KR20120051060A - 암 치료를 위한 전달 도구로서의 지방­유래 기질 세포（ａｓｃ） - Google Patents

Abstract

본 발명은 전반적으로 암의 치료를 위한 성체 지방-유래 기질 세포(ASC) 및 유전적으로 조작된 ASC의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 전반적으로, 하나 이상의 항암제를 코딩하는 유전자를 발현하도록 변형된, 조작된 ASC를 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 가진 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 항암제는 아폽토시스-촉진제(pro-apoptotic agent)이다. 일부 구체예에서, 항암제는 발암유전자의 발현을 저해하는 작용제이다.

Description

암 치료를 위한 전달 도구로서의 지방­유래 기질 세포（ＡＳＣ）{Adipose-derived stromal cells (ASC) as delivery tool for treatment of cancer}

본 발명의 분야는 전반적으로 개체에서 암의 치료를 위한 약물 전달 방법에 관한 것이다.

암 화학요법에서 핵심 문제는 건강한 조직에 대한 항암제의 심각한 독성 부작용이고, 이 부작용은 항상 투여량 감소, 치료 지연, 또는 심지어 화학요법의 중단을 초래한다 (Fennelly (1995) Clin. Cancer Res. 1:575-582; Hanjani, et al. (2002) Gynecol. Oncol. 85:278-284; Kobayashi, et al. (2002) Chronobiol. Int. 19:237-251; Ross and Small (2002) J. Urol. 167:1952-1956; Markman, et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20:2365-2369; Sehouli, et al. (2002) Gynecol. Oncol. 85:321-326). 건강한 기관에 대한 세포독성은 암 세포를 표적으로 작용하는 약물 전달 시스템을 이용하는 것에 의해 상당히 감소될 수 있다 (Alvarez, et al. (2002) Expert. Opin. Biol. Ther. 2:409-417; Dass and Su (2001) Drug Deliv. 8:191-213; Kopecek, et al. (2001) J. Controlled Rel. 74:147-158; Kunath, et al. (2000) Eur. J. Pharm. Biopharm. 49:11-15; Minko, et al. (2001) Dis. Manag. Clin. Outcomes 3:48-54; Vasey, et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20:1562-1569).

종양 치료법의 효율성을 증가시키기 위해, 항-종양 치료 및 독성 작용제(toxic agent)를 특이적으로 종양 세포에 전달하는 것이 중요하다. 전통적인 화학요법제는 개체에게 전신으로 투여되고 종양에 도달하기 위해 개체의 전신 순환을 순환한다. 항암제의 전신 투여는 항암제가 암세포가 아닌 세포(non-cancer cell)에 비특이적으로 작용하는 경우 바람직하지 않은 부작용을 가질 수 있고, 또한, 소량의 항암제만이 실제로 종양의 부위에 도달하는 결과를 초래할 수 있다. 따라서, 일부 경우에, 부분적으로 항암 약물이 효율적으로 종양 세포를 접촉할 수 없기 때문에 항암 약물의 전신 투여가 한정된다. 특히, 항암제의 종양 세포 덩어리로의 전달은 종양의 치밀한 세포 매스(dense cell mass)에 의한, 암세포에 대한 항암제의 제한적인 접근 때문에 비효율적일 수 있다.

항종양제(tumor-agent)가 개체에게 전신으로 전달되는 경우, 항암 약물은 종양 매스의 일부에만 도달할 수 있고, 또한 실제로 종양에 도달하는 경우, 너무 낮은 농도이어서 암세포를 살상하기 위해 유효하지 않을 수 있다. 또한, 종양에 혈관형성(vascularization) 및 영양분을 제공하는 자연적인 혈관신생 과정이 종양 크기의 수반된 증가를 유발하고 따라서, 종양 매스를 증가시키고, 전신 투여된 약물이 종양 매스 밀도 때문에 암세포의 상당한 부분에 도달하지 않을 가능성을 증가시킬 수 있다.

