JP4771576B2 - Ｇａｓｃ１遺伝子 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な遺伝子、より詳しくは、ヒト食道の扁平上皮細胞の染色体９ｐ２３−２４の位置に存在しており、該細胞の癌化によって、その増幅およびその遺伝子産物の過剰発現が認められる新規な遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子の増幅は、腫瘍細胞においてしばしば観察される。この増幅は、腫瘍進展に影響する癌原遺伝子の活性化メカニズムの一つである(Stark,G.R.,et al.,Cell, 57,901-908 (1989))。増幅領域内に存在して増幅の対象となっている遺伝子を同定し、その特徴を明らかにすることは、癌の発生と進展の分子機構を明らかにする上で重要な情報を提供する。
【０００３】
食道癌は世界中において癌の死因の第６番目になっている(Pisani, P., et al., Int. J. Cancer, 83, 18-29 (1999))。この組織において生じる腫瘍の２つの主な組織病理学的な型は、扁平上皮癌と腺癌とであり、扁平上皮癌は、他の国と同じく、日本において最もしばしば見られる型である(厚生白書99年版)。
【０００４】
ＭＹＣ、ＥＧＦＲおよびＣＣＮＤ１の増幅を含む、食道扁平上皮癌の発生、進展および／または転移に関連する遺伝子変化の幾つかが確認されている(Lu,S.,H., et al., Int. J. Cancer, 42, 502-505 (1988); Jiang, W., et al., Cancer Res., 52, 2980-2983 (1992))。
【０００５】
近年、ＣＧＨ(Comparative genomic hybridization)を用いた研究によって、食道扁平上皮癌において少なくとも新しく１０の増幅領域が確認されているが(Pack, S.D.,Genes Chromosomes Cancer, 25, 160-168(1999); Shinomiya,T.,et al., Genes Chromosomes Cancer, 24, 337-344 (1999);.DuPlessis, L.,et al.,Cancer Res., 59, 1877-1883 (1999))、食道扁平上皮癌に関連する遺伝子は、これらの検出された染色体上の増幅領域からは未だ同定されていない。
【０００６】
本発明者らは、２９の食道扁平上皮癌細胞株について、ＤＮＡコピー数の異常を探索した結果、幾つかの新規な増幅領域を検出し、それらの中に９ｐ２３−２４領域の増幅を高頻度に確認した。
【０００７】
該９ｐ２３−２４領域での増幅は、この領域のゲノム変化が、非小細胞肺癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮頸部癌、乳癌、骨肉腫並びに縦隔胸腺Ｂ細胞リンパ腫を含む種々の悪性疾患に関わっていることが知られている(Knuutila,S.,et al., Am. J. Pathol., 152, 1107-1123 (1998))点より、特に興味がもたれた。このような報告は、該９ｐ２３−２４領域には、組織の型に拘わらず、増幅により活性化された癌遺伝子として働き得る１またはそれ以上の遺伝子が隠れている可能性を示唆している。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、先にＣＧＨにより幾つかの食道扁平上皮癌細胞株において増幅を認めた領域を、分子細胞遺伝子学的に解析することにより、９ｐ２３−２４領域の増幅を明らかにした。本発明者らは、この９ｐ２３−２４増幅領域内に存在すると推定される腫瘍関連遺伝子を同定するために、同領域内に存在する遺伝子や未知の転写体をスクリーニングし、その結果、ＰＨＤとＰＸドメイン（Aasland,R., et al., Trends. Biochem. Sci., 20, 56-59(1995); Lock,P., et al., EMBO J., 17, 4346-4357 (1998)）を含む蛋白をコードする新規な遺伝子の単離に成功し、これをＧＡＳＣ１(Gene Amplified in Squamous cell Carcinoma 1)と命名した。本発明は、かかる知見を基礎として完成されたものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、以下の要旨の発明が提供される。
(1) 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドを含む遺伝子：
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号：２で示される塩基配列に対して少なくとも９５％の相同性を有するポリヌクレオチド、
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対する相補鎖であるポリヌクレオチド。
(2) 配列番号：２で示される塩基配列である上記(1)に記載の遺伝子。
(3) 配列番号：１で示されるアミノ酸配列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである上記(1)に記載の遺伝子。
(4) 配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有する遺伝子発現産物。
(5) 上記(1)または(2)に記載の遺伝子を有する組換え体発現ベクター。
(6) 上記(5)に記載の組換え体発現ベクターを保有する宿主細胞。
(7) 配列番号：２で示される塩基配列中の連続する少なくとも１５の塩基配列を有するヌクレオチド配列。
(8) 配列番号：２で示される塩基配列中の連続する少なくとも３０の塩基配列を有する上記(7)に記載のヌクレオチド配列。
(9) 配列番号：２で示される塩基配列中の連続する少なくとも１５の塩基配列を有するプローブ。
(10)配列番号：２で示される塩基配列中の連続する少なくとも３０の塩基配列を有する上記(9)に記載のプローブ。
(11)上記(9)または(10)に記載のプローブを有効成分として含有する癌診断剤。
(12)上記(9)または(10)に記載のプローブを有効成分として含有する癌診断用キット。
(13)上記(1)に記載の遺伝子の発現産物に結合性を有する抗体またはその断片。
(14)検体に上記(13)に記載の抗体またはその断片を反応させて、検体中の該抗体またはその断片の結合物を検出する癌の診断方法。
【００１０】
また本発明によれば、下記要旨の発明も提供される。
(15)上記(4)に記載の遺伝子発現産物を発現するクローン化されたｃＤＮＡ、その断片、それらの誘導体、例えば構造を一部改変したり、他のアミノ酸配列等を付加して得られる改変物、およびそれらの相同物。
(16)配列番号：２で示される塩基配列中の連続する少なくとも１５の塩基配列に対するアンチセンス・ヌクレオチド配列。
(17)配列番号：２で示される塩基配列中の連続する少なくとも３０の塩基配列に対する上記(16)に記載のアンチセンス・ヌクレオチド配列。
(18)上記(16)または(17)に記載のアンチセンス・ヌクレオチド配列を有効成分として含有する遺伝子治療剤。
(19)下記（ａ）または（ｂ）の蛋白質：
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つＧＡＳＣ１活性を有する蛋白質。
(20)被検物質を含む培地中で上記(1)に記載の遺伝子またはその発現産物を培養する工程、および上記(1)に記載の遺伝子またはその発現産物の量を測定する工程を含む、上記発現産物と相互作用する物質（アゴニストおよび／またはアンタゴニスト）のスクリーニング方法。
(21)上記(1)に記載の遺伝子の相同物であって、ヒト、イヌ、サル、ウマ、ブタ、ヒツジおよびネコからなる群から選ばれる哺乳動物の遺伝子相同物。
(22)上記(13)に記載の抗体またはその断片を有効成分とする癌治療剤。
【００１１】
本明細書において、アミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸（ヌクレオチド）などの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）および当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、９ｐ２３−２４増幅領域内にその存在が推定される腫瘍関連遺伝子を探究するために、ＣＧＨ(Comparative genomic hybridization:比較ゲノムハイブリダイゼーション)によって、２９の食道扁平上皮癌細胞株を用いて研究した。その結果、これら細胞株の染色体上に存在する新たな関連遺伝子の探索についての研究結果として、本発明を完成するに至った。
【００１３】
即ち、２９の食道扁平上皮癌細胞株の染色体９ｐ２３−２４の位置に、高頻度に増幅が起こっていることを、ＣＧＨによって確認した。この増幅領域は、しばしば癌遺伝子および／または他の腫瘍関連遺伝子を保持している。また、９ｐ２３−２４の増幅は、種々の他の型の癌においても報告されている。
【００１４】
これらのことから、本発明者らは９ｐ２３−２４アンプリコン（増幅領域）の遺伝子地図を作製するために、ＹＡＣ（Yeast artificial chromosome）およびＰＡＣ（P1 artificial chromosome）をプローブとして用いた蛍光in situハイブリダイゼーションとサザンブロット分析を行った。
【００１５】
また、本発明者らはノーザンブロット分析によって、このアンプリコンの範囲内に存在する標的遺伝子あるいは転写体をスクリーニングした。この方法によって、幾つかの食道扁平上皮癌細胞株において増幅および過剰発現されている新規な遺伝子のクローニングに成功し、かくして得られたクローンを「ＧＡＳＣ１」と命名した。
【００１６】
本発明のＧＡＳＣ１遺伝子は、外科的切除した腫瘍から確立された食道扁平上皮癌細胞株(KYSEシリーズ)のＣＧＨによって、染色体９ｐ２３−２４の領域において高いレベルの増幅が見られたものである。本発明者らのノーザンブロットの結果によれば、ＩＭＡＧＥクローン１３１８６５（ＧＡＳＣ１の部分シークエンスを含むｃＤＮＡクローン）のみが、９ｐ２３−２４上で増幅を示した細胞株において、過剰発現を示した。
【００１７】
本発明ＧＡＳＣ１遺伝子の配列は、胃癌細胞株(HSC39)由来のＲＮＡから２つのｃＤＮＡライブラリーを構築し、ＩＭＡＧＥクローン１３１８６５をプローブとして該ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、陽性クローンを単離し、その塩基配列を決定することにより決定されたものである。
【００１８】
本発明ＧＡＳＣ１遺伝子は、配列番号：１で示される１０５６アミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを有する遺伝子として特定される。
【００１９】
本発明ＧＡＳＣ１遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の計算された分子量は１２０．０ｋＤａである。
【００２０】
従来の報告は、９ｐにおける遺伝的変化が、食道扁平上皮癌を含む広い範囲のヒト癌において見られている。食道扁平上皮癌の既に行われた分子遺伝的研究の結果によれば、特に増殖中の細胞のＧ１／Ｓ移行期を抑制的に調節するサイクリン依存性キナーゼ４／６のインヒビターをコードするＭＴＳ１(p16/CDKN2A)を包含している領域である９ｐ２１−２２が注目されていた(Tanaka,H.,et al.,Int.J.Cancer, 70, 437-442 (1997))。
【００２１】
ＣＧＨ（Kallioniemi., et al., Science, 258, 818-821 (1992)）およびＦＩＳＨ(Inazawa, J., et al., Jpn. J. Cancer Res., 83, 1248-1252 (1992))を用いる近年の研究は、９ｐ上に、特に９ｐ２３−２４の位置で、ＤＮＡの増幅が、他の型の腫瘍と同じように、食道扁平上皮癌にもしばしば起きていることを明らかにしている(Sonoda,G.,et al., Genes Chromosomes Cancer,20, 320-328 (1997); Taguchi,T.,et al., Genes Chromosomes Cancer, 20, 208-212 (1997); Giollant,M.,et al.,Hum. Genet.,98, 265-270 (1996); Fischer,U.,et al., Eur.J.Cancer, 30, 1124-1127 (1994); Sevelyeva,L.,et al.,Cancer Res., 58, 863-866 (1998))。
【００２２】
上記９ｐ２３−２４の位置でのＤＮＡの増幅およびそれに関連するであろう各種の報告には、例えば、以下の事項および文献の記載が包含される。
【００２３】
ヒト卵巣癌のＣＧＨ分析は、９ｐ２１−ｐｔｅｒがコピー数増加の起こりやすい部位の一つであることを明らかにし、９例のうちの１例が特異的に９ｐ２４増幅を示し、そして更に、進行期の腫瘍でより高頻度に生じる傾向が認められた(Sonoda,G.,et al., Genes Chromosomes Cancer, 20, 320-328 (1997))。
【００２４】
９ｐ２３−２４の増幅は、乳癌、肺癌、高度の星状細胞腫および神経膠芽腫でも観察されている(Taguchi,T.,et al.,Genes Chromosomes Cancer, 20, 208-212 (1997); Giollant,M.,et al.,Hum. Genet.,98, 265-270 (1996); Fischer,U.,et al.,Eur.J.Cancer, 30, 1124-1127 (1994); Sevelyeva,L.,et al.,Cancer Res.,58,863-866(1998))。
【００２５】
乳癌細胞株のＣＯＬＯ８２４は、ｐ１６／ＣＤＫＮ２Ａのさらに末端側にある９ｐ２３−２４で、ＤＮＡコピー数は約１０倍の増加を示している(Sevelyeva,L.,et al.,Cancer Res., 58, 863-866 (1998))。加えて、９ｐ２３−２４の重複とＢＲＣＡ２の変異が、乳癌を持つ３人の兄弟で報告されている（Savelyeva, L., et al., Cancer Res., 58, 863-866 (1998)）。
【００２６】
以上の報告等を総合すると、９ｐ２３−２４は、複数の腫瘍型に関連しており、少なくとも一つの腫瘍関連遺伝子を保持していることが示唆される。
【００２７】
ＧＳＡＣ１は１つのＰＸドメインを、２つのＰＨＤフィンガーをもっている。該ＰＸドメインは多種の蛋白において存在し、蛋白−蛋白間の相互作用に関係しているかもしれないが、このモチーフの機能は、未だよく特定されていない(Lock,P.,EMBO J., 17, 4346- 4357 (1998))。
【００２８】
亜鉛フィンガー様配列の一つであるＰＨＤフィンガーは、ショウジョウバエ(Drosophila)のｔｒｌやｐｃｌ遺伝子産物のようなクロマチンによって介在された転写調節に関連した核蛋白において、広く見つけられている(Aasland,R.,et al.,Trends. Biochem.Sci.,20, 56-59 (1995))。転写のコアクチベーターＴＩＦ１(Trnscriptional intermediary factor 1)、クロマチン関連アセチラーゼＭＯＺ(monocytic leukemia zinc-fnger protein)および皮膚筋炎特異的自己抗原Ｍｉ２を含む幾つかのＰＨＤフィンガーを持つ蛋白が、近年同定されている(Venturini,L.,et al., 18, 1209-1217 (1999); Borrow,J.,et al., Nat. Gene.,14, 33-41 (1996); Zhang,Y.,Cell, 95, 279-289 (1998))。
【００２９】
ＴＩＦ１ファミリー蛋白(α、β、γ)は、細胞の分化、腫瘍形成、シグナル伝達において重要な役割を演ずると思われる(Venturini,L., et al., 18, 1209-1217 (1999))。一方、Ｍｉ２は、ヒストン脱アセチル化活性およびヌクレオソーム再構築活性を保有する複合物中に見出されており、クロマチンの再編成に関連している。Ｍｉ２におけるＰＨＤフィンガーは、ヒストン脱アセチル化酵素と直接の相互作用のために要求されていると思われる(Zhang,Y., Cell, 95, 279-289 (1998))。
【００３０】
ＰＨＤモチーフは、幾つかの癌原遺伝子においても保持されている。ｔｒｘのヒト相同物であるＨＲＸ／ＡＬＬ１／ＭＬＬ(HRX:human trithorax; ALL: acute lymphoblastic leukemia; MLL: mixed lineage leukemia)は、子供の急性リンパ球性白血病において、しばしば変異がみられる(Tkachuk,D.C., et al., Cell, 71, 691-700 (1992))。
【００３１】
さらにｔｒｘの別のヒト相同物であるＭＬＬ２の増幅は、種々の固形組織由来の細胞株において観察されている(Huntsman,D.G., et al., Oncogene, 18, 7975-7984 (1999))。
【００３２】
