜、脳において正常網膜芽腫遺伝子（ＲＢ遺伝子）活性を失っている細胞のアポプティックな死を誘導する〔Ｐａｎ，Ｈ．，ａｎｄ Ｇｒｉｅｐ，Ａ．Ｅ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，８，１２８５（１９９４）：Ｍｏｒｇｅｎｂｅｓｓｅｒ，Ｓ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７１，７２（１９９４）：Ｈｏｗｅｓ，Ｋ．Ａ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，８，１３００（１９９４）：Ｓｙｍｏｎｄｓ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，７８，７０３（１９９４）〕。ホワイト氏は、ｐ５３はＲＢ遺伝子変異の探索に有用であり、またＲＢ遺伝子変異を含む細胞のアポトーシスを誘導するだろうと提言している〔Ｗｈｉｔｅ，Ｅ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７１，２１（１９９４）〕。
【００１１】
また、温度感受性を持つｐ５３遺伝子のみが発現しているマウス赤芽球性白血病細胞系では温度の下降で変異ｐ５３遺伝子が野生型に戻り、アポトーシスを誘導し、そこから取り出した変異ｐ５３遺伝子をｐ５３欠損線維芽細胞系が軟寒天培地内で増殖できる能力を付与する（ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙを与える）〔Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８６：２８４−２９１（１９９５）；Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．９：２６９−２７７〕。
【００１２】
Ｂａｘは、アポトーシスの抑制因子であるＢｃｌ−２に結合することができ、アポプティックな細胞死を促進する〔Ｏｌｔｖａｉ，Ｚ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，７４，６０９（１９９３）〕。ｐ５３によるＢａｘ遺伝子の増加とＢｃｌ−２の減少は、マウス白血病細胞株Ｍ１のアポトーシスに関連しており〔Ｍｉｙａｓｈｉｔａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，９，１７９９（１９９４）〕、またアポトーシスに対するシグナル・トランスデューサーの一つであるＦａｓが、非小細胞肺癌と赤白血病において増加しているという報告がある〔Ｏｗｅｎ−Ｓｃｈａｕｂ，Ｌ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｌ．，１５，３０３２（１９９５）〕。
【００１３】
以上述べてきたような多くの研究により、ｐ５３はｐ２１遺伝子に限らず様々の遺伝子の転写を亢進或いは抑制することが明らかになってきている。また、転写調節機能が欠落した変異型ｐ５３においても、細胞内の他のタンパク質と相互作用してシグナルを伝達する能力やＤＮＡの損傷修復機能があることが示されている。
【００１４】
今までわかっているｐ５３の機能としては、例えば、転写調節機能、他の細胞内蛋白質と結合することによるシグナル伝達機能、ＤＮＡ複製に関するタンパク質複合体の構成要素、ＤＮＡ結合能、エキソヌクレアーゼ活性が挙げられ、これらの機能が複合的に作用する結果、細胞の細胞周期停止、アポトーシス誘導、ＤＮＡ修復、ＤＮＡ複製調節及び分化誘導を引き起こすものと考えられる。
【００１５】
さらにｐ５３の機能は、遺伝子に損傷が生じたときのみに働くわけではなく、例えばウイルス感染、サイトカイン刺激、低酸素状態、ヌクレオチドプールの変化、薬物による代謝異常等の各種のストレスが生体組織に及ぶと、その刺激を引き金として、ｐ５３の量的若しくは質的な変化が起こると言われている。量的・質的調節を受けたｐ５３は、他のタンパク質との相互作用によるシグナル伝達や他の遺伝子の転写制御などの機能を発現し、生体ストレスを受けた生体組織の細胞のＤＮＡを複製調節したり、細胞周期を停止させて細胞を修復したり、アポトーシスによって細胞を排除したり、成いは細胞の分化を促進したりすることで生体組織をストレスから防御するのに寄与していると考えられている〔Ｇａｎｍａｎ，Ｃ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，９，６００−６１１（１９９５）：Ｇｒａｅｂｅｒ，Ｔ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７９，８８−９１（１９９６）：Ｌｉｎｋｅ，Ｓ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１０，９３４−９４７（１９９６）：Ｘｉａｎｇ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１６，６７５３−６７６５（１９９６）〕。
【００１６】
ヒト腫瘍の半数にｐ５３遺伝子の変異が存在することから、近年腫瘍の診断や治療に対して、ｐ５３遺伝子及びそのタンパクの臨床的応用が検討されている。ｐ５３遺伝子の変異部位を特異的に認識するプライマーを用いてＰＣＲを行い、リンパ節や体液中に浸潤した腫瘍細胞を検出する方法は、腫瘍の浸潤範囲或いは再発などを予測するための有効な診断方法となりうる〔Ｈａｙａｓｈｉ，Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３４５，１２５７−１２５９（１９９５）〕。
【００１７】
更にｐ５３には、アポトーシス誘導能があることから、ウイルスベクターを用いて腫瘍細胞に野生型ｐ５３遺伝子を導入する遺伝子治療が米国で行われており、その有効性が報告されている〔Ｒｏｔｈ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，２，９８５−９９１（１９９６）〕。また最近、日本においても数カ所でこのような遺伝子治療が開始されている。
【００１８】
その一方で、ヒト腫瘍の半数以上はｐ５３遺伝子の変異を有しておらず、このことからｐ５３に類似する腫瘍形成抑制機能を有する他のタンパクが存在する可能性が指摘されていた。
【００１９】
このような情況のもと、１９９７年８月、フランスのＣａｐｕｔらのグループによって偶然にもｐ５３遺伝子と高い相同性を有する新規な遺伝子（ｐ７３遺伝子）が発見された〔Ｋａｇｈａｄ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９０，８０９−８１９（１９９７）〕。上記ｐ７３遺伝子の産物であるｐ７３（タンパク）は、ｐ５３と同様に、転写活性化領域（１〜５４位）、ＤＮＡ結合領域（１３１〜３１０位）及びオリゴメリゼーション領域（３４５〜３８０位）の機能的領域を有しており、ｐ５３の各領域との相同性は、転写活性化領域において２９％、ＤＮＡ結合領域において６３％で、オリゴメリゼーション領域において３８％と、ＤＮＡ結合領域で最も高いことが明らかになっている。
【００２０】
その後、ｐ７３には、スプライシングの違いによる２種の分子量のタンパクがあることがわかり、先に見いだされた分子量約７０Ｋのものがｐ７３α、後に見いだされた分子量約５０Ｋのものがｐ７３βと称されている。最近ではさらにｐ７３γ及びｐ７３δと呼ばれる別の大きさのｐ７３も見いだされている。これらのｐ７３のスプライシング変異体は、ｐ７２αのＣ末端側のエキソン間の抜け方が異なっており、ｐ７３βはエキソン１２とエキソン１４の間が抜け、ｐ７３γはエキソン１０とエキソン１２の間が抜け、ｐ７３δはエキソン１０とエキソン１４の間が抜けた形を有している。
【００２１】
ｐ７３の機能については、ｐ５３と同様に、その過剰発現によって神経芽腫細胞株やＳＡＯＳ２細胞（骨肉腫細胞株）の増殖が抑制されること、またｐ７３の一時的な発現によってＳＡＯＳ２細胞とベビー・ハムスターの腎細胞のアポトーシスが促進されるなどが報告されている〔Ｂｒｕｃｅ Ｃｌｕｒｍａｎ ａｎｄＭａｒｋ Ｇｒｏｕｄｉｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ，３８９，１２２−１２３（１９９７）：Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８９，１９１−１９４（１９９７）〕。
【００２２】
かかるｐ７３の発見に続いて、本発明者らは、ヒト骨格筋のｃＤＮＡライブラリーからｐ５３遺伝子に類縁する新規遺伝子（ｐ５１遺伝子）を見いだし、その単離に成功した。ｐ５１にも、ｐ７３と同様にｍＲＮＡスプライシングの違いによる２種類の分子量のタンパクがあり、分子量約５１Ｋの短いほうをｐ５１Ａ、分子量約７０Ｋの長いほうをｐ５１Ｂと名付けた。このｐ５１もまた、ｐ５３及びｐ７３と同様に、転写活性化領域（１〜５９位）、ＤＮＡ結合領域（１４２〜３２１位）及びオリゴメリゼーション領域（ｐ５１Ａ：３５３〜３９７位、ｐ５１Ｂ：３５３〜６４１位）の機能的領域を有している。ｐ５１Ａ、ｐ５３及びｐ７３βの各領域間でのアミノ酸レベルの相同性から、各タンパクともＤＮＡ結合領域で最も相同性が高く、またｐ５１Ａがｐ７３βにより近い構成を有することが明らかになっている（図１参照）（Ｏｓａｄａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，：Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，４，８３９−８４３（１９９８））
さらに本発明者らの研究により、ｐ５１は、ｐ５３と同様に骨肉腫細胞系ＳＡＯＳ−２細胞に対してｐ５３と同程度のコロニー形成抑制能を示すこと、トランスジェニックマウス赤白血病細胞株等に対する実験でアポトーシス誘導作用を示すこと、並びにｐ５３と同様にｐ２１ＷＡＦ１プロモーターが有するｐ５３反応性配列を介してその転写活性能を活性化させる機能を有することが明らかになった（Ｏｓａｄａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，：Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，４，８３９−８４３（１９９８））。
【００２３】
これらのことから、ｐ７３及びｐ５１は、ｐ５３とともにｐ５３ファミリーを形成するｐ５３類縁タンパクと考えられている。また、ｐ７３遺伝子及びｐ５１遺伝子のｐ５３ファミリー遺伝子は、前述するようにいずれもｍＲＮＡのスプライシングに起因する分子量の異なるタンパクを複数種コードすることが分かっており、さらにｐ５１遺伝子からは前述のｐ５１Ａ及びｐ５１Ｂのほかに、ｐ４０（Ｔｒｉｎｋ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，：Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，４，７４７−７４８（１９９８））やｐ６３（Ｙａｎｇ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２，３０５−３１６（１９９８））などが作られることが報告されている。
【００２４】
このことから、ｐ５３、ｐ７３及びｐ５１（及びｐ４０、ｐ６３）とともに、ｐ５３ファミリーを形成するタンパク及びその遺伝子が新たに見いだされることも期待される。
【００２５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、優れた細胞増殖抑制能を発揮し得る新規遺伝子を提供することを目的とする。より詳細には、本発明はｐ５３遺伝子またはそのタンパクよりも有意に優れた特性を有するｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子並びにそのタンパクを提供することを目的とする。
【００２６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らが先に見いだしたｐ５１Ａ及びｐ５１Ｂは、互いに共通するアミノ末端側の４０８アミノ酸残基からなるポリペプチドと、更にそれに続いてｐ５１Ａは追加の４０アミノ酸残基からなるポリペプチド、及びｐ５１Ｂは追加の２３３アミノ酸残基からなるポリペプチドとからなるタンパクである。両者は互いに共通する転写活性化領域及びＤＮＡ結合領域を有しており、Ｃ末端側のアミノ酸配列のみ相違している。これらは、前述の通り、ｐ５３やｐ７３と同様にアポトーシス誘導作用を奏するが、本発明者らのその後の研究により、その転写活性能及びアポトーシス誘導能は互いに相違しており、いずれもｐ５１Ａのほうがｐ５１Ｂよりも強い能力を有することがわかった。
【００２７】
本発明者らは、この相違を明らかにするため、ｐ５３のＮ末端側（転写活性化領域及びＤＮＡ結合領域を含む）とｐ５１Ａ又はｐ５１ＢのＣ末端側（オリゴメリゼーション領域を含む）とからなるｐ５３−ｐ５１Ａおよびｐ５３−ｐ５１Ｂの融合タンパク（キメラタンパク）を発現するキメラ遺伝子構築物を作成し、それを用いて、ｐ５３欠損ＳＡＯＳ−２細胞を用いたＢＡＸ−２プロモーター−ルシフェラーゼアッセイを行ったところ、これらのキメラタンパクは、ｐ５３及びｐ５１Ａ自身の転写活性能の約３０倍に至る強い活性化能を示すことが判明した。これは、ｐ５１Ａ及びｐ５１Ｂのオリゴメリゼーション領域が単に転写抑制に機能するだけでなく、何らかのｐ５３の機能活性に関与していることを示唆するものである。
【００２８】
かかる知見を発端に、本発明者らはさらにｐ５３ファミリーに属するｐ５１、ｐ５３及びｐ７３に由来する転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域を含む種々のキメラタンパクを発現するようにキメラ遺伝子構築物を作成し、それを用いて上記と同様にルシフェラーゼアッセイを行ったところ、期せずして、１）あるキメラは、ｐ５３、ｐ５１及びｐ７３そのものよりも２０倍もの高い転写活性能を示すこと、２）キメラはｐ５３によって転写調節をうける各種の遺伝子（プロモーター）に対して著しく異なった選択性を示すこと、３）あるキメラは、野生型ｐ５３の機能をドミナントネガティブに阻害する変異ｐ５３の作用に強い抵抗性を示し、さらには変異ｐ５３の存在下においてｐ５３よりも５０倍もの強い転写活性能を示すこと、を見いだした。
【００２９】
ｐ５３遺伝子の細胞増殖抑制能、細胞周期におけるＧ１期停止の誘導及びアポトーシス誘導作用などの機能は、ｐ５３反応性配列を介したプロモーターの転写活性能に依存することが分かっている。
【００３０】
このことから、本発明者らは、上記ｐ５３ファミリー遺伝子間における種々のキメラによれば、ｐ５３が有する生物学的機能ないしは生理活性等の特性を向上ないしは改善することができ、ひいては悪性腫瘍等の遺伝子治療への適用において有用であると確信して、またｐ５３ファミリータンパクの機能解析に極めて有用であると確信して、本発明を開発するにいたった。
【００３１】
すなわち、本発明は下記（１）及び（２）に示すｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子である：
（１）下流方向に向けて、ｐ５３ファミリーに属するいずれかのタンパクの転写活性化領域をコードする塩基配列；ｐ５３ファミリーに属するいずれかのタンパクのＤＮＡ結合領域をコードする塩基配列；及びｐ５３ファミリーに属するいずれかのタンパクのオリゴメリゼーション領域をコードする塩基配列を有するｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子（但し、上記転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域の各領域がいずれも同一のタンパクに由来するものを除く）。
（２）下流方向に向けて、ｐ５１、ｐ５３及びｐ７３よりなる群から選択されるいずれかのタンパクの転写活性化領域をコードする塩基配列；ｐ５１、ｐ５３及びｐ７３よりなる群から選択されるいずれかのタンパクのＤＮＡ結合領域をコードする塩基配列；及びｐ５１、ｐ５３及びｐ７３よりなる群から選択されるいずれかのタンパクのオリゴメリゼーション領域をコードする塩基配列を有するｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子（但し、上記転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域の各領域がいずれも同一のタンパクに由来するものを除く）。
【００３２】
さらに本発明は、下記（３）及び（４）に示すｐ５３ファミリーのキメラタンパクである：
（３）ｐ５３ファミリーに属するいずれかのタンパクの転写活性化領域のアミノ酸配列、ｐ５３ファミリーに属するいずれかのタンパクのＤＮＡ結合領域のアミノ酸配列、及びｐ５３ファミリーに属するいずれかのタンパクのオリゴメリゼーション領域のアミノ酸配列を有するｐ５３ファミリーのキメラタンパク（但し、上記転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域の各領域がいずれも同一のタンパクに由来するものを除く）。
（４）ｐ５１、ｐ５３及びｐ７３よりなる群から選択されるいずれかのタンパクの転写活性化領域のアミノ酸配列、ｐ５１、ｐ５３及びｐ７３よりなる群から選択されるいずれかのタンパクのＤＮＡ結合領域のアミノ酸配列、及びｐ５１、ｐ５３及びｐ７３よりなる群から選択されるいずれかのタンパクのオリゴメリゼーション領域のアミノ酸配列を有するｐ５３ファミリーのキメラタンパク（但し、上記転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域の各領域がいずれも同一のタンパクに由来するものを除く）。
【００３３】
なお、本発明において遺伝子（ＤＮＡ）とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各１本鎖のＤＮＡを包含する趣旨であり、またその長さに何ら制限されるものではない。従って、本発明の遺伝子（ＤＮＡ）には、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、及びｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（センス鎖）、並びに該センス鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）、およびそれらの断片のいずれもが含まれる。
【００３４】
以下、本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本、米国及び欧州の三極特許庁）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００３５】
【発明の実施の形態】
（１）ｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子
前述するように、ｐ５３ファミリータンパクは、Ｎ末領域から順に、転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域、及びオリゴメリゼーション領域と称される少なくとも３つの機能的領域を有している。
【００３６】
本発明のキメラ遺伝子は、かかる３つの機能的領域のうち少なくとも１つの領域が、ｐ５３ファミリーに属する個々の異なるタンパクに由来する領域となるように再構成されたキメラタンパクをコードするように構成される。
【００３７】
具体的には、上流から下流に向けて、ｐ５３ファミリーに属するいずれかのタンパクの転写活性化領域をコードする塩基配列、ｐ５３ファミリーに属するいずれかのタンパクのＤＮＡ結合領域をコードする塩基配列、及びｐ５３ファミリーに属するいずれかのタンパクのオリゴメリゼーション領域をコードする塩基配列を有するキメラ遺伝子である。但し、この場合各機能的領域がいずれも同一のタンパクに由来するものは除外される。
【００３８】
本発明において「ｐ５３ファミリー」とは、癌抑制遺伝子であるヒトｐ５３遺伝子及びその遺伝子産物（タンパク）と、構造的特徴並びに生物学的機能や生理機能などの類似性によりひとつの遺伝子ファミリーと認識される一連の関連遺伝子及びそのタンパクを意味するものであり、スプライシング変異体やアレル体（対立遺伝子）をも包含するものである。
【００３９】
また、当該「ｐ５３ファミリー」には、将来、該ファミリーに属するものとして見いだされ得るｐ５３類縁遺伝子及びそのタンパクも包含されるものとする。なお、本明細書において遺伝子とタンパクの別を明確にするために、ｐ５３ファミリー遺伝子及びｐ５３ファミリータンパクという場合がある。
【００４０】
「ｐ５３ファミリー」として、中でも好ましくはｐ５３、ｐ５１、ｐ７３である。
【００４１】
かかるｐ５３、ｐ５１及びｐ７３を例に挙げると、本発明の具体的なキメラ遺伝子は、下流方向に向けて、ｐ５３、ｐ５１及びｐ７３よりなる群から選択されるいずれかのタンパクの転写活性化領域をコードする塩基配列、ｐ５３、ｐ５１及びｐ７３よりなる群から選択されるいずれかのタンパクのＤＮＡ結合領域をコードする塩基配列、及びｐ５３、ｐ５１及びｐ７３よりなる群から選択されるいずれかのタンパクのオリゴメリゼーション領域をコードする塩基配列を有するキメラ遺伝子である。但し、上記各領域がいずれも同一のタンパクに由来するものは除外される。なお、ここでｐ５１及びｐ７３には、いずれも選択的スプライシングによって生じるアイソタイプが含まれる。
【００４２】
より具体的に本発明のキメラ遺伝子としては、例えば表１に示す各種の態様で、転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域の各領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するものを挙げることができる。
【００４３】
【表１】
【００４４】
より詳細には、ｐ５３の転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域は、ｐ５３のアミノ酸配列を示す図２（ｂ）（配列番号５）において、それぞれアミノ酸番号１〜４５位、アミノ酸番号１１３〜２９０位及びアミノ酸番号３１９〜３６３位で特定される。
【００４５】
また、ｐ５１の転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域は、ｐ５１Ａ又はＢのアミノ酸配列を示す配列番号１又は３において、それぞれアミノ酸番号１〜５９位、アミノ酸番号１４２〜３２１位及びアミノ酸番号３５３〜３９７位で特定される。
【００４６】
また、ｐ７３の転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域は、ｐ７３α，β、γ及びδそれぞれのアミノ酸配列を示す図３（ｂ）（配列番号６）、図４（ｂ）（配列番号７）、図５（ｂ）（配列番号８）及び図６（ｂ）（配列番号９）において、それぞれアミノ酸番号１〜５４位、アミノ酸番号１３１〜３１０位及びアミノ酸番号３４５〜３８０位で特定される。
【００４７】
なお、上記の各ｐ５３ファミリーのオリゴメリゼーション領域は、各タンパクのＣ末端位まで延長された領域として特定することもできる。例えば、ｐ５１Ｂのオリゴメリゼーション領域は、ｐ５１Ｂのアミノ酸配列を示す配列番号３において、アミノ酸番号３５３〜６４１位として特定できる。
【００４８】
なお、上記各領域は、前述する特定の位置及びアミノ酸配列によって限定されるものではなく、各アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。その限度として、各領域を種々組み合わせて構築される本発明のキメラタンパクがｐ５３と同等もしくはそれ以上の生理学的活性（生理的機能）を有することが望まれる。ここでｐ５３の機能又は活性としては、細胞における転写調節機能、他の細胞内蛋白質と結合することによるシグナル伝達機能、ＤＮＡ複製に関する蛋白質複合体の構成要素としての働き、ＤＮＡ結合能及びエキソヌクレアーゼ活性等、またこれらの機能が複合的に作用することに発揮される細胞の細胞周期停止機能，アポトーシス誘導作用，ＤＮＡ修復機能，ＤＮＡ複製調節又は分化誘導作用等のいずれかを挙げる子ができる。好ましくは転写活性能または細胞増殖抑制活性である。
【００４９】
アミノ酸配列の改変は、天然において、例えば突然変異や翻訳後の修飾等により生じることもあるが、天然由来の遺伝子に基づいて人為的に改変することもできる。本発明は、このような改変の原因及び手段等を問わず、上記する少なくとも３つの機能的領域を含むキメラタンパクをコードする全てのキメラ遺伝子を包含するものである。
【００５０】
上記の人為的な改変手段としては、例えばサイトスペシフィック・ミュータジェネシス〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３５０，３６７−３８２（１９８７）；同１００，４６８（１９８３）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）；続生化学実験講座１「遺伝子研究法ＩＩ」、日本生化学会編，ｐ１０５（１９８６）〕等の遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法等の化学合成手段〔Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８９，４８０１（１９６７）；同９１，３３５０（１９６９）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５０，１７８（１９６８）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，２２，１８５９（１９８１）；同２４，２４５（１９８３）〕及びそれらの組合せ方法等が例示できる。より具体的には、ＤＮＡの合成は、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法による化学合成によることもでき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用い相補鎖を付加するかによって、化学合成した一本鎖生成物から得ることもできる。
【００５１】
なお、上記各転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域は、連続的又は非連続的を問わず、上流から下流方向にむかって順次配列されていればよい。非連続的に配列されている場合、各領域間のアミノ酸配列は特に制限されず、任意に定めることができるが、ｐ５３、ｐ５１及びｐ７３で代表されるｐ５３ファミリータンパクに由来する配列であるのが好ましく、具体的には、各タンパクの転写活性化領域を含むＮ末端ドメイン、ＤＮＡ結合領域を含むコアドメイン及びオリゴメリゼーション領域を含むＣ末端ドメインからなるキメラタンパクをコードするものを例示することができる。
【００５２】
本発明のキメラ遺伝子のより具体的な態様を例示すれば、図２（ａ）（配列番号１０）に示される塩基配列において塩基番号１〜２９１で特定される塩基配列、配列番号２又は４に示される塩基配列において塩基番号１４５〜５２２で特定される塩基配列、または図３（ａ）（配列番号１１）、図４（ａ）（配列番号１２）、図５（ａ）（配列番号１３）及び図６（ａ）（配列番号１４）に示される塩基配列において塩基番号１〜３４５で特定される塩基配列のいずれかの塩基配列（転写活性化領域をコードする塩基配列）；図２（ａ）（配列番号１０）に示される塩基配列において塩基番号２９２〜９１２で特定される塩基配列、配列番号２又は４に示される塩基配列において塩基番号５２３〜１１４９で特定される塩基配列、または図３（ａ）（配列番号１１）、図４（ａ）（配列番号１２）、図５（ａ）（配列番号１３）及び図６（ａ）（配列番号１４）に示される塩基配列において塩基番号３４６〜９７８で特定される塩基配列のいずれかの塩基配列（ＤＮＡ結合領域をコードする塩基配列）；及び図２（ａ）（配列番号１０）に示される塩基配列において塩基番号９１３〜１１７９で特定される塩基配列、配列番号２に示される塩基配列において塩基番号１１５０〜１４８８で特定される塩基配列、配列番号４に示される塩基配列において塩基番号１１５０〜２０６７で特定される塩基配列、図３（ａ）（配列番号１１）に示される塩基配列において塩基番号９７９〜１９０８で特定される塩基配列、図４（ａ）（配列番号１２）に示される塩基配列において塩基番号９７９〜１４９７で特定される塩基配列、図５（ａ）（配列番号１３）に示される塩基配列において塩基番号９７９〜１４２５で特定される塩基配列または図６（ａ）（配列番号１４）に示される塩基配列において塩基番号９７９〜１２０９で特定される塩基配列のいずれかの塩基配列（オリゴメリゼーション領域をコードする塩基配列）を、下流方向に向かって順に連続的若しくは非連続的に有する遺伝子を例示することができる。但し、上記３つの各領域をコードする塩基配列がいずれも同一のｐ５３ファミリー遺伝子に由来するものは除外される。
【００５３】
これらの塩基配列は、前述の各領域のアミノ酸配列の各アミノ酸残基をコードするコドンの一つの組合せ例でもある。このため、本発明の遺伝子はこれら特定の塩基配列を有する遺伝子に限らず、各アミノ酸残基に対して任意のコドンを組合せ、選択した塩基配列を有することも可能である。コドンの選択は、常法に従うことができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻度等を考慮することができる〔Ｎｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，４３（１９８１）〕。
【００５４】
更に、本発明の遺伝子は、前記の塩基配列と一定の相同性を有する塩基配列からなるものも包含する。かかる遺伝子としては、例えば、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃又は０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃のストリンジェントな条件下で上記塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズする塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。
【００５５】
本発明の遺伝子は、本発明により特定される塩基配列の情報に基づいて、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｄ Ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ」、日本生化学会編（１９８６）等参照〕。
【００５６】
具体的には、ｐ５３ファミリー遺伝子を利用して、例えばＰＣＲ法及び制限酵素処理等の常法に従って、それらの機能的領域を所望の通りに再構成することにより実施することができる。
【００５７】
なお、上記においてｐ５３ファミリー遺伝子が既知のものを利用でき、あるいは公知の配列に基づいて常法に従って調製することができる。例えば、各ｐ５３ファミリーのｃＤＮＡの起源としては、ｐ５３ファミリー遺伝子を発現する各種の細胞、組織やこれらに由来する培養細胞等が例示される。また、これらからの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従って実施することができる。また、ｃＤＮＡライブラリーは市販されてもおり、本発明においてはそれらｃＤＮＡライブラリー、例えばクローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂ．Ｉｎｃ．）等より市販されている各種ｃＤＮＡライブラリー等を用いることもできる。
【００５８】
ｐ５３ファミリー遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。
【００５９】
具体的には、例えばｐ５３ファミリーｃＤＮＡによって産生されるタンパク質に対して、該タンパク質特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｐ５３ファミリーのｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的の塩基配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等やこれらの組合せ等を例示できる。
【００６０】
ここで用いられるプローブとしては、本発明のｐ５３ファミリー遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたＤＮＡ等が一般的に例示できるが、既に取得されたｐ５３ファミリー遺伝子そのものやその断片も良好に利用できる。また、ｐ５３ファミリー遺伝子の塩基配列情報に基づき設定したセンス・プライマー、アンチセンス・プライマーをスクリーニング用プローブとして用いることもできる。
【００６１】
ｐ５３ファミリー遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０（１９８５）〕またはその変法によるＤＮＡ若しくはＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法〔Ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ；実験医学、１２（６），３５（１９９４）〕、特に５’−ＲＡＣＥ法〔Ｍ．Ａ．Ｆｒｏｈｍａｎ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８，８９９８（１９８８）〕等の採用が好適である。
【００６２】
かかるＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーは、ｐ５３ファミリー遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定することができ、これは常法に従って合成できる。尚、増幅させたＤＮＡ若しくはＲＮＡ断片の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法、ハイブリダイゼーション法等によることができる。
【００６３】
上記の方法で得られる本発明のキメラ遺伝子は、例えばジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，７４，５４６３（１９７７）〕やマキサム−ギルバート法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９（１９８０）〕等の常法に従って、また簡便には市販のシークエンスキット等を用いて、その塩基配列を決定することができる。
【００６４】
本発明のキメラ遺伝子は、現在癌抑制遺伝子として位置づけられているｐ５３遺伝子と同様に、癌の遺伝子治療剤として有用である。
【００６５】
