JP2013500339A - 癌を治療するための送達ツールとしての脂肪由来間質細胞（ａｓｃ） - Google Patents

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Abstract

癌の治療に成体脂肪由来間質細胞(ASC)および遺伝子操作されたASCを使用する方法であって、少なくとも1つの抗癌作用物質をコードする遺伝子を発現するように改変されている操作されたASCを含む組成物を患者に投与するステップを含む方法が開示される。抗癌作用物質は、アポトーシス促進作用物質でもよく、または発癌遺伝子の発現を阻害する作用物質でもよい。

Description

本発明の分野は、一般に、対象において癌を治療するための薬物送達の方法に関する。
癌の化学療法における中心的な問題は、健常な組織に対する抗癌作用物質の重篤な毒性副作用であり、それによっていつも用量の低減、処置の延期を、または治療の中断までも強いられる(Fennelly (1995) Clin. Cancer Res. 1:575〜582頁;Hanjaniら(2002) Gynecol. Oncol. 85:278〜284頁;Kobayashiら(2002) Chronobiol. Int. 19:237〜251頁;RossおよびSmall (2002) J. Urol. 167:1952〜1956頁;Markmanら(2002) J. Clin. Oncol. 20:2365〜2369頁;Sehouliら(2002) Gynecol. Oncol. 85:321〜326頁)。健常な臓器に対する細胞傷害性は、癌細胞を標的とする薬物送達系を使用することによって顕著に減じることができる(Alvarezら(2002) Expert. Opin. Biol. Ther. 2:409〜417頁;DassおよびSu (2001) Drug Deliv. 8:191〜213頁;Kopecekら(2001) J. Controlled Rel. 74:147〜158頁;Kunathら(2000) Eur. J. Pharm. Biopharm. 49:11〜15頁;Minkoら(2001) Dis. Manag. Clin. Outcomes 3:48〜54頁;Vaseyら(2002) J. Clin. Oncol. 20:1562〜1569頁)。
腫瘍治療の効率を増大させるには、抗腫瘍治療薬、および腫瘍細胞に特異的な毒性作用物質を送達することが重要である。旧来の化学療法剤は対象に全身投与され、対象の体循環を循環して腫瘍に到達する。抗癌薬の全身投与は、抗癌薬が非癌細胞に非特異的に作用する場合に望ましくない副作用を有することがあり、腫瘍の部位に実際に到達する抗癌薬が少量しかないこともある。したがって、場合によっては、抗癌薬の全身投与は、薬物が腫瘍細胞に効率よく接触できないために部分的に制限される。詳細には、腫瘍細胞塊への抗腫瘍作用物質の送達は、腫瘍の細胞塊が密であるので癌細胞への抗腫瘍作用物質の接近が制限されるために効率が悪い可能性がある。
腫瘍作用物質を対象に全身送達するとき、抗腫瘍薬は、腫瘍塊の一部にしか到達しないことがあり、それが実際に腫瘍に到達しても濃度が低すぎて癌細胞の死滅に有効でないこともある。さらに、腫瘍に血管形成および栄養素をもたらす血管新生の天然のプロセスは、腫瘍のサイズの付随的な増大を引き起こすことがあり、それによって腫瘍塊、および全身投与された薬物が腫瘍塊の密度のために癌細胞のかなりの部分に接近しない見込みが増大する。
場合によっては、抗腫瘍薬または化学療法剤は、腫瘍の部位に方向付けられており、癌細胞上に特異的に発現した細胞表面マーカーを特異的に認識しそれと結合する、抗腫瘍薬と結合した、腫瘍関連抗原とも呼ばれる細胞表面標的化部分を使用して癌細胞を特異的に標的とする。しかし、これらの方法でも、腫瘍関連抗原が必ずしも偏在するわけではないため、有効性の欠如という欠点を有する。
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したがって、より標的性の高い腫瘍治療法が必要である。
本発明は、一般に、癌を治療するための成体脂肪由来間質細胞(ASC)および遺伝子操作されたASCの使用に関する。詳細には、本発明は、癌を有する対象を任意選択で診断し、癌を有する対象に、少なくとも1つの抗癌作用物質をコードする遺伝子を発現するように改変されている操作されたASCを含む組成物を投与することによって、治療用抗癌作用物質を癌細胞または複数の癌細胞または腫瘍塊に送達する方法に関し、それだけに限らないが対象に投与されたASCの集団内の内皮細胞などの一部の細胞が腫瘍細胞の血管形成に組み込まれ血管新生を亢進し、脂肪由来幹細胞などの一部の細胞が腫瘍塊に入り、それによって、腫瘍の局所血管形成ネットワークを介しても、周囲の腫瘍に近接した場所からも癌細胞に直接抗癌作用物質を送達する。
その方法は、癌治療法の一部では抗血管新生化学物質、および腫瘍の周りの血管新生を抑制するタンパク質を利用するが、腫瘍の高い血管新生活性を使用して、腫瘍内での抗癌作用物質の分布を進行させることができるという驚くべき知見に基づいている。したがって、本発明は、腫瘍が抗血管新生作用物質で治療されるという有力な見解とは逆である。ここで、抗癌作用物質を発現する遺伝子改変されたASCは腫瘍の周りの脈管構造に取り込まれ、同時に抗癌タンパク質を腫瘍にひそかに送達する。
詳細には、ASCが、例えば一部の細胞は血管形成および腫瘍に血液を提供する血管に組み込まれるが(例えば内皮細胞)ASC集団内の他の細胞は腫瘍細胞へと特異的に移動しそれに入るように機能することができる(例えばASC集団内の幹細胞および間葉系細胞)など、様々な異なる経路を介して抗癌作用物質を送達するのに使用することができる細胞の異種の集団を含むことを本発明者らが発見したので、ASCは抗癌作用物質の送達ツールとして特に有用である。したがって、本発明は、腫瘍に血液および栄養素を供給する血管形成ネットワークを使用して癌または腫瘍細胞塊に抗癌作用物質を連続的に送達する操作されたASCの方法および使用に関する。
本発明の一態様は、腫瘍または癌細胞塊への生物学的に活性な抗癌作用物質(抗癌タンパク質分子、またはアポトーシス誘導分子など)の治療的送達方法としての、ASCに基づく送達系に関する。
したがって、本発明は、高用量の抗癌治療用作用物質を腫瘍の部位に局所的に直接送達する方法を提供する。理論に拘泥するものではないが、発現した抗癌作用物質は局所的に送達され、循環中で短い半減期を有すると予想されるので、全身性の非特異的応答は最小限となる。これによって、高い濃度の抗癌作用物質を使用して癌細胞を有効に死滅させることが可能となる。
本発明の一態様は、癌を有する対象へのASCの集団の移植を含む、対象における癌の治療方法に関し、その方法は、対象からASCを得るステップと、例えば抗癌タンパク質などの抗癌作用物質を発現するようにASCを遺伝子改変するステップと、抗癌作用物質を発現する操作されたASCを対象に投与して癌を治療するステップとを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、癌を有する対象へのASCの集団の自己移植であり、他の実施形態では、その方法は、癌を有する対象へのASCの集団の同種移植である。したがって、本発明は、対象における腫瘍への抗癌作用物質のASCに基づく送達方法を提供する。いくつかの実施形態では、当業者に一般的に知られている任意の方法による腫瘍の部位への局所送達など、癌を有する対象にASCの集団を局所的に投与する。他の実施形態では、日常的に使用され、当業者に知られている方法によって、癌を有する対象にASCを全身投与する。いくつかの実施形態では、抗癌作用物質をコードする核酸配列を含む操作されたASCを含む組成物を投与する対象は、以前に腫瘍切除を受けていない。いくつかの実施形態では、癌を有する対象において筋肉の再生を促進するために、本明細書で開示されている操作されたASCを含む組成物を投与しない。いくつかの実施形態では、腫瘍が対象から除去されている場所または損傷部位に、本明細書で開示されている操作されたASCを含む組成物を投与しない。
本発明の一態様は、対象において癌を治療するための方法および組成物に関し、その方法は、第1のプロモーターに作動可能に連結した核酸配列を含むように改変されている脂肪由来間質細胞(ASC)の実質的に純粋な集団を含む組成物を、癌を有する対象に投与するステップを含み、核酸は少なくとも1つの抗癌作用物質をコードし、抗癌作用物質をコードする核酸配列の発現は、癌を治療するのに有効な量である。
いくつかの実施形態では、ASCは組成物を投与する同じ対象から得られる。別の実施形態では、ASCを回収した適合ドナーを使用し、癌を有する対象に投与することができる。
本発明の全態様のいくつかの実施形態では、操作されたASCによって発現される抗癌作用物質は、核酸、タンパク質、ペプチド、siRNA、アンチセンス核酸、asRNA、RNAi、miRNAおよびそれらの変異体からなる群から選択される。
本発明の全態様のいくつかの実施形態では、脂肪由来間質細胞(ASC)の集団を含む組成物は、例えば、以下の細胞型;内皮細胞の集団、間葉系細胞の集団、線維芽細胞の集団、平滑筋細胞の集団、周皮細胞の集団、脂肪由来幹細胞の集団の少なくとも1つなどの異種の集団の細胞を含む。いくつかの実施形態では、脂肪由来間質細胞(ASC)の集団は、以下の細胞型;内皮細胞の集団、間葉系細胞の集団、線維芽細胞の集団、平滑筋細胞の集団、周皮細胞の集団、脂肪由来幹細胞の集団の少なくとも2つ、または少なくとも3つまたは少なくとも4つを含む。いくつかの実施形態では、脂肪由来間質細胞(ASC)の集団は、上記に列挙していない他の細胞または細胞集団をさらに含む。
本発明の全態様のいくつかの実施形態では、組成物は、脂肪由来幹細胞の実質的に純粋な集団を含む脂肪由来間質細胞(ASC)の集団を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、脂肪組織から精製されている脂肪由来間質細胞(ASC)の集団を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、脂肪組織由来の細胞の異種の集団から選択されている脂肪由来間質細胞(ASC)の集団を含む。
本発明の全態様のいくつかの実施形態では、脂肪由来間質細胞(ASC)の集団を含む組成物を腫瘍に局所的に投与する。腫瘍へのASC集団の直接投与は、例えば、超音波または磁気共鳴画像法を使用して実現することができる。いくつかの実施形態では、対象が手術または外科的切除、例えば腫瘍塊の一部または全部を除去するように計画された外科的処置を受けている間またはその後に、操作されたASCを対象に投与することができる。別の実施形態では、操作されたASCを投与する対象は、手術または外科的切除、例えば腫瘍塊の一部または全部を除去するように計画された外科的処置を受けていない。いくつかの実施形態では、外科的切除、例えば腫瘍塊の一部または全部を除去するように計画された外科的処置の部位に、操作されたASCを含む組成物を対象に投与しない。いくつかの実施形態では、腫瘍除去後に創傷治癒を促進し、腫瘍除去後に筋肉の再生を促進するために、本明細書で開示されている操作されたASCの投与を、癌を有する対象に行わない。
本発明の全態様のいくつかの実施形態では、操作されたASCによって発現される抗癌作用物質は、アポトーシス促進分子もしくはアポトーシス誘導分子またはそれらの断片である。いくつかの実施形態では、操作されたASCによって発現される抗癌作用物質は、抗血管新生作用物質、またはホルモンまたは血管新生ホルモン(例えばVEGF)または対象において血管新生もしくは新血管形成を促進する任意の作用物質でない。
いくつかの実施形態では、少なくとも1つの抗癌作用物質をコードする核酸配列は、ASCから抗癌作用物質を分泌する分泌配列もコードする。分泌配列は当技術分野で周知であり、任意の分泌配列が本発明での使用について包含される。
本発明の全態様のいくつかの実施形態では、ASCは、第2のプロモーターに作動可能に連結した第2の核酸配列をさらに含み、第2の核酸は少なくとも1つの細胞死遺伝子をコードする。例えば、ASCは、所望されるとき、例えば対象における癌の有効な治療および/または除去により抗癌作用物質の送達がもはや所望されないときに対象から操作されたASCを除去する生物学的安全機構として、誘導性プロモーターに作動可能に連結したアポトーシス促進作用物質などの「自殺」遺伝子を含みうる。
本発明の全態様のいくつかの実施形態では、対象は哺乳動物対象、例えばヒト対象である。
本発明の全態様のいくつかの実施形態では、第1のプロモーターに作動可能に連結した第1の核酸配列をASCにex vivoでトランスフェクトする。典型的にはベクターを使用して細胞にトランスフェクトする。
本発明の全態様のいくつかの実施形態では、操作されたASCによって発現される抗癌作用物質は、ポリペプチド、例えば、それだけに限らないがTRAIL、Bcl-XL、Hsp90;TNFα;DIABLO;BAX;BID;BID;BIM;Bcl-2の阻害物質;Bad;ポリADPリボースポリメラーゼ-1(PARP-1);第2ミトコンドリア由来カスパーゼ活性化因子(Second Mitochondria-derived Activator of Caspases)(SMAC);アポトーシス誘導因子(AIF);Fas(Apo-1またはCD95);Fasリガンド(FasL)ならびにそれらの変異体および断片などのアポトーシス促進ポリペプチドまたはアポトーシス促進分子である。
本発明の全態様のいくつかの実施形態では、抗癌ポリペプチド作用物質は、それだけに限らないが、チミジンキナーゼ、カルボキシペプチダーゼG2、プリンデオキシヌクレオシドホスホリラーゼ(PNP)、酵母シトシンデアミナーゼおよびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼからなる融合タンパク質(FCU1)、シトシンデアミナーゼなど、プロドラッグを活性化するタンパク質である。
本発明の全態様のいくつかの実施形態では、操作されたASCにより発現させるのに有用な抗癌作用物質は、癌標的遺伝子に対する阻害物質であり、例えば、癌標的遺伝子に対する阻害物質は、オリゴヌクレオチド、アンチセンス、それだけに限らないがsiRNA、miRNA、shRNAなど癌標的遺伝子を遺伝子サイレンシングするRNAi分子などの核酸阻害物質である。そのような実施形態では、癌標的遺伝子は、癌細胞または癌幹細胞中で発現するが、非癌細胞または非癌幹細胞中で発現しない任意の遺伝子であり、例えば、それだけに限らないがHER2/Her-2、BRAC1およびBRAC2、Rb、p53、ならびにそれらの変異体の群から選択される癌遺伝子などの発癌遺伝子である。
本発明の全態様のいくつかの実施形態では、その方法は、対象、好ましくは哺乳動物対象またはヒト対象における任意の癌の治療に適用可能であり、癌は、例えば、それだけに限らないが、間葉系由来(肉腫);線維肉腫;粘液肉腫;脂肪肉腫;軟骨肉腫;骨原性肉腫;血管肉腫;内皮肉腫;リンパ管肉腫;滑膜肉腫;中皮肉腫;ユーイング腫瘍;骨髄性白血病;単球性白血病;悪性白血病;リンパ球性白血病;形質細胞腫;平滑筋肉腫;および横紋筋肉腫;上皮由来の癌(癌腫);有棘細胞または表皮癌;基底細胞癌;汗腺癌;脂腺癌;腺癌;乳頭癌;乳頭腺癌;嚢胞腺癌;髄様癌;未分化癌(単純癌);気管支原性癌;気管支癌;黒色癌;腎細胞癌;肝細胞癌;胆管癌;移行上皮癌;有棘細胞癌;絨毛癌;精上皮腫;胎児性癌;悪性奇形腫;および奇形癌;白血病;急性リンパ球性白血病および急性骨髄球性白血病(骨髄芽球性、前骨髄芽球性、骨髄単球性;単球性、および赤白血病);慢性白血病;慢性骨髄球性(顆粒球性)白血病;慢性リンパ球性白血病;真性赤血球増加症;リンパ腫;ホジキン病;非ホジキン病;多発性骨髄腫;ワルデンストレームマクログロブリン血症;重鎖病である。いくつかの実施形態では、癌はリンパ腫;白血病;肉腫;腺腫である。いくつかの実施形態では、癌は急性リンパ芽球性白血病(ALL)である。
本発明の別の態様は、癌の治療用に本明細書で開示されている操作された脂肪由来間質細胞(ASC)を作製するためのキットに関し、キットは、プロモーターに作動可能に連結した核酸配列を含む少なくとも1つのベクターを含み、核酸配列は少なくとも1つの抗癌作用物質をコードする。キットは、ASCに形質導入するための説明書および培養培地ならびに操作されたASCを増殖させるための説明書および培養培地を含んでもよい。さらに、キットは、操作されたASCを対象に投与するためのデバイスおよび薬学的に許容される試薬をさらに含んでよい。
本発明は、対象において腫瘍に抗癌作用物質を送達するための方法および組成物に関し、詳細には、癌を有する対象を治療するための、抗癌作用物質を発現する遺伝子操作された脂肪由来間質細胞(ASC)の使用に関する。
詳細には、ASCが腫瘍の周囲にある血管形成へと特異的に移動しそれに組み込まれ血管新生を亢進することを本発明者らが発見したので、ASCは抗癌作用物質の送達媒体または送達ツールとして特に有用である。したがって、本発明は、癌または腫瘍細胞塊に抗癌作用物質を連続的に送達する操作されたASCの使用に関し、それだけに限らないが内皮細胞などASC集団内の一部の細胞は、腫瘍に血液および栄養素を供給する血管形成ネットワークに組み込まれ、それだけに限らないが脂肪由来幹細胞などASC集団内の他の細胞は腫瘍塊へと移動しそれに入る。
本発明の一態様は、癌を有する対象に、少なくとも1つの抗癌作用物質を発現し分泌するように改変されている操作されたASCの集団を含む組成物を投与することによって、治療用抗癌作用物質を癌細胞に送達する方法に関し、操作されたASCは腫瘍細胞塊の周囲にある血管形成に組み込まれ血管新生を亢進し、それによって体循環ならびに癌細胞に血液および栄養素を供給する局所血管形成ネットワークに抗癌作用物質を直接送達する。
定義:
便宜上、(明細書、実施例、および添付した特許請求の範囲を含めて)出願全体で使用される特定の用語をここに集める。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する分野における通常の技術を有する者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
本発明が、そのようなものとして記載された特定の方法、プロトコール、細胞系統、植物の種または属、構築物、および試薬に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される専門用語が、特定の実施形態を説明する目的のものに過ぎず、添付した特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。
「脂肪由来間質細胞」または「ASC」という用語は、脂肪組織に由来する成体細胞を指す。脂肪由来間質細胞は、以下の細胞の集団;内皮細胞、間葉系幹細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、周皮細胞および脂肪由来幹細胞、ならびに列挙していない追加の他の細胞型の少なくとも1つまたは少なくとも2つを含む細胞の異種の集団である。いくつかの実施形態では、脂肪由来間質細胞とは、脂肪由来幹細胞の実質的に純粋な集団を指す。いくつかの実施形態では、脂肪由来間質細胞は、脂肪由来再生細胞を指さない。ASCは脂肪組織から回収され、脂肪細胞および赤血球ならびに結合組織幹細胞のクローン集団を実質的に含まない。ASCは、脂肪組織由来の細胞外マトリックス物質を含む細胞を実質的に欠く。
本明細書において「脂肪」という用語は、対象由来の任意の脂肪組織を指す。「脂肪」および「脂肪組織」という用語は本明細書で互換的に使用される。脂肪組織は、皮下、網/内臓、乳房、性腺、または他の脂肪組織部位に由来する褐色脂肪、白色脂肪または黄色脂肪または白色脂肪組織でよい。脂肪組織は脂肪細胞および間質を有する。脂肪組織は、動物の身体全体にわたって認められる。例えば、哺乳動物では、脂肪組織は網、骨髄、皮下空間およびほとんどの臓器の周囲に存在する。好ましくは、脂肪は皮下の白色脂肪組織である。そのような細胞は、初代細胞培養物または不死化細胞系統を含みうる。脂肪組織は、脂肪組織を有するどんな生物由来のものでもよい。好ましくは、脂肪組織は哺乳動物のものであり、最も好ましくは、脂肪組織はヒトのものである。脂肪組織の好都合な供給源は脂肪吸引手術からであるが、脂肪組織の供給源または脂肪組織の単離方法は本発明にとって決定的に重要ではない。
本明細書において「成体」という用語は、任意の非胚性または非生後若齢動物または対象を指すことを意味する。例えば「成体脂肪由来間質細胞」という用語は、胚または若齢動物から得られたもの以外の脂肪由来間質細胞を指す。
「断片」または「セグメント」とは、少なくとも1つのアミノ酸を含むアミノ酸配列の部分、または少なくとも1つのヌクレオチドを含む核酸配列の部分である。「断片」および「セグメント」という用語は、本明細書で互換的に使用される。
本明細書において、「機能的」または「生物学的に活性な」分子とは、それによって特徴付けられる特性または活性を示す形態の分子である。
本明細書において「移植」という用語は、遊離(結合していない)細胞、組織、または臓器が対象への移植後に組織に組み込まれるプロセスを指す。
「同種移植」という用語は、同じ種の異なる動物に由来する、移植された細胞、組織、または臓器を指す。
本明細書において「異種移植」という用語は、異なる種の動物に由来する、移植された細胞、組織、または臓器を指す。
本明細書において「相同な」という用語は、2つのポリマー分子間、例えば2つの核酸分子、例えば2つのDNA分子もしくは2つのRNA分子間、または2つのポリペプチド分子間のサブユニット配列類似性を指す。2つの分子両方のサブユニット位置が同じモノマーサブユニットによって占められているとき、例えば、それぞれの2つのDNA分子の位置がアデニンによって占められている場合、それらはその位置で相同である。2つの配列間の相同性は、適合するまたは相同な位置の数の一次関数であり、例えば、2つの化合物の配列における位置の半分(例えば、長さが10サブユニットのポリマーにおける5個の位置)が相同である場合、2つの配列は50%相同であり、位置の90%、例えば10個のうち9個が適合しまたは相同である場合、2つの配列は90%の相同性を有する。例として、DNA配列3'ΑTTGCC5'および3'TATGGCは50%の相同性を有する。本明細書において、「相同性」は、「同一性」と同義的に使用される。
細胞に関して使用されるとき、「単離された」という用語は、元の組織(例えば脂肪組織)中に天然に存在する他の細胞型または他の細胞性物質から少なくとも部分的に単離された、脂肪由来間質細胞など対象の単一細胞または対象の細胞の異種の集団を指す。別の言い方をすると、単離されたASCは、脂肪細胞および赤血球ならびに結合組織幹細胞のクローン集団を実質的に含まず、細胞外マトリックス物質などの細胞および脂肪組織由来の細胞を実質的に欠く。対象の細胞以外の脂肪組織の細胞を少なくとも60%、または少なくとも75%、または少なくとも90%、特定の場合には少なくとも99%含まないとき、脂肪由来間質細胞の試料は「実質的に純粋」である。明確にするために、ASC集団の細胞の異種の集団中にある対象の細胞には、例えば、それだけに限らないが、内皮細胞、間葉系幹細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、周皮細胞および脂肪由来幹細胞が含まれる。純度は、任意の適当な方法によって、例えば、蛍光活性化細胞選別(FACS)、または細胞型を区別する他のアッセイによって測定することができる。
本明細書において、「精製された」という用語は、自然環境中で正常では細胞、細胞型、分子、または化合物に付随する他の構成成分に対する細胞、細胞型、分子、または化合物の濃縮に関する。「精製された」という用語は、特定の細胞、細胞型、分子、または化合物がプロセスの間に完全に純粋となっていることを必ずしも示さない。本明細書においてASCの「高度に精製された」集団とは、90%を超えて純粋であるASCの集団を指す(すなわちASCの高度に精製された集団は、赤血球、脂肪細胞および脂肪組織の細胞外マトリックスの細胞などの非ASC細胞に対してASC集団の細胞(すなわち内皮細胞、間葉系幹細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、周皮細胞および脂肪由来幹細胞)を少なくとも90%含む)。
本明細書において、「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝食塩水溶液、水、油/水または水/油エマルションなどのエマルションや、様々な型の湿潤剤など、任意の標準的な薬学的担体を含む。その用語は、ヒトを含めた動物における使用について米国連邦政府の規制当局によって承認され、または米国薬局方に列挙されている任意の作用物質も包含する。
本明細書において、「対象」とは、治療または予防が所望される任意の生物または動物である。そのような動物には、哺乳動物、好ましくはヒトが含まれる。
本明細書において「遺伝子」という用語は、mRNA分子の翻訳の結果、新生ポリペプチド中で認められるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を指す。真核生物では、コード領域には5'側に開始メチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ATG」による境界があり、3'側に終止コドンを特定する3つのトリプレット(すなわちTAA、TAG、TGA)の1つによる境界がある。イントロンを含有するのに加えて、ゲノム形態の遺伝子は、それぞれ「5'非翻訳領域」または5'UTRおよび3'非翻訳領域(3'UTR)と呼ばれる、RNA転写物上に存在する配列の5'末端にも3'末端にも位置する配列も含みうる。これらの配列は、「隣接」配列または領域とも称される(これらの隣接配列はmRNA転写物上に存在する非翻訳配列の5'または3'に位置する)。5'隣接領域は、遺伝子の転写を調節しまたはそれに影響を及ぼすプロモーターやエンハンサーなどの制御配列を含有しうる。3'隣接領域は、転写の終結、転写後切断およびポリアデニル化を誘導する配列を含有しうる。
本明細書において「エクソン」という用語は、その用語の通常の意味を指し、発現タンパク質の一部または全部をコードする核酸分子、通常はDNAのセグメントを意味する。
本明細書において「発現」という用語は、細胞における遺伝子産物の生合成、好ましくはヌクレオチド配列、例えば内因性遺伝子または異種遺伝子の転写および/または翻訳を指す。例えば、異種の核酸配列の場合、発現には異種の核酸配列からmRNAへの転写、および任意選択でmRNAから1つまたは複数のポリペプチドへのその後の翻訳が関与する。発現とはRNAi分子の生合成も指し、siRNA、shRNAやアンチセンスDNAなどのRNAi作用物質の発現および転写を指すが、ポリペプチド配列への翻訳を必要としない。
本明細書において「発現構築物」および「核酸構築物」という用語は同義語であり、適当な宿主細胞(例えば哺乳動物細胞)中で異種の標的遺伝子配列など特定のヌクレオチド配列の発現を誘導することができる核酸配列を指す。所望の異種標的遺伝子の翻訳を必要とする場合、典型的には、それは、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列も含む。コード領域は、対象のタンパク質をコードしうるが、対象の機能的RNA、例えばアンチセンスRNA、dsRNA、またはセンスもしくはアンチセンス方向の非翻訳RNAもコードしうる。本明細書で開示されている核酸構築物は、その構成成分の少なくとも1つが、その他の構成成分の少なくとも1つに対して異種であるという意味で、キメラでよい。
本明細書において「遺伝子」という用語は、ある形で遺伝子産物(例えばポリペプチドまたは機能的RNA)の発現を制御することができる適当な制御配列に作動可能に結合したコード領域を指す。遺伝子は、コード領域(オープンリーディングフレーム、ORF)の前(上流)および後(下流)にあるDNAの非翻訳制御領域(例えばプロモーター、エンハンサー、リプレッサーなど)、ならびに当てはまる場合には個々のコード領域(すなわちエクソン)間にある介在配列(すなわち3'UTR、5'UTR、イントロン)を含む。本明細書において「構造遺伝子」という用語は、mRNAへと転写され、次いで特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸の配列へと翻訳されるDNA配列を意味するものとする。
本明細書において「遺伝子産物」という用語は、遺伝子から転写されたRNA、または遺伝子によってコードされもしくはRNAから翻訳されたポリペプチドを含むことを指す。
本明細書において「ゲノム」または「ゲノムDNA」という用語は、宿主生物の遺伝性の遺伝情報を指す。ゲノムDNAは、核のDNA(染色体DNAとも称される)を含むが、色素体(例えば葉緑体)および他の細胞小器官(例えばミトコンドリア)のDNAも含む。典型的には、ゲノムまたはゲノムDNAという用語は核の染色体DNAを指す。