ＰＬＵ−１の発現は、乳癌においては恒常的に認められるが、その発現は正常組織においては高度に限定されている(Lu,P., et al., J. Biol.Chem., 274, 15633-15645 (1999))。
【００３３】
ＡＩＲＥ遺伝子のＰＨＤフィンガー内の変異が、ＡＰＥＣＥＤ（自己免疫性多内分泌症−カンジダ症−外胚葉形成不全）のような自己免疫疾患を有する患者からのＤＮＡにおいて発見されている(The Finnish-German APECED Consortium. Nat. Genet., 17, 399-403 (1997))。
【００３４】
ＭＯＺ遺伝子は、急性骨髄性白血病の一例のケースにおいてＣＢＰ遺伝子[t(8;16)(p11;p14)]と融合していることが見い出され（Borrow, J., et al., Nat. Genet., 14, 33-41 (1996)）、そしてＲＥＴレセプター・チロシン・キナーゼ遺伝子とＴｉｆ１の融合が小児の乳頭状甲状腺癌のケースにおいて報告されている(Klugbauer,S.,Rabes,H.M.,Oncogene, 18, 4388-4393 (1999))。
【００３５】
本発明ＧＡＳＣ１遺伝子がコードするアミノ酸配列は、２つのＰＨＤフィンガー・モチーフを持っており、上記のようにＰＨＤフィンガー・モチーフは、クロマチン介在性の転写領域において関連する核蛋白および多数の癌原遺伝子において見出されることから、過剰発現したＧＡＳＣ１は、食道扁平上皮癌を含む種々の型の癌の発生および／または進展において重要な役割を演ずる可能性がある。
【００３６】
上記のとおり、本発明ＧＡＳＣ１遺伝子の推定産物の基本構造は、２つのＰＨＤフィンガー・モチーフと一つのＰＸドメインを含んでいる。
【００３７】
前述したとおり、ＰＨＤモチーフは、多くの癌原遺伝子において見出されること、食道扁平上皮癌で９ｐ２３−２４領域の増幅がしばしば起きていること、特に該９ｐ２３−２４領域の増幅は、進行期の腫瘍に最も一般的な傾向があること、更に９ｐ２３−２４領域の増幅は、乳癌、肺癌、進行した星状細胞腫および神経膠芽腫でも観察されていることから、本発明ＧＡＳＣ１遺伝子は、複数の腫瘍の発生、進展に重要な役割を演じていると考えられる。
【００３８】
故に、後述するように、ＧＡＳＣ１は、食道癌などの扁平上皮癌に関して、癌遺伝子に属するものであると考えられる。
【００３９】
本発明遺伝子の提供によれば、該遺伝子が各細胞での細胞の増殖、分化、腫瘍形成、転写活性化を調節する作用を有することに基づいて、これら作用に関与する疾患、例えば悪性腫瘍などの病態解明や診断、治療などが可能である。
【００４０】
本発明ＧＡＳＣ１遺伝子の全部または一部は、これらを利用する発現産物に結合する抗体またはその断片の製造、並びにこれらを用いる診断に利用することができる。
【００４１】
更に本発明遺伝子の提供によれば、遺伝子配列のアンチセンス断片、これらの発現産物の利用によって、上記疾患の形成を抑制することもできる。
【００４２】
本発明ＧＡＳＣ１遺伝子の全部または一部は、またプローブとして利用でき、該利用により、癌の診断並びに診断用キットの作成が可能である。さらに腫瘍においてＧＡＳＣ１遺伝子の遺伝子増幅・発現亢進は、癌の診断ばかりでなく、癌の悪性度の判定にも利用可能である。
【００４３】
本発明ＧＡＳＣ１遺伝子またはその発現産物は、またＧＡＳＣ１蛋白相互作用物のスクリーニングにも利用することができる。
【００４４】
尚、本発明によって提供されるＧＡＳＣ１遺伝子の一例は、ヒト癌細胞起源のものであり、その利用によれば、ヒトを含む各種哺乳動物の相同遺伝子も提供できる。また、本発明遺伝子の利用によれば、本発明遺伝子によりコードされるアミノ酸配列のＣ末端側と結合する遺伝子の同定を行うこともできる。
【００４５】
以下、本発明遺伝子（ＤＮＡ分子)につき詳述する。
【００４６】
なお、本発明において遺伝子（ＤＮＡ）とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖という各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨であり、その長さに何ら制限されるものではない。従って、本発明の遺伝子（ＤＮＡ）には、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（センス鎖）並びに該センス鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）およびそれらの断片のいずれもが含まれる。
【００４７】
本発明遺伝子の一具体例としては、後述する実施例に示されるクローンの有するＤＮＡ配列から演繹されるものを挙げることができる。
【００４８】
このクローンが有する遺伝子は、配列番号：１に示される１０５６アミノ酸残基からなる蛋白質をコードする３１６８ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（配列番号：２に示される塩基配列）を有する。陽性クローンからｃＤＮＡ配列の一方向配列から上記３１６８ヌクレオチドの単一のオープン・リーディング・フレームを含む４２３５ヌクレオチドの転写体を確認した。転写の開始(「コザックのルール」)のためのコンセンサス配列がよく保存されていることから、転写のための開始コドンは、ヌクレオチド番号の１４６−１４８番目であると確認された。
【００４９】
なお、全長ｃＤＮＡの塩基配列は、配列番号：３に示すとおり４２３５ヌクレオチドである。
【００５０】
推定された遺伝子産物は、Ｃ末端側に２つのＰＨＤフィンガー・モチーフ(687-749残基および807-867残基)と、１つのＰＸドメイン(950-1047残基)を含んでいる。
【００５１】
本発明遺伝子には、上記配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする塩基配列を有するものが包含され、また当該遺伝子の相同物も包含される。
【００５２】
ここで「相同物」とは、本発明遺伝子（またはその遺伝子産物）と配列相同性を有し、上記構造的特徴、遺伝子発現パターンにおける共通性および上記したようなその生物学的機能の類似性により、ひとつの遺伝子ファミリーと認識される一連の関連遺伝子を意味する。これにはＧＡＳＣ１遺伝子のアレル体（対立遺伝子）も当然含まれる。
【００５３】
上記相同物の具体例としては、配列番号：１で示される特定のアミノ酸配列において、一定の改変を有する蛋白質であって且つ該特定のアミノ酸配列を有するＧＡＳＣ１蛋白質と同様の活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を挙げることができる。
【００５４】
上記アミノ酸配列における相同性は、ＦＡＳＴＡ或いはＢＬＡＳＴプログラムを使用した検索（Clustal,V., Methods Mol.Biol., 25, 307-318 (1994))において、通常、アミノ酸配列の全体で約４５％以上、好ましくは約５０％以上であることができる。
【００５５】
また、上記相同性は、ＰＸドメインおよび／またはＰＨＤフィンガー・モチーフ領域におけるそれが約３５％以上、好ましくは約４５％以上のいずれか少なくとも一つを満たしていることが望ましい。
【００５６】
即ち、本発明遺伝子には、配列番号：１に示されるアミノ酸配列において１または数個乃至複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ分子もまた包含される。
【００５７】
ここで、「アミノ酸の欠失、置換または付加」の程度およびそれらの位置などは、改変された蛋白質が、配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質（ＧＡＳＣ１蛋白）と同様の機能を有する同効物であれば特に制限されない。本発明において「ＧＡＳＣ１活性」とは配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質が有する活性並びに機能を意味し、具体的には、各細胞での細胞の増殖、分化、腫瘍形成、転写活性化を調節する作用を指す。
【００５８】
上記アミノ酸配列の改変（変異）などは、天然において、例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じることもあるが、天然由来の遺伝子（例えば本発明のヒトＧＡＳＣ１またはヒトＧＡＳＣ１遺伝子）に基づいて人為的に改変することもできる。本発明は、このような改変・変異の原因および手段などを問わず、上記特性を有する全ての改変アミノ酸配列をコードする遺伝子（改変遺伝子）を包含する。
【００５９】
上記の人為的手段としては、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987)；同 100, 468 (1983)；Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)；続生化学実験講座１「遺伝子研究法II」、日本生化学会編, p105 (1986)〕などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967)；同91, 3350 (1969)；Science, 150, 178 (1968)；Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981)；同24, 245 (1983)〕およびそれらの組合せ方法などが例示できる。より具体的には、ＤＮＡの合成は、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法による化学合成によることもでき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用い相補鎖を付加するかによって、化学合成した一本鎖生成物から得ることもできる。
【００６０】
本発明遺伝子の具体的態様としては、配列番号：２に示される塩基配列を有する遺伝子を例示できる。この塩基配列中のコーディング領域は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列の各アミノ酸残基を示すコドンの一つの組合せ例を示している。本発明の遺伝子は、かかる特定の塩基配列を有する遺伝子に限らず、各アミノ酸残基に対して任意のコドンを組合せ、選択した塩基配列を有することも可能である。コドンの選択は、常法に従うことができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻度などを考慮することができる〔Ncleic Acids Res., 9, 43 (1981)〕。
【００６１】
また、本発明ＤＮＡ分子は、前記のとおり、配列番号：２に示される塩基配列と一定の相同性を有する塩基配列からなるものも包含する。
【００６２】
上記相同性とは、配列番号：１で示されるアミノ酸配列を含んでいるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは配列番号：２に示される塩基配列と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、更に最も好ましくは少なくとも９７％の同一性を有することをいう。
【００６３】
かかる相同性遺伝子には、例えば、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃または０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃のストリンジェントな条件下で配列番号：２に示される塩基配列中、２３８−６３９の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズする塩基配列を有する遺伝子が包含される。
【００６４】
本発明遺伝子は、本発明により開示された本発明遺伝子の具体例についての配列情報に基づいて、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる〔Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、II、III」、日本生化学会編（1986）など参照〕。
【００６５】
具体的には、本発明遺伝子が発現される適当な起源より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、本発明遺伝子に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981)；Science, 222, 778 (1983)など〕。
【００６６】
上記において、ｃＤＮＡの起源としては、本発明の遺伝子を発現する各種の細胞、組織やこれらに由来する培養細胞などが例示される。また、これらからの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。また、ｃＤＮＡライブラリーは市販されてもおり、本発明においてはそれらｃＤＮＡライブラリー、例えばクローンテック社（Clontech Lab.Inc.）などより市販されている各種ｃＤＮＡライブラリーなどを用いることもできる。
【００６７】
本発明の遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。
【００６８】
具体的には、例えばｃＤＮＡによって産生される蛋白質に対して、該蛋白質の特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーションなどやこれらの組合せなどを例示できる。
【００６９】
ここで用いられるプローブとしては、本発明の遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたＤＮＡなどが一般的に使用できるが、既に取得された本発明遺伝子やその断片も良好に利用できる。また、本発明遺伝子の塩基配列情報に基づき設定したセンス・プライマー、アンチセンス・プライマーをスクリーニング用プローブとして用いることもできる。
【００７０】
前記プローブとして用いられるヌクレオチド配列は、配列番号：２に対応する部分ヌクレオチド配列であって、少なくとも１５個の連続した塩基、好ましくは２０個の連続した塩基、より好ましくは３０個の連続した塩基、最も好ましくは５０個の連続した塩基を有するものが含まれる。前記配列番号：２の配列を有する陽性クローンそれ自体もまたかかるプローブとして用いることができる。
【００７１】
本発明遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ法〔Science, 230, 1350 (1985)〕によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法〔Rapid amplification of cDNA ends；実験医学、12(6), 35 (1994)〕、特に５'-ＲＡＣＥ法〔M.A. Frohman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)〕などの採用が好適である。
【００７２】
かかるＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーは、本発明によって明らかにされた本発明の遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定でき、これは常法に従って合成できる。尚、増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法などによればよい。
【００７３】
また、上記で得られる本発明遺伝子或いは各種ＤＮＡ断片は、常法、例えばジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)〕やマキサム−ギルバート法〔Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)〕などに従って、また簡便には市販のシークエンスキットなどを用いて、その塩基配列を決定することができる。
【００７４】
このようにして得られる本発明の遺伝子によれば、例えば該遺伝子の一部または全部の塩基配列を利用することにより、個体もしくは各種組織における本発明遺伝子の発現の有無を特異的に検出することができる。
【００７５】
かかる検出は常法に従って行うことができ、例えばＲＴ−ＰＣＲ〔Reverse transcribed-Polymerase chain reaction; E.S. Kawasaki, et al., Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, Academic Press,Inc.,SanDiego, 21-27 (1991)〕によるＲＮＡ増幅やノーザンブロッティング解析〔Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. (1989)〕、in situ ＲＴ−ＰＣＲ〔Nucl. Acids Res., 21, 3159-3166 (1993)〕や in situ ハイブリダイゼーションなどを利用した細胞レベルでの測定、ＮＡＳＢＡ法〔Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350, 91-92 (1991)〕およびその他の各種方法を挙げることができる。好適には、ＲＴ−ＰＣＲによる検出法を挙げることができる。
【００７６】
