CN102056631A - 细胞凋亡诱导物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种作用剂、组合物和产品，其包括至少一种细胞凋亡诱导物质，和至少一种可抑制细胞凋亡抑制物质的表达和/或活性的物质；一种使用上述所用剂、组合物或产品中的一种或多种来诱导凋亡或治疗增殖性疾病(proliferative disease)的方法；一种核酸构建体，其包括编码待表达蛋白的核酸分子和可抑制不期望的蛋白表达的核酸分子；和一种用于在细胞内表达期望蛋白的同时抑制不期望的蛋白表达的方法。

Description

细胞凋亡诱导物

技术领域

相关申请援引

本申请要求获得2008年4月11日递交的美国临时专利申请流水号No.61/044,061的权利，本文通过提述并入其全部内容。

本发明涉及用于诱导细胞凋亡的作用剂、组合物和产品；使用所述作用剂、组合物或产品诱导细胞凋亡或治疗增殖性疾病的方法；包含编码待表达蛋白的核酸分子和可抑制不期望的蛋白表达的核酸分子的核酸构建体；和在细胞内表达期望蛋白同时抑制不期望的蛋白表达的方法。

背景技术

p53是最重要的肿瘤抑制基因之一。在大约一半的人类癌症中p53由于p53基因的突变而直接导致失活(Hollstein et al.，Science 1991；253：49-53，Levine et al.，Nature 1991；351：453-6)。在其它癌症中，p53通过与病毒癌蛋白的结合，或者是由于参与p53信号网络的基因的改变而失活(Vogelstein et al.，Nature 2000；408：307-10)。而且，p53的突变或删除与不良预后以及对化疗和放射的耐受有关(Clarke et al.，Oncogene 1994；9：1767-73，Merritt et al.，Cancer Res 1994；54：614-7，Poeta et al.，N Engl J Med 2007；357：2552-61，Patocs et al.，N Engl J Med 2007；357：2543-51)。

载体介导的p53基因转移被认为是一种潜在有效的癌症治疗方法。实际上，腺病毒介导的p53基因治疗正在头颈癌(III期)、非小细胞肺癌(II期)、乳腺癌(II期)和食道癌(II期)的患者中实施临床试验(INGN 201：Ad-p53，Ad5CMV-p53，adenoviral p53，p53 gene therapy--introgen，RPR/INGN 201.Drugs R D 2007；8：176-87)。然而，p53的基因转移并不是对所有癌症都有良好的治疗效果(Roth et al.，Nat Med 1996；2：985-91，Swisher et al.，J Natl Cancer Inst 1999；91：763-71，Nemunaitis et al.，J Clin Oncol 2000；18：609-22)。因此，需要对p53介导的基因治疗进行进一步的改进。

p53的活化受多种细胞应激的诱导，例如DNA损伤、癌基因激活、纺锤体损伤和缺氧。活化的p53会反式激活多种基因，其中许多参与DNA修复、细胞周期阻滞和细胞凋亡(Riley et al.，Nat Rev Mol Cell Biol 2008；9：402-12)。根据细胞的类型和应激的强度，p53活化可诱导细胞周期阻滞或者细胞凋亡(Zhang et al.，Environ Health Perspect 2007；115：653-8)。然而，调节细胞是经历细胞周期阻滞还是细胞凋亡的确切机制仍然未知。

发明概要

技术问题

本发明的一个目的是提供一种产品，其即使在对常规的p53基因转移有耐受性的癌症中仍然具有良好的治疗效果。

解决问题的方案

现在已经显示，通过同时抑制p53靶定的参与细胞周期阻滞的基因(例如p21)的表达，可以显著提高p53介导的基因治疗的效果(el-Deiry et al.，Cell1993；75：817-25，Dulic et al.，Cell 1994；76：1013-23，Deng et al.，Cell 1995；82：675-84，Brugarolas et al.，Nature 1995；377：552-7)。已知，参与细胞周期阻滞的基因通过以抗细胞凋亡的方式力图恢复基因组的完整性(Chan et al.，Genes Dev 2000；14：1584-8，Waldman et al.，Nat Med 1997；3：1034-6，Waldman et al.，Nature 1996；381：713-6)。另一方面，有证据显示，这类基因还抑制细胞的生长，导致肿瘤抑制。事实上，p21缺失小鼠的肿瘤易感性增加(Van Nguyen et al.，J Exp Med 2007；204：1453-61，Poole et al.，Oncogene 2004；23：8128-34，Martin-Caballero et al.，Cancer Res 2001；61：6234-8，Barboza et al.，Proc Natl Acad Sci U S A 2006；103：19842-7)，并且缺少p21的小鼠在暴露于致癌物之后更容易发生恶性皮肤肿瘤(Topley et al.，Proc Natl Acad Sci U S A1999；96：9089-94，Philipp et al.，Oncogene 1999；18：4689-98)。

在单剂量γ辐射之后，p21缺陷小鼠发生更多的肿瘤，并且肿瘤具有更高的转移潜力(Jackson et al.，Cancer Res 2003；63：3021-5)。此外，已有显示，抑制p21可诱导细胞周期推进(progression)，导致细胞增殖增加(van de Wetering et al.，Cell 2002；111：241-50，Gartel et al.，Cancer Res 2005；65：3980-5)。因此，抑制p21被认为会增加肿瘤进展的危险。总之，抑制参与细胞周期阻滞的基因对指向p53的基因治疗的效果的影响是不可预知的。因此，本发明的发现显示抑制细胞周期阻滞基因可提高p53诱导的肿瘤抑制，这是令人惊讶的。

因此，在一个方面中，本发明提供了一种作用剂、组合物或产品，其包括至少一种凋亡诱导物质，和至少一种可抑制凋亡抑制物质的表达和/或活性的物质。

在一个实施方案中，所述凋亡诱导物质是凋亡诱导蛋白和/或编码该蛋白的核酸分子。

在一个实施方案中，所述凋亡诱导蛋白是53家族的蛋白。

在一个实施方案中，所述凋亡抑制物质受所述凋亡诱导物质的诱导。

在一个实施方案中，该凋亡抑制物质从下组中选出：参与细胞周期阻滞的蛋白、泛素连接酶、和p53家族蛋白的显性失活变异体。

在一个实施方案中，参与细胞周期阻滞的蛋白从下组中选出：p21、SFN、Gadd45、和p300。

在一个实施方案中，所述泛素连接酶是MDM2。

在一个实施方案中，可抑制凋亡抑制物质的表达和/或活性的物质是核酸分子，其可抑制该凋亡抑制物质或编码该抑制物的基因的表达。

在一个实施方案中，可抑制凋亡抑制物质表达的核酸分子从下组中选出：反义核酸、核酶、适体(aptamer)和RNAi效应物。

在一个实施方案中，所述凋亡诱导蛋白和/或编码该蛋白的核酸分子与可抑制凋亡抑制物质表达和/或活性的物质作为单一物质存在。

在一个实施方案中，所述作用剂、组合物或产品形成为单一载体或单一核酸构建体，其包含编码凋亡诱导蛋白的核酸分子和可抑制凋亡抑制物质的表达的核酸分子。

在一个实施方案中，编码凋亡诱导蛋白的核酸分子和可抑制凋亡抑制物质的表达的核酸分子与相同的调节序列(例如启动子和增强子)可操作连接。

在一个实施方案中，编码凋亡诱导蛋白的核酸分子和可抑制凋亡抑制物质的表达的核酸分子被表达为单一初级转录本。

在一个实施方案中，编码凋亡诱导蛋白的核酸分子和可抑制凋亡抑制物质的表达的核酸分子被共顺反子地表达(expressed co-cistronically)。

在另一个实施方案中，凋亡诱导蛋白和/或编码该蛋白的核酸分子与可抑制凋亡抑制物质的表达和/或活性的物质作为各别的物质存在。

在一个实施方案中，所述作用剂、组合物或产品用于治疗增殖性疾病。

在一个实施方案中，所述增殖性疾病选自下组：良性和恶性肿瘤、增生(hyperplasia)、瘢痕疙瘩、库欣综合征、原发性醛固酮增多症、粘膜红斑病、真性红细胞增多症、白斑、增生性瘢痕、扁平苔藓和着色斑病。

在另一方面中，本发明提供了用于诱导细胞凋亡的方法，包括：

(a)提供上述作用剂、组合物或产品，和

(b)在细胞内诱导所述作用剂、组合物或产品。

在一个实施方案中，所述作用剂、组合物或产品选自下组：带有编码凋亡诱导蛋白的核酸分子与可抑制凋亡抑制物质的表达和/或活性的核酸分子的载体，或者由带有编码凋亡诱导蛋白的核酸分子的载体与带有可抑制凋亡抑制物质的表达和/或活性的核酸分子的载体组成的载体组。

