KR102097794B1 - 신규한 miRNA smR-167 및 폐암 예방 또는 치료를 위한 이의 용도 - Google Patents

신규한 miRNA smR-167 및 폐암 예방 또는 치료를 위한 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 miRNA smR-167 및 이를 이용한 폐암 예방 또는 치료용 약학 조성물, 폐암 진단용 키트, 폐암 진단의 정보 제공 방법, 폐암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
서열번호 1의 염기서열로 구성된 신규한 smR-167 miRNA의 경우, IGF-1R의 발현을 억제하고 폐암 세포의 증식 및 이동을 억제하므로, 폐암의 예방 또는 치료를 위한 다양한 용도에 이용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

Description

신규한 miRNA smR-167 및 폐암 예방 또는 치료를 위한 이의 용도 {Novel miRNA smR-167 and use thereof for treating and preventing lung cancer}
본 발명은 신규한 miRNA smR-167 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 신규한 miRNA smR-167 및 이를 이용한 폐암 예방 또는 치료용 약학 조성물, 폐암 진단용 키트, 폐암 진단의 정보 제공 방법, 폐암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
폐암 발병률은 다른 암의 발병률에 비해 굉장히 높으며, 특히 매년 발병률이 증가하고 있는 실정이며, 아울러 폐암 환자의 사망률은 전 세계적으로 높은 비중을 차지하고 있다(CA Cancer J. Clin. 2017).
MicroRNA는 생체 내 존재하는 단백질-비 암호화 RNA로, 특정 유전자의 전사 후 과정에 작용하여 해당 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 특히, miRNA는 세포주기, 분화, 발달, 대사, 발암, 노화와 같은 생물학적 기능을 조절하여 생체의 항상성 유지를 매개하는 중요한 유전적 요소로 인지되며, 특히 이의 비정상적인 네트워크 형성은 세포 생리학적인 측면에서 치명적인 결함을 나타낸다는 점에 주목할 수 있다.
비소세포폐암을 포함한 다양한 인체의 신생물 질환에서 특이적 또는 비정상적인 발현 양상을 보이는 발암 인자와 miRNA가 지속적으로 보고되고 있다. 또한 이들은 암의 발병 기전 동안 발암성 전사체 네트워크를 형성함으로써 발암 과정을 악화시킬 수 있다는 증거가 지속적으로 제시되고 있으며, 아울러 이들을 바탕으로 폐암 특이적 ‘바이오마커 및 표적 치료제'로서 활용 가능성이 제안되고 있다.
비소세포 폐암에서 기존의 항암 화학 요법 및 방사선 치료 요법의 경우는 치료에 대한 민감성이 낮은 단점과 약물에 대한 면역반응 또는 체내 축적으로 인한 독성 문제를 피할 수 없다. 또한 단일 항암제로의 치료 전략은 내성 문제에 직면하는 문제점을 나타내고 있다. 특히 폐암의 높은 사망률은 조기 진단이 어렵다는 점이며, 객담에서 실시하는 암 검사는 민감도가 다소 떨어지므로 예측 진단이 실질적으로 어려운 실정이다.
암에서 miRNA의 후성유전학적의 이해와 이에 대한 길항제 또는 유사체의 활용 방안은 생체 이용률이 높으며, 효험에 대한 정상 상태(steady state) 도달에 유리하다. 특히 클리어런스(clearance)에 강한 이점을 지니기에 독성 문제를 완화시킬 수 있을 뿐만 아니라 생체 내 존재하는 생물 소재를 이용하기에 면역 반응에도 큰 이점을 지니고 있다.
miRNA는 표적 유전자를 효과적으로 조절할 수 있으며, 광범위한 유전자를 동시에 제어할 수 있기에 종양 치료에 기대적이다. 또한 발암 인자와 발암 경로를 동시에 노리는 것은 암 치료에 시너지 효과를 기대할 수 있다.
miRNA의 혈중 내 발현 양상은 암의 초기 단계에서 민감하게 반응하므로 암의 조기, 예측 발견에 있어서 강한 이점을 나타낸다. 또한 단순한 채혈만으로 다양한 암을 검사할 수 있기에 환자로부터 몸에 가해지는 부담이 적어진다는 측면에서 매우 기대적이다. 따라서 비소세포폐암 활성 기전에서 비정상적인 네트워크를 형성하는 miRNA는 발암 과정의 주된 원인이 될 수 있는 반면에, 치료 및 진단에 대한 단서를 제공할 수 있다는 점에서 miRNA의 활용 가치가 있다.
이에 따라, 본 발명자들은 비소세포 폐암 환자들로부터 비정상적인 네트워크를 형성하는 microRNA을 탐구하고자 노력한 결과, 과정에서 상기의 본 신규한 miRNA 고유 서열을 동정 및 특성화하게 되었다.
본 신규한 microRNA 고유 서열은 비소세포폐암 환자 및 세포주로부터 특이적 또는 비정상적인 발현 양상을 나타낸 다는 사실을 다양한 분자 생물학적 기법을 활용하여 규명하였으며, 그 결과 진단 관련 바이오마커로의 활용 가능성을 입증하였다.
본 신규한 microRNA 고유 서열은 비소세포 폐암 세포주에서 특정 발암 인자를 직접적으로 조절하여 발암성 경로의 신호 전달을 억제할 수 있으며, 그 결과 비소세포폐암 관련 생체 내·외 모델로부터 항증식 및 항전이의 생물학적 기능을 나타낼 수 있음을 다양한 분자 생물학적 기법을 활용하여 규명하였다. 이의 발견과 활용 용도는 분자 표적 치료 또는 특정 유전자 조절제로의 활용 가능성을 입증하였다.
본 신규한 microRNA 고유 서열은 세포가 증식하는 동안 그 발현이 감소되는 고유한 특성을 발견하였으며, 또한 특정 발암 인자와 연관성을 규명하였으며. 그 결과 세포 증식 및 특정 유전자에 대한 예후 인자로의 활용 가능성을 입증하였다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 서열번호 1의 염기서열로 구성된 신규한 smR-167 miRNA의 경우, IGF-1R의 발현을 억제하고 폐암 세포의 증식 및 이동을 억제하므로, 폐암의 예방 또는 치료를 위한 다양한 용도에 이용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
KR 10-2017-0021580 A KR 10-2018-0009762 A
따라서, 본 발명의 주된 목적은 IGF-1R의 발현을 억제하고 폐암 세포의 증식 및 이동을 억제함으로써 폐암을 예방 또는 치료할 수 있는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 신규한 smR-167 miRNA를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규한 smR-167 miRNA를 이용한 폐암 예방 또는 치료용 약학 조성물, 폐암 진단용 키트, 폐암 진단의 정보 제공 방법, 폐암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 구성된 smR-167 miRNA를 제공한다.
상기 smR-167 miRNA는 서열번호 1의 염기서열( 5‘-CGGAAUGGGGGGGGGGGCCG-3’)로 구성된 것이 바람직하나, 상기 miRNA에 서열에 한정되지 않는다. 예컨대, 서열번호 1의 염기서열에서 1개, 2개 또는 소수의 염기가 치환, 결실 또는 삽입되는 변이체를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 smR-167 miRNA는 서열번호 1의 염기서열에서 80% 상동성을 갖는 서열을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 90% 상동성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 상기 열번호 1의 염기서열을 갖는 smR-167 miRNA는 miRBase registry (http://www.mirbase.org/)의 prof. Sam Griffiths-Jone으로부터 2018년 03월 16일에 hsa-miR-12528의 공식 이름을 배정받고 정식 등록되었다.
본 발명에 있어서, 상기 smR-167 miRNA는 인간, 오랑우탄, 침팬지 또는 원숭이와 같은 다양한 포유류 세포에서 유래될 수 있으며, 바람직하게는 인간 폐 또는 폐암 세포에서 유래된 것을 특징으로 하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 smR-167 miRNA는 IGF-1R 의 3'-UTR에 직접 결합하고, IGF-1R를 전사 후 과정 및 단백질 수준에서 직접적으로 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 smR-167 miRNA는 폐암 세포 또는 조직에서 저발현하고, 폐암 세포에서 smR-167 miRNA의 과발현은 IGF-1R의 조절을 통해 세포의 증식 및 이동을 감소시키고 세포주기 관련 단백질을 감소시키는 것을 특징으로 한다.