尚、ここでＰＣＲ法を採用する場合に用いられるプライマーとしては、本発明遺伝子のみを特異的に増幅できる該遺伝子特有のものである限り、特に制限はなく、本発明遺伝子の配列情報に基いて適宜設定することができる。通常プライマーとして１０〜３５程度のヌクレオチド、好ましくは１５〜３０ヌクレオチド程度の長さを有する本発明遺伝子の部分配列を有するものを挙げることができる。
【００７７】
このように、本発明の遺伝子には、本発明にかかるＧＡＳＣ１遺伝子を検出するための特異プライマーおよび／または特異プローブとして使用されるＤＮＡ断片もまた包含される。
【００７８】
当該ＤＮＡ断片は、配列番号：２に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とするＤＮＡとして規定することできる。ここで、ストリンジェントな条件としては、プライマーまたはプローブとして用いられる通常の条件を挙げることができ、特に制限はされないが、例えば、前述するような０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃の条件または０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃の条件を例示することができる。
【００７９】
本発明遺伝子の利用によれば、通常の遺伝子工学的手法により、該遺伝子の発現産物（ＧＡＳＣ１蛋白）またはこれを含む蛋白質を容易に大量に、安定して製造することができる。
【００８０】
従って本発明は、本発明遺伝子によってコードされる蛋白質を始め、該蛋白質の製造のための、例えば本発明遺伝子を含有するベクター、該ベクターによって形質転換された宿主細胞、該宿主細胞を培養して上記本発明蛋白質を製造する方法などをも提供するものである。
【００８１】
本発明蛋白質の具体的態様としては、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＧＡＳＣ１蛋白質を挙げることができる。本発明蛋白質には、該ＧＡＳＣ１蛋白質のみならず、その相同物も包含される。該相同物としては、上記配列番号：１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個乃至複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し且つ前記ＧＡＳＣ１活性を有する蛋白質を挙げることができる。具体的には、前記ＧＡＳＣ１遺伝子の相同物（アレル体を含むＧＡＳＣ１同等遺伝子）の遺伝子産物を挙げることができる。
【００８２】
また、本発明ＧＡＳＣ１蛋白質の相同物には、配列番号：１に示されるアミノ酸配列のＧＡＳＣ１蛋白質と同一活性を有する、哺乳動物、例えばヒト、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラット、ウサギなどのげっ歯類動物の蛋白質も包含される。
【００８３】
本発明蛋白質は、本発明により提供されるＧＡＳＣ１遺伝子の配列情報に基づいて、常法の遺伝子組換え技術〔例えばScience, 224, 1431 (1984) ; Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985)；Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80, 5990 (1983)など参照〕に従って調製することができる。
【００８４】
該蛋白質の製造は、より詳細には、該所望の蛋白をコードする遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から回収することにより行われる。
【００８５】
上記宿主細胞としては、原核生物および真核生物のいずれも用いることができ、例えば原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌といった一般的に用いられるものが広く挙げられ、好適には大腸菌、とりわけエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２株に含まれるものを例示できる。また、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、前者としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Cell, 23: 175 (1981)〕やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞およびそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 77: 4216 (1980)〕などが、後者としては、サッカロミセス属酵母細胞などが好適に用いられる。勿論、これらに限定される訳ではない。
【００８６】
原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーターおよびＳＤ（シャイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン（例えばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを好適に利用できる。上記ベクターとしては、一般に大腸菌由来のプラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３などがよく用いられるが、これらに限定されず既知の各種のベクターを利用することができる。大腸菌を利用した発現系に利用される上記ベクターの市販品としては、例えばｐＧＥＸ−４Ｔ（Amersham Pharmacia Biotech社）、ｐＭＡＬ−Ｃ２，ｐＭＡｌ−Ｐ２（New England Biolabs社）、ｐＥＴ２１，ｐＥＴ２１／ｌａｃｑ（Invitrogen社）、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（Invitrogen社）等を例示できる。
【００８７】
脊椎動物細胞を宿主とする場合の発現ベクターとしては、通常、発現しようとする本発明遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終了配列を保有するものが挙げられ、これは更に必要により複製起点を有していてもよい。該発現ベクターの例としては、具体的には、例えばＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳＶ２dhfr〔Mol. Cell. Biol., 1: 854 (1981)〕等が例示できる。上記以外にも既知の各種の市販ベクターを用いることができる。動物細胞を利用した発現系に利用されるかかるベクターの市販品としては、例えばｐＥＧＦＰ−Ｎ，ｐＥＧＦＰ−Ｃ（Clontrech社）、ｐＩＮＤ（Invitrogen社）、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（Invitrogen社）などの動物細胞用ベクターや、ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴ（ＧｉｂｃｉＢＲＬ社）、ｐＡｃＧＨＬＴ（PharMingen社）、ｐＡｃ５／Ｖ５−Ｈｉｓ，ｐＭＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ，ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ｈｉｓ（以上Invitrogen社）などの昆虫細胞用ベクターなどが挙げられる。
【００８８】
また、酵母細胞を宿主とする場合の発現ベクターの具体例としては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモーターを有するｐＡＭ８２〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80: 1 (1983)〕などが例示できる。市販の酵母細胞用発現ベクターには、例えばｐＰＩＣＺ（Invitrogen社）、ｐＰＩＣＺα（Invitrogen社）なとが包含される。
【００８９】
プロモーターとしても特に限定なく、エッシェリヒア属菌を宿主とする場合は、例えばトリプトファン(trp)プロモーター、lppプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、PL/PRプロモーターなどを好ましく利用できる。宿主がバチルス属菌である場合は、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。酵母を宿主とする場合のプロモーターとしては、例えばpH05プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどを好適に利用できる。また、動物細胞を宿主とする場合の好ましいプロモーターとしては、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを例示できる。
【００９０】
尚、本発明遺伝子の発現ベクターとしては、通常の融合蛋白発現ベクターも好ましく利用できる。該ベクターの具体例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として発現させるためのｐＧＥＸ（Promega 社）などを例示できる。
【００９１】
所望の組換えＤＮＡ（発現ベクター）の宿主細胞への導入法およびこれによる形質転換法としては、特に限定されず、一般的な各種方法を採用することができる。
【００９２】
また得られる形質転換体は、常法に従い培養でき、該培養により所望のように設計した遺伝子によりコードされる本発明の目的蛋白質が、形質転換体の細胞内、細胞外または細胞膜上に発現、生産（蓄積、分泌）される。
【００９３】
該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。
【００９４】
かくして得られる本発明の組換え蛋白質は、所望により、その物理的性質、化学的性質などを利用した各種の分離操作〔「生化学データーブックII」、1175-1259 頁、第１版第１刷、1980年 6月23日株式会社東京化学同人発行；Biochemistry, 25(25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987)など参照〕により分離、精製できる。
【００９５】
該方法としては、具体的には、通常の再構成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せが例示でき、特に好ましい方法としては、本発明蛋白質に対する特異的な抗体を結合させたカラムを利用したアフィニティクロマトグラフィーなどを例示することができる。
【００９６】
尚、本発明蛋白質をコードする所望の遺伝子の設計に際しては、配列番号：２に示されるＧＡＳＣ１遺伝子の塩基配列を良好に利用することができる。該遺伝子は、所望により、各アミノ酸残基を示すコドンを適宜選択変更して利用することも可能である。また、ＧＡＳＣ１遺伝子でコードされるアミノ酸配列において、その一部のアミノ酸残基ないしはアミノ酸配列を置換、欠失、付加などにより改変する場合には、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシスなどの前記した各種方法により行うことができる。
【００９７】
本発明蛋白質は、また、配列番号：１に示すアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により製造することができる。該方法には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法が包含される。
【００９８】
かかるペプチド合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていく所謂ステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含し、本発明蛋白質の合成は、そのいずれによってもよい。
【００９９】
上記ペプチド合成に採用される縮合法も、常法に従うことができ、例えば、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドなど）法、ウッドワード法などを例示できる。
【０１００】
これら各方法に利用できる溶媒も、この種ペプチド縮合反応に使用されることのよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチルなどおよびこれらの混合溶媒などを挙げることができる。
【０１０１】
尚、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸乃至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第３級ブチルエステルなどの低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステルなどのアラルキルエステルなどとして保護することができる。
【０１０２】
また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばチロシン残基の水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第３級ブチル基などで保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。更に、例えばアルギニン残基のグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基などの適当な保護基により保護することができる。
【０１０３】
上記保護基を有するアミノ酸、ペプチドおよび最終的に得られる本発明蛋白質におけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸などを用いる方法などに従って実施することができる。
【０１０４】
かくして得られる本発明蛋白質は、前記した各種の方法、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、向流分配法などのペプチド化学の分野で汎用される方法に従って、適宜精製を行うことができる。
【０１０５】
本発明ＧＡＳＣ１蛋白質およびそのフラグメントは、これらに対する特異抗体を作成するための免疫抗原としても好適に利用でき、これらの抗原を利用することにより、所望の抗血清（ポリクローナル抗体）およびモノクローナル抗体を取得することができる。
【０１０６】
該抗体の製造法自体は、当業者によく理解されているところであり、本発明においてもこれら常法に従うことができる〔例えば、続生化学実験講座「免疫生化学研究法」、日本生化学会編（1986）など参照〕。
【０１０７】
かくして得られる抗体は、例えばＧＡＳＣ１蛋白の精製およびその免疫学的手法による測定ないしは識別などに有利に利用することができる。より具体的には、本発明遺伝子の増幅および発現亢進が癌細胞において確認されていることから、該抗体を用いて癌の診断または、癌の悪性度の判定に利用することができる。更に、ＧＡＳＣ１に結合する抗体を有効成分とする癌の治療剤として利用することができる。
【０１０８】
従って、本発明蛋白質に結合する抗体は、これを有効成分とする医薬品として医薬分野において有用である。従って、本発明は本発明蛋白質を有効成分とする医薬組成物をも提供するものである。
【０１０９】
該医薬組成物において有効成分とする蛋白質には、その医薬的に許容される塩もまた包含される。かかる塩には、当業界で周知の方法により調製される、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウムなどの無毒性アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などが包含される。更に上記塩には、本発明蛋白質と適当な有機酸ないし無機酸との反応による無毒性酸付加塩も包含される。代表的無毒性酸付加塩としては、例えば塩酸塩、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、硼酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩（トシレート）、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、スルホン酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩およびナプシレートなどが例示される。
【０１１０】
上記医薬組成物は、本発明蛋白質を活性成分として、その薬学的有効量を、適当な無毒性医薬担体ないし希釈剤と共に含有するものが含まれる。
【０１１１】
上記医薬組成物（医薬製剤）に利用できる医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤或は賦形剤などを例示でき、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用される。
【０１１２】
特に好ましい本発明医薬製剤は、通常の蛋白製剤などに使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤などを適宜使用して調製される。
【０１１３】