「異種標的遺伝子」または「異種遺伝子配列」という用語は本明細書で互換的に使用され、細胞のゲノムに導入される任意の核酸(例えば遺伝子配列)を指す。異種遺伝子配列は、導入される遺伝子が宿主細胞における天然に存在するレベルと比較して異なるレベルで発現し、かつ/または天然に存在する遺伝子と比べて何らかの改変(例えば点突然変異、選択マーカー遺伝子の存在など)を含有し、または導入されるレベルと比較して細胞中で正常な同じレベルで発現しない限り、その細胞中で認められる遺伝子配列を含んでよい。異種標的遺伝子は、細胞中に存在しうるが発現されるレベルではなく、または核酸配列が例えば1つもしくは複数のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、反転もしくは挿入である改変など、実験操作によって改変され、例えば、例えば突然変異生成などの非天然、合成または「人工的」方法によって改変されており、または核酸はその天然もしくは自然の遺伝的環境に位置しない。核酸を改変するそのような方法が記載されている(参照により本明細書に組み込まれている米国特許第5,565,350号;WO 00/15815)。場合によっては、異種標的遺伝子は、それだけに限らないが、異種遺伝子または構造遺伝子のコード配列(例えばレポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子、薬物耐性遺伝子、成長因子など)、およびmRNAまたはタンパク質産物をコードしない非コード制御配列(例えばプロモーター配列、ポリアデニル化配列、終結配列、エンハンサー配列、RNAi分子など)を含む。対象の核酸配列は、好ましくは、異種遺伝子、例えば価値のある形質、例えば、それだけに限らないが、癌治療薬で使用する毒素タンパク質をコードする異種遺伝子またはその断片などをコードしうる。場合によっては、異種標的遺伝子は、それを導入する細胞にとって内因性でなく、その細胞に天然に付随しないが、別の細胞から得られたものである。異種標的遺伝子は、何らかの改変を含有する内因性DNA配列、天然に存在しない複数コピーの内因性DNA配列、またはそれに生理的に連結した別のDNA配列に天然には付随しないDNA配列も含む。一般に、必ずしもではないが、異種標的遺伝子は、それが発現する細胞によって正常では産生されないRNAおよびタンパク質をコードする。
「標的」、「標的遺伝子」および「標的ヌクレオチド配列」という用語は本明細書で同等に使用され、生物中に存在する対象の任意の遺伝子でありうる標的遺伝子を指す。標的遺伝子は内因性でもよく、または導入することもできる。例えば、標的遺伝子は機能が知られている遺伝子または機能が知られていない遺伝子であるが、その全体のまたは部分的なヌクレオチド配列は知られている。あるいは、標的遺伝子の機能およびそのヌクレオチド配列はどちらも知られていない。標的遺伝子は真核細胞の天然の遺伝子でもよく、または例えば遺伝子形質転換によって真核細胞もしくは前記真核細胞の親細胞に以前に導入されている異種遺伝子でもよい。異種標的遺伝子は、真核細胞のゲノムに安定に組み込むことができ、または染色体外分子として、例えば自律複製する染色体外分子として真核細胞中に存在する。標的遺伝子は、ポリペプチドをコードする領域、または複製、転写、翻訳もしくは標的タンパク質の発現で重要な他のプロセスを制御するポリヌクレオチド領域を含むポリヌクレオチド;あるいは標的ポリペプチドをコードする領域および標的ポリペプチドの発現を制御する領域;または5'もしくは3'UTRやイントロンなどの非コード領域を含むポリヌクレオチドを含んでよい。標的遺伝子は、例えば、対象の遺伝子の転写によって産生されたmRNA分子を指すことがある。
「内因性」ヌクレオチド配列という用語は、正常な条件下で細胞のゲノム中に存在するヌクレオチド配列、すなわち細胞中に正常に存在し、細胞中にまたは他の遺伝子操作戦略によって導入されていないヌクレオチド配列を指す。「非内因性」または「合成」配列と称される核酸配列は、その配列全体が核酸を導入する細胞中に認められない配列を指す。いくつかの実施形態では、RNAi標的部位は、その配列全体が核酸構築物を導入する細胞内に認められないという意味で、非内因性または合成配列である。
「必須」遺伝子という用語は、例えば、生合成酵素、受容体、シグナル伝達タンパク質、構造遺伝子産物、または輸送タンパク質など生物または細胞の成長または生存に必須であるタンパク質をコードする遺伝子である。
本明細書において「相同DNA配列」という用語は、宿主細胞または別のDNA配列に天然に付随するDNA配列を指す。
「哺乳動物」または「哺乳動物の」という用語は本明細書で互換的に使用され、その通常の意味を包含するものとする。最も望ましくは、本発明はヒトでの効力について意図されているが、イヌ、ネコやウマなどの家畜哺乳動物、ならびに特に対象とする哺乳動物、例えば動物園の動物、農場資産、トランスジェニック動物、齧歯類などでそれを使用することもできる。
本明細書において、RNAi分子、例えばsiRNAまたはmiRNAの活性に関して「遺伝子サイレンシング」または「遺伝子サイレンシングされた」とは、異種標的遺伝子の細胞におけるmRNAレベルが、miRNAまたはRNA干渉分子が存在しない細胞中で認められるmRNAレベルの少なくとも約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約99%、約100%低下することを指す。好ましい一実施形態では、mRNAレベルは少なくとも約70%、約80%、約90%、約95%、約99%、約100%低下する。本明細書において、「低減した」または「遺伝子サイレンシング」とは、低くなり、好ましくは著しく低くなり、より好ましくはヌクレオチド配列の発現が検出できないことを指す。
本明細書において「二本鎖RNA」分子、「RNAi分子」、または「dsRNA」分子という用語は、ヌクレオチド配列のセンスRNA断片およびヌクレオチド配列のアンチセンスRNA断片を指し、どちらも互いに相補的なヌクレオチド配列を含み、それによってセンスおよびアンチセンスRNA断片が対となり二本鎖RNA分子を形成することが可能となる。いくつかの実施形態では、その用語は、発現したときに異種標的遺伝子のmRNAのレベルを少なくとも部分的に低減することができる二本鎖RNA分子を指す。詳細には、RNAi分子は、異種標的遺伝子の非コード領域に位置する合成RNAi標的配列と相補的である。本明細書において、「RNA干渉」、「RNAi」、および「dsRNAi」は本明細書で互換的に使用され、遺伝子サイレンシングすることができる核酸分子を指す。
本明細書において、「RNAi」という用語は、それだけに限らないが、siRNAi、shRNAi、stRNAi、内因性マイクロRNAおよび人工RNAを含めた任意の型の干渉RNAを指す。例えば、RNAの下流プロセシングの機構とは関係なく、それはsiRNAとして以前に同定された配列を含む(すなわち、siRNAはその結果mRNAを切断するin vivoプロセシングの特定の方法を有すると考えられるが、本明細書に記載の隣接配列との関連でそのような配列をベクターに取り込むことができる)。「siRNA」という用語は、二本鎖RNAを形成する核酸も指し、二本鎖RNAは、siRNAが標的遺伝子と同じ細胞中に存在しまたはそこで発現するときに遺伝子または標的遺伝子の発現を低減または阻害する能力を有する。二本鎖RNAのsiRNAは、相補鎖によって形成することができる。一実施形態では、siRNAは、二本鎖siRNAを形成することができる核酸を指す。siRNAの配列は、完全長の標的遺伝子、またはその部分配列に対応しうる。典型的には、siRNAは長さが少なくとも約10〜50ヌクレオチドである(例えば、二本鎖siRNAの各相補配列は長さが約10〜22ヌクレオチドであり、二本鎖siRNAは長さが約10〜22塩基対、好ましくは約19〜22塩基のヌクレオチド、好ましくは長さが約17〜19ヌクレオチド、例えば長さが10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、または22ヌクレオチドである)。
本明細書において「shRNA」または「低分子ヘアピンRNA」(ステムループとも呼ばれる)とはsiRNAの型である。一実施形態では、これらのshRNAは、短い、例えば約10〜約25ヌクレオチドのアンチセンス鎖、その後の約5〜約9ヌクレオチドのヌクレオチドループ、および類似のセンス鎖から構成される。あるいは、センス鎖がヌクレオチドループ構造に先行し、アンチセンス鎖がそれに続きうる。
「ステムループ構造」とは、一本鎖ヌクレオチドが優勢である領域(ループ部分)によって片側で連結している二本鎖(ステム部分)を形成することが知られまたは予測されるヌクレオチドの領域を含む二次構造を有する核酸を指す。ステムループ構造を指す「ヘアピン」および「折り返し」構造という用語も本明細書で使用される。そのような構造は当技術分野で周知であり、その用語は、当技術分野で知られているその意味と合致するように使用される。ステムループ構造内にあるヌクレオチドの実際の一次配列は、二次構造が存在する限り、本発明の実施にとって決定的に重要でない。当技術分野で知られているように、二次構造は正確な塩基対形成を必要としない。したがって、ステムは1つまたは複数の塩基のミスマッチを含んでよい。あるいは、塩基対形成は正確であり、すなわちミスマッチを全く含まなくてもよい。場合によっては、前駆マイクロRNA分子は複数のステムループ構造を含んでよい。例えば核酸リンカーなどのリンカーを介して、またはマイクロRNA隣接配列もしくは他の配列またはそれらのいくつかの組合せによって、複数のステムループ構造を互いに連結することができる。ステムループ構造内にあるヌクレオチドの実際の一次配列は、二次構造が存在する限り決定的に重要でない。当技術分野で知られているように、二次構造は正確な塩基対形成を必要としない。したがって、ステムは1つまたは複数の塩基のミスマッチを含んでよい。あるいは、塩基対形成はミスマッチを全く含まなくてもよい。
本明細書において「ヘアピンRNA」という用語は、任意の自己アニーリングする二本鎖RNA分子を指す。それを最も単純に描写すると、ヘアピンRNAは、一本鎖RNAループによってつながった、RNA鎖のアニーリングによってできている二本鎖ステムからなり、「パンハンドルRNA (pan-handle RNA)」とも称される。しかし、「ヘアピンRNA」という用語は、自己アニーリングする二本鎖RNA配列を含むが内部の隆起およびループも含むより複雑な二次RNA構造をも包含するものとする。適合する特定の二次構造は、RNA分子の自由エネルギーによって決定され、FOLDRNAなどの適当なソフトウェアを使用して、異なる状況について予測することができる(ZukerおよびStiegler (1981) Nucleic Acids Res 9(1):133〜48頁;Zuker, M. (1989) Methods Enzymol. 180、262〜288頁)。
「作用物質」という用語は、細胞中で正常では不在であり、または投与されるレベルでは存在しない任意の実体を指す。作用物質は、化学物質;低分子;核酸配列;核酸類似体;タンパク質;ペプチド;アプタマー;抗体;またはそれらの断片を含む群から選択することができる。核酸配列はRNAまたはDNAでよく、一本鎖または二本鎖でよく、対象のタンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、核酸類似体、例えばペプチド核酸(PNA)、偽相補的PNA(pseudo-complementary PNA)(pc-PNA)、ロックド核酸(LNA)などを含む群から選択することができる。そのような核酸配列には、例えば、それだけに限らないが、例えば転写リプレッサーとして作用するタンパク質をコードする核酸配列、アンチセンス分子、リボザイム、低分子阻害性核酸配列、例えばそれだけに限らないがRNAi、shRNAi、siRNA、マイクロRNAi(mRNAi)、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが含まれる。タンパク質および/もしくはペプチドまたはそれらの断片は、対象の任意のタンパク質、例えば、それだけに限らないが、突然変異タンパク質;治療用タンパク質;切断タンパク質でよく、タンパク質は細胞中で正常では不在であり、または低いレベルで発現する。タンパク質は、突然変異タンパク質、遺伝子操作されたタンパク質、ペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、キメラタンパク質、抗体、ミディボディ(midibodies)、トリボディ(tribodies)、ヒト化タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、改変タンパク質およびそれらの断片を含む群から選択することもできる。作用物質を培地に適用することができ、培地中でそれは細胞に接触しその効果を誘導する。あるいは、作用物質は、細胞への核酸配列の導入の結果細胞内にあってもよく、その転写の結果、細胞内で核酸および/またはタンパク質の環境刺激が生じる。いくつかの実施形態では、作用物質は、それだけに限らないが、合成および天然に存在する非タンパク質性実体を含めた任意の化学物質、実体または部分である。特定の実施形態では、作用物質は、化学的部分を有する低分子である。例えば、化学的部分には、マクロライド、レプトマイシンおよび関連の天然産物を含めた非置換もしくは置換のアルキル、芳香族もしくはヘテロ環部分またはそれら
の類似体が含まれる。作用物質は、所望の活性および/もしくは特性を有することが知られていることもあり、または多様な化合物のライブラリーから選択することもできる。
本明細書において、遺伝子のレベルの「低減」は、細胞または生物におけるタンパク質またはmRNAのレベルの低下を含む。本明細書において、作用物質(標的遺伝子によって発現されるRNA、mRNA、rRNA、tRNAおよび/またはそれによってコードされるタンパク質産物など)のレベルの「少なくとも部分的な低減」とは、本明細書で開示されているRNAi作用物質を欠く細胞または生物と比べてレベルが少なくとも25%、好ましくは少なくとも50%低減することを意味する。本明細書において、タンパク質またはmRNAなどの作用物質のレベルの「実質的な低減」とは、作用物質を低減することができる本発明のキメラRNA分子を欠く細胞または生物と比べてレベルが低減することを意味し、その作用物質のレベルの低減は少なくとも75%、好ましくは少なくとも85%である。その低減は、当業者が精通している方法によって決定することができる。したがって、導入遺伝子のタンパク質の低減は、例えばタンパク質の免疫学的検出によって決定することができる。さらに、導入遺伝子のタンパク質またはmRNAを検出するノーザンハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護アッセイ、逆転写(定量的RT-PCR)、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、ウェスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ(RIA)または他のイムノアッセイおよび蛍光活性化細胞分析(FACS)などの生化学的技術。低減した導入遺伝子の型に応じて、その活性または生物もしくは細胞の表現型に対する効果を決定することもできる。タンパク質の量を決定する方法は当業者に知られている。挙げることができる例は、マイクロビウレット法(micro-Biuret method)(Goa J (1953) Scand J Clin Lab Invest 5:218〜222頁)、フォーリンチオカルト法(Lowry OHら(1951) J Biol Chem 193:265〜275頁)またはCBB G-250の吸収の測定 (Bradford MM (1976) Analyt Biochem 72:248〜254頁)である。
本明細書において、「アミノ酸配列」という用語は、アミノ酸残基を表す略語、字、文字または語のリストを指す。アミノ酸は、本明細書において、一般的に知られている3字の記号またはIUPAC-IUB生化学命名委員会により推奨される1字の記号によって指すことができる。ヌクレオチドも同様に、一般的に受け入れられている1字のコードによって指すことができる。
本明細書において「アンチセンス」という用語は、転写のその正常な方向に対して反転したヌクレオチド配列を指し、そのためそれはワトソンクリック塩基対形成によって標的遺伝子のmRNA分子とハイブリダイズすることができる。アンチセンス鎖は、それが標的遺伝子の発現に干渉できることを条件に、いくつかの異なる方法で構築することができる。例えば、アンチセンス鎖は、転写のその正常な方向に対して標的遺伝子のコード領域(またはその部分)を反転させてその相補体の転写を可能にすることにより構築することができる(例えば、アンチセンスおよびセンス遺伝子によってコードされるRNAは相補的となりうる)。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は標的遺伝子と同じイントロンまたはエクソンのパターンを有する必要はなく、標的遺伝子の非コードセグメントは、コードセグメントのように標的遺伝子発現のアンチセンス抑制の実現において等しく有効でありうる。遺伝子サイレンシングとの関連で、「アンチセンス」という用語は、標的配列と相補的な配列を有する核酸、例えば標的配列とのハイブリダイゼーションによってその発現の遮断を開始しようとするメッセンジャーRNA(mRNA)配列を意味すると理解される。
本明細書において「成熟タンパク質」という用語は、例えば、タンパク質と、特定の細胞小器官への移行を誘導する標的化またはシグナルペプチドなどの追加のタンパク質構成成分を含むプレタンパク質など、正常ではプレ形態で合成されるタンパク質を指す。プレタンパク質の翻訳後プロセシングの結果成熟タンパク質が生じ、例えばプレタンパク質構成成分が切断される。場合によっては、プレタンパク質は、翻訳後プロセシングの後に活性タンパク質となる、生物学的に不活性なタンパク質を含みうる。
本明細書において「最小限プロモーター」という用語は、機能的なプロモーターを維持しつつも最小限であるプロモーターエレメントの核酸領域を指す。
「非コード」という用語は、発現タンパク質の一部または全部をコードしない核酸分子の配列を指す。非コード配列には、それだけに限らないが、イントロン、プロモーター領域、3'非翻訳領域(3'UTR)、および5'非翻訳領域(5'UTR)が含まれる。
「核酸」および「ヌクレオチド」という用語は、天然に存在する、または合成のまたは人工の核酸またはヌクレオチドを指す。「核酸」および「ヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖のセンスまたはアンチセンス形態のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらの任意のヌクレオチド類似体およびポリマーもしくはハイブリッドを含む。別段示されない限り、特定の核酸配列はまた、それらの保存的に改変された変異体(例えば縮重コドン置換物)および相補配列、ならびにはっきりと示されている配列も暗に包含する。「核酸」という用語は、本明細書で「遺伝子」、「cDNA」、「mRNA」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」と互換的に使用される。ヌクレオチド類似体には、それだけに限らないが、5位のピリミジンの改変、8位のプリンの改変、シトシン環外アミンでの改変、5-ブロモ-ウラシルの置換など;およびそれだけに限らないが2'-OHがH、OR、R、ハロ、SH、SR、NH2、NHR、NR2、またはCNから選択される基によって置き換えられた糖改変リボヌクレオチドを含めた2'位の糖の改変を含めた塩基、糖および/またはリン酸の化学構造に改変を有するヌクレオチドが含まれる。shRNAは、非天然塩基、例えばイノシンおよびキサンチン、非天然糖、例えば2'-メトキシリボース、または非天然ホスホジエステル連結、例えばメチルホスホネート、ホスホロチオエートおよびペプチドなどの非天然エレメントを含んでもよい。「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」という用語は本明細書で互換的に使用され、互いに共有結合した少なくとも2つのヌクレオチドを指す。当業者には理解されるであろうが、一本鎖の描写によって相補鎖の配列も定義される。したがって、核酸は、描写された一本鎖の相補鎖も包含する。やはり当業者には理解されるであろうが、所与の核酸と同じ目的で核酸の多数の変異体を使用することができる。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸およびその相補体も包含する。やはり当業者には理解されるであろうが、一本鎖は、厳密なハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズすることができるプローブを提供する。したがって、核酸は、厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
「核酸配列」という用語は、5'から3'末端へと読まれるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖のポリマーを指す。それは染色体DNA、自己複製するプラスミド、DNAまたはRNAの感染性ポリマーおよび主として構造的な役割を果たすDNAまたはRNAを含む。「核酸配列」は、ヌクレオチドを表す略語、字、文字または語の連続したリストも指す。一実施形態では、核酸は、通常は長さが100ヌクレオチド未満の比較的短い核酸である「プローブ」でありうる。核酸プローブは長さ約50ヌクレオチドから長さ約10ヌクレオチドであることが多い。
核酸は一本鎖でもよく、もしくは二本鎖でもよく、または二本鎖と一本鎖の両方の配列の部分を含有してもよい。核酸はゲノムとcDNAのどちらのDNAでもよく、RNAでもよく、またはハイブリッドでもよく、核酸はデオキシリボおよびリボヌクレオチドの組合せ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンを含めた塩基の組合せを含有してよい。核酸は、化学合成法によっても、または組換え法によっても得ることができる。
核酸は一般にホスホジエステル結合を含有するが、少なくとも1つの異なる連結、例えばホスホロアミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはO-メチルホスホロアミダイト連結ならびにペプチド核酸骨格および連結を有しうる核酸類似体を含めることができる。他の類似核酸には、参照により組み込まれている米国特許第5,235,033号および第5,034,506号に記載のものを含めた、陽性骨格(positive backbone);非イオン性骨格、および非リボース骨格を有するものが含まれる。1つまたは複数の天然に存在しないまたは改変ヌクレオチドを含有する核酸も、核酸の1つの定義内に含まれる。改変ヌクレオチド類似体を例えば核酸分子の5'末端および/または3'末端に置くことができる。ヌクレオチド類似体の代表的な例は、糖または骨格改変リボヌクレオチドから選択することができる。しかし、5位で改変されたウリジンまたはシトシン、例えば5-(2-アミノ)プロピルウリジン、5-ブロモウリジン;8位で改変されたアデノシンおよびグアノシン、例えば8-ブロモグアノシン;デアザヌクレオチド、例えば7デアザアデノシン;O-およびN-アルキル化ヌクレオチド、例えばN6-メチルアデノシンなどのヌクレオ塩基改変リボヌクレオチド、すなわち天然に存在するヌクレオ塩基の代わりに天然に存在しないヌクレオ塩基を含有するリボヌクレオチドも適切であることに留意すべきである。2'OH-基は、H、OR、R、ハロ、SH、SR、NH2、NHR、NR2またはCNから選択される基によって置き換えることができ、式中RはC〜C6アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロはF、Cl、BrまたはIである。リボース-リン酸骨格の改変は、様々な理由で、例えば生理的環境中でそのような分子の安定性および半減期を増大するために、またはバイオチップのプローブとしてなすことができる。天然に存在する核酸および類似体の混合物を作製することができる;あるいは、異なる核酸類似体の混合物、および天然に存在する核酸および類似体の混合物を作製することができる。
本明細書において「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸(RNA)もしくはデオキシリボ核酸(DNA)またはそれらの模倣物のオリゴマーまたはポリマー、ならびに同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを指す。そのような改変または置換オリゴヌクレオチドは、例えば細胞取り込みの亢進、核酸標的に対する親和性の亢進や、ヌクレアーゼ存在下での安定性の増大などの望ましい特性のために、天然型より好ましいことが多い。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、連結(例えばホスホジエステル)または代用の連結によって互いに共有結合した2つ以上のヌクレオモノマーを含む。
「作動可能な連結」または「作動可能に連結した」という用語は本明細書で互換的に使用され、例えば、制御エレメントがそれぞれその意図する機能を果たして、連結した核酸配列の発現を可能にし、改変し、促進しまたはその他の形で影響を及ぼすことができるような、制御エレメント(例えばプロモーター)と、発現させる核酸配列および適当な場合にはさらなる制御エレメント(例えばターミネーターなど)の配列上の配置を意味するものと理解されたい。発現は、センスまたはアンチセンスRNAとの関連で核酸配列の配置に応じて生じうる。この目的のために、化学的な意味での直接連結は必ずしも必要でない。例えばエンハンサー配列などの遺伝子調節配列は、さらに離れた位置から、または実に他のDNA分子から、標的配列に対してその機能を発揮することもできる。いくつかの実施形態では、配置は、組換えにより発現させる核酸配列が、プロモーターとして作用する配列の後に位置し、その結果2つの配列が互いに共有結合しているものである。プロモーター配列と組換えにより発現させる核酸配列との距離は任意の距離でよく、いくつかの実施形態では200塩基対未満、特に100塩基対未満、50塩基対未満である。いくつかの実施形態では、転写開始が本発明のキメラRNAの所望される始まりと同一になるように、転写する核酸配列をプロモーターの後に置く。作動可能な連結、および発現構築物は、(例えば、Maniatis T、Fritsch EFおよびSambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor (NY);Silhavyら(1984) Experiments with Gene Fusions、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor (NY);Ausubelら(1987) Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Assoc and Wiley Interscience;Gelvinら(編) (1990) Plant Molecular Biology Manual; Kluwer Academic Publisher、Dordrecht、The Netherlandsに)記載されている通例の組換えおよびクローニング技術を用いて生成することができる。しかし、例えば、制限酵素の特定の切断部位を有するリンカーとして、またはシグナルペプチドとして作用するさらなる配列を2つの配列間に位置付けることもできる。配列の挿入によって融合タンパク質を発現させることもできる。いくつかの実施形態では、プロモーターおよび発現させる核酸配列の連結からなる発現構築物はベクターに組み込まれた形で存在し、例えば形質転換によって植物ゲノムに挿入することができる。
本明細書において「核酸構築物」という用語は、組換え法によって少なくとも部分的に作製される核酸を指す。「DNA構築物」という用語は、デオキシリボヌクレオチドからなるポリヌクレオチド構築物を指している。構築物は一本鎖でもよく、または二本鎖でもよい。構築物は環状でも直鎖状でもよい。当業者は、DNA構築物の1つを得る様々な方法に精通している。構築物は、例えば、Maniatis T、Fritsch EFおよびSambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor (NY);Silhavyら(1984) Experiments with Gene Fusions、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor (NY);Ausubelら(1987) Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Assoc and Wiley Interscience;Gelvinら(編) (1990) Plant Molecular Biology Manual; Kluwer Academic Pub-lisher、Dordrecht、The Netherlandに記載されている通例の組換えおよびクローニング技術を用いて調製することができる。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」、「遺伝子産物」、「発現産物」および「タンパク質」という用語は本明細書で互換的に使用され、連続したアミノ酸残基のポリマーまたはオリゴマーを指す。