IGF-1R은 다양한 암 세포들에서 과잉 발현되거나 비활성적으로 활성화되는 수용체 단백질이다. 특히, 신호 전달관련 및 세포성장, 생존, 세포주기 진행에 관여하는 여러 신호전달체계에서 중요한 핵심 인자로서 Apoptosis 억제, 세포증식 촉진 등에 관여하는 것으로 알려져 있다. 특히, AKT 신호전달체계는 IGF-1(Insulin-like growth factor 1)에 의해 강력하게 활성화되는데, IGF-1가 결합하는 IGF-1R(Insulin-like growth factor 1 receptor)는 몇몇의 암과 연관되어 있으며, 특히 비소세포폐암과 연관되어 있음이 알려져 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 smR-167 miRNA가 IGF-1R 및 AKT/mTOR의 하위신호전달체계와 관련된 인자들인 Cdk-2, Cdk-4, 인산화된-Rb, Bcl-2, XIAP 및 Caspase 3/7의 조절에 미치는 영향을 확인한 결과, 과발현된 smR-167 miRNA는 상기 인자들을 신호 전환시키는 것을 확인하였다. 이러한 결과는, 궁극적으로 세포주기 조절인자와 세포사멸 조절인자의 발현을 조절함으로써 폐암 세포의 세포주기 정지 및 세포 사멸 촉진 기능을 유도할 수 있음을 시사한다(도 8 내지 도 10 참조).
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 smR-167 miRNA를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 당업계에서 유전자 발현을 위해 일반적으로 이용되는 어떠한 벡터도 이용될 수 있으며, 바람직하게는 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성 벡터일 수 있다. 비바이러스성 벡터로는 플라스미드 DNA일 수 있으며, 바이러스성 벡터로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 아데노부석바이러스 벡터인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 smR-167 miRNA를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 형질전환시킨 형질전환체를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주세포는 인간을 포함한 포유류의 체세포일 수 있으며, 바람직하게는 인간의 폐 또는 폐암 세포인 것일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 smR-167 miRNA, 이를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 폐암 세포주 및 종양이 유도된 마우스에서 smR-167 miRNA의 효과를 확인한 결과, smR-167 miRNA의 도입은 세포주의 콜로니 형성을 억제하고, 세포의 운동성, 침윤성 및 이동성을 억제할뿐만 아니라 종양 형성을 감소시키는 것을 확인하였다. 이러한 결과는, smR-167 miRNA를 폐암 예방 또는 치료제, 또는 폐암 전이 억제제의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있음을 시사한다(도 11 내지 도 17 참조).
본 발명에 따른 조성물은 smR-167 miRNA에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있다.
상기 조성물은 임상 투여 시에 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
상기 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
상기 조성물의 일일 투여량은 약 0.0001 내지 1000 ㎎/㎏이고, 구체적으로 0.001 내지 100 ㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여할 수 있으나 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 smR-167 miRNA를 포함하는 벡터의 경우 구체적으로 0.01 내지 500 mg을 함유하고, 보다 구체적으로 0.1 내지 300 mg을 함유하며, smR-167 miRNA를 포함하는 재조합 바이러스의 경우, 구체적으로 103~1012IU(10 내지 1010PFU)를 함유하고, 보다 구체적으로 105 내지 1010IU를 함유하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 smR-167 miRNA를 포함하는 세포의 경우, 구체적으로 103 내지 108개를 함유하고, 보다 구체적으로 104 내지 107개를 함유하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 smR-167 miRNA를 포함하는 벡터 또는 세포를 유효성분으로 함유하는 조성물의 유효 용량은 체중 1 ㎏당 벡터의 경우에는 0.05 내지 12.5 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 107 내지 1011 바이러스 입자(105 내지 109IU)/㎏, 세포의 경우에는 103 내지 106 세포/㎏이고, 구체적으로 벡터의 경우에는 0.1 내지 10 ㎎/㎏,재조합 바이러스의 경우에는 108 내지 1010입자(106 내지 108IU)/㎏, 세포의 경우에는 102 내지 105 세포/㎏이며, 하루 2 내지 3회 투여될 수 있다. 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다.
상기 조성물은 실제 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 smR-167 miRNA의 검출을 위한 프라이머쌍, 프로브 또는 항체를 포함하는 폐암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 miRNA의 검출인자로는 프라이머, 프로브 또는 항체인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은,
1) 피검 개체에서 분리된 시료에서 제1항의 smR-167 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 smR-167 miRNA의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 감소된 개체를 선별하는 단계; 및
3) 상기 단계 3)에서 선별된 개체를 폐암 또는 폐암에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계; 를 포함하는, 폐암 진단의 정보를 제공하기 위한 유전자 검출 방법을 제공한다.
상기 유전자 검출 방법에 있어서, 상기 피검 개체는 인간을 포함한 포유류일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
상기 유전자 검출 방법에 있어서, 상기 시료는 체세포일 수 있으며, 바람직하게는 폐 또는 폐암 세포 또는 조직인 것을 특징으로 하며, 이에 한정되지 않는다.
상기 유전자 검출 방법에 있어서, 상기 smR-167 miRNA의 발현 수준의 측정은 당업계에 알려진 유전자 발현 측정방법은 모두 사용가능하며, 바람직하게는 실시간 RT-PCR으로 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은,
1) 피검 조성물 또는 화합물을 제 1항의 smR-167 miRNA 발현 세포에 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 smR-167 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 발현 수준이 무처리 대조군의 발현 수준에 비해 증가하는 피검 조성물 또는 화합물을 선별하는 단계; 를 포함하는, 폐암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, smR-167 miRNA의 발현 세포는 smR-167 miRNA 서열에 대한 합성물인 모방체(mimic) 또는 smR-167 miRNA를 포함하는 발현벡터를 폐암 세포에 형질전환시켜 제조된 smR-167 miRNA 과발현 세포인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 상기 smR-167 miRNA의 발현 수준의 측정은 당업계에 알려진 유전자 발현 측정방법은 모두 사용가능하며, 바람직하게는 실시간 RT-PCR으로 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은,
1) 피검 조성물 또는 화합물을 제 1항의 smR-167 miRNA 및 IGF-1R 발현 세포에 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 smR-167 miRNA 및 IGF-1R의 결합 수준을 측정하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 발현 수준이 무처리 대조군의 발현 수준에 비해 증가하는 피검 조성물 또는 화합물을 선별하는 단계; 를 포함하는, 폐암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, smR-167 miRNA의 발현 세포는 smR-167 miRNA 서열에 대한 합성물인 모방체(mimic) 또는 smR-167 miRNA를 포함하는 발현벡터를 폐암 세포에 형질전환시켜 제조된 smR-167 miRNA 과발현 세포인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 상기 smR-167 miRNA의 발현 수준의 측정은 당업계에 알려진 유전자 발현 측정방법은 모두 사용가능하며, 바람직하게는 실시간 RT-PCR으로 수행되는 것을 특징으로 한다.
전술한 바와 같이, 본 발명에서 동정한 신규한 smR-167 miRNA는 폐암 세포에서 저발현하고, 인간 IGF-1R을 전사 후 과정 및 단백질 수준에서 직접적으로 억제한다. 또한, 폐암 세포에서 smR-167 miRNA의 과발현은 IGF-1R의 하위신호전달체계인 Akt1/mTOR 경로의 조절을 통해 세포의 증식 및 이동을 감소시킴으로써 폐암을 예방 및 치료할 수 있다. 그러므로, 본 발명에 따른 smR-167 miRNA는 폐암 진단의 바이오마커로 사용할 수 있으며, 폐암 예방 및 치료제, 또는 폐암 전이 억제제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 신규한 smR-167 miRNA의 구조를 나타내는 도면이다.