本発明のキメラ遺伝子又はその遺伝子産物としては、好ましくはｐ５３遺伝子またはその産物が有する生理学的活性（生理的機能）と同等もしくはそれ以上の活性（機能）を有することによって特徴づけられるものを例示することができる。ここでｐ５３の機能又は活性としては、細胞における転写調節機能、他の細胞内蛋白質と結合することによるシグナル伝達機能、ＤＮＡ複製に関する蛋白質複合体の構成要素としての働き、ＤＮＡ結合能及びエキソヌクレアーゼ活性等、またこれらの機能が複合的に作用することに発揮される細胞の細胞周期停止機能，アポトーシス誘導作用，ＤＮＡ修復機能，ＤＮＡ複製調節又は分化誘導作用等を挙げることができる。
【００６６】
また本発明のキメラ遺伝子又はその遺伝子産物としては、より好ましくは、上記の機能又は活性、具体的にはｐ５３によって転写調節を受ける各種遺伝子への異なった選択性を示すことによって特徴づけられるものを例示することができる。これらは、例えばＢＡＸ２、ＭＤＭ２−Ｐ２、ｐ２１ＷＡＦ１、１４−３−３ｓ及びＲＧＣプロモーターのいずれかへの転写活性能の選択性により特徴づけられる。
【００６７】
さらにまた本発明のキメラ遺伝子又はその遺伝子産物としては、より好ましくは、野生型ｐ５３の上記機能及び活性をドミナントネガティブに阻害する変異ｐ５３の効果（ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ｐ５３）に強い抵抗性を有することによって特徴づけられるものを例示することができる。
【００６８】
これらの本発明のキメラ遺伝子又はその遺伝子産物のより好ましい具体的態様は、後述する実施例において詳述される。
（２）ｐ５３ファミリーのキメラタンパク
従って、本発明は前述するキメラ遺伝子によってコードされるキメラタンパクを提供する。
【００６９】
本発明のキメラタンパクの具体的態様としては、Ｎ端からＣ端方向に向けて、連続的若しくは非連続的に、図２（ｂ）（配列番号５）で示されるアミノ酸番号１〜４５位、配列番号１または３で示されるアミノ酸番号１〜５９位、又は図３（ｂ）（配列番号６）、図４（ｂ）（配列番号７）、図５（ｂ）（配列番号８）及び図６（ｂ）（配列番号９）で示されるアミノ酸番号１〜５４位でのいずれかで特定されるアミノ酸配列（転写活性化領域）；図２（ｂ）（配列番号５）で示されるアミノ酸番号１１３〜２９０位、配列番号１または３で示されるアミノ酸番号１４２〜３２１位、又は図３（ｂ）（配列番号６）、図４（ｂ）（配列番号７）、図５（ｂ）（配列番号８）及び図６（ｂ）（配列番号９）で示されるアミノ酸番号１３１〜３１０位でのいずれかで特定されるアミノ酸配列（ＤＮＡ結合領域）；および図２（ｂ）（配列番号５）で示されるアミノ酸番号３１９〜３６３位、配列番号１のアミノ酸番号３５３〜３９７位、配列番号３で示されるアミノ酸番号３５３〜６４１位、図３（ｂ）（配列番号６）で示されるアミノ酸番号３４５〜６３６位、図４（ｂ）（配列番号７）で示されるアミノ酸番号３４５〜４９９位、図５（ｂ）（配列番号８）で示されるアミノ酸番号３４５〜４７５位または図６（ｂ）（配列番号９）で示されるアミノ酸番号３４５〜４０３位のいずれかで特定されるアミノ酸配列（オリゴメリゼーション領域）を有することで特徴づけられるものを挙げることができる。ただし、本発明のキメラタンパクは、上記特定のアミノ酸配列に限定されず、それらと相同物であればよい。
【００７０】
相同物としては、上記各キメラタンパクのアミノ酸配列において、細胞増殖抑制活性、好ましくはｐ５３の該活性よりも優れた細胞増殖抑制活性を有することを限度として、各アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたものを挙げることができる。
【００７１】
本発明のキメラタンパクは、本発明で提供するアミノ酸配列に基づいて化学合成により、または前述するキメラ遺伝子の配列情報に基づいて常法の遺伝子組換え技術〔例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１３０，６９２（１９８５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８０，５９９０（１９８３）等参照〕に従って調製することができる。
（３）ｐ５３ファミリー・キメラタンパクの製造法及び製造に使用するもの
また本発明は、ｐ５３ファミリー・キメラタンパクの製造方法、並びにその製造に用いられる、例えば上記キメラ遺伝子を含有するベクター、該ベクターによって形質転換された宿主細胞を提供するものである。
【００７２】
該タンパクの製造は、より詳細には、該所望のタンパクをコードする遺伝子が宿主細胞中で発現できるように組換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から所望のタンパクを回収することにより行なわれる。
【００７３】
ここで宿主細胞としては、真核生物及び原核生物のいずれをも用いることができる。
【００７４】
真核生物の細胞には、脊椎動物、酵母等の真核微生物の細胞が含まれる。脊椎動物細胞としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Ｃｅｌｌ，２３，１７５（１９８１）〕、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞及びそれらのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｌ．，ＵＳＡ．，７７，４２１６（１９８０）〕等が通常よく用いられるが、これらに限定される訳ではない。また、真核微生物としては、酵母が一般によく用いられ、中でもサッカロミセス属酵母が有利に利用できる。
【００７５】
原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌が一般によく用いられる。大腸菌のなかでも、特にエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２株等がよく用いられる。
【００７６】
発現ベクターは、本発明のキメラ遺伝子を含んでおり且つ該遺伝子を発現することができるものであれば特に制限されず、一般に宿主細胞との関係から適宜選択される。
【００７７】
宿主細胞として脊椎動物細胞を使用する場合、発現ベクターとしては、通常発現しようとする本発明の遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを使用でき、これは更に必要により複製起点を有していてもよい。該発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ 〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，８５４（１９８１）〕等を例示することができる。
【００７８】
宿主細胞として酵母等の真核微生物の細胞を使用する場合、発現ベクターとしては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモーターを有するｐＡＭ８２〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８０，１（１９８３）〕等を利用でき、本発明のベクターは該プロモーターの上流域に本発明の遺伝子を挿入することによって調製することができる。好適には、原核生物遺伝子と融合した融合ベクターを挙げることができ、該ベクターの具体例としては、例えば分子量２６０００のＧＳＴドメイン（Ｓ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ由来）を有するｐＧＥＸ−２ＴＫやｐＧＥＸ−４Ｔ−２等が例示される。
【００７９】
宿主細胞として原核生物の細胞を使用する場合、発現ベクターとしては、例えば該宿主細胞中で複製可能なプラスミドベクターであって、このベクター中に所望遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ（シヤイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、更にタンパク合成開始に必要な開始コドン（例えばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを挙げることができる。特に大腸菌（例えばエシエリヒア・コリＫ１２株等）を宿主細胞をして用いる場合は、発現ベクターとしては一般にｐＢＲ３２２及びその改良ベクターがよく用いられる。ただしこれらに限定されず公知の各種の菌株及びベクターをも利用できる。なお、上記プロモーターとしては、例えばトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬ／ＰＲプロモーター等を使用できる。
【００８０】
かかる本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入する方法並びにこれによる形質転換方法は、特に限定されず、一般的な各種方法を採用することができる。
【００８１】
また得られる形質転換体は、常法に従い培養でき、該培養により所望のように設計した遺伝子によりコードされる本発明の目的のタンパクが、形質転換体の細胞内、細胞外又は細胞膜上に発現、生産（蓄積、分泌）される。
【００８２】
該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。
【００８３】
斯くして得られる本発明の組換えタンパクは、所望により、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作〔「生化学データーブックＩＩ」、１１７５−１２５９頁、第１版第１刷、１９８０年６月２３日株式会社東京化学同人発行；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５（２５），８２７４（１９８６）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６３，３１３（１９８７）等参照〕により分離、精製できる。
【００８４】
該方法としては、具体的には、通常の再構成処理、タンパク沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せが例示でき、特に好ましい方法としては、本発明のタンパクに対する特異的な抗体を結合させたカラムを利用したアフィニティクロマトグラフィー等を例示することができる。
【００８５】
また、キメラ遺伝子でコードされるアミノ酸配列において、その一部のアミノ酸残基ないしはアミノ酸配列を置換、欠失、付加等により改変する場合には、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス等の前記した各種方法により行うことができる。
【００８６】
本発明のタンパクはまた、本発明によって提供されるアミノ酸配列の情報に基づいて、一般的な化学合成法により製造することができる。該方法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が包含される。
【００８７】
かかるペプチド合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていく所謂ステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含し、本発明ペプチドの合成は、そのいずれによってもよい。
【００８８】
上記ペプチド合成に採用される縮合法も、常法に従うことができ、例えば、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）法、ウッドワード法等を例示できる。
【００８９】
これら各方法に利用できる溶媒も、この種ペプチド縮合反応に使用されることのよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。
【００９０】
尚、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸乃至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第３級ブチルエステル等の低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステル等のアラルキルエステル等として保護することができる。
【００９１】
また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばチロシン残基の水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第３級ブチル基等で保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行なう必要はない。更に、例えばアルギニン残基のグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基等の適当な保護基により保護することができる。
【００９２】
上記保護基を有するアミノ酸、ペプチド及び最終的に得られる本発明タンパク質におけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸等を用いる方法等に従って実施することができる。
【００９３】
斯くして得られる本発明のタンパク質は、前記した各種の方法、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、向流分配法等のペプチド化学の分野で汎用される方法に従って、適宜精製を行なうことができる。
【００９４】
また、本発明のキメラタンパクは、これを有効成分とする医薬品として医薬分野において有用である。
（４）ｐ５３ファミリー・キメラタンパクを含む医薬組成物（医薬製剤）
本発明は前述する本発明のキメラタンパクを有効成分として含む医薬組成物（医薬製剤）に関する。
【００９５】
該タンパクは、その医薬的に許容される塩の態様で配合されていてもよい。かかる塩は当業界で周知の方法により調製され、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウム等の無毒性アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩及びアンモニウム塩等が包含される。更に上記塩には、本発明のタンパクと適当な有機酸ないし無機酸との反応による無毒性酸付加塩も包含される。代表的無毒性酸付加塩としては、例えば塩酸塩、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、硼酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩（トシレート）、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、スルホン酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩及びナプシレート等が例示される。
【００９６】
本発明の医薬組成物は、ｐ５３ファミリー・キメラタンパクを薬学的有効量含むものであればよいが、他成分として、薬学的に許容される無毒性医薬担体ないしは希釈剤と含むことができる。
【００９７】
上記医薬組成物（医薬製剤）に利用できる医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤或は賦形剤等を例示でき、これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択使用される。
【００９８】
また、当該医薬組成物は、通常のタンパク製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤等を適宜配合することもできる。
【００９９】
上記安定化剤としては、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等を例示でき、これらは単独で又は界面活性剤等と組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。
【０１００】
上記Ｌ−アミノ酸としては、特に限定はなくいずれのものをも使用できるが、例えばグリシン、システィン、グルタミン酸等が例示される。
【０１０１】
糖類としても特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類；マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール；ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類；デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等及びそれらの誘導体等を使用できる。
【０１０２】
界面活性剤としても特に限定はなく、イオン性（カチオン性、アニオン性）及び非イオン性界面活性剤のいずれも使用でき、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等を使用できる。
【０１０３】
セルロース誘導体としても特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等を使用できる。
【０１０４】
上記糖類の添加量は、有効成分であるキメラタンパク１μｇ当り約０．０００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０１〜１０ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。界面活性剤の添加量は、有効成分であるキメラタンパク１μｇ当り約０．００００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０００１〜０．０１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。ヒト血清アルブミンの添加量は、有効成分１μｇ当り約０．０００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．００１〜０．１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。アミノ酸は、有効成分１μｇ当り約０．００１〜１０ｍｇ程度とするのが適当である。また、セルロース誘導体の添加量は、有効成分１μｇ当り約０．００００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．００１〜０．１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。
【０１０５】
本発明の医薬組成物中に含まれるキメラタンパクの量は、制限されることなく広い範囲から適宜選択されるが、通常約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。
【０１０６】
また本発明の医薬組成物中には、各種添加剤、例えば緩衝剤、等張化剤、キレート剤等をも添加することができる。
【０１０７】
ここで緩衝剤としては、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸及び／又はそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）等を例示できる。等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等を例示できる。またキレート剤としては、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸等を例示できる。
【０１０８】
本発明の医薬組成物は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥し保存し得る状態にした後、用時水、生埋的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することも可能である。
【０１０９】
本発明の医薬製剤はその投与形態を治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとしては、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれ、これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（注射剤、点滴剤）、経鼻剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、軟膏剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形乃至調製することができる。
【０１１０】
例えば、錠剤の形態に成形するに際しては、上記製剤担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウム等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤；カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム等の崩壊剤：ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド等の界面活性剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、デンプン等の保湿剤；デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を使用できる。
【０１１１】
更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠とすることができ、また二重錠ないしは多層錠とすることもできる。
【０１１２】
丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤；ラミナラン、カンテン等の崩壊剤等を使用できる。
【０１１３】
カプセル剤は、常法に従い通常本発明の有効成分を上記で例示した各種の製剤担体と混合して硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセル等に充填して調製される。
【０１１４】
経口投与用の液体投与形態は、慣用される不活性希釈剤、例えば水、を含む医薬的に許容される溶液、エマルジョン、懸濁液、シロップ、エリキシル等を包含し、更に湿潤剤、乳剤、懸濁剤等の助剤を含ませることができ、これらは常法に従い調製される。
【０１１５】
非経口投与用の液体投与形態は、希釈剤として例えば滅菌水、エチルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及びオリーブ油等といった植物油等を使用し、例えば液体、エマルジョン、懸濁液等の形状を有する注射剤や点滴剤に調製することができる。またこれらの非経口投与剤には、注入投与可能な有機エステル類、例えばオレイン酸エチル等を配合することもでき、更に通常の溶解補助剤、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、分散剤等を添加することもできる。
【０１１６】
滅菌は、例えばバクテリア保留フィルターを通過させる濾過操作、殺菌剤の配合、照射処理及び加熱処理等により実施できる。また、これらは使用直前に滅菌水や適当な滅菌可能媒体に溶解することのできる滅菌固体組成物形態に調製することもできる。
【０１１７】
坐剤や膣剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として、例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン及び半合成グリセライド等を使用できる。
【０１１８】
ペースト、クリーム、ゲル等の軟膏剤の形態に成形するに際しては、希釈剤として、例えば白色ワセリン、パラフイン、グリセリン、セルロース誘導体、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト及びオリーブ油等の植物油等を使用できる。
【０１１９】
経鼻又は舌下投与用組成物は、周知の標準賦形剤を用いて、常法に従い調製することができる。
【０１２０】
尚、本発明の医薬組成物には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬有効成分等を含有させることもできる。
【０１２１】
上記医薬組成物（医薬製剤）の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等に応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤は経口投与され、注射剤は単独で又はブドウ糖やアミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じ単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、坐剤は直腸内投与され、膣剤は膣内投与され、経鼻剤は鼻腔内投与され、舌下剤は口腔内投与され、軟膏剤は経皮的に局所投与される。
【０１２２】
上記医薬組成物中に含有される本発明のキメラタンパクの量及びその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件等に応じて広範囲より適宜選択されるが、一般的には、該投与量は、通常、１日当り体重１ｋｇ当り、約０．０１μｇ〜１０ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度とするのがよく、該製剤は１日に１〜数回に分けて投与することができる。
（５）遺伝子治療
また本発明は、前述する本発明のキメラ遺伝子を利用して行う遺伝子治療法を提供する。該治療法は、例えば変異ｐ５３遺伝子を有するか若しくは野生型（正常）ｐ５３遺伝子を欠損した細胞に、野生型ｐ５３機能以上の機能を供給する方法としてとらえることができる。かかる野生型ｐ５３遺伝子若しくはその遺伝子産物が本来的に有する機能以上の優れた機能を細胞に供給すれば、受容細胞／標的細胞における新生物の増殖を有意に抑制することができる。上記キメラ遺伝子は、当該遺伝子を染色体外に維持するようなベクターまたはプラスミドを用いて目的の細胞に導入することができる。この場合、当該遺伝子は、染色体外から発現される。
【０１２３】
このように変異ｐ５３遺伝子を有するか若しくはｐ５３遺伝子を欠損した細胞に、本発明のキメラ遺伝子を導入して所望の機能を発現させる場合、当該キメラ遺伝子は前述するように特定の塩基配列を有するものである必要はなく、例えば上記キメラ遺伝子の所望機能と実質的に同質な機能を保持する限りにおいて、前記塩基配列の１若しくは複数の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列を有する改変体であることもできる。
【０１２４】
キメラ遺伝子又はその一部分は、細胞に存在する内因的な突然変異体との間で組換えが起こるように突然変異細胞に導入することが好ましい。このような組換えには、ｐ５１遺伝子突然変異が修正される二重組換えの発生が必要とされる。
【０１２５】
かかる組換え及び染色体外維持の双方のための所望遺伝子の導入のためのベクターは、当該分野において既に知られており、本発明ではかかる既知のベクターのいずれもが使用できる。例えば、発現制御エレメントに連結したキメラ遺伝子のコピーを含み、かつ目的の細胞内で当該遺伝子産物を発現できるウイルスベクターまたはプラスミドベクターを挙げることができる。かかるベクターとして、通常前述する発現用ベクターを利用することもできるが、好適には、例えば起源ベクターとして、米国特許第５２５２４７９号明細書及びＰＣＴ国際公開ＷＯ９３／０７２８２号明細書に開示されたベクター（ｐＷＰ−７Ａ、ｐＷＰ−１９、ｐＷＵ−１、ｐＷＰ−８Ａ、ｐＷＰ−２１及び／又はｐＲＳＶＬなど）又はｐＲＣ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を用いて、調製されたベクターを挙げることができる。より好ましくは、後述する各種ウイルス・ベクターである。
【０１２６】
なお、遺伝子導入治療において用いられるベクターに使用されるプロモーターとしては、各種疾患の治療対象となる患部組織に固有のものを好適に利用することができる。
【０１２７】
その具体例としては、例えば、肝臓に対しては、アルブミン、α−フェトプロティン、α１−アンチトリプシン、トランスフェリン、トランススチレンなどを例示できる。結腸に対しては、カルボン酸アンヒドラーゼＩ、カルシノエンブロゲンの抗原などを例示できる。子宮及び胎盤に対しては、エストロゲン、アロマターゼサイトクロームＰ４５０、コレステロール側鎖切断Ｐ４５０、１７アルファーヒドロキシラーゼＰ４５０などを例示できる。
【０１２８】
前立腺に対しては、前立腺抗原、ｇｐ９１−フォックス遺伝子、前立腺特異的カリクレインなどを例示できる。乳房に対しては、ｅｒｂ−Ｂ２、ｅｒｂ−Ｂ３、β−カゼイン、β−ラクトグロビン、乳漿タンパク質などを例示できる。肺に対しては、活性剤タンパク質Ｃウログロブリンなどを例示できる。皮膚に対しては、Ｋ−１４−ケラチン、ヒトケラチン１又は６、ロイクリンなどを例示できる。
【０１２９】
脳に対しては、神経膠繊維質酸性タンパク質、成熟アストロサイト特異タンパク質、ミエリン、チロシンヒドロキシラーゼ膵臓ヴィリン、グルカゴン、ランゲルハンス島アミロイドポリペプチドなどを例示できる。甲状腺に対しては、チログロブリン、カルシトニンなどを例示できる。骨に対しては、α１コラーゲン、オステオカルシン、骨シアログリコプロティンなどを例示できる。腎臓に対してはレニン、肝臓／骨／腎臓アルカリ性ホスフォターゼ、エリスロポエチンなどを、膵臓に対しては、アミラーゼ、ＰＡＰ１などを例示できる。
【０１３０】
なお遺伝子導入用ベクターの製造において、導入される遺伝子（全部又は一部）は、本発明のキメラ遺伝子の塩基配列情報に基づいて、前記の如く、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる。
【０１３１】
かかる遺伝子導入用ベクターの細胞への導入は、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈法、ウイルス形質導入などを始めとする、細胞にＤＮＡを導入する当該分野において既に知られている各種の方法に従って行うことができる。なお、野生型ｐ５１遺伝子で形質転換された細胞は、それ自体単離状態で癌の抑制ないしは癌転移の抑制のための医薬や、治療研究のためのモデル系として利用することも可能である。
【０１３２】
遺伝子治療においては、上記の遺伝子導入用ベクターは、患者の腫瘍部位に局所的にまたは全身的に注射投与することにより患者の腫瘍細胞内に導入することができる。この際全身的投与によれば、他の部位に転移し得るいずれの腫瘍細胞にも到達させることができる。形質導入された遺伝子が各標的腫瘍細胞の染色体内に恒久的に取り込まれない場合には、該投与を定期的に繰り返すことによって達成できる。
【０１３３】
本発明の遺伝子治療方法は、前述する遺伝子導入用の材料（遺伝子導入用ベクター）を直接体内に投与するインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）法と、患者の体内より一旦標的とする細胞を取り出して体外で遺伝子を導入して、その後、該細胞を体内に戻すエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）法の両方の方法を包含する。
【０１３４】
またキメラ遺伝子を直接細胞内に導入し、ＲＮＡ鎖を切断する活性分子であるリボザイムによる遺伝子治療も可能である。
【０１３５】
後述する、キメラ遺伝子若しくはその断片を含有する遺伝子導入用ベクター及び該ベクターによりキメラ遺伝子が導入された細胞を有効成分とする本発明の遺伝子治療剤は、特に癌治療を対象とするものであるが、上記の遺伝子治療（処置）は、癌以外にも遺伝性疾患、ＡＩＤＳのようなウイルス疾患の治療、並びに遺伝子標識をも目的として行うことができる。
【０１３６】
また、遺伝子を導入する標的細胞は、遺伝子治療（処置）の対象により適宜選択することができる。例えば、標的細胞として、癌細胞や腫瘍組織以外に、リンパ球、線維芽細胞、肝細胞、造血幹細胞などの細胞などを挙げることができる。
【０１３７】
上記遺伝子治療における遺伝子導入方法には、ウイルス的導入方法及び非ウイルス的導入方法が含まれる。
【０１３８】
ウイルス的導入方法としては、例えば、キメラ遺伝子が正常細胞に発現する外来遺伝子であることに鑑みて、ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる方法を挙げることができる。その他のウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、ＨＩＶ（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）ベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ，ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター及びエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ，Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）ベクターなどがあげられる。
【０１３９】
非ウイルス的な遺伝子導入方法としては、リン酸カルシウム共沈法；ＤＮＡを封入したリポソームと予め紫外線で遺伝子を破壊した不活性化センダイウイルスを融合させて膜融合リポソームを作成し、細胞膜と直接融合させてＤＮＡを細胞内に導入する膜融合リポソーム法〔Ｋａｔｏ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，２２０７１−２２０７４（１９９１）〕；プラスミドＤＮＡを金でコートして高圧放電によって物理的に細胞内にＤＮＡを導入する方法〔Ｙａｎｇ，Ｎ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７，９５６８−９５７２（１９９０）〕；プラスミドＤＮＡを直接インビボで臓器や腫瘍に注入するネイキッド（ｎａｋｅｄ）ＤＮＡ法〔Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６７（１９９０）〕；多重膜正電荷リポソームに包埋した遺伝子を細胞に導入するカチオニック・リポソーム法〔八木国夫，医学のあゆみ，Ｖｏｌ．１７５，Ｎｏ．．９，６３５−６３７（１９９５）〕；特定細胞のみに遺伝子を導入し、他の細胞に入らないようにするために、目的とする細胞に発現するレセプターに結合するリガンドをＤＮＡと結合させてそれを投与するリガンド−ＤＮＡ複合体法〔Ｆｒｉｎｄｅｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１１，２０２（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９，１９０（１９９５）〕などを使用することができる。