上記安定化剤としては、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体などを例示でき、これらは単独でまたは界面活性剤などと組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。
【０１１４】
上記Ｌ−アミノ酸としては、特に限定はなく例えばグリシン、システィン、グルタミン酸などのいずれでもよい。
【０１１５】
上記糖としても特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖などの単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトールなどの糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖などの二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸などの多糖類などおよびそれらの誘導体などを使用できる。
【０１１６】
界面活性剤としても特に限定はなく、イオン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用でき、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエ−テル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系などを使用できる。
【０１１７】
セルロース誘導体としても特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを使用できる。
【０１１８】
上記糖類の添加量は、有効成分１μｇ当り約０．０００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０１〜１０ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。界面活性剤の添加量は、有効成分１μｇ当り約０．００００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０００１〜０．０１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。ヒト血清アルブミンの添加量は、有効成分１μｇ当り約０．０００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．００１〜０．１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。アミノ酸は、有効成分１μｇ当り約０．００１〜１０ｍｇ程度とするのが適当である。また、セルロース誘導体の添加量は、有効成分１μｇ当り約０．００００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．００１〜０．１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。
【０１１９】
本発明医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択されるが、通常約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。
【０１２０】
また本発明医薬製剤中には、各種添加剤、例えば緩衝剤、等張化剤、キレート剤などをも添加することができる。ここで緩衝剤としては、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）などを例示できる。等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリンなどを例示できる。またキレート剤としては、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸などを例示できる。
【０１２１】
本発明医薬製剤は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時水、生埋的食塩水などを含む緩衝液などで溶解して適当な濃度に調製した後に使用することも可能である。
【０１２２】
本発明の医薬製剤の投与単位形態としては、各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとしては、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤などの固体投与形態や、溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ、エリキシルなどの液剤投与形態が含まれ、これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤、経鼻剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、軟膏剤などに分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形乃至調製することができる。
【０１２３】
例えば、錠剤の形態に成形するに際しては、上記製剤担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウムなどの賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウムなどの崩壊剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリドなどの界面活性剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤、グリセリン、デンプンなどの保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸などの吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコールなどの滑沢剤などを使用できる。
【０１２４】
更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠とすることができ、また二重錠ないしは多層錠とすることもできる。
【０１２５】
丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結合剤、ラミナラン、カンテンなどの崩壊剤などを使用できる。
【０１２６】
カプセル剤は、常法に従い通常本発明の有効成分を上記で例示した各種の製剤担体と混合して硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセルなどに充填して調整される。
【０１２７】
経口投与用液体投与形態は、慣用される不活性希釈剤、例えば水、を含む医薬的に許容される溶液、エマルジョン、懸濁液、シロップ、エリキシルなどを包含し、更に湿潤剤、乳剤、懸濁剤などの助剤を含ませることができ、これらは常法に従い調製される。
【０１２８】
非経口投与用の液体投与形態、例えば滅菌水性乃至非水性溶液、エマルジョン、懸濁液などへの調製に際しては、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルおよびオリーブ油などの植物油などを使用でき、また注入可能な有機エステル類、例えばオレイン酸エチルなどを配合できる。これらには更に通常の溶解補助剤、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、分散剤などを添加することもできる。
【０１２９】
滅菌は、例えばバクテリア保留フィルターを通過させる濾過操作、殺菌剤の配合、照射処理および加熱処理などにより実施できる。また、これらは使用直前に滅菌水や適当な滅菌可能媒体に溶解することのできる滅菌固体組成物形態に調製することもできる。
【０１３０】
坐剤や膣投与用製剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として、例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチンおよび半合成グリセライドなどを使用できる。
【０１３１】
ペースト、クリーム、ゲルなどの軟膏剤の形態に成形するに際しては、希釈剤として、例えば白色ワセリン、パラフイン、グリセリン、セルロース誘導体、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイトおよびオリーブ油などの植物油などを使用できる。
【０１３２】
経鼻または舌下投与用組成物は、周知の標準賦形剤を用いて、常法に従い調製することができる。
【０１３３】
尚、本発明薬剤中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などや他の医薬品などを含有させることもできる。
【０１３４】
上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤は経口投与され、注射剤は単独でまたはブドウ糖やアミノ酸などの通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じ単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、坐剤は直腸内投与され、経膣剤は膣内投与され、経鼻剤は鼻腔内投与され、舌下剤は口腔内投与され、軟膏剤は経皮的に局所投与される。
【０１３５】
上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。一般的には、該投与量は、通常、１日当り体重１ｋｇ当り、約０．０１μｇ〜１０ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度とするのがよく、該製剤は１日に１回または数回に分けて投与することができる。
【０１３６】
また、本発明は、本発明ＧＡＳＣ１遺伝子の発現する細胞において、細胞内のｍＲＮＡに対して相補的配列を持つＲＮＡを作り出し、翻訳を阻害し、ＧＡＳＣ１遺伝子の発現を抑制するためのアンチセンス医薬の提供による癌の遺伝子治療法を提供する。該治療法は、例えばＧＡＳＣ１遺伝子を有する癌細胞本来のｍＲＮＡと結合させるか、或いはＤＮＡ二重螺旋の間に入り込み三重鎖を形成させることによって、転写或いは翻訳の過程を阻害することによって、標的とする遺伝子の発現を抑制する方法である。この方法は従って遺伝子のｍＲＮＡと相補的なアンチセンス・ヌクレオチドを製造し、該アンチセンス・ヌクレオチドを標的細胞に供給する方法としてとらえることができる。
【０１３７】
かかるＧＡＳＣ１遺伝子の発現機能を抑制する作用を供給すれば、受容細胞／標的細胞における新生物の増殖を抑制することができる。当該アンチセンス・ヌクレオチドを含有するベクターまたはプラスミドを用いて染色体外に維持し、目的の細胞に導入することができる。
【０１３８】
上記アンチセンス・ヌクレオチドを用いた癌遺伝子治療によれば、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ由来のベクターに該アンチセンス・ヌクレオチドを組み込み、これを癌細胞に感染させてアンチセンス・ヌクレオチドを過剰発現させることにより、所望の抗腫瘍効果を得ることができる。
【０１３９】
このようにＧＡＳＣ１遺伝子を有する細胞にアンチセンス・ヌクレオチドを導入してＧＡＳＣ１蛋白の発現を抑制させる場合、当該アンチセンス・ヌクレオチドは対応するＧＡＳＣ１遺伝子の全長に対応するものである必要はなく、例えば該ＧＡＳＣ１遺伝子の発現機能を抑制する機能と実質的に同質な機能を保持する限りにおいて、前記した改変体であっても、また特定の機能を保持した一部配列からなる遺伝子であってもよい。
【０１４０】
かかる組換えおよび染色体外維持の双方のための、所望遺伝子を導入すべきベクターは、当該分野において既に知られており、本発明ではかかる既知のベクターのいずれもが使用できる。例えば、発現制御エレメントに連結したＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチドのコピーを含み且つ目的の細胞内で当該アンチセンス・ヌクレオチド産物を発現できるウイルスベクターまたはプラスミドベクターを挙げることができる。かかるベクターとしては、通常前述した発現用ベクターを利用することもでき、好適には、例えば起源ベクターとして、米国特許第５２５２４７９号明細書およびＰＣＴ国際公開ＷＯ９３／０７２８２号明細書に開示されたベクター（ｐＷＰ−７Ａ、ｐＷＰ−１９、ｐＷＵ−１、ｐＷＰ−８Ａ、ｐＷＰ−２１および／またはｐＲＳＶＬなど）またはｐＲＣ／ＣＭＶ（Invitrogen社製）などを用いて調製されたベクターを用いることもできる。より好ましいベクターとしては、後述する各種ウイルス・ベクターを挙げることができる。
【０１４１】
なお、遺伝子導入治療において用いられるベクターに使用されるプロモーターとしては、各種疾患の治療対象となる患部組織に固有のものを好適なものとして例示することができる。
【０１４２】
その具体例としては、例えば、肝臓に対しては、アルブミン、α−フェトプロティン、α１−アンチトリプシン、トランスフェリン、トランススチレンなどを例示できる。結腸に対しては、カルボン酸アンヒドラーゼＩ、カルシノエンブロゲンの抗原などを例示できる。子宮および胎盤に対しては、エストロゲン、アロマターゼ、サイトチトクロームＰ４５０、コレステロール側鎖切断Ｐ４５０、１７アルファーヒドロキシラーゼＰ４５０などを例示できる。
【０１４３】
前立腺に対しては、前立腺抗原、ｇｐ９１−フォックス遺伝子、前立腺特異的カリクレインなどを例示できる。乳房に対しては、ｅｒｂ−Ｂ２、ｅｒｂ−Ｂ３、β−カゼイン、β−ラクトグロビン、乳漿蛋白質などを例示できる。肺に対しては、活性剤蛋白質Ｃウログロブリンなどを例示できる。皮膚に対しては、Ｋ−１４−ケラチン、ヒトケラチン１または６、ロイクリンなどを例示できる。
【０１４４】
脳に対しては、神経膠繊維質酸性蛋白質、成熟アストロサイト特異蛋白質、ミエリン塩基性蛋白質、チロシンヒドロキシラーゼ等を例示できる。膵臓に対しては、ヴィリン、グルカゴン、ランゲルハンス島アミロイドポリペプチドなどを例示できる。甲状腺に対しては、チログロブリン、カルシトニンなどを例示できる。骨に対しては、α１コラーゲン、オステオカルシン、骨シアログリコプロティンなどを例示できる。腎臓に対してはレニン、肝臓／骨／腎臓アルカリ性ホスフォターゼ、エリスロポエチンなどを、膵臓に対しては、アミラーゼ、ＰＡＰ１などを例示できる。
【０１４５】
なおアンチセンス・ヌクレオチド導入用ベクターの製造において、導入されるアンチセンス・ヌクレオチド（ＧＡＳＣ１遺伝子配列に対応する相補配列全部または一部）は、本発明のＧＡＳＣ１遺伝子の塩基配列情報に基づいて、前記の如く、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる。
【０１４６】
かかるアンチセンス・ヌクレオチド導入用ベクターの細胞への導入は、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈法、ウイルス形質導入などを始めとする、細胞にＤＮＡを導入する当該分野において既に知られている各種の方法に従って行うことができる。なお、ＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチドで形質転換された細胞は、それ自体単離状態で癌の抑制ないしは癌転移の抑制のための医薬や、治療研究のためのモデル系として利用することも可能である。
【０１４７】
遺伝子治療においては、上記のアンチセンス・ヌクレオチド導入用ベクターは、患者の腫瘍部位に局所的にまたは全身的に注射投与することにより患者の腫瘍細胞内に導入することができる。この際全身的投与によれば、他の部位に転移し得るいずれの腫瘍細胞にも到達させることができる。形質導入された遺伝子が各標的腫瘍細胞の染色体内に恒久的に取り込まれない場合には、該投与を定期的に繰り返すことによって達成できる。
【０１４８】
本発明の遺伝子治療方法は、前述したアンチセンス・ヌクレオチド導入用の材料（アンチセンス・ヌクレオチド導入用ベクター）を直接体内に投与するインビボ（in vivo）法と、患者の体内より一旦標的とする細胞を取り出して体外で遺伝子を導入して、その後、該細胞を体内に戻すエクスビボ（ex vivo）法の両者を包含する。
【０１４９】
またＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチドを直接細胞内に導入し、ＲＮＡ鎖を切断する活性分子であるリボザイムによる遺伝子治療も可能である。
【０１５０】
後述する、本発明ＧＡＳＣ１遺伝子に対応する配列のアンチセンス・ヌクレオチド全部もしくはその断片を含有する遺伝子導入用ベクターおよび該ベクターによりＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチドが導入された細胞を有効成分とする本発明の遺伝子治療剤は、特に癌をその利用対象とするものであるが、上記の遺伝子治療（処置）は、癌以外にも遺伝性疾患、ＡＩＤＳのようなウイルス疾患の治療、並びに遺伝子標識をも目的として行うことができる。
【０１５１】
また、アンチセンス・ヌクレオチドを導入する標的細胞は、遺伝子治療（処置）の対象により適宜選択することができる。例えば、標的細胞として、癌細胞や腫瘍組織以外に、リンパ球、線維芽細胞、肝細胞、造血幹細胞、如き細胞などを挙げることができる。