도 2 및 도 3은 이종간 상동성 보존 여부 분석 연구에 따른 신규한 smR-167 miRNA의 고유서열을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4 및 도 5는 비소세포폐암 세포주 및 국내환자 조직 샘플에서의 smR-167 miRNA 발현 양상을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6 및 도 7은 smR-167 miRNA의 표적유전자 확인 및 표적 유전자에 대한 단백질 억제 효과를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8 내지 도 10은 분자적 수준에서 smR-167 miRNA의 표적 유전자 조절 효과 및 세포주기, 세포사멸에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 11 내지 도 15은 smR-167 miRNA 유도체의 도입에 따른 세포의 증식률, 운동성, 침윤성 및 이동성을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 16 및 도 17은 smR-167 miRNA 유도체의 도입에 따른 종양 형성 억제 효과를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 18 내지 도 20은 smR-167 miRNA의 임상적 효과를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 21 내지 도 23은 smR-167 miRNA의 표적 유전자 조절 효과를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 세포주 및 조직 샘플의 준비 및 배양
인간 이배체 폐 정상 섬유아 세포(WI-38), 바이러스 형질감염 인간 폐 불멸화 상피 세포(BEAS-2B), 인간 폐 선암종(A549, SK-LU-1 및 NCI-H1299), 인간 폐 선편평암 상피 세포(NCI-H596), 인간 폐 편평암 상피 세포(SK-MES-1 및 NCI-H226) 및 인간 폐 대세포암 상피 세포(NCI-H460)에 해당하는 인간 유래 세포주는 미국 균주 은행(American Type Culture Collection; ATCC) 및 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank; KCLB)에서 획득하였다.
배양 방법으로 WI-38 세포주는 Eagle's minimal essential medium, EMEM 배양액(Welgene, Daegu, Korea)에서 유지하였으며, A549, NCI-H1299, NCI-H596, NCI-H226 및 NCI-H460 세포주는 RPMI-1640 배양액(Welgene)에서 유지하였다. 또한 SK-LU-1 및 SK-MES-1 세포주는 Dulbeco’s Modified Eagle’s Media, DMEM 배양액(Welgene)에서 유지하였으며, BEAS-2B 세포주는 DMEM/F12 배양액 (Gibco, Grand Island, NY)에서 유지하였다. 상기의 모든 인간 유래 세포주는 10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS) (Welgene, Gibco)과 1% 페니실린(100 U/mℓ, Welgene) 및 스트렙토마이신 (100 μg/mℓ, Welgene)의 혼합 배양액으로 유지하였으며, 5% CO2의 대기 조건과 37℃에서 배양하였다. 국내 폐암 환자로부터 유래된 모든 조직 샘플 및 분양리스트에 대한 임상정보는 고려대학교 구로병원 인체자원은행에서 제공한 자원을 이용하여 수행하였다.
실시예 2: 신규한 miRNA인 smR-167의 클로닝 및 동정
2-1. 폐암으로부터 RNA의 분리
폐암 세포주 및 조직 샘플로부터 TRIzol 시약(Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 전체 RNA을 분리하였다. 분리된 RNA는 75% 에탄올로 세척한 후, 0.1% DEPC로 처리된 멸균수 (Sigma-Aldrich, St, Louis, MO, USA)에 재현탁하여 -80 ℃에서 보관하였다.
2-2. 신규 miRNA의 클로닝 및 시퀀싱
신규한 microRNA 고유 서열을 동정하기 위하여, 약 200 뉴클레오타이드(nt)보다 작은 RNA 단편을 mirVana RNA 분리 키트(Ambion, Foster City, CA, USA)를 사용하여 전체 RNA로부터 분리하였다. 분리된 작은 RNA는 DynaExpressmiRNA 클로닝 키트(BioDynamics Laboratory Inc., Tokyo, Japan)을 이용하여 일부 변형(Yoo JK et al., Stem Cells Dev, 2012, 21: 2049-2057)을 행하여 제조사의 지시에 따라 벡터 내로 클로닝 하였다. 작은 RNA 단편은 15% 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 (polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)에서 분리 및 정제하였다. 15-30nt 사이즈의 RNA는 알칼린포스파타아제(alkaline phosphatase)를 처리하여 탈인산화한 후, 3'-링커에 연결시켰다. 3'-링커가 연결된 산물은 5'-말단과 재원형화(re-circularization) 되는 현상을 방지하기 위하여 3'-말단을 차단시켰다. 그런 다음, 3'-말단이 차단된 산물을 15% 변성 PAGE를 이용하여 재분리한 후, 36-46nt의 산물을 절단한 다음 정제하였다. 산물은 역전사 효소를 사용하여 cDNA를 합성하였다. PCR 산물은 TA 클로닝 벡터(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 클로닝 하였으며, 서열 내 정보는 시퀀싱 (Macrogen Inc, Seoul, Korea)을 기반으로 분석 하였다.
2-3. 폐암에서 신규한 miRNA인 smR-167 서열 확인
클로닝 및 서열화된 작은 RNA에 대한 인간 게놈에서의 정보, 특성 및 이종간 상동성 보존 유무 등은 NCBI BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 및 Ensemble genome browser의 바이오인포매틱스 도구를 이용하여 고유 서열을 분석하였다. 추정되는 miRNA 고유 서열의 2차 머리핀 (stem loop) 형성 유무는 RNAfold 웹 사이트 (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgibin/RNAfold.cgi)을 이용하여 분석하였다. 추가적으로 상기의 과정에서 발굴된 추정되는 microRNA 고유 서열의 긍정성 또는 진실성(false negative/positive)을 입증하기 위하여 miRNA 생합성 과정에 중대한 역할을 수행하는 Dicer 유전자를 특이적 siRNA 서열(Sense: 5'-UGCUUGAAGCAGCUCUGGAUU-3'; Antisense: 5'-UCCAGAGCUGCUUCAAGCAUU-3') (Genolution pharmaceuticals Inc., Seoul, Korea)과 Lipofectamine 2000 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 ‘녹-다운’화를 유도한 후, miScript II RT 키트 (Qiagen, Hilden, Germany)와 qRT-PCR (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 시스템을 사용하여 제조사의 지시에 따라 miRNA 고유 서열의 발현 양상을 대조군 세포와 Dicer 유전자 침묵 세포 사이에서 프로파일링 하였다.
그 결과, 작은 RNA 중에서 smR-167의 고유 서열을 동정하였고, 이의 서열에 대한 인간 게놈에서의 정보, 특성, 이종간 상동성, 2차 머리핀 구조 및 Dicer 유전자 발현과의 연관성을 입증하였다 (도 1 내지 3 참조).
실시예 3: 비소세포폐암 세포주 및 폐암 환자 조직에서 smR-167의 발현 양상 프로파일 분석
3-1. 비소세포폐암 세포에서 smR-167의 발현 양상 확인
WI-38 및 BEAS-2B의 정상 폐 세포와 A549, NCI-H1299, SK-LU-1, NCI-H596, NCI-H226, SK-MES-1 및 NCI-H460의 폐암 세포주에서 신규 smR-167의 발현 양상을 분석하기 위하여 폴리-A-테일(Poly-A-tailed) RT-PCR 분석을 수행하였다. 각 세포주로부터 RNA는 상기 <2-1>에서 언급한 RNA 분리 기법을 이용하여 전체 RNA를 회수하였다. 분리된 RNA는 miScript II RT 키트 (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 miRNA 서열에 대한 cDNA를 합성하였다. 발현 양상에 대한 프로파일화는 QuantiTect SYBR Green PCR 키트 (QIAGEN, Hilden, Germany) 및 실시간 PCR 검출 시스템(qRT-PCR) (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 분석하였으며(프라이머 서열은 하기 표 1에 나타내었음), 정량적 수치화는 2-ΔΔC(t) 방법을 이용하여 분석하였다. 상기의 방법을 기반으로 정상 세포와 폐암 세포 사이에서 smR-167의 발현 양상을 비교 분석하였다.