「プロモーター」、「プロモーターエレメント」、または「プロモーター配列」という用語は同等のものであり、本明細書において、対象のヌクレオチド配列に作動可能に連結したときにmRNAへの対象のヌクレオチド配列の転写を調節することができるDNA配列を指す。必ずしもではないが、プロモーターは、典型的には、それがmRNAへの転写を調節する対象のヌクレオチド配列の5'(すなわち上流)に(例えば、構造遺伝子の転写開始部位の近位に)位置し、転写を開始するためのRNAポリメラーゼおよび他の転写因子による特異的な結合の部位をもたらす。ポリヌクレオチド配列は、それが外来の種に由来する場合に、または同じ種由来であれば、その元の形態から改変されている場合に、生物または第2のポリヌクレオチド配列「に対して異種」である。例えば、異種のコード配列に作動可能に連結したプロモーターとは、プロモーターが由来するものと異なる種由来のコード配列、または同じ種由来であれば、プロモーターと天然には付随しないコード配列(例えば、遺伝子操作されたコード配列または異なる生態型もしくは変種由来の対立遺伝子)を指す。適切なプロモーターは、発現が生じるべきである宿主細胞の遺伝子に由来しうる(例えば組織プロモーター)。プロモーターが誘導性プロモーターである場合、転写の速度は誘導作用物質に応答して増大する。その一方で、プロモーターが構成的プロモーターである場合、転写の速度は誘導作用物質によって制御されない。また、プロモーターは、癌細胞などの特定の組織型の中で付随したコード領域を転写する際にのみ活性となるように、組織特異的なまたは組織に好ましい形で制御することもできる。
それがプロモーターに当てはまるとき「組織特異的」という用語は、異なる型の組織(例えば腎臓)中では対象の同じヌクレオチド配列の発現が相対的に存在しない状態で、特定の型の組織(例えば肝臓)に対して対象のヌクレオチド配列の選択的発現を誘導することができるプロモーターを指す。プロモーターの組織特異性は、例えば、プロモーター配列にレポーター遺伝子を作動可能に連結してレポーター構築物を生成し、得られるトランスジェニック動物の全組織にレポーター構築物が組み込まれるようにレポーター構築物を生物、例えば動物モデルのゲノムに導入し、トランスジェニック動物の様々な組織中でのレポーター遺伝子の発現を検出する(例えば、レポーター遺伝子によってコードされるmRNA、タンパク質、またはタンパク質の活性を検出する)ことによって評価することができる。他の組織中でのレポーター遺伝子の発現のレベルと比べて、1つまたは複数の組織中でレポーター遺伝子の大きなレベルの発現が検出されると、そのプロモーターが、大きなレベルの発現が検出された組織に特異的であることが示される。
プロモーターに当てはめるとき「細胞型特異的」という用語は、同じ組織内の異なる型の細胞中では対象の同じヌクレオチド配列の発現が相対的に存在しない状態で、特定の型の細胞中で対象のヌクレオチド配列の選択的発現を誘導することができるプロモーターを指す。プロモーターに当てはめるときに「細胞型特異的」という用語はまた、単一組織内の領域中で対象のヌクレオチド配列の選択的発現を促進することができるプロモーターをも意味する。プロモーターの細胞型特異性は、当技術分野で周知である方法、例えばGUS活性染色または免疫組織化学染色を使用して評価することができる。
プロモーターに言及するときに「構成的」という用語は、プロモーターが、刺激(例えば熱ショック、化学物質、作用物質、光など)の不在下で、作動可能に連結した核酸配列の転写を誘導できることを意味する。典型的には、構成的プロモーターは、実質的にどんな細胞およびどんな組織中でも導入遺伝子の発現を誘導することができる。
その一方で、本明細書で言及される「制御可能な」または「誘導性」プロモーターという用語は、刺激(例えば熱ショック、化学物質、光、作用物質など)の存在下で、刺激の不在下での作動可能に連結した核酸配列の転写のレベルとは異なるレベルの作動可能に連結した核酸配列の転写を誘導できるものである。
本明細書において「センス」という用語は、標的配列、例えばタンパク質転写因子と結合し、所与の遺伝子の発現に関与する配列と相同なまたは同一の配列を有する核酸を指す。好ましい実施形態によれば、核酸は、対象の遺伝子、および前記対象の遺伝子の発現を可能にするエレメントを含む。
その最も広い意味で、基準または標的ヌクレオチド配列との関連でヌクレオチド配列に関して本明細書で使用するときに「実質的に相補的な」という用語は、実質的に相補的なヌクレオチド配列と前記基準または標的ヌクレオチド配列の正確な相補配列との間で少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%または96%、少なくとも97%または98%、少なくとも99%または100%(この場面において最後は「同一の」という用語と同等となる)の同一性の百分率を有するヌクレオチド配列を意味する。例えば、同一性は、(以下で別段の特定がない限り)前記基準配列に対して核酸配列の長さ全体の少なくとも10ヌクレオチド、または少なくとも11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または最大で50ヌクレオチドの長さにわたって評価される。配列比較は、NeedlemanおよびWunschのアルゴリズム(NeedlemanおよびWunsch (1970) J Mol. Biol. 48:443〜453頁;上記で定義)に基づいて、ウィスコンシン大学GCG、GAPのSEQWEBアプリケーションを用いた初期設定のGAP分析を使用して実施される。基準ヌクレオチド配列と「実質的に相補的な」ヌクレオチド配列は、低い厳密性の条件、好ましくは中程度の厳密性の条件、最も好ましくは高い厳密性の条件下で基準ヌクレオチド配列とハイブリダイズする(上記で定義)。
その最も広い意味で、ヌクレオチド配列に関して本明細書で使用するときに「実質的に同一の」という用語は、基準または標的ヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を意味し、実質的に同一のヌクレオチド配列と基準または標的ヌクレオチド配列との間の同一性の百分率は、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%または96%、少なくとも97%または98%、少なくとも99%または100%である(この場面において最後は「同一の」という用語と同等となる)。例えば、同一性は、(以下で別段の特定がない限り)前記基準配列に対して核酸配列の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22などの10〜22ヌクレオチド、または最大で50ヌクレオチドの長さにわたって評価される。配列比較は、NeedlemanおよびWunschのアルゴリズム(NeedlemanおよびWunsch (1970) J Mol. Biol. 48:443〜453頁;上記で定義)に基づいて、ウィスコンシン大学GCG、GAPのSEQWEBアプリケーションを用いた初期設定のGAP分析を使用して実施される。基準ヌクレオチド配列と「実質的に同一の」ヌクレオチド配列は、低い厳密性の条件、好ましくは中程度の厳密性の条件、最も好ましくは高い厳密性の条件下で基準ヌクレオチド配列の正確な相補配列(すなわち二本鎖分子においてその対応する鎖)とハイブリダイズする(上記で定義)。特定のヌクレオチド配列の相同体は、上記に記載のパラメーターを使用して測定したとき、基準アミノ酸配列と少なくとも24%同一であり、少なくとも35%同一であり、少なくとも50%同一であり、少なくとも65%同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、相同体によってコードされるアミノ酸配列は、その特定のヌクレオチドによってコードされるタンパク質と同じ生物学的活性を有する。「実質的に同一でない」という用語は、厳密な条件下で核酸配列とハイブリダイズしないヌクレオチド配列を指す。ポリペプチドに関して本明細書で使用するときに「実質的に同一の」という用語は、基準ポリペプチドに対応するタンパク質を意味し、ポリペプチドは、基準タンパク質と実質的に同じ構造および機能を有し、例えば、ポリペプチドの機能に影響を及ぼさないアミノ酸配列の変化しか存在しない。ポリペプチドまたはアミノ酸配列に使用するとき、実質的に類似したポリペプチドまたはアミノ酸配列と基準のものとの間の同一性の百分率は、上記に記載の初期設定のGAP分析パラメーターを使用すると、少なくとも24%、少なくとも30%、少なくとも45%、少なくとも60%、少なくとも75%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%である。相同体とは、上記に記載のパラメーターを使用して測定したとき、基準ポリペプチドまたはアミノ酸配列と少なくとも24%同一であり、より好ましくは少なくとも35%同一であり、さらにより好ましくは少なくとも50%同一であり、さらにより好ましくは少なくとも65%同一であるアミノ酸配列であり、相同体によってコードされるアミノ酸配列は、基準ポリペプチドと同じ生物学的活性を有する。
本明細書において「形質転換」という用語は、細胞、組織または生物への遺伝物質(例えば導入遺伝子または異種の核酸分子)の導入を指す。細胞の形質転換は安定なものでもよく、または一過性のものでもよい。「一過性形質転換」または「一過性に形質転換された」という用語は、宿主細胞のゲノムへの導入遺伝子の組み込みの不在下における、細胞への1つまたは複数の導入遺伝子の導入を指す。一過性形質転換は、例えば、導入遺伝子の1つまたは複数によってコードされるポリペプチドの存在を検出する酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって検出することができる。あるいは、一過性形質転換は、導入遺伝子(例えばuid A遺伝子)によってコードされるタンパク質(例えばβ-グルクロニダーゼ)の活性を検出することによって検出することができる。「一過性形質転換体」という用語は、1つまたは複数の導入遺伝子を一過性に取り込んでいる細胞を指す。その一方で、「安定形質転換」または「安定に形質転換された」という用語は、細胞のゲノムへの1つまたは複数の導入遺伝子の導入および組み込みを指し、好ましくはその結果染色体に組み込まれ減数分裂により安定に遺伝する。細胞の安定形質転換は、導入遺伝子の1つまたは複数と結合することができる核酸配列を用いた細胞のゲノムDNAのサザンブロットハイブリダイゼーションによって検出することができる。あるいは、細胞の安定形質転換は、導入遺伝子配列を増幅する、細胞のゲノムDNAのポリメラーゼ連鎖反応によって検出することもできる。「安定形質転換体」という用語は、ゲノムDNAに1つまたは複数の導入遺伝子を安定に組み込んでいる細胞を指す。したがって、安定形質転換体は、安定形質転換体のゲノムDNAが1つまたは複数の導入遺伝子を含有する一方で、一過性形質転換体のゲノムDNAが導入遺伝子を含有しない点で、一過性形質転換体と区別される。形質転換は、エピ染色体(epichromosomal)複製および遺伝子発現を伴う植物ウイルスベクターの形態での植物細胞への遺伝物質の導入も含み、これは減数分裂の安定性に関して変動的な特性を示しうる。形質転換細胞、組織、または植物は、形質転換プロセスの最終産物だけでなく、そのトランスジェニック子孫をも包含するものと理解される。
本明細書において「導入遺伝子」という用語は、実験操作によって細胞のゲノムに導入された任意の核酸配列を指す。導入遺伝子は、「内因性DNA配列」でもよく、または「異種DNA配列」(すなわち「外来DNA」)でもよい。「内因性DNA配列」という用語は、天然に存在する配列に対して何らの改変も含有しない限り(例えば点突然変異、選択マーカー遺伝子の存在など)それが導入される細胞において天然に認められるヌクレオチド配列を指す。細胞、組織または生物に言及するときにトランスジェニックという用語は、対象のDNA配列に作動可能に連結した適切なプロモーターを含むことが好ましい組換えDNA分子で形質転換され、好ましくは安定に形質転換されたことを意味する。
「ベクター」という用語は、「プラスミド」と互換的に使用され、連結している別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。作動可能に連結した遺伝子および/または核酸配列の発現を誘導することができるベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。一般に、組換えDNA技術において有用な発現ベクターは、環状の二本鎖DNAループを指し、そのベクターの形態では染色体と結合しない「プラスミド」の形態であることが多い。本発明の異なる実施形態で他の発現ベクター、例えば、それだけに限らないが、プラスミド、エピソーム、バクテリオファージまたはウイルスベクターを使用することができ、そのようなベクターは、宿主のゲノムに組み込まれ、または特定の細胞中で自律複製することができる。同等の機能を果たす、当業者に知られている他の形態の発現ベクターを使用することもできる。発現ベクターは、DNAをコードする、安定または一過性発現用の発現ベクターを含む。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体でもよい。ベクターはDNAベクターでもよく、またはRNAベクターでもよい。ベクターは、自己複製する染色体外ベクターでもよく、または宿主ゲノムに組み込まれるベクターでもよい。
本明細書において、「ベクター」という用語は、連結している別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。1つの型のベクターは、宿主細胞の染色体DNAに組み込むことができるゲノム組み込みベクター、または「組み込みベクター」である。別の型のベクターは、エピソームベクター、すなわち染色体外複製が可能な核酸である。作動可能に連結した遺伝子の発現を誘導することができるベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。本明細書では、特に文脈から明らかでない限り、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用される。in vitroまたはin vivoで本明細書に記載のRNAを産生するように設計された発現ベクターは、ミトコンドリアRNAポリメラーゼ、RNA pol I、RNA pol II、およびRNA pol IIIを含めた任意のRNAポリメラーゼの調節下にある配列を含有しうる。ベクターは、望ましくは、内因性ミトコンドリアRNAポリメラーゼを利用するように設計することができる(例えばヒトミトコンドリアRNAポリメラーゼ、この場合そのようなベクターは対応するヒトミトコンドリアプロモーターを利用することができる)。ミトコンドリアポリメラーゼを使用して、(キャップ付加酵素の発現により)キャップの付いた、またはキャップの付いていないメッセージをin vivoで生成することができる。RNA pol I、RNA pol II、およびRNA pol III転写物をin vivoで生成することもできる。そのようなRNAはキャップを付けてもよく、または付けなくてもよく、所望の場合には、ワクシニアキャップ付加酵素やアルファウイルスキャップ付加酵素などのキャップ付加酵素の使用を含めた様々な手段によって細胞質キャップ付加を行うことができる。そのようなプラスミドまたはベクターは、細菌、ウイルスまたはファージ由来のプラスミド配列を含んでよい。そのようなベクターには、染色体、エピソームおよびウイルス由来ベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、およびウイルスに由来するベクター、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝エレメントに由来するもの、コスミドやファージミドなどのこれらの組合せに由来するベクターが含まれる。したがって、1つの例示的なベクターは、一本鎖または
二本鎖のファージベクターである。別の例示的なベクターは、一本鎖または二本鎖のRNAまたはDNAウイルスベクターである。そのようなベクターは、ポリヌクレオチド、好ましくはDNAとして、DNAおよびRNAを細胞に導入する周知の技術により細胞に導入することができる。ファージおよびウイルスベクターの場合、ベクターは、パッケージングされたまたはキャプシド形成したウイルスとして、感染および形質導入の周知の技術により細胞に導入することもでき、好ましくは導入されている。ウイルスベクターは複製可能でもよく、または複製欠損でもよい。後者の場合、一般にウイルス増殖は補完性宿主細胞中でのみ起こる。
本明細書において、「二本鎖RNA」または「dsRNA」とは、2本の鎖からなるRNA分子を指す。二本鎖分子には、それ自体折り返して二本鎖構造を形成する、1本のRNA分子からなるものが含まれる。例えば、プレmiRNAと呼ばれる、一本鎖miRNAが由来する前駆分子のステムループ構造(Bartelら、2004. Cell 116:281〜297頁)は、dsRNA分子を含む。
「疾患」または「障害」という用語は本明細書で互換的に使用され、身体または一部の臓器の状態の任意の変化を指し、その機能の遂行を中断もしくは妨害し、かつ/または苦しむ人間もしくは人間と接触した者に不快感、機能不全、苦痛などの症状を、もしくは死までも引き起こす。疾患または障害は、不調、病弱、病気、病弊、障害、吐き気、疾病、愁訴、不快、罹患とも関連しうる。
「悪性腫瘍」または「癌」という用語は本明細書で互換的に使用され、哺乳動物における臓器または組織の任意の疾患を指し、その組織中の正常または異常細胞の調節不良のまたは調節のきかない増殖、および全体としての身体に対するその影響を特徴とする。定義の範囲内にある癌疾患は、良性の新生物、異形成、過形成、ならびに転移性増殖、または例えば癌の発生にしばしば先行する白板症のような任意の他の形質転換を示す新生物を含む。「腫瘍」または「腫瘍細胞」という用語は本明細書で互換的に使用され、異常増殖を起こしている組織塊または組織型の細胞を指す。
本明細書において、「または(or)」という語は、特定のリストの任意の1つのメンバーを意味し、そのリストのメンバーの任意の組合せも含む。本明細書および以下の特許請求の範囲で使用するとき「含む(comprise)」、「含んでいる(comprising)」、「含む(include)」、「含んでいる(including)」、および「含む(includes)」という語は、1つまたは複数の述べられた特徴、整数、構成成分、またはステップの存在を特定することを意図するが、それらは、1つまたは複数の他の特徴、整数、構成成分、ステップ、またはそれらの群の存在または追加を除外しない。
本明細書および添付した特許請求の範囲において、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈上特に明らかな指示がない限り複数の参照物を含み、したがって、「1つの(a)」および「1つの(an)」は、その冠詞の文法上の対象物の1つまたは複数(すなわち少なくとも1つ)を指すのに本明細書で使用される。例として、「1つのエレメント(an element)」とは、1つのエレメントまたは複数のエレメントを意味し、「1つの作用物質(an agent)」を送達するための組成物への言及は、1つまたは複数の作用物質への言及を含む。
1つまたは複数の列挙されたエレメントを「含む(comprising)」組成物または方法は、具体的に列挙されていない他のエレメントを含みうる。例えば、ASCを含む組成物は、単離されたASCをどちらも包含するが、他の細胞型もしくはタンパク質または他の構成成分も含みうる。さらなる例として、エレメントAおよびBを含む組成物は、A、BおよびCからなる組成物も包含する。「含んでいる(comprising)」という用語は、「主に含んでいるが、必ずしも単独ではない」ことを意味する。さらに、「含む(comprise)」や「含む(comprises)」などの語「含んでいる(comprising)」の語尾変化は、対応して変化した意味を有する。「から本質的になっている(consisting essentially)」という用語は、「主に含んでいるが、必ずしも単に少なくとも1つではない」ことを意味し、したがって、「1つまたは複数の、任意の組合せでの選択」を意味するものとする。
操作例以外で、または別段示されない限り、本明細書で使用される成分の量または反応条件を表す全ての数は、全ての場合で「約(about)」という用語によって修飾されるものと理解されるはずである。「約(about)」という用語は、およそ、ざっと、そのぐらい、またはその領域内にあることを意味するように本明細書で使用される。「約(about)」という用語が数値範囲と併せて使用されるとき、それは、示された数値の上下にある境界を拡張することによってその範囲を修飾する。百分率との関連で使用されるとき「約(about)」という用語は±1%を意味する。
脂肪由来間質細胞
理論に拘泥するものではないが、脂肪組織は、ヒトおよび他の哺乳動物種の正常な発生および生理において重要かつ見落とされた役割を果たす。多くの異なる種類の脂肪が存在する。最も一般的な型は白色脂肪組織であり、皮膚の下(皮下脂肪)、腹腔内(内臓脂肪)および生殖器の周り(性腺脂肪)に位置する。成人であまり余り一般的でないのは褐色脂肪組織であり、新生児期の間に熱を発生する際に重要な役割を果たす;この型の脂肪は肩甲骨の間(肩甲骨間)、大血管および心臓の周り(大動脈周囲および心臓周囲)、ならびに腎臓の上(腎臓上)に位置する。脂肪組織は黄色脂肪も包含する。脂肪組織はヒトを含めた動物の全身にわたって認められ、網、骨髄、皮下空間およびほとんどの臓器の周囲に存在する。
成体ASCまたはヒト脂肪組織由来成体間質細胞は、日常的に回収することができ、対象に対するリスクまたは不快感が最小限である細胞供給源となる。それをex vivoで増殖させ、独特の系列の経路に沿って分化させ、遺伝子操作し、自己または同種移植として個体に再導入することができる。
本明細書に記載のASCの集団は、以下の細胞の集団;内皮細胞、間葉系幹細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、周皮細胞および脂肪由来幹細胞、ならびに列挙していない追加の他の細胞型の少なくとも1つまたは少なくとも2つを含む細胞の異種の集団である。いくつかの実施形態では、脂肪由来間質細胞とは、脂肪由来幹細胞の実質的に純粋な集団を指す。いくつかの実施形態では、脂肪由来間質細胞は、脂肪由来再生細胞を指さない。本発明の方法で有用なASCは、それだけに限らないが、脂肪細胞、軟骨細胞、および骨芽細胞を含めた様々な細胞型に分化する能力も有し、疾患および障害の治療のための研究、移植、組織工学製品の開発ならびに外傷修復用の完全に分化した機能的な細胞も提供する。
当技術分野で一般的に知られている方法に従ってASCを培養して、中胚葉、外胚葉または内胚葉の系列を有する細胞が生じるようにASCを誘導することができる。分化を誘導する培地中でASCを適切な時間(例えば数日から1週間またはそれ以上)培養した後、ASCについてアッセイを行って、実際にそれが所望の系列を獲得しているかどうかを決定することができる。
ASCの集団を特徴付ける方法には、それだけに限らないが、組織学的、形態学的、生化学的および免疫組織化学的方法、または細胞表面マーカーを使用する方法、または遺伝学的もしくは分子的な方法、または分化した細胞によって分泌される因子を同定することによる方法、および分化したASCの誘導性の性質による方法が含まれる。
例えば、本発明のASCから分化する中胚葉系細胞を特徴付ける分子マーカーには、それだけに限らないが、MyoD、ミオシン、アルファ-アクチン、ブラキュリ、FOG、tbx5、FoxF1、Nkx-2.5が含まれる。上記に挙げたマーカーの哺乳動物相同体が好ましい。
本発明のASCから分化する外胚葉系細胞を特徴付ける分子マーカーには、例えば、それだけに限らないが、N-CAM、GABAおよび表皮特異的ケラチンが含まれる。上記に挙げたマーカーの哺乳動物相同体が好ましい。ADSCから分化する内胚葉系細胞を特徴付ける分子マーカーには、例えば、それだけに限らないが、Xhbox8、Endo1、Xhex、Xcad2、Edd、EF1-アルファ、HNF3-ベータ、LFABP、アルブミン、インスリンが含まれる。上記に挙げたマーカーの哺乳動物相同体が好ましい。
脂肪組織は、多くの個体において容易に入手可能であり、豊富にある。肥満は、米国において割合が広がっている状態であり、50%を超える成人が、その身長に基づいて推奨されるBMIを超過している。
例えば、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第7,270,996号で開示されている方法およびデバイスを使用して、対象から成体脂肪由来間質細胞(ASC)を回収することができる。さらに、成体脂肪由来間質細胞(ASC)を得、参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第2008/0248003号で開示されている培養条件に従って培養することができる。
その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第2003/0082152号またはWO 00/53795に記載のものなど、当業者に知られている様々な方法により、本発明の方法で有用なASCを単離することができる。いくつかの実施形態では、哺乳動物対象、好ましくはヒト対象から脂肪組織を単離する。いくつかの実施形態では、脂肪の供給源は皮下脂肪組織である。いくつかの実施形態では、脂肪組織の供給源は網の脂肪である。ヒトでは、典型的には脂肪吸引によって脂肪を単離する。いくつかの実施形態では、操作されたASCをヒト対象に移植する場合、自己移植組織を提供するその同じ対象から脂肪組織を単離することが好ましい。あるいは、移植されるASCは同種である。
ヒト脂肪由来間質細胞(ASC)の単離、増殖、および分化方法が報告されている。例えば、Burrisら、1999、Mol Endocrinol 13:410〜7頁;Ericksonら、2002、Biochem Biophys Res Commun.、2002年1月18日;290(2):763〜9頁;Gronthosら、2001、Journal of Cellular Physiology、189:54〜63頁;Halvorsenら、2001、Metabolism 50:407〜413頁;Halvorsenら、2001、Tissue Eng. 7(6):729〜41頁;Harpら、2001、Biochem Biophys Res Commun 281:907〜912頁;Saladinら、1999、Cell Growth & Diff 10:43〜48頁;Senら、2001、Journal of Cellular Biochemistry 81:312〜319頁;Zhouら、1999、Biotechnol. Techniques 13:513〜517頁を参照されたい。脂肪組織由来間質細胞は、コラゲナーゼ消化および分画遠心により、切り刻んだヒト脂肪組織から得られる[Halvorsenら、2001、Metabolism 50:407〜413頁;Haunerら、1989、J Clin Invest 84:1663〜1670頁;Rodbellら、1966、J Biol Chem 241:130〜139頁]。
脂肪細胞が補充可能な細胞集団であることは十分に裏付けられている。脂肪吸引または他の処置による外科的除去の後でも、時間とともに個体中に脂肪細胞が再び出現することは一般的にみられる。このことから、脂肪組織が間質幹細胞および/または自己複製が可能な前駆体を含有することが示唆される。
どのようにして得られても、脂肪組織は、脂肪組織の残りから本発明のASCを分離するように処理される。間葉系幹細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞および周皮細胞および脂肪由来幹細胞の異種の集団を含有するASC集団は、得られた脂肪組織をリン酸緩衝食塩水(PBS)などの生理的に適合する溶液で洗浄することによって得られる。洗浄ステップは、脂肪組織をPBSですすぐこと、組織を撹拌すること、および組織を沈殿させることからなる。洗浄に加えて、脂肪組織を解離する。解離は、酵素分解および中和によって行うことができる。そのような酵素処理の代わりに、またはそれと併せて、機械的撹拌、音波エネルギー、または熱エネルギーなどの他の解離方法を使用することができる。洗浄、解離、および沈殿ステップの後に3つの層が形成する。上層は遊離脂質の層である。中間層は格子および脂肪細胞の凝集物を含む。中間層は、「脂肪由来格子濃縮分画」と称される。