【０１４０】
上記リガンド−ＤＮＡ複合体法には、例えば肝細胞が発現するアシアロ糖タンパクレセプターをターゲットとしてアシアロ糖タンパクをリガンドとして用いる方法〔Ｗｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１４３３８（１９９１）；Ｆｅｒｋｏｌ，ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢＪ．，７，１０８１−１０９１（１９９３）〕や、腫瘍細胞が強く発現しているトランスフェリン・レセプターを標的としてトランスフェリンをリガンドとして用いる方法〔Ｗａｇｎｅｒ ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８７，３４１０（１９９０）〕などが含まれる。
【０１４１】
また本発明で用いられる遺伝子導入法は、上記の如き各種の生物学的及び物理学的な遺伝子導入法を適宜組合せたものであってもよい。該組合せによる方法としては、例えばあるサイズのプラスミドＤＮＡをアデノウイルス・ヘキソンタンパク質に特異的なポリリジン抱合抗体と組合わせる方法を例示できる。該方法によれば、得られる複合体がアデノウイルスベクターに結合し、かくして得られる三分子複合体を細胞に感染させることにより本発明のキメラ遺伝子を導入できる。この方法では、アデノアイルスベクターにカップリングしたＤＮＡが損傷される前に、効率的な結合、内在化及びエンドソーム分解が可能となる。また、前記リポソーム／ＤＮＡ複合体は、直接インビボにて遺伝子導入を媒介できる。
【０１４２】
以下、具体的な遺伝子導入用ウイルスベクターの作成法並びに標的細胞又は標的組織への遺伝子導入法について述べる。
【０１４３】
レトロウイルスベクター・システムは、ウイルスベクターとヘルパー細胞（パッケージング細胞）からなっている。ここでヘルパー細胞は、レトロウイルスの構造タンパク質ｇａｇ（ウイルス粒子内の構造タンパク質）、ｐｏｌ（逆転写酵素）、ｅｎｖ（外被タンパク質）などの遺伝子を予め発現しているが、ウイルス粒子を生成していない細胞を言う。一方、ウイルスベクターは、パッケージングシグナルやＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ）を有しているが、ウイルス複製に必要なｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖなどの構造遺伝子を持っていない。パッケージングシグナルはウイルス粒子のアセンブリーの際にタグとなる配列で、選択遺伝子（ｎｅｏ，ｈｙｇ）とクローニングサイトに組込まれた所望の導入遺伝子（ｐ５１遺伝子またはその断片）がウイルス遺伝子の代りに挿入される。ここで高力価のウイルス粒子を得るにはインサートを可能な限り短くし、パッケージングシグナルをｇａｇ遺伝子の一部を含め広くとることと、ｇａｇ遺伝子のＡＴＧを残さぬようにすることが重要である。
【０１４４】
所望のキメラ遺伝子を組み込んだベクターＤＮＡをヘルパー細胞に移入することによって、ヘルパー細胞が作っているウイルス構造タンパク質によりベクターゲノムＲＮＡがパッケージされてウイルス粒子が形成され、分泌される。組換えウイルスとしてのウイルス粒子は、標的細胞に感染した後、ウイルスゲノムＲＮＡから逆転写されたＤＮＡが細胞核に組み込まれ、ベクター内に挿入された遺伝子が発現する。
【０１４５】
尚、所望のキメラ遺伝子の導入効率を上げる方法として、フイブロネクチンの細胞接着ドメインとヘパリン結合部位と接合セグメントとを含む断片を用いる方法〔Ｈａｎｅｎｂｅｒｇ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ．，２３，７４７（１９９５）〕を採用することもできる。
【０１４６】
なお、上記レトロウイルスベクター・システムにおいて用いられるベクターとしては、例えばマウスの白血病ウイルスを起源とするレトロウイルス〔ＭｃＬａｃｈｌｉｎ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｒｅｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，３８，９１−１３５（１９９０）〕を例示することができる。
【０１４７】
アデノウイルスベクターを利用する方法につき詳述すれば、該アデノウイルスベクターの作成は、バークネル〔Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８，３９−６６（１９９２）〕、瀬戸口康弘ら〔Ｓｅｔｏｇｕｃｈｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８４，２９４６−２９５３（１９９４）〕、鐘カ江裕美ら〔実験医学，１２，２８−３４（１９９４）〕及びケナーら〔Ｋｅｔｎｅｒ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，９１，６１８６−６１９０（１９９４）〕の方法に準じて行うことができる。
【０１４８】
例えば、非増殖性アデノウイルスベクターを作成するには、まずアデノウイルスの初期遺伝子のＥ１及び／又はＥ３遺伝子領域を除去する。次に、目的とする所望の外来遺伝子発現単位（目的とする導入遺伝子、本発明においてはキメラ遺伝子、その遺伝子を転写するためのプロモーター、転写された遺伝子の安定性を賦与するポリＡから構成）及びアデノウイルスゲノムＤＮＡの一部を含むプラスミドベクターと、アデノウイルスゲノムを含むプラスミドとを、例えば２９３細胞に同時にトランスフェクションする。この２者間で相同性組換えを起こさせて、遺伝子発現単位とＥ１とを置換することにより、所望のｐ５１遺伝子を包含する本発明ベクターである非増殖性アデノウイルスベクターを作成することができる。また、コスミドベクターにアデノウイルスゲノムＤＮＡを組み込んで、末端タンパク質を付加した３’側アデノウイルスベクターを作成することもできる。更に組換えアデノウイルスベクターの作成には、ＹＡＣベクターも利用可能である。
【０１４９】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの製造につき概略すると、ＡＡＶはアデノウイルスの培養系に混入してくる小型のウイルスとして発見された。これには、ウイルス複製にヘルパーウイルスを必要とせず宿主細胞内で自律的に増殖するパルボウイルス属と、ヘルパーウイルスを必要とするディペンドウイルス属の存在が確認されている。該ＡＡＶは宿主域が広く、種々の細胞に感染するありふれたウイルスであり、ウイルスゲノムは大きさが４６８０塩基の線状一本鎖ＤＮＡからなり、その両端の１４５塩基がＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）と呼ばれる特徴的な配列を持って存在している。このＩＴＲの部分が複製開始点となり、プライマーの役割をなす。更にウイルス粒子へのパッケージングや宿主細胞の染色体ＤＮＡへの組込みにも、該ＩＴＲが必須となる。また、ウイルスタンパク質に関しては、ゲノムの左半分が非構造タンパク質、即ち複製や転写をつかさどる調節タンパク質のＲｅｐをコードしている。
【０１５０】
組換えＡＡＶの作成は、ＡＡＶが染色体ＤＮＡに組み込まれる性質を利用して行うことができ、かくして所望の遺伝子導入用ベクターが作成できる。この方法は、より詳しくは、まず野生型ＡＡＶの５’と３’の両端のＩＴＲを残し、その間に所望の導入用遺伝子（ヒトｐ５１遺伝子）を挿入したプラスミド（ＡＡＶベクタープラスミド）を作成する。一方、ウイルス複製やウイルス粒子の形成に必要とされるウイルスタンパク質は、別のヘルパープラスミドにより供給させる。この両者の間には共通の塩基配列が存在しないようにし、遺伝子組換えによる野生型ウイルスが出現しないようにする必要がある。その後、両者のプラスミドを例えば２９３細胞へのトランスフェクションにより導入し、さらにヘルパーウイルスとしてアデノウイルス（２９３細胞を用いる場合は非増殖型のものでもよい）を感染させると、非増殖性の所望の組換えＡＡＶが産生される。続いて、この組換えＡＡＶは核内に存在するので、細胞を凍結融解して回収し、混入するアデノウイルスを５６℃加熱により失活させる。更に必要に応じて塩化セシウムを用いる超遠心法により組換えＡＡＶを分離濃縮する。上記のようにして所望の遺伝子導入用の組換えＡＡＶを得ることができる。
【０１５１】
ＨＩＶベクターの作成は、例えば島田らの方法に準じて行うことができる〔Ｓｈｉｍａｄａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８８，１０４３−１０４７（１９９１）〕。
【０１５２】
ＨＩＶウイルスはＣＤ４をレセプターとしヘルパーＴ細胞に特異的に感染するので、その利用によれば、ヒトＣＤ４陽性細胞に特異的に遺伝子導入の可能な組織特異的遺伝子導入ベクターとしてのＨＩＶベクターを作成することができる。該ＨＩＶベクターは、ＡＩＤＳの遺伝子治療に最適といえる。
【０１５３】
組換えＨＩＶベクターの作成は、例えばまずパッケージングプラスミドであるＣＧＰＥをｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖの構造遺伝子とこれらの発現に必要な調節遺伝子（ｔａｔ、ｒｅｖなど）をサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーターとヒトグロビン遺伝子のポリＡシグナル（ｐｏｌｙ Ａ）により発現するように作成する。次にベクタープラスミドＨＸＮを、ＨＩＶの両ＬＴＲの間に、標識遺伝子としてチミジンキナーゼ（ＴＫ）のプロモーターをもつバクテリアのネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏＲ）を挿入し、さらに基本となるプラスミドベクターにＳＶ４０の複製機転を挿入することにより、ＣＯＳ細胞内で効率よく増殖できるように構築できる。これらのパッケージングプラスミドであるＣＧＰＥとベクタープラスミドＨＸＮを同時にＣＯＳ細胞にトランスフェクションさせることにより大量のｎｅｏＲ遺伝子が組み込まれた所望の組換えウイルスを作成し、培養培地中に放出させることができる。
【０１５４】
ＥＢＶベクターの製造は、例えば清水らの方法に準じて行うことができる〔清水則夫ら、細胞工学，１４（３），２８０−２８７（１９９５）〕。
【０１５５】
本発明の遺伝子導入用ＥＢＶベクターの製造につき概略すると、ＥＢウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ：ＥＢＶ）は、１９６４年にエプスタイン（Ｅｐｓｔｅｉｎ）らによりバーキット（Ｂｕｒｋｉｔｔ）リンパ腫由来の培養細胞より分離されたヘルペス科に属するウイルスである〔Ｋｉｅｆｆ，Ｅ．ａｎｄ Ｌｉｅｂｏｗｉｔｚ，Ｄ．：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０，ｐｐ．１８８９−１９２０〕。該ＥＢＶには細胞をトランスフォームする活性があるので、遺伝子導入用ベクターとするためには、このトランスフォーム活性を欠いたウイルスを調製しなければならない。これは次の如くして実施できる。
【０１５６】
即ち、まず、所望の外来遺伝子を組み込む標的ＤＮＡ近傍のＥＢＶゲノムをクローニングする。そこに外来遺伝子のＤＮＡ断片と薬剤耐性遺伝子を組込み、組換えウイルス作製用ベクターとする。次いで適当な制限酵素により切り出された組換えウイルス作製用ベクターをＥＢＶ陽性Ａｋａｔａ細胞にトランスフェクトする。相同組換えにより生じた組換えウイルスは抗表面免疫グロブリン処理によるウイルス産生刺激により野生型ＡｋａｔａＥＢＶとともに回収できる。これをＥＢＶ陰性Ａｋａｔａ細胞に感染し、薬剤存在下で耐性株を選択することにより、野生型ＥＢＶが共存しない所望の組換えウイルスのみが感染したＡｋａｔａ細胞を得ることができる。さらに組換えウイルス感染Ａｋａｔａ細胞にウイルス活性を誘導することにより、目的とする大量の組換えウイルスベクターを産生することができる。
【０１５７】
組換えウイルスベクターを用いることなく所望の遺伝子を標的細胞に導入する、非ウイルスベクターの製造は、例えば膜融合リポソームによる遺伝子導入法により実施することができる。これは膜リポソーム（脂質二重膜からなる小胞）に細胞膜への融合活性をもたせることにより、リポソームの内容物を直接細胞内に導入する方法である。
【０１５８】
上記膜融合リポソームによる遺伝子の導入は、例えば中西らの方法によって行うことができる〔Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．，１５９，３９９−４９９（１９８５）；Ｎａｏ．ｋａｎｉｓｈｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ａｎｉｍａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｉｎ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（ｅｄ．ｂｙＬｅｅ，Ｖ．Ｈ．ｅｔａｌ．）．，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｇｍｂｈ．Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９５，ｐｐ．３３７−３４９〕。
【０１５９】
以下、該膜融合リポソームによる遺伝子の導入法につき概略する。即ち、紫外線で遺伝子を不活性化したセンダイウイルスと所望の遺伝子やタンパク質などの高分子物質を封入したリポソームを３７℃で融合させる。この膜融合リポソームは、内側にリポソーム由来の空洞を、外側にウイルス・エンベロープと同じスパイクがある疑似ウイルスともよばれる構造を有している。更にショ糖密度勾配遠心法で精製後、標的とする培養細胞又は組織細胞に対して膜融合リポソームを４℃で吸着させる。次いで３７℃にするとリポソームの内容物が細胞に導入され、所望の遺伝子を標的細胞に導入できる。ここでリポソームとして用いられる脂質としては、５０％（モル比）コレステロールとレシチン及び陰電荷をもつ合成リン脂質で、直径３００ｎｍの１枚膜リポソームを作製して使用するのが好ましい。
【０１６０】
また、別のリポソームを用いて遺伝子を標的細胞に導入する方法としては、カチオニック・リポソームによる遺伝子導入法を挙げることができる。該方法は、八木らの方法に準じて実施できる〔Ｙａｇｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．，１９６，１０４２−１０４８（１９９３）〕。この方法は、プラスミドも細胞も負に荷電していることに着目して、リポソーム膜の内外両面に正の電荷を与え、静電気によりプラスミドの取り込みを増加させ、細胞との相互作用を高めようとするものである。ここで用いられるリポソームは正荷電を有する多重膜の大きなリポソーム（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ ｌａｒｇｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ＭＬＶ）が有用であるが、大きな１枚膜リポソーム（ｌａｒｇｅ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ＬＵＶ）や小さな１枚膜リポソーム（ｓｍａｌｌ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ＳＵＶ）を使用してプラスミドとの複合体を作製し、所望の遺伝子を導入することも可能である。
【０１６１】
プラスミト包埋カチオニックＭＬＶの調製法について概略すると、これはまず脂質ＴＭＡＧ（Ｎ−（α−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏａｃｅｔｙｌ）−ｄｉｄｏｄｅｃｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＤＬＰＣ（ｄｉｌａｕｒｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）及びＤＯＰＥ（ｄｉｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）をモル比が１：２：２となる割合で含むクロロホルム溶液（脂質濃度として１ｍＭ）を調製する。次いで総量１μｍｏｌの脂質をスピッツ型試験管に入れ、ロータリーエバポレーターでクロロホルムを減圧除去して脂質薄膜を調製する。更に減圧下にクロロホルムを完全に除去し、乾燥させる。次いで２０μｇの遺伝子導入用プラスミドを含む０．５ｍｌのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩液−Ｍｇ，Ｃａ含有を添加し、窒素ガス置換後、２分間ボルテックスミキサーにより攪袢して、所望の遺伝子を含有するプラスミド包埋カチオニックＭＬＶ懸濁液を得ることができる。
【０１６２】
上記で得られたプラスミド包埋カチオニックＭＬＶを遺伝子治療剤として使用する一例としては、例えば発現目的遺伝子のｃＤＮＡを組み込んだ発現プラスミドを上記カチオニックＭＬＶにＤＮＡ量として０．６μｇ、リポソーム脂質量として３０ｎｍｏｌになるように包埋し、これを２μｌのリン酸緩衝生理食塩液に懸濁させて患者より抽出した標的細胞または患者組織に対して隔日投与する方法が例示できる。
【０１６３】
ところで、遺伝子治療とは「疾病の治療を目的として、遺伝子または遺伝子を導入した細胞をヒトの体内に投与すること」と日本国の厚生省ガイドラインに定義されている。これに基づいて、本発明における遺伝子治療とは、癌を始めとする各種疾患の治療並びに処置を目的として、前述の本発明のキメラ遺伝子または該遺伝子を導入した標的細胞若しくは標的組織をヒト体内に投与することを包含する。
【０１６４】
本発明の遺伝子治療において、所望遺伝子の標的細胞または標的組織への導入方法には、代表的には２種類の方法が含まれる。
【０１６５】
その第１法は、治療対象とする患者から標的細胞を採取した後、該細胞を体外で例えばインターロイキン−２（ＩＬ−２）などの添加の下で培養し、レトロウイルスベクターに含まれる目的とするキメラ遺伝子を導入した後、得られる細胞を再移植する手法（ｅｘ ｖｉｖｏ法）である。該方法はＡＤＡ欠損症を始め、欠陥遺伝子によって発生する遺伝子病や癌、ＡＩＤＳなどの治療に好適である。
【０１６６】
第２法は、キメラ遺伝子を直接患者の体内や腫瘍組織などの標的部位に注入する遺伝子直接導入法（直接法）である。
【０１６７】
上記遺伝子治療の第１法は、より詳しくは、例えば次のようにして実施される。即ち、患者から採取した単核細胞を血液分離装置を用いて単球から分取し、分取細胞をＩＬ−２の存在下にＡＩＭ−Ｖ培地などの適当な培地で７２時間程度培養し、導入すべきキメラ遺伝子を含有するベクターを加える。遺伝子の導入効率をあげるために、プロタミン存在下に３２℃で１時間、２５００回転にて遠心分離した後、３７℃で１０％炭酸ガス条件下で２４時間培養してもよい。この操作を数回繰り返した後、更にＩＬ−２存在下にＡＩＭ−Ｖ培地などで４８時間培養し、細胞を生理食塩水で洗浄し、生細胞数を算定し、遺伝子導入効率を前記ｉｎｓｉｔｕＰＣＲや、例えば所望の対象が酵素活性であればその活性の程度を測定することにより、目的遺伝子導入効果を確認する。
【０１６８】
また、培養細胞中の細菌・真菌培養、マイコプラズマの感染の有無、エンドトキシンの検索などの安全度のチェックを行い、安全性を確認した後、予測される効果用量のキメラ遺伝子が導入された培養細胞を患者に点滴静注により戻す。かかる方法を例えば数週間から数カ月間隔で繰り返することにより遺伝子治療が施される。
【０１６９】
ここでウイルスベクターの投与量は、導入する標的細胞により適宜選択される。通常、ウイルス価として、例えば標的細胞１×１０８細胞に対して１×１０３ｃｆｕから１×１０８ｃｆｕの範囲となる投与量を採用することが好ましい。
【０１７０】
上記第１法の別法として、キメラ遺伝子を含有するレトロウイルスベクターが導入されたウイルス産生細胞と例えば患者の細胞とを共培養して、目的とする細胞へキメラ遺伝子を導入する方法を採用することもできる。
【０１７１】
遺伝子治療の第２法（直接法）の実施に当たっては、特に体外における予備実験によって、遺伝子導入により実際に目的のキメラ遺伝子が導入されるか否かを、予めベクター遺伝子ｃＤＮＡのＰＣＲ法による検索やｉｎ ｓｉｔｕＰＣＲ法によって確認するか、或いはキメラ遺伝子の導入に基づく所望の治療効果である特異的活性の上昇や標的細胞の増殖増加や増殖抑制などを確認することが望ましい。また、ウイルスベクターを用いる場合は、増殖性レトロウイルスなどの検索をＰＣＲ法で行うか、逆転写酵素活性を測定するか、或は膜タンパク（ｅｎｖ）遺伝子をＰＣＲ法でモニターするなどにより、遺伝子治療に際して遺伝子導入による安全性を確認することが重要であることはいうまでもない。
【０１７２】
本発明の遺伝子治療法において、特に癌や悪性腫瘍を対象とする場合は、患者から癌細胞を採取後、酵素処理などを施して培養細胞を樹立した後、例えばレトロウイルスにて所望の遺伝子を標的癌細胞に導入し、Ｇ４１８細胞にてスクリーニングした後、ＩＬ−１２などの発現量を測定（ｉｎ ｖｉｖｏ）測定し、次いで放射線処理を施行し、患者腫瘍内または傍腫瘍に接種する癌治療法を一例として挙げることができる。
【０１７３】
ヘルペス単体ウイルスーチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子は、特にヌクレオチドアナログであるガンシクロビル（ＧＣＶ）を毒性中間体に転換して、分裂性細胞の死をもたらすことが報告され、該遺伝子を腫瘍に対して用いる遺伝子治療が知られている〔米国特許第５６３１２３６号明細書；特表平９−５０４７８４号公報参照〕。該方法は自殺遺伝子といわれる前記ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を組み込んだレトロウイルスベクター産生細胞を注入して１週間後に抗ウイルス剤として知られているＧＣＶを投与すると、遺伝子導入細胞ではＧＣＶがリン酸化を受けて活性化されて遺伝子導入細胞を自殺に導くと同時に、ギャップ・ジャンクションを介した細胞接触により、周囲の非導入細胞にも細胞死をもたらすことを利用した遺伝子治療法である。本発明の遺伝子導入ベクターもしくは該ベクターを含む細胞は、上記遺伝子療法にも利用することができる。
【０１７４】
別の遺伝子治療法としては、標的細胞表面に結合する抗体を結合させたキメラ遺伝子含有イムノリポゾームを作製し、包埋したｃＤＮＡを選択的に効率よく標的細胞に導入させる方法があげられる。また、前記したサイトカイン遺伝子含有ウイルスベクターと自殺遺伝子含有アデノウイルスとを同時に投与する結合遺伝子療法も可能である。これらの方法は当該分野における当業者の技術レベルある。
（６）遺伝子治療用医薬組成物（遺伝子治療剤）
本発明はまた、本発明の遺伝子導入用ベクター又は目的のキメラ遺伝子が導入された細胞を有効成分とし、それを薬学的有効量、適当な無毒性医薬担体ないしは希釈剤と共に含有する医薬組成物又は医薬製剤（遺伝子治療剤）を提供する。
【０１７５】
本発明の医薬組成物に利用できる医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤ないし賦形剤などを例示でき、これらは製剤の投与形態に応じて適宜選択使用できる。
【０１７６】
本発明の医薬製剤の投与形態としては、前記したキメラタンパク製剤の製剤例を同様に挙げることができ、治療目的に応じて各種の形態から適宜選択することができる。
【０１７７】
例えば、本発明の遺伝子導入用ベクターを含む医薬製剤は、該ベクターをリポソームに包埋された形態あるいは所望の遺伝子が包含されるレトロウイルスベクターを含むウイルスによって感染された培養細胞の形態に調製される。
【０１７８】
これらは、リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４）、リンゲル液、細胞内組成液用注射剤中に配合した形態などに調製することもでき、またプロタミンなどの遺伝子導入効率を高める物質と共に投与されるような形態に調製することもできる。
【０１７９】
上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。
【０１８０】
上記医薬製剤中に含有されるべき本発明有効成分の量及びその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。
【０１８１】
一般には、医薬製剤としての所望のキメラ遺伝子含有レトロウイルスベクターの投与量は、１日当り体重１ｋｇ当り、例えばレトロウイルスの力価として約１×１０３ｐｆｕから１×１０１５ｐｆｕ程度とするのがよい。
【０１８２】
また所望のキメラ遺伝子が導入された細胞の場合は、１×１０４細胞／ｂｏｄｙから１×１０１５細胞／ｂｏｄｙ程度の範囲から選ばれるのが適当である。
【０１８３】
該製剤は１日に１〜数回に分けて投与することもでき、１から数週間間隔で間欠的に投与することもできる。尚、好ましくは、プロタミンなど遺伝子導入効率を高める物質又はこれを含む製剤と併用投与することができる。
【０１８４】
本発明に従う遺伝子治療を癌の治療に適用する場合は、前記した種々の遺伝子治療を適宜組み合わせて行う（結合遺伝子治療）こともでき、前記した遺伝子治療に、従来の癌化学療法、放射線療法、免疫療法などを組合わせて行うこともできる。さらに本発明の遺伝子治療は、その安全性を含めて、ＮＩＨのガイドラインを参考にして実施することができる〔Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，４，３６５−３８９（１９９３）〕。
（７）新規薬剤の設計
また本発明によれば、より活性叉は安定した形態のキメラタンパク誘導体、または、例えば、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でキメラタンパクの機能を高めるか若しくは妨害する薬剤を開発するために、それらが相互作用する目的の生物学的に活性なタンパク叉は構造アナログを作製することが可能である。前記構造アナログは例えばキメラタンパクと他のタンパクの複合体の三次元構造をＸ線結晶学、コンピューター・モデリング又は、これらの組み合わせた方法によって決定することが出来る。また、構造アナログの構造に関する情報は、相同性タンパク質の構造に基づくタンパク質のモデリングによって得ることも可能である。
【０１８５】
また上記より活性叉は安定した形態のキメラタンパク誘導体を得る方法としては、例えばアラニン・スキャンによって分析することが可能である。該方法はアミノ酸残基をＡｌａで置換し、ペプチドの活性に対するその影響を測定する方法でペプチドの各アミノ酸残基をこのように分析し、当該ペプチドの活性や安定性に重要な領域を決定する方法である。該方法によって、より活性な、または安定なキメラタンパク誘導体を設計することができる。
【０１８６】
また機能性アッセイによって選択した標的−特異的抗体を単離し、次いでその結晶構造を解析することも可能である。原則として、このアプローチにより、続く薬剤の設計の基本となるファーマコア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を得る。機能性の薬理学的に活性な抗体に対する抗−イディオタイプ抗体を生成させることによって、化学的または生物学的に生成したペプチドのバンクよりペプチドを同定したり単離したりすることが可能である。故に選択されたペプチドもファーマコアとして作用すると予測される。
【０１８７】
かくして、改善されたｐ５３活性、特に細胞増殖抑制能性を有する薬剤を設計・開発することが出来る。
【０１８８】
クローン化ｐ５１配列によって、十分な量のｐ５１ポリペプチドを入手して、Ｘ線結晶学のような分析研究をも行うことができる。さらに、本発明のキメラタンパクの提供により、Ｘ線結晶学に代えるか、または加えて、コンピューターモデリング技術に適応可能である。
【０１８９】
また本発明によれば、キメラタンパク含有ノックアウト・マウス（変異マウス）を作成することによってキメラ遺伝子配列のどの部位が生体内で上記したような多様なｐ５３活性に影響を与えるかどうか、即ちキメラ遺伝子並びにその産物が生体内でどのような機能を有するかを確認することができる。
【０１９０】
該方法は、遺伝子の相同組換えを利用して、生物の遺伝情報を意図的に修飾する技術であり、マウスの胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いた方法を例示できる（Ｃａｐｅｃｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１２８８−１２９２（１９８９））。
【０１９１】
尚、上記変異マウスの作製方法はこの分野の当業者にとって既に通常の技術であり、この改変技術（野田哲生編、実験医学，増刊，１４（２０）（１９９６）、羊土社）に、本発明のキメラ遺伝子を適応して容易に変異マウスを作製し得る。従って前記技術の適応により、改善されたｐ５３活性を有する薬剤を設計・開発することが出来る。
【０１９２】
なお、本発明には、以下のものが含まれる：
１．ｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子を腫瘍細胞に移すことからなる腫瘍形成抑制方法。
２．ｐ５３ファミリーのキメラタンパクを腫瘍細胞に移すことからなる腫瘍形成抑制方法。
３．ｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子又はその同効物、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
４．ｐ５３ファミリーのキメラタンパク又はその同効物、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
５．ｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子又はその同効物を有効成分とする遺伝子治療剤。
６．ｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子又はその同効物を含有する癌治療剤。
９．ｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子又はその同効物を用いて、細胞の腫瘍形成を抑制作用物をスクリーニングする方法。
【０１９３】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例及び実験例を挙げる。ただし、本発明はかかる実施例及び実験例により何ら限定されるものではない。
参考例１ ヒトｐ５１遺伝子の単離
（１）ヒトｐ５１遺伝子のクローニング及びＤＮＡシークエンシング
（ａ）本発明者らは、次に掲げるｐ７３−Ｆ１センスプライマー及びｐ７３−Ｒ１アンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行い増幅し、次いでｐ７３−Ｆ２センスプライマー及びｐ７３−Ｒ２アンチセンスプライマーでＮｅｓｔして増幅を行った。
【０１９４】
ｐ７３−Ｆ１： ５’−ＴＡ（ＣＧＴ）ＧＣＡ（ＣＧＴ）ＡＡＡ（Ｇ）ＡＣＡ（ＣＧＴ）ＴＧＣ（Ｔ）ＣＣ−３’
ｐ７３−Ｒ１： ３’−ＴＧＣ（Ｔ）ＧＣＡ（ＣＧＴ）ＴＧＣ（Ｔ）ＣＣＡ（ＣＧＴ）ＧＧＡ（ＣＧＴ）Ａ（Ｃ）Ｇ−５’
ｐ７３−Ｆ２： ５’−ＴＡ（ＣＧＴ）ＡＴＡ（ＣＴ）Ａ（Ｃ）ＧＡ（ＣＧＴ）ＧＴＡ（ＣＧＴ）ＧＡＡ（Ｇ）ＧＧ−３’
ｐ７３−Ｒ２： ３’−ＡＴＧＡＡＣ（Ｔ）Ａ（Ｃ）ＧＡ（ＣＧＴ）Ａ（Ｃ）ＧＡ（ＣＧＴ）ＣＣＡ（ＣＧＴ）ＡＴ−５’
具体的には、ヒト骨格筋ポリＡ＋ＲＮＡ（クローンテック社製）よりランダムプライマーおよびオリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを合成し、λ ＺｉｐＬｏｘ（ギブコＢＲＬ社製）をベクターとして構築した約１０７プラークからなるｃＤＮＡライブラリーを増幅し、ＤＮＡを抽出した。そのｃＤＮＡ０．２μｇを鋳型として上記プライマーｐ７３−Ｆ１及びｐ７３−Ｒ１を用いてＴａｇ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ギブコＢＲＬ社製）の説明書に従って、９４℃で３０秒、４５℃で３０秒、７２℃で３０秒を２５サイクルで増幅し、次いでその１００分の１を鋳型として上記プライマーｐ７３−Ｆ２及びｐ７３−Ｒ２を用いて同様の反応によって増幅した。
【０１９５】
ｐ５３遺伝子の構造から推測される１７２ｂｐのバンドが得られたので、そのバンドの制限酵素地図を作成したところ、ｐ５３遺伝子以外の遺伝子があることが判明した。そのバンドをｐＧＥＭ７（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にサブクローニングし、ＡＢＩ３７７自動シークエンサー（ＡＢＩ社製）を用いて、常法に従って塩基配列を決定したところ、ｐ５３遺伝子に類似するものの、異なる新規塩基配列を有する新規遺伝子に由来するＤＮＡ断片であった。
【０１９６】
このサブクローンされたＤＮＡ断片を切り出し、ＢｃａＢｅｓｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造製）を用いて標識プローブを作成した。オリゴｄｔプライマーのみを用いる以外は上記ｃＤＮＡライブラリーと同様にして構築した未増幅のライブラリー２．４×１０６プラークをプラークハイブリダイゼーションによってスクリーニングした結果、８個のポジティブクローンが得られた。λ ＺｉｐＬｏｘはＣｒｅ−ＬｏｘＰの系を用いて容易にプラスミドに変換できるので、変換プラスミドをＬＩＣＯＲ社の自動シークエンサーとＡＢＩ３７７自動シークエンサー（ＡＢＩ社）を用いて、常法に従って塩基配列を決定した。
【０１９７】
次いで、得られた遺伝子の塩基配列とｐ５３遺伝子及びｐ７３遺伝子の塩基配列との相同性を、ＧＣＧソフトウェア（ウィスコンシン・配列分析パッケージ、ジェネティクス・コンピューター・グループ製）を使用するＦＡＳＴＡプログラムを用いて（Ｐｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５，１４３５−１４４１（１９８８））、探索した。
【０１９８】