【０１５２】
上記遺伝子治療におけるアンチセンス・ヌクレオチド導入方法には、ウイルス的導入方法および非ウイルス的導入方法が含まれる。
【０１５３】
ウイルス的導入方法としては、例えば、ＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチドが正常細胞に発現する外来の物質であることに鑑みて、ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる方法を挙げることができる。その他のウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、ＨＩＶ（human immunodeficiency virus）ベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ，adeno-associated virus）、ヘルペスウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターおよびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ，Epstein-Barr virus）ベクターなどがあげられる。
【０１５４】
非ウイルス的な遺伝子導入方法としては、リン酸カルシウム共沈法；ＤＮＡを封入したリポソームと予め紫外線で遺伝子を破壊した不活性化センダイウイルスを融合させて膜融合リポソームを作成し、細胞膜と直接融合させてＤＮＡを細胞内に導入する膜融合リポソーム法〔Kato,K.,et al., J. Biol. Chem., 266, 22071-22074 (1991)〕；プラスミドＤＮＡを金でコートして高圧放電によって物理的に細胞内にＤＮＡを導入する方法〔Yang,N.S. et al.,Proc.Natl.Acad.Sci., 87, 9568-9572 (1990)〕；プラスミドＤＮＡを直接インビボで臓器や腫瘍に注入するネイキッド（naked）ＤＮＡ法〔Wolff,J.A.,et al., Science, 247, 1465-1467 (1990)〕；多重膜正電荷リポソームに包埋した遺伝子を細胞に導入するカチオニック・リポソーム法〔八木国夫, 医学のあゆみ, Vol.175,No.9,635-637 (1995)〕；特定細胞のみに遺伝子を導入し、他の細胞に入らないようにするために、目的とする細胞に発現するレセプターに結合するリガンドをＤＮＡと結合させてそれを投与するリガンド−ＤＮＡ複合体法〔Frindeis,et al.,Trends Biotechnol., 11, 202 (1993); Miller,et al.,FASEB J., 9, 190 (1995)〕などを使用することができる。
【０１５５】
上記リガンド−ＤＮＡ複合体法には、例えば肝細胞が発現するアシアロ糖蛋白レセプターをターゲットとしてアシアロ糖蛋白をリガンドとして用いる方法〔Wu, et al.,J.Biol.Chem., 266, 14338 (1991); Ferkol,et al.,FASEB J., 7, 1081-1091 (1993)〕や、腫瘍細胞が強く発現しているトランスフェリン・レセプターを標的としてトランスフェリンをリガンドとして用いる方法〔Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 87, 3410 (1990)〕などが含まれる。
【０１５６】
また本発明で用いられる遺伝子導入法は、上記の如き各種の生物学的および物理学的な遺伝子導入法を適宜組合せたものであってもよい。該組合せによる方法としては、例えばあるサイズのプラスミドＤＮＡをアデノウイルス・ヘキソン蛋白質に特異的なポリリジン抱合抗体と組合わせる方法を例示できる。該方法によれば、得られる複合体がアデノウイルスベクターに結合し、かくして得られる三分子複合体を細胞に感染させることにより本発明アンチセンス・ヌクレオチドの導入を行い得る。この方法では、アデノアイルスベクターにカップリングしたＤＮＡが損傷される前に、効率的な結合、内在化およびエンドソーム分解が可能となる。また、前記リポソーム／ＤＮＡ複合体は、直接インビボにて遺伝子導入を媒介できる。
【０１５７】
以下、具体的な本発明のアンチセンス・ヌクレオチド導入用ウイルスベクターの作成法並びに標的細胞または標的組織へのアンチセンス・ヌクレオチド導入法について述べる。
【０１５８】
レトロウイルスベクター・システムは、ウイルスベクターとヘルパー細胞（パッケージング細胞）からなっている。ここでヘルパー細胞は、レトロウイルスの構造蛋白質ｇａｇ（ウイルス粒子内の構造蛋白質）、ｐｏｌ（逆転写酵素）、ｅｎｖ（外被蛋白質）などの遺伝子を予め発現しているが、ウイルス粒子を生成していない細胞を言う。一方、ウイルスベクターは、パッケージングシグナルやＬＴＲ(long terminal repeats)を有しているが、ウイルス複製に必要なｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖなどの構造遺伝子を持っていない。パッケージングシグナルはウイルス粒子のアセンブリーの際にタグとなる配列で、選択遺伝子（ｎｅｏ，ｈｙｇ）とクローニングサイトに組込まれた所望の導入アンチセンス・ヌクレオチド（ＧＡＳＣ１遺伝子に対応する全アンチセンス・ヌクレオチドまたはその断片）がウイルス遺伝子の代りに挿入される。ここで高力価のウイルス粒子を得るにはインサートを可能な限り短くし、パッケージングシグナルをｇａｇ遺伝子の一部を含め広くとることと、ｇａｇ遺伝子のＡＴＧを残さぬようにすることが重要である。
【０１５９】
所望のＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチドを組み込んだベクターＤＮＡをヘルパー細胞に移入することによって、ヘルパー細胞が作っているウイルス構造蛋白質によりベクターゲノムＲＮＡがパッケージされてウイルス粒子が形成され、分泌される。組換えウイルスとしてのウイルス粒子は、標的細胞に感染した後、ウイルスゲノムＲＮＡから逆転写されたＤＮＡが細胞核に組み込まれ、ベクター内に挿入されたアンチセンス遺伝子が発現する。
【０１６０】
尚、所望の遺伝子の導入効率を上げる方法として、フイブロネクチンの細胞接着ドメインとヘパリン結合部位と接合セグメントとを含む断片を用いる方法〔Hanenberg,H.,et al.,Exp.Hemat., 23, 747 (1995)〕を採用することもできる。
【０１６１】
なお、上記レトロウイルスベクター・システムにおいて用いられるベクターとしては、例えばマウスの白血病ウイルスを起源とするレトロウイルス〔McLachlin, J.R., et al., Proc. Natl. Acad. Res. Molec. Biol., 38, 91-135 (1990)〕を例示することができる。
【０１６２】
アデノウイルスベクターを利用する方法につき詳述すれば、該アデノウイルスベクターの作成は、バークネル〔Berkner,K.L.,Curr.Topics Microbiol.Immunol., 158, 39-66 (1992)〕、瀬戸口康弘ら〔Setoguchi,Y.,et al., Blood, 84, 2946-2953 (1994)〕、鐘カ江裕美ら〔実験医学, 12, 28-34 (1994)〕およびケナーら〔Ketner,G.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA., 91, 6186-6190 (1994)〕の方法に準じて行うことができる。
【０１６３】
例えば、非増殖性アデノウイルスベクターを作成するには、まずアデノウイルスの初期遺伝子のＥ１および／またはＥ３遺伝子領域を除去する。次に、目的とする所望の外来遺伝子発現単位（目的とする導入アンチセンス・ヌクレオチド、即ち本発明ＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチド、そのアンチセンス・ヌクレオチドを転写するためのプロモーター、転写された遺伝子の安定性を賦与するポリＡから構成）およびアデノウイルスゲノムＤＮＡの一部を含むプラスミドベクターと、アデノウイルスゲノムを含むプラスミドとを、例えば２９３細胞に同時にトランスフェクションする。この２者間で相同性組換えを起こさせて、遺伝子発現単位とＥ１とを置換することにより、所望のＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチドを包含する本発明遺伝子治療用ベクターである非増殖性アデノウイルスベクターを作成することができる。また、コスミドベクターにアデノウイルスゲノムＤＮＡを組み込んで、末端蛋白質を付加した３’側アデノウイルスベクターを作成することもできる。更に組換えアデノウイルスベクターの作成には、ＹＡＣベクターも利用可能である。
【０１６４】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの製造につき概略すると、ＡＡＶはアデノウイルスの培養系に混入してくる小型のウイルスとして発見された。これには、ウイルス複製にヘルパーウイルスを必要とせず宿主細胞内で自律的に増殖するパルボウイルス属と、ヘルパーウイルスを必要とするディペンドウイルス属の存在が確認されている。該ＡＡＶは宿主域が広く、種々の細胞に感染するありふれたウイルスであり、ウイルスゲノムは大きさが４６８０塩基の線状一本鎖ＤＮＡからなり、その両端の１４５塩基がＩＴＲ(inverted terminal repeat)と呼ばれる特徴的な配列を持って存在している。このＩＴＲの部分が複製開始点となり、プライマーの役割をなす。更にウイルス粒子へのパッケージングや宿主細胞の染色体ＤＮＡへの組込みにも、該ＩＴＲが必須となる。また、ウイルス蛋白質に関しては、ゲノムの左半分が非構造蛋白質、即ち複製や転写をつかさどる調節蛋白質のＲｅｐをコードしている。
【０１６５】
組換えＡＡＶの作成は、ＡＡＶが染色体ＤＮＡに組み込まれる性質を利用して行うことができ、かくして所望の遺伝子導入用ベクターが作成できる。この方法は、より詳しくは、まず野生型ＡＡＶの５'と３'の両端のＩＴＲを残し、その間に所望の導入用アンチセンス・ヌクレオチド（ＧＡＳＣ１ アンチセンス・ヌクレオチド）を挿入したプラスミド（ＡＡＶベクタープラスミド）を作成する。一方、ウイルス複製やウイルス粒子の形成に必要とされるウイルス蛋白質は、別のヘルパープラスミドにより供給させる。この両者の間には共通の塩基配列が存在しないようにし、遺伝子組換えによる野生型ウイルスが出現しないようにする必要がある。その後、両者のプラスミドを例えば２９３細胞へのトランスフェクションにより導入し、さらにヘルパーウイルスとしてアデノウイルス（２９３細胞を用いる場合は非増殖型のものでもよい）を感染させると、非増殖性の所望の組換えＡＡＶが産生される。続いて、この組換えＡＡＶは核内に存在するので、細胞を凍結融解して回収し、混入するアデノウイルスを５６℃加熱により失活させる。更に必要に応じて塩化セシウムを用いる超遠心法により組換えＡＡＶを分離濃縮する。上記のようにして所望の遺伝子導入用の組換えＡＡＶを得ることができる。
【０１６６】
ＥＢＶベクターの製造は、例えば清水らの方法に準じて行うことができる〔清水則夫ら、細胞工学, 14(3), 280-287 (1995)〕。
【０１６７】
本発明のアンチセンス・ヌクレオチド導入用ＥＢＶベクターの製造につき概略すると、ＥＢウイルス（Epstein-Barr virus: EBV）は、1964年にエプスタイン(Epstein)らによりバーキット（Burkitt）リンパ腫由来の培養細胞より分離されたヘルペス科に属するウイルスである〔Kieff, E. and Liebowitz, D.: Virology, 2nd ed. Raven Press, New York, 1990, pp.1889-1920〕。該ＥＢＶには細胞をトランスフォームする活性があるので、遺伝子導入用ベクターとするためには、このトランスフォーム活性を欠いたウイルスを調製しなければならない。これは次の如くして実施できる。
【０１６８】
即ち、まず、所望の外来遺伝子を組み込む標的ＤＮＡ近傍のＥＢＶゲノムをクローニングする。そこに外来遺伝子のＤＮＡ断片と薬剤耐性遺伝子を組込み、組換えウイルス作製用ベクターとする。次いで適当な制限酵素により切り出された組換えウイルス作製用ベクターをＥＢＶ陽性Ａｋａｔａ細胞にトランスフェクトする。相同組換えにより生じた組換えウイルスは抗表面免疫グロブリン処理によるウイルス産生刺激により野生型ＡｋａｔａＥＢＶとともに回収できる。これをＥＢＶ陰性Ａｋａｔａ細胞に感染し、薬剤存在下で耐性株を選択することにより、野生型ＥＢＶが共存しない所望の組換えウイルスのみが感染したＡｋａｔａ細胞を得ることができる。さらに組換えウイルス感染Ａｋａｔａ細胞にウイルス活性を誘導することにより、目的とする大量の組換えウイルスベクターを産生することができる。
【０１６９】
組換えウイルスベクターを用いることなく所望のアンチセンス・ヌクレオチドを標的細胞に導入する、非ウイルスベクターの製造は、例えば膜融合リポソームによる遺伝子導入法により実施することができる。これは膜リポソーム（脂質二重膜からなる小胞）に細胞膜への融合活性をもたせることにより、リポソームの内容物を直接細胞内に導入する方法である。
【０１７０】
上記膜融合リポソームによるアンチセンス・ヌクレオチドの導入は、例えば中西らの方法によって行うことができる〔Nakanishi,M.,et al.,Exp.Cell Res., 159, 399-499 (1985); Nakanishi,M.,et al.,Gene introduction into animal tissues.In Trends and Future Perspectives in Peptide and Protein Drug Delivery (ed. by Lee, V.H. et al.)., Harwood Academic Publishers Gmbh. Amsterdam, 1995, pp.337-349〕。
【０１７１】
以下、該膜融合リポソームによるアンチセンス・ヌクレオチドの導入法につき概略する。即ち、紫外線で遺伝子を不活性化したセンダイウイルスと所望のアンチセンス・ヌクレオチドや発現蛋白質などの高分子物質を封入したリポソームを３７℃で融合させる。この膜融合リポソームは、内側にリポソーム由来の空洞を、外側にウイルス・エンベロープと同じスパイクがある疑似ウイルスともよばれる構造を有している。更にショ糖密度勾配遠心法で精製後、標的とする培養細胞または組織細胞に対して膜融合リポソームを４℃で吸着させる。次いで３７℃にするとリポソームの内容物が細胞に導入され、所望のアンチセンス・ヌクレオチドを標的細胞に導入できる。ここでリポソームとして用いられる脂質としては、５０％(モル比）コレステロールとレシチンおよび陰電荷をもつ合成リン脂質で、直径３００ｎｍの１枚膜リポソームを作製して使用するのが好ましい。
【０１７２】
また、別のリポソームを用いてアンチセンス・ヌクレオチドを標的細胞に導入する方法としては、カチオニック・リポソームによるアンチセンス・ヌクレオチド導入法を挙げることができる。該方法は、八木らの方法に準じて実施できる〔Yagi,K.,et al.,B.B.R.C., 196, 1042-1048 (1993)〕。この方法は、プラスミドも細胞も負に荷電していることに着目して、リポソーム膜の内外両面に正の電荷を与え、静電気によりプラスミドの取り込みを増加させ、細胞との相互作用を高めようとするものである。ここで用いられるリポソームは正荷電を有する多重膜の大きなリポソーム（multilamellar large vesicles: ＭＬＶ）が有用であるが、大きな１枚膜リポソーム（large unilamellar vesicles: ＬＵＶ）や小さな１枚膜リポソーム（small unilamellar vesicles: ＳＵＶ）を使用してプラスミドとの複合体を作製し、所望のアンチセンス・ヌクレオチドを導入することも可能である。
【０１７３】
プラスミド包埋カチオニックＭＬＶの調製法について概略すると、これはまず脂質ＴＭＡＧ（N-(α-trimethylammonioacetyl)-didodecyl-D-glutamate chloride）、ＤＬＰＣ（dilauroyl phosphatidylcholine）およびＤＯＰＥ（dioleoyl phosphatidylethanolamine）をモル比が１：２：２となる割合で含むクロロホルム溶液（脂質濃度として１ｍＭ）を調製する。次いで総量１μmolの脂質をスピッツ型試験管に入れ、ロータリーエバポレーターでクロロホルムを減圧除去して脂質薄膜を調製する。更に減圧下にクロロホルムを完全に除去し、乾燥させる。次いで２０μgの遺伝子導入用プラスミドを含む０．５mlのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩液−Ｍｇ，Ｃａ含有を添加し、窒素ガス置換後、２分間ボルテックスミキサーにより攪袢して、所望のアンチセンス・ヌクレオチドを含有するプラスミド包埋カチオニックＭＬＶ懸濁液を得ることができる。
【０１７４】
上記で得られたプラスミド包埋カチオニックＭＬＶを遺伝子治療剤として使用する一例としては、例えば発現目的アンチセンス・ヌクレオチドを組み込んだ発現プラスミドを上記カチオニックＭＬＶにＤＮＡ量として０．６μg、リポソーム脂質量として３０nmolになるように包埋し、これを２μlのリン酸緩衝生理食塩液に懸濁させて患者より抽出した標的細胞または患者組織に対して隔日投与する方法が例示できる。