그 결과, 도 4에서 확인할 수 있듯이, smR-167는 정상세포 WI-38 및 BEAS-2B와 비교하여 폐암 세포 A549, NCI-H1299, SK-LU-1, NCI-H596, NCI-H226, SK-MES-1 및 NCI-H460에서 유의적으로 저발현되는 것을 확인하였다.
Name Genbank Accession Zone Primer sequence (5´-3´)
miR-21 NR_029493 Forward TAGCTTATCAGACTGATGTTGA
Reverse miScript universal primer
let-7a NR_029476 Forward TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT
Reverse miScript universal primer
smR-167 Novel Forward CGGAATGGGGGGGGGGGCCG
Reverse miScript universal primer
RNU6B NG_034215 Forward CTGCGCAAGGATGACACG
Reverse miScript universal primer
3-2. 국내 비소세포폐암환자 조직에서 smR-167의 발현 양상 확인
20쌍(폐암 조직 및 인접 주변의 정상 폐 조직)의 국내 폐암 환자조직 자원은 고려대학교 구로병원 인체자원은행으로부터 분양받았으며(표 2 참조), TRIzol 시약 (Qiagen, Hilden, Germany) 1 mℓ에 50-100 mg의 각 조직 샘플을 처리하여 RNA를 분리하였다. RNA 분리법 및 smR-167의 발현 양상 분석법은 상기 <3-1>과 동일하게 진행하였다.
그 결과, 도 5에서 확인할 수 있듯이, smR-167는 정상 폐 조직과 비교하여 비소세포폐암환자 폐 조직에서 유의적으로 저발현되는 것을 확인하였다.
Case Histology Sex Age TNM Staging System
T N M
1 Adenocarcinoma M 68 - - -
2 Adenocarcinoma F 68 2 0 0
3 Adenocarcinoma F 80 - - -
4 Adenocarcinoma M 67 3 2 0
5 Adenocarcinoma F 52 2 2 0
6 Adenocarcinoma F 62 1 1 0
7 Adenocarcinoma F 56 2 0 0
8 Adenocarcinoma F 70 1 0 0
9 Adenocarcinoma M 60 2a 0 0
10 Adenocarcinoma M 48 2a 0 0
11 Squamous cell carcinoma M 58 2 1 0
12 Squamous cell carcinoma M 62 - - -
13 Squamous cell carcinoma M 63 4 1 0
14 Squamous cell carcinoma M 61 2 2 0
15 Squamous cell carcinoma M 48 2 2 0
16 Squamous cell carcinoma M 61 3 1 0
17 Squamous cell carcinoma M 68 2 0 0
18 Squamous cell carcinoma M 66 4 2 0
19 Squamous cell carcinoma M 78 1b 0 0
20 Squamous cell carcinoma M 66 2b 0 0
실시예 4: 신규 smR-167의 IGF-1R에 대한 직접적인 조절 여부 확인
4-1. 신규 smR-167의 표적 유전자 탐색
폐암 활성 기전에서 신규 smR-167의 비정상적 하향 조절에 따른 잠재적인 생물학적 기능을 평가하기 위하여 smR-167의 발현 양상과 정반대로 폐암에서 발현이 증가되는 유전자를 웹 사이트 (http://www.ebi.ac.uk/gxa/E-MTAB-37)를 참고하여 탐색하였다. 이들 중, 신규 smR-167의 종자 부위(seed region)와 상보적 결합 서열을 가진 유전자를 동정하였으며, 5개의 유전자(IGF-1R, EGFR, SRC, NRAS 및 IKKβ)가 smR-167에 대한 잠재적인 후보 표적 유전자로 1차 선별되었다.
4-2. 신규 smR-167 미믹(Mimic) 합성 및 세포 내 형질전환
신규 smR-167 고유 서열에 대한 미믹[음성 대조군 (Negative control, NC), smR-167, Anti-167(smR-167 저해제) 및 기타(IGF-1R 및 Dicer 유전자를 '표적화'하는 siRNA)]은 제놀루션 제약회사 (Genolution pharmaceuticals Inc., Seoul, Korea)로부터 화학적 합성 및 제작 의뢰 하였으며(표 3 참조), 형질전환은 제조사의 지시에 따라 리포펙타민 2000 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 수행하였다.
No miRNA/siRNA Position Sequence (5´ - 3´)
1 Si-Dicer Sense UGCUUGAAGCAGCUCUGGAUU
Antisense UCCAGAGCUGCUUCAAGCAUU
2 Negative Control; NC Sense ACGUGACACGUUCGGAGAAUU
Antisense UUCUCCGAACGUGUCACGUUU
3 si-IGF1R Sense GCAAUUUGCUCAUUAACAUUU
Antisense AUGUUAAUGAGCAAAUUGCUU
4 smR-167 Sense CGGAAUGGGGGGGGGGGCCG
Antisense CGGCCCCCCCCCCCAUUCCG
5 Anti-167 Antisense Complementary sequence of smR-167 sense
4.3 이중 루시퍼라아제 리포터 유전자 분석
pGL3 및 pmirGLO 벡터(Promega, Madison, WI, USA)의 다중 클로닝 부위(Multi Cloning Site, MCS)에 잠재적인 후보 표적 유전자 3'-UTR 서열을 결합하여 재조합 리포터 유전자 구조물 또는 플라스미드를 제작하였다. 돌연변이 리포터 유전자 플라스미드는 뮤타-직접 부위-직접 돌연변이 생성 키트(Muta-Site-Directed Mutagenesis Kit) (iNtRON, Seoungnam, Korea)를 사용하여 신규 smR-167의 종자 서열 (seed sequence)에 대한 잠재적 결합 영역을 부조화(mismatch) 서열로 돌연변이화한 형태로 제작 하였다. A549 세포(5 x 104)를 24-웰 플레이트에 성장시킨 후, 다음날 pGL-3 리포터 유전자 구조물 (100 ng) 또는 pmirGLO 리포터 유전자 구조물(100ng)과 각 miRNA 미믹(100 nM)을 공동-형질전환 하였다. pRL-TK 레닐라 루시퍼라아제 벡터(50 ng)는 pGL3 리포터 유전자 플라스미드에 대한 표준화-대조군 벡터로 pGL3 플라스미드와 함께 공동-형질전환 하였다. 약 48시간 동안 공동-형질전환한 후, 파이어플라이(Fire-fly) 및 레닐라 (Renilla) 루시퍼라아제 활성은 이중 루시퍼라아제 리포터 분석 시스템 키트 (Dual-Luciferase Reporter Assay System kit) (Promega, Madison, WI, USA)와 VICTOR3 분석기 (PerkinElmer Inc., Foster City, CA, USA)를 사용하여 연속적으로 측정하여 분석하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6 및 도 7에서 확인할 수 있듯이, 신규 miRNA는 비소세포폐암의 발암 과정 동안 주요 발암인자인 IGF-1R을 직접적으로 조절/표적하여 해당 유전자의 단백질 번역 수준을 억제할 수 있음을 확인하였다.