일부 경우에, 항암 약물 또는 화학요법제는 암세포에서 특이적으로 발현되는 세포-표면 마커를 특이적으로 인식하고 결합하는 항암 약물에 결합된, 종양 연관 항원(tumor associated antigen)으로도 지칭되는, 세포-표면 표적 모이어티(cell-surface targeting moiety)를 이용하여 종양의 부위로 유도되었고, 특이적으로 암 세포를 표적화했다. 그러나, 이러한 방법들도 종양 연관 항원이 반드시 편재하는 것은 아니므로 효과가 미진했다.

따라서, 보다 표적화된 종양 요법에 대한 요구가 존재한다.

본 발명은 전반적으로 성체 지방-유래 기질 세포(adipose-derived stromal cell, ASC) 및 유전적으로 조작된(genetically engineered) ASC의 암 치료를 위한 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 선택적으로 개체를 암으로 진단하고, 암을 갖는 개체에게 하나 이상의 항암제를 코딩하는 유전자를 발현하도록 변형된 조작된 ASC를 포함하는 조성물을 투여하는 것에 의해 암세포, 암세포들, 또는 종양 매스에 치료적 항암제를 전달하는 방법으로서, 개체에게 투여된 ASC의 집단 내의 내피 세포와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 일부 세포가 종양 세포의 혈관형성에 통합되고 혈관신생을 강화하고, 지방-유래 줄기 세포와 같은 일부 세포는 종양 매스로 귀소(home)하여, 그에 의해 항암제를 종양의 국소 혈관형성 네트워크(local vascularization network)를 통해 암세포에 직접 전달하고 근접한 범위 내의 위치로부터 주변 종양(surrounnding tumor)까지 전달하는 것인 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 일부 암 치료법이 항-혈관신생 화학물질 및 종양 주위에서 혈관신생을 억제하는 단백질을 이용하나, 종양의 높은 혈관신생 활성이 종양 내에서 항암제의 분포를 진행시키기 위해 이용될 수 있다는 놀라운 발견에 근거한다. 따라서, 본 발명은 종양을 혈관신생 억제제로 치료한다는 우세한 관점의 정반대이다. 본 발명에서, 항암제를 발현하는 유전적으로 변형된 ASC가 종양 주위의 혈관 구조(vasculature)에 내포되고 몰래 항암 단백질을 종양에 동시에 전달한다.

특히, ASC는 본 발명자가 ASC가 다양한 상이한 경로를 통해 항암제를 전달하기 위해 이용될 수 있는 세포들의 이질적 집단을 포함한다는 것을 발견한 바와 같이, 항암제 전달 도구로서 특히 유용하고, 예를 들면, 일부 세포는 종양에 혈액을 제공하는 혈관형성 및 혈관에 통합되고(예를 들면, 내피 세포) ASC 집단 내의 다른 세포들은 특이적으로 이동하여 종양 세포 내로 귀소하도록 기능한다(예를 들면, ASC 집단 내의 줄기 세포 및 간엽 세포). 따라서, 본 발명은 종양에 혈액 및 영양분을 제공하는 혈관형성 네트워크를 이용하여 암 또는 종양 세포 매스에 지속적으로 항암제를 전달하는 방법 및 이를 위한 조작된 ASC의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 일 양태는 종양 또는 암세포 매스에 생물학적 활성 항암제(예를 들면, 항암 단백질 분자, 또는 아폽토시스-유도 분자)를 치료적으로 전달하는 방법인 ASC-기반 전달 시스템에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 종양의 부위에 국소로 및 직접적으로 고 투여량의 항암제를 전달하는 방법을 제공한다. 이론에 의해 구속되기를 원하지 않으면서, 발현된 항암제는 국소로 전달되고 순환 내에서 짧은 반감기를 가질 것으로 예상되기 때문에, 전신성 비-특이적 반응은 최소일 것이다. 이는 보다 효과적으로 암세포를 살상하기 위해 보다 높은 농도의 항암제를 사용할 수 있게 한다.