下層はASC集団を含有する。下層をさらに処理して、本明細書で開示されているASCを単離する。下層の細胞分画を濃縮してペレットにする。細胞を濃縮する1つの方法は遠心分離を含む。
下層を遠心分離し、ペレットを保持する。そのペレットは脂肪由来間質細胞集団と称し、脂肪由来幹細胞ならびにASC集団中の他の細胞を含む。ASC集団は赤血球(RBC)も含有しうる。好ましい方法では、RBCを溶解し除去する。RBCを溶解し除去する方法は当技術分野で周知である(例えば、低張媒体中でのインキュベーション)。しかし、ADSC-EFからRBCを除去することは必要でない。
ペレットを再懸濁し、それを1回または複数の連続した回数(PBS中で)洗浄し、遠心分離し、再懸濁してASCのより高い純度を実現することができる。本明細書で開示されているASC集団は、細胞の中でも特に、脂肪由来幹細胞(ADSC)を含む細胞の異種の集団である。洗浄し再懸濁したペレットの細胞は、遺伝子操作およびその後の対象への移植の準備ができている。
再懸濁したペレット中のASCは、それだけに限らないが、細胞選別、サイズ分画、粒状度、密度、分子的、形態学的、および免疫組織学的な方法を含む方法によって、再懸濁したペレットの他の細胞から分離することができる。フローサイトメトリーに基づいた脂肪由来間質細胞の免疫表現型は、CD13、CD29、CD34、CD44、CD63、CD73、CD90、CD166、ならびにアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび多剤耐性輸送タンパク質(ABCG2)などの間質細胞関連マーカーを含む。ASCは、例えば、それだけに限らないが、CD31、CD144またはVE-カドヘリン、血管内皮成長因子受容体2、フォンウィルブランド因子などの内皮細胞関連マーカーも発現することができる。
一実施形態では、細胞のサイズおよび粒状度を基礎として他の細胞からASCを分離し、ここでASCは小さく無顆粒である。あるいは、ペレットの他の細胞からASCを分離する分子的方法は、テロメアの長さについてアッセイを行うことによるものである。脂肪由来幹細胞(ADSC)は、分化した細胞より長いテロメアを有する傾向がある。
別の実施形態では、テロメアーゼ活性についてアッセイを行うことによりペレットの他の細胞からASCを分離する生化学的方法が使用される。テロメアーゼ活性は幹細胞特異的マーカーとして使用することができる。
さらに別の実施形態では、例えば、磁性ビーズを使用したパニング、またはアフィニティークロマトグラフィーにより、ペレットの他の細胞からASCを免疫組織化学的に分離する。
あるいは、ASCでADSC濃縮分画を単離するプロセスは適切なデバイスを用い、その多くは当技術分野で知られている(例えば、米国特許第5,786,207号を参照)。そのようなデバイスは、洗浄および解離ステップを機械的に実行することができる。
脂肪組織は、組織工学の適用にとって多くの実際的な利点を提供する。第1に、それは豊富にある。第2に、それは回収しやすく、患者に対するリスクが最小限である。第3に、それは補充可能である。間質細胞は骨髄の有核細胞集団の0.01%未満しかないが、脂肪組織1グラム当たりおよそ少なくとも8.6×104または少なくとも8.6×106個の間質細胞がある(Senら、2001、J. Cell. Biochem.、81:312〜319頁)。2〜4週間にわたるex vivoでの増殖で、0.5キログラムの脂肪組織から5億個の間質細胞が得られる。
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で開示されている操作されたASCは、癌を有する対象への移植もしくは投与に直ちに使用することもでき、または癌を有する対象への将来の自己もしくは同種適用のために凍結保存することもできる。
ASCはいくつかの接着および表面タンパク質も発現する。これらには、CD9;CD29(インテグリンベータ1);CD44(ヒアルロン酸受容体);CD49d、e(インテグリンアルファ4、5);CD54(ICAM1);CD55(崩壊促進因子);CD105(エンドグリン);CD106(VCAM-1);CD166(ALCAM)やHLA-ABC(クラスI組織適合抗原)などの細胞表面マーカー;およびインターロイキン6、7、8、11;マクロファージ-コロニー刺激因子;GM-コロニー刺激因子;顆粒球-コロニー刺激因子;白血病抑制因子;幹細胞因子や骨形成タンパク質などのサイトカインが含まれる。これらのタンパク質の多くは造血を支持する機能を果たす潜在性を有し、これらは全て骨髄間質細胞によって共有されている。
本明細書で開示されている方法に従って抗癌作用物質を発現するように操作するのに有用なASCは、WO 00/53795に記載のものなど、当業者に知られている様々な方法によって単離することができる。一実施形態では、哺乳動物対象、好ましくはヒト対象から脂肪組織を単離する。ヒトでは、典型的には脂肪吸引によって脂肪を単離する。本発明の細胞をヒト対象に移植する場合、自己移植組織を提供するその同じ対象から脂肪組織を単離することが好ましい。あるいは、移植される細胞は同種である。
本明細書に記載の細胞は、以前に記載されている方法を使用して脂肪組織から単離することができる(Zukら、Tissue Engineering 7:211頁、2001;Katzら、Stem Cells 23:412頁、2005)。しかし、当業者なら、各実験条件または使用目的について細胞を播く密度などの培養条件を選択できることを理解するであろう。本明細書に記載の細胞の単離および特徴付けに有用な他の技術は、細胞マーカーを使用した細胞の分画を含む。
(参照により本明細書に組み込まれている)US2002/0076400およびWO 00/53795は、ヒト脂肪組織からの多能性細胞集団の産生について記載している。前記細胞集団は、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、および筋細胞に分化することができる。これらの刊行物は、一部の細胞が、少なくとも15回細胞を移してもその多能性の特徴を失わずにin vitroでの培養で維持できることを示す。参照により本明細書に組み込まれている米国特許第6,800,480号は、フィーダー細胞を含まない培養系において霊長類由来始原幹細胞を増殖させるための方法および材料について記載している。
脂肪細胞の分化、ならびに他の間葉系細胞の分化を測定するための多数の技術が当業者に知られ、本明細書に記載されていないものも本発明の技術内に包含される。
一実施形態では、脂肪組織、または脂肪組織に由来するASCを本明細書に記載の様々な培養培地の条件にさらして、無血清または低血清の条件下での増殖または分化を支援する。当業者なら、使用する各成長因子、ホルモン、化合物、栄養素、ビタミンなどの量が、培養条件、使用する追加の分化誘導作用物質の量、または複数の作用物質を使用するときの使用する作用物質の組合せの数に従って様々となりうることを理解するであろう。
抗癌作用物質
本明細書で開示されているように、本発明は、抗癌作用物質を発現するように脂肪由来間質細胞(ASC)を操作することに関する。抗癌作用物質は、その用語が本明細書で定義されているようにどんな作用物質でもよい。いくつかの実施形態では、抗癌作用物質は、血管新生(血管の成長および内皮細胞の移動)および新血管形成を促進する血管新生亢進ホルモンなどの抗血管新生作用物質またはホルモンを特に除外する。
いくつかの実施形態では、抗癌作用物質はタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである。いくつかの実施形態では、抗癌作用物質がタンパク質である場合、抗癌作用物質はアポトーシス促進タンパク質である。アポトーシス促進タンパク質は当技術分野で周知であり、本明細書で開示されている方法および組成物での使用について包含される。アポトーシス促進タンパク質の例には、それだけに限らないが、細胞中で細胞死経路を誘導することができる任意の分子が含まれる。そのようなエフェクター分子の例には、それだけに限らないが、当技術分野で周知であるアポトーシス促進分子、例えばそれだけに限らないが、本明細書で開示されている方法によってASCにより発現されるアポトーシス促進作用物質としての使用について包含されるTRAIL、Hsp90;TNFα;DIABLO;BAX;BID;BID;BIM;Bcl-2の阻害物質;Bad;ポリADPリボースポリメラーゼ-1(PARP-1);第2ミトコンドリア由来カスパーゼ活性化因子(SMAC);アポトーシス誘導因子(AIF);Fas(Apo-1またはCD95としても知られる);Fasリガンド(FasL)、ならびに生物学的に活性な切断変異体を含めたそのようなアポトーシス促進分子の天然の変異体または組換えもしくは遺伝子改変された変異体が含まれる。
いくつかの実施形態では、抗癌作用物質は、癌幹細胞を選択的に標的とし、好ましくはそれを消失させるタンパク質またはポリペプチド抗癌作用物質である。そのような抗癌作用物質は当技術分野で知られ、癌幹細胞の表面上に発現したマーカーを標的とする細胞表面標的化部分を含む抗癌作用物質を含む。
血管新生は、悪性疾患の病原性ならびに腫瘍の増殖、浸潤および転移において中心的な役割を果たす。本発明では抗癌作用物質を腫瘍に送達するためにASCを利用して血管新生を刺激するので、一実施形態では、抗癌作用物質は、in vivoで免疫応答および/または抗血管新生応答を誘導する能力を有する治療用ポリペプチドをコードする。
一実施形態では、操作されたASCにより発現される核酸配列は、免疫刺激活性も抗血管新生活性も示す治療用遺伝子、例えばIL12(Diasら、(1998) Int J Cancer 75(1):151〜157頁、および本明細書において以下で引用される参考文献を参照)、インターフェロンアルファ(INFα)(O'Byrneら(2000) Eur J Cancer 36(2):151〜169頁、およびその中で引用される参考文献)、またはケモカイン(Nomura & Hasegawa (2000) Anticancer Res 20(6A):4073〜4080頁、およびその中で引用される参考文献)をコードする。
いくつかの実施形態では、ASCにより発現される抗癌作用物質は、細胞の死滅を促進する任意の分子、例えばそれだけに限らないが、creリコンビナーゼ(Cre)、アポトーシス促進遺伝子、細胞毒素分子、免疫毒素分子およびそれらの断片または誘導体でよい。いくつかの実施形態では、細胞毒性分子は、例えばそれだけに限らないが、植物ハロ毒素(halotoxin)、植物ヘミ毒素(hemitoxin)、細菌毒素、炭疽毒素、ジフテリア毒素(DT)、シュードモナス内毒素、ストレプトリシンO、サポリン(SAP)、ポークウィード抗ウイルスタンパク質(PAP)、ブリオジン1、ボーガニン(bouganin)およびゲロニンならびにそれらの断片または変異体でよい。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の第2の作用物質に対して細胞を感受性にする分子、例えば、例えばβ-グルクロニダーゼ、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β-ラクタマーゼ、カルボキシルエステラーゼHCE1、ペルオキシダーゼ酵素などの1つまたは複数の第2の作用物質に対して細胞を感受性にする抗癌作用物質である。いくつかの実施形態では、抗癌作用物質は、アポトーシス促進遺伝子、またはその断片もしくは変異体である。
いくつかの実施形態では、ASCにより発現されるアポトーシス促進作用物質は、核酸作用物質、例えばRNAi分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸分子である。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されている方法で有用なRNA干渉(RNAi)作用物質には、例えば、それだけに限らないが、アンチセンスヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、siRNA、shRNA、miRNA、リボザイム、アビミア(avimir)またはそれらの変異体もしくは誘導体が含まれる。いくつかの実施形態では、RNAi作用物質はshRNA分子である。そのような実施形態では、RNAi分子は、その用語が本明細書で定義されているように、必須遺伝子(例えば、細胞生存に必要なタンパク質をコードする遺伝子)、あるいは癌標的遺伝子を遺伝子サイレンシングする。RNAi抗癌作用物質により遺伝子サイレンシングされる癌標的遺伝子の例には、例えば、それだけに限らないが、HER2/Her-2、BRAC1およびBRAC2、Rb、p53などが含まれる。これらのタンパク質のいずれかに対するsiRNA分子を設計することは、当業者にとって日常的である。
いくつかの実施形態では、抗癌作用物質は、対象において癌を引き起こす発癌遺伝子を遺伝子サイレンシングするRNAi作用物質であり、ここで対象は発癌遺伝子(すなわち癌を引き起こす異常な遺伝子)も正常な遺伝子も含む。癌を引き起こす遺伝子は、ポリヌクレオチド配列の違いにより、その遺伝子の正常なコピーとは異なる。癌を引き起こすそのような遺伝子は当技術分野で周知であり、本明細書で開示されている抗癌作用物質により遺伝子サイレンシングされることについて包含され、それには、例えば、それだけに限らないが、ABL1、BCL1、BCL2、BCL6、CBFA2、CBL、CSF1R、ERBA、ERBB、EBRB2、FGR、FOS、FYN、HRAS、JUN、LCK、LYN、MYB、MYC、NRAS、RETまたはSRCなどの発癌遺伝子;BRCA1またはBRCA2などの腫瘍抑制遺伝子;接着分子;サイクリンキナーゼおよびその阻害物質が含まれる。発生遺伝子、発癌遺伝子、および酵素を含めた潜在的な標的遺伝子の例示的なリスト、ならびに本発明に従って治療することができる癌のリストは、その全体が参照により本明細書に組み込まれているWO 99/32619中に認めることができる。
いくつかの実施形態では、抗癌作用物質は、癌幹細胞を選択的に標的とし、好ましくはそれを消失させるRNAi抗癌作用物質である。そのようなRNAi抗癌作用物質は当技術分野で知られ、癌幹細胞において特異的に発現する遺伝子を遺伝子サイレンシングするRNAi抗癌作用物質を含む。
いくつかの実施形態では、抗癌作用物質をコードする核酸配列は、特に癌細胞を死滅させる抗癌作用物質の発現を可能にし、例えばそれは免疫毒素分子などをコードしうる。
いくつかの実施形態では、抗癌作用物質は、任意の抗血管新生作用物質、または血管の形成を阻害しもしくは血管新生、例えば内皮細胞の移動を阻害する任意の作用物質を特に除外する。
別の実施形態では、抗癌作用物質はホルモンまたはホルモンステロイドを特に除外する。いくつかの実施形態では、除外されるホルモンには、ヒト成長因子、線維芽細胞成長因子、神経成長因子、インスリン様成長因子、造血幹細胞成長因子、線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバー、血小板由来成長因子ファミリーのメンバー、血管および内皮細胞成長因子、(骨形成因子を含めた)TGFbファミリーのメンバー、酸性および塩基性線維芽細胞成長因子、血管内皮成長因子(VEGF)、上皮成長因子(EGF)、形質転換成長因子a(TGFa)およびベータ(TGFb)、血小板由来内皮成長因子(PDEGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)、肝細胞成長因子(HGF)、インスリン様成長因子、エリスロポエチン(EPO)、コロニー刺激因子(CSF)、マクロファージ-CSF、顆粒球/マクロファージCSFおよび一酸化窒素シンターゼ(NOS)などのサイトカインもしくは成長ホルモン、または先天性疾患(例えばジストロフィー)に特異的な酵素が含まれる。
別の実施形態では、抗癌作用物質は、組織内で血管新生を誘導し、または組織内で新血管形成を促進する血管新生ホルモン(例えば血管成長因子、血管および内皮細胞成長因子など)を特に除外する。
いくつかの実施形態では、抗癌作用物質はアポトーシス促進作用物質である。いくつかの実施形態では、アポトーシス促進作用物質はRNAi作用物質である。いくつかの実施形態では、RNAiアポトーシス促進作用物質は、(生存分子または生存因子としても知られる)抗アポトーシス分子を遺伝子サイレンシングする。そのような分子の例には、それだけに限らないが、当業者に周知である数多くの抗アポトーシス分子、例えばBcl-2;Bcl-XL;Hsp27;アポトーシス阻害(IAP)タンパク質が含まれる。
いくつかの実施形態では、ASCにより発現されるアポトーシス促進作用物質は、第2の作用物質(すなわちプロドラッグ)を活性化するタンパク質(例えば酵素)である。例えば、理論に拘泥するものではないが、抗癌作用物質は、チロシンキナーゼ、例えばβグルクロニダーゼ活性でありうる。βグルクロニダーゼは、9-アミノカンプトテシンやp-ヒドロキシアニリンマスタードなどの低毒性プロドラッグ、またはドキソルビシン(DOX)の抗腫瘍効果を向上させるために開発されたN-[4-ドキソルビシン-N-カルボニル(オキシメチル)フェニル]O-β-グルクロニルカルバメート(DOX-GA3)などの類似体を活性化する。プロドラッグDOX-GA3は、ヒトβ-グルクロニダーゼ(GUS)により活性分子または薬物へと活性化されて腫瘍部位で特異的に高い細胞傷害効果が生じるように最初に設計された。抗癌化学療法併用放射線療法(CCRTC)戦略において適当な放射性核種を取り込むことで、そのようなプロドラッグの効力を大いに亢進することもできる。いくつかの実施形態では、抗癌薬を効率よく送達するためにプロドラッグを利用してリポソームを改変することもできる(Chenら、current medicinal chemistry; 2003 3;139〜150頁;Chenら、cancer Gene Ther、2006)。
別の実施形態では、ASCにより発現されるアポトーシス促進作用物質は、例えば、寄生虫トリパノソーマブルセイ(Trypanosoma brucei)(Tb)由来のヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)であり、それは、そのヒト相同体より高い効率で、プリン類似体であるアロプリノールを対応するヌクレオチドに変換することができ、したがってプロドラッグのアロプリノールを細胞傷害性代謝物へと活性化することができる(Trudeauら、2001;Human Gene Ther; 12:1673〜1680頁)。別の実施形態では、エフェクター分子は、シュードモナスシュードアルカリゲネス(Pseudomonas pseudoalcaligenes)JS45由来の細菌ニトロベンゼンニトロレダクターゼ(NbzA)でよく、それはジニトロベンズアミド癌プロドラッグCB 1954および前駆抗生物質ニトロフラゾンを活性化する(Berneら、2006;Biomacromolecules、7;2631〜6頁)。
別の実施形態では、ASCにより発現されるアポトーシス促進作用物質はβ-ラクタマーゼであり、それはプロドラッグのデスアセチルビンブラスチン-3-カルボン酸ヒドラジド(DAVLBHYD)または他の類似体から活性作用物質または薬物を産生する。そのような実施形態では、エフェクタータンパク質であるエンテロバクタークロアカエ(Enterobacter cloacae)ベータ-ラクタマーゼ(bL)は、フェニレンジアミンマスタード(PDM)のセファロスポリンプロドラッグである抗癌プロドラッグ7-(4-カルボキシブタンアミド)セファロスポリンマスタード(CCM)を活性化することができる(Svenssonら、1999; J Med Chem.、41:1507〜12頁)。
別の実施形態では、ASCにより発現されるアポトーシス促進作用物質は、抗ウイルス薬、例えば、それだけに限らないが、抗ウイルス薬として一般的に使用されるオセルタミビルを触媒する分子でよく、オセルタミビルは、エフェクター分子であるカルボキシルエステラーゼHCE1の第2の作用物質として働くことができる(Shiら、2006; J Pharmacol Exp Ther.)。
一実施形態では、当技術分野で知られているプロドラッグ/酵素の組合せは、ASCにより発現されるアポトーシス促進作用物質として使用することができ、光力学療法で毒性ラジカルを産生する酵素を含めて(Wardmanら、2001; Scientific Yearbook、2001-2002を参照)、本明細書で開示されている方法での使用について包含され、例えばペルオキシダーゼ遺伝子をエフェクター分子として使用することができる。
発現系
いくつかの実施形態では抗癌作用物質は、抗癌作用物質がプロモーターに作動可能に連結した核酸配列によってコードされているASCから発現される。これによりプロモーターの活性化は抗癌作用物質の発現を生じる。本明細書で開示されるとおり具体的なプロモーター、例えば構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターは抗癌作用物質の発現を選択的にオンにするまたはオフにするために使用されうる。
プロモーターは当業者に十分に周知であり、抗癌作用物質の発現のために任意の適切なプロモーターが使用されうる。いくつかの実施形態ではプロモーターは構成的プロモーターまたはそれらの断片もしくは誘導物である。代替の実施形態ではプロモーターは、組織特異的もしくは細胞特異的プロモーターまたはそれらの断片もしくは誘導物である。
いくつかの実施形態では本明細書で開示される抗癌作用物質をコードする核酸配列は、場合によってプロモーター、例えばこれだけに限らないがエンハンサー、5'非翻訳領域(5'UTR)、3'非翻訳領域(3'UTR)および抑制配列;構成的プロモーター、誘導性プロモーター;組織特異的プロモーター、細胞特異的プロモーターまたはそれらの変異体をさらに含みうる。使用されうる組織特異的プロモーターの例は、これだけに限らないがアルブミン、リンパ系特異的プロモーター、T細胞プロモーター、神経線維プロモーター、膵臓特異的プロモーター、乳清プロモーター;hoxプロモーター、アルファ-フェトプロテインプロモーター、ヒトLIMK2遺伝子プロモーター、FABプロモーター、インスリン遺伝子プロモーター、トランスサイレチン、アルファ1-アンチトリプシン、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子1型(PAI-1)、アポリポタンパク質ミエリン塩基性タンパク質(MBP)遺伝子、GFAPプロモーター、OPSINプロモーター、NSE、Her2、erb2ならびにそれらの断片および誘導物を含む。使用されうる他のプロモーターの例は、これだけに限らないがテトラサイクリン、メタロチオネイン、エクジソン、哺乳動物ウイルス(例えばアデノウイルス後期プロモーター;およびマウス乳癌ウイルス末端反復配列(MMTV-LTR))ならびに他のステロイド応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーターおよびそれらの変異体を含む。
いくつかの実施形態ではASCは、第2のプロモーターに作動可能に連結した少なくとも1つのマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む第2の核酸配列で場合によって形質導入されてよく、マーカー遺伝子の遺伝子発現は標的遺伝子も発現している細胞を同定する。第1のおよび第2の核酸は、同じまたは別のベクター中にあってよい。
いくつかの実施形態ではヌクレオチド構築物は、少なくとも1つのマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列であって、マーカー遺伝子の発現が第1の抑制性プロモーター配列に作動可能に連結しており、マーカー遺伝子の遺伝子発現が標的遺伝子も発現している細胞を同定するヌクレオチド配列を場合によってさらに含む。いくつかの実施形態では核酸配列は;配列内リボソーム標的部位(IRES)および/またはマルチプルクローニングヌクレオチド配列部位の群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列を場合によってさらに含みうる。あるいはいくつかの実施形態では本明細書で開示される核酸および系は、第1の抑制性プロモーター配列に作動可能に連結したマーカー遺伝子またはその断片をさらに含む。
プロモーター
本明細書において使用される用語「プロモーター」は、異種性標的遺伝子、RNAi作用物質または抑制タンパク質をコードする核酸などの核酸配列の発現を制御する任意の配列を意味する。プロモーターは、例えば構成的、誘導性、抑制性または組織特異的であってよい。「プロモーター」は、転写の開始および速度が調節されるポリヌクレオチド配列の領域である調節配列である。それは、制御タンパク質および分子がRNAポリメラーゼおよび他の転写因子などにそこで結合できる遺伝子エレメントを含有できる。句「作動可能に連結した」、「作動可能に位置した」「作動的に連結した」「調節下」および「転写調節下」は、配列の転写開始および/または発現を調節するための核酸配列との関連でプロモーターが正しい機能的位置および/または向きにあることを意味する。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性制御配列を指す「エンハンサー」と共に使用されてよいまたはされなくてよい。
プロモーターは、コードセグメントおよび/またはエクソンの上流に位置する5'非コード配列を単離するステップによって得られる場合があることから、遺伝子または配列と天然で関連するものである場合がある。そのようなプロモーターは「内在性」と称されうる。同様にエンハンサーは、配列の下流または上流のいずれかに位置する核酸配列に天然で関連するものである場合がある。あるいはコード核酸セグメントを組換えまたは異種性プロモーター(天然環境においては核酸配列と通常関連していないプロモーターを意味する)の調節下に位置付けるステップによって一定の有利点が得られる。組換えまたは異種性エンハンサーは、天然環境においては核酸配列と通常関連していないエンハンサーも意味する。そのようなプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサーおよび任意の他の原核生物、ウイルスもしくは真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサーならびに「天然に存在」しない(すなわち異なる転写制御領域のさまざまなエレメントおよび/または発現を変化させる変異を含有する)プロモーターまたはエンハンサーを含んでよい。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に作製するステップに加えて、配列は本明細書で開示される組成物と関連して組換えクローニングおよび/またはPCR(商標)を含む核酸増幅技術を使用して作製されうる(米国特許第4683202号、米国特許第5928906号を参照されたい、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる)。さらにミトコンドリア、葉緑体などの非核細胞小器官中の配列の転写および/または発現を導く調節配列が同様に使用されうることは検討される。
抑制性および誘導性プロモーター
(i)誘導性プロモーター
誘導性プロモーターは、プロモーターの非存在下、非影響下または接していない場合よりも誘導物質の存在下、影響下または接している場合に生じる追加的転写活性によって特徴付けられる。誘導物質は内在性でもよく、または誘導性プロモーターによって発現を誘導するステップにおいて活性であるような方法で投与される通常は外来性の化合物もしくはタンパク質でもよい。いくつかの実施形態では誘導作用物質、すなわち化合物またはタンパク質は、それ自体がポリヌクレオチドの転写または発現の結果でもよく(すなわち抑制タンパク質でもよい)、それ自体が調節下にあるまたは誘導性もしくは抑制性プロモーターでもよい。誘導性プロモーターの例は、これだけに限らないが;テトラサイクリン、メタロチオネイン、エクジソン、哺乳動物ウイルス(例えばアデノウイルス後期プロモーターおよびマウス乳癌ウイルス末端反復配列(MMTV-LTR))ならびに他のステロイド応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーターなどを含む。
本発明の方法および系において有用な誘導性プロモーターは、真核宿主生物において機能できる。好ましい実施形態は、哺乳動物誘導性プロモーターを含むが、他の生物由来の誘導性プロモーターおよび真核宿主において機能するように設計された合成プロモーターも使用されうる。本発明の誘導性プロモーターの重要な機能的特徴は、環境誘導作用物質(environmental inducing agent)などの外来的に添加された作用物質への暴露によるそれらの最終的な誘導能である。適切な環境誘導作用物質は、熱、種々のステロイド性化合物、2価カチオン(Cu+2およびZn+2を含む)、ガラクトース、テトラサイクリン、IPTG(イソプロピル-ベータ-Dチオガラクトシド)ならびに他の天然に存在するおよび合成の誘導作用物質ならびに無償性誘導物質(gratuitous inducer)への暴露を含む。