실시예 5: 분자적 수준에서 smR-167에 의한 IGF-1R 유전자 조절 효과
5-1. 웨스턴 블랏 기법을 이용한 반-정량적 단백질 발현 및 신호전달경로 변화 분석
포스파타아제 억제제 칵테일(phosphatase inhibitor cocktail) (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)을 보충한 프로-프렙 (Pro-Prep) 세포 용해 완충용액(iNtRON, Seoungnam, Korea)을 사용하여 smR-167을 포함하는 각 miRNA 미믹을 형질전환 시킨 세포로부터 단백질을 용해 및 추출하였다. 추출된 단백질을 도데실황산 나트륨(sodium dodecyl sulfate, SDS)-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis)으로 단백질을 크기별로 분획화한 후, 폴리비닐리덴 플루오라이드(불화물) 막(polyvinylidene fluoride, PVDF, 공극 크기: 0.45 μm) (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA)에 전압을 주어 이동시켰다. 단백질의 이동이 완료된 막(membrane)은 약 1 시간 동안 5 % 탈지유(skim milk) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)가 첨가된 TBS-T 완충용액에서 단백질 사이의 틈을 메우는 블로킹(blocking)을 수행하였다. 이 후, 1차 항체(primary antibodies)를 1 % 탈지유 첨가 TBS-T 완충용액에 1:500-1000 비율로 희석하여 막에 처리한 후 4 ℃에서 하룻밤 동안 면역블롯반응(immunoblotting)을 수행하였다. 여기서 GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase) 1차 항체는 단백질 정량 분석의 표준화를 위한 내부 대조군으로 사용하였다. 다음날 1차 단백질 항체 회수와 동시에 TBS-T 완충용액으로 3 회 세척한 후 적절한 2차 항체 (Secondary antibodies)를 처리하여 상온에서 약 2-3 시간 동안 반응시켰다. 2차 항체의 반응 후, TBS-T 완충용액으로 3회 세척을 실시하였으며, 세척이 완료된 막은 웨스트-큐 피코 이씨엘 용액 (West-Q Pico ECL solution) (GenDEPOT, Barker, TX, USA)과 라스-4000 이미지 분석기 (LAS-4000 imager) (FUJIFILM Medical Systems, Woodbridge, CT, USA)를 이용하여 면역블롯반응에 대한 단백질 발현 정도를 검출하였다. 단백질 밴드의 반·정량적 분석은 NIH Image J 프로그램을 사용하여 분석하였다. 사용된 1차 항체 및 2차 항체는 하기 표 4에 나타내었으며, 상기 분석 결과는 도 7 및 도 8에 나타내었다.
Form Antibody Company Cat. No
Primary IGF-1Rβ (C-20) Santa Cruz SC-713
Primary Akt1 (B-1) Santa Cruz SC-5298
Primary p-Akt1 (Thr 308) Santa Cruz SC-135650
Primary mTOR (Ser 2481) Cell Signaling #2972
Primary p-mTOR (Ser 2448) Santa Cruz SC-101738
Primary XIAP Cell Signaling #2042
Primary Bcl-2 (C-2) Santa Cruz SC-7382
Primary α-Tubulin (B-7) Santa Cruz SC-5286
Primary Cdk4 (C-22) Santa Cruz SC-260
Primary Cdk2 (D-12) Santa Cruz SC-6248
Primary Rb (C-2) Santa Cruz SC-74562
Primary p-Rb (Thr 821/826) Santa Cruz SC-16669
Primary GAPDH (FL-335) Santa Cruz SC-25778
Secondary Goat anti-Rabbit IgG-HRP Santa Cruz SC-2004
Secondary Goat anti-Mouse IgG-HRP Santa Cruz SC-2005
Secondary Donkey anti-Goat IgG-HRP Santa Cruz SC-2020
그 결과, 도 7 및 도 8에서 확인할 수 있듯이, 인산화된 Akt1 단백질 발현이 대조군과 비교하였을 때, smR-167 형질전환 세포에서 유의적으로 감소하였다. 또한, Cdk-2, Cdk-4, 인산화된-Rb, Bcl-2 및 XIAP 단백질의 발현도 유의적으로 감소하였다. 이러한 결과는 smR-167가 IGF-1R 유전자의 3-UTR과 상호작용함으로써 하위 신호전달 경로인 Akt1/mTOR의 인산화 반응을 저해하여 세포주기 및 세포 사멸 인자를 조절함을 시사한다.
실시예 6: 세포주기 및 세포사멸에 미치는 영향 분석
smR-167에 의한 IGF-1R 표적 효과는 Akt/mTOR 경로에 대한 하이포인산화 반응(hypophosphorylation)을 유도하며, 그 결과 세포주기 및 세포사멸 조절 관련 단백질의 발현에 영향을 미친다는 것을 웨스턴 블랏팅 (Western blotting) 실험 결과에서 1차 확인하였다. 이와 관련하여 실제로 smR-167 도입 효과가 세포사멸 및 세포주기를 직접적으로 제어할 수 있는지를 확인하기 위하여 활성화 케스페이즈 3/7 어세이 (Active Caspase 3/7 Assay) 및 플로우 사이토메트리 (Flow Cytometry) (Fluorescence activated cell sorter, FACS) 실험을 수행하였다.
6-1. 세포사멸 과정에서 smR-167에 의한 케스페이즈(Caspase) 3/7 활성화 확인
A549 세포 (1 x 104)를 흰-벽으로 코딩된 96-웰 세포 배양 플레이트 (white-walled 96-well cell culture plate) (Greiner Bio-One, Kyunggi-do, Korea)에 성장시킨 후, 다음날 NC(음성 대조군), smR-167, Anti-167(생체 내 smR-167의 저해제) 및 siRNA-IGF-1R (IGF-1R 표적 효과에 대한 양성 대조군) 미믹을 각각 리포펙타민 2000 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 48 시간 동안 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터에서 세포 내 형질 전환을 유도하였다. 48 시간 이후, 케스페이즈-글루 3/7 시료(Caspase-Glo ® 3/7 reagent) (Promega, Madison, WI, USA)를 제조사의 지시에 따라 각 형질 전환된 세포의 배양액에 처리하고 상온에서 3시간 동안 배양하였다. 이후 발광 (luminescence) 정도에 대한 계측은 루미노미터 (luminometer) (BioTeK Inc., Winooski, VT, USA)를 이용하여 평가하였다. 데이터 분석은 독립적인 각 실험군에서 반복 수행되어 평가되었으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
6-2. 세포주기 및 세포사멸 분석을 위한 세포 준비
A549 세포 (1 x 105)를 6-웰 플레이트에 성장시킨 후, 다음날 NC (음성 대조군), smR-167, Anti-167 (생체 내 smR-167의 저해제) 및 siRNA-IGF-1R (IGF-1R 표적 효과에 대한 양성 대조군) 미믹을 각각 리포펙타민 2000 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 48 시간 동안 세포 내 형질 전환을 유도하였다. 48 시간 후, 세포주기 분석을 위한 과정으로 형질 전환된 세포를 회수하고 70 % 차가운 에탄올에서 약 1 시간 동안 고정하였다. 이어서 원심분리를 이용하여 에탄올을 제거함과 동시에 1X PBS 완충용액으로 세척 및 재현탁을 수행하였다. 이 후, 효율적인 DNA 염색 및 형광 염료의 세포 내 투과성을 용이하게 하기 위하여 Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St, Louis, MO, USA)과 RNase A (Elpis, Daejeon, Korea) 혼합액을 처리한 후, 상온에서 30 분 동안 세포 내 RNA 분해 및 세포 막 투과성 확대 과정을 수행하였다. 이 후 50μg/mℓ의 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide, PI) (Sigma-Aldrich, St, Louis, MO, USA)를 처리하여 세포 내 DNA 염색 과정을 수행하였다. 세포 사멸 분석을 위한 과정은 Annexin V-FITC 결합 및 PI 세포사멸 검출 키트 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 준비하였다. 상기에서 설명된 형질 전환된 세포를 제조사의 지시에 따라 1X 아넥신 파이프 결합 용액 (Annexin V binding buffer)에 재현탁한 다음, Annexin V-FITC/PI 키트를 사용하여 세포 막 내부에 존재하는 포스파티딜세린 (phosphatidylserine)과 DNA의 염색 과정을 수행하였다.