본 발명의 일 양태는 암을 가진 개체에 ASC 집단을 이식시키는 단계를 포함하는 암 치료 방법으로서, 상기 방법은 개체로부터 ASC를 수득하는 단계, 및 상기 ASC를 항암제, 예를 들면, 항암 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형시키는 단계, 및 암의 치료를 위해 상기 항암제를 발현하는 조작된 ASC를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 암을 가진 개체로의 ASC 집단의 자가 조직 이식(autologous transplantation)이고, 다른 구체예에서, 상기 방법은 암을 가진 개체로의 ASC 집단의 동종(allogenic) 이식이다. 따라서, 본 발명은 개체 중 암으로의 항암제의 ASC-기반 전달 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, ASC의 집단이 암을 가진 개체에 국소로 투여되고, 예를 들면, 당해 분야에서 통상의 기술자에게 일반적으로 알려진 방법에 의해 종양의 부위로 국소 전달된다. 다른 구체예에서, ASC는 당해 분야에서 통상의 기술자에게 일반적으로 알려진 방법에 의해 암을 가진 개체에 전신으로 투여된다. 일부 구체예에서, 항암제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 ASC를 포함하는 조성물을 투여받는 개체는 이전에 종양 절제를 받지 않았다. 일부 구체예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 조작된 ASC를 포함하는 조성물은 암을 가진 개체에서 근육 재생을 촉진하기 위해 투여되지 않는다. 일부 구체예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 조작된 ASC를 포함하는 조성물은 개체에서 종양이 제거된 위치 또는 병변 부위에 투여되지 않는다.

본 발명의 일 양태는 개체에서 암의 치료를 위한 방법 및 조성물로서, 상기 방법은 암을 갖는 개체에게 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 포함하도록 변형된 지방-유래 기질 세포(ASC)의 실질적으로 순수한 집단을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 핵산 서열은 하나 이상의 항암제를 코딩하고, 상기 항암제를 코딩하는 핵산 서열의 발현은 암을 치료하기에 유효한 양인 것인 방법 및 조성물에 관한 것이다.

일부 구체예에서, ASC는 상기 조성물이 투여되는 개체와 동일한 개체로부터 수득된다. 또 다른 구체예에서, ASC가 수집된 적합한 공여체(matching donor)가 이용될 수 있고 암을 갖는 개체에게 투여될 수 있다.

본 발명의 모든 양태의 일부 구체예에서, 조작된 ASC에 의해 발현되는 항암제는 핵산, 단백질, 펩티드, siRNA, 안티센스 핵산, asRNA, RNAi, miRNA, 및 이들의 변이체로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 모든 양태의 일부 구체예에서, 지방-유래 기질 세포(ASC)의 집단을 포함하는 조성물은 이질적인 세포 집단, 예를 들면, 내피 세포의 집단, 간엽 세포의 집단, 섬유아세포의 집단, 평활근 세포의 집단, 혈관주위 세포(pericyes)의 집단, 지방-유래 줄기 세포의 집단 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, 지방-유래 기질 세포(ASC)의 집단은 2종 이상, 또는 3종 이상, 또는 4종 이상의 하기 세포 종류를 포함한다: 내피 세포의 집단, 간엽 세포의 집단, 섬유아세포의 집단, 평활근 세포의 집단, 혈관주위 세포의 집단, 지방-유래 줄기 세포의 집단. 일부 구체예에서, 지방-유래 기질 세포(ASC)의 집단은 추가적으로 기타 세포 또는 앞서 열거되지 않은 세포 집단을 포함한다.

본 발명의 모든 양태의 일부 구체예에서, 상기 조성물은 지방-유래 줄기 세포의 실질적으로 순수한 집단을 포함하는 지방-유래 기질 세포(ASC)의 집단을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 조성물은 지방 조직으로부터 정제된 지방-유래 기질 세포(ASC)의 집단을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 조성물은 지방 조직으로부터의 세포의 이질적 집단으로부터 선택된 지방-유래 기질 세포(ASC)의 집단을 포함한다.