本明細書で開示される核酸構築物および系は、2つの機構のいずれかによる真核生物プロモーターの誘導能を包含する。本発明の詳細な実施形態では適切な誘導性プロモーターを含む核酸構築物は、転写活性化因子(これはさらに環境誘導作用物質に依存する)に依存する場合がある。いくつかの実施形態では誘導性プロモーターは、それ自体が環境誘導作用物質によって不活性化される転写抑制因子によって抑制されうる。これにより誘導性プロモーターは、転写活性化因子をポジティブに活性化させる環境誘導作用物質によって誘導されるものまたは転写抑制因子をネガティブに制御する環境作用物質によって抑制解除されるもののいずれかでありうる。例えば実施例において実証されるとおり、使用される1つの誘導性プロモーターはLacO系であるので外来的に加えられる作用物質IPTGの添加は転写抑制因子LacIをネガティブに制御する。
本明細書で開示される方法および系において有用な誘導性プロモーターは、環境誘導作用物質の作用による誘導の対象である潜在的転写活性化因子(latent transcriptional activator)の作用によって調節されるものを含む。好ましい例は、酵母ACE1転写活性化因子による銅依存性活性化の対象である酵母遺伝子CUP1、CRS5およびSOD1の銅誘導性プロモーターを含む(例えばStrainおよびCulotta、1996;Hottigerら、1994;Lapinskasら、1993;およびGrallaら、1991を参照されたい)。あるいは、ACE1転写活性化因子に非依存的に作動する(Lapinskasら、1993)酵母遺伝子CTT1(細胞質カタラーゼTをコードする)の銅誘導性プロモーターは利用されうる。これらの遺伝子の効果的な誘導のために必要な銅濃度は、酵母およびショウジョウバエ細胞を含む大部分の細胞系が耐えられる程度に十分低い。あるいは他の天然に存在する誘導性プロモーターは;ステロイド誘導性遺伝子プロモーター(例えばOliginoら、(1998) Gene Ther.5:491〜6頁を参照されたい);酵母由来ガラクトース誘導性プロモーター(例えばJohnston(1987)Microbiol Rev 51:458〜76頁;Ruzziら(1987) Mol Cell Biol 7:991〜7頁を参照されたい);および種々の熱ショック遺伝子プロモーターを含み本発明において使用されうる。多数の真核生物転写活性化因子は、広範囲の真核宿主細胞において機能することが示されており、それにより例えば酵母において同定された誘導性プロモーターの多くが哺乳動物宿主細胞における使用のために同様に適用されうる。例えばGAL4結合部位を含有する哺乳動物プロモーターを誘導するGAL4-エストロゲン受容体融合タンパク質に基づく哺乳動物細胞のための独特な合成転写誘導系が開発されている(Braselmannら(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90:1657〜61頁)。特異的誘導作用物質に依存する転写活性化因子に応答するこれらおよび他の誘導性プロモーターは、本発明での使用に適している。
本明細書で開示される方法および系において有用な誘導性プロモーターは、環境誘導作用物質の作用による不活性化の対象である抑制因子によって抑制されるものも含む。例は、適切な抑制因子結合オペレーター配列を組み込むように操作されている真核生物プロモーターを転写的に抑制できる原核生物抑制因子を含む。本発明における使用のための好ましい抑制因子は、生理学的に穏和な誘導作用物質による不活性化に感受性である。したがってlacOオペレーター配列を含有するように操作されている真核生物プロモーターの発現を調節するためにlac抑制タンパク質が使用される場合、宿主細胞のIPTGでの処置は操作されたプロモーターからのlac抑制因子の解離を生じ、転写が生じるようにする。同様にtetOオペレーター配列を含有するように操作されている真核生物プロモーターの発現を調節するためにtet抑制因子が使用される場合、宿主細胞のテトラサイクリンでの処置は操作されたプロモーターからのtet抑制因子の解離を生じ、転写が生じるようにする。
本明細書で開示される方法および系において有用である誘導性プロモーターは、pH、温度、放射線、浸透圧、塩勾配、細胞表面結合および1つまたは複数の外来性もしくは内在性作用物質の濃度における変化など、1つまたは複数の生理的条件によって誘導されうる。外来性作用物質は、アミノ酸およびアミノ酸類似物、糖類および多糖類、核酸、転写活性化因子および抑制因子、サイトカイン、毒素、石油系化合物、金属含有化合物、塩、イオン、酵素基質類似物ならびにそれらの組合せを含みうる。具体的な実施形態では誘導性プロモーターは、化学物質、金属、放射線もしくは栄養素の濃度における変化またはpHにおける変化などの環境条件の変化への応答で活性化または抑制される。
さらに本明細書で開示される方法および系において有用な誘導性プロモーターは、ファージ誘導性プロモーター、栄養誘導性プロモーター、温度誘導性プロモーター、放射線誘導性プロモーター、金属誘導性プロモーター、ホルモン誘導性プロモーター、ステロイド誘導性プロモーターならびに/またはそれらのハイブリッドおよび組合せでありうる。電離放射線によって誘導されうるプロモーターは、特定の実施形態において、詳細にはUVまたはx線などの電離放射線への暴露によって遺伝子発現が癌細胞中で局所的に誘導される癌の遺伝子治療において使用されうる。放射線誘導性プロモーターは、fosプロモーター、c-junプロモーターまたはEgr-1プロモーターの少なくとも1つのCArGドメインの非限定的な例を含む。誘導性プロモーターの例は、チトクロムP450遺伝子、熱ショックタンパク質遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、エストロゲン遺伝子プロモーターなどのホルモン誘導性遺伝子などの遺伝子由来のプロモーターを含む。
さらなる実施形態では本明細書で開示される方法および系において有用な誘導性プロモーターは、Zn2+メタロチオネインプロモーター、メタロチオネイン-1プロモーター、ヒトメタロチオネインILAプロモーター、lacプロモーター、lacOプロモーター、マウス乳癌ウイルス初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、トリオース脱水素酵素プロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、サルウイルス40初期プロモーターまたはレトロウイルス骨髄増殖性肉腫ウイルスプロモーターでありうる。
誘導性プロモーターの例は、哺乳動物プロバシンプロモーター、ラクトアルブミンプロモーター、GRP78プロモーターまたは細菌性テトラサイクリン誘導性プロモーターを含む。他の例は、熱ショック、ステロイドホルモン、重金属、ホルボールエステル、アデノウイルスE1Aエレメント、インターフェロンおよび血清誘導性プロモーターを含む。
in vivoでの使用のための本明細書で開示される方法および系において有用な誘導性プロモーターは、限定された動物組織において通常見られるものなどの生物学的に適合性の作用物質に応答するものを含みうる。一例は、腫瘍壊死因子によって誘導されうるヒトPAI-1プロモーターである。さらなる適切な例は、種々の毒素および他の作用物質によって誘導されうるチトクロムP450遺伝子プロモーター;種々のストレスによって誘導されうる熱ショックタンパク質遺伝子;エストロゲン遺伝子プロモーターなどのホルモン誘導性遺伝子などである。
誘導性プロモーターは、Cu2+、Zn2+、テトラサイクリン、テトラサイクリン類似物、エクジソン、グルココルチコイド、タモキシフェンまたはlacオペロン(LacO)の誘導因子によっても誘導されうる。プロモーターは、エクジソン、グルココルチコイドまたはタモキシフェンによって誘導されうる。具体的な実施形態では誘導性プロモーターは、ファージ誘導性プロモーター、栄養誘導性プロモーター、温度誘導性プロモーター、放射線誘導性プロモーター、金属誘導性プロモーター、ホルモン誘導性プロモーター、ステロイド誘導性プロモーターまたはそれらの組合せである。放射線誘導性プロモーターの例は、fosプロモーター、junプロモーターまたはergプロモーターを含む。
本発明の意図する範囲内で使用されうる遺伝子発現の制御のための系は、プロゲステロン、エストロゲンおよび/またはエクジソンなどの化合物を利用する制御系を含む。
発現構築物は、異種性の標的遺伝子の発現が特定の時点で調節されうることを用いる、化学的に誘導できるプロモーターも含みうる(総説;Gatzら、(1997)Annu Rev Plant Physiol Plant MoI Biol 48:89〜108頁)。そのようなプロモーター、例えばサリチル酸誘導性プロモーター(WO 95/19443)、ベンゼンスルホンアミド誘導性プロモーター(EP 0 388 186)、テトラサイクリン誘導性プロモーター(Gatzら(1991)MoI Gen Genetics 227:229〜237頁)、アブシジン酸誘導性プロモーター(EP0 335 528)またはエタノールシクロヘキサノン誘導性プロモーター(WO 93/21334)は同様に使用されうる。同様に適切なのは、外来的に添加された例えばN,N-ジアリル-2,2-ジクロロアセトアミドなどの毒性緩和剤(safener)によって活性化でき(WO 93/01294)、単子葉類および双子葉類の両方の多数の組織において作動可能であるグルタチオン-S転移酵素アイソフォームII遺伝子(GST-I I-27)のプロモーターである。本発明において利用されうるさらなる例示的誘導性プロモーターは、銅に応答するACE1系由来のものを含む(Mettら、PNAS 90:4567〜4571頁(1993))。例示的誘導性プロモーターは、ステロイドホルモン遺伝子由来の誘導性プロモーターであり、その転写活性はグルココルチコステロイドホルモンによって誘導される(Schenaら(1991)Proc Nat'l Acad Sci USA 88:10421頁)。
(ii)抑制性プロモーター
本発明において検討されるプロモーターは、本明細書においてしばしば「抑制性プロモーター」と称される条件プロモーターを含む。条件プロモーターまたは抑制性プロモーターは、特定の条件下でのみ活性であるプロモーターである。例えばプロモーターは、化学化合物または「抑制タンパク質」と称される特定のタンパク質などの特定の抑制性作用物質が存在する場合に不活性化または抑制されうる。作用物質が存在しなくなると転写は活性化されるかまたは抑制解除される。条件プロモーターの例は、これだけに限らないがメチオニン濃度に応じて制御されうるプロモーターMet25(Kerjan P.ら、1986)、またはガラクトースの濃度に応じて制御されうるプロモーターGAL1またはGAL10(JohnstonおよびDavis、1984)を含みうる。
抑制可能なプロモーターは、転写を促進するその能力が、プロモーターを抑制するように作用しそれによりプロモーターの影響下のポリヌクレオチドの転写を減少、阻害または抑制する化合物またはタンパク質である抑制因子の存在または作用に少なくとも部分的に応答するものである。抑制可能なプロモーターは、プロモーターの非存在下、非影響下または接していない場合よりも抑制因子の存在下、影響下または接している場合に生じるより低いレベルの転写活性によって特徴付けられる。抑制因子は内在性でもよく、または抑制可能なプロモーターを抑制するステップにおいて活性であるような方法で投与される通常は外来性の化合物もしくはタンパク質でもよい。抑制因子(すなわち化合物またはタンパク質)の提供は、それ自体がポリヌクレオチド(それ自体が調節下にあるまたは誘導性もしくは抑制可能なプロモーターでもよい)の転写または発現の結果でよい。
具体的な実施形態では本明細書で開示される核酸構築物は、核酸構築物のRNAi作用物質の発現を転写的に調節する抑制性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では抑制性プロモーターへの抑制タンパク質の発現は、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターによって転写的に調節されうる。
いくつかの実施形態では外来性の刺激によって調節されうるプロモーターは、本発明の方法および組成物において利用される。外来性の刺激によって調節されうるプロモーターの例は、例えばPLプロモーター、PRプロモーター、Preプロモーター、Prmプロモーター、P'Rプロモーター、T7後期プロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、lacプロモーター、galプロモーター、araプロモーターもしくはrecAプロモーターまたはそれらの断片を含む。詳細な実施形態ではこれらのプロモーター由来のオペレーター配列は、本発明の核酸構築物および系において利用される。
本発明の詳細な実施形態では発現の調節は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド成分の両方を含む具体的な系の使用を通じてもたらされる。原核生物および真核生物の両方において、DNA上の特定の部位に対して親和性を有するポリペプチドは遺伝子の転写発現および遺伝子の特定の部位でのDNAとの相互作用を調節し、本明細書において「抑制タンパク質」または「抑制因子」と称されるポリペプチドは、例えばRNAポリメラーゼにDNAが到達できないようにすることによって転写を妨げる。
典型的には本明細書で開示されるLTRi構築物は、少なくとも1つのtetオペレーター(tetO)配列に作動可能に連結したRNAi作用物質を含む。tetO配列は、例えば、その内容全体が本明細書に参照により組み込まれるProtein-Nucleic Acid Interaction、Saeger & Heinemann編、Macmillan, London、1989、Vol.10、143〜162頁中のHillen & Wissmann、「Topics in Molecular and Structural Biology」により得られる。本発明の実施において使用されうる他のtetO配列は、Genbankから得られるおよび/またはそれらの内容全体が本明細書に参照により組み込まれるWaters, S. H.ら、(1983)Nucl. Acids Res.11:6089〜6105頁;Hillen, W. and Schollmeier, K.(1983)Nucl. Acids Res.11:525〜539頁;Stuber, D.およびBujard, H.(1981)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:167〜171頁;Unger, B.ら(1984)Nucl Acids Res.12:7693〜7703頁;およびTovar, K.ら(1988)Mol. Gen. Genet. 215:76〜80頁において開示されている。tetオペレーター配列の1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個もしくは10個またはそれ以上のコピーは、そのような配列の数が多くなるほど制御幅の増強が可能になって、いくつかの実施形態で使用されうる。
しかしながらERDまたはSID転写抑制ドメインを含む他の抑制ドメインが使用でき、例えば転写抑制因子として作用する転写因子および転写因子ドメインは、例えばMAD (例えばSommerら、1998;Guptaら、1998;Quevaら、1998;Larssonら、1997;Lahertyら、1997およびCultraroら、1997を参照されたい);FKHR (横紋筋肉腫遺伝子におけるフォークヘッド、Ginsbergら、1998;Epsteinら、1998);EGR-1 (初期増殖応答遺伝子産物-1、Yanら、1998およびLiuら、1998);ets2抑制因子抑制ドメイン(ERD、Sgourasら、1995);およびMAD smSIN3相互作用ドメイン(SID、Ayerら、1996)を含む。
DNA結合タンパク質は、直接結合機構を通じた抑制に関する実施形態についてこれらのポリペプチドが実際どのようにDNA分子に接触し、遺伝子発現に影響を与えるためにそれと相互作用するかを決定するために広く特徴付けられている。これらのポリペプチドの非限定的ないくつかの例は、アルファヘリックス-ターン-アルファヘリックス(H-T-H)構造モチーフを含有するものを含む。これらのタンパク質は、二量体としてまたは四量体としてパリンドローム近似配列(approximately palindromic sequence)を有する特定のオペレーター配列でDNAに結合する。各単量体の2つの隣接するアルファヘリックスによってB型DNAの主溝における2つの部位の中および付近に作られる接触がDNAとこれらのタンパク質との間の境界面における主な特性である。このやり方で結合するタンパク質は、H-T-H領域において配列類似性を共有するが他の領域における類似性の程度はさまざまである。タンパク質のこの群は、例えば溶原性バクテリオファージ抑制タンパク質およびCroタンパク質、GalR、LacI、LexAおよびTrpRなどの細菌性代謝抑制タンパク質、細菌性活性化タンパク質CAPおよび二重活性化/抑制タンパク質AraC、細菌性トランスポゾンおよびプラスミドTetRタンパク質、酵母交配型制御タンパク質MATalおよびMATアルファ2ならびに真核生物ホメオボックスタンパク質を含む。
他の抑制因子は、H-T-H結合タンパク質にほとんどまたは全く配列相同性を有さず、H-T-H結合モチーフを有さない。オペレーターのパリンドローム近似配列対称との結合は、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)バクテリオファージP22 Mntタンパク質(VERS87a)および大腸菌(E. coli)TyrR抑制タンパク質(DEFE86)などのこの群のいくつかのタンパク質において観察される。この群の他のものは、部分的に対称である(S.チフィムリウムファージP22 Arcタンパク質、VERS87b;大腸菌Furタンパク質、DEL087;プラスミドR6K piタンパク質、FILU85)または非対称である(ファージMu抑制因子、KRAU86)オペレーター配列に結合する。
当業者は、本発明において利用される抑制因子および/またはDNA結合ドメインは野生型と比較した変異を、これらの成分の各機能に変異が有害な影響を与えない限り、含みうることおよびこれらの変異化された成分が本発明の方法および組成物において利用されうることを認識する。
B.誘導性作用物質および誘導性の系
本明細書で開示される作用物質の投与または除去は、異種性標的遺伝子の転写のオン状態またはオフ状態の間の切り換えを生じる。いくつかの小分子リガンドは、制御された遺伝子発現を組織培養細胞においておよび/またはトランスジェニック動物モデルにおいてのいずれでも調節することが示されている。これらはFK1012およびラパマイシン免疫抑制薬(Spencerら、1993;Magariら、1997)、プロゲステロンアンタゴニストミフェプリストン(RU486) (Wang、1994;Wangら、1997)、テトラサイクリン抗生物質誘導物(GossenおよびBujard、1992;Gossenら、1995;Kistnerら、1996)および昆虫ステロイドホルモンエクジソン(Noら、1996)を含む。これら全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
さらなる例示の方法により、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6444871号においてYaoは、テトラサイクリン耐性(tet)オペロンに関連する原核生物エレメント、tet抑制タンパク質が哺乳動物細胞において転写を調節することが既知であるポリペプチドと融合されている系を開示している。それにより融合タンパク質は、tetオペレーター配列の位置決定によって特定の部位に方向付けられている。例えばtet抑制因子は、トランス活性化因子(VP16)に融合されており、選択された遺伝子のプロモーターの上流に位置するtetオペレーター配列に標的化されている(Gussenら、1992;Kimら、1995;Hennighausenら、1995)。融合タンパク質のtet抑制因子部分はオペレーターに結合し、それにより転写の誘導が望ましい特定の部位にVP16活性化因子を標的化する。代替手法は、tet抑制因子をKRAB抑制因子ドメインに融合し、このタンパク質を遺伝子の数百塩基対上流に位置するオペレーターに標的化する。この系を使用してキメラタンパク質(しかしtet抑制因子単独ではなく)がCMV制御遺伝子発現の10から15倍の抑制を作りだせることが見出されている(Deuschleら、1995)。
本明細書で開示される方法および系において有用である抑制性プロモーターの一例は、3種の異なる手法:(1)プロモーター部位に適切に位置付けられたlacオペレーターによる転写開始の阻止(HuおよびDavidson、1987;Brownら、1987;Figgeら、1988;Fuerstら、1989;Deuschleら、1989;(2)LacR/オペレーター複合体による転写しているRNAポリメラーゼIIの伸長中の遮断(Deuschleら、(1990);ならびに(3)LacRと単純ヘルペスウイルス(HSV)ビリオンタンパク質16(VP16)の活性化ドメインと間の融合に応答するプロモーターの活性化(Labowら、1990;Bairnら、1991)によって遺伝子発現を制御するために使用されている大腸菌のLac抑制因子(lacR)/オペレーター/誘導因子系である。
Lac系の1バージョンではlacオペレーター連結配列の発現は、LacR-VP16融合タンパク質によって構成的に活性化され、イソプロピル-ベータ-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)の存在下で遮断される(Labowら(1990)、上に引用)。系の他のバージョンにおいてはIPTGの存在下でlacオペレーターに結合し、細胞の温度を上昇させることによって増強されうるlacR-VP16変異体が使用される(Baimら(1991)、上に引用)。したがって本発明のいくつかの実施形態ではLac系の成分が利用される。例えばlacオペレーター(LacO)は組織特異的プロモーターに作動可能に連結でき、異種性標的遺伝子および、TetRなどの第1抑制タンパク質(first repressor protein)の転写および発現を調節できる。したがってsiRNAの発現(およびしたがって異種性標的遺伝子の遺伝子サイレンシング)は、IPTGの存在がRNAi発現の阻害および異種性標的遺伝子発現の誘導を生じるように、異種性標的発現の発現と比較して逆に制御される。
大腸菌のテトラサイクリン(Tc)耐性系の成分が真核細胞において機能することも見出されており、遺伝子発現を制御するために使用されている。例えば、テトラサイクリン非存在下でtetオペレーター(tetO)配列に結合し、遺伝子転写を抑制するTet抑制因子(TetR)は、tetオペレーター配列を含有するプロモーターからの転写を抑制するために十分高い濃度で植物細胞において発現されている(Gatz, C.ら(1992)Plant J. 2:397〜404頁)。本発明のいくつかの実施形態ではTet抑制系は同様に利用される。
低温誘導性トランス活性化因子をVP16トランス活性化因子に融合している熱ショック応答性制御因子rheAを有する融合タンパク質の形態で含む例示的TIGR系などの温度誘導性遺伝子制御系も本発明において使用されうる(Weberら、2003a)。この融合温度熱センサーに応答するプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターのミニマル型などのミニマルプロモーターに作動可能に連結したrheOエレメントを含む。37℃の許容的温度では、低温誘導性トランス活性化因子は、例示的なrheO-CMVminプロモーターをトランス活性化し、標的遺伝子の発現を可能にする。41℃では低温誘導性トランス活性化因子は、もはやrheOプロモーターをトランス活性化しない。
本発明において有用な他の実施形態は、エリスロマイシン、クラリスロマイシンおよびロキシスロマイシンなどのマクロライド抗生物質に応答する抑制可能な(Eoff)および誘導性(Eon)系を有する大腸菌由来のエリスロマイシン耐性レギュロンを含む(Weberら、2002)。Eoff系は、マクロライド抗生物質が導入遺伝子発現を抑制するとの条件でエリスロマイシン依存性トランス活性化因子を利用する。Eon系では、抑制因子のオペレーターへの結合は導入遺伝子発現の抑制を生じる。したがってマクロライドの存在下で遺伝子発現が誘導される。
Fusseneggerら、(2000)は、ストレプトマイセス・セリカラー(Streptomyces coelicolor)のストレプトグラミン耐性オペロンによってコードされたPip(プリスチナマイシン誘導タンパク質)抑制因子を使用する抑制可能なおよび誘導性の系であって、ストレプトグラミン型抗生物質(例えばプリスチナマイシン、バージニアマイシンおよびシナッシドなど)に応答性の系を記載している。PipDNA結合ドメインは、例えばVP16トランス活性化ドメインまたはKRABサイレンシングドメインに融合される。例えばプリスチナマイシンの存在または非存在は、PipONおよびPipOFF系を本明細書に記載のとおりそれらそれぞれのやり方で制御する。
導入遺伝子発現系の他の例は、クオラムセンシング(抑制因子のオペレーター部位への結合を阻止し、標的レギュロンの抑制解除を生じる拡散性シグナル分子を有する具体的な原核生物分子情報伝達系を指す)系を利用する。例えばWeberら、(2003b)は、融合タンパク質が結合する各オペレーターを有するキメラプロモーターを制御するトランス活性化ドメインに対するストレプトマイセス・セリカラーのクオラム送信受容体を含む融合タンパク質を使用する。発現は、SCB1およびMP133などの無毒性ブチロラクトンで良く調整される。
詳細な実施形態では、相互に機能的に適合する多重制御された多重遺伝子治療用遺伝子発現系は、本発明において利用される(例えばKramerら、(2003)を参照されたい)。例えばWeberら、(2002)では、マクロライド応答性エリスロマイシン耐性レギュロン系がストレプトグラミン(PIP)制御およびテトラサイクリン制御発現系と共に使用される。
いくつかの実施形態では誘導性プロモーターは、熱誘導性プロモーターでありうる。これだけに限らないが熱ショック遺伝子中の熱応答性エレメント(例えばhsp20-30、hsp27、hsp40、hsp60、hsp70およびhsp90)を含む任意の熱誘導性プロモーターが本発明の方法に従って使用されうる。Eastonら(2000) Cell Stress Chaperones 5(4):276〜290頁;Csermelyら(1998)Pharmacol Ther 79(2):129〜168頁;Ohtsuka & Hata(2000)lnt J Hyperthermia 16(3):231〜245頁およびこれらに引用されている参考文献を参照されたい。熱ショックタンパク質および熱応答性プロモーターエレメントへの配列類似性は、他の機能に関して初めに特徴付けられた遺伝子においても認められており、熱誘導性を付与するDNA配列は開示される遺伝子治療ベクターにおける使用のために適している。例えばグルコース応答性遺伝子(例えばgrp94、grp78、モータリン/grp75) (Merrickら(1997)Cancer Lett 119(2):185〜190頁; Kiangら(1998)FASEB J 12(14):1571〜16〜579)、カルレティキュリン(Szewczenko-Pawlikowskiら(1997)MoI Cell Biochem 177(1〜2):145〜152頁)、クラスタリン(Viardら(1999)J Invest Dermatol 112(3):290〜296頁;Michelら(1997)Biochem J 328(Pt1):45〜50頁;Clark & Griswold(1997)J Androl 18(3):257〜263頁)、組織適合性クラスI遺伝子(HLA-G)(Ibrahimら(2000)Cell Stress Chaperones 5(3):207〜218頁)およびアミロイド前駆体タンパク質のクニツプロテアーゼアイソフォーム(Shepherdら(2000)Neuroscience 99(2):31 7〜325頁)の発現は、熱への応答で上方制御される。