在另一个方面中，本发明提供了一种核酸构建体，其包括：

编码待表达蛋白的核酸分子，和

可抑制不期望的蛋白表达的核酸分子。

在一个实施方案中，待表达的蛋白质是凋亡诱导蛋白。

在一个实施方案中，凋亡诱导蛋白是p53家族蛋白。

在一个实施方案中，不期望的蛋白是细胞凋亡抑制蛋白。

在一个实施方案中，细胞凋亡抑制蛋白选自下组：参与细胞周期阻滞的蛋白、泛素连接酶、和p53家族蛋白的显性失活变异体。

在一个实施方案中，编码待表达蛋白的核酸分子和可抑制不期望的蛋白表达的核酸分子与相同的调节序列(例如启动子和增强子)可操作连接。

在一个实施方案中，编码待表达蛋白的核酸分子和可抑制不期望的蛋白表达的核酸分子被表达为单一初级转录本。

在一个实施方案中，编码待表达蛋白的核酸分子和可抑制不期望的蛋白表达的核酸分子被共顺反子地表达。

在另一个方面中，本发明提供了包含上述核酸构建体的载体。

在另一个方面中，本发明提供了用于在细胞内表达期望蛋白而同时抑制不期望的蛋白表达的方法，包括：

(a)提供上述核酸构建体和/或载体，和

(b)将该核酸构建体和/或载体引入到细胞内。

发明的有利效果

通过使用本发明的作用剂、组合物、产品或方法，有可能在对单独使用凋亡诱导蛋白的治疗耐受的细胞(如肿瘤细胞)内诱导细胞凋亡，从而可以预期为医学和兽医学领域做出较大的贡献。而且，本发明的核酸构建体或载体使得在细胞内表达期望蛋白的同时抑制不期望的蛋白的表达成为可能，这可以有多种应用，特别是在不期望的蛋白被期望蛋白的表达所诱导的场合。

附图简述

[图1]图1显示了三种不同p21特异的pre-miRNA：miR-p21A、B和C的折叠结构。相应于人p21靶定序列的双链RNA用粗体显示(miR-p21A：5′AUAGGGUGCCCU-UC-UUCUUGUG 3′，3′AUCCCACGGGA--AAGAACA C 5′；miR-p21B：5′AGCUGCCUGAG-GU-AGAACUAG 3′，3′UCGACGG ACUC--UCUUGAU 5′；miR-p21A：5′AAUACUCCAAG-UA-CACUAAGC3′，3′UUAUGAGGUUC--GUGAUUCG 5′)。

[图2]图2显示p21的表达被人工miRNA抑制。HEK293细胞用miRNA表达质粒pcDNA6.2-miR-p21A，pcDNA6.2-miR-p21B和pcDNA6.2-miR-p21C转染，它们编码三种不同的p21特异的人工miRNA(分别是miR-p21A，B和C)。还用对照质粒pcDNA6.2-miR-对照(miR-对照)转染细胞。转染24小时后，用抗-p21和抗-肌动蛋白抗体通过Western印迹对总细胞裂解物进行分析。

[图3]图3显示在用阿霉素(多柔比星)处理的细胞内，p21的表达被人工miRNA抑制。HCT116细胞用pcDNA6.2-miR-p21A、B和C的混合物(miR-p21mix)或对照载体(miR-对照)转染。24小时后，培养基更换为含有或者不含0.5微克/ml阿霉素的新鲜培养基。转染24小时后，用抗-53，-p21和-肌动蛋白抗体通过Western印迹对总细胞裂解物进行分析。

[图4]图4显示在用p53表达载体处理的细胞内，p21的表达被人工miRNA抑制。HEK293细胞用所示量的pCMV-Tag2-FLAG-p53(FLAG-p53)以及编码串联的系列miR-p21A、B和C的pcDNA6.2-miR-p21(miR-p21)或者对照载体(miR-对照)共转染。转染24小时后，用抗-53，-FLAG，-p21和-肌动蛋白抗体通过Western印迹对总细胞裂解物进行分析。

[图5]图5是本实施例所用质粒载体的示意图。载体从亲本质粒(parental plasmid)pcDNA6.2-GW/miR产生。p53 ORF，其包含FLAG表位的序列，被插入在由多个miRNA构成的簇的5’侧。因此，pcDNA6.2-p53/miR-p21能够例如在CMV启动子的控制下在一个初级转录本中共顺反子地表达带FLAG标签的p53蛋白和三种不同的p21特异miRNA。

[图6]图6显示了用单个质粒载体诱发的p53表达和p21抑制。HEK293细胞用标明的载体(如图5所述的载体)转染。转染24小时后，用抗-53，-p21和-肌动蛋白抗体通过Western印迹对总细胞裂解物进行分析。

[图7]图7显示了使用单个质粒载体在用阿霉素处理的细胞内诱发的p53表达和p21抑制。SW480和p53(-/-)HCT116细胞用标明的载体转染(泳道1和5，pcDNA6.2-p53/miR-p21；泳道2和6，pcDNA6.2-p53/miR-对照；泳道3和7，pcDNA6.2-miR-p21；泳道4和8，pcDNA6.2-miR-对照)。(+)和(-)分别指示存在和不存在p53和miR-p21表达。24小时后，将培养基用含有(泳道1-4)或不含(泳道5-8)0.5微克/ml阿霉素的新鲜培养基代替，再将细胞温育24小时。用抗-53，-p21和-肌动蛋白抗体通过Western印迹分析总细胞裂解物。

[图8]图8显示了在用不同剂量的表达p53及p21-特异miRNA的重组腺病毒处理后的细胞内诱发的p53表达和p21抑制。p53(-/-)HCT116细胞用Ad-p53/miR-p21(泳道1，3，5和7)或Ad-p53/miR-对照(泳道2，4，6和8)以标明的moi转染。转染24小时后，用抗-53，-p21和-肌动蛋白抗体通过Western印迹对总细胞裂解物进行分析。

[图9]图9显示了在用表达p53及p21-特异miRNA的重组腺病毒处理的细胞内诱发的p53表达和p21抑制(上面3行)，以及标明的mRNA的表达(下面5行)。p53(-/-)HCT116细胞用标明的重组腺病毒以100moi转染。转染24小时后，用抗-53，-p21和-肌动蛋白抗体通过Western印迹对总细胞裂解物进行分析。还用RT-PCR对载体来源的miRNA，p21和GAPDH的mRNA表达进行了分析。靶标A-B：包括miR-p21A和B的靶位点(1327-1493)。靶标C：包括miR-p21C的靶位点(1525-1677)。ORF：包括ORF(523-778)。位置编号是基于p21的mRNA序列(GenBank登录号：NM_000389)。

[图10]图10显示了在用表达p53和p21特异的miRNA的重组腺病毒处理的细胞中诱发的p21抑制。p53(-/-)HCT116细胞用Ad-p53/miR-p21或Ad-p53/miR-对照以100moi转染。转染24小时后，用抗-FLAG兔多克隆抗体(红色)、抗-p21小鼠单克隆抗体(绿色)和4，6-二脒-2苯基吲哚(DAPI，蓝色)进行免疫荧光染色。

[图11]图11显示了用表达p53及p21特异性miRNA的重组腺病毒处理的不同细胞中诱发的p53表达和p21抑制。HLF、Hep3B和DLD1细胞用标明的重组腺病毒以200moi转染(泳道1，5和9：Ad-p53/miR-p21；泳道2，6和10：Ad-p53/miR-对照；泳道3，7和11：Ad-模拟/miR-p21；泳道4，8和12：Ad-模拟/miR-对照)。转染24小时后，用抗-53，-p21和-肌动蛋白抗体通过Western印迹对总细胞裂解物进行分析。

[图12]图12显示了在各种用表达p53与p21特异性miRNA的重组腺病毒处理的细胞中经历细胞凋亡的细胞的比例。HLF、Hep3B和DLD1细胞用标明的重组腺病毒转染，然后在转染48小时后用流式细胞仪进行分析。显示了处于sub-G1的细胞百分比(上图)。还显示了三个独立实验的平均数(下图)。误差线指示S.E.，p-值通过Student′s t检验计算而得。

[图13]图13显示了在用表达p53与p21特异性miRNA的重组腺病毒处理的细胞中诱发的p53表达和p21抑制。SW480细胞用标明的腺病毒以200moi感染(泳道1和5：Ad-p53/miR-p21；泳道2和6：Ad-p53/miR-对照；泳道3和7：Ad-模拟/miR-p21；泳道4和8：Ad-模拟/miR-对照)。24小时后，将培养基用含有(泳道1-4)或不含(泳道5-8)0.5微克/ml阿霉素的新鲜培养基代替，并对细胞再温育24h。用抗-53，-p21和-肌动蛋白抗体通过Western印迹对总细胞裂解物进行分析。

[图14]图14显示了在用表达p53与p21特异性的miRNA的重组腺病毒处理的细胞中胱天蛋白酶-3的活性。胱天蛋白酶-3活性在腺病毒感染后72小时测定。用和不用阿霉素处理的细胞分别用灰色和黑色柱指示。胱天蛋白酶-3活性相对于用阿霉素处理的Ad-模拟/miR-对照感染细胞加以标准化。

[图15]图15显示了在用表达p53和p21特异的miRNA的重组腺病毒处理的细胞中经历细胞凋亡的细胞的比例。细胞DNA含量用流式细胞仪进行分析。显示了处于sub-G1的细胞百分比(上图)。还显示了三次独立实验的平均值(下图)。误差线指示S.E.，p值用Student′s t检验计算而得。