본 발명의 모든 양태의 일부 구체예에서, 지방-유래 기질 세포(ASC)의 집단을 포함하는 조성물은 종양에 국소로 투여된다. 종양으로의 ASC 집단의 직접 투여는 예를 들면, 초음파 또는 자기 공명 이미징을 이용하여 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, 개체가 수술 또는 외과적 절제, 예를 들면, 종양 매스의 일부 또는 전체를 제거하도록 설계된 수술 절차를 받는 동안 또는 그 후에 개체에게 조작된 ASC를 투여할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 조작된 ASC가 투여된 개체는 수술 또는 외과적 절제, 예를 들면, 종양 매스의 일부 또는 전체를 제거하도록 설계된 수술 절차를 받은 적이 없었다. 일부 구체예에서, 상기 조작된 ASC는 외과적 절제, 예를 들면, 종양 매스의 일부 또는 전체를 제거하도록 설계된 수술 절차가 수행된 부위에서 개체에게 투여되지 않는다. 일부 구체예에서, 본 명세서에 개시된 조작된 ASC의 투여는 종양 제거 후 상처 치유를 촉진하고, 종양 제거 후 근육 재생을 촉진하기 위해 암을 갖는 개체에게 투여되지 않는다.

본 발명의 모든 양태의 일부 구체예에서, 조작된 ASC에 의해 발현된 항암제는 아폽토시스-촉진(pro-apoptotic) 분자 또는 아폽토시스-유도 분자, 또는 그의 단편이다. 일부 구체예에서, 조작된 ASC에 의해 발현된 항암제는 혈관신생 억제제(anti-angiogenic agent), 또는 호르몬, 또는 혈관신생 호르몬(예를 들면, VEGF) 또는 개체에서 혈관신생 또는 혈관형성을 촉진하는 작용제가 아니다.

일부 구체예에서, 하나 이상의 항암제를 코딩하는 핵산은 ASC로부터 상기 항암제를 분비시키는 분비 서열(secretary sequence)을 코딩하지 않는다. 분비 서열은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있고 모든 분비 서열이 본 발명에서의 사용을 위해 포함된다.

본 발명의 모든 양태의 일부 구체예에서, ASC는 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 핵산 서열은 하나 이상의 세포 사망 유전자(cell death gene)를 코딩한다. 예를 들면, ASC는 "자살(self-suicide)" 유전자, 예를 들면, 필요한 경우, 예를 들면, 개체에서 암의 효과적인 치료 및/또는 제거 때문에 항암제의 전달이 더 이상 필요하지 않은 경우, 개체로부터 조작된 ASC를 제거하기 위한 생물학적 안전성 메카니즘으로서 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 아폽토시스-촉진제를 포함할 수 있다.

본 발명의 모든 양태의 일부 구체예에서, 상기 개체는 포유동물 개체, 예를 들면, 인간 개체이다.

본 발명의 모든 양태의 일부 구체예에서, 상기 ASC는 체외에서(ex vivo) 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1 핵산 서열에 의해 형질감염된다. 벡터가 통상적으로 세포를 형질감염시키기 위해 이용된다.

본 발명의 모든 양태의 일부 구체예에서, 조작된 ASC에 의해 발현되는 항암제는 폴리펩티드, 예를 들면, 아폽토시스-촉진 폴리펩티드, 또는 아폽토시스-촉진 분자이고, 예를 들면, TRAIL, Bcl-XL, Hsp90; TNFα; DIABLO; BAX; BID; BID; BIM; Bcl-2의 저해제; Bad; PARP-1(poly ADP ribose polymerase-1); SMAC (Second Mitochondria-derived Activator of Caspases); 아폽토시스 유도 인자(apoptosis inducing factor, AIF); Fas (Apo-1 또는 CD95); Fas 리간드 (FasL) 및 이들의 변이체 및 단편이나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 모든 양태의 일부 구체예에서, 폴리펩티드 항암제(anti-cancer polypeptide agent)는 티미딘 키나아제, 카르복시펩티다아제 G2, 퓨린-데옥시뉴클레오시드 포스포릴라아제(PNP), 효모 시토신 데아미나아제 및 우라실 포스포리보실 트랜스퍼라아제로 구성된 융합 단백질(FCU1), 시토신 데아미나아제 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 전구 약물을 활성화시키는 단백질이다.