クラスタリンの場合、熱誘導性のために十分である14塩基対エレメントが概説されている(Michelら(1997)Biochem J 328(Pt1):45〜50頁)。同様に10および14塩基対エレメントをカルレティキュリンプロモーター領域に含む2つの配列構成単位が熱誘導性を付与することが示されている(Szewczenko-Pawlikowskiら(1997)MoI Cell Biochem 177(1〜2):145〜152頁)。非熱性刺激に応答性の他のプロモーターは使用されうる。例えばモータリンプロモーターは低照射量の電離放射線によって誘導され(Sadekova(1997)Int J Radiat Biol 72(6):653〜660頁)、hsp27プロモーターは17ベータ-エストラジオールおよびエストロゲン受容体アゴニストによって活性化され(Porterら(2001)J MoI Endocrinol 26(1):31〜42頁)、HLA-Gプロモーターは亜ヒ酸によって誘導され、hspプロモーターは光線力学的療法によって活性化されうる(Lunaら(2000)Cancer Res 60(6):1637〜1644頁)。適切なプロモーターは組織特異的活性化などの因子を組み込みうる。例えばhsp70は、負荷をかけた神経芽細胞腫細胞において転写的に損なわれる(Drujan & De Maio(1999)12(6):443〜448頁)。ヒト脳腫瘍において上方制御されるモータリンプロモーター(Takanoら(1997)Exp Cell Res 237(1):38〜45頁)。本発明の方法において使用されるプロモーターは、例えばモータリン(Takanoら、(1997)Exp Cell Res 237(1):38〜45頁)、hsp27およびカルレティキュリン(Szewczenko-Pawlikowskiら(1997)MoI Cell Biochem 177(1〜2):145〜152頁;Yuら(2000)Electrophoresis 2 l(14):3058〜3068頁)、grp94およびgrp78 (Gazitetら(1999)Breast Cancer Res Treat 54(2):135〜146頁)、hsp27、hsp70、hsp73およびhsp90(Cardilloら(2000)Anticancer Res 20(6B):4579〜4583頁;Strikら(2000)Anticancer Res 20(6B):4457〜4552頁)について記載のとおり腫瘍細胞において選択的な上方制御を示しうる。
C.組織特異的プロモーター
本発明の特定の態様では、具体的な細胞または組織において(例えば脂肪細胞において)抗癌作用物質を発現するために組織特異的プロモーターが使用される。組織特異的プロモーターの使用は、したがって例えば抗癌作用物質がASCにおいてのみ発現されるような抗癌作用物質発現について追加的レベルの調節を提供する。
分子生物学の当業者は、一般にタンパク質発現のためのプロモーターと細胞型との組合せの使用を周知であり、例えば本明細書に参照により組み込まれるSambrookら(1989)を参照されたい。使用されるプロモーターは、組換えタンパク質および/またはペプチドの大規模産生において有利であるなど、形質導入されたDNAセグメントの高レベル発現を導くために適切な条件下で構成的、組織特異的、誘導性および/または有用でありうる。プロモーターは異種性または内在性でありうる。特定の実施形態では本発明で使用されるプロモーターは組織特異的プロモーターである。
現在種々のプロモーターが動物、哺乳動物またはヒトにおいて配列を発現するために当技術分野において使用されている。それらの大部分は、組織特異性を欠いており、本明細書において提供される教示と有利に組み合わされうる。例えばプロモーターは、perbB2プロモーター、乳清酸性タンパク質プロモーター、ストロメライシン3プロモーター、前立腺特異的抗原プロモーター、プロバシンプロモーターからなる群から選択されうる。
いくつかの実施形態では他の組織特異的プロモーターは、例えばこれだけに限らないがアルブミン(肝臓特異的、Pinkertら、(1987))、リンパ系特異的プロモーター(CalameおよびEaton、1988)、特にT細胞受容体のプロモーター(WinotoおよびBaltimore、(1989))および免疫グロブリン;Banerjiら、(1983); QueenおよびBaltimore、1983)、神経特異的プロモーター(例えば神経フィラメントプロモーター;ByrneおよびRuddle、1989)、膵臓特異的プロモーター(Edlundら、(1985))または乳腺特異的プロモーター(乳清プロモーター、米国特許第4873316号および欧州特許出願公開第264166号)ならびにマウスhoxプロモーター(KesselおよびCruss、Science 249:374〜379頁(1990))またはアルファ-フェトプロテインプロモーター(CampesおよびTilghman、Genes Dev.3:537〜546頁(1989))などの発生的に制御されたプロモーターを含み、それぞれの内容全体は本明細書に参照により組み込まれる。好ましくはプロモーターは、各細胞型において構成的である。
組織特異的プロモーターまたはエレメントの独自性およびそれらの活性を特徴付けるアッセイは当業者に十分に周知である。そのような領域の例は、ヒトLIMK2遺伝子(Nomotoら1999)、ソマトスタチン受容体2遺伝子(Krausら、1998)、マウス精巣上体レチノイン酸結合遺伝子(Lareyreら、1999)、ヒトCD4(Zhao-Emonetら、1998)、マウスアルファ2(XI)コラーゲン(Tsumakiら、1998)、DlAドパミン受容体遺伝子(Leeら、1997)、インスリン様増殖因子II(Wuら、1997)、ヒト血小板内皮細胞接着分子-1(Almendroら、1996)およびSM22アルファプロモーターを含む。組織特異的プロモーターおよび/または制御エレメントは、特定の実施形態で有用である。本発明の発現ベクターと使用されうるそのような組織特異的プロモーターの他の例は、結腸上皮細胞に対して特異的な肝臓脂肪酸結合(FAB)タンパク質遺伝子;膵臓細胞に対して特異的なインスリン遺伝子;肝臓細胞に対して特異的なトランスサイレチン、アルファ1-アンチトリプシン、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子1型(PAI-1)、アポリポタンパク質AIおよびLDL受容体遺伝子;オリゴデンドロサイトに対して特異的なミエリン塩基性タンパク質(MBP)遺伝子;グリア細胞に対して特異的なグリア線維酸性タンパク質(GFAP)遺伝子;目への標的化について特異的なOPSIN;および神経細胞に対して特異的な神経特異的エノラーゼ(NSE)プロモーターを含む。
同様に本発明において有用であると検討されるのは、デクチン-1およびデクチン-2プロモーターである。追加的な任意のプロモーター/エンハンサー組合せ(真核生物プロモーターデータベースEPDBによる)も、オリゴ糖プロセシング酵素をコードする構造遺伝子、タンパク質フォールディングアクセサリータンパク質、選択マーカータンパク質または対象の異種性タンパク質の発現を導くために使用されうる。代替として癌遺伝子治療などの遺伝子治療のための組織特異的プロモーターは、本発明において使用されうる。
組織特異的プロモーターの例は、これだけに限らないが筋肉および心臓組織での発現を導くために使用されているクレアチンキナーゼ用のプロモーターならびにB細胞での発現のための免疫グロブリン重鎖または軽鎖プロモーターを含む。他の組織特異的プロモーターは、ヒト平滑筋アルファ-アクチンプロモーターを含む。肝臓に対する例示的な組織特異的発現エレメントは、これだけに限らないがHMG-COA還元酵素プロモーター、ステロール制御エレメント1、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)プロモーター、ヒトC反応性タンパク質(CRP)プロモーター、ヒトグルコキナーゼプロモーター、コレステロールL7-アルファヒドロキシラーゼ(CYP-7)プロモーター、ベータ-ガラクトシダーゼアルファ-2,6シアリルトランスフェラーゼプロモーター、インスリン様増殖因子結合タンパク質(IGFBP-1)プロモーター、アルドラーゼBプロモーター、ヒトトランスフェリンプロモーターおよびコラーゲンI型プロモーターを含む。前立腺に対する例示的な組織特異的発現エレメントは、これだけに限らないが前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)プロモーター、前立腺分泌タンパク質94(PSP94)プロモーター、前立腺特異的抗原複合体プロモーターおよびヒト腺性カリクレイン遺伝子プロモーター(hgt-1)を含む。胃組織に対する例示的な組織特異的発現エレメントは、これだけに限らないがヒトH+/K+-ATPaseアルファサブユニットプロモーターを含む。膵臓に対する例示的な組織特異的発現エレメントは、これだけに限らないが膵炎関連タンパク質プロモーター(PAP)、エラスターゼ1転写エンハンサー、膵臓特異的アミラーゼおよびエラスターゼエンハンサープロモーターならびに膵臓コレステロールエステラーゼ遺伝子プロモーターを含む。子宮内膜に対する例示的な組織特異的発現エレメントは、これだけに限らないがウテログロビンプロモーターを含む。副腎細胞に対する例示的な組織特異的発現エレメントは、これだけに限らないがコレステロール側鎖切断(SCC)プロモーターを含む。神経系に対する例示的な組織特異的発現エレメントは、これだけに限らないがガンマ-ガンマエノラーゼ(神経特異的エノラーゼ、NSE)プロモーターを含む。脳に対する例示的な組織特異的発現エレメントは、これだけに
限らないが神経フィラメント重鎖(NF-H)プロモーターを含む。リンパ球に対する例示的な組織特異的発現エレメントは、これだけに限らないがヒトCGL-1/グランザイムBプロモーター、末端デオキシ転移酵素(TdT)、ラムダ5、VpreBおよびlck(リンパ球特異的チロシンタンパク質キナーゼp561ck)プロモーター、ヒトCD2プロモーターおよびその3'転写エンハンサーならびにヒトNKおよびT細胞特異的活性化(NKG5)プロモーターを含む。結腸に対する例示的な組織特異的発現エレメントは、これだけに限らないがpp60c-srcチロシンキナーゼプロモーター、器官特異的ネオ抗原(OSN)プロモーターおよび結腸特異的抗原Pプロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、乳房細胞に対する組織特異的発現エレメントは、これだけに限らないが、例えばヒトアルファ-ラクトアルブミンプロモーターである。肺に対する例示的な組織特異的発現エレメントは、これだけに限らないが嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)遺伝子プロモーターを含む。
対象の組織における発現の特異性を助ける他のエレメントは、分泌リーダー配列、エンハンサー、核局在化シグナル、エンドソーム分解性ペプチドなどを含みうる。好ましくはこれらのエレメントは、特異性を助けるために対象の組織由来である。一般にin vivo発現エレメントは、転写の開始に関与する5'非転写および5'非翻訳配列を必要に応じて含むべきである。それらは、場合によってエンハンサー配列または上流活性化配列を含む。
D.構成的プロモーター
本明細書で開示されるASCによって発現される抗癌作用物質をコードする核酸配列において有用であるそのような構成的プロモーターの例は、これだけに限らないが、例えばBoshartら、(1985)によって教示されるヒトサイトメガロウイルスプロモーターIE、偏在的に発現されているプロモーター(HSV-Tk(McKnightら、(1984)およびベータ-アクチンプロモーター(例えば、Ngら、(1985)によって記載されたヒトベータ-アクチンプロモーター)など)、および導入遺伝子の組込み部位非依存的発現を可能にする調節領域と組み合わせたプロモーター(Grosveldら、(1987))を含む。
構成的哺乳動物プロモーターは、これだけに限らないがポリメラーゼプロモーターおよび以下の遺伝子:ヒポキサンチンホスホリボシル転移酵素(HPTR)、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼおよびベータ-アクチンに対するプロモーターを含む。真核細胞において構成的に機能する例示的ウイルスプロモーターは、これだけに限らないがサルウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、Rous肉腫ウイルス、サイトメガロウイルスに由来するプロモーター、モロニー白血病ウイルスおよび他のレトロウイルスの末端反復配列(LTR)ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターを含む。他の構成的プロモーターは、当業者に周知である。誘導性プロモーターは誘導作用物質の存在下で発現され、これだけに限らないが金属誘導性プロモーターおよびステロイド調節性プロモーターを含む。例えばメタロチオネインプロモーターは特定の金属イオンの存在下で転写を促進するように誘導される。他の誘導性プロモーターは当業者に周知である。
E.他の制御エレメント
特定の開始シグナルもコード配列の効率的な翻訳のために必要である場合がある。これらのシグナルはATG開始コドンまたは隣接配列を含む。ATG開始コドンを含む外来性翻訳調節シグナルは、提供される必要がある場合がある。当業者はこれを容易に決定でき、必要なシグナルを提供できる。挿入物全体の翻訳を確実にするために開始コドンは所望のコード配列の読み枠と「インフレーム」でなければならないことは十分に周知である。外来性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは天然または合成のいずれでもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントの含有によって増強されうる。
本発明の特定の実施形態では、配列内リボソーム進入部位(IRES)エレメントの使用が多重遺伝子またはポリシストロニックメッセージを作製するために使用される。IRESエレメントは、5'-メチル化キャップ依存性翻訳のリボソームスキャンニングモデルを迂回でき、内部部位で翻訳を開始できる(PelletierおよびSonenberg、1988)。ピコルナウイルスファミリーの2つのメンバー(ポリオおよび脳心筋炎)由来のIRESエレメントは記載されており(PelletierおよびSonenberg、1988)、同様に哺乳動物メッセージ由来のIRESも記載されている(MacejakおよびSarnow、1991)。IRESエレメントは異種性翻訳領域に連結されうる。複数の翻訳領域は一緒に転写でき、それぞれはIRESによって分離され、ポリシストロニックメッセージを生じる。IRESエレメントによって各翻訳領域は効率的な翻訳のためにリボソームに到達できる。複数の遺伝子は、単一のメッセージを転写するための単一のプロモーター/エンハンサーを使用して効率的に発現されうる(本明細書に参照により組み込まれる米国特許第5925565号および第5935819号を参照されたい)。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるASCによって発現される抗癌作用物質をコードする核酸配列は、複数の制限酵素部位を含有する核酸領域であるマルチプルクローニング部位(MCS)をさらに含むことができ、そのいずれもベクターを消化するための標準的組換え技術と共に使用されうる(本明細書に参照により組み込まれるCarbonelliら、1999およびCocea、1997を参照されたい)。「制限酵素消化」は、核酸分子中の特定の位置でのみ機能する酵素での核酸分子の触媒的切断を意味する。これらの制限酵素の多くは商業的に入手可能である。そのような酵素の使用は当業者に広く理解されている。しばしばベクターは、外来性配列がベクターにライゲーションできるようにするためにMCS内を切断する制限酵素を使用して直線化または断片化される。「ライゲーション」は相互に隣接する場合があるまたはない2つの核酸断片間のリン酸ジエステル結合を形成する工程を意味する。制限酵素およびライゲーション反応に関与する技術は、組換え技術の当業者に十分に周知である。いくつかの実施形態ではマルチプルクローニング部位は、1つの異種性標的遺伝子を他の異種性標的遺伝子で置き換えるために本明細書で開示される核酸構築物および組成物において有用である。
転写された真核生物RNA分子の大部分は、一次転写物からイントロンを除去するためにRNAスプライシングを受ける。真核生物ゲノム配列を含むベクターは、タンパク質発現のための転写物の正常なプロセシングを確実にするためにドナーおよび/またはアクセプタースプライシング部位を必要とする場合がある(本明細書に参照により組み込まれるChandlerら、1997を参照されたい)。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるASCによって発現される抗癌作用物質をコードする核酸配列は、少なくとも1つの終結シグナルをさらに含みうる。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、RNAポリメラーゼによるRNA転写物の特異的終結に関与するDNA配列から構成される。したがって特定の実施形態では、RNA転写物の生成を終了する終結シグナルは検討される。ターミネーターは所望のメッセージレベルを達成するためにin vivoで必要である場合がある。
F.抗癌作用物質をコードする核酸配列の他の成分
A.レポーター遺伝子および選択マーカー遺伝子
本発明の特定の実施形態では、本明細書で開示される発現される抗癌作用物質をコードする核酸配列を含有しているASCは、核酸構築物中にマーカーを含むことによってin vitroまたはin vivoで同定されうる。そのようなマーカーは、発現ベクターを含有するおよび/または抗癌作用物質を発現しているASCの容易な同定を可能にする同定可能な変化をASCに付与する。一般に選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。陽性選択マーカーはマーカーの存在がその選択を可能にするものであり、一方陰性選択マーカーはその存在がその選択を阻止するものである。陽性選択マーカーの例は薬剤耐性マーカーである。
レポーター遺伝子が抗癌作用物質を発現しているASCを同定するためである場合、レポーター遺伝子および/または選択マーカーの位置は、抗癌作用物質をコードする核酸の下流(すなわち3')でもよく、抗癌作用物質の発現と同じ転写調節(すなわちプロモーター)下であり、それにより抗癌作用物質の発現が生じる場合はレポーター遺伝子の発現も生じる。
本発明のさらなる実施形態では、抗癌作用物質をコードする核酸配列は、形質転換体のクローニングおよび同定を補助する薬剤選択マーカーをさらに含むことができ、例えばネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、DHFR、GPT、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は有用な選択マーカーである。条件の実施を基に形質転換体の区別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、その基礎が比色分析であるGFPなどのスクリーニング可能なマーカーを含む他の型のマーカーも検討される。代替として単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(tk)またはクロラムフェニコールアセチル転移酵素(CAT)などのスクリーニング可能な酵素も利用されうる。当業者は、免疫原性マーカー(immunogenic marker)を、場合によりFACS分析と共にどのように使用するかも周知である。使用されるマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されうる限り、重要であるとは考えられていない。選択マーカーおよびスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は、当業者に十分に周知である。
レポーター遺伝子は容易に定量できるタンパク質をコードし、それらの色または酵素活性を介して形質転換効率、発現部位または発現時期の評価を可能にする。いくつかの実施形態ではレポータータンパク質をコードする以下の遺伝子は有用である;(SchenbornおよびGroskreutz(1999)MoI Biotechnol 13(1):29〜44頁)緑色蛍光タンパク質(GFP)など(Haseloffら、(1997)Proc Natl Acad Sci USA 94(6):2122〜2127頁;Sheenら、(1995)Plant J 8(5):777〜784頁;Reichelら、(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93(12):5888〜5893頁;Chuiら、(1996)Curr Biol 6:325〜330頁;Leffelら、(1997)Biotechniques. 23(5):912〜8頁;Tianら、(1997)Plant Cell Repl 6:267〜271頁;WO 97/41228)、クロラムフェニコール転移酵素、ルシフェラーゼ(Millarら、(1992)Plant MoI Biol Rep 10:324〜414頁; Owら、(1986) Science 234:856〜859頁)、エクオリン遺伝子(Prasherら、(1985)Biochem Biophys Res Commun 126(3):1259〜1268頁)、b-ガラクトシダーゼ、R遺伝子座遺伝子(植物組織中でアントシアニン色素(赤色)の生成を制御するタンパク質をコードしており、それによりさらなる補助物質または発色基質の添加を行わずにプロモーター活性の直接分析を可能にする(Dellaportaら、(1988)In:Chromosome Structure and Function:Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium、11:263〜282頁;Ludwigら、(1990)Science 247:449頁)、b-グルクロニダーゼ(GUS)を伴うことは特に好ましい(Jefferson(1987b)Plant MoI. Bio. Rep.、5:387〜405頁;Jeffersonら、(1987) EMBO J 6:3901〜3907頁)。b-グルクロニダーゼ(GUS)発現は組織の5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-b-D-グルクロン酸とのインキュベーションでの青色によって検出され、細菌ルシフェラーゼ(LUX)発現は発光によって検出され、ホタルルシフェラーゼ(LUC)発現はルシフェリンとのインキュベーション後の発光によって検出され、およびガタクトシダーゼ発現は組織を5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-b-D-ガラクトピラノシドで染色した後の鮮青色によって検出される。レポーター遺伝子は、抗生物質耐性マーカーの代替として評価マーカー(scorable marker)としても使用されうる。そのようなマーカーは、異種性標的遺伝子の存在を検出するまたは発現レベルを測定するために使用される。
抗癌作用物質をコードする核酸配列のASCへの導入
トランスフェクションは、本明細書で開示される核酸構築物の、脂肪由来間質細胞(ASC)などのレシピエント細胞への導入である。いくつかの実施形態では、ASCは癌を有する対象由来である。効率的なトランスフェクションは、核酸構築物の所望の細胞への導入を促進するベクターを必要とし、いくつかの実施形態では染色体組込みのための機構を提供でき、これらの核酸によってコードされる形質またはタンパク質の適切な発現を提供する。細胞トランスフェクションのための効率的で信頼できかつ安全なベクターの設計および構築は当業者に十分に周知である。本発明との関連において開示される核酸構築物の標的細胞、組織または生物への送達およびゲノム組込みを介在できる任意のベクターは、本発明の範囲内であると考えられる。
ウイルスベクター
本発明は、プロモーターに作動可能に連結し、抗癌作用物質遺伝子をコードする核酸配列を含む核酸構築物またはベクターをASCに形質導入するための方法も提供する。
ベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターでありうる。適切なウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、偽型レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクチニアウイルス、セムリキ森林ウイルスおよびバキュロウイルスを含む。適切な非ウイルスベクターは、プラスミド、水-油乳剤、ポリエチレンイミン、デンドリマー、ミセル、マイクロカプセル、リポソームおよび陽イオン性脂質を含む。遺伝子治療構築物のための重合体担体は、Goldmanら(1997)Nat Biotechnol 15:462頁および米国特許第4551482号および第5714166号に記載のとおり使用されうる。ペプチド担体は、米国特許第5574172号に記載されている。
適切である場合は、2つ以上の型のベクターが一緒に使用されうる。例えばプラスミドベクターは、リポソームと共に使用されうる。本発明のいくつかの実施形態では、本明細書で開示される核酸構築物は、アデノウイルス、プラスミドまたはリポソームを使用し、それぞれは本明細書以下でさらに記載される。
所望によりベクター、特にウイルスベクターは、形質転換またはトラスフェクトされる細胞のゲノム中への本発明の構築物の核酸の組込みを達成するために選択されうる。特異的な細胞性マーカーに対する親和性を有するリガンドを複合体中に含むことは、in vivoでの標的への複合体の送達も増強できる。
リガンドは、複合体を腫瘍脈管構造もしくは腫瘍脈管構造に関連する内皮細胞または腫瘍細胞それ自体へ送るために作用する抗体、細胞表面マーカー、ウイルスペプチドなどを含む。複合体は、構築物または構築物によってコードされる分泌された治療用ペプチドを含みうる。抗体リガンドは、Her2/neu(verb-b2トリ赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子相同体2)、CEA(癌胎児性抗原)、フェリチン受容体などの腫瘍マーカーまたは腫瘍脈管構造に関連するマーカー(インテグリン、組織因子もしくはベータ-フィブロネクチンアイソフォーム)に対して特異的な抗体または抗体断片でありうる。抗体または他のリガンドは、当技術分野において周知のとおりリポソームおよびウイルスなどの担体と連結されうる。例えばNeriら、(1997)Nat BioTechnology 15:1271頁;Kirpotinら、(1997)Biochemistry 36:66頁;Cheng (1996) Human Gene Therapy 7:275頁;Pasqualiniら、(1997)Nat Biotechnology 15:542頁;Parkら、(1997)Proc Am Ass Cane Res 38:342頁(1997); Current Protocols in Human Genetics on CDROM、John Wiley & Sons、New York、N.Y.におけるNabel(1997)「Vectors for Gene Therapy」;米国特許第6071890号および欧州特許第0439095号を参照されたい。代替としてレトロウイルスの偽型化は、特定の細胞に対してウイルスを標的化するために使用されうる(Marinら、(1997)MoI Med Today 3:396頁)。
本発明のウイルスベクターは、好ましくは無効化(disabled)例えば複製欠損である。すなわちそれらは、それらの複製のために必要な1つまたは複数の機能性遺伝子を欠いており、それらのin vivoでの調節されない複製を阻止しウイルス感染の望ましくない副作用を回避する。好ましくは、治療用遺伝子を包含するウイルスゲノムをウイルスコートまたはキャプシドにパッケージするために必要な最小限のゲノムエレメントを除く全てのウイルスゲノムが除去される。例えば末端反復配列(LTR)または逆位末端反復(ITR)およびパッケージングシグナルを除く全てのウイルスゲノムを欠失させることは望ましい。アデノウイルスの場合は、欠失は典型的にはE1領域および場合によってE2、E3および/またはE4領域の1つまたは複数において作製される。レトロウイルスの場合は、envおよび/またはgag/polなど複製に必要な遺伝子が欠失されうる。