6-3. FACS를 이용한 세포주기 및 세포사멸 분석
세포주기 및 세포사멸 분석은 제조사의 지시에 따라 팩스-칼리버 시스템 (FACS-Calibur system) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)으로부터 유동 세포 계측 분석법 (flow cytometry analysis)을 이용하여 분석하였으며, 계측된 데이터는 셀퀘스트-프로 소프트웨어 (CellQuest-Pro software) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 정량적·상대적 평가를 수행하였다. 여기서 세포주기는 게이팅 도구 (gating tools)를 이용하여 PI 형광 염료에 반응하는 10,000 세포를 분석하였고, 각 세포주기 단계에 해당하는 밀도 (population)를 히스토그램 플롯 (histogram plot)으로 표현하였다. 세포사멸은 게이팅 도구 (gating tools)를 통해 전체 10,000개의 세포에 대한 Annexin V-FITC 및 PI에 대한 형광 강도 또는 값을 평가하였으며, 세포사멸에 대한 분석은 닷 플롯 (Dot plot) 및 히스토그램 플롯 (histogram plot)으로 표현하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에서 확인할 수 있듯이, mR-167 miRNA의 과발현 유도는 세포주기의 G1 population을 상대적으로 증가시키고, Annexin V 및 PI에 대한 양성값을 상대적으로 증가시키는 것을 확인하였다. 이러한 결과는, smR-167은 세포주기의 G1/S -phase transition 저해 및 세포사멸의 촉진을 유도할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 7: smR-167에 의한 세포 증식 억제 효과 확인
신규한 smR-167가 비소세포 폐암세포에서 세포사멸 및 세포주기 조절을 기반으로 증식을 제어하는지 확인하기 위하여 소프트 아가 콜로니 형성 기법 (Soft agar colony formation assay) 및 XTT 증식 분석 기법을 통하여 폐암 세포의 생존도에 미치는 영향을 측정하였다.
7-1. XTT 시험 용액을 이용한 증식률 분석
분석을 위한 세포 준비 과정은 7 종의 비소세포폐암 세포주 (5 x 103, A549, NCI-H1299, SK-LU-1, NCI-H596, NCI-H226, SK-MES-1 및 NCI-H460)를 96-웰 세포 배양 플레이트에 성장시킨 후(도 11), 다음날 Vehicle (미처리), NC (음성 대조군), smR-167 및 Anti-167 (생체 내 smR-167의 저해제) 미믹을 각각 리포펙타민 2000 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 48 시간 동안 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터에서 세포 내 형질 전환을 유도하였다. 이 후, 제조사의 지시에 따라 XTT 표지 용액(XTT labelling reagent) 5㎖을 전자 결합 시약(electron-coupling reagent) 100㎕와 혼합하여 제조 한 XTT 시험 용액 (XTT test solution) (XTT, Roche, Mannheim, Germany)을 각 웰의 세포 배양액에 처리하여 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터에서 2-3 시간 반응 후 VICTOR3 분석기 (PerkinElmer Inc., Foster City, CA, USA)에서 450nm 및 690nm (background) 흡광도 파장을 연속적으로 측정하여 증식률을 평가하였다. 또한 시간에 따른 증식률의 변화를 분석하기 위하여 A549 폐암 세포 (5 x 103) (도 12) 및 WI-38 정상 폐 세포 (1 x 104)를 96-웰 세포 배양 플레이트에 성장시킨 후, 다음날 Vehicle(미처리), NC(음성 대조군), smR-167, Anti-167(생체 내 smR-167의 저해제) 또는 siRNA-IGF-1R(IGF-1R 표적 효과에 대한 양성 대조군) 미믹을 각각 리포펙타민 2000 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 세포 내 형질 전환을 유도한 후, 제조사의 프로토콜에 따라 XTT 시험 용액과 VICTOR3 분석기를 이용하여 3-4 일 동안 24 시간 간격으로 시간 의존적 방식 (time-dependent manner)에서 세포 증식률을 측정하였으며, 그 결과를 도 11 및 도 12에 나타내었다.
그 결과, 도 11 및 도 12에서 확인할 수 있듯이 smR-167가 도입된 경우에는 세포의 증식이 억제되었다.
7-2. 소프트 아가 콜로니 형성 분석 기법을 이용한 증식률 분석
단일 세포의 콜로니 형성능을 평가하는 실험 기법은 고정 배양 독립적인 실험 분석법 (anchorage independent assay)으로 복잡한 구조를 형성하는 생체 내에서 단일 세포의 종양 형성능을 간접적 분석할 수 있다. 이에 따라 smR-167에 의한 증식 조절 기능이 폐암 치료에서 임상적 중요성을 나타낼 수 있는지 그 여부를 평가하기 위하여 다음과 같은 연구를 수행하였다. 세포의 접종 이전에 60-mm 배양 접시에 0.5% 아가로오스(agarose)를 함유하는 RPMI-1640 배양액을 2 mℓ 볼륨으로 예비 코팅하여 세포 배양 접시의 바닥을 베이스 아가로오스 (base agarose)으로 고체화 하였다. 세포의 준비 과정은 A549 폐암 세포 (3 x 105)를 6-웰 플레이트에 성장시킨 후, 다음날 NC(음성 대조군), smR-167, Anti-167 (생체 내 smR-167의 저해제) 또는 siRNA-IGF-1R (IGF-1R 표적 효과에 대한 양성 대조군) 미믹을 각각 리포펙타민 2000 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 세포 내 형질 전환을 유도하였다. 형질 전환의 약 4 시간 후, 세포를 회수하여 헤마토사이토미터 (hemocytometer)을 이용하여 세포 수를 카운트한 후, 형질 전환된 각 7 x 103 세포를 0.3 % 아가로오스(agarose)가 보충된 RPMI-1640 배양액의 최종 2 mℓ 볼륨에서 조심스럽게 재현탁하여 베이스 아가로오스 (base agarose)로 미리 예비 코팅된 배양 접시 상에 적층시켰다. 3주 후, 단일 세포에서 유래된 콜리니를 0.2 % 크리스탈 바이올렛 (Crystal Violet) (Sigma-Aldrich, St, Louis, MO, USA)으로 염색하고 해부 현미경 (dissecting microscope)을 사용하여 콜리니 수 및 크기를 평가하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다. 데이터 분석은 독립적인 실험군에 대해 3 회 반복 수행되었다.
그 결과, smR-167가 도입된 경우에는 콜로니 형성능이 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있다.
실시예 8: smR-167에 의한 세포 운동성 및 이동성(침윤성) 억제 효과 확인
세포 운동성, 이동성 및 침윤성은 2차 전이를 결정하는 중요한 암 발달의 특징이다. 이에 따라, smR-167의 IGF-1R 유전자 조절을 기반으로 폐암 세포에서 세포 운동성 및 이동성에 미치는 영향을 분자생물학적 실험 기법인 생체외(in vitro) 상처 치유 분석 (wound-healing assay)과 트랜스웰 이동 분석 (Trans-well migration assay)을 수행하여 평가하였다.
8-1. 상처 치유 (wound-healing) 분석을 통한 세포 운동성 평가
A549 폐암 세포를 3 x 105 밀도로 6-웰 플레이트에 성장시킨 후, 다음 날 각 웰의 세포층(cell layer)을 멸균 처리된 플라스틱 파이펫 팁 (plastic pipette tip)을 사용하여 일정한 간격으로 긁어냈다. 이어서, 각 웰은 NC (음성 대조군), smR-167, Anti-167 (생체 내 smR-167의 저해제) 또는 siRNA-IGF-1R (IGF-1R 표적 효과에 대한 양성 대조군) 미믹을 리포펙타민 2000 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 세포 내 형질 전환을 유도하였다. 이 후, 형질 전환된 세포는 현미경 (Nikon Inc., Melville, NY, USA; Eclipse 50i)을 사용하여 시간 의존적으로 관찰하고 사진을 기록하였으며, 그 결과를 도 14에 나타내었다.
그 결과, smR-167가 도입된 경우에 세포의 운동성 및 이동성이 현저히 감소하였다.