かかる相同性検索の結果、上記の方法によって選択され、塩基配列が決定されたクローンのうち２つがｐ５３遺伝子およびｐ７３遺伝子と高い相同性を有していることを見出した。これら２つのクローンが有する遺伝子の配列によりコードされる推定アミノ酸から分子量を掲載したところ、それぞれ５０，８９４Ｄａ及び約７１，９００Ｄａであった。本発明者らは、これらのクローンをそれぞれｐ５１Ａクローン及びｐ５１Ｂクローンと命名した。
【０１９９】
上記で得られたｐ５１Ａクローンが有する遺伝子（ｐ５１Ａ遺伝子）の全塩基配列を配列番号２に、またｐ５１Ｂクローンが有する遺伝子（ｐ５１Ｂ遺伝子）の全塩基配列を配列番号４に示す。
【０２００】
ｐ５１Ａクローンは、配列番号２に示すように、配列番号１で示されるアミノ酸配列（４４８アミノ酸）をコードする塩基配列（１３４４ヌクレオチド）を、オープン・リーディング・フレームとして１４５〜１４８８位に有する遺伝子を有していた。また、このクローンが有する遺伝子の塩基配列によりコードされる推定アミノ酸配列において、転写活性化領域は１〜５９位、ＤＮＡ結合領域は１４２〜３２１位、及びオリゴメリゼーション領域は３５９〜３９７位であった。
【０２０１】
一方、ｐ５１Ｂクローンは、配列番号４に示すように、配列番号３で示されるアミノ酸配列（６４１アミノ酸）をコードする塩基配列（１９２３ヌクレオチド）を、オープン・リーディング・フレームとして１４５〜２０６７位に有する遺伝子を有していた。また、このクローンが有する遺伝子の塩基配列によりコードされる推定アミノ酸配列において、転写活性化領域は１〜５９位、ＤＮＡ結合領域は１４２〜３２１位、及びオリゴメリゼーション領域は３５３〜３９７位であり、これは更に、Ｃ末端側の領域に付加的配列（ＳＡＭドメイン）を有しており、当該付加的配列を含む３５３〜６４１位の領域を広義のオリゴメリゼーション領域とみることができる。
【０２０２】
ｐ５１Ａ遺伝子でコードされるｐ５１Ａのアミノ酸配列をｐ５３及びｐ７３βのアミノ酸配列と比較し、三者間の相同性を調べた（図７）。なお、図中、三者間で同一のアミノ酸を四角で囲んで示す。
【０２０３】
また図１に、ｐ５１Ａの構造的なドメインの特徴を、ｐ５３及びｐ７３βとともに、シェーマ的に示す。図中「ＴＡ」は転写活性化領域、「ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ」はＤＮＡ結合領域、「ｏｌｉｇｏ」はオリゴメリゼーション領域をそれぞれ示す。
【０２０４】
これらの結果、全配列、転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーシヨン領域における、それぞれのｐ５１Ａ、ｐ５３及びｐ７３βの推定アミノ酸配列の相同性は、表２に示す通りであった。
【０２０５】
【表２】
また、ｐ５１Ａの４４８アミノ酸残基は、ｐ７３αの６３６アミノ酸残基より短いものの、ｐ５１Ａの全構造はｐ７３のカルボキシ末端部位が割裂した部分が類似していた（図８参照）。
【０２０６】
これらの結果から、ｐ５１Ａの推定アミノ酸配列は、ｐ５３及びｐ７３βのいずれとも類似しているものの、ｐ５３のアミノ酸配列よりもｐ７３βのアミノ酸配列に相同性が高く、またｐ５１Ａとｐ７３βとの相同性は、オリゴメリゼーション領域以外の領域で、ｐ５３とｐ７３βの相同性よりも高いことが判明した。更にｐ５１Ａ及びｐ７３β間では、ｐ５３及びｐ７３β間又はｐ５３及びｐ５１Ａ間で相同性がない領域においても、相同性が認められた。これらのことからｐ５１Ａは、アミノ酸配列レベルにおいてｐ５３よりもｐ７３βにより近似しているといえる。
【０２０７】
また、同様に本発明のｐ５１Ｂ遺伝子でコードされるアミノ酸配列をｐ７３αタンパクのアミノ酸配列と比較し二者間の相同性を調べた（図９）。なお、図において二者間で同一のアミノ酸を四角で囲んで示す。
【０２０８】
実施例１ キメラｐ５３／ｐ５１Ａ／ｐ７３γ発現ベクターの構築
基本的にＰＣＲの変法（Ｓｅｎａｎａｙａｋｅ，Ｓ．Ｄ．，ａｎｄ Ｂｒｉａｎ，Ｄ．Ａ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，１３−１５（１９９５））を用いて、キメラを作成した。
（１）まず、哺乳動物発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロゲン社製）中にｐ５３、ｐ５１Ａ及びｐ７３γ遺伝子を挿入してｃＤＮＡ発現構築物を構築した（後述する表４中、便宜上キメラ１、キメラ１４及びキメラ２７として示す。）。また、表３に示すように、１２個のハイブリッドプライマーと６個のアンチセンスプライマーをデザインして作成した。
【０２０９】
【表３】
ＰＣＲ増幅を、鋳型として上記ｐ５３、ｐ５１Ａ及びｐ７３γのｃＤＮＡ発現構築物（キメラ１、キメラ１４及びキメラ２７）を用いて、アンチセンスプライマー（表３）とＴ７プライマー（ｐＲｃ／ＣＭＶベクター中に挿入された遺伝子の５’位に位置する）、及び対応するハイブリッドプライマー（表３）とＳＰ６プライマー（ｐＲｃ／ＣＭＶベクター中に挿入された遺伝子の３’位に位置する）を使用して行った（９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分、２０サイクル、ＥＸＴａｑ（宝酒造製）使用）。図１０において具体的には、まずアンチセンスプライマー及びＴ７プライマー及び鋳型としてｐ５３ｃＤＮＡ発現構築物（キメラ１）を用いてＰＣＲ増幅を行い、また別個の試験管内でハイブリッドプライマー、ＳＰ６プライマー及び鋳型としてｐ５１ＡｃＤＮＡ発現構築物（キメラ１４）を用いてＰＣＲ増幅を行った（図１０（ａ））。
【０２１０】
得られた増幅フラグメントをゲル精製し、次いで得られた精製増幅フラグメントの各相当ペアを混合して、再度Ｔ７プライマー及びＳＰ６プライマーを用いてＰＣＲ増幅（９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２分、２０サイクル、ＥｘＴａｑ）を行った（図１０（ｂ））。得られたキメラフラグメントをｐＲｃ／ＣＭＶベクターにサブクローニングして、完全なコード領域を有していることが確認された。
（２）上記で得られたキメラクローンを、変異のないことを確認した後、２つのジャンクションを有するキメラの構築に使用した。具体的には、上記で作成したキメラのＤＮＡ結合領域、及びｐＲｃ／ＣＭＶベクターの両方に存在する制限酵素認識部位を利用して作成することができる。例えば図１１では、キメラ１０及びキメラ２を利用し、これらのＤＮＡ結合領域及びｐＲｃ／ＣＭＶベクターに存在する部位を認識する制限酵素Ｂｓｕ３６Ｉで消化し、得られる消化フラグメントを結合することによってキメラ１１（ｐ５１−ｐ５３−ｐ５１Ａ）を構築する工程を示す。また図１２では、キメラ２及びｐ５３Ｂ遺伝子をｐＲｃ／ＣＭＶベクターに挿入して構築したｃＤＮＡ発現構築物（キメラ３２、表４参照）を利用し、これらに存在する共通部位を認識する制限酵素ＭｆｅＩで消化し、得られる消化フラグメントを結合することによってキメラ２８（ｐ５３−ｐ５３−ｐ５１Ｂ、表４参照）を構築する工程を示す。
【０２１１】
なお、図１０〜１２において黒ボックスはｐ５３由来、白ボックスはｐ５１Ａ由来、ストライプボックスはｐＲｃ／ＣＭＶベクター由来、スティップル（ｓｔｉｐｐｌｅｄ）ボックスはｐ５１ＢのＳＡＭドメインを示す。また、図中、ＴＡは転写活性化領域、ＤＮＡはＤＮＡ結合領域及びＯＬＩＧＯはオリゴメリゼーション領域を意味する。
【０２１２】
このようにして得られた各種のキメラ遺伝子及びその産物を表４に示す（なお、キメラ１、１４、２７及び３２は、それぞれｐ５３、ｐ５１Ａ、ｐ７３γ及びｐ５１Ｂに対応するものでありキメラではないが、説明の都合上表に掲げたものである。）。
【０２１３】
【表４】
細胞分裂周期におけるＧ１期停止を誘導したり、またアポトーシスを誘導するといったｐ５３の能力は、ｐ５３の転写活性能に依存している。このことから、実施例１で調製した各ｐ５３ファミリー・キメラタンパク（キメラ１〜２７、表４参照）について、それらが転写活性能を有するかどうかを試験した。
【０２１４】
（１）ｐ５３タンパクの転写活性能によって調節されることが知られているＢＡＸ２プロモーターをターゲットプロモーターとして、ルシフェラーゼリポーターアッセイにより、各ｐ５３ファミリー・キメラタンパクの転写活性能を評価した。具体的には、４００ｎｇの各種キメラ構築物（キメラ１〜２７）及び１００ｎｇのｐＢＡＸ２ｌｕｃを、ｐ５３欠損ヒト骨肉腫細胞系ＳＡＯＳ−２細胞にトランスフェクトして、デュアル（Ｄｕａｌ）−ルシフェラーゼ・リポーター測定システム（プロメガ社製）及びルミノメーター（ＡＴＴＯ；Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ ＪＮＲ ＡＢ−２１００）を用いて、ルシフェラーゼアッセイを行った。なお、ｐＢＡＸ２ｌｕｃはＰＣＲによってＢＡＸ２のプロモーター全領域を増幅し、ｐＧＬ３ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）に挿入することによって作成した。
【０２１５】
３回の実験から集計して得られた結果を、相対光量ユニット（ＲＬＵ）として、図１３に示す。なお、図の左に示すキメラの番号は表４に記載するキメラ１〜２７に対応するものであり、黒ボックスはｐ５３由来、白ボックスはｐ５１Ａ由来、及びドット（点）ボックスはｐ７３γ由来を意味する。また、図中、ＴＡは転写活性化領域、ＤＮＡはＤＮＡ結合領域及びＯｌｉｇｏはオリゴメリゼーション領域を意味する。
【０２１６】
この結果からわかるように、転写活性化領域がｐ５３に由来するキメラ構築物（キメラ２〜９）は、ｐ５３（キメラ１）そのものよりも強い転写活性能を示し、中でもキメラ２、５及び８はｐ５３の２倍もの強い転写活性能を有していた。さらに、キメラ１〜３、キメラ４〜６及びキメラ７〜９間でそれぞれこれらのキメラ構築物のオリゴメリゼーション領域の由来に関して検討するに、ｐ５１に由来するオリゴメリゼーション領域を有するキメラ構築物の転写活性能が最も強く、次いで強いのがｐ７３に由来するものであった。また、一般的にｐ５１由来の転写活性化領域を有するキメラは転写活性能を低い傾向が見られた（キメラ１０〜１８）。
【０２１７】
さらに、ｐ５１またはｐ７３に由来する転写活性化領域を有するキメラの場合、転写活性能の強さは、ＤＮＡ結合性領域によって決まるようである。ｐ５１に由来する転写活性化領域を有するキメラ構築物において、ｐ７３に由来するＤＮＡ結合領域を有するものが最も高い転写活性能を示し、次いで強いのはｐ５１に由来するＤＮＡ結合領域を有するものであった。一方、ｐ７３に由来する転写活性化領域を有するキメラ構築物において、ｐ５３に由来するＤＮＡ結合領域を有するものが最も高い転写活性能を示し、次いでｐ５１に由来するＤＮＡ結合領域を有するものが強かった。
【０２１８】
（２）実施例１で調製したキメラ２（ｐ５３−ｐ５３−Ｐ５１Ａ）及びキメラ２８（ｐ５３−ｐ５３−Ｐ５１Ｂ）について、上記（２）と同様にしてルシフェラーゼアッセイを行い、ルシフェラーゼ活性から各キメラの転写活性化能を評価した。結果を、ｐ５３そのもの（キメラ１）、ｐ５１Ａそのもの（キメラ１４）、ｐ５１Ｂ（キメラ３２）及びｐＲｃ／ＣＭＶベクターについて実験を行った結果と合わせて図１４に示す。結果からわかるように、ｐ５３及びｐ５１Ａそのものよりも、ｐ５１Ｂ由来のオリゴメリゼーション領域を有するキメラ２８及びｐ５１Ａ由来のオリゴメリゼーション領域を有するキメラ２は、それぞれ３０倍及び２０倍強い転写活性を示した。このことから、本来転写抑制領域と考えられているｐ５１ＢのＣ末端ドメインは、単に転写抑制に機能しているだけでなく、上記キメラにおいて強いトランスアクチベーターとしてｐ５３の機能活性に関与していることが示唆された。
【０２１９】
実験例２ 種々のプロモーターに対するキメラの転写活性能
ＢＡＸ２プロモーターと同様にｐ５３の転写活性能によって調節されることが知られているＲＧＣプロモーター、１４−３−３σプロモーター、ｐ２１ＷＡＦ１プロモーター及びＭＤＭ２プロモーター、並びにＢＡＸ２プロモーターを用いて、実験例１と同様にして各種キメラ構築物の転写活性能を調べた。具体的には、１００ｎｇの各リポータープラスミド（ｐＢＡＸ２ｌｕｃ、ｐＧＬ２ｈｍｄｍ２−ＨＸ−ｌｕｃ、ｐＷＡＦ１ｌｕｃ、１４−３−３ｓｌｕｃ）を４００ｎｇのキメラ発現構築物とともに、ＳＡＯＳ−２細胞株に導入して、デュアル（Ｄｕａｌ）−ルシフェラーゼ・リポーター測定システム（プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼアッセイを行った（ｎ＝３）。
【０２２０】
結果を図１５に示す。なお、図中横軸は各キメラの番号を示すが、ターゲットプロモーターとしてＢＡＸ２プロモーターを用いた場合に得られる各種キメラの転写活性能の強さの順の並び変えたものである（図１５（ｅ）参照）。また図中、黒の棒グラフはｐ５３そのもの（ｐ５３発現構築物：キメラ１）の転写活性能を示す。
【０２２１】
これらの結果から、各キメラはｐ５３の転写活性能によって調節される異なるターゲットプロモーターに対して、顕著に異なる選択性を示すことがうかがわれた。
【０２２２】
実験例３ 変異ｐ５３のドミナントネガティブ効果に対するキメラの抵抗性
実験例２から、キメラの転写活性能は種々のプロモーターを用いた場合も強いことが判明したので、標的腫瘍中の野生型（正常）ｐ５３の機能消失を復活させる遺伝子治療への利用の可能性が考えられる。しかしながら、多くの腫瘍で検出される変異ｐ５３はしばしばドミナントネガティブ作用を発揮し、外来性のｐ５３機能を阻害する。このため、本発明のｐ５３ファミリーキメラについて、ドミナントネガティブ活性を有する変異ｐ５３の存在下での転写活性能を調べた。なお、以下の実験において、変異ｐ５３として、変異ｐ５３試験を行った１０個の中で最も強いコンペティターであった、２４９位に変異を有するＳｅｒ２４９変異体を用いた。
【０２２３】
ＢＡＸ２プロモーターに対する種々のキメラの転写活性能を、種々の量のドミナントネガティブｐ５３プラスミドの存在下で測定した。具体的には、２００ｎｇキメラプラスミド及び５０ｎｇのｐＢＡＸ２ｌｕｃを、種々の量の変異ｐ５３（８００、４００、２００、１００及び０ｎｇ）（ｐＲｃ／ＣＭＶベクターでＤＮＡ量を調整した）と一緒にトランスフェクトし、デュアル（Ｄｕａｌ）−ルシフェラーゼ・リポーター測定システム（プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼアッセイに供した（ｎ＝３）。
【０２２４】
結果を図１６及び図１７に示す。結果は、ｐＲｃ／ＣＭＶベクターの存在下で検出されるルシフェラーゼ活性に対する、変異プラスミドの存在下でのルシフェラーゼ活性の、相対（比較）ルシフェラーゼ活性として示す（図１６）。図１６のａ〜ｉは、表４に示すキメラ１〜２７をＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域の由来に基づいて、下記のように分類したものに対応する。
【０２２５】
図ａ，ｂ，ｃ：ｐ５３由来のＤＮＡ結合領域を有するキメラ
図ｄ，ｅ，ｆ：ｐ５１Ａ由来のＤＮＡ結合領域を有するキメラ
図ｇ，ｈ，ｉ：ｐ７３γ由来のＤＮＡ結合領域を有するキメラ
図ｂ，ｅ，ｈ：ｐ５１Ａ由来のオリゴメリゼーション領域を有するキメラ
図ｃ，ｆ，ｉ：ｐ７３γ由来のオリゴメリゼーション領域を有するキメラ
図ａ，ｄ，ｇ：ｐ５３由来のオリゴメリゼーション領域を有するキメラ
また、各図中、点線はｐ５３由来の転写活性化領域を有するキメラ、実線はｐ５１Ａ由来の転写活性化領域を有するキメラ、及びダッシュ線はｐ７３γ由来の転写活性化領域を有するキメラを意味する。
【０２２６】
また図１７の（ｊ）及び（ｋ）は、それぞれ８００ｎｇのドミナントネガティブｐ５３プラスミド及び８００ｎｇのｐＲｃ／ＣＭＶベクターの存在下で得られるルシフェラーゼ活性の絶対値を比較光量ユニット（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ：ＲＬＵ）として示すものである。また図１７の（ｌ）は、上記（ｊ）及び（ｋ）から得られる値の比（変異ｐ５３／ベクター：（ｊ）／（ｋ））を各キメラについて示すものである。なお、各図中、ＶはｐＲｃ／ＣＭＶベクターのトランスフェクションから得られるルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）の結果を示すものである。
【０２２７】
これらの結果から、ｐ５３に由来するＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域を有するキメラは、その転写活性化領域の由来に関わらず、用量依存的に変異ｐ５３発現によるドミナントネガティブ作用にセンシティブであることがわかる（図１６（ａ）、図１７（ｊ）〜（ｌ）：キメラ１、１９及び１０）。このことは、変異ｐ５３とオリゴメライズして変異ｐ５３に対してドミナントネガティブ阻害を働かせることを可能とするには、ＤＮＡ結合領域とオリゴメリゼーション領域の完全性が必須の成分であることを示唆するものである。
【０２２８】
一方、ｐ５１又はｐ７３に由来するＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域を有するキメラは、その転写活性化領域の由来に関わらず、変異ｐ５３発現によるドミナントネガティブ作用に抵抗性を示した。またそれらは、変異ｐ５３自体は転写活性能を全く有していないにも関わらず、変異ｐ５３の存在によって転写活性能が増強された。この現象は、これらのキメラがオリゴマー成分として変異ｐ５３を取り込み、それによって転写活性能が増大している、または変異ｐ５３がそのタンパクへの誘き寄せ（ｄｅｃｏｙ）機能を果たし、それによってＭＤＭ２タンパクといったキメラ性タンパクの活性を打ち消している、という理由によって説明できるかもしれない。
【０２２９】
特にキメラ５、６、８及び９は、変異ｐ５３の存在下で、ｐ５３そのものよりも５０倍以上も高いルシフェラーゼ活性（転写活性能）を示した（図１７（ｊ））。
【０２３０】
実験例４ ｐ５３ファミリーキメラの転写活性能に対するＭＤＭ２及びｐ１９ＡＲＦの影響
本発明のｐ５３ファミリーキメラについて、その転写活性能に対するＭＤＭ２及びｐ１９ＡＲＦの影響を分析した。具体的には、８００ｎｇのｐＭＤＭ２／Ｒｃ／ＣＭＶ、２００ｎｇキメラプラスミド及び５０ｎｇｐＢＡＸ２ｌｕｃをＳＡＯＳ細胞株にコトランスフェクトし、デュアル（Ｄｕａｌ）−ルシフェラーゼ・リポーター測定システム（プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼアッセイを行った（ｎ＝３）。
【０２３１】
結果を図１８に示す。なお、図１８の（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ８００ｎｇのＭＤＭ２／Ｒｃ／ＣＭＶ及び８００ｎｇのｐＲｃ／ＣＭＶベクターの存在下で得られるルシフェラーゼ活性の絶対値を比較光量ユニット（ｒｅｌａｔｉｖｅｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ：ＲＬＵ）として示すものである。また図１８の（ｃ）は、上記（ａ）及び（ｂ）から得られる値の比（ＭＤＭ２／ベクター：（ａ）／（ｂ））を各キメラについて示すものである。なお、各図中、ＶはｐＲｃ／ＣＭＶベクターのトランスフェクションから得られるルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）の結果を示すものである。
【０２３２】
これらの結果から、強い転写活性能を有するキメラの中でもｐ５１に由来するオリゴメリゼーション領域を有するキメラは、ＭＤＭ２の過剰の発現によって著しく減少することが示された（キメラ２、５、８及び２０）。このことから、ＭＤＭ２がｐ５１Ａ由来オリゴメリゼーション領域に依存するユビキチン経路を活性化する可能性が示唆された。一方、ｐＳＲα−ｍｓｖ−ｐ１９ＡＲＦ−ｔｋ−ｃＤ８をコトランスフェクションすることによるｐ１９ＡＲＦの発現は余り影響しなかった。
【０２３３】
以上の実験から、本発明のｐ５３ファミリーからなるキメラタンパクの転写活性能に関して、
１）あるキメラはｐ５３、ｐ５１及びｐ７３そのものよりも２０倍もの高い転写活性能を示すこと、
２）キメラはｐ５３によって転写調節をうける各種の遺伝子（プロモーター）に対して著しく異なった選択性を示すこと、
３）あるキメラは、野生型ｐ５３をドミナントネガティブ的に阻害する変異ｐ５３作用に強い抵抗性を示し、さらには変異ｐ５３の存在下においてｐ５３よりも５０倍もの強い転写活性能を示すこと、
が明らかになった。
【０２３４】
このような本発明のｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子及びキメラタンパクは、ｐ５３ファミリータンパクの機能を検討並びに解明する上で有用である。ｐ５３ファミリータンパクのメンバーから形成されるヘテロオリゴマー（４量体）により、ｐ５３ファミリータンパクの機能を様々なレベルで精巧に制御することができる。例えば、▲１▼タンパクの発現レベル、▲２▼オリゴメリゼーションレベル（ヘテロオリゴマー形成を含む）、▲３▼種々のヘテロオリゴマーのＤＮＡ結合能レベル、▲４▼種々のオリゴマーの存在下でのＤＮＡ結合オリゴマーの転写活性能及び転写抑制能レベル、▲５▼ターゲットプロモーターレベルを挙げることができる。本発明のキメラによれば、免疫共沈実験（ｃｏ−ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）、ゲルシフトアッセイ、トランスアクチベーションアッセイ、及びアポトーシス分析などの各種の方法を組み合わせることにより、更なる素晴らしい進展が得られることが期待される。
【０２３５】
また本発明のｐ５３ファミリーキメラの種々のプロモーターに対する異なった選択性は、ｐ５３ファミリータンパクのターゲット遺伝子の検索に利用できる。すなわち、本発明のキメラは、好適なターゲット遺伝子の分別に役立ち、またさらに結合部位選択法、ＳＡＧＥまたはマイクロアレイ技術等の方法を組み合わせることにより、真なるｐ５３ファミリータンパクのターゲット遺伝子の同定を導くものと期待される。さらに、選択性における顕著な相違は、あるｐ５３ファミリー遺伝子におけるエフェレントシグナル（ｅｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｇｎａｌ）を、他のｐ５３ファミリー遺伝子の下流ターゲットに対するアフェレントシグナル（ａｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｇｎａｌ）に変換できるであろうことを示す。
【０２３６】
本発明のｐ５３ファミリーキメラ遺伝子は、遺伝子治療においても有用である。
【０２３７】
ｐ５３欠損性腫瘍について、遺伝子治療によって正常ｐ５３機能を復活させることにより、癌性細胞を死滅させるか、または癌性細胞を良好状態に変えることができることを示す多くの証拠がある。しかしながら、実際は癌細胞への正常ｐ５３遺伝子の導入は必ずしも成功裡を収めるわけではない。正常なｐ５３は、多くの腫瘍において原因となる変異ｐ５３のドミナントネガティブ作用に十分強くなく、または阻害され得る。また最近、ｐ５３経路の異常（不全機能）は変異ｐ５３だけでなく、ｐ１４ＡＲＦ変異及びＭＤＭ２増幅によっても生じることが分かっている。種々の性質を有すると考えられる本発明のキメラ遺伝子によれば、このような変異ｐ５３のドミナントネガティブ作用やｐ１４ＡＲＦ変異及びＭＤＭ２増幅等の障害を回避することが可能となり、その結果腫瘍に対する遺伝子治療において有用なツール（遺伝子治療剤）となるものと期待される。さらに、遺伝子の異なるレパートリーを転写活性化するキメラの利用は、癌の治療により一層有効と思われる。また、本発明のｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子を種々組み合わせて使用することにより、単一のキメラでは得られない有用な性質が得られる可能性も期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐ５１Ａ蛋白の構造的なドメインの特徴を、ｐ５３蛋白及びｐ７３β蛋白とともに示した図である。図中、「ＴＡ」は転写活性化領域、「ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ」はＤＮＡ結合領域、及び「ｏｌｉｇｏ」はオリゴメリゼーション領域をそれぞれ示す。
【図２】ｐ５３遺伝子の塩基配列（ａ）及びｐ５３のアミノ酸配列（ｂ）を示す図である。
【図３】ｐ７３α遺伝子の塩基配列（ａ）及びｐ７３αのアミノ酸配列（ｂ）を示す図である。
【図４】ｐ７３β遺伝子の塩基配列（ａ）及びｐ７３βのアミノ酸配列（ｂ）を示す図である。
【図５】ｐ７３γ遺伝子の塩基配列（ａ）及びｐ７３γのアミノ酸配列（ｂ）を示す図である。
【図６】ｐ７３δ遺伝子の塩基配列（ａ）及びｐ７３δのアミノ酸配列（ｂ）を示す図である。
【図７】ヒトｐ５１Ａ遺伝子でコードされるアミノ酸配列をｐ５３蛋白及びｐ７３β蛋白の各アミノ酸配列と比較し、三者間の相同性をみた図である。三者が同一であるアミノ酸を四角で囲んで示す。
【図８】ｐ５１蛋白のａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｖａｒｉａｎｔ（ｐ５１Ａ、ｐ５１Ｂ）の構造を、ｐ７３蛋白のａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓｐｌｉｃｉｎｇｖａｒｉａｎｔ（ｐ７３α、ｐ７３β）の構造と模式的に比較した図である。
【図９】ヒトｐ５１Ｂ遺伝子でコードされるアミノ酸配列をｐ７３α蛋白の各アミノ酸配列と比較し、両者の相同性をみた図である。両者が同一であるアミノ酸を四角で囲んで示す。
【図１０】本発明のキメラ（キメラ２）を作成する方法を示す図である（実施例１）。
【図１１】本発明のキメラ（キメラ１１）を作成する方法を示す図である（実施例１）。
【図１２】本発明のキメラ（キメラ２８）を作成する方法を示す図である（実施例１）。
【図１３】実験例１（１）でおこなったｐ５３ファミリーキメラタンパクの転写活性化機能試験の結果を示す図である。グラフの横軸は相対光量ユニット（ＲＬＵ）を示す。図の左に示すキメラの番号は表４に記載するキメラ１〜２７に対応する。黒ボックスはｐ５３由来、白ボックスはｐ５１Ａ由来、及びドット（点）ボックスはｐ７３γ由来を意味する。また、図中、ＴＡは転写活性化領域、ＤＮＡはＤＮＡ結合領域及びＯｌｉｇｏはオリゴメリゼーション領域を意味する。
【図１４】実験例１（２）でおこなったキメラ２（ｐ５３−ｐ５３−Ｐ５１Ａ）及びキメラ２８（ｐ５３−ｐ５３−Ｐ５１Ｂ）の転写活性化機能試験の結果を示す図である。グラフの縦軸は相対光量ユニット（ＲＬＵ）を示す。図の横軸の番号は次のキメラ構築物に対応する：１．キメラ構築物（キメラ２８）、２．キメラ構築物（キメラ２）、３．ｐ５３（キメラ１）、４．ｐ５１Ａ（キメラ１４）、５．ｐ５１Ｂ（キメラ３２）、６．ｐＲｃ／ＣＭＶベクター。
【図１５】種々のプロモーターに対するキメラの転写活性能の結果を示す図である（実験例）。（ａ）ＲＧＣプロモーター、（ｂ）１４−３−３σプロモーター、（ｃ）ｐ２１ＷＡＦ１プロモーター、（ｄ）及びＭＤＭ２プロモーター、及び（ｅ）ＢＡＸ２プロモーターを使用した結果をそれぞれ示す。図の横軸の番号は表４に記載するキメラ１〜２７に対応するものであり、縦軸は相対光量ユニット（ＲＬＵ）を示す。
【図１６】変異ｐ５３のドミナントネガティブ効果に対するキメラの抵抗性の結果を示す図である（実験例３）。図１６のａ〜ｉは、表４に示すキメラ１〜２７をＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域の由来に基づいて、下記のように分類したものに対応する：図ａ，ｂ，ｃ：ｐ５３由来のＤＮＡ結合領域を有するキメラ；図ｄ，ｅ，ｆ：ｐ５１Ａ由来のＤＮＡ結合領域を有するキメラ；図ｇ，ｈ，ｉ：ｐ７３γ由来のＤＮＡ結合領域を有するキメラ；図ｂ，ｅ，ｈ：ｐ５１Ａ由来のオリゴメリゼーション領域を有するキメラ；図ｃ，ｆ，ｉ：ｐ７３γ由来のオリゴメリゼーション領域を有するキメラ；図ａ，ｄ，ｇ：ｐ５３由来のオリゴメリゼーション領域を有するキメラ。各図中、点線はｐ５３由来の転写活性化領域を有するキメラ、実線はｐ５１Ａ由来の転写活性化領域を有するキメラ、及びダッシュ線はｐ７３γ由来の転写活性化領域を有するキメラを意味する。横軸は、変異ｐ５３の量（ｎｇ）を、縦軸はｐＲｃ／ＣＭＶベクターの存在下で検出されるルシフェラーゼ活性に対する、変異プラスミドの存在下でのルシフェラーゼ活性の、相対（比較）ルシフェラーゼ活性を示す。
【図１７】変異ｐ５３のドミナントネガティブ効果に対するキメラの抵抗性の結果を示す図である（実験例３）。図１７の（ｊ）及び（ｋ）は、それぞれドミナントネガティブｐ５３プラスミド及びｐＲｃ／ＣＭＶベクターの存在下で得られるルシフェラーゼ活性を比較光量ユニット（ＲＬＵ）として示すものである。（ｌ）は、上記（ｊ）及び（ｋ）から得られる値の比（（ｊ）／（ｋ））を各キメラについて示すものである。
【図１８】ｐ５３ファミリーキメラの転写活性能に対するＭＤＭ２及びｐ１９ＡＲＦの影響を見た実験例４の結果を示す図である。図１８の（ａ）及び（ｂ）は、それぞれＭＤＭ２／Ｒｃ／ＣＭＶ及びｐＲｃ／ＣＭＶベクターの存在下で得られるルシフェラーゼ活性を比較光量ユニット（ＲＬＵ）として示したものである。（ｃ）は、上記（ａ）及び（ｂ）から得られる値の比（（ａ）／（ｂ））を各キメラについて示すものである。各図中、ＶはｐＲｃ／ＣＭＶベクターのトランスフェクションから得られるルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）の結果を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子並びにキメラタンパクに関する。本発明のキメラ遺伝子は、その優れた特性に基づいて悪性腫瘍とくにｐ５３変異ヒト腫瘍の遺伝子治療に有用であり、またｐ５３ファミリー遺伝子の機能分析において有用なツールとなるものと期待される。
【０００２】
【従来の技術】
ｐ５３はＤＮＡ型腫瘍ウイルスＳＶ４０の大型Ｔ抗原と結合する核内タンパクとして発見され、既にその遺伝子（ｐ５３遺伝子）がクローニングされている。当初ｐ５３遺伝子は、ｒａｓ遺伝子と共に細胞に導入することによって胚由来細胞がトランスフォームされることから癌遺伝子と考えられていたが、その後の研究により当初得られたｐ５３遺伝子のクローンは変異型であり、野生型ｐ５３遺伝子はむしろ変異型のトランスフォーム能を抑制することが明らかになった。ｐ５３遺伝子の欠失若しくは異常が多くのヒト癌細胞で検出されており、また高発癌性遺伝病として知られるＬｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｉ症候群においてｐ５３遺伝子の配偶子変異が発見されたこと等から、今ではｐ５３遺伝子は重要な癌抑制遺伝子と考えられるに至っている〔Ｂａｋｅｒ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，２１７−２２１（１９８９）：Ｎｉｇｒｏ，Ｊ．Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２，７０５−７０８（１９８９）〕。
【０００３】
ヒトｐ５３は、３９３個のアミノ酸からなり、大きくＮ末端ドメイン（１〜１０１位）、コアドメイン（１０２〜２９２位）、及びＣ末端ドメイン（２９３〜３９３位）の３領域に分けられる。Ｎ末端ドメインは、１〜４５位に酸性アミノ酸やプロリンを多く含む転写活性化領域（１〜４５位）を有しており、転写の制御に寄与しているものと考えられる。中央のコアドメインは、３カ所の疎水性部位を含むＤＮＡ結合領域を有している（１１３〜２９０位）。またＣ末端ドメインは、四量体形成に必要なオリゴメリゼーション領域（３１９〜３６３位）及びそのＣ末側に塩基性アミノ酸を多く含む領域を有しており、非特異的ＤＮＡ結合やＤＮＡ損傷の認識並びにトランスフォーム抑制などの役目を担っていると考えられている。
【０００４】
ヒト癌細胞に検出されるｐ５３遺伝子の異常の多くがミスセンス変異で、その殆どがＮ末端から１００〜３００アミノ酸の部位に相当するコアドメイン、特に種を越えて保存されたホット・スポット（Ｈｏｔ Ｓｐｏｔ）と称される領域に集中している。かかるコアドメイン中のホット・スポット領域はｐ５３とＤＮＡとの結合に関与する領域であり、実際、当該領域の変異によってＤＮＡとの特異的結合が障害される。
【０００５】
これらのことから、ｐ５３は、他の遺伝子に特異的に結合して当該遺伝子の発現を調節する転写制御因子としての役割をもつことが明らかとなった。
【０００６】
ｐ５３によって転写が誘発される遺伝子の産物としては、ｐ２１〔ＷＡＦ１或いはＣｉｐ１、或いはＳＤＩ１と言われる（ＥＩ−Ｄａｉｒｙ，Ｗ．Ｓ．，ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，７５，８１７（１９９３））〕、ＭＤＭ２（Ｗｕ．Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，７，１１２６（１９９３）、ＭＣＫ（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４５７０（１９９１）：Ｚａｍｂｅｔｔｉ．Ｇ．Ｐ．，ｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，６，１１４３（１９９２））、ＧＡＤＤ４５〔Ｋａｓｔａｎ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，７１，５８７（１９９２）〕、サイクリンＧ〔Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ：Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｋ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１３，４８１６（１９９４）〕、Ｂａｘ〔Ｍｉｙａｓｈｉｔａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８０，２９３（１９９５）〕、及びインスリン様成長因子結合蛋白３〔ＩＧＦ−ＢＰ３：Ｂｕｃｋｂｉｎｄｅｒ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７７，６４６（１９９５）〕などを例示することができる（Ｓａｍｅｓｈｉｍａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，：Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，７，４５１−４５７（１９９２））。
【０００７】