[图16]图16显示了腺病毒介导的p53和p21特异性的miRNA的表达在肿瘤发生的体内异种移植模型中的治疗效果。SW480和DLD1细胞被皮下注射到裸鼠体内。当肿瘤体积达到100mm³时，在第0/1和2天将标明的腺病毒载体直接注射到肿瘤内(箭头指示)。Ad-p53/miR-p21，实心圆；Ad-p53/miR-对照，空心圆；Ad-模拟/miR-p21，实心方形；Ad-模拟/miR-对照，空心方形。数据代表注射了腺病毒的三个独立肿瘤的平均体积。每个肿瘤的体积被表示为相对于第0天的体积的大小，第0天的体积被设定为1。误差线指示S.E.，p值用Student′s t检验计算而得。

实施方案详述

除非在本说明书中特别指出，否则本发明所用的科学和技术术语具有本领域技术人员所通常理解的意思。一般地，本说明书中关于细胞核组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、基因、蛋白质和核酸化学、和杂交使用的术语和技术是本领域众所周知并且通常使用的。一般地，除非另外指出，否则本发明方法和技术都是根据本领域众所周知，并且在本说明书中所引用或讨论的各种一般性和专业出版物中有介绍的标准方法来实施。这些出版物包括，例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)和Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3d ed.，Cold Spring Harbor Press(2001)；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates(1992，和2000版补充)；Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology-4th Ed.，Wiley&Sons(1999)；Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1990)；和Harlow and Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)等，所有这些出版物，本文通过提述并入它们的全部内容。

酶反应和纯化技术是根据制造商提供的使用说明，依照本领域所通常使用的方式或者按照本说明书所述来实施。本说明书中关于分析化学、合成有机化学、医学化学和药物化学所用的术语、实验流程和技术是本领域众所周知并且通常使用的。在作用剂的化学合成、化学分析、生产、剂型和输送以及在受试者处理中采用的是标准技术。

除非在内容中清晰指出，否则本文所用的单数形式“一个”、“与”和“该”包括多个指示物。除了在实施例中或者特别指出的地方之外，本申请书中所用的所有表示成分、反应条件等的量的数字在所有情况下都应当理解为被术语“大约”所修饰。因此，除非特别指出，否则本申请书中提出的数字参数均是近似的，可以根据预期通过本发明获得的期望性质而加以改变。而且，除非另外指出，否则术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可以互换使用。

在本发明中，提供了这样的作用剂、组合物或产品，其包括凋亡诱导物质和可抑制凋亡抑制物质的表达和/或活性的物质。

如这里所使用的，凋亡诱导物质包括任何能够诱导细胞中凋亡的物质，包括但不仅限于，至少一种小分子，和/或蛋白质和编码所述蛋白的核酸分子。能够诱导凋亡的小分子包括，但不仅限于，多柔比星、铂络合物，例如卡铂、顺铂和奈达铂。在一个实施方案中，本发明使用的细胞凋亡诱导性小分子通过诱导如下定义的凋亡诱导蛋白诱发细胞凋亡。

本发明使用的凋亡诱导蛋白包括，但不仅限于，p53家族蛋白如p53、p63、p73，和其同种型、嵌合体和功能片段。人p53、p63和p73的核酸序列可以在GenBank数据库中获得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，登录号分别是NM_000546，NM_003722和NM_005427。p53的核酸序列在这里还被表示为SEQ ID NO：9。其它动物的序列也可以在公众可得的数据库例如GenBank中找到：NM_001003210(狗的p53)，NM_001009294(猫的p53)，XM_545249(狗的p63)，AY069989(狗的p73)。

P53家族的蛋白以各种同种型，例如p53 beta，gamma，p73 alpha，beta，gamma，delta，epsilon，theta，zeta，eta，p63 alpha，beta，gamma存在，这主要是由于剪接所致，所有这些均包含在本发明所用的凋亡诱导蛋白内。此外，p53家族的蛋白享有高度同源的结构域，即反式激活域(TA)、DNA结合域(DBD)和寡聚化域(OD)，这些结构域参与蛋白的功能(见例如Stiewe，Nat Rev Cancer.2007；7(3)：165-8)。因此，本发明所用的凋亡诱导蛋白还包括p53家族蛋白的包括反式激活域、DNA结合域和寡聚化域的功能片段。功能片段的功能性可以通过检测通常被全长蛋白诱导的基因来测定，在p53的场合，这样的基因例如p21，SFN，Gadd45，BTG2，CAV1，DUSP5，EGFR，HGF，MET，PCNA，PLAGL1，SESN1，SH2D1A，TGFA，PCBP4，RRM2B，STEAP3，ARID3A，C13orf15，CCNG1，CCNK，DDB2，DDIT4，GML，GPX1，HRAS，IBRDC2，MET，MSH2，PLK2，RB1，S100A2，TP53i3，TRIM22和VCAN。

本发明所用的凋亡诱导蛋白还包括p53家族的嵌合蛋白(见例如JP2000-354488A)。这些嵌合蛋白包括任何单个p53家族成员的反式激活域，任何单个相同成员或者其它p53家族成员的DNA结合域，和任何单个相同成员或者其它p53家族成员的寡聚化域。这些嵌合体所用的每个域可以来自p53家族的相同蛋白或不同蛋白。例如，嵌合蛋白可以包括p53的反式激活域、p63的DNA结合域和p73的寡聚化域，等等。

如这里所使用的，凋亡诱导蛋白意图包括其从下组中选出的功能突变体：

i)具有在凋亡诱导蛋白氨基酸序列中发生一个或多个，或者一个或数个突变而成的氨基酸序列，但是仍然能够诱导凋亡的多肽；

ii)由在严格条件下与编码凋亡诱导蛋白的核酸分子杂交的核酸分子或其互补链或片段编码，并且能够诱导细胞凋亡的多肽；和

ii)与凋亡诱导蛋白的氨基酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或者至少95％同源性，并且能够诱导细胞凋亡的多肽。

类似地，编码凋亡诱导蛋白的核酸分子意图包括其从下组中选出的其功能突变体：

i)具有在编码凋亡诱导蛋白核苷酸序列中发生一个或多个，或者一个或数个突变而成的核苷酸序列，但是仍然编码能够诱导细胞凋亡的多肽的核酸分子；

ii)在严格条件下与编码凋亡诱导蛋白的核酸分子、或其互补链或片段杂交，并且编码能够诱导细胞凋亡的多肽的核酸分子；和

ii)与编码凋亡诱导蛋白的核苷酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或者至少95％同源性，并且编码能够诱导细胞凋亡的多肽的核酸分子。

这里使用的术语“严格条件”是指本领域众所周知的参数。用于核酸杂交的参数在标准实验规程中有介绍，例如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3d ed.，Cold Spring Harbor Press(2001)，或Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates(1992)。

具体地，本说明书中使用的严格条件是指通过含有3.5x SSC，Ficoll0.02％，聚乙烯吡咯烷酮0.02％，牛血清白蛋白0.02％，NaH₂PO₄ 25mM(pH7)，SDS 0.05％，和EDTA 2mM的杂交缓冲液在65度实施的杂交。在上述组分中，SSC是0.15M氯化钠/0.15M乙酸钠，pH 7，SDS是十二烷基硫酸钠，EDTA是乙二胺四乙酸。杂交后，在室温下用2x SSC清洗转移有DNA的膜，然后在最高68摄氏度的温度下用0.1-0.5x SSC/0.1x SDS清洗。或者，严格杂交可以采用制造商介绍的杂交和清洗条件，使用商业的杂交缓冲液例如ExpressHyb^(R)缓冲溶液(由Clontech公司制造)。

还可以使用其他的条件、试剂等获得相同程度的严格性，但是因为本领域技术人员非常熟悉这些条件，所以在本说明书中没有具体介绍它们。然而，有可能进行条件控制使得编码兴趣核酸分子或蛋白突变体的核酸的同源物或等位基因能够被清晰地鉴定出来。

在本发明中使用的凋亡诱导物质的细胞凋亡诱导性质可以通过任何合适的方法进行评估，这些方法包括但不仅限于，比较存在或不存在候选物情况下凋亡的程度或者正在经历凋亡的细胞比例。凋亡的程度可以通过例如测量胱天蛋白酶-3活性来进行评估，正在经历细胞凋亡的细胞比例可以通过例如测量处于sub-G1期的细胞的比例来进行评估(见实施例)。

如这里所使用的，凋亡抑制物质包括任何能够抑制细胞中的凋亡的蛋白质。在一个实施方案中，凋亡抑制物质是这样的物质，其可抑制由凋亡诱导蛋白，尤其是上述p53家族蛋白以及其同种型、嵌合体或功能片段所诱导的凋亡。因此，本实施方案中的凋亡抑制物质可以选自下组：参与细胞周期阻滞的蛋白、泛素连接酶和p53家族蛋白的显性失活变异体。