본 발명의 모든 양태의 일부 구체예에서, 조작된 ASC에 의해 발현되기에 유용한 항암제는 암 표적 유전자에 대한 저해제이고, 예를 들면, 암 표적 유전자에 대한 저해제는 핵산 저해제, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드, 안티센스, siRNA, miRNA, shRNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 그 유전자가 암 표적 유전자를 침묵시키는 RNAi 분자이다. 그와 같은 구체예에서, 암 표적 유전자는 암 세포 또는 암 줄기 세포에서 발현되나, 비-암세포, 또는 비-암 줄기 세포에서는 발현되지 않는 유전자이고, 예를 들면, HER2/Her-2, BRAC1과 BRAC2, Rb, p53, 및 그의 변이체의 군으로부터 선택된 암 유전자를 포함하나, 이에 한정되지 않는 발암유전자(oncogene)이다.

본 발명의 모든 양태의 일부 구체예에서, 상기 방법은 개체, 바람직하게는 포유동물 개체, 또는 인간 개체에서 암의 치료를 위해 적용될 수 있고, 상기에서 암은 예를 들면, 간엽 유래(mescenchymal in origin)(육종); 섬유 육종(fibrosarcoma); 점액 육종(myxosarcoma); 지방 육종(liposarcoma); 연골 육종(chondrosarcoma); 골육종(osteogenic sarcoma); 혈관육종(angiosarcoma); 내피육종(endotheliosarcoma); 림프관육종(lymphangiosarcoma); 윤활막육종(synoviosarcoma); 중피육종(mesotheliosarcoma); 유잉 종양(Ewing's tumor); 골수성 백혈병(myelogenous leukemia); 단핵구 백혈병(monocytic leukemia); 악성 백혈병(malignant leukemia); 림프구 백혈병(lymphocytic leukemia); 형질세포종(plasmacytoma); 평활근육종(leiomyosarcoma); 및 횡문근육종(rhabdomyosarcoma); 상피세포암(cancers epithelial in origin)(암종); 편평세포암종 또는 상피세포 암종(squamous cell or epidermal carcinoma); 기저세포 암종(basal cell carcinoma); 한선 암종(sweat gland carcinoma); 피지선 암종(sebaceous gland carcinoma); 선암종(adenocarcinoma); 유두 암종(papillary carcinoma); 유두 선암종(papillary adenocarcinoma); 낭선암종(cystadenocarcinoma); 수질 암종(medullary carcinoma); 미분화 암종(undifferentiated carcinoma)(단순 암종(simplex carcinoma)); 기관지원성 암종(bronchogenic carcinoma); 기관지 암종(bronchial carcinoma); 흑색암종(melanocarcinoma); 신장세포 암종(renal cell carcinoma); 간세포 암종(hepatocellular carcinoma); 담관 암종(bile duct carcinoma); 이행 세포 암종(transitional cell carcinoma); 편평세포 암종(squamous cell carcinoma); 융모막암종(choriocarcinoma); 고환종(seminoma); 배아 암종(embryonal carcinoma); 악성 기형종(malignant teratoma); 및 기형암종(terato carcinoma); 백혈병(leukemia); 급성 림프구 백혈병(acute lymphocytic leukemia) 및 급성 골수세포 백혈병(acute myelocytic leukemia)(골수모세포성(myeloblastic), 전골수모세포성(promyeloblastic), 골수단핵세포성(myelomonocytic); 단핵세포성(monocytic), 및 적백혈병(erythroleukemia)); 만성 백혈병(chronic leukemia); 만성 골수세포성(과립세포성) 백혈병(chronic myelocytic (granulocytic) leukemia); 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia); 진성 적혈구 증가증(polycythemia vera); 림프종; 호지킨병; 비-호지킨병(non-Hodgekin's disease); 다발 골수종(multiple mycloma); 발덴스트룀 마크로글로불린혈증(Waldenstrm's macroglobulinemia); 중쇄병(heavy chain disease)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 상기 암은 림프종(lymphia); 백혈병; 육종; 선종이다. 일부 구체예에서, 상기 암은 급성 림프모세포성 백혈병(acute lympoblastic leukemia, ALL)이다.