ｐ２１は、サイクリン−サイクリン−依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の阻害タンパクであり、野生型ｐ５３がｐ２１を介して細胞周期を抑制的に調節することが判明している〔Ｈａｒｐｅｒ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，７５，８０５（１９９３）：Ｘｉｏｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６６，７０７（１９９３）：Ｇｕ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６６，７０１（１９９３）〕。またｐ２１遺伝子は、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）に結合して、直接ＤＮＡの複製を抑制することも報告されている〔Ｗａｇａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６９，５７４（１９９４）〕。更にｐ２１遺伝子は、細胞の老化を誘導し、ＤＮＡ合成を抑制する作用を有するＳＤＩ１遺伝子と同一の遺伝子であることが判明している〔Ｎｏｄａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，２１１，９０（１９９４）〕。
【０００８】
ＭＤＭ２は、ｐ５３に結合して該タンパクの転写制御活性を不活性化することから、負のフィードバック調節因子として作用していると推測されている。
【０００９】
ＩＧＦ−ＢＰ３は、ＩＧＦシグナル化の負の調節因子である。このためｐ５３によるＩＧＦ−ＢＰ３遺伝子の増加は、結果としてｐ５３がＩＧＦ依存性細胞の成長抑制を導く可能性を示唆する。
【００１０】
また、野生型ｐ５３は、骨髄性白血病性細胞のアポトーシスを誘導することが報告されている〔Ｙｏｎｉｓｈ−Ｒｏｕａｃｈ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２，３４５（１９９１）〕。放射線照射による胸腺細胞アポトーシスの誘導はｐ５３欠損マウスには起こらず〔Ｌｏｗｅ，Ｓ．Ｗ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２，８４７（１９９３）：Ｃｌａｒｋｅ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２，８４９（１９９３）〕、またｐ５３タンパクは、水晶体、網膜、脳において正常網膜芽腫遺伝子（ＲＢ遺伝子）活性を失っている細胞のアポプティックな死を誘導する〔Ｐａｎ，Ｈ．，ａｎｄ Ｇｒｉｅｐ，Ａ．Ｅ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，８，１２８５（１９９４）：Ｍｏｒｇｅｎｂｅｓｓｅｒ，Ｓ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７１，７２（１９９４）：Ｈｏｗｅｓ，Ｋ．Ａ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，８，１３００（１９９４）：Ｓｙｍｏｎｄｓ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，７８，７０３（１９９４）〕。ホワイト氏は、ｐ５３はＲＢ遺伝子変異の探索に有用であり、またＲＢ遺伝子変異を含む細胞のアポトーシスを誘導するだろうと提言している〔Ｗｈｉｔｅ，Ｅ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７１，２１（１９９４）〕。
【００１１】
また、温度感受性を持つｐ５３遺伝子のみが発現しているマウス赤芽球性白血病細胞系では温度の下降で変異ｐ５３遺伝子が野生型に戻り、アポトーシスを誘導し、そこから取り出した変異ｐ５３遺伝子をｐ５３欠損線維芽細胞系が軟寒天培地内で増殖できる能力を付与する（ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙを与える）〔Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８６：２８４−２９１（１９９５）；Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．９：２６９−２７７〕。
【００１２】
Ｂａｘは、アポトーシスの抑制因子であるＢｃｌ−２に結合することができ、アポプティックな細胞死を促進する〔Ｏｌｔｖａｉ，Ｚ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，７４，６０９（１９９３）〕。ｐ５３によるＢａｘ遺伝子の増加とＢｃｌ−２の減少は、マウス白血病細胞株Ｍ１のアポトーシスに関連しており〔Ｍｉｙａｓｈｉｔａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，９，１７９９（１９９４）〕、またアポトーシスに対するシグナル・トランスデューサーの一つであるＦａｓが、非小細胞肺癌と赤白血病において増加しているという報告がある〔Ｏｗｅｎ−Ｓｃｈａｕｂ，Ｌ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｌ．，１５，３０３２（１９９５）〕。
【００１３】
以上述べてきたような多くの研究により、ｐ５３はｐ２１遺伝子に限らず様々の遺伝子の転写を亢進或いは抑制することが明らかになってきている。また、転写調節機能が欠落した変異型ｐ５３においても、細胞内の他のタンパク質と相互作用してシグナルを伝達する能力やＤＮＡの損傷修復機能があることが示されている。
【００１４】
今までわかっているｐ５３の機能としては、例えば、転写調節機能、他の細胞内蛋白質と結合することによるシグナル伝達機能、ＤＮＡ複製に関するタンパク質複合体の構成要素、ＤＮＡ結合能、エキソヌクレアーゼ活性が挙げられ、これらの機能が複合的に作用する結果、細胞の細胞周期停止、アポトーシス誘導、ＤＮＡ修復、ＤＮＡ複製調節及び分化誘導を引き起こすものと考えられる。
【００１５】
さらにｐ５３の機能は、遺伝子に損傷が生じたときのみに働くわけではなく、例えばウイルス感染、サイトカイン刺激、低酸素状態、ヌクレオチドプールの変化、薬物による代謝異常等の各種のストレスが生体組織に及ぶと、その刺激を引き金として、ｐ５３の量的若しくは質的な変化が起こると言われている。量的・質的調節を受けたｐ５３は、他のタンパク質との相互作用によるシグナル伝達や他の遺伝子の転写制御などの機能を発現し、生体ストレスを受けた生体組織の細胞のＤＮＡを複製調節したり、細胞周期を停止させて細胞を修復したり、アポトーシスによって細胞を排除したり、成いは細胞の分化を促進したりすることで生体組織をストレスから防御するのに寄与していると考えられている〔Ｇａｎｍａｎ，Ｃ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，９，６００−６１１（１９９５）：Ｇｒａｅｂｅｒ，Ｔ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７９，８８−９１（１９９６）：Ｌｉｎｋｅ，Ｓ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１０，９３４−９４７（１９９６）：Ｘｉａｎｇ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１６，６７５３−６７６５（１９９６）〕。
【００１６】
ヒト腫瘍の半数にｐ５３遺伝子の変異が存在することから、近年腫瘍の診断や治療に対して、ｐ５３遺伝子及びそのタンパクの臨床的応用が検討されている。ｐ５３遺伝子の変異部位を特異的に認識するプライマーを用いてＰＣＲを行い、リンパ節や体液中に浸潤した腫瘍細胞を検出する方法は、腫瘍の浸潤範囲或いは再発などを予測するための有効な診断方法となりうる〔Ｈａｙａｓｈｉ，Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３４５，１２５７−１２５９（１９９５）〕。
【００１７】
更にｐ５３には、アポトーシス誘導能があることから、ウイルスベクターを用いて腫瘍細胞に野生型ｐ５３遺伝子を導入する遺伝子治療が米国で行われており、その有効性が報告されている〔Ｒｏｔｈ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，２，９８５−９９１（１９９６）〕。また最近、日本においても数カ所でこのような遺伝子治療が開始されている。
【００１８】
その一方で、ヒト腫瘍の半数以上はｐ５３遺伝子の変異を有しておらず、このことからｐ５３に類似する腫瘍形成抑制機能を有する他のタンパクが存在する可能性が指摘されていた。
【００１９】
このような情況のもと、１９９７年８月、フランスのＣａｐｕｔらのグループによって偶然にもｐ５３遺伝子と高い相同性を有する新規な遺伝子（ｐ７３遺伝子）が発見された〔Ｋａｇｈａｄ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９０，８０９−８１９（１９９７）〕。上記ｐ７３遺伝子の産物であるｐ７３（タンパク）は、ｐ５３と同様に、転写活性化領域（１〜５４位）、ＤＮＡ結合領域（１３１〜３１０位）及びオリゴメリゼーション領域（３４５〜３８０位）の機能的領域を有しており、ｐ５３の各領域との相同性は、転写活性化領域において２９％、ＤＮＡ結合領域において６３％で、オリゴメリゼーション領域において３８％と、ＤＮＡ結合領域で最も高いことが明らかになっている。
【００２０】
その後、ｐ７３には、スプライシングの違いによる２種の分子量のタンパクがあることがわかり、先に見いだされた分子量約７０Ｋのものがｐ７３α、後に見いだされた分子量約５０Ｋのものがｐ７３βと称されている。最近ではさらにｐ７３γ及びｐ７３δと呼ばれる別の大きさのｐ７３も見いだされている。これらのｐ７３のスプライシング変異体は、ｐ７２αのＣ末端側のエキソン間の抜け方が異なっており、ｐ７３βはエキソン１２とエキソン１４の間が抜け、ｐ７３γはエキソン１０とエキソン１２の間が抜け、ｐ７３δはエキソン１０とエキソン１４の間が抜けた形を有している。
【００２１】
ｐ７３の機能については、ｐ５３と同様に、その過剰発現によって神経芽腫細胞株やＳＡＯＳ２細胞（骨肉腫細胞株）の増殖が抑制されること、またｐ７３の一時的な発現によってＳＡＯＳ２細胞とベビー・ハムスターの腎細胞のアポトーシスが促進されるなどが報告されている〔Ｂｒｕｃｅ Ｃｌｕｒｍａｎ ａｎｄＭａｒｋ Ｇｒｏｕｄｉｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ，３８９，１２２−１２３（１９９７）：Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８９，１９１−１９４（１９９７）〕。
【００２２】
かかるｐ７３の発見に続いて、本発明者らは、ヒト骨格筋のｃＤＮＡライブラリーからｐ５３遺伝子に類縁する新規遺伝子（ｐ５１遺伝子）を見いだし、その単離に成功した。ｐ５１にも、ｐ７３と同様にｍＲＮＡスプライシングの違いによる２種類の分子量のタンパクがあり、分子量約５１Ｋの短いほうをｐ５１Ａ、分子量約７０Ｋの長いほうをｐ５１Ｂと名付けた。このｐ５１もまた、ｐ５３及びｐ７３と同様に、転写活性化領域（１〜５９位）、ＤＮＡ結合領域（１４２〜３２１位）及びオリゴメリゼーション領域（ｐ５１Ａ：３５３〜３９７位、ｐ５１Ｂ：３５３〜６４１位）の機能的領域を有している。ｐ５１Ａ、ｐ５３及びｐ７３βの各領域間でのアミノ酸レベルの相同性から、各タンパクともＤＮＡ結合領域で最も相同性が高く、またｐ５１Ａがｐ７３βにより近い構成を有することが明らかになっている（図１参照）（Ｏｓａｄａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，：Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，４，８３９−８４３（１９９８））
さらに本発明者らの研究により、ｐ５１は、ｐ５３と同様に骨肉腫細胞系ＳＡＯＳ−２細胞に対してｐ５３と同程度のコロニー形成抑制能を示すこと、トランスジェニックマウス赤白血病細胞株等に対する実験でアポトーシス誘導作用を示すこと、並びにｐ５３と同様にｐ２１ＷＡＦ１プロモーターが有するｐ５３反応性配列を介してその転写活性能を活性化させる機能を有することが明らかになった（Ｏｓａｄａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，：Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，４，８３９−８４３（１９９８））。
【００２３】
これらのことから、ｐ７３及びｐ５１は、ｐ５３とともにｐ５３ファミリーを形成するｐ５３類縁タンパクと考えられている。また、ｐ７３遺伝子及びｐ５１遺伝子のｐ５３ファミリー遺伝子は、前述するようにいずれもｍＲＮＡのスプライシングに起因する分子量の異なるタンパクを複数種コードすることが分かっており、さらにｐ５１遺伝子からは前述のｐ５１Ａ及びｐ５１Ｂのほかに、ｐ４０（Ｔｒｉｎｋ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，：Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，４，７４７−７４８（１９９８））やｐ６３（Ｙａｎｇ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２，３０５−３１６（１９９８））などが作られることが報告されている。
【００２４】
このことから、ｐ５３、ｐ７３及びｐ５１（及びｐ４０、ｐ６３）とともに、ｐ５３ファミリーを形成するタンパク及びその遺伝子が新たに見いだされることも期待される。
【００２５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、優れた細胞増殖抑制能を発揮し得る新規遺伝子を提供することを目的とする。より詳細には、本発明はｐ５３遺伝子またはそのタンパクよりも有意に優れた特性を有するｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子並びにそのタンパクを提供することを目的とする。
【００２６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らが先に見いだしたｐ５１Ａ及びｐ５１Ｂは、互いに共通するアミノ末端側の４０８アミノ酸残基からなるポリペプチドと、更にそれに続いてｐ５１Ａは追加の４０アミノ酸残基からなるポリペプチド、及びｐ５１Ｂは追加の２３３アミノ酸残基からなるポリペプチドとからなるタンパクである。両者は互いに共通する転写活性化領域及びＤＮＡ結合領域を有しており、Ｃ末端側のアミノ酸配列のみ相違している。これらは、前述の通り、ｐ５３やｐ７３と同様にアポトーシス誘導作用を奏するが、本発明者らのその後の研究により、その転写活性能及びアポトーシス誘導能は互いに相違しており、いずれもｐ５１Ａのほうがｐ５１Ｂよりも強い能力を有することがわかった。
【００２７】
本発明者らは、この相違を明らかにするため、ｐ５３のＮ末端側（転写活性化領域及びＤＮＡ結合領域を含む）とｐ５１Ａ又はｐ５１ＢのＣ末端側（オリゴメリゼーション領域を含む）とからなるｐ５３−ｐ５１Ａおよびｐ５３−ｐ５１Ｂの融合タンパク（キメラタンパク）を発現するキメラ遺伝子構築物を作成し、それを用いて、ｐ５３欠損ＳＡＯＳ−２細胞を用いたＢＡＸ−２プロモーター−ルシフェラーゼアッセイを行ったところ、これらのキメラタンパクは、ｐ５３及びｐ５１Ａ自身の転写活性能の約３０倍に至る強い活性化能を示すことが判明した。これは、ｐ５１Ａ及びｐ５１Ｂのオリゴメリゼーション領域が単に転写抑制に機能するだけでなく、何らかのｐ５３の機能活性に関与していることを示唆するものである。
【００２８】
かかる知見を発端に、本発明者らはさらにｐ５３ファミリーに属するｐ５１、ｐ５３及びｐ７３に由来する転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域を含む種々のキメラタンパクを発現するようにキメラ遺伝子構築物を作成し、それを用いて上記と同様にルシフェラーゼアッセイを行ったところ、期せずして、１）あるキメラは、ｐ５３、ｐ５１及びｐ７３そのものよりも２０倍もの高い転写活性能を示すこと、２）キメラはｐ５３によって転写調節をうける各種の遺伝子（プロモーター）に対して著しく異なった選択性を示すこと、３）あるキメラは、野生型ｐ５３の機能をドミナントネガティブに阻害する変異ｐ５３の作用に強い抵抗性を示し、さらには変異ｐ５３の存在下においてｐ５３よりも５０倍もの強い転写活性能を示すこと、を見いだした。
【００２９】
ｐ５３遺伝子の細胞増殖抑制能、細胞周期におけるＧ１期停止の誘導及びアポトーシス誘導作用などの機能は、ｐ５３反応性配列を介したプロモーターの転写活性能に依存することが分かっている。
【００３０】
このことから、本発明者らは、上記ｐ５３ファミリー遺伝子間における種々のキメラによれば、ｐ５３が有する生物学的機能ないしは生理活性等の特性を向上ないしは改善することができ、ひいては悪性腫瘍等の遺伝子治療への適用において有用であると確信して、またｐ５３ファミリータンパクの機能解析に極めて有用であると確信して、本発明を開発するにいたった。
【００３１】
すなわち、本発明は下記（１）及び（２）に示すｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子である：
（１）下流方向に向けて、ｐ５３ファミリーに属するいずれかのタンパクの転写活性化領域をコードする塩基配列；ｐ５３ファミリーに属するいずれかのタンパクのＤＮＡ結合領域をコードする塩基配列；及びｐ５３ファミリーに属するいずれかのタンパクのオリゴメリゼーション領域をコードする塩基配列を有するｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子（但し、上記転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域の各領域がいずれも同一のタンパクに由来するものを除く）。
（２）下流方向に向けて、ｐ５１、ｐ５３及びｐ７３よりなる群から選択されるいずれかのタンパクの転写活性化領域をコードする塩基配列；ｐ５１、ｐ５３及びｐ７３よりなる群から選択されるいずれかのタンパクのＤＮＡ結合領域をコードする塩基配列；及びｐ５１、ｐ５３及びｐ７３よりなる群から選択されるいずれかのタンパクのオリゴメリゼーション領域をコードする塩基配列を有するｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子（但し、上記転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域の各領域がいずれも同一のタンパクに由来するものを除く）。
【００３２】
さらに本発明は、下記（３）及び（４）に示すｐ５３ファミリーのキメラタンパクである：
（３）ｐ５３ファミリーに属するいずれかのタンパクの転写活性化領域のアミノ酸配列、ｐ５３ファミリーに属するいずれかのタンパクのＤＮＡ結合領域のアミノ酸配列、及びｐ５３ファミリーに属するいずれかのタンパクのオリゴメリゼーション領域のアミノ酸配列を有するｐ５３ファミリーのキメラタンパク（但し、上記転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域の各領域がいずれも同一のタンパクに由来するものを除く）。
（４）ｐ５１、ｐ５３及びｐ７３よりなる群から選択されるいずれかのタンパクの転写活性化領域のアミノ酸配列、ｐ５１、ｐ５３及びｐ７３よりなる群から選択されるいずれかのタンパクのＤＮＡ結合領域のアミノ酸配列、及びｐ５１、ｐ５３及びｐ７３よりなる群から選択されるいずれかのタンパクのオリゴメリゼーション領域のアミノ酸配列を有するｐ５３ファミリーのキメラタンパク（但し、上記転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域の各領域がいずれも同一のタンパクに由来するものを除く）。
【００３３】
なお、本発明において遺伝子（ＤＮＡ）とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各１本鎖のＤＮＡを包含する趣旨であり、またその長さに何ら制限されるものではない。従って、本発明の遺伝子（ＤＮＡ）には、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、及びｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（センス鎖）、並びに該センス鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）、およびそれらの断片のいずれもが含まれる。
【００３４】
以下、本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本、米国及び欧州の三極特許庁）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００３５】
【発明の実施の形態】
（１）ｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子
前述するように、ｐ５３ファミリータンパクは、Ｎ末領域から順に、転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域、及びオリゴメリゼーション領域と称される少なくとも３つの機能的領域を有している。
【００３６】
本発明のキメラ遺伝子は、かかる３つの機能的領域のうち少なくとも１つの領域が、ｐ５３ファミリーに属する個々の異なるタンパクに由来する領域となるように再構成されたキメラタンパクをコードするように構成される。
【００３７】
具体的には、上流から下流に向けて、ｐ５３ファミリーに属するいずれかのタンパクの転写活性化領域をコードする塩基配列、ｐ５３ファミリーに属するいずれかのタンパクのＤＮＡ結合領域をコードする塩基配列、及びｐ５３ファミリーに属するいずれかのタンパクのオリゴメリゼーション領域をコードする塩基配列を有するキメラ遺伝子である。但し、この場合各機能的領域がいずれも同一のタンパクに由来するものは除外される。
【００３８】
本発明において「ｐ５３ファミリー」とは、癌抑制遺伝子であるヒトｐ５３遺伝子及びその遺伝子産物（タンパク）と、構造的特徴並びに生物学的機能や生理機能などの類似性によりひとつの遺伝子ファミリーと認識される一連の関連遺伝子及びそのタンパクを意味するものであり、スプライシング変異体やアレル体（対立遺伝子）をも包含するものである。
【００３９】
また、当該「ｐ５３ファミリー」には、将来、該ファミリーに属するものとして見いだされ得るｐ５３類縁遺伝子及びそのタンパクも包含されるものとする。なお、本明細書において遺伝子とタンパクの別を明確にするために、ｐ５３ファミリー遺伝子及びｐ５３ファミリータンパクという場合がある。
【００４０】
「ｐ５３ファミリー」として、中でも好ましくはｐ５３、ｐ５１、ｐ７３である。
【００４１】
かかるｐ５３、ｐ５１及びｐ７３を例に挙げると、本発明の具体的なキメラ遺伝子は、下流方向に向けて、ｐ５３、ｐ５１及びｐ７３よりなる群から選択されるいずれかのタンパクの転写活性化領域をコードする塩基配列、ｐ５３、ｐ５１及びｐ７３よりなる群から選択されるいずれかのタンパクのＤＮＡ結合領域をコードする塩基配列、及びｐ５３、ｐ５１及びｐ７３よりなる群から選択されるいずれかのタンパクのオリゴメリゼーション領域をコードする塩基配列を有するキメラ遺伝子である。但し、上記各領域がいずれも同一のタンパクに由来するものは除外される。なお、ここでｐ５１及びｐ７３には、いずれも選択的スプライシングによって生じるアイソタイプが含まれる。
【００４２】
より具体的に本発明のキメラ遺伝子としては、例えば表１に示す各種の態様で、転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域の各領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するものを挙げることができる。
【００４３】
【表１】
より詳細には、ｐ５３の転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域は、ｐ５３のアミノ酸配列を示す図２（ｂ）（配列番号５）において、それぞれアミノ酸番号１〜４５位、アミノ酸番号１１３〜２９０位及びアミノ酸番号３１９〜３６３位で特定される。
【００４５】
また、ｐ５１の転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域は、ｐ５１Ａ又はＢのアミノ酸配列を示す配列番号１又は３において、それぞれアミノ酸番号１〜５９位、アミノ酸番号１４２〜３２１位及びアミノ酸番号３５３〜３９７位で特定される。
【００４６】
また、ｐ７３の転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域は、ｐ７３α，β、γ及びδそれぞれのアミノ酸配列を示す図３（ｂ）（配列番号６）、図４（ｂ）（配列番号７）、図５（ｂ）（配列番号８）及び図６（ｂ）（配列番号９）において、それぞれアミノ酸番号１〜５４位、アミノ酸番号１３１〜３１０位及びアミノ酸番号３４５〜３８０位で特定される。
【００４７】
なお、上記の各ｐ５３ファミリーのオリゴメリゼーション領域は、各タンパクのＣ末端位まで延長された領域として特定することもできる。例えば、ｐ５１Ｂのオリゴメリゼーション領域は、ｐ５１Ｂのアミノ酸配列を示す配列番号３において、アミノ酸番号３５３〜６４１位として特定できる。
【００４８】
なお、上記各領域は、前述する特定の位置及びアミノ酸配列によって限定されるものではなく、各アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。その限度として、各領域を種々組み合わせて構築される本発明のキメラタンパクがｐ５３と同等もしくはそれ以上の生理学的活性（生理的機能）を有することが望まれる。ここでｐ５３の機能又は活性としては、細胞における転写調節機能、他の細胞内蛋白質と結合することによるシグナル伝達機能、ＤＮＡ複製に関する蛋白質複合体の構成要素としての働き、ＤＮＡ結合能及びエキソヌクレアーゼ活性等、またこれらの機能が複合的に作用することに発揮される細胞の細胞周期停止機能，アポトーシス誘導作用，ＤＮＡ修復機能，ＤＮＡ複製調節又は分化誘導作用等のいずれかを挙げる子ができる。好ましくは転写活性能または細胞増殖抑制活性である。
【００４９】
アミノ酸配列の改変は、天然において、例えば突然変異や翻訳後の修飾等により生じることもあるが、天然由来の遺伝子に基づいて人為的に改変することもできる。本発明は、このような改変の原因及び手段等を問わず、上記する少なくとも３つの機能的領域を含むキメラタンパクをコードする全てのキメラ遺伝子を包含するものである。
【００５０】
上記の人為的な改変手段としては、例えばサイトスペシフィック・ミュータジェネシス〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３５０，３６７−３８２（１９８７）；同１００，４６８（１９８３）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）；続生化学実験講座１「遺伝子研究法ＩＩ」、日本生化学会編，ｐ１０５（１９８６）〕等の遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法等の化学合成手段〔Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８９，４８０１（１９６７）；同９１，３３５０（１９６９）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５０，１７８（１９６８）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，２２，１８５９（１９８１）；同２４，２４５（１９８３）〕及びそれらの組合せ方法等が例示できる。より具体的には、ＤＮＡの合成は、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法による化学合成によることもでき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用い相補鎖を付加するかによって、化学合成した一本鎖生成物から得ることもできる。
【００５１】
なお、上記各転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域は、連続的又は非連続的を問わず、上流から下流方向にむかって順次配列されていればよい。非連続的に配列されている場合、各領域間のアミノ酸配列は特に制限されず、任意に定めることができるが、ｐ５３、ｐ５１及びｐ７３で代表されるｐ５３ファミリータンパクに由来する配列であるのが好ましく、具体的には、各タンパクの転写活性化領域を含むＮ末端ドメイン、ＤＮＡ結合領域を含むコアドメイン及びオリゴメリゼーション領域を含むＣ末端ドメインからなるキメラタンパクをコードするものを例示することができる。
【００５２】
本発明のキメラ遺伝子のより具体的な態様を例示すれば、図２（ａ）（配列番号１０）に示される塩基配列において塩基番号１〜２９１で特定される塩基配列、配列番号２又は４に示される塩基配列において塩基番号１４５〜５２２で特定される塩基配列、または図３（ａ）（配列番号１１）、図４（ａ）（配列番号１２）、図５（ａ）（配列番号１３）及び図６（ａ）（配列番号１４）に示される塩基配列において塩基番号１〜３４５で特定される塩基配列のいずれかの塩基配列（転写活性化領域をコードする塩基配列）；図２（ａ）（配列番号１０）に示される塩基配列において塩基番号２９２〜９１２で特定される塩基配列、配列番号２又は４に示される塩基配列において塩基番号５２３〜１１４９で特定される塩基配列、または図３（ａ）（配列番号１１）、図４（ａ）（配列番号１２）、図５（ａ）（配列番号１３）及び図６（ａ）（配列番号１４）に示される塩基配列において塩基番号３４６〜９７８で特定される塩基配列のいずれかの塩基配列（ＤＮＡ結合領域をコードする塩基配列）；及び図２（ａ）（配列番号１０）に示される塩基配列において塩基番号９１３〜１１７９で特定される塩基配列、配列番号２に示される塩基配列において塩基番号１１５０〜１４８８で特定される塩基配列、配列番号４に示される塩基配列において塩基番号１１５０〜２０６７で特定される塩基配列、図３（ａ）（配列番号１１）に示される塩基配列において塩基番号９７９〜１９０８で特定される塩基配列、図４（ａ）（配列番号１２）に示される塩基配列において塩基番号９７９〜１４９７で特定される塩基配列、図５（ａ）（配列番号１３）に示される塩基配列において塩基番号９７９〜１４２５で特定される塩基配列または図６（ａ）（配列番号１４）に示される塩基配列において塩基番号９７９〜１２０９で特定される塩基配列のいずれかの塩基配列（オリゴメリゼーション領域をコードする塩基配列）を、下流方向に向かって順に連続的若しくは非連続的に有する遺伝子を例示することができる。但し、上記３つの各領域をコードする塩基配列がいずれも同一のｐ５３ファミリー遺伝子に由来するものは除外される。
【００５３】
これらの塩基配列は、前述の各領域のアミノ酸配列の各アミノ酸残基をコードするコドンの一つの組合せ例でもある。このため、本発明の遺伝子はこれら特定の塩基配列を有する遺伝子に限らず、各アミノ酸残基に対して任意のコドンを組合せ、選択した塩基配列を有することも可能である。コドンの選択は、常法に従うことができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻度等を考慮することができる〔Ｎｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，４３（１９８１）〕。
【００５４】
更に、本発明の遺伝子は、前記の塩基配列と一定の相同性を有する塩基配列からなるものも包含する。かかる遺伝子としては、例えば、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃又は０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃のストリンジェントな条件下で上記塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズする塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。
【００５５】
本発明の遺伝子は、本発明により特定される塩基配列の情報に基づいて、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｄ Ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ」、日本生化学会編（１９８６）等参照〕。
【００５６】
具体的には、ｐ５３ファミリー遺伝子を利用して、例えばＰＣＲ法及び制限酵素処理等の常法に従って、それらの機能的領域を所望の通りに再構成することにより実施することができる。
【００５７】
なお、上記においてｐ５３ファミリー遺伝子が既知のものを利用でき、あるいは公知の配列に基づいて常法に従って調製することができる。例えば、各ｐ５３ファミリーのｃＤＮＡの起源としては、ｐ５３ファミリー遺伝子を発現する各種の細胞、組織やこれらに由来する培養細胞等が例示される。また、これらからの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従って実施することができる。また、ｃＤＮＡライブラリーは市販されてもおり、本発明においてはそれらｃＤＮＡライブラリー、例えばクローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂ．Ｉｎｃ．）等より市販されている各種ｃＤＮＡライブラリー等を用いることもできる。
【００５８】
ｐ５３ファミリー遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。
【００５９】
具体的には、例えばｐ５３ファミリーｃＤＮＡによって産生されるタンパク質に対して、該タンパク質特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｐ５３ファミリーのｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的の塩基配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等やこれらの組合せ等を例示できる。
【００６０】