参与细胞周期阻滞的蛋白包括，但不仅限于，p21(NM_000389)，SFN(stratifin，14-3-3 sigma，NM_006142)，Gadd45(NM_001924)，p300(EP300，NM_001429)，BTG2(TIS21，NM_006763)，CAV1(NM_001753)，DUSP5(NM_004419)，EGFR(NM_005228)，HGF(SF，NM_000601)，MET(NM_000245)，PCNA(NM_002592)，PLAGL1(ZAC，BC074814)，SESN1(PA26，AF033120)，SH2D1A(SAP，NM_002351)，TGFA(NM_003236)，PCBP4(NM_020418)，RRM2B(NM_015713)，STEAP3(NM_001008410)，ARID3A(E2FBP1，NM_005224)，C13orf15(RGC32，NM_014059)，CCNG1(NM_004060)，CCNK(NM_003858)，DDB2(NM_000107)，DDIT4(REDD1，NM_019058)，GML(NM_002066)，GPX1(NM_000581)，HRAS(c-Ha-Ras，NM_176795)，IBRDC2(NM_182757)，MET(NM_000245)，MSH2(NM_000251)，PLK2(SNK，NM_006622)，RB1(NM_000321)，S100A2(NM_005978)，TP53i3(Pig3，NM_004881)，TRIM22(Staf50，NM_006074)，VCAN(CSPG2，NM_004385)(见Riley et al.，Nat Rev Mol Cell Biol.2008；9(5)：402-12，特别是其补充信息。圆括号内的数字指示GenBank登录号)。在一个实施方案中，参与细胞周期阻滞的蛋白选自下组：p21，SFN，Gadd45和p300。

本发明中使用的泛素连接酶包括，但不仅限于，MDM2(GenBank登录号：NM_002392，NM_006878，NM_006879，NM_006881，NM_006882)。本发明中使用的p53家族蛋白的显性失活变异体包括如下的p53家族蛋白变异体，其在反式激活域、DNA结合域和/或寡聚化域中，特别是在DNA结合域中具有突变。在一个实施方案中，p53家族蛋白的显性失活变异体包括，但不仅限于，具有如下突变的人p53：G117E，P152T，T155I，R156P，R175H，P177S，P177F，P177H，H179Y，E180K，R181G，R181H，N239S，S241T，S241F，C242Y，G244S，G245S，G245D，M246L，P250L，L257P，D259V，R273C，R273H，V274F，G279E，G279V，G279R，D281N，D281E，R282Q，E286K(见Willis et al.，Oncogene 2004；23：2330-8，Blagosklonny et al.，Faseb J 2000；14：1901-7，Monti et al.，Oncogene 2002；21：1641-8.)。

在一个实施方案中，凋亡抑制物质被凋亡诱导物质的作用所诱导。这些凋亡抑制物质的实例包括，但不仅限于，p21，SFN，Gadd45，BTG2，CAV1，DUSP5，EGFR，HGF，MET，PCNA，PLAGL1，SESN1，SH2D1A，TGFA，PCBP4，RRM2B，STEAP3，ARID3A，C13orf15，CCNG1，CCNK，DDB2，DDIT4，GML，GPX1，HRAS，IBRDC2，MET，MSH2，PLK2，RB1，S100A2，TP53i3，TRIM22和VCAN，所有这些均被p53诱导。

本发明使用的凋亡抑制物质的细胞凋亡抑制性质可以通过任何合适的方法加以评估，这样的方法包括但不仅限于，在细胞凋亡条件下比较存在或不存在候选物的情况下凋亡的程度或者正在经历凋亡的细胞比例。细胞凋亡条件包括，但不仅限于，暴露于凋亡诱导刺激，例如辐射、用凋亡诱导物质例如多柔比星和铂络合物处理，凋亡诱导蛋白例如p53家族蛋白的表达。凋亡的程度可以通过例如测量胱天蛋白酶-3活性进行评估，正在经历凋亡的细胞的比例可以通过例如测量处于sub-G1期的细胞比例进行评估(见实施例)。

因此，本发明使用的可抑制凋亡抑制物质表达和/或活性的物质包括，但不仅限于，如上定义的可抑制凋亡抑制物质表达的核酸分子，例如反义核酸、核酶、适体和RNAi效应物如指向凋亡抑制物质的miRNA，shRNA和siRNA，以及编码这些核酸分子的核酸分子。

在一个实施方案中，可抑制凋亡抑制物质活性的物质包括，但不仅限于，可结合凋亡抑制物质的物质，例如抗体，凋亡抑制物质的显性失活(dominant negative)变异体，凋亡抑制物质的拮抗物，例如可结合凋亡抑制物质的靶物或受体的物质。

某种物质抑制凋亡抑制物质表达和/或活性的能力可以用常规的方法进行评估，例如通过比较在存在或不存在测试物质时凋亡抑制物质的表达和/或活性，如果存在测试物质时凋亡抑制物质的表达和/或活性比不存在测试物质时增加，则认为所述测试物质是可抑制凋亡抑制物质表达和/或活性的物质。

RNAi效应物是可通过RNA干扰(RNAi)抑制靶基因表达的物质。RNAi是一种广泛使用的用于抑制特定靶基因的技术(Hannon et al.，Nature 2002；418：244-51，Rana et al.，Nat Rev Mol Cell Biol 2007；8：23-36)。RNAi效应物包括，但不仅限于，小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)和Micro-RNA(miRNA)。siRNA是一种双链RNA寡核苷酸，其可以被直接转染进入细胞。shRNA用基于载体的表达系统表达，具有类似G-N18-环-N′18-C的短结构，没有5’-帽和polyA尾巴(Brummelkamp et al.，Science 2002；296：550-3，Paddison et al.，Genes Dev 2002；16：948-58，Paul et al.，Nat Biotechnol 2002；20：505-8)。为了表达转录本的长度必须被严格调节的shRNA，优选地使用能够调节转录本长度的pol III启动子。miRNA是第三种类型的RNAi系统，其被转录为具有5’-帽和polyA尾巴的长mRNA(pri-miRNA)，与编码基因的转录本相似(Ambros et al.，Nature 2004；431：350-5，Ambros et al.，Cell 2001；107：823-6)。因此，存在各种启动子，例如pol II和pol III启动子，用于通过载体表达miRNA。

miRNA具有多种有利特征。首先，ORF可以被整合到miRNA载体内，从而使前-miRNA插入位点处于编码序列的3’UTR中。Pol II启动子能够在哺乳动物细胞内共顺反子地表达目的蛋白和被工程化以抑制特异靶基因的人工miRNA。使用该系统，有可能从单个载体同时表达凋亡诱导蛋白例如p53和特异针对细胞凋亡抑制蛋白的miRNA。用这种方式，可以避免在没有凋亡诱导蛋白表达的情况下凋亡抑制蛋白被抑制导致的可能的副作用。例如，有可能规避在没有p53家族蛋白表达的情况下由于参与细胞周期阻滞的蛋白导致的癌细胞增殖的危险。

miRNA的第二个优势是，多个miRNA序列可以被串联插入在单个核酸构建体或者载体内。该特征使得从单个构建体共顺反子地表达多个miRNA成为可能。实际上，一些内源miRNA在Pol II启动子驱动下在长初级转录本内成簇表达。因此，有可能将不同的miRNA序列插入到单个载体中，实现协同效果。第三个优势是，miRNA质粒载体可以容易地转换成重组腺病毒载体，从而提供一种供治疗应用的多用途系统。

针对特定蛋白的miRNA可以根据从数据库获得的其碱基序列或其登录号用Invitrogen的BLOCK-iT RNAi Designer(https://rnaidesigner.invitro- gen.com/rnaiexpress/)来进行设计。

可以列举的另一类RNAi系统是在JP，A，2003-219893中介绍的，由RNA和DNA形成的可抑制靶基因表达的双链多核苷酸。该多核苷酸可以是DNA/RNA杂交体，其中两条链中的一条是DNA，另一条是RNA，或者是DNA/RNA嵌合体，其中同一条链的一部分是DNA，另一部分是RNA。这种多核苷酸优选地由19-25个核苷酸，更优选地由19-23个核苷酸，再优选地由19-21个核苷酸构成；在DNA/RNA杂交体的情况下，优选地有义链是DNA，反义链是RNA，在DNA/RNA嵌合体的情况下，优选地双链多核苷酸的上游侧的一部分是RNA。这种多核苷酸可以按照自身已知的化学合成方法制备成具有任何序列。

在可抑制p53的显性失活变异体的表达的核酸分子的场合，该核酸分子可以靶定蛋白的编码区，但是也可能靶定蛋白的非编码区，特别是p53家族mRNA的3’UTR，从而使所有的内源显性失活蛋白被特异敲低，同时从本发明的作用剂、组合物或产品表达的仅含有编码区的内源野生型p53家族蛋白保持完整。

如这里所使用的，可抑制凋亡抑制物质表达的核酸分子意图包括其从下组中选出的功能突变体：

i)具有在可抑制凋亡抑制物质表达的核酸分子的核苷酸序列中发生一个或多个，或者一个或数个突变而成的核苷酸序列，但是仍然能够抑制凋亡抑制物质的表达的核酸分子；

ii)在严格条件下与可抑制凋亡抑制物质表达的核酸分子、其互补链或片段杂交，并且能够抑制凋亡抑制物质的表达的核酸分子；和

iii)与可抑制凋亡抑制物质表达的核酸分子的核苷酸序列至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或者至少95％同源，并且能够抑制凋亡抑制物质的表达的核酸分子。