配列の欠失は、例えば適切な制限酵素での消化に続く再ライゲーションを含む組換え手段によって達成されうる。複製コンピテント、自己制限(self-limiting)または自滅(self-destructing)ウイルスベクターも使用されうる。本発明の核酸構築物は、当技術分野において周知の任意の適切な手段によってウイルスゲノムに包含されうる。典型的にはそのような包含は、構築物をウイルスゲノムの適切な制限部位にライゲーションすることによって実施される。次いでウイルスゲノムは、ウイルスコートまたはキャプシドに任意の適切な手順によってパッケージされうる。特に任意の適切なパッケージング細胞系は、本発明のウイルスベクターを作製するために使用されうる。これらのパッケージング系は、それらが(典型的にはそれらのゲノムに包含されて)複製欠損ゲノムから欠失されている遺伝子を含むことから本発明の複製欠損ウイルスゲノムを補完する。したがってパッケージング系の使用は、本発明のウイルスベクターの培養物中での生成を可能にする。レトロウイルスのための適切なパッケージング系は、PA317細胞、プサイ-2細胞、CRE細胞、CRIP細胞、E-86-GP細胞、および293GP細胞の誘導物を含む。293系細胞は、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスのために使用されうる。
遺伝子治療構築物の細胞への導入のための適切な方法は、細胞または細胞塊への直接注入、粒子介在遺伝子移入(particle-mediated gene transfer)、電気穿孔法、DEAE-デキストラントランスフェクション、リポソーム介在トランスフェクション、ウイルス感染およびそれらの組合せを含む。送達方法は、ベクター型、コードされた遺伝子の毒性および治療される状態などを考慮して選択される。
多数の型のウイルスがベクターの基礎を形成している。ウイルス感染は、宿主細胞へのウイルスゲノムの導入を含む。この特性は、ウイルスに基づくベクターにおける遺伝子送達ビヒクルとしての使用のために用いられる。使用されるウイルスは、細胞にトランスフェクトするために必要な形質および能力の多くを既に有する病原性ウイルス種にしばしば由来する。しかし全てのウイルスが細胞周期の全ての段階で全ての細胞型に上手くトランスフェクトするのではない。したがってウイルスベクターの開発においてウイルスゲノムは、導入遺伝子構築物(導入遺伝子)または他の核酸を導入するためのそれらの有用性および有効性を増強するためにしばしば改変される。同時に疾患を生じるそれらの能力を低減または除去する改変が導入される場合もある。したがってレトロウイルス、ワクチニアウイルス(Ridgeway、1988;BaichwalおよびSugden、1986;Couparら、1988)、アデノ随伴ウイルス(AAV) (Ridgeway、1988;BaichwalおよびSugden、1986;HermonatおよびMuzycska、1984)およびヘルペスウイルスなどのウイルス由来のウイルスベクターは、本発明において使用されうる。これらは、種々の哺乳動物細胞用にいくつかの魅力的な性質を提供する(Friedmann、1989;Ridgeway、1988;BaichwalおよびSugden、1986;Couparら、1988;Horwichら、1990)。ワクチニアウイルス(Ridgeway、1988;BaichwalおよびSugden、1986;Couparら、1988)、シンドビスウイルス、サイトメガロウイルスおよび単純ヘルペスウイルスなどのウイルス由来の他のウイルスベクターも使用されうる。
プロモーターに作動可能に連結した抗癌遺伝子をコードする核酸配列のASCへの形質導入のためのベクターは、当技術分野において十分に周知である。CMVプロモーターなどの強力な非特異的プロモーターを使用する過剰発現が使用されうる一方で、発現構築物に組織または細胞型特異的プロモーターを含むことが有用である場合があり、例えば脂肪細胞プロモーターまたは他の細胞型特異的プロモーターの使用が有利である場合がある。ウイルスベクターは、当業者に十分に周知であり、本明細書でさらに詳細に考察される。
これらのベクターは、本発明の方法における使用のために容易に適合される。発現される遺伝子(例えば、TRAIL、BAXなどのアポトーシス促進遺伝子などの抗癌作用物質または癌遺伝子に対するRNAi作用物質などの核酸阻害物質および本明細書で開示される他の抗癌作用物質)をコードする作動可能に連結した核酸配列を選択された発現/送達ベクターに挿入するための組換えDNA/分子生物学的技術を使用する適切な操作によって、本明細書に記載の方法の実行のための多数の等価のベクターが作製されうる。クローニングされた遺伝子がタンパク質のアミノ酸配列を変更するために容易に操作されうることは当業者に理解される。
発現ベクターおよび宿主細胞の例は、BL21、BL21(DE3)およびAD494(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)およびOrigami(DE3)((NOVAGEN(登録商標))などの大腸菌宿主細胞におけるタンパク質発現のためのpETベクター(NOVAGEN(登録商標))、pGEXベクター(GE Life Sciences)およびpMALベクター(New England labs. Inc.); CHO、COS、HEK-293、JurkatおよびMCF-7などの哺乳動物細胞系における発現のための強力CMVプロモーターに基づくpcDNA3.1(INVITROGEN(商標) Inc.)およびpCIneoベクター(Promega);アデノウイルス介在遺伝子移行および哺乳動物細胞における発現のための複製不全アデノウイルスベクター、ベクターpAdeno X、pAd5F35、pLP-Adeno-X-CMV (CLONTECH(登録商標))、pAd/CMV/V5-DEST、pAd-DESTベクター(INVITROGEN(商標) Inc.);レトロウイルス介在遺伝子移行および哺乳動物細胞における発現のためのClontechからのRETRO-X(商標)系と共に使用するpLNCX2、pLXSNおよびpLAPSNレトロウイルスベクター;レンチウイルス介在遺伝子移行および哺乳動物細胞における発現のためのpLenti4/V5-DEST(商標)、pLenti6/V5-DEST(商標)およびpLenti6.2/V5-GW/lacZ (INVITROGEN(商標)Inc.);アデノ随伴ウイルス介在遺伝子移行および哺乳動物細胞における発現のためのpAAV-MCS、pAAV-IRES-hrGFPおよびpAAV-RCベクター(STRATAGENE(登録商標))などのアデノ随伴ウイルス発現ベクター;スポドペラ・フンギペルダ(Spodopera frugiperda 9)(Sf9)および昆虫細胞系Sfl 1における発現のためのBACpak6 baculovirus(CLONTECH(登録商標))およびpFastBac(商標)HT (INVITROGEN(商標)Inc.);ドロソフィラ・シュナイダー(Drosophila Schneider)S2細胞における発現のためのpMT/BiP/V5-His (INVITROGEN(商標)Inc.);ピキア・パストリス(Pichia pastoris)における発現のためのピキア発現ベクターpPICZα、pPICZ、pFLDαおよびpFLD(INVITROGEN(商標)Inc.)ならびにP.メタノリカ(P.methanolica)における発現のためのベクターpMETαおよびpMET;酵母サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)における発現のためのpYES2/GSおよびpYDl (INVITROGEN(商標)Inc.)ベクターである。クラミドモナス・レインハーディー(Chlamydomonas reinhardtii)での大規模発現異種性タンパク質における近年の進歩は、Griesbeck C.ら2006 Mol.Biotechnol.34:213〜33頁およびFuhrmann M. 2004、Methods Mol Med.94:191〜5頁によって記載されている。外来性異種性コード配列は、核、葉緑体およびミトコンドリアのゲノムに相同組換えによって挿入される。最も多目的な葉緑体選択マーカー、アミノグリコシドアデニル転移酵素(aadA)(スペクチノマイシンまたはストレプトマイシンへの耐性を付与する)を保持している葉緑体発現ベクターp64は、葉緑体で外来性タンパク質を発現するために使用されうる。微粒子遺伝子銃法は、ベクターを藻類に導入するために使用される。葉緑体へのその進入において外来性DNAは遺伝子銃粒子から放出され、葉緑体ゲノムに相同組換えを通じて組み込まれる。
一実施形態では発現ベクターは、レンチウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターである。組換えアデノウイルスを作製するための簡易化された系は、例えばHe TC.らProc. Natl. Acad. Sci.USA、95:2509〜2514頁、1998によって示されている。対象の遺伝子は、シャトルベクター(例えばpAdTrack-CMV)中に最初にクローニングされる。得られたプラスミドを制限エンドヌクレアーゼPmeIで消化することによって直線化し、続いて大腸菌BJ5183細胞にアデノウイルス骨格プラスミド(例えばSTRATAGENE(登録商標)のADEASY(商標)アデノウイルスベクター系、pAdEasy-1)と共に共形質転換される。組換えアデノウイルスベクターは、カナマイシン耐性について選択され、組換えは制限エンドヌクレアーゼ分析によって確認される。最後に直線化された組換えプラスミドは、アデノウイルスパッケージング細胞系(例えばHEK293細胞(E1形質転換ヒト胎児由来腎臓細胞)または911(E1形質転換ヒト胎児由来網膜細胞))にトランスフェクトされる(Human Gene Therapy 7:215〜222頁、1996)。組換えアデノウイルスはHEK293細胞中に作製される。
一実施形態では好ましいウイルスベクターはレンチウイルスベクターであり、造血性細胞の遺伝性障害および種々の型の癌に対する遺伝子治療のためのレンチウイルスベクターの多数の使用例があり、これらの参考文献は本明細書に参照により組み込まれる(Klein, C.およびBaum, C.(2004)、Hematol. J.、5:103〜111頁; Zufferey, Rら(1997)、Nat. Biotechnol.、15:871〜875頁; Morizono, K.ら(2005)、Nat.Med.、11:346〜352頁; Di Domenico, C.ら(2005)、Hum.Gene Ther.、16:81〜90頁)。HIV-1に基づくレンチウイルスは、モロニー白血病ウイルス(MoMLV)に基づくレトロウイルス系よりも広範な宿主に効果的に形質導入できる。組換えレンチウイルスの調製は、INVITROGEN(商標)Inc.からのVIRAPOWER(商標)レンチウイルス発現系と共にpLenti4/V5-DEST(商標)、pLenti6/V5-DEST(商標)またはpLentiベクターを使用して達成されうる。
一実施形態では発現ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターでありうる。rAAVベクターを使用して、遺伝子は多数の異なるヒトおよび非ヒト細胞系または組織を含む広範な宿主細胞に送達されうる。AAVが非病原性であり、免疫応答を誘発しないことから多数の前臨床試験が優れた安全性プロファイルを報告している。rAAVは、広範な細胞型に形質導入でき、形質導入は能動的な宿主細胞分裂に依存しない。高力価、>108ウイルス粒子/mlが上清中で容易に得られ、さらなる濃縮で1011〜1012ウイルス粒子/mlが得られる。導入遺伝子は宿主ゲノムに組み込まれ、それにより発現は長期間かつ安定である。
AAV-2以外の代替AAV血清型の使用(Davidsonら(2000)、PNAS 97(7)3428〜32頁;Passiniら(2003)、J. Virol 77(12):7034〜40頁)は、さまざまな細胞指向性および増大した形質導入能力を実証している。脳癌に関して脳への新規注入技術、具体的には対流増強送達(convection enhanced delivery)(CED;Boboら(1994)、PNAS 91(6):2076〜80頁;Nguyenら(2001)、Neuroreport 12(9):1961〜4頁)の開発は、AAVベクターで脳の広範囲に形質導入するための能力を顕著に増強した。
AAVベクターの大規模調製は、パッケージング細胞系の3種のプラスミド(キメラDNAコード配列を保持しているAAVベクター、AAV repおよびcap遺伝子を含有しているAAV RCベクターおよびアデノウイルスヘルパープラスミドpDF6)でのサブコンフルエントな293細胞の50×150mmプレートへの共トランスフェクションによって作製される。細胞はトランスフェクションの3日後に回収され、ウイルスは3サイクルの凍結融解または超音波処理によって放出される。
次いでAAVベクターはベクターの血清型に応じて2種の異なる方法によって精製される。AAV2ベクターは、そのヘパリンに対する親和性に基づいて単一ステップ重力流カラム精製法によって精製される(Auricchio, A.ら、2001、Human Gene therapy 12;71〜6頁; Summerford, C.およびR. Samulski、1998、J. Virol. 72:1438〜45頁;Summerford, C.およびR. Samulski、1999、Nat. Med.5:587〜88頁)。AAV2/1およびAAV2/5ベクターは、3種の連続的CsCl勾配によって現在精製される。
組換えレンチウイルスは、抗癌作用物質をコードする核酸または融合もしくは切断されたそれらの核酸の分裂または非分裂哺乳動物細胞のいずれかでの送達および発現の有利点を有する。HIV-1に基づくレンチウイルスは、モロニー白血病ウイルス(MoMLV)に基づくレトロウイルス系よりも広範な宿主に効果的に形質導入できる。組換えレンチウイルスの調製は、InvitrogenからのViraPower(商標)レンチウイルス発現系と共にpLenti4/V5-DEST(商標)、pLenti6/V5-DEST(商標)またはpLentiベクターを使用して達成されうる。
組換えアデノウイルスを作製するための簡易化した系は、He TC.らProc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2509〜2514頁、1998によって示されている。対象の遺伝子はシャトルベクター、例えばpAdTrack-CMV中に最初にクローニングされる。得られたプラスミドを制限エンドヌクレアーゼPmeIで消化することによって直線化し、続いて大腸菌BJ5183細胞にアデノウイルス骨格プラスミド(例えばStratageneのAdEasy(商標)アデノウイルスベクター系、pAdEasy-1)と共に共形質転換される。組換えアデノウイルスベクターは、カナマイシン耐性について選択され、組換えは制限エンドヌクレアーゼ分析によって確認される。最後に直線化された組換えプラスミドは、アデノウイルスパッケージング細胞系(例えばHEK293細胞(E1形質転換ヒト胎児由来腎臓細胞)または911(E1形質転換ヒト胎児由来網膜細胞))にトランスフェクトされる(Human Gene Therapy 7:215〜222頁、1996)。組換えアデノウイルスはHEK293細胞中に作製される。
一実施形態では、抗癌作用物質をコードする核酸または融合もしくは切断されたそれらの核酸および/またはそれら変異体形態を含むAAVウイルスベクターを使用する。組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターは、多数の異なるヒトおよび非ヒト細胞系または組織を含む広範な宿主細胞に適用されうる。AAVが非病原性であり、免疫応答を誘発しないことから多数の前臨床試験が優れた安全性プロファイルを報告している。rAAVは、広範な細胞型に形質導入でき、形質導入は能動的な宿主細胞分裂に依存しない。高力価、>108ウイルス粒子/mlが上清中で容易に得られ、さらなる濃縮で1011〜1012ウイルス粒子/mlが得られる。導入遺伝子は宿主ゲノムに組み込まれ、それにより発現は長期間かつ安定である。
AAV-2以外の代替AAV血清型の使用(Davidsonら(2000)、PNAS 97(7)3428〜32頁; Passiniら(2003)、J. Virol 77(12):7034〜40頁)は、さまざまな細胞指向性および増大した形質導入能力を実証している。脳癌に関して脳への新規注入技術、具体的には対流増強送達(CED;Boboら(1994)、PNAS 91(6):2076〜80頁;Nguyenら(2001)、Neuroreport 12(9):1961〜4頁)の開発は、AAVベクターで脳の広範囲に形質導入するための能力を顕著に増強した。
AAVベクターの大規模調製は、パッケージング細胞系の3種のプラスミド(コード核酸を保持しているAAVベクター、AAV repおよびcap遺伝子を含有しているAAV RCベクターおよびアデノウイルスヘルパープラスミドpDF6)のサブコンフルエントな293細胞の50×150mmプレートへの共トランスフェクションによって作製される。細胞はトランスフェクションの3日後に回収され、ウイルスは3サイクルの凍結融解または超音波処理によって放出される。
次いでAAVベクターはベクターの血清型に応じて2種の異なる方法によって精製される。AAV2ベクターは、そのヘパリンに対する親和性に基づいて単一ステップ重力流カラム精製法によって精製される(Auricchio, A.ら、2001、Human Gene therapy 12;71〜6頁;Summerford, C.およびR. Samulski、1998、J. Virol. 72:1438〜45頁; Summerford, C.およびR. Samulski、1999、Nat. Med. 5:587〜88頁)。AAV2/1およびAAV2/5ベクターは、3種の連続的CsCl勾配によって現在精製される。
レトロウイルスベクターは、核酸構築物およびsiRNA発現構築物の送達において有用であるとして当技術分野において周知である。例えば、レトロウイルスがsiRNA発現カセットの哺乳動物細胞への送達のための効率的なベクターであることを開示している、本明細書に参照により組み込まれるDevroeおよびSilver(2002)の文献を参照されたい。BartonおよびMedzhitov(2002)は、siRNA発現構築物のレトロウイルス導入が初代細胞中の遺伝子の安定的不活性化を生じることを開示している。
レンチウイルスは、核膜孔(nucleopore)を通じた能動移入を可能にするそれらの組込み前複合体の核親和性の性質によって非分裂細胞に感染できるレトロウイルスのサブグループである。
レンチウイルスは、ウシレンチウイルス群、ウマレンチウイルス群、ネコレンチウイルス群、ヒツジヤギレンチウイルス群および霊長類レンチウイルス群のメンバーを含む。遺伝子治療のためのレンチウイルスベクターの開発は、Klimatchevaら、(1999)に概説されている。遺伝子治療のために適切なレンチウイルスベクターの設計および使用は、例えば米国特許第6531123号、米国特許第6207455号および米国特許第6165782号に記載されている(それぞれは本明細書に参照により詳細に組み込まれる)。レンチウイルスの例は、これだけに限らないがHIV-1、HIV-2、HIV-1/HIV-2偽型、HIV-1/SIV、FIV、ヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ伝染性貧血ウイルスおよびウシ免疫不全ウイルスを含む。HIV-1も使用のために包含される。
レンチウイルスベクターは、遺伝子治療に対して大きな有利点を提供する。それらは、長期間の発現が必要とされる標的細胞の染色体に安定的に組み込む。同様にそれらは、ウイルス遺伝子を移行せず、それにより細胞傷害性T細胞によって破壊される場合がある形質導入細胞生成の問題を回避する。追加的にそれらは、比較的大きなクローニング能力を有し、臨床適用を可能にする。さらに、他のレトロウイルスとは対照的にレンチウイルスは、非分裂細胞に形質導入できる。造血系、脳、肝臓、肺および筋肉などの組織に対する遺伝子治療との関連においてこれは非常に重要である。例えばHIV-1由来のベクターは、ニューロン、肝細胞および筋細胞などの細胞への導入遺伝子の効率的なin vivoおよびex vivo送達、組込みおよび安定的な発現を可能にする(Blomerら、1997;Kafriら、1997;Naldiniら、1996a;1996b)。
レンチウイルスゲノムおよびプロウイルスDNAは、レトロウイルスにおいて見出された3つの遺伝子:gag、pol、envを有し、これらは2つの末端反復(LTR)配列に隣接されている。gag遺伝子は、内部構造(マトリクス、キャプシドおよびヌクレオキャプシド)タンパク質をコードし;pol遺伝子はRNA指向性DNAポリメラーゼ(逆転写酵素)、プロテアーゼおよびインンテグラーゼをコードし;ならびにenv遺伝子はウイルス外被糖タンパク質をコードする。5'および3'LTRは、ビリオンRNAの転写およびポリアデニル化を促進するために役立つ。LTRは、ウイルス複製に必要な全ての他のcis作用性配列を含有する。レンチウイルスは、vif、vpr、tat、rev、vpu、nefおよびvpxを含む追加的遺伝子を有する。
5'LTRに隣接するのは、ゲノムの逆転写のために必要な(tRNAプライマー結合部位)およびウイルスRNAの粒子への効率的なキャプシド形成のために必要な(Psi部位)配列である。キャプシド形成(またはレトロウイルスRNAの感染性ビリオンへのパッケージング)のために必要な配列がウイルスゲノムから失われる場合、cis欠損はゲノムRNAのキャプシド形成を阻止する。しかし得られた変異株は、全てのビリオンタンパク質の合成を導くことができるままである。レンチウイルスベクターは当技術分野において十分に周知であり、全てが参照により本明細書に組み込まれるNaldiniら、(1996aおよび1996b);Zuffereyら、(1997);Dullら(1998);米国特許第6013516号および第5994136号を参照されたい。一般にこれらのベクターは、プラスミドに基づくまたはウイルスに基づき、外来核酸を包含するために、選択のためにおよび宿主細胞への核酸の移行のために必須の配列を保持するように構成される。
対応して、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)由来のレンチウイルスベクターは、導入遺伝子の非有糸分裂細胞へのin vitroおよびin vivoの両方での効率的な送達、組込みおよび長期間の発現を介在できる(Naldiniら、1996a;Naldiniら、1996b;Blomerら、1997)。
レトロウイルスゲノムでは、必要な全てのcis作用性エレメントも含有する単一のRNA分子が全てのコード配列を保持する。したがってベクター産生系のバイオセーフティーは、複製コンピテント組換え体(RCR)を再作製するために必要なクロスオーバーの数を最大化するために、その種々の成分をコードする配列を可能な限り多数の非依存性ユニットにわたって分散させることによって最良に達成される。レンチベクター粒子はビリオンパッケージングエレメントとベクターゲノムとを宿主産生細胞、例えば293ヒト胎児由来腎臓細胞で共発現させることによって作製される。HIV-1に基づくベクターの場合は、ビリオンのコアおよび酵素成分はHIV-1に由来する一方で外被タンパク質は異種ウイルス、最も多くは(高い安定性およびそのGタンパク質の広範な指向性により)VSVに由来する。遺伝子の全セットが病原性に必須の病原性因子をコードしているが、ウイルス遺伝子カーゴを移行するためには不必要であるHIVのゲノム複雑性は、臨床的に許容されるベクター系の開発を実質的に助ける。
複数回弱毒化したパッケージング系は、典型的には今やHIV-1の9個の遺伝子中の3個だけ:ビリオンの主な構造タンパク質をコードするgag、レトロウイルス特異的酵素に関与するpol、ならびに効率的なgagおよびpol発現のために必要な転写後制御因子をコードするrevを含む(Dullら、1998)。そのゲノムの約60%が完全に除外されていることから、そのように広く欠失したパッケージング系から親ウイルスは再構成されえない。HIVに基づくパッケージング系の1バージョンでは、Gag/Pol、Rev、VSV Gおよびベクターは4つの別々のDNA単位から産生される。同様にベクターとヘルパー配列との間の重複は数十ヌクレオチドまで低減されており、相同組換えのための機会は最小化されている。
HIV 1型(HIV-1)に基づくベクター粒子は、いわゆる産生細胞、例えば293Tヒト胎児由来腎臓細胞中でのビリオンパッケージングエレメントとベクターゲノムとの共発現によって作製されうる。これらの細胞は、多数のプラスミドで一時的にトランスフェクトされうる。典型的には3から4個のプラスミドが使用されるが、数はレンチウイルス成分が別々の単位に分割されている程度に応じてより多い場合もある。一般に1つのプラスミドは、HIV-1由来のビリオンのコアおよび酵素成分をコードする。このプラスミドはパッケージングプラスミドと称される。他のプラスミドは、外被タンパク質(複数可)、最も多い場合は、その高い安定性および広範な指向性から水疱性口内炎ウイルスのGタンパク質(VSV G)をコードする。このプラスミドは外被発現プラスミドと称される場合がある。さらに他のプラスミドは標的細胞に移行されるゲノム、すなわちベクター自体をコードしており移行ベクターと称される。1ミリリットルあたり数百万の形質導入単位(TU/ml)の力価を有する組換えウイルスは、この技術およびそれらの変法によって作製されうる。超遠心分離後におよそ109TU/mlの濃縮された保存物が得られる。
ベクターそれ自体は、標的細胞に移行される単なる遺伝物質である。典型的にはそれは、そのキャプシド形成、逆転写、核内移入および組込みに必要なcis作用性エレメントに隣接された導入遺伝子カセットを含む。オンコレトロウイルスベクターで既に実施されたとおり、標的細胞に一度移行されるとウイルス性末端反復配列(LTR)の転写能力を失う「自己不活性化する」レンチウイルスベクターが作製されている(Zuffereyら、1998)。この改変は複製コンピテント組換え体(RCR)の出現リスクをさらに低減し、プロモーター干渉に関連する問題を回避する。これらのベクターまたはそれらの成分は、SINベクターまたはSIN含有ベクターとして周知である。SIN設計は、Zuffereyら、1998および米国特許第5994136号にさらに詳細に記載されており、両者は本明細書に参照により組み込まれる。
導入遺伝子発現を増強することが特定の実施形態、特に中程度に活性なプロモーターを有する本発明のレンチウイルス構築物に関与するものでは必要である場合がある。転写後制御エレメント(PRE)の1型は、発現カセット中に位置するイントロンであり、遺伝子発現を刺激できる。しかしイントロンは、レンチウイルスの生活環イベント(life cycle event)の際に切り出されうる。したがってイントロンがPREとして使用される場合は、それらはベクターゲノムの転写とは逆向きに位置付けられる必要がある場合がある。
切り出しイベントに依存しない転写後制御エレメントは、ウイルスの生活環の際に除去されない利益を提供する。いくつかの例は、単純ヘルペスウイルスの転写後プロセシングエレメント、B型肝炎ウイルスの転写後制御エレメント(HPRE)およびウッドチャック肝炎ウイルスの転写後制御エレメント(WPRE)である。これらの内でHPREにおいて見出されない追加的cis作用性エレメントを含有することからWPREが最も好ましい(Donelloら、1998)。この制御エレメントは、導入遺伝子のRNA転写物中であるが導入遺伝子翻訳単位の終止コドンの下流に含まれるようにベクター内に位置している。本発明およびZuffereyら、1999において実証されるとおりWPREエレメントは、レンチウイルスベクターとの関連において所望の導入遺伝子の遺伝子発現を刺激および増強するための有用な手段である。WPREは特徴付けられ、本明細書に参照により組み込まれる米国特許第6136597号に記載されている。そこに記載のとおりWPREは、核から細胞質へのRNAの効率的な輸送を介在するRNA輸送エレメントである。それは、エレメントおよび導入遺伝子が単一の転写物中に含有されるように、cis作用性核酸配列の挿入によって導入遺伝子の発現を増強する。センス方向でのWPREの存在は、導入遺伝子の発現を7から10倍まで増加させることが示された。レトロウイスルベクターは、レトロウイルス粒子の形成を導く一連の事象の際にイントロンが一般に切り出されることから、完全なイントロン含有遺伝子の代わりにcDNAの形態で配列を送達する。イントロンは、一次転写物とスプライシング機構との相互作用を調節する。スプライシング機構によるRNAのプロセシングがそれらの細胞質内輸送を、スプライシング機構と輸送機構との間の結合によって促進することから、cDNAはしばしば非効率的に発現される。したがってベクター中のWPREの含有は、導入遺伝子の増強された発現を生じる。