ここで用いられるプローブとしては、本発明のｐ５３ファミリー遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたＤＮＡ等が一般的に例示できるが、既に取得されたｐ５３ファミリー遺伝子そのものやその断片も良好に利用できる。また、ｐ５３ファミリー遺伝子の塩基配列情報に基づき設定したセンス・プライマー、アンチセンス・プライマーをスクリーニング用プローブとして用いることもできる。
【００６１】
ｐ５３ファミリー遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０（１９８５）〕またはその変法によるＤＮＡ若しくはＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法〔Ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ；実験医学、１２（６），３５（１９９４）〕、特に５’−ＲＡＣＥ法〔Ｍ．Ａ．Ｆｒｏｈｍａｎ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８，８９９８（１９８８）〕等の採用が好適である。
【００６２】
かかるＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーは、ｐ５３ファミリー遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定することができ、これは常法に従って合成できる。尚、増幅させたＤＮＡ若しくはＲＮＡ断片の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法、ハイブリダイゼーション法等によることができる。
【００６３】
上記の方法で得られる本発明のキメラ遺伝子は、例えばジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，７４，５４６３（１９７７）〕やマキサム−ギルバート法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９（１９８０）〕等の常法に従って、また簡便には市販のシークエンスキット等を用いて、その塩基配列を決定することができる。
【００６４】
本発明のキメラ遺伝子は、現在癌抑制遺伝子として位置づけられているｐ５３遺伝子と同様に、癌の遺伝子治療剤として有用である。
【００６５】
本発明のキメラ遺伝子又はその遺伝子産物としては、好ましくはｐ５３遺伝子またはその産物が有する生理学的活性（生理的機能）と同等もしくはそれ以上の活性（機能）を有することによって特徴づけられるものを例示することができる。ここでｐ５３の機能又は活性としては、細胞における転写調節機能、他の細胞内蛋白質と結合することによるシグナル伝達機能、ＤＮＡ複製に関する蛋白質複合体の構成要素としての働き、ＤＮＡ結合能及びエキソヌクレアーゼ活性等、またこれらの機能が複合的に作用することに発揮される細胞の細胞周期停止機能，アポトーシス誘導作用，ＤＮＡ修復機能，ＤＮＡ複製調節又は分化誘導作用等を挙げることができる。
【００６６】
また本発明のキメラ遺伝子又はその遺伝子産物としては、より好ましくは、上記の機能又は活性、具体的にはｐ５３によって転写調節を受ける各種遺伝子への異なった選択性を示すことによって特徴づけられるものを例示することができる。これらは、例えばＢＡＸ２、ＭＤＭ２−Ｐ２、ｐ２１ＷＡＦ１、１４−３−３ｓ及びＲＧＣプロモーターのいずれかへの転写活性能の選択性により特徴づけられる。
【００６７】
さらにまた本発明のキメラ遺伝子又はその遺伝子産物としては、より好ましくは、野生型ｐ５３の上記機能及び活性をドミナントネガティブに阻害する変異ｐ５３の効果（ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ｐ５３）に強い抵抗性を有することによって特徴づけられるものを例示することができる。
【００６８】
これらの本発明のキメラ遺伝子又はその遺伝子産物のより好ましい具体的態様は、後述する実施例において詳述される。
（２）ｐ５３ファミリーのキメラタンパク
従って、本発明は前述するキメラ遺伝子によってコードされるキメラタンパクを提供する。
【００６９】
本発明のキメラタンパクの具体的態様としては、Ｎ端からＣ端方向に向けて、連続的若しくは非連続的に、図２（ｂ）（配列番号５）で示されるアミノ酸番号１〜４５位、配列番号１または３で示されるアミノ酸番号１〜５９位、又は図３（ｂ）（配列番号６）、図４（ｂ）（配列番号７）、図５（ｂ）（配列番号８）及び図６（ｂ）（配列番号９）で示されるアミノ酸番号１〜５４位でのいずれかで特定されるアミノ酸配列（転写活性化領域）；図２（ｂ）（配列番号５）で示されるアミノ酸番号１１３〜２９０位、配列番号１または３で示されるアミノ酸番号１４２〜３２１位、又は図３（ｂ）（配列番号６）、図４（ｂ）（配列番号７）、図５（ｂ）（配列番号８）及び図６（ｂ）（配列番号９）で示されるアミノ酸番号１３１〜３１０位でのいずれかで特定されるアミノ酸配列（ＤＮＡ結合領域）；および図２（ｂ）（配列番号５）で示されるアミノ酸番号３１９〜３６３位、配列番号１のアミノ酸番号３５３〜３９７位、配列番号３で示されるアミノ酸番号３５３〜６４１位、図３（ｂ）（配列番号６）で示されるアミノ酸番号３４５〜６３６位、図４（ｂ）（配列番号７）で示されるアミノ酸番号３４５〜４９９位、図５（ｂ）（配列番号８）で示されるアミノ酸番号３４５〜４７５位または図６（ｂ）（配列番号９）で示されるアミノ酸番号３４５〜４０３位のいずれかで特定されるアミノ酸配列（オリゴメリゼーション領域）を有することで特徴づけられるものを挙げることができる。ただし、本発明のキメラタンパクは、上記特定のアミノ酸配列に限定されず、それらと相同物であればよい。
【００７０】
相同物としては、上記各キメラタンパクのアミノ酸配列において、細胞増殖抑制活性、好ましくはｐ５３の該活性よりも優れた細胞増殖抑制活性を有することを限度として、各アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたものを挙げることができる。
【００７１】
本発明のキメラタンパクは、本発明で提供するアミノ酸配列に基づいて化学合成により、または前述するキメラ遺伝子の配列情報に基づいて常法の遺伝子組換え技術〔例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１３０，６９２（１９８５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８０，５９９０（１９８３）等参照〕に従って調製することができる。
（３）ｐ５３ファミリー・キメラタンパクの製造法及び製造に使用するもの
また本発明は、ｐ５３ファミリー・キメラタンパクの製造方法、並びにその製造に用いられる、例えば上記キメラ遺伝子を含有するベクター、該ベクターによって形質転換された宿主細胞を提供するものである。
【００７２】
該タンパクの製造は、より詳細には、該所望のタンパクをコードする遺伝子が宿主細胞中で発現できるように組換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から所望のタンパクを回収することにより行なわれる。
【００７３】
ここで宿主細胞としては、真核生物及び原核生物のいずれをも用いることができる。
【００７４】
真核生物の細胞には、脊椎動物、酵母等の真核微生物の細胞が含まれる。脊椎動物細胞としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Ｃｅｌｌ，２３，１７５（１９８１）〕、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞及びそれらのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｌ．，ＵＳＡ．，７７，４２１６（１９８０）〕等が通常よく用いられるが、これらに限定される訳ではない。また、真核微生物としては、酵母が一般によく用いられ、中でもサッカロミセス属酵母が有利に利用できる。
【００７５】
原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌が一般によく用いられる。大腸菌のなかでも、特にエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２株等がよく用いられる。
【００７６】
発現ベクターは、本発明のキメラ遺伝子を含んでおり且つ該遺伝子を発現することができるものであれば特に制限されず、一般に宿主細胞との関係から適宜選択される。
【００７７】
宿主細胞として脊椎動物細胞を使用する場合、発現ベクターとしては、通常発現しようとする本発明の遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを使用でき、これは更に必要により複製起点を有していてもよい。該発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ 〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，８５４（１９８１）〕等を例示することができる。
【００７８】
宿主細胞として酵母等の真核微生物の細胞を使用する場合、発現ベクターとしては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモーターを有するｐＡＭ８２〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８０，１（１９８３）〕等を利用でき、本発明のベクターは該プロモーターの上流域に本発明の遺伝子を挿入することによって調製することができる。好適には、原核生物遺伝子と融合した融合ベクターを挙げることができ、該ベクターの具体例としては、例えば分子量２６０００のＧＳＴドメイン（Ｓ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ由来）を有するｐＧＥＸ−２ＴＫやｐＧＥＸ−４Ｔ−２等が例示される。
【００７９】
宿主細胞として原核生物の細胞を使用する場合、発現ベクターとしては、例えば該宿主細胞中で複製可能なプラスミドベクターであって、このベクター中に所望遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ（シヤイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、更にタンパク合成開始に必要な開始コドン（例えばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを挙げることができる。特に大腸菌（例えばエシエリヒア・コリＫ１２株等）を宿主細胞をして用いる場合は、発現ベクターとしては一般にｐＢＲ３２２及びその改良ベクターがよく用いられる。ただしこれらに限定されず公知の各種の菌株及びベクターをも利用できる。なお、上記プロモーターとしては、例えばトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬ／ＰＲプロモーター等を使用できる。
【００８０】
かかる本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入する方法並びにこれによる形質転換方法は、特に限定されず、一般的な各種方法を採用することができる。
【００８１】
また得られる形質転換体は、常法に従い培養でき、該培養により所望のように設計した遺伝子によりコードされる本発明の目的のタンパクが、形質転換体の細胞内、細胞外又は細胞膜上に発現、生産（蓄積、分泌）される。
【００８２】
該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。
【００８３】
斯くして得られる本発明の組換えタンパクは、所望により、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作〔「生化学データーブックＩＩ」、１１７５−１２５９頁、第１版第１刷、１９８０年６月２３日株式会社東京化学同人発行；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５（２５），８２７４（１９８６）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６３，３１３（１９８７）等参照〕により分離、精製できる。
【００８４】
該方法としては、具体的には、通常の再構成処理、タンパク沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せが例示でき、特に好ましい方法としては、本発明のタンパクに対する特異的な抗体を結合させたカラムを利用したアフィニティクロマトグラフィー等を例示することができる。
【００８５】
また、キメラ遺伝子でコードされるアミノ酸配列において、その一部のアミノ酸残基ないしはアミノ酸配列を置換、欠失、付加等により改変する場合には、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス等の前記した各種方法により行うことができる。
【００８６】
本発明のタンパクはまた、本発明によって提供されるアミノ酸配列の情報に基づいて、一般的な化学合成法により製造することができる。該方法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が包含される。
【００８７】
かかるペプチド合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていく所謂ステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含し、本発明ペプチドの合成は、そのいずれによってもよい。
【００８８】
上記ペプチド合成に採用される縮合法も、常法に従うことができ、例えば、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）法、ウッドワード法等を例示できる。
【００８９】
これら各方法に利用できる溶媒も、この種ペプチド縮合反応に使用されることのよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。
【００９０】
尚、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸乃至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第３級ブチルエステル等の低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステル等のアラルキルエステル等として保護することができる。
【００９１】
また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばチロシン残基の水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第３級ブチル基等で保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行なう必要はない。更に、例えばアルギニン残基のグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基等の適当な保護基により保護することができる。
【００９２】
上記保護基を有するアミノ酸、ペプチド及び最終的に得られる本発明タンパク質におけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸等を用いる方法等に従って実施することができる。
【００９３】
斯くして得られる本発明のタンパク質は、前記した各種の方法、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、向流分配法等のペプチド化学の分野で汎用される方法に従って、適宜精製を行なうことができる。
【００９４】
また、本発明のキメラタンパクは、これを有効成分とする医薬品として医薬分野において有用である。
（４）ｐ５３ファミリー・キメラタンパクを含む医薬組成物（医薬製剤）
本発明は前述する本発明のキメラタンパクを有効成分として含む医薬組成物（医薬製剤）に関する。
【００９５】
該タンパクは、その医薬的に許容される塩の態様で配合されていてもよい。かかる塩は当業界で周知の方法により調製され、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウム等の無毒性アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩及びアンモニウム塩等が包含される。更に上記塩には、本発明のタンパクと適当な有機酸ないし無機酸との反応による無毒性酸付加塩も包含される。代表的無毒性酸付加塩としては、例えば塩酸塩、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、硼酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩（トシレート）、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、スルホン酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩及びナプシレート等が例示される。
【００９６】
本発明の医薬組成物は、ｐ５３ファミリー・キメラタンパクを薬学的有効量含むものであればよいが、他成分として、薬学的に許容される無毒性医薬担体ないしは希釈剤と含むことができる。
【００９７】
上記医薬組成物（医薬製剤）に利用できる医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤或は賦形剤等を例示でき、これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択使用される。
【００９８】
また、当該医薬組成物は、通常のタンパク製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤等を適宜配合することもできる。
【００９９】
上記安定化剤としては、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等を例示でき、これらは単独で又は界面活性剤等と組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。
【０１００】
上記Ｌ−アミノ酸としては、特に限定はなくいずれのものをも使用できるが、例えばグリシン、システィン、グルタミン酸等が例示される。
【０１０１】
糖類としても特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類；マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール；ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類；デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等及びそれらの誘導体等を使用できる。
【０１０２】
界面活性剤としても特に限定はなく、イオン性（カチオン性、アニオン性）及び非イオン性界面活性剤のいずれも使用でき、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等を使用できる。
【０１０３】
セルロース誘導体としても特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等を使用できる。
【０１０４】
上記糖類の添加量は、有効成分であるキメラタンパク１μｇ当り約０．０００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０１〜１０ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。界面活性剤の添加量は、有効成分であるキメラタンパク１μｇ当り約０．００００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０００１〜０．０１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。ヒト血清アルブミンの添加量は、有効成分１μｇ当り約０．０００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．００１〜０．１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。アミノ酸は、有効成分１μｇ当り約０．００１〜１０ｍｇ程度とするのが適当である。また、セルロース誘導体の添加量は、有効成分１μｇ当り約０．００００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．００１〜０．１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。
【０１０５】
本発明の医薬組成物中に含まれるキメラタンパクの量は、制限されることなく広い範囲から適宜選択されるが、通常約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。
【０１０６】
また本発明の医薬組成物中には、各種添加剤、例えば緩衝剤、等張化剤、キレート剤等をも添加することができる。
【０１０７】
ここで緩衝剤としては、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸及び／又はそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）等を例示できる。等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等を例示できる。またキレート剤としては、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸等を例示できる。
【０１０８】
本発明の医薬組成物は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥し保存し得る状態にした後、用時水、生埋的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することも可能である。
【０１０９】
本発明の医薬製剤はその投与形態を治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとしては、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれ、これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（注射剤、点滴剤）、経鼻剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、軟膏剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形乃至調製することができる。
【０１１０】
例えば、錠剤の形態に成形するに際しては、上記製剤担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウム等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤；カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム等の崩壊剤：ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド等の界面活性剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、デンプン等の保湿剤；デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を使用できる。
【０１１１】
更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠とすることができ、また二重錠ないしは多層錠とすることもできる。
【０１１２】
丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤；ラミナラン、カンテン等の崩壊剤等を使用できる。
【０１１３】
カプセル剤は、常法に従い通常本発明の有効成分を上記で例示した各種の製剤担体と混合して硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセル等に充填して調製される。
【０１１４】
経口投与用の液体投与形態は、慣用される不活性希釈剤、例えば水、を含む医薬的に許容される溶液、エマルジョン、懸濁液、シロップ、エリキシル等を包含し、更に湿潤剤、乳剤、懸濁剤等の助剤を含ませることができ、これらは常法に従い調製される。
【０１１５】
非経口投与用の液体投与形態は、希釈剤として例えば滅菌水、エチルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及びオリーブ油等といった植物油等を使用し、例えば液体、エマルジョン、懸濁液等の形状を有する注射剤や点滴剤に調製することができる。またこれらの非経口投与剤には、注入投与可能な有機エステル類、例えばオレイン酸エチル等を配合することもでき、更に通常の溶解補助剤、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、分散剤等を添加することもできる。
【０１１６】
滅菌は、例えばバクテリア保留フィルターを通過させる濾過操作、殺菌剤の配合、照射処理及び加熱処理等により実施できる。また、これらは使用直前に滅菌水や適当な滅菌可能媒体に溶解することのできる滅菌固体組成物形態に調製することもできる。
【０１１７】
坐剤や膣剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として、例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン及び半合成グリセライド等を使用できる。
【０１１８】
ペースト、クリーム、ゲル等の軟膏剤の形態に成形するに際しては、希釈剤として、例えば白色ワセリン、パラフイン、グリセリン、セルロース誘導体、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト及びオリーブ油等の植物油等を使用できる。
【０１１９】
経鼻又は舌下投与用組成物は、周知の標準賦形剤を用いて、常法に従い調製することができる。
【０１２０】
尚、本発明の医薬組成物には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬有効成分等を含有させることもできる。
【０１２１】
上記医薬組成物（医薬製剤）の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等に応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤は経口投与され、注射剤は単独で又はブドウ糖やアミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じ単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、坐剤は直腸内投与され、膣剤は膣内投与され、経鼻剤は鼻腔内投与され、舌下剤は口腔内投与され、軟膏剤は経皮的に局所投与される。
【０１２２】
上記医薬組成物中に含有される本発明のキメラタンパクの量及びその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件等に応じて広範囲より適宜選択されるが、一般的には、該投与量は、通常、１日当り体重１ｋｇ当り、約０．０１μｇ〜１０ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度とするのがよく、該製剤は１日に１〜数回に分けて投与することができる。
（５）遺伝子治療
また本発明は、前述する本発明のキメラ遺伝子を利用して行う遺伝子治療法を提供する。該治療法は、例えば変異ｐ５３遺伝子を有するか若しくは野生型（正常）ｐ５３遺伝子を欠損した細胞に、野生型ｐ５３機能以上の機能を供給する方法としてとらえることができる。かかる野生型ｐ５３遺伝子若しくはその遺伝子産物が本来的に有する機能以上の優れた機能を細胞に供給すれば、受容細胞／標的細胞における新生物の増殖を有意に抑制することができる。上記キメラ遺伝子は、当該遺伝子を染色体外に維持するようなベクターまたはプラスミドを用いて目的の細胞に導入することができる。この場合、当該遺伝子は、染色体外から発現される。
【０１２３】
このように変異ｐ５３遺伝子を有するか若しくはｐ５３遺伝子を欠損した細胞に、本発明のキメラ遺伝子を導入して所望の機能を発現させる場合、当該キメラ遺伝子は前述するように特定の塩基配列を有するものである必要はなく、例えば上記キメラ遺伝子の所望機能と実質的に同質な機能を保持する限りにおいて、前記塩基配列の１若しくは複数の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列を有する改変体であることもできる。
【０１２４】
キメラ遺伝子又はその一部分は、細胞に存在する内因的な突然変異体との間で組換えが起こるように突然変異細胞に導入することが好ましい。このような組換えには、ｐ５１遺伝子突然変異が修正される二重組換えの発生が必要とされる。
【０１２５】
かかる組換え及び染色体外維持の双方のための所望遺伝子の導入のためのベクターは、当該分野において既に知られており、本発明ではかかる既知のベクターのいずれもが使用できる。例えば、発現制御エレメントに連結したキメラ遺伝子のコピーを含み、かつ目的の細胞内で当該遺伝子産物を発現できるウイルスベクターまたはプラスミドベクターを挙げることができる。かかるベクターとして、通常前述する発現用ベクターを利用することもできるが、好適には、例えば起源ベクターとして、米国特許第５２５２４７９号明細書及びＰＣＴ国際公開ＷＯ９３／０７２８２号明細書に開示されたベクター（ｐＷＰ−７Ａ、ｐＷＰ−１９、ｐＷＵ−１、ｐＷＰ−８Ａ、ｐＷＰ−２１及び／又はｐＲＳＶＬなど）又はｐＲＣ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を用いて、調製されたベクターを挙げることができる。より好ましくは、後述する各種ウイルス・ベクターである。
【０１２６】
なお、遺伝子導入治療において用いられるベクターに使用されるプロモーターとしては、各種疾患の治療対象となる患部組織に固有のものを好適に利用することができる。
【０１２７】
その具体例としては、例えば、肝臓に対しては、アルブミン、α−フェトプロティン、α１−アンチトリプシン、トランスフェリン、トランススチレンなどを例示できる。結腸に対しては、カルボン酸アンヒドラーゼＩ、カルシノエンブロゲンの抗原などを例示できる。子宮及び胎盤に対しては、エストロゲン、アロマターゼサイトクロームＰ４５０、コレステロール側鎖切断Ｐ４５０、１７アルファーヒドロキシラーゼＰ４５０などを例示できる。
【０１２８】
前立腺に対しては、前立腺抗原、ｇｐ９１−フォックス遺伝子、前立腺特異的カリクレインなどを例示できる。乳房に対しては、ｅｒｂ−Ｂ２、ｅｒｂ−Ｂ３、β−カゼイン、β−ラクトグロビン、乳漿タンパク質などを例示できる。肺に対しては、活性剤タンパク質Ｃウログロブリンなどを例示できる。皮膚に対しては、Ｋ−１４−ケラチン、ヒトケラチン１又は６、ロイクリンなどを例示できる。
【０１２９】
脳に対しては、神経膠繊維質酸性タンパク質、成熟アストロサイト特異タンパク質、ミエリン、チロシンヒドロキシラーゼ膵臓ヴィリン、グルカゴン、ランゲルハンス島アミロイドポリペプチドなどを例示できる。甲状腺に対しては、チログロブリン、カルシトニンなどを例示できる。骨に対しては、α１コラーゲン、オステオカルシン、骨シアログリコプロティンなどを例示できる。腎臓に対してはレニン、肝臓／骨／腎臓アルカリ性ホスフォターゼ、エリスロポエチンなどを、膵臓に対しては、アミラーゼ、ＰＡＰ１などを例示できる。
【０１３０】
なお遺伝子導入用ベクターの製造において、導入される遺伝子（全部又は一部）は、本発明のキメラ遺伝子の塩基配列情報に基づいて、前記の如く、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる。
【０１３１】
かかる遺伝子導入用ベクターの細胞への導入は、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈法、ウイルス形質導入などを始めとする、細胞にＤＮＡを導入する当該分野において既に知られている各種の方法に従って行うことができる。なお、野生型ｐ５１遺伝子で形質転換された細胞は、それ自体単離状態で癌の抑制ないしは癌転移の抑制のための医薬や、治療研究のためのモデル系として利用することも可能である。
【０１３２】
遺伝子治療においては、上記の遺伝子導入用ベクターは、患者の腫瘍部位に局所的にまたは全身的に注射投与することにより患者の腫瘍細胞内に導入することができる。この際全身的投与によれば、他の部位に転移し得るいずれの腫瘍細胞にも到達させることができる。形質導入された遺伝子が各標的腫瘍細胞の染色体内に恒久的に取り込まれない場合には、該投与を定期的に繰り返すことによって達成できる。
【０１３３】
本発明の遺伝子治療方法は、前述する遺伝子導入用の材料（遺伝子導入用ベクター）を直接体内に投与するインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）法と、患者の体内より一旦標的とする細胞を取り出して体外で遺伝子を導入して、その後、該細胞を体内に戻すエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）法の両方の方法を包含する。
【０１３４】
またキメラ遺伝子を直接細胞内に導入し、ＲＮＡ鎖を切断する活性分子であるリボザイムによる遺伝子治療も可能である。
【０１３５】
後述する、キメラ遺伝子若しくはその断片を含有する遺伝子導入用ベクター及び該ベクターによりキメラ遺伝子が導入された細胞を有効成分とする本発明の遺伝子治療剤は、特に癌治療を対象とするものであるが、上記の遺伝子治療（処置）は、癌以外にも遺伝性疾患、ＡＩＤＳのようなウイルス疾患の治療、並びに遺伝子標識をも目的として行うことができる。
【０１３６】
また、遺伝子を導入する標的細胞は、遺伝子治療（処置）の対象により適宜選択することができる。例えば、標的細胞として、癌細胞や腫瘍組織以外に、リンパ球、線維芽細胞、肝細胞、造血幹細胞などの細胞などを挙げることができる。