在本发明中，凋亡诱导物质和可抑制凋亡抑制物质表达和/或功能的物质可以按任何方式组合。在一个实施方案中，该凋亡抑制物质可抑制由该凋亡诱导物质诱发的凋亡。例如，如果凋亡诱导物质是p53，则凋亡抑制物质可以选自下组：与p53相关的参与细胞周期阻滞的蛋白，例如p21、SFN、Gadd45、p300、BTG2、CAV1、DUSP5、EGFR、HGF、MET、PCNA、PLAGL1、SESN1、SH2D1A、TGFA、PCBP4、RRM2B、STEAP3、ARID3A、C13orf15、CCNG1、CCNK、DDB2、DDIT4、GML、GPX1、HRAS、IBRDC2、MET、MSH2、PLK2、RB1、S100A2、TP53i3、TRIM22和VCAN，与p53相关的泛素连接酶例如MDM2，和p53家族蛋白的显性失活变异体。

本发明的作用剂、组合物或产品可以包括至少一种凋亡诱导物质，和至少一种可抑制凋亡抑制物质的表达和/或活性的物质。例如，本发明的作用剂、组合物或产品可以包括至少一种p53家族蛋白和/或编码它的核酸分子。在一个实施方案中，本发明的作用剂、组合物或产品包括至少一种可抑制参与细胞周期阻滞的蛋白的表达和/或活性的物质，作为可抑制凋亡抑制物质的表达和/或活性的物质。在另一个实施方案中，除了作为可抑制凋亡抑制物质表达和/或活性的物质的至少一种可抑制参与细胞周期阻滞的蛋白的表达和/或活性的物质之外，本发明的作用剂、组合物或产品还包括至少一种可抑制泛素连接酶和/或p53家族蛋白显性失活变异体表达和/或活性的物质，作为可抑制凋亡抑制物质的表达和/或活性的物质。

在一个实施方案中，本发明的作用剂、组合物或产品包括至少一种可抑制p21，SFN，Gadd45和/或p300的表达和/或活性的物质。在另一个实施方案中，除了可抑制p21，SFN，Gadd45和/或p300的表达和/或活性的物质之外，本发明的作用剂、组合物或产品还包括至少一种可抑制MDM2和/或p53家族蛋白显性失活变异体的表达和/或活性的物质。

本发明的作用剂、组合物或产品可以用作细胞凋亡诱导剂或者用于治疗增殖性疾病。这里所使用的增殖性疾病是指任何涉及细胞异常增殖的病症，包括但不仅限于，良性和恶性肿瘤、增生(hyperplasia)、瘢瘤、库欣综合征、原发性醛固酮增多症、增殖性红斑、真性红细胞增多症、粘膜白斑病、增生性瘢痕、扁平苔藓和着色斑病。在本实施方案中，本发明的作用剂、组合物或产品可以进一步包括其它可用于治疗相应疾病的活性物质，例如抗肿瘤剂、抗炎剂、维生素等。

可用于本发明的抗肿瘤剂包括，但不仅限于，烷基化剂，例如异环磷酰胺、尼莫司汀、环磷酰胺、氮烯唑胺、美法仑和雷莫司汀，抗代谢物，例如吉西他滨、依诺他宾、阿糖胞苷、喃氟啶/尿嘧啶、喃氟啶/吉美嘧啶/奥替拉西混合物、去氧氟尿苷、羟基脲、氟脲嘧啶、氨甲蝶呤和巯基嘌呤，抗肿瘤抗生素，例如伊达比星，表柔比星，柔红霉素，多柔比星，吡柔比星，博来霉素，培洛霉素，米托蒽醌，和丝裂霉素C，生物碱例如依托泊苷，伊立替康，长春瑞滨，多西他赛，紫杉醇，长春新碱，长春地辛和长春花碱，激素治疗剂例如阿那曲唑，他莫西芬，托瑞米芬，比卡鲁胺，氟他米特和雌莫司汀，铂络合物，例如卡铂，顺铂和奈达铂，血管新生抑制剂例如萨立多胺，诺斯达和贝伐单抗(bevacizumab)，L-天冬酰胺酶等。

可用于本发明的抗炎剂包括，但不仅限于，甾体抗炎药物，例如泼尼松龙、倍氯米松、倍他米松、氟替卡松、地塞米松和氢化可的松；非甾体抗炎药物，例如乙酰水杨酸、洛索洛芬、醋氨酚、酮洛芬、噻洛芬酸、舒洛芬、托美丁、卡洛芬、苯恶洛芬、吡罗昔康、苄达明、萘普生、双氯芬酸、布洛芬、双氟尼酸和阿扎丙酮；可抑制炎性细胞因子表达的物质，例如针对炎性细胞因子基因的反义核酸、核酶、适体和RNAi效应物；和可抑制炎性细胞因子活性的物质，例如针对炎性细胞因子的抗体和炎性细胞因子受体的受体拮抗剂。

可用于本发明的维生素包括，但不仅限于，VA(视黄醇)、VB₁(硫胺素)、VB₂(核黄素)、VB₃(烟酸)、VB₅(泛酸)、VB₆(吡哆醇)、VB₇(生物素)、VB₉(叶酸)、VB₁₂(氰钴胺素)、VC(抗坏血酸)、VD(钙化固醇)、VE(生育酚)和VK(叶绿醌)以及其衍生物和类似物。

本发明的作用剂、组合物或产品可以以任何合适的形式存在，这取决于其用途和其中所含的活性物质，即凋亡诱导物质和可抑制凋亡抑制物质表达和/或活性的物质，和任选地活性物质。例如，所有的活性物质可以包含在和/或附着于合适的载体，例如高分子胶束(polymer micelle)、脂质体、乳液、微球和纳米球。如果至少一种物质是小分子或多肽，则这些形式是特别合适的。如果所有的活性物质都是核酸分子，则有可能将它们整合到至少一个核酸构建体或载体内。在这种情况下，这些核酸分子可以串联地置于单个表达盒内，使得表达受到相同的调节序列如启动子或增强子的控制。在一个实施方案中，核酸分子们可以被表达作为单个初级转录本。在一个实施方案中，核酸分子们可以被共顺反子地表达。

当在本发明中使用时，“载体”的意思是任何这样的核酸，其能够通过消化或连接引入期望的核酸分子，从而在不同遗传环境之间转移或者在宿主细胞内进行表达。载体典型地由DNA构成，但是也可以使用RNA载体。载体包括质粒、噬粒和病毒基因组，但是并不仅限于此。克隆载体可能在宿主细胞内自主复制或者在整合到基因组内后复制，并且进一步以一个或多个内切酶限制位点为特征，该载体在这些位点以可决定的方式被切割，期望的核酸序列可以与之连接，并且新的重组质粒能够藉此在宿主内复制靶核酸分子。在质粒的场合，通过增加在宿主细菌中的质粒拷贝数，期望的核酸分子可以被复制任何次数，或者在宿主通过细胞分裂再生之前在每个宿主内仅进行一次复制。在噬菌体的场合，复制可以在溶菌期(lytic phase)之间主动地发生，或者可以在溶原期(lysogenic phase)之间被动的发生。

关于表达载体，期望的核酸分子通过消化和连接插入其中，与调节序列操作连接，并作为转录本被表达。

本发明所用的基因可以从一个或多个基因构建，并且当它从两个或更多个基因构建时，这些基因可以插入到单个表达载体内，或者可以分离地插入到两个或更多个载体内。

表达载体可以进一步含有一个或多个标记序列，其适合于鉴定已被或者未被载体转化或转染的细胞。标记包含例如编码可增加或降低对抗生素或另一种化合物的抗性或敏感性的蛋白，编码活性可以通过本领域的标准分析方法检测到的酶(例如beta-半乳糖苷酶、荧光素酶或碱性磷酸酶)的基因，和能够对被转化或被转染的细胞、宿主、克隆或菌斑的表型产生可视的影响的基因。优选的表达载体是能够自主复制并且表达存在于与载体操作连接的DNA节段内的结构基因产物。

在本说明书中，当编码序列和调节序列以这样的方式连接，使得编码序列的表达或转录处于调节序列的影响或控制之下时，则称它们是“可操作”连接的。如果期望编码序列被翻译成为功能蛋白，则两条DNA序列若满足下述条件，就称它们是“可操作地”连接的：在5’调节序列中启动子的诱导下发生编码序列的转录，或者两条DNA序列之间的连接性质(1)不会诱发移框突变，(2)不会干扰启动子指导编码序列转录的功能，或者(3)不会干扰相应RNA转录本被翻译成蛋白质的能力。因此，如果启动子区能够转录DNA序列，从而使所得的转录本翻译成期望的蛋白后多肽，则启动子区与编码序列可操作地连接。

本发明的一种有用的载体包含编码凋亡诱导蛋白的核酸分子以及如上定义的可抑制凋亡抑制物质的表达和/或活性的物质，后者与合适转录或反义调节序列功能连接，所述调节序列来自基因，例如哺乳动物、微生物、病毒或昆虫的基因(视需要)。这类调节序列包括在基因表达中发挥调节作用的序列，例如转录启动子或增强子，用于调节转录的操纵基因序列，编码信使RNA内的核糖体结合位点的序列，和合适的可调节转录、翻译起始或翻译终止的序列。