【０１７５】
ところで、遺伝子治療とは「疾病の治療を目的として、遺伝子または遺伝子を導入した細胞をヒトの体内に投与すること」と厚生省ガイドラインに定義されている。しかしながら、本発明における遺伝子治療とは、該ガイドラインの定義に加えて、前記した標的細胞にＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチドを癌抑制アンチセンスＤＮＡとして導入することによって、癌を始めとする各種疾患の治療のみならず、更に標識となる遺伝子または標識となる遺伝子を導入した細胞をヒト体内に導入することも含むものとする。
【０１７６】
本発明の遺伝子治療において、所望遺伝子の標的細胞または標的組織への導入方法には、代表的には２種類の方法が含まれる。
【０１７７】
その第１法は、治療対象とする患者から標的細胞を採取した後、該細胞を体外で例えばインターロイキン−２(ＩＬ−２)などの添加の下で培養し、レトロウイルスベクターに含まれる目的とするＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチドを導入した後、得られる細胞を再移植する手法(ex vivo法)である。該方法はＡＤＡ欠損症を始め、欠陥遺伝子によって発生する遺伝子病や癌、ＡＩＤＳなどの治療に好適である。
【０１７８】
第２法は、目的アンチセンス・ヌクレオチド（ＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチド）を直接患者の体内や腫瘍組織などの標的部位に注入する遺伝子直接導入法(直接法)である。
【０１７９】
上記遺伝子治療の第１法は、より詳しくは、例えば次のようにして実施される。即ち、患者から採取した単核細胞を血液分離装置を用いて単球から分取し、分取細胞をＩＬ−２の存在下にＡＩＭ−Ｖ培地などの適当な培地で７２時間程度培養し、導入すべきアンチセンス・ヌクレオチド（ＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチド）を含有するベクターを加える。アンチセンス・ヌクレオチドの導入効率をあげるために、プロタミン存在下に３２℃で１時間、２５００回転にて遠心分離した後、３７℃で１０％炭酸ガス条件下で２４時間培養してもよい。この操作を数回繰り返した後、更にＩＬ−２存在下にＡＩＭ−Ｖ培地などで４８時間培養し、細胞を生理食塩水で洗浄し、生細胞数を算定し、アンチセンス・ヌクレオチド導入効率を前記in situ ＰＣＲや、例えば所望の対象が酵素活性であればその活性の程度を測定することにより、目的アンチセンス・ヌクレオチド導入効果を確認する。
【０１８０】
また、培養細胞中の細菌・真菌培養、マイコプラズマの感染の有無、エンドトキシンの検索などの安全度のチェックを行い、安全性を確認した後、予測される効果用量のアンチセンス・ヌクレオチド（ＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチド）が導入された培養細胞を患者に点滴静注により戻す。かかる方法を例えば数週間から数カ月間隔で繰り返することにより遺伝子治療が施される。
【０１８１】
ここでウイルスベクターの投与量は、導入する標的細胞により適宜選択される。通常、ウイルス価として、例えば標的細胞 １×１０⁸細胞に対して１×１０³ｃｆｕから１×１０⁸ｃｆｕの範囲となる投与量を採用することが好ましい。
【０１８２】
上記第１法の別法として、目的アンチセンス・ヌクレオチド（ＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチド）を含有するレトロウイルスベクターを含有するウイルス産生細胞と例えば患者の細胞とを共培養して、目的とする細胞へアンチセンス・ヌクレオチド（ＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチド）を導入する方法を採用することもできる。
【０１８３】
遺伝子治療の第２法（直接法）の実施に当たっては、特に体外における予備実験によって、遺伝子導入法によって、実際に目的アンチセンス・ヌクレオチド（ＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチド）が導入されるか否かを、予めベクター遺伝子ｃＤＮＡのＰＣＲ法による検索やin situＰＣＲ法によって確認するか、或いは目的アンチセンス・ヌクレオチド（ＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチド）の導入に基づく所望の治療効果である特異的活性の上昇や標的細胞の増殖増加や増殖抑制などを確認することが望ましい。また、ウイルスベクターを用いる場合は、増殖性レトロウイルスなどの検索をＰＣＲ法で行うか、逆転写酵素活性を測定するか、或は膜蛋白(env)遺伝子をＰＣＲ法でモニターするなどにより、遺伝子治療に際してアンチセンス・ヌクレオチド導入による安全性を確認することが重要であることはいうまでもない。
【０１８４】
本発明遺伝子治療法において、特に癌や悪性腫瘍を対象とする場合は、患者から癌細胞を採取後、酵素処理などを施して培養細胞を樹立した後、例えばレトロウイルスにて所望のアンチセンス・ヌクレオチドを標的とする癌細胞に導入し、Ｇ４１８細胞にてスクリーニングした後、ＩＬ−１２などの発現量を測定(in vivo測定)し、次いで放射線処理を施行し、患者腫瘍内または傍腫瘍に接種する癌治療法を一例として挙げることができる。
【０１８５】
本発明はまた、本発明のアンチセンス・ヌクレオチド導入用ベクターまたは目的アンチセンス・ヌクレオチド（ＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチド）が導入された細胞を活性成分とし、それを薬学的有効量、適当な無毒性医薬担体ないしは希釈剤と共に含有する医薬組成物または医薬製剤（遺伝子治療剤）を提供する。
【０１８６】
本発明の医薬組成物（医薬製剤）に利用できる医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤ないし賦形剤などを例示でき、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用できる。
【０１８７】
本発明医薬製剤の投与単位形態としては、前記したＧＡＳＣ１蛋白質抗体製剤の製剤例を同様に挙げることができ、治療目的に応じて各種の形態から適宜選択することができる。
【０１８８】
例えば、本発明のアンチセンス・ヌクレオチド導入用ベクターを含む医薬製剤は、該ベクターをリポソームに包埋された形態あるいは所望のアンチセンス・ヌクレオチドが包含されるレトロウイルスベクターを含むウイルスによって感染された培養細胞の形態に調製される。
【０１８９】
これらは、リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４）、リンゲル液、細胞内組成液用注射剤中に配合した形態などに調製することもでき、またプロタミンなどの遺伝子導入効率を高める物質と共に投与されるような形態に調製することもできる。
【０１９０】
上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。
【０１９１】
上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。
【０１９２】
一般には、医薬製剤としての所望アンチセンス・ヌクレオチド含有レトロウイルスベクターの投与量は、１日当り体重１ｋｇ当り、例えばレトロウイルスの力価として約１×１０³ｐｆｕから１×１０¹⁵ｐｆｕ程度とするのがよい。
【０１９３】
また所望の導入用アンチセンス・ヌクレオチドが導入された細胞の場合は、１×１０⁴細胞／bodyから１×１０¹⁵細胞／body程度の範囲から選ばれるのが適当である。
【０１９４】
該製剤は１日に１回または数回に分けて投与することもでき、１から数週間間隔で間欠的に投与することもできる。尚、好ましくは、プロタミンなど遺伝子導入効率を高める物質またはこれを含む製剤と併用投与することができる。
【０１９５】
本発明に従う遺伝子治療を癌の治療に適用する場合は、前記した種々の遺伝子治療を適宜組合わせて行う（結合遺伝子治療）こともでき、前記した遺伝子治療に、従来の癌化学療法、放射線療法、免疫療法などを組合わせて行うこともできる。さらに本発明遺伝子治療は、その安全性を含めて、ＮＩＨのガイドラインを参考にして実施することができる〔Recombinant DNA Advisory Committee, Human Gene Therapy, 4, 365-389 (1993)〕。
【０１９６】
本発明によれば、細胞の腫瘍形成を促すＧＡＳＣ１遺伝子の存在を検出するために、血液または血清のごとき生物学的試料を調製し、所望により核酸を抽出し、ＧＡＳＣ１の感受性遺伝子が存在する否かについて分析することが可能である。また、本発明によれば細胞または組織における新生物、悪性の前駆障害への進行、または予後指標としての存在を検出するためには、障害を有する生物学的な試料を調製し、ＧＡＳＣ１の新生物遺伝子が存在するか否かについて分析できる。この方法を用いることにより細胞または組織における新生物、悪性の前駆障害への進行、または予後指標としての存在を検出することが可能となり、これらの診断、例えば癌の診断並びに癌治療効果の判定並びに予後の予測が可能となる。
【０１９７】
該検出方法は、例えば、予め腫瘍を有する患者サンプルから得られたＧＡＳＣ１遺伝子に関する情報を基に、該ＤＮＡ断片を作成し、ＧＡＳＣ１遺伝子のスクリーニングおよび／またはその増幅に用いられるように設計される。より具体的には、例えばプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、サザンブロット法、ノーザンブロット法などにおけるプローブとしての性質を有するもの、核酸配列をポリメラーゼで増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、増幅したＧＡＳＣ１の全部または一部のＤＮＡ断片を得ることができるためのプローブとしての性質を有するものを作成できる。そのためにはまずＧＡＳＣ１と同じ配列を持つプライマーを作成し、スクリーニング用プローブとして用い、生物学的試料（核酸試料）と反応させることにより、当該ＧＡＳＣ１配列を有する遺伝子の存在を確認することができる。該核酸試料は、標的配列の検出を容易にする種々の方法、例えば変性、制限消化、電気泳動またはドットブロッティングで調製してもよい。
【０１９８】
前記スクリーニング方法としては、特にＰＣＲ法を用いるのが感度の点から好ましく、該方法は、ＧＡＳＣ１断片をプライマーとして用いる方法であれば特に制限されず、従来公知の方法(Science, 230, 1350-1354(1985))や新たに開発された、或いは将来使用されるＰＣＲ変法(榊 佳之、ほか編、羊土社、実験医学、増刊, 8(9)(1990); 蛋白質・核酸・酵素、臨時増刊、共立出版(株), 35(17)(1990))のいずれも利用することが可能である。
【０１９９】
プライマーとして使用されるＤＮＡ断片は、化学合成したオリゴＤＮＡであり、これらオリゴＤＮＡの合成は自動ＤＮＡ合成装置など、例えばＤＮＡ合成装置(PharmaciaLKB Gene Assembler Plus: ファルマシア社製)を使用して合成することができる。合成されるプライマー(センスプライマーまたはアンチセンスプライマー)の長さは約１０〜３０ヌクレオチド程度が好ましく例示できる。上記スクリーニングに用いられるプローブは、通常は標識したプローブを用いるが、非標識であってもよく、直接的または間接的に標識したリガンドとの特異的結合によって検出してもよい。適当な標識、並びにプローブおよびリガンドを標識する方法は、本発明の技術分野で知られており、ニック・トランスレーション、ランダム・プライミングまたはキナーゼ処理のような、既知の方法によって取り込ませることができる放射性標識、ビオチン、蛍光性基、化学発光基、酵素、抗体などがこれらの技術に包含される。
【０２００】
検出のために用いるＰＣＲ法としては、例えばＲＴ−ＰＣＲ法が例示されるが、当該分野で用いられる種々の変法を適応することができる。
【０２０１】
また、本発明の測定方法は、試料中のＧＡＳＣ１遺伝子の検出のための試薬キットを利用することによって、簡便に実施することができる。
【０２０２】
故に本発明によれば上記ＧＡＳＣ１ ＤＮＡ断片を含有することを特徴とするＧＡＳＣ１の検出用試薬キットが提供される。
【０２０３】
該試薬キットは、少なくとも配列番号：２に示される塩基配列もしくはその相補的塩基配列の一部または全てにハイブリダイズするＤＮＡ断片を必須構成成分として含んでいれば、他の成分として、標識剤、ＰＣＲ法に必須な試薬（例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸、プライマーなど）が含まれていてもよい。
【０２０４】
標識剤としては、放射性同位元素または蛍光物質などの化学修飾物質などが挙げられるが、ＤＮＡ断片自身が予め該標識剤でコンジュゲートされていてもよい。更に当該試薬キットには、測定の実施の便益のために適当な反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤、反応停止液などが含まれていてもよい。
【０２０５】
更に本発明は、前記測定方法を用いる癌の診断方法および該方法に用いる診断剤並びに診断用キットをも提供するものである。
【０２０６】
また、前記方法を用いることにより、被検試料中から得られたＧＡＳＣ１配列を直接的若しくは間接的に配列決定することにより、野生型ＧＡＳＣ１と相同性の高い相同物である新たなＧＡＳＣ１遺伝子に関連する関連遺伝子を見出すことができる。
【０２０７】
従って、本発明はかかる測定と被検試料中のＧＡＳＣ１ ＤＮＡの配列決定により、被検試料中のヒトＧＡＳＣ１遺伝子に関連する関連遺伝子のスクリーニング方法をも提供するものである。
【０２０８】
また、本発明の配列番号：１で示されるヒトＧＡＳＣ１遺伝子でコードされる蛋白質または該配列番号：１において、１もしくは数個乃至複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列またはこれらの断片から蛋白質を合成し、もしくは該蛋白質に対する抗体を合成することによって、野生型ＧＡＳＣ１および／または変異ＧＡＳＣ１の測定が可能となる。
【０２０９】
従って、本発明は、野生型ＧＡＳＣ１および／または変異ＧＡＳＣ１の抗体測定法、抗原測定法を提供するものである。該測定法によって新生物状態の障害の程度、或いは悪性腫瘍の悪性度を野生型ＧＡＳＣ１ポリペプチドの変化に基づいて検出することも可能である。かかる変化は、この分野における前記慣用技術によるＧＡＳＣ１配列分析によっても決定できるが、更に好ましくは、抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル抗体)を用いて、ＧＡＳＣ１蛋白質中の相違、またはＧＡＳＣ１蛋白質の有無を検出することができる。本発明の測定法の具体的な例示としては、ＧＡＳＣ１抗体は、血液・血清などのヒトより採取した生体材料試料含有溶液からＧＡＳＣ１蛋白質を免疫沈降し、かつポリアクリルアミドゲルのウェスタン・ブロットまたはイムノブロット上でＧＡＳＣ１蛋白質と反応することができる。また、ＧＡＳＣ１抗体は免疫組織化学的技術を用いてパラフィンまたは凍結組織切片中のＧＡＳＣ１蛋白質を検出することができる。抗体産生技術および精製する技術は当該分野においてよく知られているので、これらの技術を適宜選択することができる。
【０２１０】
野生型ＧＡＳＣ１またはその突然変異体を検出する方法に関連するより好ましい具体例には、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を用いるサンドイッチ法を含む、酵素結合イムノソルベントアッセイ(ＥＬＩＳＡ)、放射線免疫検定法(ＲＩＡ)、免疫放射線検定法(ＩＲＭＡ)および免疫酵素法(ＩＥＭＡ)が含まれる。
【０２１１】
また、本発明は、ＧＡＳＣ１蛋白に対するＧＡＳＣ１結合活性を有する細胞膜画分または細胞表面上に存在するＧＡＳＣ１レセプターをも提供することが可能である。該ＧＡＳＣ１レセプターの取得は、細胞膜画分を含む生体材料試料中において標識したＧＡＳＣ１蛋白をコンジュゲートさせ、ＧＡＳＣ１結合反応物を抽出・単離、精製し、単離物のアミノ酸配列を特定することによって達成され、該ＧＡＳＣ１レセプター蛋白の取得並びに配列決定は、この分野の当業者には容易に達成できる。
【０２１２】
また本発明は、ＧＡＳＣ１レセプター蛋白質またはその結合断片を種々の薬剤のいずれかをスクリーニングする技術に用いることによって、化合物(ＧＡＳＣ１レセプター反応物：化合物は低分子化合物、高分子化合物、蛋白質、蛋白質部分断片、抗原または抗体など言う)をスクリーニングすることに利用可能である。好ましくは、ＧＡＳＣ１レセプターを利用する。かかるスクリーニング試験に用いるＧＡＳＣ１レセプターポリペプチドまたはその断片は、固体支持体に付着するか、または細胞表面に運ばれている溶液中の遊離物であってもよい。
【０２１３】