【０１３７】
上記遺伝子治療における遺伝子導入方法には、ウイルス的導入方法及び非ウイルス的導入方法が含まれる。
【０１３８】
ウイルス的導入方法としては、例えば、キメラ遺伝子が正常細胞に発現する外来遺伝子であることに鑑みて、ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる方法を挙げることができる。その他のウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、ＨＩＶ（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）ベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ，ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター及びエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ，Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）ベクターなどがあげられる。
【０１３９】
非ウイルス的な遺伝子導入方法としては、リン酸カルシウム共沈法；ＤＮＡを封入したリポソームと予め紫外線で遺伝子を破壊した不活性化センダイウイルスを融合させて膜融合リポソームを作成し、細胞膜と直接融合させてＤＮＡを細胞内に導入する膜融合リポソーム法〔Ｋａｔｏ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，２２０７１−２２０７４（１９９１）〕；プラスミドＤＮＡを金でコートして高圧放電によって物理的に細胞内にＤＮＡを導入する方法〔Ｙａｎｇ，Ｎ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７，９５６８−９５７２（１９９０）〕；プラスミドＤＮＡを直接インビボで臓器や腫瘍に注入するネイキッド（ｎａｋｅｄ）ＤＮＡ法〔Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６７（１９９０）〕；多重膜正電荷リポソームに包埋した遺伝子を細胞に導入するカチオニック・リポソーム法〔八木国夫，医学のあゆみ，Ｖｏｌ．１７５，Ｎｏ．．９，６３５−６３７（１９９５）〕；特定細胞のみに遺伝子を導入し、他の細胞に入らないようにするために、目的とする細胞に発現するレセプターに結合するリガンドをＤＮＡと結合させてそれを投与するリガンド−ＤＮＡ複合体法〔Ｆｒｉｎｄｅｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１１，２０２（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９，１９０（１９９５）〕などを使用することができる。
【０１４０】
上記リガンド−ＤＮＡ複合体法には、例えば肝細胞が発現するアシアロ糖タンパクレセプターをターゲットとしてアシアロ糖タンパクをリガンドとして用いる方法〔Ｗｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１４３３８（１９９１）；Ｆｅｒｋｏｌ，ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢＪ．，７，１０８１−１０９１（１９９３）〕や、腫瘍細胞が強く発現しているトランスフェリン・レセプターを標的としてトランスフェリンをリガンドとして用いる方法〔Ｗａｇｎｅｒ ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８７，３４１０（１９９０）〕などが含まれる。
【０１４１】
また本発明で用いられる遺伝子導入法は、上記の如き各種の生物学的及び物理学的な遺伝子導入法を適宜組合せたものであってもよい。該組合せによる方法としては、例えばあるサイズのプラスミドＤＮＡをアデノウイルス・ヘキソンタンパク質に特異的なポリリジン抱合抗体と組合わせる方法を例示できる。該方法によれば、得られる複合体がアデノウイルスベクターに結合し、かくして得られる三分子複合体を細胞に感染させることにより本発明のキメラ遺伝子を導入できる。この方法では、アデノアイルスベクターにカップリングしたＤＮＡが損傷される前に、効率的な結合、内在化及びエンドソーム分解が可能となる。また、前記リポソーム／ＤＮＡ複合体は、直接インビボにて遺伝子導入を媒介できる。
【０１４２】
以下、具体的な遺伝子導入用ウイルスベクターの作成法並びに標的細胞又は標的組織への遺伝子導入法について述べる。
【０１４３】
レトロウイルスベクター・システムは、ウイルスベクターとヘルパー細胞（パッケージング細胞）からなっている。ここでヘルパー細胞は、レトロウイルスの構造タンパク質ｇａｇ（ウイルス粒子内の構造タンパク質）、ｐｏｌ（逆転写酵素）、ｅｎｖ（外被タンパク質）などの遺伝子を予め発現しているが、ウイルス粒子を生成していない細胞を言う。一方、ウイルスベクターは、パッケージングシグナルやＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ）を有しているが、ウイルス複製に必要なｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖなどの構造遺伝子を持っていない。パッケージングシグナルはウイルス粒子のアセンブリーの際にタグとなる配列で、選択遺伝子（ｎｅｏ，ｈｙｇ）とクローニングサイトに組込まれた所望の導入遺伝子（ｐ５１遺伝子またはその断片）がウイルス遺伝子の代りに挿入される。ここで高力価のウイルス粒子を得るにはインサートを可能な限り短くし、パッケージングシグナルをｇａｇ遺伝子の一部を含め広くとることと、ｇａｇ遺伝子のＡＴＧを残さぬようにすることが重要である。
【０１４４】
所望のキメラ遺伝子を組み込んだベクターＤＮＡをヘルパー細胞に移入することによって、ヘルパー細胞が作っているウイルス構造タンパク質によりベクターゲノムＲＮＡがパッケージされてウイルス粒子が形成され、分泌される。組換えウイルスとしてのウイルス粒子は、標的細胞に感染した後、ウイルスゲノムＲＮＡから逆転写されたＤＮＡが細胞核に組み込まれ、ベクター内に挿入された遺伝子が発現する。
【０１４５】
尚、所望のキメラ遺伝子の導入効率を上げる方法として、フイブロネクチンの細胞接着ドメインとヘパリン結合部位と接合セグメントとを含む断片を用いる方法〔Ｈａｎｅｎｂｅｒｇ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ．，２３，７４７（１９９５）〕を採用することもできる。
【０１４６】
なお、上記レトロウイルスベクター・システムにおいて用いられるベクターとしては、例えばマウスの白血病ウイルスを起源とするレトロウイルス〔ＭｃＬａｃｈｌｉｎ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｒｅｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，３８，９１−１３５（１９９０）〕を例示することができる。
【０１４７】
アデノウイルスベクターを利用する方法につき詳述すれば、該アデノウイルスベクターの作成は、バークネル〔Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８，３９−６６（１９９２）〕、瀬戸口康弘ら〔Ｓｅｔｏｇｕｃｈｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８４，２９４６−２９５３（１９９４）〕、鐘カ江裕美ら〔実験医学，１２，２８−３４（１９９４）〕及びケナーら〔Ｋｅｔｎｅｒ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，９１，６１８６−６１９０（１９９４）〕の方法に準じて行うことができる。
【０１４８】
例えば、非増殖性アデノウイルスベクターを作成するには、まずアデノウイルスの初期遺伝子のＥ１及び／又はＥ３遺伝子領域を除去する。次に、目的とする所望の外来遺伝子発現単位（目的とする導入遺伝子、本発明においてはキメラ遺伝子、その遺伝子を転写するためのプロモーター、転写された遺伝子の安定性を賦与するポリＡから構成）及びアデノウイルスゲノムＤＮＡの一部を含むプラスミドベクターと、アデノウイルスゲノムを含むプラスミドとを、例えば２９３細胞に同時にトランスフェクションする。この２者間で相同性組換えを起こさせて、遺伝子発現単位とＥ１とを置換することにより、所望のｐ５１遺伝子を包含する本発明ベクターである非増殖性アデノウイルスベクターを作成することができる。また、コスミドベクターにアデノウイルスゲノムＤＮＡを組み込んで、末端タンパク質を付加した３’側アデノウイルスベクターを作成することもできる。更に組換えアデノウイルスベクターの作成には、ＹＡＣベクターも利用可能である。
【０１４９】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの製造につき概略すると、ＡＡＶはアデノウイルスの培養系に混入してくる小型のウイルスとして発見された。これには、ウイルス複製にヘルパーウイルスを必要とせず宿主細胞内で自律的に増殖するパルボウイルス属と、ヘルパーウイルスを必要とするディペンドウイルス属の存在が確認されている。該ＡＡＶは宿主域が広く、種々の細胞に感染するありふれたウイルスであり、ウイルスゲノムは大きさが４６８０塩基の線状一本鎖ＤＮＡからなり、その両端の１４５塩基がＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）と呼ばれる特徴的な配列を持って存在している。このＩＴＲの部分が複製開始点となり、プライマーの役割をなす。更にウイルス粒子へのパッケージングや宿主細胞の染色体ＤＮＡへの組込みにも、該ＩＴＲが必須となる。また、ウイルスタンパク質に関しては、ゲノムの左半分が非構造タンパク質、即ち複製や転写をつかさどる調節タンパク質のＲｅｐをコードしている。
【０１５０】
組換えＡＡＶの作成は、ＡＡＶが染色体ＤＮＡに組み込まれる性質を利用して行うことができ、かくして所望の遺伝子導入用ベクターが作成できる。この方法は、より詳しくは、まず野生型ＡＡＶの５’と３’の両端のＩＴＲを残し、その間に所望の導入用遺伝子（ヒトｐ５１遺伝子）を挿入したプラスミド（ＡＡＶベクタープラスミド）を作成する。一方、ウイルス複製やウイルス粒子の形成に必要とされるウイルスタンパク質は、別のヘルパープラスミドにより供給させる。この両者の間には共通の塩基配列が存在しないようにし、遺伝子組換えによる野生型ウイルスが出現しないようにする必要がある。その後、両者のプラスミドを例えば２９３細胞へのトランスフェクションにより導入し、さらにヘルパーウイルスとしてアデノウイルス（２９３細胞を用いる場合は非増殖型のものでもよい）を感染させると、非増殖性の所望の組換えＡＡＶが産生される。続いて、この組換えＡＡＶは核内に存在するので、細胞を凍結融解して回収し、混入するアデノウイルスを５６℃加熱により失活させる。更に必要に応じて塩化セシウムを用いる超遠心法により組換えＡＡＶを分離濃縮する。上記のようにして所望の遺伝子導入用の組換えＡＡＶを得ることができる。
【０１５１】
ＨＩＶベクターの作成は、例えば島田らの方法に準じて行うことができる〔Ｓｈｉｍａｄａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８８，１０４３−１０４７（１９９１）〕。
【０１５２】
ＨＩＶウイルスはＣＤ４をレセプターとしヘルパーＴ細胞に特異的に感染するので、その利用によれば、ヒトＣＤ４陽性細胞に特異的に遺伝子導入の可能な組織特異的遺伝子導入ベクターとしてのＨＩＶベクターを作成することができる。該ＨＩＶベクターは、ＡＩＤＳの遺伝子治療に最適といえる。
【０１５３】
組換えＨＩＶベクターの作成は、例えばまずパッケージングプラスミドであるＣＧＰＥをｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖの構造遺伝子とこれらの発現に必要な調節遺伝子（ｔａｔ、ｒｅｖなど）をサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーターとヒトグロビン遺伝子のポリＡシグナル（ｐｏｌｙ Ａ）により発現するように作成する。次にベクタープラスミドＨＸＮを、ＨＩＶの両ＬＴＲの間に、標識遺伝子としてチミジンキナーゼ（ＴＫ）のプロモーターをもつバクテリアのネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏＲ）を挿入し、さらに基本となるプラスミドベクターにＳＶ４０の複製機転を挿入することにより、ＣＯＳ細胞内で効率よく増殖できるように構築できる。これらのパッケージングプラスミドであるＣＧＰＥとベクタープラスミドＨＸＮを同時にＣＯＳ細胞にトランスフェクションさせることにより大量のｎｅｏＲ遺伝子が組み込まれた所望の組換えウイルスを作成し、培養培地中に放出させることができる。
【０１５４】
ＥＢＶベクターの製造は、例えば清水らの方法に準じて行うことができる〔清水則夫ら、細胞工学，１４（３），２８０−２８７（１９９５）〕。
【０１５５】
本発明の遺伝子導入用ＥＢＶベクターの製造につき概略すると、ＥＢウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ：ＥＢＶ）は、１９６４年にエプスタイン（Ｅｐｓｔｅｉｎ）らによりバーキット（Ｂｕｒｋｉｔｔ）リンパ腫由来の培養細胞より分離されたヘルペス科に属するウイルスである〔Ｋｉｅｆｆ，Ｅ．ａｎｄ Ｌｉｅｂｏｗｉｔｚ，Ｄ．：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０，ｐｐ．１８８９−１９２０〕。該ＥＢＶには細胞をトランスフォームする活性があるので、遺伝子導入用ベクターとするためには、このトランスフォーム活性を欠いたウイルスを調製しなければならない。これは次の如くして実施できる。
【０１５６】
即ち、まず、所望の外来遺伝子を組み込む標的ＤＮＡ近傍のＥＢＶゲノムをクローニングする。そこに外来遺伝子のＤＮＡ断片と薬剤耐性遺伝子を組込み、組換えウイルス作製用ベクターとする。次いで適当な制限酵素により切り出された組換えウイルス作製用ベクターをＥＢＶ陽性Ａｋａｔａ細胞にトランスフェクトする。相同組換えにより生じた組換えウイルスは抗表面免疫グロブリン処理によるウイルス産生刺激により野生型ＡｋａｔａＥＢＶとともに回収できる。これをＥＢＶ陰性Ａｋａｔａ細胞に感染し、薬剤存在下で耐性株を選択することにより、野生型ＥＢＶが共存しない所望の組換えウイルスのみが感染したＡｋａｔａ細胞を得ることができる。さらに組換えウイルス感染Ａｋａｔａ細胞にウイルス活性を誘導することにより、目的とする大量の組換えウイルスベクターを産生することができる。
【０１５７】
組換えウイルスベクターを用いることなく所望の遺伝子を標的細胞に導入する、非ウイルスベクターの製造は、例えば膜融合リポソームによる遺伝子導入法により実施することができる。これは膜リポソーム（脂質二重膜からなる小胞）に細胞膜への融合活性をもたせることにより、リポソームの内容物を直接細胞内に導入する方法である。
【０１５８】
上記膜融合リポソームによる遺伝子の導入は、例えば中西らの方法によって行うことができる〔Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．，１５９，３９９−４９９（１９８５）；Ｎａｏ．ｋａｎｉｓｈｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ａｎｉｍａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｉｎ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（ｅｄ．ｂｙＬｅｅ，Ｖ．Ｈ．ｅｔａｌ．）．，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｇｍｂｈ．Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９５，ｐｐ．３３７−３４９〕。
【０１５９】
以下、該膜融合リポソームによる遺伝子の導入法につき概略する。即ち、紫外線で遺伝子を不活性化したセンダイウイルスと所望の遺伝子やタンパク質などの高分子物質を封入したリポソームを３７℃で融合させる。この膜融合リポソームは、内側にリポソーム由来の空洞を、外側にウイルス・エンベロープと同じスパイクがある疑似ウイルスともよばれる構造を有している。更にショ糖密度勾配遠心法で精製後、標的とする培養細胞又は組織細胞に対して膜融合リポソームを４℃で吸着させる。次いで３７℃にするとリポソームの内容物が細胞に導入され、所望の遺伝子を標的細胞に導入できる。ここでリポソームとして用いられる脂質としては、５０％（モル比）コレステロールとレシチン及び陰電荷をもつ合成リン脂質で、直径３００ｎｍの１枚膜リポソームを作製して使用するのが好ましい。
【０１６０】
また、別のリポソームを用いて遺伝子を標的細胞に導入する方法としては、カチオニック・リポソームによる遺伝子導入法を挙げることができる。該方法は、八木らの方法に準じて実施できる〔Ｙａｇｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．，１９６，１０４２−１０４８（１９９３）〕。この方法は、プラスミドも細胞も負に荷電していることに着目して、リポソーム膜の内外両面に正の電荷を与え、静電気によりプラスミドの取り込みを増加させ、細胞との相互作用を高めようとするものである。ここで用いられるリポソームは正荷電を有する多重膜の大きなリポソーム（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ ｌａｒｇｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ＭＬＶ）が有用であるが、大きな１枚膜リポソーム（ｌａｒｇｅ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ＬＵＶ）や小さな１枚膜リポソーム（ｓｍａｌｌ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ＳＵＶ）を使用してプラスミドとの複合体を作製し、所望の遺伝子を導入することも可能である。
【０１６１】
プラスミト包埋カチオニックＭＬＶの調製法について概略すると、これはまず脂質ＴＭＡＧ（Ｎ−（α−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏａｃｅｔｙｌ）−ｄｉｄｏｄｅｃｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＤＬＰＣ（ｄｉｌａｕｒｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）及びＤＯＰＥ（ｄｉｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）をモル比が１：２：２となる割合で含むクロロホルム溶液（脂質濃度として１ｍＭ）を調製する。次いで総量１μｍｏｌの脂質をスピッツ型試験管に入れ、ロータリーエバポレーターでクロロホルムを減圧除去して脂質薄膜を調製する。更に減圧下にクロロホルムを完全に除去し、乾燥させる。次いで２０μｇの遺伝子導入用プラスミドを含む０．５ｍｌのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩液−Ｍｇ，Ｃａ含有を添加し、窒素ガス置換後、２分間ボルテックスミキサーにより攪袢して、所望の遺伝子を含有するプラスミド包埋カチオニックＭＬＶ懸濁液を得ることができる。
【０１６２】
上記で得られたプラスミド包埋カチオニックＭＬＶを遺伝子治療剤として使用する一例としては、例えば発現目的遺伝子のｃＤＮＡを組み込んだ発現プラスミドを上記カチオニックＭＬＶにＤＮＡ量として０．６μｇ、リポソーム脂質量として３０ｎｍｏｌになるように包埋し、これを２μｌのリン酸緩衝生理食塩液に懸濁させて患者より抽出した標的細胞または患者組織に対して隔日投与する方法が例示できる。
【０１６３】
ところで、遺伝子治療とは「疾病の治療を目的として、遺伝子または遺伝子を導入した細胞をヒトの体内に投与すること」と日本国の厚生省ガイドラインに定義されている。これに基づいて、本発明における遺伝子治療とは、癌を始めとする各種疾患の治療並びに処置を目的として、前述の本発明のキメラ遺伝子または該遺伝子を導入した標的細胞若しくは標的組織をヒト体内に投与することを包含する。
【０１６４】
本発明の遺伝子治療において、所望遺伝子の標的細胞または標的組織への導入方法には、代表的には２種類の方法が含まれる。
【０１６５】
その第１法は、治療対象とする患者から標的細胞を採取した後、該細胞を体外で例えばインターロイキン−２（ＩＬ−２）などの添加の下で培養し、レトロウイルスベクターに含まれる目的とするキメラ遺伝子を導入した後、得られる細胞を再移植する手法（ｅｘ ｖｉｖｏ法）である。該方法はＡＤＡ欠損症を始め、欠陥遺伝子によって発生する遺伝子病や癌、ＡＩＤＳなどの治療に好適である。
【０１６６】
第２法は、キメラ遺伝子を直接患者の体内や腫瘍組織などの標的部位に注入する遺伝子直接導入法（直接法）である。
【０１６７】
上記遺伝子治療の第１法は、より詳しくは、例えば次のようにして実施される。即ち、患者から採取した単核細胞を血液分離装置を用いて単球から分取し、分取細胞をＩＬ−２の存在下にＡＩＭ−Ｖ培地などの適当な培地で７２時間程度培養し、導入すべきキメラ遺伝子を含有するベクターを加える。遺伝子の導入効率をあげるために、プロタミン存在下に３２℃で１時間、２５００回転にて遠心分離した後、３７℃で１０％炭酸ガス条件下で２４時間培養してもよい。この操作を数回繰り返した後、更にＩＬ−２存在下にＡＩＭ−Ｖ培地などで４８時間培養し、細胞を生理食塩水で洗浄し、生細胞数を算定し、遺伝子導入効率を前記ｉｎｓｉｔｕＰＣＲや、例えば所望の対象が酵素活性であればその活性の程度を測定することにより、目的遺伝子導入効果を確認する。
【０１６８】
また、培養細胞中の細菌・真菌培養、マイコプラズマの感染の有無、エンドトキシンの検索などの安全度のチェックを行い、安全性を確認した後、予測される効果用量のキメラ遺伝子が導入された培養細胞を患者に点滴静注により戻す。かかる方法を例えば数週間から数カ月間隔で繰り返することにより遺伝子治療が施される。
【０１６９】
ここでウイルスベクターの投与量は、導入する標的細胞により適宜選択される。通常、ウイルス価として、例えば標的細胞１×１０８細胞に対して１×１０３ｃｆｕから１×１０８ｃｆｕの範囲となる投与量を採用することが好ましい。
【０１７０】
上記第１法の別法として、キメラ遺伝子を含有するレトロウイルスベクターが導入されたウイルス産生細胞と例えば患者の細胞とを共培養して、目的とする細胞へキメラ遺伝子を導入する方法を採用することもできる。
【０１７１】
遺伝子治療の第２法（直接法）の実施に当たっては、特に体外における予備実験によって、遺伝子導入により実際に目的のキメラ遺伝子が導入されるか否かを、予めベクター遺伝子ｃＤＮＡのＰＣＲ法による検索やｉｎ ｓｉｔｕＰＣＲ法によって確認するか、或いはキメラ遺伝子の導入に基づく所望の治療効果である特異的活性の上昇や標的細胞の増殖増加や増殖抑制などを確認することが望ましい。また、ウイルスベクターを用いる場合は、増殖性レトロウイルスなどの検索をＰＣＲ法で行うか、逆転写酵素活性を測定するか、或は膜タンパク（ｅｎｖ）遺伝子をＰＣＲ法でモニターするなどにより、遺伝子治療に際して遺伝子導入による安全性を確認することが重要であることはいうまでもない。
【０１７２】
本発明の遺伝子治療法において、特に癌や悪性腫瘍を対象とする場合は、患者から癌細胞を採取後、酵素処理などを施して培養細胞を樹立した後、例えばレトロウイルスにて所望の遺伝子を標的癌細胞に導入し、Ｇ４１８細胞にてスクリーニングした後、ＩＬ−１２などの発現量を測定（ｉｎ ｖｉｖｏ）測定し、次いで放射線処理を施行し、患者腫瘍内または傍腫瘍に接種する癌治療法を一例として挙げることができる。
【０１７３】
ヘルペス単体ウイルスーチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子は、特にヌクレオチドアナログであるガンシクロビル（ＧＣＶ）を毒性中間体に転換して、分裂性細胞の死をもたらすことが報告され、該遺伝子を腫瘍に対して用いる遺伝子治療が知られている〔米国特許第５６３１２３６号明細書；特表平９−５０４７８４号公報参照〕。該方法は自殺遺伝子といわれる前記ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を組み込んだレトロウイルスベクター産生細胞を注入して１週間後に抗ウイルス剤として知られているＧＣＶを投与すると、遺伝子導入細胞ではＧＣＶがリン酸化を受けて活性化されて遺伝子導入細胞を自殺に導くと同時に、ギャップ・ジャンクションを介した細胞接触により、周囲の非導入細胞にも細胞死をもたらすことを利用した遺伝子治療法である。本発明の遺伝子導入ベクターもしくは該ベクターを含む細胞は、上記遺伝子療法にも利用することができる。
【０１７４】
別の遺伝子治療法としては、標的細胞表面に結合する抗体を結合させたキメラ遺伝子含有イムノリポゾームを作製し、包埋したｃＤＮＡを選択的に効率よく標的細胞に導入させる方法があげられる。また、前記したサイトカイン遺伝子含有ウイルスベクターと自殺遺伝子含有アデノウイルスとを同時に投与する結合遺伝子療法も可能である。これらの方法は当該分野における当業者の技術レベルある。
（６）遺伝子治療用医薬組成物（遺伝子治療剤）
本発明はまた、本発明の遺伝子導入用ベクター又は目的のキメラ遺伝子が導入された細胞を有効成分とし、それを薬学的有効量、適当な無毒性医薬担体ないしは希釈剤と共に含有する医薬組成物又は医薬製剤（遺伝子治療剤）を提供する。
【０１７５】
本発明の医薬組成物に利用できる医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤ないし賦形剤などを例示でき、これらは製剤の投与形態に応じて適宜選択使用できる。
【０１７６】
本発明の医薬製剤の投与形態としては、前記したキメラタンパク製剤の製剤例を同様に挙げることができ、治療目的に応じて各種の形態から適宜選択することができる。
【０１７７】
例えば、本発明の遺伝子導入用ベクターを含む医薬製剤は、該ベクターをリポソームに包埋された形態あるいは所望の遺伝子が包含されるレトロウイルスベクターを含むウイルスによって感染された培養細胞の形態に調製される。
【０１７８】
これらは、リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４）、リンゲル液、細胞内組成液用注射剤中に配合した形態などに調製することもでき、またプロタミンなどの遺伝子導入効率を高める物質と共に投与されるような形態に調製することもできる。
【０１７９】
上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。
【０１８０】
上記医薬製剤中に含有されるべき本発明有効成分の量及びその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。
【０１８１】
一般には、医薬製剤としての所望のキメラ遺伝子含有レトロウイルスベクターの投与量は、１日当り体重１ｋｇ当り、例えばレトロウイルスの力価として約１×１０３ｐｆｕから１×１０１５ｐｆｕ程度とするのがよい。
【０１８２】
また所望のキメラ遺伝子が導入された細胞の場合は、１×１０４細胞／ｂｏｄｙから１×１０１５細胞／ｂｏｄｙ程度の範囲から選ばれるのが適当である。
【０１８３】
該製剤は１日に１〜数回に分けて投与することもでき、１から数週間間隔で間欠的に投与することもできる。尚、好ましくは、プロタミンなど遺伝子導入効率を高める物質又はこれを含む製剤と併用投与することができる。
【０１８４】
本発明に従う遺伝子治療を癌の治療に適用する場合は、前記した種々の遺伝子治療を適宜組み合わせて行う（結合遺伝子治療）こともでき、前記した遺伝子治療に、従来の癌化学療法、放射線療法、免疫療法などを組合わせて行うこともできる。さらに本発明の遺伝子治療は、その安全性を含めて、ＮＩＨのガイドラインを参考にして実施することができる〔Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，４，３６５−３８９（１９９３）〕。
（７）新規薬剤の設計
また本発明によれば、より活性叉は安定した形態のキメラタンパク誘導体、または、例えば、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でキメラタンパクの機能を高めるか若しくは妨害する薬剤を開発するために、それらが相互作用する目的の生物学的に活性なタンパク叉は構造アナログを作製することが可能である。前記構造アナログは例えばキメラタンパクと他のタンパクの複合体の三次元構造をＸ線結晶学、コンピューター・モデリング又は、これらの組み合わせた方法によって決定することが出来る。また、構造アナログの構造に関する情報は、相同性タンパク質の構造に基づくタンパク質のモデリングによって得ることも可能である。
【０１８５】
また上記より活性叉は安定した形態のキメラタンパク誘導体を得る方法としては、例えばアラニン・スキャンによって分析することが可能である。該方法はアミノ酸残基をＡｌａで置換し、ペプチドの活性に対するその影響を測定する方法でペプチドの各アミノ酸残基をこのように分析し、当該ペプチドの活性や安定性に重要な領域を決定する方法である。該方法によって、より活性な、または安定なキメラタンパク誘導体を設計することができる。
【０１８６】
また機能性アッセイによって選択した標的−特異的抗体を単離し、次いでその結晶構造を解析することも可能である。原則として、このアプローチにより、続く薬剤の設計の基本となるファーマコア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を得る。機能性の薬理学的に活性な抗体に対する抗−イディオタイプ抗体を生成させることによって、化学的または生物学的に生成したペプチドのバンクよりペプチドを同定したり単離したりすることが可能である。故に選択されたペプチドもファーマコアとして作用すると予測される。
【０１８７】
かくして、改善されたｐ５３活性、特に細胞増殖抑制能性を有する薬剤を設計・開発することが出来る。
【０１８８】
クローン化ｐ５１配列によって、十分な量のｐ５１ポリペプチドを入手して、Ｘ線結晶学のような分析研究をも行うことができる。さらに、本発明のキメラタンパクの提供により、Ｘ線結晶学に代えるか、または加えて、コンピューターモデリング技術に適応可能である。
【０１８９】
また本発明によれば、キメラタンパク含有ノックアウト・マウス（変異マウス）を作成することによってキメラ遺伝子配列のどの部位が生体内で上記したような多様なｐ５３活性に影響を与えるかどうか、即ちキメラ遺伝子並びにその産物が生体内でどのような機能を有するかを確認することができる。
【０１９０】
該方法は、遺伝子の相同組換えを利用して、生物の遺伝情報を意図的に修飾する技術であり、マウスの胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いた方法を例示できる（Ｃａｐｅｃｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１２８８−１２９２（１９８９））。
【０１９１】
尚、上記変異マウスの作製方法はこの分野の当業者にとって既に通常の技術であり、この改変技術（野田哲生編、実験医学，増刊，１４（２０）（１９９６）、羊土社）に、本発明のキメラ遺伝子を適応して容易に変異マウスを作製し得る。従って前記技術の適応により、改善されたｐ５３活性を有する薬剤を設計・開発することが出来る。
【０１９２】
なお、本発明には、以下のものが含まれる：
１．ｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子を腫瘍細胞に移すことからなる腫瘍形成抑制方法。
２．ｐ５３ファミリーのキメラタンパクを腫瘍細胞に移すことからなる腫瘍形成抑制方法。
３．ｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子又はその同効物、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
４．ｐ５３ファミリーのキメラタンパク又はその同効物、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
５．ｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子又はその同効物を有効成分とする遺伝子治療剤。
６．ｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子又はその同効物を含有する癌治療剤。
９．ｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子又はその同効物を用いて、細胞の腫瘍形成を抑制作用物をスクリーニングする方法。
【０１９３】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例及び実験例を挙げる。ただし、本発明はかかる実施例及び実験例により何ら限定されるものではない。
参考例１ ヒトｐ５１遺伝子の単離
（１）ヒトｐ５１遺伝子のクローニング及びＤＮＡシークエンシング
（ａ）本発明者らは、次に掲げるｐ７３−Ｆ１センスプライマー及びｐ７３−Ｒ１アンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行い増幅し、次いでｐ７３−Ｆ２センスプライマー及びｐ７３−Ｒ２アンチセンスプライマーでＮｅｓｔして増幅を行った。
【０１９４】
ｐ７３−Ｆ１： ５’−ＴＡ（ＣＧＴ）ＧＣＡ（ＣＧＴ）ＡＡＡ（Ｇ）ＡＣＡ（ＣＧＴ）ＴＧＣ（Ｔ）ＣＣ−３’
ｐ７３−Ｒ１： ３’−ＴＧＣ（Ｔ）ＧＣＡ（ＣＧＴ）ＴＧＣ（Ｔ）ＣＣＡ（ＣＧＴ）ＧＧＡ（ＣＧＴ）Ａ（Ｃ）Ｇ−５’
ｐ７３−Ｆ２： ５’−ＴＡ（ＣＧＴ）ＡＴＡ（ＣＴ）Ａ（Ｃ）ＧＡ（ＣＧＴ）ＧＴＡ（ＣＧＴ）ＧＡＡ（Ｇ）ＧＧ−３’
ｐ７３−Ｒ２： ３’−ＡＴＧＡＡＣ（Ｔ）Ａ（Ｃ）ＧＡ（ＣＧＴ）Ａ（Ｃ）ＧＡ（ＣＧＴ）ＣＣＡ（ＣＧＴ）ＡＴ−５’