基因表达必需的调节序列的详细特征可以根据生物物种或细胞种类而不同，但一般地至少含有参与转录和翻译起始的5’非转录和5’非翻译序列，例如TATA框、加帽序列和CAAT序列。特别地，这种5’非转录调节序列可以包含启动子区，其含有启动子序列，用于调节可操作地连接的基因的转录。调节序列还含有增强子序列或期望的上游激活序列。本发明的载体可以任选地含有5’前导或信号序列。本领域技术人员有能力自由选择和设计合适的载体。

特别有用的调节序列包含来自各种哺乳动物、病毒、微生物和昆虫基因的启动子区。该启动子区指令靶基因转录的起始，从而导致整个含有目的基因的DNA的转录。有用的启动子区包括CAG启动子、逆转录病毒LTR启动子、细胞巨大型病毒(CMV)增强子/启动子区、RSV LTR启动子、lac启动子、和从腺病毒分离的启动子，但是也可以使用任何其它本领域技术人员已知的可用于在真核生物、原核生物、病毒或微生物细胞中进行基因表达的启动子。

其它特别有用的用于在真核生物细胞内表达基因或蛋白的启动子包括哺乳动物细胞启动子和增强子序列，例如从多瘤病毒、腺病毒、SV40病毒和人巨细胞病毒获得的序列。典型地，病毒早期和晚期启动子，它们出现在SV40等病毒的病毒复制起点的附近，是特别有用的。具体的有用启动子的选择取决于细胞系和用于在特定细胞系内表达目的蛋白或核酸的核酸构建体的相关参数。而且，可以选择任何已知可以以足够高的水平在本发明可用的靶细胞内表达基因的启动子。

因此，本发明的核酸构建体包括各种形式的目的核酸分子，它们与启动子序列或启动子和增强子序列可操作地连接，并且进一步与指令mRNA终止和多聚腺苷酸化的多聚腺苷酸化序列功能连接。本发明的核酸构建体可以包含另一使构建体能够在期望的细胞内有效地复制并表达的基因序列。这种序列可以包括来自病毒基因等的内含子。

本发明的作用剂、组合物或产品可以通过多种途径给药，包括经口和胃肠外途径；其实例包括，但不仅限于，经口、静脉内、肌肉内、皮下、局部、直肠、肿瘤内、动脉内、门静脉内(intraportal)、心室内、跨粘膜(transmucosal)、经皮、鼻内、腹膜内、肺内和子宫内途径，并且可以将药物制备成适合于每种给药途径的形式。这些形式和制备方法可以采用任何已知的合适形式和方法(见例如′Hyoujun Yakuzaigaku′(Standard Pharmaceutics)，Ed.Y.Watanabe et al.，Nankodo，2003，等)。

适合于经口给药的剂型实例包括，但不仅限于，粉末、颗粒、药片、胶囊、液体、悬浮液、乳液、凝胶和糖浆，适合于胃肠外给药的剂型实例包括注射剂(injections)，如可注射溶液、可注射悬浮液、可注射乳液，和现配型(on-site preparation type)注射剂。胃肠外给药的制剂可以采取水成或非水成等渗无菌溶液或悬浮液的形式。

在本发明的另一个方面中，提供了一种诱导细胞凋亡的方法，包括向细胞中引入凋亡诱导物质和可抑制凋亡抑制物质的表达和/或活性的物质的步骤。该方法可以以体外、离体或体内方式实施。因此，细胞可以是从受试者分离的，或者可以是存在于受试者体内的。

在本发明的另一个方面中，提供了一种用于治疗增殖性疾病的方法，其包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的凋亡诱导物质和可抑制凋亡抑制物质的表达和/或活性的物质。

在本发明的这些方面中所用的凋亡诱导物质、可抑制凋亡抑制物质的表达和/或活性的物质，以及增殖性疾病的意思如上文关于本发明的作用剂、组合物和产品中所定义的。

在一个实施方案中，凋亡诱导物质和可抑制凋亡抑制物质的表达和/或活性的物质被包含在如上定义的本发明任何作用剂、组合物或产品中。

而且，上述方法中的引入方法并没有限制，可以使用任何已知的引入方法，例如磷酸钙方法、脂质体转染方法、超声引入方法、电穿孔方法、粒子枪方法、采用病毒载体例如腺病毒载体或逆转录病毒的方法，或显微注射方法。

在用于治疗增殖性疾病的方法中，本发明的作用剂、组合物或产品可以被单独施用，或者与其它可用于治疗相应疾病的活性物质联合施用，这样的活性物质例如抗肿瘤剂、抗炎剂、维生素等，在上文有举例。在联合施用的情况下，本发明的作用剂、组合物或产品可以在给予其他活性物质之前、同时或之后施用。

这里所说的有效量是可抑制目标疾病发生、减轻其症状或防止其进展的量，并且优选地是可防止目标疾病发生或治愈目标疾病的量。有效量优选地是不会导致超出给药的益处的副作用的量。这样的量可以通过使用培养细胞进行体外测试，或者通过在模式动物如小鼠、大鼠、狗、猪体内进行测试等来合适地加以确定，这些测试方法是本领域技术人员公知的。

本发明方法施用的活性物质的剂量取决于所用药物的类型。在本发明方法中使用的活性物质、作用剂、组合物或产品的剂量是本领域技术人员已知的，或者可以通过上述的测试等合适地确定。例如，在腺病毒载体的场合，剂量范围可以是1x10³-1x10¹⁴，或1x10⁴-1x10¹³，或1x10⁵-1x10¹²，或1x10⁶-1x10¹¹，或1x10⁷-1x10¹⁰噬斑形成单位(p.f.u.)/人受试者。

本发明方法中施用的药物的具体剂量可以在考虑需要治疗的受试者的各种条件的基础上，例如病症的严重程度，受试者的一般健康条件，受试者的年龄、体重、性别，饮食，给药的时间选择和频率，联合使用的药物，治疗的响应，和对治疗的顺应性等，来加以确定，剂量可以和上述典型的剂量不同，但是在这种情况下，这些方法仍然包含在本发明的范围内。

关于给药途径，可以有多种途径，包括经口和胃肠外途径，例如经口、静脉内、肌肉内、皮下、局部、直肠、肿瘤内、动脉内、门静脉内(intraportal)、心室内、跨粘膜(transmucosal)、经皮、鼻内、腹膜内、肺内和子宫内途径。

给药的频率取决于所用药物的性质和受试者的上述条件，并且可以例如一天多次(即一天2，3，4，5或更多次)、一天一次、数天一次(即每2，3，4，5，6，或7天等一次)、每周一次、或者数周一次(即每2，3，4周等一次)。

在本发明的方法中，术语“受试者”是指任何活的个体，优选的是动物，更优选的是哺乳动物，进一步优选的是人类个体。在本发明中，受试者可以是健康的或者患有某些疾病的，在意图治疗某种疾病的情况下，受试者典型地是指患有该疾病或者具有患上该疾病的危险的受试者。

而且，术语“治疗”包括医学上可接受的所有类型的出于治愈、暂时缓解、预防疾病等目的的预防和/或治疗性干预。例如，当疾病是增殖性疾病时，术语“治疗”包括医学上可接受的出于各种目的的干预，这些目的包括延迟或停止其进展，使病灶退化或消失，防止疾病的发生，或防止其复发。

当在对由凋亡诱导蛋白诱发的凋亡耐受的细胞中诱发细胞凋亡时，使用上述试剂、组合物、产物和方法是特别有利的。

在本发明的另一个方面中，提供了一种核酸构建体，其包括：

编码待表达的蛋白的核酸分子，和

可抑制不期望的蛋白的表达的核酸分子。

在一个实施方案中，待表达的蛋白是如上所定义的凋亡诱导蛋白。在一个实施方案中，该凋亡诱导蛋白优选地是p53家族蛋白。在一个实施方案中，不期望的蛋白是如上所定义的凋亡抑制蛋白。在一个实施方案中，该凋亡抑制蛋白选自下组：参与细胞周期阻滞的蛋白、泛素连接酶、和如上所定义的p53家族蛋白的显性失活变异体。在一个实施方案中，编码待表达蛋白的核酸分子和可抑制不期望的蛋白表达的核酸分子与相同的调节序列(例如启动子和增强子)可操作连接。在一个实施方案中，编码待表达蛋白的核酸分子和可抑制不期望的蛋白表达的核酸分子被表达为单一的初级转录本。在一个实施方案中，编码待表达蛋白的核酸分子和可抑制不期望的蛋白表达的核酸分子被共顺反子地表达。在一个优选的实施方案中，核酸分子可以被串联地放置于单个表达盒内，使得其表达受到同一启动子的控制。当仅表达其中一个核酸分子具有不良效应时，这些配置是有利的。