薬剤スクリーニングの一例としては、例えば、ＧＡＳＣ１蛋白質またはその断片を発現する組換え蛋白質で安定して形質転換した原核生物または真核生物の宿主細胞を、好ましくは競合的結合アッセイにおいて利用することができる。また遊離のまたは固定した形態のかかる細胞を標準結合アッセイに用いることもできる。より具体的には、ＧＡＳＣ１レセプター蛋白質またはその断片と、試験する物質との間の複合体の形成を測定し、ＧＡＳＣ１レセプター蛋白質またはその断片とＧＡＳＣ１蛋白質またはその断片との間の複合体の形成が試験する物質によって阻害される程度を検出することによって化合物をスクリーニングすることが可能である。
【０２１４】
かくして、本発明は、当該分野で既知の方法によって、かかる物質とＧＡＳＣ１レセプター蛋白質またはその断片とを接触させ、次いで、該物質とＧＡＳＣ１レセプター蛋白質またはその断片との間の複合体の存在またはＧＡＳＣ１レセプター蛋白質またはその断片とリガンドとの間の複合体の存在について測定することを特徴とする薬剤のスクリーニング方法を提供することができる。さらに、ＧＡＳＣ１レセプター活性を測定して、かかる物質がＧＡＳＣ１レセプターを阻害でき、かくして上記定義されたＧＡＳＣ１の活性、例えば細胞増殖や分化を調節する蛋白質と結合したり、解離したりすることで、結合蛋白の血中並びに組織中の濃度や移行を調節したり、活性そのものを調節できるかどうか判断する。かかる競合結合アッセイにおいて、より具体的には、ＧＡＳＣ１レセプター蛋白質またはその断片を標識する。遊離のＧＡＳＣ１レセプター蛋白質またはその断片を、蛋白質：蛋白質複合体で存在するものから分離し、遊離（複合体未形成）標識の量は、各々、試験される因子のＧＡＳＣ１レセプターに対する結合またはＧＡＳＣ１レセプター：ＧＡＳＣ１蛋白質結合の阻害の尺度となる。ＧＡＳＣ１蛋白質の小さなペプチド(ペプチド疑似体)をこのように分析し、ＧＡＳＣ１レセプター阻害活性を有するものを測定できる。
【０２１５】
本発明において、薬剤スクリーニングのための他の方法は、ＧＡＳＣ１レセプター蛋白質に対して適当な結合親和性を有する化合物についてのスクリーニング法であって、該略すると、多数の異なるペプチド試験化合物をプラスチックのピンまたは他の物質の表面のごとき固体支持体上で合成し、次いでペプチド試験化合物をＧＡＳＣ１レセプター蛋白質と反応させ、洗浄する。次いで既知の方法を用いて反応結合ＧＡＳＣ１レセプター蛋白質を検出する方法も例示できる（ＰＣＴ特許公開番号：ＷＯ８４−０３５６４号）。精製されたＧＡＳＣ１レセプターは、直接、前記の薬剤スクリーニング技術で使用するプレート上に被覆することができる。しかしながら、ポリペプチドに対する非−中和抗体を用いて抗体を補足し、ＧＡＳＣ１レセプター蛋白質を固相上に固定することができる。さらに本発明は、競合薬剤スクリーニングアッセイの使用をも目的とし、ＧＡＳＣ１レセプター蛋白質またはその断片に対する結合性につき、ＧＡＳＣ１レセプター蛋白質に特異的に結合できる中和抗体と試験化合物とを競合させる。抗体による該競合によって、ＧＡＳＣ１レセプター蛋白質の１またはそれ以上の抗原決定部位を有するいずれのペプチドの存在をも検出することが可能である。
【０２１６】
また、薬剤スクリーニングに関し、さらなる方法としては、非機能性ＧＡＳＣ１遺伝子を含有する宿主真核細胞系または細胞の使用が挙げられる。宿主細胞系または細胞を薬剤化合物の存在下において一定期間増殖させた後、該宿主細胞の増殖速度を測定して、該化合物が例えば、細胞増殖や分化を調節する蛋白質と結合したり、解離したりすることで、結合蛋白の血中並びに組織中の濃度や移行を調節したり、活性そのものを調節できるかどうかを確認する。増殖速度を測定する１手段として、ＧＡＳＣ１レセプターの生物活性を測定することも可能である。
【０２１７】
また本発明によれば、より活性または安定した形態のＧＡＳＣ１蛋白質誘導体または例えば、イン・ビボ(in vivo)でＧＡＳＣ１蛋白質の機能を高めるかもしくは妨害する薬剤を開発するために、それらが相互作用する目的の生物学的に活性な蛋白質または構造アナログ、例えばＧＡＳＣ１アゴニスト、ＧＡＳＣ１アンタゴニスト、ＧＡＳＣ１インヒビターなどを作製することが可能である。前記構造アナログは例えばＧＡＳＣ１と他の蛋白質の複合体の三次元構造をＸ線結晶学、コンピューター・モデリングまたはこれらの組み合わせた方法によって決定することができる。また、構造アナログの構造に関する情報は、相同性蛋白質の構造に基づく蛋白質のモデリングによって得ることも可能である。
【０２１８】
また上記より活性または安定した形態のＧＡＳＣ１蛋白質誘導体を得る方法としては、例えばアラニン・スキャンによって分析することが可能である。該方法はアミノ酸残基をアラニンで置換し、ペプチドの活性に対するその影響を測定する方法でペプチドの各アミノ酸残基をこのように分析し、当該ペプチドの活性や安定性に重要な領域を決定する方法である。該方法によって、より活性なまたは安定なＧＡＳＣ１誘導体を設計することができる。
【０２１９】
また機能性アッセイによって選択した標的−特異的抗体を単離し、次いでその結晶構造を解析することも可能である。原則として、このアプローチにより、続く薬剤の設計の基本となるファーマコア(pharmacore)を得る。機能性の薬理学的に活性な抗体に対する抗−イディオタイプ抗体を生成させることによって、化学的または生物学的に生成したペプチドのバンクよりペプチドを同定したり単離したりすることが可能である。故に選択されたペプチドもファーマコアとして作用すると予測される。
【０２２０】
かくして、改善されたＧＡＳＣ１活性もしくは安定性またはＧＡＳＣ１活性のインヒビター、アゴニスト、アンタゴニストなどとしての作用を有する薬剤を設計・開発することができる。
【０２２１】
クローン化ＧＡＳＣ１配列によって、十分な量のＧＡＳＣ１蛋白質を入手して、Ｘ線結晶学のような分析研究をも行うことができる。さらに、本発明の配列番号：１に示されるアミノ酸配列よりなるＧＡＳＣ１蛋白質の提供により、Ｘ線結晶学に代えるかまたはこれに加えて、コンピューターモデリング技術に適応可能である。
【０２２２】
また本発明によれば、ＧＡＳＣ１遺伝子含有ノックアウト・マウス(変異マウス)を作成することによってＧＡＳＣ１遺伝子配列のどの部位が生体内で上記したような多様なＧＡＳＣ１活性に影響を与えるかどうか、即ちＧＡＳＣ１遺伝子産物、並びに改変ＧＡＳＣ１遺伝子産物が生体内でどのような機能を有するかを確認することができる。
【０２２３】
該方法は、遺伝子の相同組換えを利用して、生物の遺伝情報を意図的に修飾する技術であり、マウスの胚性幹細胞(ＥＳ細胞)を用いた方法を例示できる（Capeccchi, M. R., Science, 244, 1288-1292 (1989))。
【０２２４】
尚、上記変異マウスの作製方法はこの分野の当業者にとって既に通常の技術であり、この改変技術(野田哲生編、実験医学,増刊, 14 (20) (1996)、羊土社)に、本発明のヒト野生型ＧＡＳＣ１遺伝子および変異ＧＡＳＣ１遺伝子を適応して容易に変異マウスを作製し得る。従って前記技術の適応により、改善されたＧＡＳＣ１活性もしくは安定性またはＧＡＳＣ１活性のインヒビター、アゴニスト、アンタゴニストなどとしての作用を有する薬剤を設計・開発することができる。
【０２２５】
【発明の効果】
本発明によれば、各細胞での細胞の増殖、分化、腫瘍形成、転写活性化を調節する作用を有する新規なＧＡＳＣ１遺伝子が提供され、該作用に関与する疾患、例えば悪性腫瘍などの病態解明や診断、治療などが可能である。
【０２２６】
本発明遺伝子がコードするアミノ酸配列のペプチドのＣ末端側には、公知の癌遺伝子がコードしている２つのＰＨＤフィンガー・モチーフおよび１つのＰＸドメインが存在しており、また本発明遺伝子が位置している染色体９ｐ２３−２４の増幅は多くの癌において観察されているため、本発明遺伝子乃至その関連遺伝子の解析によれば、それらの機能と各種疾患との係わりについての研究を実施でき、これら各種疾患の遺伝子診断並びに該遺伝子の発現産物に対する抗体やアンチセンスによる医薬用途への応用研究が可能である。本発明遺伝子の利用によれば、各種組織での該遺伝子の発現状況が調べられ、生体内におけるその機能を解析することが可能となる。
【０２２７】
また、該遺伝子によれば、該遺伝子がコードする蛋白質を遺伝子工学的に大量に製造することができ、該蛋白質の提供によれば、ＧＡＳＣ１蛋白質活性やＧＡＳＣ１蛋白質の結合活性などの機能を調べることもできる。
【０２２８】
またＧＡＳＣ１蛋白質は、ＧＡＳＣ１遺伝子およびその産物が関与する疾患（例えば、細胞の増殖、分化、腫瘍形成、転写活性化を調節する作用に関連する各種疾患など、特に癌）の病態解明や診断、治療などに有用である。
【０２２９】
本発明によれば、更にＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチドを含有する遺伝子治療に有用な遺伝子導入用ベクター、該ＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチドを導入された細胞および該ベクターまたは細胞を有効成分とする遺伝子治療剤、並びにその利用による遺伝子治療法などが提供される。
【０２３０】
本発明によれば、更に各種癌細胞の成長抑制作用を有し、該作用による各種癌の疾患および病態の処置などに使用されるＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチドまたはＧＡＳＣ１蛋白質に結合性を有する抗体を有効成分とする医薬も提供できる。
【０２３１】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。
【０２３２】
【実施例１】
１．材料および方法
１）食道扁平上皮癌細胞株と分裂中期スライドの作成
試験に用いた２９の食道扁平上皮癌細胞株(KYSEシリーズ)は、外科的に切除した腫瘍から確立されたものである(Shimada,Y.,et al., Cancer, 69, 277-284 (1992))。これらの細胞株の全てのコピー数異常は、先に本発明者らによって確認されている。分裂中期のクロモゾーム・スライドは、シノミヤらの方法(Shinomiya,T.,et al., Genes Chromosomes Cancer, 24, 337-344 (1999))に順じて作製し、ＦＩＳＨ試験に用いた。
２）プローブとしてＹＡＣとＰＡＣを使用するＦＩＳＨ試験
ＹＡＣの所定領域内の位置は、ホワイトヘッド研究所/ＭＩＴゲノム・センター(Whitehead Institute/MIT Genome Center)(http://www-genome.Wi.Mit.Edu/)およびヒト分子細胞遺伝学財団(Resources for Human Molecular Cytogenetics) (http://bioserver.uniba.it/fish/rocchi/welcom.html)の情報から集めた。
【０２３３】
ヒト９ｐ２３−２４領域をカバーする複数のＹＡＣクローンを、セントレ・エツデ・ドゥ・ポリモルフィズム・ヒューメイン（the Centre d'Etude du Polymorphisme Humain：ＣＥＰＨ)のＹＡＣライブラリーから単離し、そのＦＩＳＨプローブを前記シノミヤらの方法に順じて、Ａｌｕ配列を用いたＰＣＲにより調製した。
【０２３４】
このＰＣＲは次の通り実施した。即ち、ＹＡＣ ＤＮＡ１μｇ（１μｌ）、配列番号：４に示す塩基配列のプライマー２４８４（３０μＭ）１μｌ、配列番号：５に示す塩基配列のプライマーＰＤＪ３４（１０μＭ）１μｌ、１０×ＰＣＲバッファー（ExTaq buffer,タカラ社製）１０μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（タカラ社製）５μｌ、ＥｘＴａｑポリメラーゼ０．５μｌおよび水８１．５μｌの計１００μｌを混合し、９５℃−４分間（最初の変性処理１回）に続いて、９５℃−４分、５５℃−１分及び７２℃−４分を１サイクルとして計３０サイクル反応させ、最後に７２℃−７分（１回）の処理を行なった。上記全反応は、パーキンエルマー社製GeneAmp PCRシステム9700を用いて実施した。
【０２３５】
９ｐ２４領域にマップされた既知遺伝子、januaキナーゼ２(JAK2, GenBank Accession No.NM-004972)を含む一つのＰＡＣクローン（Peter Marynen博士より供与を受けた）をプローブとして使用した。
【０２３６】
上記プローブを、ビオチン１６−ｄＵＴＰまたはジゴキシン１１−ｄＵＴＰ(ベーリンガー・マインハイム社製)を用い、ニックトランスレーションによって、標識した。染色体のハイブリダゼーション・シグナルの蛍光検出は、前記シノミヤらの方法に順じて実施した。
【０２３７】
洗浄後、スライドは、ＣＣＤ(cooled charge-coupled device)カメラ(KAF1400;フォトメトリックス:Photometrics社製)を使用し、染色像と蛍光を同時にイメージ化した。
【０２３８】
ＤＮＡ配列のコピー数の相対的な変化を、ＩＰラボ・スペクトラム・ソフトウェア(IP Lab Spectrum Software:シグナル・アナリティクス・コーポレーション社製:Signal Analytics Corp.)を用いて分析した。必要な領域のコピー数は分裂中期および静止期の染色体の両者において観察されたハイブリダゼーション・パターンに従い評価した。 蛍光比が１．５を超えたとき、その染色体領域が高いレベルの増幅があると判定した。
【０２３９】
その結果、本発明者らの先のＣＧＨ分析において９ｐ上におけるコピー数の増加が検討した２９の食道扁平上皮癌細胞株のうち５つにおいて検出されている(17.2%)。更に、高レベルの増幅が、それらのうちの一つに現れていた。このＣＧＨの結果を基に、本発明者らは、９ｐ２３−２４のアンプリコンの遺伝子地図を作り出すために、プローブとして８つのＹＡＣおよび１つのＰＡＣを用いて、ＫＹＳＥ１５０においてＦＩＳＨ分析を実施した。
３）結果
その結果を図１にＡおよびＢとして示す。
【０２４０】
図１中、Ａは本発明遺伝子を含む９ｐ２３−２４領域の遺伝子地図であり、図中、"STSs(Genes/ESTs)"は、配列認識部位（遺伝子／発現配列タグ）を、"Tel"はテロメア側を、"Cen"はセントロメア側を、また"YACs/PAC"はＦＩＳＨに用いられた各プローブをそれぞれ示す。
【０２４１】
図１Ａにおいて、染色体を示す線上には、既知の遺伝子や括弧内に示した発現配列タグ（EST, Expression Sequence Tag）で表わされる未知の転写体が示されており、これらはサザンブロッティングにおいてプローブとして使用された。
【０２４２】
またＦＩＳＨに使用された複数のＹＡＣと一つのＰＡＣが、水平横線の黒と中抜き横線によってそれぞれ染色体を示す線の下に記述されている。横線内の丸印は、それぞれＹＡＣまたはＰＡＣ上のマーカーの定着点を指し示している。尚、この図は模式的に示したものであり、ＹＡＣおよびＰＡＣのサイズおよびマーカーの距離は実際のものを反映していない。
【０２４３】
図１のＢは、サザンブロット分析によって特定した５つの食道扁平上皮癌細胞株（図中、KYSE70、KYSE450、KYSE890、KYSE1170およびKYSE150と表示する）の各々における９ｐ２３アンプリコンを模式的に示す図である。図中、重複の最も小さい領域(SRO)は、サザンブロット分析の結果と共にＦＩＳＨによって特定された。
図中の記号は次のものを示す。
【０２４４】
図２は、上記一つの食道扁平上皮癌細胞ＫＹＳＥ１５０におけるＦＩＳＨ分析の典型的な結果を示す図面代用写真である。
【０２４５】
該図は、上からＰＡＣＰＪ２Ｂ、ＹＡＣ７９９Ｄ２およびＹＡＣ８３０Ｅ１クローンを用いてＦＩＳＨ法を行なって得られた結果を示しており、各写真中の蛍光の数がＤＮＡコピー数を表わしている。尚、写真に示される略号ＰＪ２Ｂ、７９９Ｄ２および８３０Ｅ１は、図１のＡに示されるそれと同じものを示す。
【０２４６】
該図２より、ＹＡＣ７９９Ｄ２は、２つのマーカー染色体上に均一領域(HSRs: Homogeneouslyh Staining Regions)として強度のシグナルを産生することが明らかであり、これは高度の増幅がＹＡＣ７９９Ｄ２の含まれる領域で生じていることを示している。尚、図には示していないが、同様にして行なった８０７Ｂ４の場合も、同じ結果が得られている。
【０２４７】
上記ＹＡＣ７９９Ｄ２の両側に存在するＹＡＣ９５３Ａ７、８７１Ｆ１、８５３Ｆ４および９３３Ｆ６（図１のＡ参照）でのＦＩＳＨシグナルの数は、４から９に及んでいたが、これらはＹＡＣ７９９Ｄ２や８０７Ｂ４と比べるとはるかに少ないものであった。またＰＡＣ ＰＪ２ＢおよびＹＡＣ８３０Ｅ１のシグナル数はわずか２から３であった。
【０２４８】
９ｐ２３−２４で増幅の最も小さな共通領域を特定するために、先のＣＧＨ分析において９ｐ上においてコピー数の上昇が認められた他の4つの細胞株(KYSE70、450、890および1170)でもＦＩＳＨ分析を実施した。
【０２４９】
その結果、ＫＹＳＥ８９０および１１７０では、ＹＡＣ７９９Ｄ２および８０７Ｂ４のハイブリダゼーションシグナルは、小さなＨＳＲパターンとして検出された。一方、ＫＹＳＥ７０および４５０では、シグナルの数が、６から９程度であった。しかし、これらの細胞株では、ＫＹＳＥ１５０において検出された増幅領域より広い領域が増幅していたため、ＫＹＳＥ１５０で決定されたアプリコンの大きさを狭めることはできなかった。
【０２５０】
このように、９ｐ２３−２４のアンプリコンにおける所望の遺伝子は、ＹＡＣ７９９Ｄ２および８０７Ｂ４によってカバーされた比較的狭い領域内にあると思われた。