具体的には、ヒト骨格筋ポリＡ＋ＲＮＡ（クローンテック社製）よりランダムプライマーおよびオリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを合成し、λ ＺｉｐＬｏｘ（ギブコＢＲＬ社製）をベクターとして構築した約１０７プラークからなるｃＤＮＡライブラリーを増幅し、ＤＮＡを抽出した。そのｃＤＮＡ０．２μｇを鋳型として上記プライマーｐ７３−Ｆ１及びｐ７３−Ｒ１を用いてＴａｇ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ギブコＢＲＬ社製）の説明書に従って、９４℃で３０秒、４５℃で３０秒、７２℃で３０秒を２５サイクルで増幅し、次いでその１００分の１を鋳型として上記プライマーｐ７３−Ｆ２及びｐ７３−Ｒ２を用いて同様の反応によって増幅した。
【０１９５】
ｐ５３遺伝子の構造から推測される１７２ｂｐのバンドが得られたので、そのバンドの制限酵素地図を作成したところ、ｐ５３遺伝子以外の遺伝子があることが判明した。そのバンドをｐＧＥＭ７（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にサブクローニングし、ＡＢＩ３７７自動シークエンサー（ＡＢＩ社製）を用いて、常法に従って塩基配列を決定したところ、ｐ５３遺伝子に類似するものの、異なる新規塩基配列を有する新規遺伝子に由来するＤＮＡ断片であった。
【０１９６】
このサブクローンされたＤＮＡ断片を切り出し、ＢｃａＢｅｓｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造製）を用いて標識プローブを作成した。オリゴｄｔプライマーのみを用いる以外は上記ｃＤＮＡライブラリーと同様にして構築した未増幅のライブラリー２．４×１０６プラークをプラークハイブリダイゼーションによってスクリーニングした結果、８個のポジティブクローンが得られた。λ ＺｉｐＬｏｘはＣｒｅ−ＬｏｘＰの系を用いて容易にプラスミドに変換できるので、変換プラスミドをＬＩＣＯＲ社の自動シークエンサーとＡＢＩ３７７自動シークエンサー（ＡＢＩ社）を用いて、常法に従って塩基配列を決定した。
【０１９７】
次いで、得られた遺伝子の塩基配列とｐ５３遺伝子及びｐ７３遺伝子の塩基配列との相同性を、ＧＣＧソフトウェア（ウィスコンシン・配列分析パッケージ、ジェネティクス・コンピューター・グループ製）を使用するＦＡＳＴＡプログラムを用いて（Ｐｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５，１４３５−１４４１（１９８８））、探索した。
【０１９８】
かかる相同性検索の結果、上記の方法によって選択され、塩基配列が決定されたクローンのうち２つがｐ５３遺伝子およびｐ７３遺伝子と高い相同性を有していることを見出した。これら２つのクローンが有する遺伝子の配列によりコードされる推定アミノ酸から分子量を掲載したところ、それぞれ５０，８９４Ｄａ及び約７１，９００Ｄａであった。本発明者らは、これらのクローンをそれぞれｐ５１Ａクローン及びｐ５１Ｂクローンと命名した。
【０１９９】
上記で得られたｐ５１Ａクローンが有する遺伝子（ｐ５１Ａ遺伝子）の全塩基配列を配列番号２に、またｐ５１Ｂクローンが有する遺伝子（ｐ５１Ｂ遺伝子）の全塩基配列を配列番号４に示す。
【０２００】
ｐ５１Ａクローンは、配列番号２に示すように、配列番号１で示されるアミノ酸配列（４４８アミノ酸）をコードする塩基配列（１３４４ヌクレオチド）を、オープン・リーディング・フレームとして１４５〜１４８８位に有する遺伝子を有していた。また、このクローンが有する遺伝子の塩基配列によりコードされる推定アミノ酸配列において、転写活性化領域は１〜５９位、ＤＮＡ結合領域は１４２〜３２１位、及びオリゴメリゼーション領域は３５９〜３９７位であった。
【０２０１】
一方、ｐ５１Ｂクローンは、配列番号４に示すように、配列番号３で示されるアミノ酸配列（６４１アミノ酸）をコードする塩基配列（１９２３ヌクレオチド）を、オープン・リーディング・フレームとして１４５〜２０６７位に有する遺伝子を有していた。また、このクローンが有する遺伝子の塩基配列によりコードされる推定アミノ酸配列において、転写活性化領域は１〜５９位、ＤＮＡ結合領域は１４２〜３２１位、及びオリゴメリゼーション領域は３５３〜３９７位であり、これは更に、Ｃ末端側の領域に付加的配列（ＳＡＭドメイン）を有しており、当該付加的配列を含む３５３〜６４１位の領域を広義のオリゴメリゼーション領域とみることができる。
【０２０２】
ｐ５１Ａ遺伝子でコードされるｐ５１Ａのアミノ酸配列をｐ５３及びｐ７３βのアミノ酸配列と比較し、三者間の相同性を調べた（図７）。なお、図中、三者間で同一のアミノ酸を四角で囲んで示す。
【０２０３】
また図１に、ｐ５１Ａの構造的なドメインの特徴を、ｐ５３及びｐ７３βとともに、シェーマ的に示す。図中「ＴＡ」は転写活性化領域、「ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ」はＤＮＡ結合領域、「ｏｌｉｇｏ」はオリゴメリゼーション領域をそれぞれ示す。
【０２０４】
これらの結果、全配列、転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーシヨン領域における、それぞれのｐ５１Ａ、ｐ５３及びｐ７３βの推定アミノ酸配列の相同性は、表２に示す通りであった。
【０２０５】
【表２】
【０２０６】
これらの結果から、ｐ５１Ａの推定アミノ酸配列は、ｐ５３及びｐ７３βのいずれとも類似しているものの、ｐ５３のアミノ酸配列よりもｐ７３βのアミノ酸配列に相同性が高く、またｐ５１Ａとｐ７３βとの相同性は、オリゴメリゼーション領域以外の領域で、ｐ５３とｐ７３βの相同性よりも高いことが判明した。更にｐ５１Ａ及びｐ７３β間では、ｐ５３及びｐ７３β間又はｐ５３及びｐ５１Ａ間で相同性がない領域においても、相同性が認められた。これらのことからｐ５１Ａは、アミノ酸配列レベルにおいてｐ５３よりもｐ７３βにより近似しているといえる。
【０２０７】
また、同様に本発明のｐ５１Ｂ遺伝子でコードされるアミノ酸配列をｐ７３αタンパクのアミノ酸配列と比較し二者間の相同性を調べた（図９）。なお、図において二者間で同一のアミノ酸を四角で囲んで示す。
【０２０８】
実施例１ キメラｐ５３／ｐ５１Ａ／ｐ７３γ発現ベクターの構築
基本的にＰＣＲの変法（Ｓｅｎａｎａｙａｋｅ，Ｓ．Ｄ．，ａｎｄ Ｂｒｉａｎ，Ｄ．Ａ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，１３−１５（１９９５））を用いて、キメラを作成した。
（１）まず、哺乳動物発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロゲン社製）中にｐ５３、ｐ５１Ａ及びｐ７３γ遺伝子を挿入してｃＤＮＡ発現構築物を構築した（後述する表４中、便宜上キメラ１、キメラ１４及びキメラ２７として示す。）。また、表３に示すように、１２個のハイブリッドプライマーと６個のアンチセンスプライマーをデザインして作成した。
【０２０９】
【表３】
【０２１０】
得られた増幅フラグメントをゲル精製し、次いで得られた精製増幅フラグメントの各相当ペアを混合して、再度Ｔ７プライマー及びＳＰ６プライマーを用いてＰＣＲ増幅（９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２分、２０サイクル、ＥｘＴａｑ）を行った（図１０（ｂ））。得られたキメラフラグメントをｐＲｃ／ＣＭＶベクターにサブクローニングして、完全なコード領域を有していることが確認された。
（２）上記で得られたキメラクローンを、変異のないことを確認した後、２つのジャンクションを有するキメラの構築に使用した。具体的には、上記で作成したキメラのＤＮＡ結合領域、及びｐＲｃ／ＣＭＶベクターの両方に存在する制限酵素認識部位を利用して作成することができる。例えば図１１では、キメラ１０及びキメラ２を利用し、これらのＤＮＡ結合領域及びｐＲｃ／ＣＭＶベクターに存在する部位を認識する制限酵素Ｂｓｕ３６Ｉで消化し、得られる消化フラグメントを結合することによってキメラ１１（ｐ５１−ｐ５３−ｐ５１Ａ）を構築する工程を示す。また図１２では、キメラ２及びｐ５３Ｂ遺伝子をｐＲｃ／ＣＭＶベクターに挿入して構築したｃＤＮＡ発現構築物（キメラ３２、表４参照）を利用し、これらに存在する共通部位を認識する制限酵素ＭｆｅＩで消化し、得られる消化フラグメントを結合することによってキメラ２８（ｐ５３−ｐ５３−ｐ５１Ｂ、表４参照）を構築する工程を示す。
【０２１１】
なお、図１０〜１２において黒ボックスはｐ５３由来、白ボックスはｐ５１Ａ由来、ストライプボックスはｐＲｃ／ＣＭＶベクター由来、スティップル（ｓｔｉｐｐｌｅｄ）ボックスはｐ５１ＢのＳＡＭドメインを示す。また、図中、ＴＡは転写活性化領域、ＤＮＡはＤＮＡ結合領域及びＯＬＩＧＯはオリゴメリゼーション領域を意味する。
【０２１２】
このようにして得られた各種のキメラ遺伝子及びその産物を表４に示す（なお、キメラ１、１４、２７及び３２は、それぞれｐ５３、ｐ５１Ａ、ｐ７３γ及びｐ５１Ｂに対応するものでありキメラではないが、説明の都合上表に掲げたものである。）。
【０２１３】
【表４】
【０２１４】
（１）ｐ５３タンパクの転写活性能によって調節されることが知られているＢＡＸ２プロモーターをターゲットプロモーターとして、ルシフェラーゼリポーターアッセイにより、各ｐ５３ファミリー・キメラタンパクの転写活性能を評価した。具体的には、４００ｎｇの各種キメラ構築物（キメラ１〜２７）及び１００ｎｇのｐＢＡＸ２ｌｕｃを、ｐ５３欠損ヒト骨肉腫細胞系ＳＡＯＳ−２細胞にトランスフェクトして、デュアル（Ｄｕａｌ）−ルシフェラーゼ・リポーター測定システム（プロメガ社製）及びルミノメーター（ＡＴＴＯ；Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ ＪＮＲ ＡＢ−２１００）を用いて、ルシフェラーゼアッセイを行った。なお、ｐＢＡＸ２ｌｕｃはＰＣＲによってＢＡＸ２のプロモーター全領域を増幅し、ｐＧＬ３ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）に挿入することによって作成した。
【０２１５】
３回の実験から集計して得られた結果を、相対光量ユニット（ＲＬＵ）として、図１３に示す。なお、図の左に示すキメラの番号は表４に記載するキメラ１〜２７に対応するものであり、黒ボックスはｐ５３由来、白ボックスはｐ５１Ａ由来、及びドット（点）ボックスはｐ７３γ由来を意味する。また、図中、ＴＡは転写活性化領域、ＤＮＡはＤＮＡ結合領域及びＯｌｉｇｏはオリゴメリゼーション領域を意味する。
【０２１６】
この結果からわかるように、転写活性化領域がｐ５３に由来するキメラ構築物（キメラ２〜９）は、ｐ５３（キメラ１）そのものよりも強い転写活性能を示し、中でもキメラ２、５及び８はｐ５３の２倍もの強い転写活性能を有していた。さらに、キメラ１〜３、キメラ４〜６及びキメラ７〜９間でそれぞれこれらのキメラ構築物のオリゴメリゼーション領域の由来に関して検討するに、ｐ５１に由来するオリゴメリゼーション領域を有するキメラ構築物の転写活性能が最も強く、次いで強いのがｐ７３に由来するものであった。また、一般的にｐ５１由来の転写活性化領域を有するキメラは転写活性能を低い傾向が見られた（キメラ１０〜１８）。
【０２１７】
さらに、ｐ５１またはｐ７３に由来する転写活性化領域を有するキメラの場合、転写活性能の強さは、ＤＮＡ結合性領域によって決まるようである。ｐ５１に由来する転写活性化領域を有するキメラ構築物において、ｐ７３に由来するＤＮＡ結合領域を有するものが最も高い転写活性能を示し、次いで強いのはｐ５１に由来するＤＮＡ結合領域を有するものであった。一方、ｐ７３に由来する転写活性化領域を有するキメラ構築物において、ｐ５３に由来するＤＮＡ結合領域を有するものが最も高い転写活性能を示し、次いでｐ５１に由来するＤＮＡ結合領域を有するものが強かった。
【０２１８】
（２）実施例１で調製したキメラ２（ｐ５３−ｐ５３−Ｐ５１Ａ）及びキメラ２８（ｐ５３−ｐ５３−Ｐ５１Ｂ）について、上記（２）と同様にしてルシフェラーゼアッセイを行い、ルシフェラーゼ活性から各キメラの転写活性化能を評価した。結果を、ｐ５３そのもの（キメラ１）、ｐ５１Ａそのもの（キメラ１４）、ｐ５１Ｂ（キメラ３２）及びｐＲｃ／ＣＭＶベクターについて実験を行った結果と合わせて図１４に示す。結果からわかるように、ｐ５３及びｐ５１Ａそのものよりも、ｐ５１Ｂ由来のオリゴメリゼーション領域を有するキメラ２８及びｐ５１Ａ由来のオリゴメリゼーション領域を有するキメラ２は、それぞれ３０倍及び２０倍強い転写活性を示した。このことから、本来転写抑制領域と考えられているｐ５１ＢのＣ末端ドメインは、単に転写抑制に機能しているだけでなく、上記キメラにおいて強いトランスアクチベーターとしてｐ５３の機能活性に関与していることが示唆された。
【０２１９】
実験例２ 種々のプロモーターに対するキメラの転写活性能
ＢＡＸ２プロモーターと同様にｐ５３の転写活性能によって調節されることが知られているＲＧＣプロモーター、１４−３−３σプロモーター、ｐ２１ＷＡＦ１プロモーター及びＭＤＭ２プロモーター、並びにＢＡＸ２プロモーターを用いて、実験例１と同様にして各種キメラ構築物の転写活性能を調べた。具体的には、１００ｎｇの各リポータープラスミド（ｐＢＡＸ２ｌｕｃ、ｐＧＬ２ｈｍｄｍ２−ＨＸ−ｌｕｃ、ｐＷＡＦ１ｌｕｃ、１４−３−３ｓｌｕｃ）を４００ｎｇのキメラ発現構築物とともに、ＳＡＯＳ−２細胞株に導入して、デュアル（Ｄｕａｌ）−ルシフェラーゼ・リポーター測定システム（プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼアッセイを行った（ｎ＝３）。
【０２２０】
結果を図１５に示す。なお、図中横軸は各キメラの番号を示すが、ターゲットプロモーターとしてＢＡＸ２プロモーターを用いた場合に得られる各種キメラの転写活性能の強さの順の並び変えたものである（図１５（ｅ）参照）。また図中、黒の棒グラフはｐ５３そのもの（ｐ５３発現構築物：キメラ１）の転写活性能を示す。
【０２２１】
これらの結果から、各キメラはｐ５３の転写活性能によって調節される異なるターゲットプロモーターに対して、顕著に異なる選択性を示すことがうかがわれた。
【０２２２】
実験例３ 変異ｐ５３のドミナントネガティブ効果に対するキメラの抵抗性
実験例２から、キメラの転写活性能は種々のプロモーターを用いた場合も強いことが判明したので、標的腫瘍中の野生型（正常）ｐ５３の機能消失を復活させる遺伝子治療への利用の可能性が考えられる。しかしながら、多くの腫瘍で検出される変異ｐ５３はしばしばドミナントネガティブ作用を発揮し、外来性のｐ５３機能を阻害する。このため、本発明のｐ５３ファミリーキメラについて、ドミナントネガティブ活性を有する変異ｐ５３の存在下での転写活性能を調べた。なお、以下の実験において、変異ｐ５３として、変異ｐ５３試験を行った１０個の中で最も強いコンペティターであった、２４９位に変異を有するＳｅｒ２４９変異体を用いた。
【０２２３】
ＢＡＸ２プロモーターに対する種々のキメラの転写活性能を、種々の量のドミナントネガティブｐ５３プラスミドの存在下で測定した。具体的には、２００ｎｇキメラプラスミド及び５０ｎｇのｐＢＡＸ２ｌｕｃを、種々の量の変異ｐ５３（８００、４００、２００、１００及び０ｎｇ）（ｐＲｃ／ＣＭＶベクターでＤＮＡ量を調整した）と一緒にトランスフェクトし、デュアル（Ｄｕａｌ）−ルシフェラーゼ・リポーター測定システム（プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼアッセイに供した（ｎ＝３）。
【０２２４】
結果を図１６及び図１７に示す。結果は、ｐＲｃ／ＣＭＶベクターの存在下で検出されるルシフェラーゼ活性に対する、変異プラスミドの存在下でのルシフェラーゼ活性の、相対（比較）ルシフェラーゼ活性として示す（図１６）。図１６のａ〜ｉは、表４に示すキメラ１〜２７をＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域の由来に基づいて、下記のように分類したものに対応する。
【０２２５】
図ａ，ｂ，ｃ：ｐ５３由来のＤＮＡ結合領域を有するキメラ
図ｄ，ｅ，ｆ：ｐ５１Ａ由来のＤＮＡ結合領域を有するキメラ
図ｇ，ｈ，ｉ：ｐ７３γ由来のＤＮＡ結合領域を有するキメラ
図ｂ，ｅ，ｈ：ｐ５１Ａ由来のオリゴメリゼーション領域を有するキメラ
図ｃ，ｆ，ｉ：ｐ７３γ由来のオリゴメリゼーション領域を有するキメラ
図ａ，ｄ，ｇ：ｐ５３由来のオリゴメリゼーション領域を有するキメラ
また、各図中、点線はｐ５３由来の転写活性化領域を有するキメラ、実線はｐ５１Ａ由来の転写活性化領域を有するキメラ、及びダッシュ線はｐ７３γ由来の転写活性化領域を有するキメラを意味する。
【０２２６】
また図１７の（ｊ）及び（ｋ）は、それぞれ８００ｎｇのドミナントネガティブｐ５３プラスミド及び８００ｎｇのｐＲｃ／ＣＭＶベクターの存在下で得られるルシフェラーゼ活性の絶対値を比較光量ユニット（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ：ＲＬＵ）として示すものである。また図１７の（ｌ）は、上記（ｊ）及び（ｋ）から得られる値の比（変異ｐ５３／ベクター：（ｊ）／（ｋ））を各キメラについて示すものである。なお、各図中、ＶはｐＲｃ／ＣＭＶベクターのトランスフェクションから得られるルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）の結果を示すものである。
【０２２７】
これらの結果から、ｐ５３に由来するＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域を有するキメラは、その転写活性化領域の由来に関わらず、用量依存的に変異ｐ５３発現によるドミナントネガティブ作用にセンシティブであることがわかる（図１６（ａ）、図１７（ｊ）〜（ｌ）：キメラ１、１９及び１０）。このことは、変異ｐ５３とオリゴメライズして変異ｐ５３に対してドミナントネガティブ阻害を働かせることを可能とするには、ＤＮＡ結合領域とオリゴメリゼーション領域の完全性が必須の成分であることを示唆するものである。
【０２２８】
一方、ｐ５１又はｐ７３に由来するＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域を有するキメラは、その転写活性化領域の由来に関わらず、変異ｐ５３発現によるドミナントネガティブ作用に抵抗性を示した。またそれらは、変異ｐ５３自体は転写活性能を全く有していないにも関わらず、変異ｐ５３の存在によって転写活性能が増強された。この現象は、これらのキメラがオリゴマー成分として変異ｐ５３を取り込み、それによって転写活性能が増大している、または変異ｐ５３がそのタンパクへの誘き寄せ（ｄｅｃｏｙ）機能を果たし、それによってＭＤＭ２タンパクといったキメラ性タンパクの活性を打ち消している、という理由によって説明できるかもしれない。
【０２２９】
特にキメラ５、６、８及び９は、変異ｐ５３の存在下で、ｐ５３そのものよりも５０倍以上も高いルシフェラーゼ活性（転写活性能）を示した（図１７（ｊ））。
【０２３０】
実験例４ ｐ５３ファミリーキメラの転写活性能に対するＭＤＭ２及びｐ１９ＡＲＦの影響
本発明のｐ５３ファミリーキメラについて、その転写活性能に対するＭＤＭ２及びｐ１９ＡＲＦの影響を分析した。具体的には、８００ｎｇのｐＭＤＭ２／Ｒｃ／ＣＭＶ、２００ｎｇキメラプラスミド及び５０ｎｇｐＢＡＸ２ｌｕｃをＳＡＯＳ細胞株にコトランスフェクトし、デュアル（Ｄｕａｌ）−ルシフェラーゼ・リポーター測定システム（プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼアッセイを行った（ｎ＝３）。
【０２３１】
結果を図１８に示す。なお、図１８の（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ８００ｎｇのＭＤＭ２／Ｒｃ／ＣＭＶ及び８００ｎｇのｐＲｃ／ＣＭＶベクターの存在下で得られるルシフェラーゼ活性の絶対値を比較光量ユニット（ｒｅｌａｔｉｖｅｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ：ＲＬＵ）として示すものである。また図１８の（ｃ）は、上記（ａ）及び（ｂ）から得られる値の比（ＭＤＭ２／ベクター：（ａ）／（ｂ））を各キメラについて示すものである。なお、各図中、ＶはｐＲｃ／ＣＭＶベクターのトランスフェクションから得られるルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）の結果を示すものである。
【０２３２】
これらの結果から、強い転写活性能を有するキメラの中でもｐ５１に由来するオリゴメリゼーション領域を有するキメラは、ＭＤＭ２の過剰の発現によって著しく減少することが示された（キメラ２、５、８及び２０）。このことから、ＭＤＭ２がｐ５１Ａ由来オリゴメリゼーション領域に依存するユビキチン経路を活性化する可能性が示唆された。一方、ｐＳＲα−ｍｓｖ−ｐ１９ＡＲＦ−ｔｋ−ｃＤ８をコトランスフェクションすることによるｐ１９ＡＲＦの発現は余り影響しなかった。
【０２３３】
以上の実験から、本発明のｐ５３ファミリーからなるキメラタンパクの転写活性能に関して、
１）あるキメラはｐ５３、ｐ５１及びｐ７３そのものよりも２０倍もの高い転写活性能を示すこと、
２）キメラはｐ５３によって転写調節をうける各種の遺伝子（プロモーター）に対して著しく異なった選択性を示すこと、
３）あるキメラは、野生型ｐ５３をドミナントネガティブ的に阻害する変異ｐ５３作用に強い抵抗性を示し、さらには変異ｐ５３の存在下においてｐ５３よりも５０倍もの強い転写活性能を示すこと、
が明らかになった。
【０２３４】
このような本発明のｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子及びキメラタンパクは、ｐ５３ファミリータンパクの機能を検討並びに解明する上で有用である。ｐ５３ファミリータンパクのメンバーから形成されるヘテロオリゴマー（４量体）により、ｐ５３ファミリータンパクの機能を様々なレベルで精巧に制御することができる。例えば、▲１▼タンパクの発現レベル、▲２▼オリゴメリゼーションレベル（ヘテロオリゴマー形成を含む）、▲３▼種々のヘテロオリゴマーのＤＮＡ結合能レベル、▲４▼種々のオリゴマーの存在下でのＤＮＡ結合オリゴマーの転写活性能及び転写抑制能レベル、▲５▼ターゲットプロモーターレベルを挙げることができる。本発明のキメラによれば、免疫共沈実験（ｃｏ−ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）、ゲルシフトアッセイ、トランスアクチベーションアッセイ、及びアポトーシス分析などの各種の方法を組み合わせることにより、更なる素晴らしい進展が得られることが期待される。
【０２３５】
また本発明のｐ５３ファミリーキメラの種々のプロモーターに対する異なった選択性は、ｐ５３ファミリータンパクのターゲット遺伝子の検索に利用できる。すなわち、本発明のキメラは、好適なターゲット遺伝子の分別に役立ち、またさらに結合部位選択法、ＳＡＧＥまたはマイクロアレイ技術等の方法を組み合わせることにより、真なるｐ５３ファミリータンパクのターゲット遺伝子の同定を導くものと期待される。さらに、選択性における顕著な相違は、あるｐ５３ファミリー遺伝子におけるエフェレントシグナル（ｅｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｇｎａｌ）を、他のｐ５３ファミリー遺伝子の下流ターゲットに対するアフェレントシグナル（ａｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｇｎａｌ）に変換できるであろうことを示す。
【０２３６】
本発明のｐ５３ファミリーキメラ遺伝子は、遺伝子治療においても有用である。
【０２３７】
ｐ５３欠損性腫瘍について、遺伝子治療によって正常ｐ５３機能を復活させることにより、癌性細胞を死滅させるか、または癌性細胞を良好状態に変えることができることを示す多くの証拠がある。しかしながら、実際は癌細胞への正常ｐ５３遺伝子の導入は必ずしも成功裡を収めるわけではない。正常なｐ５３は、多くの腫瘍において原因となる変異ｐ５３のドミナントネガティブ作用に十分強くなく、または阻害され得る。また最近、ｐ５３経路の異常（不全機能）は変異ｐ５３だけでなく、ｐ１４ＡＲＦ変異及びＭＤＭ２増幅によっても生じることが分かっている。種々の性質を有すると考えられる本発明のキメラ遺伝子によれば、このような変異ｐ５３のドミナントネガティブ作用やｐ１４ＡＲＦ変異及びＭＤＭ２増幅等の障害を回避することが可能となり、その結果腫瘍に対する遺伝子治療において有用なツール（遺伝子治療剤）となるものと期待される。さらに、遺伝子の異なるレパートリーを転写活性化するキメラの利用は、癌の治療により一層有効と思われる。また、本発明のｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子を種々組み合わせて使用することにより、単一のキメラでは得られない有用な性質が得られる可能性も期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐ５１Ａ蛋白の構造的なドメインの特徴を、ｐ５３蛋白及びｐ７３β蛋白とともに示した図である。図中、「ＴＡ」は転写活性化領域、「ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ」はＤＮＡ結合領域、及び「ｏｌｉｇｏ」はオリゴメリゼーション領域をそれぞれ示す。
【図２】ｐ５３遺伝子の塩基配列（ａ）及びｐ５３のアミノ酸配列（ｂ）を示す図である。
【図３】ｐ７３α遺伝子の塩基配列（ａ）及びｐ７３αのアミノ酸配列（ｂ）を示す図である。
【図４】ｐ７３β遺伝子の塩基配列（ａ）及びｐ７３βのアミノ酸配列（ｂ）を示す図である。
【図５】ｐ７３γ遺伝子の塩基配列（ａ）及びｐ７３γのアミノ酸配列（ｂ）を示す図である。
【図６】ｐ７３δ遺伝子の塩基配列（ａ）及びｐ７３δのアミノ酸配列（ｂ）を示す図である。
【図７】ヒトｐ５１Ａ遺伝子でコードされるアミノ酸配列をｐ５３蛋白及びｐ７３β蛋白の各アミノ酸配列と比較し、三者間の相同性をみた図である。三者が同一であるアミノ酸を四角で囲んで示す。
【図８】ｐ５１蛋白のａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｖａｒｉａｎｔ（ｐ５１Ａ、ｐ５１Ｂ）の構造を、ｐ７３蛋白のａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓｐｌｉｃｉｎｇｖａｒｉａｎｔ（ｐ７３α、ｐ７３β）の構造と模式的に比較した図である。
【図９】ヒトｐ５１Ｂ遺伝子でコードされるアミノ酸配列をｐ７３α蛋白の各アミノ酸配列と比較し、両者の相同性をみた図である。両者が同一であるアミノ酸を四角で囲んで示す。
【図１０】本発明のキメラ（キメラ２）を作成する方法を示す図である（実施例１）。
【図１１】本発明のキメラ（キメラ１１）を作成する方法を示す図である（実施例１）。
【図１２】本発明のキメラ（キメラ２８）を作成する方法を示す図である（実施例１）。
【図１３】実験例１（１）でおこなったｐ５３ファミリーキメラタンパクの転写活性化機能試験の結果を示す図である。グラフの横軸は相対光量ユニット（ＲＬＵ）を示す。図の左に示すキメラの番号は表４に記載するキメラ１〜２７に対応する。黒ボックスはｐ５３由来、白ボックスはｐ５１Ａ由来、及びドット（点）ボックスはｐ７３γ由来を意味する。また、図中、ＴＡは転写活性化領域、ＤＮＡはＤＮＡ結合領域及びＯｌｉｇｏはオリゴメリゼーション領域を意味する。
【図１４】実験例１（２）でおこなったキメラ２（ｐ５３−ｐ５３−Ｐ５１Ａ）及びキメラ２８（ｐ５３−ｐ５３−Ｐ５１Ｂ）の転写活性化機能試験の結果を示す図である。グラフの縦軸は相対光量ユニット（ＲＬＵ）を示す。図の横軸の番号は次のキメラ構築物に対応する：１．キメラ構築物（キメラ２８）、２．キメラ構築物（キメラ２）、３．ｐ５３（キメラ１）、４．ｐ５１Ａ（キメラ１４）、５．ｐ５１Ｂ（キメラ３２）、６．ｐＲｃ／ＣＭＶベクター。
【図１５】種々のプロモーターに対するキメラの転写活性能の結果を示す図である（実験例）。（ａ）ＲＧＣプロモーター、（ｂ）１４−３−３σプロモーター、（ｃ）ｐ２１ＷＡＦ１プロモーター、（ｄ）及びＭＤＭ２プロモーター、及び（ｅ）ＢＡＸ２プロモーターを使用した結果をそれぞれ示す。図の横軸の番号は表４に記載するキメラ１〜２７に対応するものであり、縦軸は相対光量ユニット（ＲＬＵ）を示す。
【図１６】変異ｐ５３のドミナントネガティブ効果に対するキメラの抵抗性の結果を示す図である（実験例３）。図１６のａ〜ｉは、表４に示すキメラ１〜２７をＤＮＡ結合領域及びオリゴメリゼーション領域の由来に基づいて、下記のように分類したものに対応する：図ａ，ｂ，ｃ：ｐ５３由来のＤＮＡ結合領域を有するキメラ；図ｄ，ｅ，ｆ：ｐ５１Ａ由来のＤＮＡ結合領域を有するキメラ；図ｇ，ｈ，ｉ：ｐ７３γ由来のＤＮＡ結合領域を有するキメラ；図ｂ，ｅ，ｈ：ｐ５１Ａ由来のオリゴメリゼーション領域を有するキメラ；図ｃ，ｆ，ｉ：ｐ７３γ由来のオリゴメリゼーション領域を有するキメラ；図ａ，ｄ，ｇ：ｐ５３由来のオリゴメリゼーション領域を有するキメラ。各図中、点線はｐ５３由来の転写活性化領域を有するキメラ、実線はｐ５１Ａ由来の転写活性化領域を有するキメラ、及びダッシュ線はｐ７３γ由来の転写活性化領域を有するキメラを意味する。横軸は、変異ｐ５３の量（ｎｇ）を、縦軸はｐＲｃ／ＣＭＶベクターの存在下で検出されるルシフェラーゼ活性に対する、変異プラスミドの存在下でのルシフェラーゼ活性の、相対（比較）ルシフェラーゼ活性を示す。
【図１７】変異ｐ５３のドミナントネガティブ効果に対するキメラの抵抗性の結果を示す図である（実験例３）。図１７の（ｊ）及び（ｋ）は、それぞれドミナントネガティブｐ５３プラスミド及びｐＲｃ／ＣＭＶベクターの存在下で得られるルシフェラーゼ活性を比較光量ユニット（ＲＬＵ）として示すものである。（ｌ）は、上記（ｊ）及び（ｋ）から得られる値の比（（ｊ）／（ｋ））を各キメラについて示すものである。
【図１８】ｐ５３ファミリーキメラの転写活性能に対するＭＤＭ２及びｐ１９ＡＲＦの影響を見た実験例４の結果を示す図である。図１８の（ａ）及び（ｂ）は、それぞれＭＤＭ２／Ｒｃ／ＣＭＶ及びｐＲｃ／ＣＭＶベクターの存在下で得られるルシフェラーゼ活性を比較光量ユニット（ＲＬＵ）として示したものである。（ｃ）は、上記（ａ）及び（ｂ）から得られる値の比（（ａ）／（ｂ））を各キメラについて示すものである。各図中、ＶはｐＲｃ／ＣＭＶベクターのトランスフェクションから得られるルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）の結果を示す。
Claims (5)
- 以下の（a）転写活性化領域、（b）ＤＮＡ結合領域、及び（c）オリゴメリゼーション領域のアミノ酸配列を含むことを特徴とする（１）〜（９）のいずれかに示すキメラタンパク：
（１）下流方向に向けて、（a）配列番号５の１〜４５番目のアミノ酸配列、（b）配列番号５の１１３〜２９０番目のアミノ酸配列、及び（c）配列番号１の３５３〜３９７番目のアミノ酸配列を含むタンパク；
（２）下流方向に向けて、（a）配列番号５の１〜４５番目のアミノ酸配列、（b）配列番号５の１１３〜２９０番目のアミノ酸配列、及び（c）配列番号８の３４５〜４７５番目のアミノ酸配列を含むタンパク；
（３）下流方向に向けて、（a）配列番号５の１〜４５番目のアミノ酸配列、（b）配列番号１の１４２〜３２１番目のアミノ酸配列、及び（c）配列番号１の３５３〜３９７番目のアミノ酸配列を含むタンパク；
（４）下流方向に向けて、（a）配列番号５の１〜４５番目のアミノ酸配列、（b）配列番号１の１４２〜３２１番目のアミノ酸配列、及び（c）配列番号８の３４５〜４７５番目のアミノ酸配列を含むタンパク；
（５）下流方向に向けて、（a）配列番号５の１〜４５番目のアミノ酸配列、（b）配列番号６の１３１〜３１０番目のアミノ酸配列、及び（c）配列番号１の３５３〜３９７番目のアミノ酸配列を含むタンパク；
（６）下流方向に向けて、（a）配列番号５の１〜４５番目のアミノ酸配列、（b）配列番号６の１３１〜３１０番目のアミノ酸配列、及び（c）配列番号８の３４５〜４７５番目のアミノ酸配列を含むタンパク；
（７）下流方向に向けて、（a）配列番号６の１〜５４番目のアミノ酸配列、（b）配列番号５の１１３〜２９０番目のアミノ酸配列、及び（c）配列番号１の３５３〜３９７番目のアミノ酸配列を含むタンパク；
（８）下流方向に向けて、（a）配列番号６の１〜５４番目のアミノ酸配列、（b）配列番号５の１１３〜２９０番目のアミノ酸配列、及び（c）配列番号８の３４５〜４７５番目のアミノ酸配列を含むタンパク；及び
（９）下流方向に向けて、（a）配列番号５の１〜４５番目のアミノ酸配列、（b）配列番号５の１１３〜２９０番目のアミノ酸配列、及び（c）配列番号３の３５３〜６４１番目のアミノ酸配列を含むタンパク。 - 以下（１’）〜（９’）のいずれかに示すキメラＤＮＡ：
（１’）下流方向に向けて、配列番号１０の１〜２９１番目の塩基配列、配列番号１０の２９２〜９１２番目の塩基配列、及び配列番号２の１１５０〜１４８８番目の塩基配列を含むキメラＤＮＡ；
（２’）下流方向に向けて、配列番号１０の１〜２９１番目の塩基配列、配列番号１０の２９２〜９１２番目の塩基配列、及び配列番号１３の９７９〜１４２５番目の塩基配列を含むキメラＤＮＡ；
（３’）下流方向に向けて、配列番号１０の１〜２９１番目の塩基配列、配列番号２の５２３〜１１４９番目の塩基配列、及び配列番号２の１１５０〜１４８８番目の塩基配列を含むキメラＤＮＡ；
（４’）下流方向に向けて、配列番号１０の１〜２９１番目の塩基配列、配列番号２の５２３〜１１４９番目の塩基配列、及び配列番号１３の９７９〜１４２５番目の塩基配列を含むキメラＤＮＡ；
（５’）下流方向に向けて、配列番号１０の１〜２９１番目の塩基配列、配列番号１１の３４６〜９７８番目の塩基配列、及び配列番号２の１１５０〜１４８８番目の塩基配列を含むキメラＤＮＡ；
（６’）下流方向に向けて、配列番号１０の１〜２９１番目の塩基配列、配列番号１１の３４６〜９７８番目の塩基配列、及び配列番号１３の９７９〜１４２５番目の塩基配列を含むキメラＤＮＡ；
（７’）下流方向に向けて、配列番号１１の１〜３４５番目の塩基配列、配列番号１０の２９２〜９１２番目の塩基配列、及び遺伝子番号２の１１５０〜１４８８番目の塩基配列を含むキメラＤＮＡ；及び
（８’）下流方向に向けて、配列番号１１の１〜３４５番目の塩基配列、配列番号１０の２９２〜９１２番目の塩基配列、及び配列番号１３の９７９〜１４２５番目の塩基配列を含むキメラＤＮＡ；及び
（９’）下流方向に向けて、配列番号１０の１〜２９１番目の塩基配列、配列番号１０の２９２〜９１２番目の塩基配列、及び配列番号４の１１５０〜２０６７番目の塩基配列を含むキメラＤＮＡ。 - 請求項２に記載のキメラＤＮＡを含有するベクター。
- 請求項３に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
- 請求項４に記載の宿主細胞から産生される組換タンパク。
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