8-2. 트랜스웰(Trans-well) 이동 분석을 통한 세포 이동성/침윤성 평가
세포 이동성 및 침윤성에 미치는 영향은 트랜스웰(Trans-well) 시스템 (Corning Inc., Corning, NY, USA)을 사용하여 평가하였다. 실험에 앞서, 트랜스-웰 챔버 (플레이트) 내부의 8-mm 구멍 크기를 가진 막은 0.1 % 젤라틴 (Sigma-Aldrich, St, Louis, MO, USA)으로 예비 코팅하였다. 세포의 준비 과정은 이전의 기능 연구와 동일하게 A549 폐암 세포를 각 miRNA 미믹 (NC, smR-167, Anti-167 및 siRNA-IGF-1R)과 리포펙타민 2000 시약의 혼합물을 이용하여 세포 내 형질 전환을 유도하여 준비하였다. 형질전환 4 시간 후, 형질 전환된 세포를 회수하고 헤마토사이토미터 (hemocytometer)를 이용하여 카운팅한 후, 트랜스웰 상단 챔버에서 혈청(FBS)이 없는 배양액 0.2 ㎖에 3 x 104 세포의 밀도로 접종하고, 하부 챔버에 10% 혈청을 함유한 배양액 0.5 ㎖을 채웠다. 세포를 인큐베이터 (5% CO2, 37 ℃)에서 48 시간 동안 배양한 다음, 트랜스-웰 막을 95 % 에탄올에서 고정시킨 후, 0.2% 크리스탈 바이올렛 (crystal violet) (Sigma-Aldrich, St, Louis, MO, USA)을 처리하여 상온에서 30분 동안 트랜스-웰 막 하부로 이동한 세포를 염색시켰다. 세포 이동에 대한 평가는 현미경 (Nikon Inc., Melville, NY, USA; Eclipse 50i)을 이용하여 각 실험군에 대한 트랜스-웰 막 하부 표면의 무작위적 세 영역의 필드로부터 기록되었고, 현미경적 부위당 세포 수를 계측하여 평균 수로 나타내었으며, 그 결과를 도 15에 나타내었다. 데이터 분석은 독립적인 실험군에 대해 3 회 반복 수행되었다.
그 결과, smR-167가 도입된 경우에 세포의 운동성, 침윤성 및 이동성이 현저히 감소하였다.
실시예 9: smR-167의 생체 내 (In vivo)에서 항종양 효과 평가
실험에 사용된 Balb/c 누드 마우스는 오리엔트 바이오(Orient Bio Inc., Seongnam, Korea)에서 구입하여 차의과학대학교의 기관 동물 관리 및 사용위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인된 지침에 따라 무균 동물 실험실 조건 하에서 사용되었다. 또한, 동물 실험을 시작하기 전에 마우스에 가해지는 부담을 최소화하기 위하여 졸래틸 50(Zoletil 50) (Virbac, Carros, France)과 럼푼 (Rompun) 2% (Bayer Korea Ltd., Seoul, Korea)의 혼합 칵테일을 복강 내 주사하여 마취시켰다.
9-1. 피하 종양 세포 이식 모델의 구축 및 miRNA mimic의 투여
마우스의 양쪽 둔부 부위의 피하 내에 1X PBS 완충용액으로 재현탁한 A549 폐암 세포를 3 x 106 밀도로 피하 주사한 후, 5주 동안 무균 동물 실험실에서 성장 또는 안정화 기간을 거쳤다. 5주 후에, 양이온성 리포좀인 리포펙타민 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)과 miRNA mimic (NC, smR-167 및 Anti-167) 또는 PBS (Mock)의 혼합물을 전체 4 주 동안 매주 2 회씩 형성된 종양의 인접한 부위에 직접적으로 피하 주사 하였다 (400 pmol 당 1회 주사; 각 그룹 당 7 마리의 마우스 실험군; A 그룹: 왼쪽 부위-Mock, 오른쪽 부위-NC; B 그룹: 왼쪽-Mock, 오른쪽-smR-167; C 그룹: 왼쪽-Mock, 오른쪽-Anti-167). 주사로부터 총 4 주 후, 종양 조직의 분석을 위하여 희생된 마우스로부터 종양 덩어리를 절제하고 4 % 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)에 보관 하였다.
9-2. 절제된 종양 조직의 분석
절제된 종양에 대한 크기는 캘리퍼스(calliper)를 사용하여 폭(W)과 길이(L)의 위치를 재고, 종양 부피 계산 공식 (W2*L)/2을 활용하여 종양 덩어리의 부피를 분석하였다.
또한, 종양 조직은 4% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)에서 고정화 시킨 후, 면역 염색법 및 TUNEL 분석을 위하여 파라핀(Paraffin)에 매립하고 5μm 크기로 절편화 하였다. 면역조직염색은 파라핀 절편에서 수행하고 슬라이드 상에 장착 하였다. 파라핀 절편은 헤마톡실린과 에오신 (haematoxylin and eosin, H&E)으로 염색하고, 면역조직화학염색법을 위해 항-Ki67 항체 (Santa Cruz, CA, USA; SC-15402)를 사용하여 표지 하였다. 1 차 항체인 항-Ki67은 1:200의 비율로 사용하고 하룻밤 동안 배양하였다. 이어서, 절편을 겨자무과산화효소-결합 2차 항체 (horseradish peroxidase-conjugated (HRP) secondary antibody) (Dako, Seoul, Korea; K4003)를 사용하여 약 2 시간 동안 반응 시켰다. 면역조직화학염색법 (IHC)에 대한 시각화 및 검출은 3,3'-디아미노벤지딘 (diaminobenzidine) 키트 (Thermo Scientific; TA-125-HDX)를 사용하여 수행하였고, 헤마톡실린(haematoxylin)은 IHC 염색에 대한 대비 염색법 (counterstain)으로 사용하였다. TUNEL 분석 (Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP Nick End Labeling assay)에서, 희생된 마우스의 종양 조직을 마찬가지로 4 % PFA로 고정시킨 다음 파라핀에 매립 하였다. 파라핀 절편을 멸균된 정제수(물)에서 탈파라핀화 (deparaffin) 시키고 내인성 퍼옥시다아제 (endogenous peroxidase)의 반응을 해소(quench)하기 위해 실온에서 10분 동안 3 % H2O2에 두었다. 그런 다음, TUNEL 분석은 제조사의 지시에 따라 TUNEL 세포사멸 검출 키트 (TUNEL Apoptosis Detection Kit) (Upstate Biotechnology, Charlottesville, VA, USA)를 사용하여 수행하였다. H&E, 항-Ki67 IHC 및 TUNEL 샘플에 대한 이미지화는 염색된 조직 절편의 임의의 위치를 현미경 (Nikon Inc., Melville, NY, USA; Eclipse 50i)과 아이-솔루션 이미지 분석기 (i-solution image analyser) (Daejeon, Korea)를 사용하여 기록하고 분석하였다(갈색의 핵 염색 결과는 항-Ki67과 TUNEL에 대한 양성도를 나타낸다). 그 결과를 도 16 및 도 17에 나타내었다.
그 결과, 도 16 및 도 17에서 확인할 수 있듯이 smR-167가 도입된 경우에 종양의 크기가 감소하였으며, 세포 또한 감소 및 사멸되었다. 이러한 결과는, 항증식 효과에는 종양 세포의 증식 억제 및 세포 사멸 과정이 촉진됨을 시사한다.
실시예 10: 생체 내 생물 발광 이미징(BLI)을 이용한 smR-167의 항전이 효과 분석
전이성 폐암 동물 모델의 경우, 전이의 진행 과정에 대한 실시간 분석이 힘들며, 또한 적출된 폐 표면에 발생된 결절(Nodule)은 크기와 모양이 제각기 다르기에 객관적인 평가가 어렵고 분석에 대한 신뢰성이 현저히 낮아지는 문제점이 있다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 생체 내 (in vivo) 생물 발광(bioluminescence) 이미징 기법을 적용하여 가시광선 파장이 길어 조직 투과성이 용이한 루시퍼라아제를 상시 안정적으로 발현하는 A549 폐암 세포주를 구축하였고, 이로부터 smR-167이 생체 내 전이 과정에 미치는 영향을 평가하였다.