２． サザンブロットおよびノーザンブロット分析ゲノム研究データーベースについてホワイトヘッド研究所から選択した９ｐ２３−２４領域の８つのＥＳＴクローン（(1)ＧＹＧ２、(2)ＧＬＤＣ、(3)ＩＭＡＧＥクローン１３１８６５(GenBank Accession No.Ｒ２４５４２：配列番号１０)、(4)ＳＬＣ１Ａ１、(5)ＣＳＮＫ１Ｇ２、(6)ＪＡＫ２、(7)ＩＭＡＧＥクローン６５０４９５(GenBank Accession No.ＡＡ２１９３６０)及び(8)ＩＭＡＧＥクローン３０３５４（GenBank Accession No.Ｒ１８５６７、上記(1)、(2)および(4)−(6)は既知遺伝子の一部であり、(3)、(7)および(8)は転写体の一部である）を、リサーチ・ジェネティクス社(Research Genetics)から購入し、サザンブロットおよびノーザンブロット分析のために、プローブとして使用した。
【０２５１】
腫瘍のＤＮＡは、標準方法(文献：Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Mannual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)によって培養した食道扁平上皮癌細胞株から抽出した。
【０２５２】
サザンブロット分析のために、各細胞株または正常リンパ球から抽出し、ＥｃｏＲＩ消化した１０μgのＤＮＡを０．８％アガロースゲルにて電気泳動にかけて、ナイロン膜(BIODYNE B,日本パル社製(Nihon Pall))に転写した。また、ノーザンブロット分析のために、各細胞株から抽出した２０μｇの全ＲＮＡを１．０％アガロース／０．６７Ｍホルムアルデヒド・ゲルにて電気泳動にかけて、ナイロン膜上(Hybond-N+,アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製(Amersham Pharmacia Biotech))に転写した。
【０２５３】
各転写膜は、適当な条件下に［α³²Ｐ］ｄＣＴＰ標識した各ＥＳＴプローブでハイブリダイズし、洗浄した後、前記シノミヤらの方法に順じてコダックＸ−ＯＭＡＴフィルムに対して、露光させた。
【０２５４】
異なったヒト正常組織における発現パターンを比較するために、１２の異なる組織から抽出したＲＮＡを用いて作成されたノーザンブロット(MTN-ヒト１２レーン:クロンテック社製)を［α³²Ｐ］ｄＣＴＰ標識したＩＭＡＧＥクローン１３１８６５(GenBank accession number:R24542)でハイブリダイズした。
【０２５５】
サザンブロット分析は、以下の条件で行なった。
1)プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション緩衝液：変性サケ精子ＤＮＡ（200mg/ml）およびヒト胎盤ＤＮＡ（200mg/ml）を含むPEG/SDS溶液（7% PEG8000, 10% SDS）
2)プレハイブリダイゼーション条件：連続攪拌下に６５℃で１２−１６時間
3)ハイブリダイゼーション条件：連続攪拌下に６５℃で１２−１６時間
4)洗浄： 連続攪拌下に洗浄溶液１（２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）にて、５５℃、１５分間、連続攪拌下に洗浄溶液２（０．１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）にて、５５℃、１５分間、２×ＳＳＣにてすすぐ。
【０２５６】
また、ノーザンブロット分析は、以下の条件で行なった。
1)プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション緩衝液：ExpressHyb（クローンテック社）を使用
2)プレハイブリダイゼーション条件：連続攪拌下に６８℃で３０分間
3)ハイブリダイゼーション条件：連続攪拌下に６８℃で１時間
4)洗浄：連続攪拌下に洗浄溶液１（２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）にて、５５℃、３０分間、連続攪拌下に洗浄溶液２（０．１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）にて、５５℃、１５分間を２回、２×ＳＳＣにてすすぐ。
【０２５７】
以上の結果、ＹＡＣ７９９Ｄ２上に局在しているグリコゲニン２(GYG2: Glycogenin2)、グリシンデヒドロゲナーゼ(GLDC: Glycine dehydrogenease)およびＩＭＡＧＥクローン１３１８６５(GenBank Accession No.R24542)の３つのＥＳＴプローブを用いた食道扁平上皮癌細胞株のサザンブロット分析は、ＣＧＨおよびＦＩＳＨ試験において９ｐでコピー数の増加を示した５つの細胞株全てで増幅パターンを示した。
【０２５８】
対照的に、領域外の遺伝子または未知の転写体に対するプローブである、溶質担体ファミリー(solute-carrier family)の一つであるＳＬＣ１Ａ１、ＪＡＫ２、カゼイン・キナーゼ１γ２(CSNK1G2)、ＩＭＡＧＥクローン６５０４９５(GenBank Accession No. AA219360)およびＩＭＡＧＥクローン３５０３５４(GenBank Accession No. R18567)は、ＫＹＳＥ１５０において、増幅が見られないことが明らかになった(図１のＢ参照)。
【０２５９】
食道扁平上皮癌細胞株ＤＮＡと正常ＤＮＡのハイブリダゼーション・シグナルの比較に基づく、増幅の程度の大まかな評価によると、最初の３つのプローブ(GYG2, GLDC, IMEGEクローン131865)ではＫＹＳＥ１５０においては、１２倍以上の増幅が明らかとなり、他の４つの細胞株において、およそ３から６倍の増幅が確認された(図３のＡ参照)。
【０２６０】
尚、図３のＡは、食道扁平上皮癌細胞株におけるＧＡＳＣ１の増幅を示す図である。この図は、前述の方法のようにプローブとしてＩＭＡＧＥクローン１３１８６５を使用するサザンブロットにより求められた。
【０２６１】
該図より、健常人末梢血リンパ球由来のＤＮＡ（Ｎ）上のシグナルは、８つの食道扁平上皮癌細胞株のうち、ＫＹＳＥ７０，１５０，４５０，８９０および１１７０より弱く、１２５０および１２６０より強く、そして１１０と同程度であることが判る。このことから、ＫＹＳＥ７０，１５０，４５０，８９０および１１７０においてＩＭＡＧＥクローン１３１８６５が増幅していることを示している。
【０２６２】
また、図３のＢは、図３のＡで用いたのと同じ８つの食道扁平上皮癌細胞株からの全ＲＮＡを対象にプローブとしてＩＭＡＧＥクローン１３１８６５或いはコントロール・プローブ(GAPDH)でハイブリダイズしたノーザンプロット分析結果を示す図である。
【０２６３】
該図より、図３のＡで増幅があった５つの食道扁平上皮癌細胞株(KYSE-70, KYSE-150, KYSE-450, KYSE-890, KYSE-1170)において、ＧＡＳＣ１遺伝子が過剰発現していることが明らかである。
【０２６４】
更に、図４は、正常ヒト組織における本発明遺伝子の発現を調べた結果を示す図である。
【０２６５】
この図は、１２の異なる組織から抽出されたＲＮＡを用いて作成したノーザンプロットに対して、［α³²Ｐ］ｄＣＴＰ標識したＩＭＡＧＥクローン１３１８６５をハイブリダイズして作成された結果を示す図である。尚、ハイブリダイズ操作は図３のＢと同様とした。
【０２６６】
３つの未知の転写体（IMAGEクローン131865, 650495, 30354）の発現レベルを分析するために実施したノーザンブロットの結果は、ＩＭＡＧＥクローン１３１８６５のみが、９ｐ２３−２４上で増幅を示した細胞株において過剰発現を示した(図３のＢ参照)。
【０２６７】
この結果は、ＩＭＡＧＥクローン１３１８６５が、このアンプリコン内に存在する増幅の標的遺伝子の候補の一部であることを示しており、このため、このクローンを用いて全長の遺伝子をクローニングし、その配列を決定することとした。
【０２６８】
ＩＭＡＧＥクローン１３１８６５とハイブリダイズした複数のひと正常組織のＲＮＡを用いたノーザンプロットは、４．５Ｋｂの１つのシグナルの転写体が全ての組織で発現していることを示した(図４参照)。
３．ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングとＤＮＡ配列決定
オリゴキャップ法(Maruyama,Ｋ.,et al., Gene, 138, 171-174 (1994))およびＺＡＰ−ｃＤＮＡギガパックIIIゴールドクローニングキット(ZAP-cDNA Gigapack III Gold cloning Kit:ストラタジーン社製)によって、胃癌細胞株(HSC39)のＲＮＡから２つのｃＤＮＡライブラリー構築した。
【０２６９】
各ライブラリーは、プローブとしてＩＭＡＧＥクローン１３１８６５（その配列の一部が既知であり、その配列に対してGenBank accession No.R24542が与えられている）を用いてスクリーニングした。
【０２７０】
該スクリーニングにより、６つの重複しているｃＤＮＡクローンが単離され、それらのＤＮＡ配列を３７７ＡＢＩ自動シーケンサー(ＰＥバイオシステムズ:PE Biosystems社製)を用いて決定した。この方法によって、４２３５塩基の転写体を見出した。
【０２７１】
該転写体は、ノーザンブロット分析によって示されたものとサイズが良く対応していたので、このｃＤＮＡは、全長ｃＤＮＡであると考えられた。
【０２７２】
核酸配列分析は、転写開始のためのコンセンサス配列(コザックのルール)が良く保存されているので転写が１４７番目で始まっていると考えられた。２つのＡＡＴＡＡポリアデニーレーション・シグナルがポリ(Ａ)伸長によって続いた３’末端で見つかった。故に、推定された蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号：１に示されるように１０５６のアミノ酸配列を含むものと同定された。
【０２７３】
また、ＧＡＳＣ１のＤＮＡ配列（配列番号：２に示す）の１０番目から３１４０番目は、ＫＩＡＡ０７８０(GenBank Accession No. AB018323)のｃＤＮＡ配列の部分に対して著しい相同性を示した。
【０２７４】
更に、単離されたクローンの配列を確認するために、鋳型として過剰発現を示した５つの食道扁平上皮癌細胞株（KYSE-70, KYSE-150, KYSE-450, KYSE-890およびKYSE-1170）由来のＲＮＡと 、クローン１３１８６５をスクリーニングすることによって単離したクローンから決定した配列を基に作製した下記２組のプライマーを使用する逆転写ＰＣＲ(RT-PCR)分析を実施した。
【０２７５】
これらＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーの配列は、配列番号：６から配列番号：９に示される。
【０２７６】
プライマーＷ１ｆ： 配列番号：６
プライマーＷ１ｒ： 配列番号：７
プライマーＷ２ｆ： 配列番号：８
プライマーＷ２ｒ： 配列番号：９
ＲＴ（逆転写）反応は、１μｇのＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）プライマー０．５μｇと混合し（全量１０μｌ）、７０℃、１０分間変性させた後、５×逆転写バッファー（GIBCO社）４μｌ、ＲＮａｓｅインヒビター（TOYOBO社）１μｌおよび２．５ｍＭｄＮＴＰ（TAKARA社）４μｌを加え（全量１９μｌ）、更にSuperscript II (GIBCO社）１μｌを加えて、４２℃で４５分間インキュベートすることにより実施した。
【０２７７】
ＰＣＲ反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム９７００(パーキン−エルマー社製)を利用して行った。該反応は、１μｌのＲＴ産物に１０×ＥｘＴａｑバッファー（TAKARA社）２μｌ、２．５ｍＭｄＮＴＰ（TAKARA社）１．０μｌ、１０μＭ各プライマー０．５μｌおよびＥｘＴａｑ（TAKARA社）０．５Ｕを加えて全量を２０μｌとして実施した。条件としては、９４℃で２分間の最初の変性、引続く、９４℃で３０秒、５８℃で３０秒および７２℃で３０秒を１サイクルとする２５サイクル、その後、７２℃で７分間の伸長反応の追加とした。
【０２７８】
その結果、配列決定した配列が正しいことを確認できる予測されたサイズの単一のバンド産物が生み出されていた。加えて、プライマーとして上記Ｗ２ｆとＷ２ｒとを用いたＲＴ−ＰＣＲにより、作成したＤＮＡの配列２３８番−６３８番よりなるＤＮＡ断片を〔α³²Ｐ〕ｄＣＴＰで標識して、ＩＭＡＧＥクローン(R24542)を含んでいるＹＡＣ７９９Ｄ２をスポットしたナイロン膜（BIODYNEB, 日本パル社製(Nihon Pall)）にハイブリダイズした所、シグナルが検出され、また５つの９ｐ２３−２４に増幅を示す５つの腫瘍細胞株（KYSE70, KYSE150, KYSE450, KYSE890およびKYSE1170）の全てでサザンブロット上に増幅シグナルを示した。
【０２７９】
推定されたアミノ酸配列の分析は、遺伝子産物が、２つのＰＨＤフィンガーと１つのＰＸドメインを含んでいることを示唆した(配列番号：１で示されるアミノ酸配列中、６８７〜７４９番目および８０６〜８６７番目の配列がＰＨＤフィンガー配列であり、９８０〜１０４７番目のアミノ酸配列がＰＸドメインの配列である)。
【０２８０】
ＰＳＯＲＴIIプログラム(文献：http://psort.nibb.ac.jp/form2.html)を用いるその細胞内局在のコンピュータ予測によって、ＧＡＳＣ１蛋白質には、一つの典型的二連の核局在シグナルが、９７９−９９６番目のアミノ酸に検出されたことから、核に局在していることが推測された。
【０２８１】
上記で得られた結果から、「癌遺伝子」の候補であることを示すモチーフのＰＨＤフィンガー・モチーフおよびＰＸドメインを含んでいるＧＡＳＣ１遺伝子は、様々な腫瘍の発生や進展に重要な役割を演じていると推定され、染色体９ｐ２３−２４領域でのＧＡＳＣ１転写物の発現増加が、同様に食道扁平上皮癌を含む種々の型の腫瘍の発生および／または進展に関連した腫瘍関連遺伝子(癌遺伝子の候補遺伝子を含む)であることを強く示唆している。
【０２８２】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の１に示すＦＩＳＨ試験の結果を示す図であり、図中、Ａは本発明遺伝子の周囲の９ｐ２３−２４の遺伝子地図を、Ｂはサザンブロット分析によって特定した５つの食道扁平上皮癌細胞株の各々における９ｐ２３アンプリコンのサイズまたは長さを模式的に示す図である。
【図２】実施例１の１に示す食道扁平上皮癌細胞であるＫＹＳＥ−１５０におけるＦＩＳＨ分析の典型的な結果を示す図面代用写真である。
【図３】実施例１の２に示す試験の結果を示す図であり、Ａはサザンプロット分析により、食道扁平上皮癌細胞株におけるＧＡＳＣ１の増幅を示す図、Ｂは種々の食道扁平上皮癌細胞株からのＲＮＡを用いたノーザンブロット分析の結果であって、ＧＡＳＣ１の過剰発現を示す図である。
【図４】実施例１の２に示す試験の結果を示す図であり、様々な正常ヒト組織における本発明遺伝子の発現パターンを調べた結果を示す図面代用写真である。

Claims (11)

1. 以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドを含む遺伝子：
   （ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
   （ｂ）上記（ａ）のポリヌクレオチドに対する相補鎖であるポリヌクレオチド。
2. 配列番号：２で示される塩基配列である請求項１に記載の遺伝子。
3. 配列番号：１で示されるアミノ酸配列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである請求項１に記載の遺伝子。
4. 配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有する遺伝子発現産物。
5. 請求項１または２に記載の遺伝子を有する組換え体発現ベクター。
6. 請求項５に記載の組換え体発現ベクターを保有する宿主細胞。
7. 癌診断剤であって、
   診断する癌が、食道扁平上皮癌であり、
   配列番号１０で示される塩基配列、及び配列番号３で示される塩基配列２３８番から６３９番よりなる塩基配列からなる群より選択される少なくとも１種以上を有するプローブを有効成分として含有する癌診断剤。
8. 癌診断用キットであって、
   診断する癌が、食道扁平上皮癌であり、
   配列番号１０で示される塩基配列、及び配列番号３で示される塩基配列２３８番から６３９番よりなる塩基配列からなる群より選択される少なくとも１種以上を有するプローブを有効成分として含有する癌診断用キット。
9. 癌診断剤であって、
   診断する癌が、食道扁平上皮癌であり、
   配列番号６で示される塩基配列と配列番号７で示される塩基配列のセット、又は配列番号８で示される塩基配列と配列番号９で示される塩基配列のセットからなるプライマーを含む
   癌診断剤。
10. 癌診断用キットであって、
    診断する癌が、食道扁平上皮癌であり、
    配列番号６で示される塩基配列と配列番号７で示される塩基配列のセット、又は配列番号８で示される塩基配列と配列番号９で示される塩基配列のセットからなるプライマーを含む
    癌診断用キット。
11. 請求項１に記載の遺伝子の発現産物に対する抗体。

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