抗癌作用物質をコードする核酸配列などの核酸配列の細胞核への導入は、核膜を通じた核への核酸の移行を必要とする。レンチウイルスは、非分裂細胞中で効率的に複製するそれらの能力の基礎を形成する能動核内移入系を利用する。この能動移入系は逆転写のための具体的な様式を含む一連の複雑な事象に依存する。特にHIV-1においてpol遺伝子中に位置するセントラルポリプリン配列(cPPT)は、下流プラス鎖の合成を開始し、一方プラス鎖合成は3'ポリプリン配列(PPT)でも開始される。短いDNA分子の鎖転移後に、上流プラス鎖合成が開始し、ゲノムの中央に達するまで進行する。鎖置換モードで機能している場合は、セントラル終止配列(cTS)でHIV-1逆転写酵素は排出される(鋳型から放出される)(Charneauら、1994)。最終的な結果は、安定なフラップを有する、長さ99ヌクレオチドのゲノム中央部の二重鎖DNA分子である。この中央「フラップ」は、核移入を促進する(Zennouら、2000)。
抗癌作用物質(すなわちアポトーシス促進遺伝子、細胞毒、免疫毒など)のためにクローニングされた遺伝子は、in vitro変異誘発に関する種々の十分に周知の技術、とりわけ天然に存在するヒトタンパク質の変異体(本明細書においてムテインまたは変異体または変異株と称する)を産生するための技術によって操作でき、本明細書に記載の方法および組成物と合わせて使用されうる。抗癌作用物質(すなわちアポトーシス促進分子、細胞毒分子など)のムテインの一次構造における多様性は、本発明において有用であり、例えば欠失、追加および置換を含みうる。置換は保存的または非保存的でよい。天然のタンパク質とムテインとの間の差異は、一般に望ましい特性を保存し、望ましくない特性を軽減または除去し、かつ望ましいまたは新規の特性を追加する。例えばいくつかの実施形態ではアポトーシス促進分子である抗癌作用物質は、天然の(すなわち野生型)アポトーシス促進タンパク質の少なくとも50アミノ酸のアポトーシス促進ポリペプチドもしくは機能性ムテインまたはそれらの変異体でありうる。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド(すなわち細胞毒分子、アポトーシス促進分子など)である発現された抗癌作用物質は、所望により、例えば生成物を所望の位置に標的化するポリペプチドにまたは例えばその精製を促進するタグに融合された融合ポリペプチドでもよい。発現されるポリペプチド、すなわち発現される抗癌ポリペプチド作用物質(アポトーシス促進分子、免疫毒および細胞毒分子など)の安定性を増大させるポリペプチド配列への融合も検討される。例えば血清タンパク質、例えば血清アルブミンへの融合は、抗癌ポリペプチド作用物質の循環半減期を増加させうる。タグおよび融合パートナーは、所望により切断可能であるように設計されうる。具体的に検討される他の改変は、ポリマーへの結合、例えば共有結合である。一態様ではポリエチレングリコール(PEG)またはメトキシポリエチレングリコール(mPEG)などのポリマーは、それらがコンジュゲートしたタンパク質のin vivo半減期を増大できる。例えばどのような大きさのPEGポリマーを使用するかが検討事項であるようにポリペプチド作用物質のPEG化の方法は当業者に十分に周知である。他の態様では、生分解性または吸収性のポリマーは、ポリペプチド作用物質の長期間、しばしば局所的な、放出を提供できる。数週間または数ヶ月にわたってタンパク質を放出できるそのような合成生体吸収性、生体適合性ポリマーは、例えばポリ-アルファ-ヒドロキシ酸(例えばポリ乳酸、ポリグリコリドおよびそれらのコポリマー)、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリエチレングリコールとポリブチレンテレフタラートとのセグメント化ブロックコポリマー(POLYACTIVE(商標))、チロシン誘導体ポリマーまたはポリ(エステルアミド)を含みうる。薬物送達物質および移植物の生産において使用される適切な生体吸収性ポリマーは、本明細書に参照によりその全体が組み込まれる米国特許第4968317号および第5618563号において、およびとりわけS. W. Shalaby、Carl Hanser Verlagによって編集された「Biomedical Polymers」、Munich、Vienna、New York、1994においておよび上の刊行物で引用された多数の参考文献において考察されている。選択されるべき具体的な生体吸収性ポリマーは、治療される具体的な患者によって決まる。
癌を治療するための抗癌作用物質を発現する操作されたASCの使用
本発明の一態様は、操作されたASCを含む組成物を対象に投与するステップを含む対象における癌の治療および/または予防の方法であって、操作されたASCが抗癌作用物質をコードする核酸配列を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では本発明は、癌を有する対象を治療する方法であって、ASCが対象から得られる(いくつかの実施形態では癌について治療される同じ対象から得られる)方法に関する。次いでASCは、本明細書で開示される方法による少なくとも1つの抗癌作用物質を発現する操作されたASCを産生するためにex vivoで遺伝的に改変される(すなわちASCはプロモーターに作動可能に連結した抗癌作用物質をコードする核酸配列でex vivoで形質導入される)。いくつかの実施形態では操作されたASCは操作されたASCの実質的に純粋な集団を得るために場合によって増殖されうる。次いで操作されたASCは、癌を有する対象に投与される。抗癌作用物質を発現する操作されたASCの投与は、任意の適切な手段、例えば全身投与または腫瘍への直接注入などの局所投与によってでありうる。好ましい実施形態では操作されたASCは、癌または腫瘍細胞塊に血液を供給する血管新生ネットワークへ静脈内投与される。
癌の治療のための脂肪組織および脂肪由来再生細胞(すなわち脂肪由来幹細胞)の使用は、国際特許出願WO09/076548(「548出願」)に開示されるとおり報告されている。‘548出願は腫瘍部位へのまたは付近への脂肪組織の投与を考察しているが、癌を有する対象への脂肪由来間質細胞の不均一な集団(以下の細胞集団:内皮細胞、間葉系幹細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、周皮細胞または脂肪由来幹細胞の少なくとも1つを含む)および列挙されていない他の追加的細胞型の使用または投与を開示、示唆または言及していない。追加的にこの‘548出願は、対象中の腫瘍または癌部位に抗癌作用物質を送達するための送達手段として使用するためにこれらの細胞を操作することを考察または示唆していない。米国特許出願第2009/0181456号(「456出願」)は、血管新生を亢進するおよび創傷閉鎖を促進するためならびに破損した、変性したまたは除去された筋肉の修復および関節軟骨の欠損の修復のために遺伝的に改変した脂肪由来幹細胞(ADSC)を考察している。特にこの456出願は、抗癌作用物質または特にアポトーシス促進作用物質を発現するためにこれらの細胞を操作することを考察または示唆していない。脂肪組織由来の細胞の不均一な集団(すなわち本明細書で開示される脂肪由来間質細胞の不均一な集団)ではなく、遺伝子操作された脂肪組織由来幹細胞(ADSC)を考察し、細胞増殖(外傷、血管損傷および腫瘍切除による筋肉損失の領域での筋肉増殖を促進することを含む)を促進する分子を含む均一な脂肪由来幹細胞集団を操作することを考察していることから、正確にはこの‘456出願は正反対のことを考察している。この‘456出願は、抗血管新生作用物質を発現することも開示しており、したがって当業者は癌を有する対象の治療のために‘456出願に記載の細胞を使用しない。米国特許第5980887号(‘887特許)も、増殖を促進するための、特に損傷した血管の内皮増殖を促進するため、特に虚血型障害における血管新生を亢進するために血管新生亢進作用物質および抗血管新生作用物質を発現する操作された胚細胞由来内皮細胞を考察している。したがって‘456出願と同様に‘887特許は操作された細胞で細胞増殖を促進することを考察しており、これだけに限らないがアポトーシス促進作用物質を含む抗癌作用
物質を発現する操作された細胞によって癌細胞の細胞増殖を阻害する本発明と正反対である。
いくつかの実施形態では操作されたASCは、1つより多い抗癌作用物質を、例えば少なくとも2つまたは少なくとも3つまたは少なくとも4つまたは少なくとも5つまたはそれ以上の抗癌作用物質を発現する。いくつかの実施形態では、操作されたASCが1つより多い抗癌作用物質を発現する場合、抗癌作用物質は同じ型(すなわちポリペプチド抗癌作用物質)または異なる型(すなわち抗癌ポリペプチド作用物質およびRNAi抗癌作用物質)の作用物質でもよい。いくつかの実施形態では、操作されたASCが1つより多い抗癌作用物質を発現する場合、抗癌作用物質は同じ核酸配列上(例えばIRES配列によって分離された)にまたは別々の核酸配列上にコードされうる。いくつかの実施形態では、操作されたASCが1つより多い抗癌作用物質を発現する場合、抗癌作用物質は同じプロモーターにまたは異なるプロモーターに作動可能に連結されうる、例えば異なるプロモーターが使用される場合1つの抗癌作用物質をコードする核酸配列は組織特異的プロモーター(脂肪組織プロモーターなど)に作動可能に連結でき、第2の抗癌作用物質をコードする核酸配列は誘導性プロモーターに作動可能に連結されうる。
したがっていくつかの実施形態では、本明細書で開示される抗癌作用物質を発現するASCは、癌の治療のために有用である。いくつかの実施形態では癌または疾患もしくは障害もしくは悪性腫瘍は、組織中の正常または異常細胞のほとんど調節されていないまたは未調節の増殖によって特徴付けられる哺乳動物における器官または組織の任意の疾患および全身へのその影響でありうる。いくつかの実施形態では癌は、良性腫瘍、異形成、過形成および転移性増殖または、例えば癌の発症にしばしば先行する白板症などの任意の他の形質転換を示す新生物を含む。細胞および組織は、それらが正常細胞よりも早く増殖する、転移性増殖と記載されるように周囲の健康な組織または身体の任意の他の組織に置き換わるまたは伝播する、異常な形状および大きさを呈する、それらの核細胞質比に変化を示す、核多染性、および最終的には消失しうる場合に癌性である。癌性細胞および組織は、腫瘍随伴症候群を生じる場合に全身に影響を与える場合があり、癌が重要な器官または組織内に生じる場合、正常な機能は致命的結果の可能性を有して損なわれるまたは停止される場合がある。いくつかの場合では重要な器官の機能が癌または癌細胞によって傷つけられると、原発性または転移性のいずれかの癌は罹患した対象または哺乳動物の死を導きうる。悪性癌は、伝播する傾向を有し、治療しない場合に死を生じうる癌である。良性腫瘍は通常は死を生じないが、それらの位置、大きさまたは腫瘍随伴性の副作用によってそれらが正常な身体機能を妨害する場合は死を導きうる。
ASCが抗癌作用物質をコードする発現ベクターを保持するように操作されている(すなわち核酸が導入されている)場合に、癌を有する対象にASCの集団を投与する能力は、対象中の種々の良性および悪性の癌(例えば腹水および固形の腫瘍、細胞腫、白血病、リンパ腫、メラノーマ、肉腫)の治療のために有用である。対象のいくつかの腫瘍型は、乳房、結腸直腸、肺、卵巣、膵臓、前立腺、腎臓および精巣細胞腫である。
したがって抗癌作用物質を発現する操作されたASCで治療されうる癌の例は、これだけに限らないが、例えば小細胞または非小細胞肺、燕麦細胞、乳頭状、細気管支、扁平細胞、移行細胞、ウォーカー)、白血病(例えばB-細胞、T-細胞、HTLV、急性または慢性リンパ性、マスト細胞、骨髄性)、組織球腫、組織球症、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、形質細胞腫、細網内皮症、腺腫、腺癌、腺線維腫、腺リンパ腫、エナメル上皮腫、被角血管腫、好酸球性血管リンパ球増殖症、硬化性血管腫、血管腫症、アプドーマ、鰓腫、悪性カルチノイド症候群、カルチノイド心疾患、癌肉腫、セメント質腫、胆管腫、真珠腫、軟骨肉腫、軟骨芽細胞腫、軟骨肉腫、脊索腫、分離腫、頭蓋咽頭腫、軟骨腫、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢胞腺腫、葉状嚢胞肉腫、未分化胚細胞腫、上衣腫、ユーイング肉腫、線維腫、線維肉腫、巨細胞腫、神経節腫、神経膠芽腫、グロムス血管腫、顆粒膜細胞腫、ギナンドロブラストーマ、過誤腫、血管内皮腫、血管腫、血管外皮腫、血管肉腫、肝細胞種、膵島腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、白血肉腫、ライディッヒ細胞腫、脂肪腫、脂肪肉腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫、リンパ管肉腫、髄芽種、髄膜腫、間葉腫、中腎腫、中皮腫、筋芽細胞腫、筋腫、筋肉腫、粘液腫、粘液肉腫、神経鞘腫、神経腫、神経芽細胞腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経線維腫症、歯牙腫、骨腫、骨肉腫、乳頭腫、傍神経節腫、非クロム親和性傍神経節腫、松果体腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、セルトリ細胞腫、奇形腫、莢膜細胞腫および細胞が形成異常となった、不死化したまたは癌化した他の疾患を含む。
いくつかの実施形態では抗癌作用物質をコードする核酸配列を含む操作されたASCを含む組成物への対象は、それ以前に腫瘍の切除を受けていない。いくつかの実施形態では本明細書で開示される操作されたASCを含む組成物は、癌を有する対象における筋肉再生を促進するためには投与されない。いくつかの実施形態では本明細書で開示される操作されたASCを含む組成物は、対象から腫瘍が除去された位置または病変部には投与されない。
抗癌作用物質を発現する操作されたASCの癌を有する対象への投与
抗癌作用物質を発現する操作されたASCの集団は、単独でまたは他の細胞、組織、組織断片、VEGFなどの増殖因子および他の周知の血管新生増殖因子もしくは動脈新生(arteriogenic)増殖因子、生物学的に活性なもしくは不活性な化合物、吸収性プラスチックスキャフォールドまたは送達、有効性、許容性もしくは集団の機能を増強する目的の他の添加物との組合せで適用されうる。ASC集団は、構造的なまたは治療目的の誘導のために細胞の機能を変更、増強または補強するようにDNAの挿入によってまたは細胞培養物中に置くことによっても改変されうる。例えば幹細胞に対する遺伝子移行技術は、(Morizonoら、2003;Moscaら、2000)に開示されるとおり当業者に周知であり、ウイルストランスフェクション技術およびより詳細には、(WaltherおよびStein、2000)および(Athanasopoulosら、2000)に開示されるとおりアデノ随伴ウイルス遺伝子移行技術を含みうる。非ウイルスに基づく技術も、(Murarnatsuら、1998)に開示のとおり実施されうる。他の態様では抗癌作用物質を発現する操作されたASCは、血管新生亢進増殖因子(複数可)をコードする遺伝子で場合によって形質導入されうる。
抗癌作用物質を発現する操作されたASCの有効量を含む医薬組成物も本発明によって検討される。これらの組成物は、有効数の細胞を場合によって薬学的に許容される担体、添加物または賦形剤との組合せで含む。本発明の特定の態様では、細胞は移植の必要がある対象に滅菌生理食塩水中で投与される。本発明の他の態様では、細胞はハンクス平衡塩類溶液(HBSS)中またはIsolyte S、pH7.4中で投与される。無血清細胞培地の使用を含む他の手法も使用されうる。一実施形態では、細胞は血漿またはウシ胎児血清およびDMSO中で投与される。対象への細胞の全身投与は、特定の徴候には好ましい場合がある一方で、疾患の部位もしくは近傍および/または腫瘍部位への直接投与が他の徴候もしくは癌の種類では好ましい場合がある。
抗癌作用物質を発現する操作されたASCの集団を含む組成物は、癌を治療するための抗癌作用物質を発現する操作されたASCの再構成などの所望の目的のための書面による説明と共に適切な容器に場合によっては包装されうる。
一実施形態では抗癌作用物質を発現する操作されたASCを含む組成物は分化剤と共に投与される。一実施形態では抗癌作用物質を発現する操作されたASCは、対象への投与のために分化剤と組み合わされる。他の実施形態では抗癌作用物質を発現する操作されたASCは、分化剤とは別に対象に投与される。場合によって抗癌作用物質を発現する操作されたASCが分化剤とは別に投与される場合、ASCの投与と分化剤の投与とには時間的分離がある。時間的分離は、時間で約1分間未満から時間で約数時間または数日に及ぶ場合がある。最適な時期および投与順序の決定は容易であり、当業者によって日常的に決定される。
医薬組成物
抗癌作用物質を発現する操作されたASCを含む組成物は、任意の他の薬物、いくつかの実施形態では同じ医薬品適応症の治療のための他の作用物質と組み合わされうる。例えば抗癌作用物質を発現する操作されたASCの集団を含む組成物は、1つまたは複数の抗癌剤または癌治療、例えば手術、放射線もしくは化学療法薬(ダウノルビシン、イダルビシン、マイトマイシンC、5-フルオロウラシル(5-FU)、メトトレキサート(MTX)、タキソール、ビンクリスチンおよびシスプラチンなど)と組み合わされうる。本発明の範囲内で利用されうるオリゴヌクレオチド化合物との関連において医薬組成物およびそれらの調製、投与および投薬についての追加的適切な教示は、本明細書に参照により組み込まれる米国特許出願第20040146902号に示されている。
用語「抗癌剤」(抗癌作用物質を発現する操作されたASCを含む組成物と共に対象に同時投与されうる)は、対象中の癌にネガティブに影響を与えうる(例えば癌細胞を殺す、癌細胞のアポトーシスを誘導する、癌細胞の増殖速度を低下させる、転移細胞の数を減少させる、腫瘍の大きさを減少させる、腫瘍増殖を阻害する、腫瘍または癌細胞への血液供給を減少させる、癌細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進する、癌の進行を阻止もしくは阻害する、または癌を有する対象の寿命を増大させる)任意の作用物質、化合物または実体物である。抗癌治療は、生物学的作用物質(生物療法)、化学療法剤および放射線療法剤を含む。化学療法と生物療法との組合せ(すなわち抗癌作用物質を発現する操作されたASCを含む組成物の投与)は、生化学療法(biochemotherapy)として周知である。
他の実施形態では癌療法は、放射線療法をさらに含む化学療法投与計画を含む。代替実施形態では療法は、抗EGFR抗体またはその生物学的等価物の投与を含む。
操作されたASC細胞の対象への投与と共に(同時、先行もしくは続けてのいずれか)使用されうる化学療法および治療用抗癌作用物質もしくは抗癌剤は、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、カンプトテシン(CPT)、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにそれらの類似物および相同体などの細胞毒性作用物質を含む。治療剤は、これだけに限らないが代謝拮抗剤(例えばメトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシル、デカルバジン)、アルキル化剤(例えばメクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BCNU)、ロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、シス-ジクロロジアミン白金(II)(DDP)、シスプラチン)、アントラサイクリン(例えばダウノルビシン(以前のダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えばダクチノマイシン(以前のアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン(AMC))、有糸分裂阻害作用物質(例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン)ならびにAPTOSYN(登録商標)(エクシスリンド)、PANZEM(登録商標)(2-メトキシエストラジオール)およびプロテアソーム阻害物質VELCADE(登録商標)(ボルテゾミブ)などの選択的アポトーシス作用物質を含む。
卵巣癌の治療のための例示的抗癌作用物質は、以下の:エトポシド、メルファラン、シスプラチン、カルボプラチン、CPT、パクリタキセル、アントラサイクリン(例えばドキソルビシン)、ヘキサメチルアミン(アルトレタミン)、プロゲスチン(酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール)、5-フルオロウラシルに加えてロイコボリン(葉酸アンタゴニストに拮抗する)、イホスファミドまたはトポテカンの1つまたは複数を含みうる。
乳癌の治療のための例示的抗癌作用物質は、ドキソルビシン、PANZEM(登録商標)(2-メトキシエストラジオール)、パクリタキセル、メトトレキサート、5-フルオロウラシル、ドセタキセル、チオテパ、シスプラチン、(タモキシフェンおよびトレミフェンなどの)エストロゲン受容体調節因子、エストロゲン(例えばジエチルスチルベストロール)、アンドロゲン(例えばフルオキシメステロン)、生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)、アナストロゾール、アロマターゼ阻害物質(抗悪性腫瘍薬)、酒石酸ビノレルビン、塩酸ゲムシタビン、プロゲスチン(例えば酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール)、トラスツマブ(HERCEPTIN(登録商標))およびシクロホスファミドを含みうる。結腸直腸癌治療のための抗癌作用物質は、オキサリプラチン、5-フルオロウラシルまたはロイコボリンを含みうる。
前立腺癌の治療のための例示的抗癌作用物質は、抗アンドロゲン(例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、シプロテロン、メゲステロール)および黄体ホルモン放出ホルモン類似物(例えばブセレリン、ゴセレリン、ロイプロリド)を含みうる。肝臓癌治療のための抗癌作用物質は、5-フルオロウラシル、ロイコボリン、ラルチトレキセド、マイトマイシンCおよびCPT-1を含みうる。肺癌治療のための抗癌作用物質は、パクリタキセル、カルボプラチン、酒石酸ビノレルビン、塩酸ゲムシタビン、エトポシド、ドキソルビシン、イフォスアミド、ドセタキセル、シクロホスファミド、メトトレキサート、ロムスチン(CCNU)、塩酸トポテカンおよびシスプラチンを含みうる。
いくつかの実施形態では癌治療は、遺伝的に操作された成体ASCの投与および、フルオロピリミジン(例えば5-FU)、オキサリプラチン、CPT-11、(例えばイリノテカン)白金剤または抗EGFR抗体(セツキシマブ抗体など)から成る群から選択される化学療法剤またはそのような療法の組合せの投与を単独もしくは腫瘍の外科的切除との組合せで含む。
さらなる態様では治療は、放射線療法および/または腫瘍実体の外科的切除を腫瘍にまたは主な腫瘍実体が除去された位置に遺伝的に操作した成体ASCを投与することと併せて含む。一実施形態では本発明は、RCCを有すると同定されたまたは発症のリスクが増大している対象に、例えばTAXOL、シクロホスファミド、シスプラチン、ガンシクロビルなどの抗癌作用物質の組合せが使用される抗癌組合せ療法を投与することを包含する。抗癌療法は当技術分野において十分に周知であり、本発明の方法における使用に包含される。化学療法は、これだけに限らないがアルキル化剤、有糸分裂阻害物質、抗生物質または代謝拮抗剤、血管新生抑制作用物質などを含む。化学療法は、CTP-11、テモゾロミドまたは白金化合物の投与を含みうる。放射線療法は、例えばx-線照射、w-照射、ベータ-照射またはマイクロ波を含みうる。
いくつかの実施形態では化学療法剤は、細胞毒性形態に活性化されうるプロドラッグの形態でありうる。化学療法剤は当業者に周知であり、本発明における使用に包含される。例えば腫瘍および神経膠腫の治療のための化学療法剤は、これだけに限らないが:テモゾロミド(テモダール)、プロカルバジン(マチュレーン)およびロムスチン(CCNU)を含む。静脈内に投与される化学療法(IVによって、血管に挿入した針を介して)は、ビンクリスチン(オンコビンまたはビンカサールPFS)、シスプラチン(プラチノール)、カルムスチン(BCNU、BiCNU)およびカルボプラチン(パラプラチン)、メトトレキサート(リューマトレックスまたはトレキサル)、イリノテカン(CPT-11);エルロチニブ;オキサリパチン;アントラサイクリン-イダルビシンおよびダウノルビシン;ドキソルビシン;メルファランおよびクロラムブシルなどのアルキル化剤;cis-白金、メトトレキサートならびにビンデシンおよびビンブラスチンなどのアルカロイドを含む。
一実施形態では本発明の核酸構築物を含む医薬品は、対象に投与されうる。対象の例は、哺乳動物、例えばヒトおよび他の霊長類;ウシ、ブタ、ウマおよび飼育(農業用)動物;イヌ、ネコおよび他の家畜化された愛玩動物;マウス、ラットおよびトランスジェニック非ヒト動物を含む。
本発明は、限定として解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに説明される。本出願全体において引用された全ての参考文献の内容ならびに図および表は、本明細書に参照により組み込まれる。本発明は本明細書に記載される具体的な方法、手順および薬品などに、それらが変更できることから限定されないと理解されるべきである。本明細書において使用される専門用語は、具体的な実施形態を記載する目的のためのみであり、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図しない。
参考文献
本願明細書において引用された、文献、特許および特許出願を含む参考文献は参照によってその全体を本願明細書に組み込まれる。

Claims (20)

  1. 対象において癌を治療する方法であって、脂肪組織に由来する脂肪由来間質細胞(ASC)の単離集団を含む組成物を対象に投与するステップを含み、ASCの単離集団中の少なくとも1つのASCが、第1のプロモーターに作動可能に連結した第1の核酸配列を含み、第1の核酸配列が少なくとも1つの抗癌作用物質をコードし、少なくとも1つの抗癌作用物質をコードする第1の核酸配列の発現が癌を治療するためである方法。
  2. ASCの単離集団が、組成物を投与する同じ対象から得られる、請求項1に記載の方法。
  3. 抗癌作用物質が、核酸、タンパク質、ペプチド、siRNA、アンチセンス核酸、asRNA、RNAi、miRNA、抗体およびFc断片ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
  4. 脂肪由来間質細胞(ASC)の集団を含む組成物を全身または腫瘍に局所的に投与する、請求項1に記載の方法。
  5. 抗癌作用物質がアポトーシス促進分子またはそのアポトーシス促進断片である、請求項1に記載の方法。
  6. 抗癌作用物質が抗血管新生または血管新生亢進作用物質でない、請求項1に記載の方法。
  7. 少なくとも1つの抗癌作用物質をコードする第1の核酸配列が分泌配列もコードする、請求項1に記載の方法。
  8. ASCが、第2のプロモーターに作動可能に連結した第2の核酸配列をさらに含み、第2の核酸が少なくとも1つの細胞死遺伝子をコードする、請求項1に記載の方法。
  9. 対象が哺乳動物対象である、請求項1に記載の方法。
  10. 哺乳動物対象がヒト対象である、請求項9に記載の方法。
  11. 哺乳動物対象が腫瘍の切除を受けていない、請求項9に記載の方法。
  12. 脂肪組織に由来するASCの単離集団を含む前記組成物の投与を、腫瘍が対象から切除されている場所に行わない、請求項1に記載の方法。
  13. 第1のプロモーターに作動可能に連結した第1の核酸配列をASCにex vivoでトランスフェクトする、請求項1に記載の方法。
  14. 抗癌作用物質がポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
  15. ポリペプチドが、プロドラッグを活性化するタンパク質である、請求項14に記載の方法。
  16. 抗癌作用物質が、発癌遺伝子に対する阻害物質である、請求項1に記載の方法。
  17. 発癌遺伝子に対する阻害物質が、発癌遺伝子に対するRNAi分子である、請求項16に記載の方法。
  18. 発癌遺伝子が、HER2/Her-2、BRAC1およびBRAC2、Rb、p53、ならびにそれらの変異体からなる癌遺伝子の群から選択される、請求項16に記載の方法。
  19. 発癌遺伝子が、HER2/Her-2、BRAC1およびBRAC2、Rb、p53、ならびにそれらの変異体からなる癌遺伝子の群から選択される、請求項17に記載の方法。
  20. 癌が固形腫瘍である、請求項1に記載の方法。
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