在本发明的另一个方面中，提供了一种载体，其包括上面定义的核酸构建体。可以在这里使用的载体的各种细节在上面已有讨论。

在本发明的另一个方面中，提供了一种用于在细胞内表达期望蛋白同时抑制不期望的蛋白表达的方法，包括：

(a)提供一种载体，其包括含有编码待表达蛋白的核酸分子和可抑制如上所定义的不期望的蛋白表达的核酸分子的核酸构建体，和

(b)将该载体引入到细胞内。

本发明的这些方面特别有利地用于同时抑制不期望的蛋白的表达，并表达期望被表达的蛋白，特别是在不期望的蛋白被相同细胞内给定蛋白的表达所诱导的情况下。

本发明将通过参考下面的实施例详细地说明本发明，但是本发明的范围并不受这些实施例的限制。

实施例

材料和方法

细胞培养

人类胚胎肾细胞系HEK293从Riken Cell Bank(筑波，日本)获得。结直肠癌细胞系DLD-1和SW480，和肝细胞癌细胞系Hep3B从美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection)(Manassas，VA)购买。肝细胞癌细胞系HLF来自Health Science Research Resource Bank(大阪，日本)。HCT116(p53-/-)细胞由Bert Vogelstein博士(Johns Hopkins University)惠赠。HEK293细胞在补充有10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco′s Modified Eagle′s培养基中培养。所有其它细胞系在含有10％FCS的RPMI-1640培养基中培养。

质粒

用在线工具，Invitrogen的RNAi Designer(http://www.invitrogen.com)，设计了三种pre-miRNA序列，其靶定人p21 mRNA的3’非翻译区(UTR)。设计工程化的pre-miRNA序列作为内源鼠miR-155的模拟物。将对应于三种不同的p21特异性pre-miRNA和对照序列的双链DNA寡核苷酸分别克隆到亲本载体pcDNA6.2-GW/miR(Invitrogen)内，分别产生了pcDNA6.2-miR-p21A，pcDNA6.2-miR-p21B，pcDNA6.2-miR-p21C和pcDNA6.2-miR-对照。

还将三种p21 pre-miRNA通过多轮链接(chaining)串联地克隆到一个载体内，产生能够共顺反子地表达多个miRNA的pcDNA6.2-miR-p21。简而言之，将有突出端的DNA插入物连接到以经剪切状态提供的载体上，该剪切产生5’侧的BamH位点和3’侧的BglII位点。使用BglII位点3’侧的XhoI位点，将经BamHI和XhoI消化的插入片段通过已连接的DNA插入物的3’侧的BglII和XhoI连接到载体内。通过重复该过程有可能串联插入多个插入物(见例如用户手册http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf，特别是《Chaining pre-miRNAs》一章)。

利用人类p53基因编码区每一侧的BamHI位点，用pCMV-Tag2-FLAG(Stratagene，La Jolla，CA)产生了用于p53 FLAG表位融合蛋白的表达载体(pCMV-Tag2-FLAG-p53)。将人p53基因的编码区用SalI克隆到pcDNA6.2-miR-p21和pcDNA6.2-miR-对照中，分别产生了pcDNA6.2-p53/miR-p21和pcDNA6.2-p53/miR-对照，如图5所示。用于质粒构建的工程化pre-miRNA和相邻侧翼区域的寡核苷酸序列如下：

[表1]

重组腺病毒

重组腺病毒用ViraPower腺病毒表达系统(Invitrogen)根据制造商的使用说明来生成。简而言之，在体外重组反应中将每个基于pcDNA6.2-GW/miR的表达载体的重组区用转移载体pDONR221转移到Gateway载体pAd/CMV/V5-DEST。将以这种方式从pAd/CMV/V5-DEST产生的重组腺病毒质粒转化到感受态DH5alpha(Toyobo，东京，日本)中。选择后，分离并扩增一个单克隆DH5alpha。纯化重组腺病毒质粒，然后转染进入293A细胞。在293A细胞内观察到充分的细胞致病效果后，用Adeno-X病毒纯化试剂盒(Clontech，志贺，日本)纯化腺病毒。从pcDNA6.2-p53/miR-21、pcDNA6.2-p53/miR-对照、pcDNA6.2-miR-p21和pcDNA6.2-miR-对照分别产生了重组腺病毒Ad-p53/miR-21，Ad-p53/miR-对照、Ad-模拟/miR-p21和Ad-模拟/miR-对照。所有的插入序列通过核苷酸测序进行了确认。关于重组腺病毒构建的详细信息可以通过向作者索取获得。

腺病毒滴度p.f.u.通过HEK293细胞感染后的噬斑形成测定加以确定。感染复数(moi)定义为p.f.u.总数与被感染的细胞总数的比值。我们用重复样品滴定了腺病毒，以确认实验的可重复性。

Western印迹分析

抗-p21(Ab-1)小鼠单克隆抗体从Calbiochem(Darmstadt，Germany)购买，抗-肌动蛋白小鼠单克隆抗体得自Chemicon(Billerica，MA)，抗-FLAG M2小鼠单克隆抗体得自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)，抗-p53(DO-1)小鼠单克隆抗体得自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。用RIPA缓冲液(150mM NaCl，1％NP40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，50mM Tris HCl，pH 8.0)在4摄氏度抽提总细胞裂解物。样品通过SDS-PAGE分级，并转移到Immobilon-P膜(Millipore，Billerica，MA)上。免疫反应性蛋白用增强化学发光法(ECL)(Amersham，Piscataway，NJ)检测。

免疫荧光显微术

使p53(-/-)HCT116细胞在用多聚L-赖氨酸(PLL)包被的盖玻片(Asahi Technoglass，船桥，日本)上生长。用4％多聚甲醛固定后，细胞用抗-FLAG兔多克隆抗体(Sigma-Aldrich)和抗-p21小鼠单克隆抗体(Calbiochem)在4摄氏度过夜孵育。用Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG和Alexa Fluor 594标记的山羊抗兔IgG(Invitrogen)孵育后，用荧光显微镜(Keyence，东京，日本)检查盖玻片。

流式细胞术

将细胞(1x10⁶)接种在6孔板中。接种24小时后，将细胞用溶于1ml补充有1％FCS的培养基中的纯化病毒一起温育，每10分钟短暂震荡一次。为了进行流式细胞术，在感染后的不同时间通过胰蛋白酶消化收集细胞，并通过离心沉淀。沉淀的细胞用90％冷乙醇固定，用RNA酶A(500单位/ml)处理，然后用碘化丙锭(50mg/ml)染色。样品在FACSCalibur流式细胞仪(BD Bioscience，San Jose，CA)上分析。实验至少重复3次，每个样品分析50,000个事件。数据用FlowJo软件(Tree Star，Ashland，OR)进行分析。对于联合治疗，感染24小时后，细胞用0.5微克/ml阿霉素处理，然后在24h后通过流式细胞术进行分析，如上所述。

RT-PCR

用Trizol试剂根据制造商(Invitrogen)的使用说明从细胞系提取总RNA。用SuperScript Preamplification系统(Invitrogen)使用2mg总RNA进行反转录获得cDNA。每个PCR包括94摄氏度，2分的最初变性步骤，随后是30个循环(用于miRNA、p21)和25个循环(用于GAPDH)的94摄氏度30秒，58摄氏度30秒，和72摄氏度30秒。寡核苷酸引物序列如下：

miRNA：5′-CTTGCTGAAGGCTGTATGC-3′(正向，SEQ ID NO：10)，

5′-TGGGCCATTTGTTCCATGTG-3′(反向，SEQ ID NO：11)，

靶A-B：5′-GGGAAGGGACACACAAGAAGAA-3′(正向，SEQ ID NO：12)，

5′-CCATCATATACCCCTAACACAGAGATAA-3′(反向，SEQ ID NO：13)，

靶C：5′-CACTAACGTTGAGCCCCTGG-3′(正向，SEQ ID NO：14)，

5′-CTAGGTGGAGAAACGGGAACC-3′(反向，SEQ ID NO：15)，

ORF：5′-CTGGAGACTCTCAGGGTCGAA-3′(正向，SEQ ID NO：16)，

5′-GATGTAGAGCGGGCCTTTGA-3′(反向，SEQ ID NO：17)

GAPDH：5′ACCACAGTCCATGCCATCAC 3′(正向，SEQ ID NO：18)，

5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3′(反向，SEQ ID NO：19).