10-1. 파이어-플라이 루시퍼라아제(firefly luciferase, Fluc)를 상시 안정적으로 발현하는 폐암 세포주 확립
파이어플라이 루시퍼라아제를 상시 발현하는 A549 폐암 세포주는 CMV 프로모터 기반 pGL 4.51 벡터(Promega, Madison, WI, USA)를 리포펙타민 2000 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 단일 세포의 게놈에 무작위로 통합시켜 만들었다. 형질 감염된 단일 세포의 구분은 G418 (800 μg/ml, Gibco, Grand Island, NY)을 함유하는 배양액을 약 2주 동안 처리하여 선별하고, 2주 후에 형질 감염된 단일세포로부터 형성한 단일 콜로니를 채취하여 수집 하였다. 수집된 콜로니는 6-웰 플레이트로 옮겨졌고 이어서 계대 배양을 통해 100-mm 배양 접시에 옮겨져 유지되었다. 이 후, D-루시페린 생물 발광 기질 (D-luciferin substrate) (Xenogen; PerkinElmer, Waltham, MA, USA)을 처리 한 후, 루미노미터 (luminometer) (BioTeK Inc., Winooski, VT, USA)에서 생물 발광의 활성도를 평가함으로써 파이어플라이 루시퍼라아제 (Fluc)를 상시 발현하는 A549 폐암 세포주를 최종 선별하였다. 선별된 세포주의 배양 및 유지 조건은 10% 소태아혈청 (Fetal Bovine Serum, FBS) (Welgene, Gibco), G418 (800 μg/ml, Gibco, Grand Island, NY), 1% 페니실린 (100 U/mℓ, Welgene) 및 스트렙토마이신 (100 μg/mℓ, Welgene)의 혼합 RPMI-1640 배양액으로 유지하였으며, 5% CO2의 대기 조건과 37 ℃에서 배양하였다.
10-2. 전이성 폐암 동물 모델 구축 및 생물 발광 이미징 분석
생체 내 실험에 사용된 Balb/c 누드 마우스는 오리엔트 바이오 (Orient Bio Inc., Seongnam, Korea)에서 구입하였으며, CHA 대학의 IACUC의 승인된 지침에 따라 무균 동물 실험실 조건 하에서 사육되었다. 또한, 동물 실험을 시작하기 전에 졸래틸 50 (Zoletil 50) (Virbac, Carros, France)과 럼푼 (Rompun) 2% (Bayer Korea Ltd., Seoul, Korea)의 혼합 칵테일을 복강 내 주사하여 마취시킨 후에 수행하였다. 세포의 준비 과정은 상기에서 설명된 Fluc-상시 발현 A549 세포로부터 NC, smR-167 및 Anti-167 미믹을 리포펙타민 2000 시약으로 형질 전환을 유도하였다. 약 6 시간 후, 각 형질 전환된 Fluc-A549 세포를 회수하고, 1X PBS 완충용액에 재현탁한 다음 헤마토사이토미터 (hemocytometer)을 이용하여 세포 수를 카운트하였다. 1x PBS 완충용액 100 μℓ에 형질 전환된 각 1 x 106 세포의 계수로 재분배한 다음, 24 마리의 마우스의 꼬리정맥으로 천천히 주사하여 폐 전이성 폐암 동물 모델을 구축하였다 (8 마리 당 각 그룹으로 분류). 생물 발광 이미징 분석은 D-루시페린 기질 (Xenogen; PerkinElmer, Waltham, MA, USA)의 100 μℓ (150 mg/kg)을 각 마우스의 복강으로 주사한 10 분 후에 IVIS 200 이미징 시스템 (Xenogen Corporation, Berkeley, CA, USA)을 이용하여 Fluc의 활성도를 관찰하였다. 데이터는 리빙 이미지 3D 소프트웨어 (Living Image 3D Software, version 3.0) (Xenogen; PerkinElmer)를 사용하여 분석하였고, Fluc 활성에 대한 평가는 관심 영역 (region of interest, ROI) 게이트 도구를 이용하여 정량화 하였다(도18 및 도 19).
H&E 염색법은 상기의 절제된 종양 조직의 분석 항목에서 설명된 방법으로 수행하였으며(도 20), 생물 발광 이미징 (BLI) 분석에 대한 자세한 설명은 PerkinElmer Inc.가 제공하는 IVIS 이미징 프로토콜을 참조하여 수행하였다.
그 결과, 도 18 내지 도 20에서 확인할 수 있듯이, smR-167 그룹의 경우의 폐로의 종양 전이가 대조군 및 smR-167 저해제 그룹 대비 현저히 낮음을 알 수 있다.
실시예 11: smR-167 miRNA의 표적 유전자 조절 효과 확인
smR-167 miRNA의 표적 유전자 조절 효과를 확인하기 위하여 웨스턴 블랏팅을 이용한 단백질 밴드 검출 및 NIH image J 프로그램을 이용한 단백질 반정량 분석은 상기 실시예 5-1과 동일한 방법으로 실험하였으며, XTT 시험 용액을 이용한 세포의 증식률 실험은 상기 실시예 7-1에 기재된 방법과 동일하게 진행하였다. 그 결과를 도 21 내지 도 23에 나타내었다.
그 결과, 도 21 내지 도 23에서 확인할 수 있듯이, smR-167 miRNA 유도체 도입 효과는 폐암 세포뿐만 아닌 다양한 발암성 세포에서 IGF-1R 조절 효과를 나타내며, 특히 정상 폐 세포에서 내재적인 smR-167의 저해시 IGF-1R의 증가와 더불어 세포증식이 촉진되는 것을 확인할 수 있다.
<110> College of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel miRNA smR-167 and use thereof for treating and preventing lung cancer <130> P18-0172 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 cggaaugggg gggggggccg 20

Claims (15)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 구성된 smR-167 miRNA.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 miRNA는 인간 폐 또는 폐암 세포로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 smR-167 miRNA.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 miRNA는 IGF-1R의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 smR-167 miRNA.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 miRNA는 인간 폐 또는 폐암 세포의 증식 및 이동을 억제하는 것을 특징으로 하는 smR-167 miRNA.
  5. 제1항의 smR-167 miRNA를 포함하는 발현벡터.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 발현벡터는 비-바이러스성 벡터 또는 바이러스성 벡터인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  7. 제5항의 발현벡터를 숙주세포에 형질전환시킨 형질전환체.
  8. 제1항의 smR-167 miRNA 또는 제5항의 발현벡터를 포함하는 비소세포폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제1항의 smR-167 miRNA의 검출을 위한 프라이머쌍, 프로브 또는 항체를 포함하는 비소세포폐암 진단용 키트.
  10. 1) 피검 개체에서 분리된 시료에서 제1항의 smR-167 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 smR-167 miRNA의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 감소된 개체를 선별하는 단계; 및
    3) 상기 단계 3)에서 선별된 개체를 비소세포폐암 또는 비소세포폐암에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계; 를 포함하는, 비소세포폐암 진단의 정보를 제공하기 위한 유전자 검출 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 smR-167 miRNA의 발현 수준은 실시간 RT-PCR에 의한 것을 특징으로 하는 비소세포폐암 진단의 정보를 제공하기 위한 유전자 검출 방법.
  12. 1) 피검 조성물 또는 화합물을 제 1항의 smR-167 miRNA 발현 세포에 처리하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 smR-167 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)의 발현 수준이 무처리 대조군의 발현 수준에 비해 증가하는 피검 조성물 또는 화합물을 선별하는 단계; 를 포함하는, 비소세포폐암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 smR-167 miRNA의 발현 수준은 RT-PCR에 의한 것을 특징으로 하는 비소세포폐암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
  14. 1) 피검 조성물 또는 화합물을 제 1항의 smR-167 miRNA 및 IGF-1R 발현 세포에 처리하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 smR-167 miRNA 및 IGF-1R의 결합 수준 및 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)의 발현 수준이 무처리 대조군의 발현 수준에 비해 증가하는 피검 조성물 또는 화합물을 선별하는 단계; 를 포함하는, 비소세포폐암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 smR-167 miRNA 및 IGF-1R의 결합 수준은 웨스턴 블랏팅, 이중 루시퍼라아제 리포터 유전자 분석법 또는 실시간 RT-PCR에 의한 것을 특징으로 하는 비소세포폐암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
KR1020180111075A 2018-09-17 2018-09-17 신규한 miRNA smR-167 및 폐암 예방 또는 치료를 위한 이의 용도 KR102097794B1 (ko)

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