PCR产物通过在1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分离。

胱天蛋白酶-3活性测定

胱天蛋白酶-3活性用胱天蛋白酶-3测定试剂盒(Biovision，Mountain View，CA)根据制造商的使用说明通过比色试验加以确定。该试剂盒利用标记有对硝基苯胺的合成四肽。简而言之，在试剂盒提供的裂解缓冲液中裂解细胞。收集上清，并用含有二硫苏糖醇和底物的反应缓冲液在37摄氏度温育。胱天蛋白酶-3活性通过用酶标仪测量405nm的吸光度变化加以确定。

动物模型

所有的动物被保持在无特定病原体条件下，并根据札幌医科大学动物管理和使用委员会的指南进行处理。为了评估对已建立肿瘤的治疗效果，将24只雌性BALB/c裸鼠两胁皮下注射(s.c.)2x10⁶个SW480或DLD1细胞。当肿瘤尺寸达到100mm³时，对小鼠直接肿瘤内注射1x10⁹p.f.u.(溶于100微升PBS中)的标明的腺病毒，在第0、1和2天总共处理三次。每个处理组使用三只小鼠。监视小鼠中的肿瘤形成，最多到4周。肿瘤体积用公式V(mm³)＝axb2/2计算，其中“a”表示最大尺寸，“b”是垂径。

实施例1：由单个质粒载体诱发的p53表达和p21抑制

我们设计了三种靶定p21 mRNA 3’非翻译区(UTR)的不同人工pre-miRNA序列(miR-p21A，B和C)(图1)。pre-miRNA序列被设计作为内源鼠miR-155的模拟物。该结构由如下三个部分构成：(i)与p21 3′UTR中的靶位点完全互补的21-核苷酸核心序列，(ii)来自鼠miR-155的19-核苷酸序列，形成一个末端环(terminal loop)，(iii)有义靶序列，其除去了两个核苷酸(位置9和10)，从而形成一个短的内部环，其可导致更有效的敲低。将这些pre-miRNA各自克隆到质粒载体pcDNA6.2-GW/miR内，其中工程化pre-miRNA的表达被人巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子所驱动。

在HEK293细胞中，本底水平(basal level)的p21表达被使用各单独miRNA载体的转染所抑制(图2)。为了确定内源p53活化后p21表达的诱导是否也被p21特异的miRNA所抑制，我们将三种miRNA载体的混合物转染到HCT116结肠癌细胞中，其中野生型p53被阿霉素处理所激活。P21基因响应于阿霉素诱导的表达在用对照miRNA载体转染的细胞中明显可见，而在用p21特异性miRNA载体混合物转染的细胞中被抑制(图3)。

这些研究中使用的亲本miRNA质粒的独特之处在于，Pol II启动子使得多个miRNA能够在一个初级转录本中共顺反子地表达，从而使得用单个载体敲低多个靶序列成为可能。为了确定当从单个载体表达时，三个p21特异性miRNA是否以协同的方式发挥功能，我们将这三个miRNA以串联排列的方式克隆到pcDNA6.2-GW/miR中，产生pcDNA6.2-miR-p21。然后，我们检查了所有三种miRNA的联合表达是否能够抑制由过表达外源p53诱发的p21诱导。在过表达p53的HEK293细胞中，p21的诱导被用pcDNA6.2-miR-p21的共转染所抑制(图4)。

在涉及数个载体的共转染中，所有的载体可能不是等效率地转染到每个细胞内。因此，在一些细胞中，可能p53过表达而p21未被抑制，而在其它细胞中，p21可能被抑制而没有外源p53的达。一些报告表明，p21抑制会通过解除对细胞周期阻滞的抑制而提高细胞生长(van de Wetering et al.，Cell 2002；111：241-50，Gartel et al.，Cancer Res 2005；65：3980-5)，并诱发肿瘤形成(Van Nguyen et al.，J Exp Med 2007；204：1453-61，Poole et al.，Oncogene2004；23：8128-34，Martin-Caballero et al.，Cancer Res 2001；61：6234-8，Barboza et al.，Proc Natl Acad Sci U S A 2006；103：19842-7，Topley et al.，Proc Natl Acad Sci U S A 1999；96：9089-94，Philipp et al.，Oncogene 1999；18：4689-98，Jackson et al.，Cancer Res 2003；63：3021-5)。为了避免增强癌细胞增殖，有利的是在每个细胞内p21抑制和p53过表达同时被诱发。

使用Pol II启动子的亲本miRNA载体系统的一个独特特征是，蛋白质编码序列以这样的方式整合到载体内，使miRNA插入位点处于蛋白编码序列的3’非翻译区(UTR)中。这个特征使得目的蛋白和可抑制特定靶基因的人工miRNA能够共顺反子地表达。我们将p53基因编码区插入在多个p21特异性miRNA集簇或对照miRNA序列的上游，分别产生了pcDNA6.2-p53/miR-p21或pcDNA6.2-p53/miR-对照(图5)。在HEK293细胞中，pcDNA6.2-p53/miR-p21转染可充分表达p53，并且完全抑制p21的诱导(图6)。在结肠癌细胞SW480和p53(-/-)HCT116中，即使在没有阿霉素的情况下，用pcDNA6.2-p53/miR-p21转染也可导致p53表达并诱发p21抑制(图7)。

实施例2：表达p53和p21特异性miRNA的单个腺病毒体外增强凋亡诱导

我们以p53和/或miR-p21表达质粒为基础构建了数种腺病毒载体。为了检验腺病毒载体是否以和质粒载体相似的方式发挥作用，我们用仅表达p53的腺病毒(Ad-p53/miR-对照)或同时表达p53与成簇的多个p21特异性miRNA的腺病毒(Ad-p53/miR-p21)感染了p53(-/-)HCT116细胞。在用Ad-p53/miR-对照或Ad-p53/miR-p21感染后，p53蛋白水平以剂量依赖的方式增加。然而，与转染实验的结果相似，用Ad-p53/miR-p21感染细胞高效地抑制了p21的诱导(图8和9)。还通过免疫荧光染色确认了p53表达和p21抑制的诱导(图10)。

为了确定腺病毒感染对凋亡的影响，我们用腺病毒感染了肝细胞癌细胞系HLF(携带突变的p53)和Hep3B(p53-缺失)，和结直肠癌细胞系DLD1(携带突变的p53)。Western印迹分析确认了p53在这些细胞中被表达，并且p21的诱导被抑制(图11)。当我们通过流式细胞术检查细胞时，与被Ad-p53/miR-对照感染的细胞相比，被Ad-p53/miR-p21感染的细胞具有显著更大的sub-G1部分，其指示凋亡性细胞死亡(图12)。

并非所有p53突变的癌细胞均对外源p53介导的细胞凋亡敏感。在先前的研究中我们显示，SW480结直肠癌细胞对腺病毒介导的p53基因转移的凋亡效应相对耐受(Sasaki et al.，Mol Cancer Ther 2008；7：779-87)。为了确定p53和p21特异性miRNA的联合表达是否会增加SW480细胞对外源p53诱导的凋亡的敏感性，我们测量了在存在和不存在阿霉素的情况下被腺病毒感染的细胞的sub-G1部分和胱天蛋白酶-3活性(图13-15)。Western印迹确认了p53表达和p21抑制的诱导(图13)。与用Ad-p53/miR-对照感染的细胞相比，用Ad-p53/miR-p21感染细胞增加了胱天蛋白酶-3活性(图14)和处于sub-G1的细胞数目(图15)

实施例3：体内腺病毒介导的p53和p21特异性miRNA的表达的治疗效果

为了确定体外p53表达和p21抑制在对凋亡的作用是否与体内治疗效果相关联，我们在一种肿瘤发生的异种移植物模型中检查了我们的新组合腺病毒载体的活性。将SW480和DLD1细胞皮下注射到裸鼠体内。当肿瘤体积达到恒定尺寸时，在第0，1和2天将腺病毒直接注射到肿瘤内(图16，箭头)。随着时间的推移，用Ad-p53/miR-p21注射的SW480-和DLD1-来源肿瘤的体积小于用Ad-p53/miR-对照注射的肿瘤(图16)。同时注意，Ad-模拟/miR-p21注射与Ad-模拟/miR-对照注射相比，导致SW480来源肿瘤的肿瘤体积增加。这些结果表明，在某些类型的癌症中，在没有p53过表达的情况下抑制p21会增加肿瘤进展的危险，这提示，为了有效而安全地治疗癌症，应当在肿瘤细胞中在与p53表达的同时诱导p21抑制。

Claims (14)

1.一种产品，其包括至少一种凋亡诱导物质，和至少一种可抑制凋亡抑制物质的表达和/或活性的物质。

2.根据权利要求1的产品，其中该凋亡诱导物质是凋亡诱导蛋白和/或编码该蛋白的核酸分子。

3.根据权利要求2的产品，其中该凋亡诱导蛋白是p53家族的蛋白。

4.根据权利要求1-3中任一项的产品，其中该凋亡抑制物质受该凋亡诱导物质的诱导。

5.根据权利要求1-4中任一项的产品，其中该凋亡抑制物质选自下组：参与细胞周期阻滞的蛋白质、泛素连接酶、和p53家族蛋白的显性失活变异体。

6.根据权利要求1-5中任一项的产品，其中该凋亡诱导蛋白和/或编码该蛋白的核酸分子与可抑制凋亡抑制物质的表达和/或活性的物质作为单一物质存在。

7.根据权利要求6的产品，其包含单一载体或单一核酸构建体，所述载体或核酸构建体包含编码该凋亡诱导蛋白的核酸分子以及编码可抑制凋亡抑制物质的表达的物质的核酸分子。

8.根据权利要求1-7中任一项的产品，其用于治疗增殖性疾病。

9.一种诱导凋亡的方法，包括：

(a)提供权利要求1-8中任一项的产品，和

(b)在细胞内诱导该产品。

10.一种核酸构建体，包括：

编码待表达蛋白的核酸分子，和

可抑制不期望的蛋白的表达的核酸分子。

11.根据权利要求10的核酸构建体，其中待表达的蛋白是凋亡诱导蛋白。

12.根据权利要求10或11的核酸构建体，其中该不期望的蛋白是凋亡抑制蛋白。

13.一种载体，其包含权利要求10-12中任一项的核酸构建体。

14.一种在细胞内表达期望的蛋白同时抑制不期望的蛋白表达的方法，包括：

(a)提供权利要求10-12中任一项的核酸构建体，和/或权利要求13的载体，和

(b)将该核酸构建体和/或载体引入到细胞内。

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