본 발명의 또 다른 양태는 암의 치료를 위한 본 발명에 개시된 지방-유래 기질 세포(ASC)를 생성하기 위한 키트로서, 상기 키트는 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하고, 상기 핵산 서열은 하나 이상의 항암제를 코딩하는 것인 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 또한 ASC를 형질도입시키기 위한 설명서 및 배양 배지, 및 조작된 ASC를 증식시키기 위한 설명서 및 배양 배지를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 개체로의 조작된 ASC의 투여를 위한 장치 및 약제학적으로 허용가능한 시약을 더 포함할 수 있다.

본 발명은 개체 중 종양에 항암제를 전달하는 방법 및 이를 위한 조성물에 관한 것이고, 특히, 암을 가진 개체의 치료를 위한, 항암제를 발현하는 유전적으로 조작된 지방-유래 기질 세포(ASC)의 용도에 관한 것이다.

특히, 본 발명자들은 ASC가 특이적으로 이동해서 종양 주변의 혈관형성에 통합되고 혈관신생을 강화시킨다는 것을 발견했기 때문에, ASC는 항암제 전달 비히클 또는 전달 도구로서 특히 유용하다. 따라서, 본 발명은 암 또는 종양 세포 매스로 지속적으로 항암제를 전달하기 위한 조작된 ASC의 용도에 관한 것이고, ASC 집단 내 일부 세포, 예를 들면, 내피 세포이나, 이에 한정되지 않는 세포가 종양에 혈액 및 영양분을 공급하는 혈관형성 네트워크로 통합되고, ASC 집단 내 일부 세포, 예를 들면, 지방-유래 줄기 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는 세포가 종양 매스로 이동해 귀소된다.

본 발명의 일 양태는 암을 갖는 개체에게 하나 이상의 항암제를 발현하고 분비하도록 변형된 조작된 ASC의 집단을 포함하는 조성물을 투여하는 것에 의해 암세포에 치료 항암제를 전달하는 방법으로서, 상기 조작된 ASC가 종양 세포 매스 주위의 혈관형성에 통합되고 혈관신생을 강화하여, 이에 의해 항암제를 암세포에 혈액 및 영양분을 공급하는 전신 순환 및 국소 혈관형성 네트워크에 전달하는 것인 방법에 관한 것이다.

정의:

편의를 위해, 전체 출원(명세서, 실시예, 및 첨부된 청구항)에서 사용된 일부 용어를 정리한다. 달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

본 발명은 기재된 특정한 방법, 프로토콜, 세포주, 식물 종 또는 속, 작제물(construct), 및 시약에 한정되지 않는 것으로 이해될 것이다. 또한, 본 명세서에서 사용된 전문용어는 특정한 구체예만을 설명하기 위한 목적이며, 첨부된 청구항에 의해서만 한정될, 본 발명의 범위를 한정하도록 의도되지 않는 것으로 이해될 것이다.

용어 "지방-유래 기질 세포(adipose-derived stromal cell)" 또는 "ASC"는 지방 조직으로부터 유래된 성체 세포를 의미한다. 지방-유래 기질 세포는 하기의 세포 집단 중 1종 이상 또는 2종 이상을 포함하는 세포의 이질적 집단이다: 내피 세포, 간엽 줄기 세포, 섬유모세포, 평활근세포, 혈관주위세포(pericyte), 및 지방-유래 줄기 세포, 및 열거되지 않은 추가적인 기타 세포 종류. 일부 구체예에서, 지방-유래 기질 세포는 지방-유래 줄기 세포의 실질적으로 순수한 집단이다. 일부 구체예에서, 지방-유래 기질 세포는 지방 유래 재생 세포(adipose derived regenerative cell)를 의미하지 않는다. ASC는 지방 조직으로부터 수집되고 실질적으로 지방세포 및 적혈구 및 결합 조직 줄기 세포의 클론 집단을 실질적으로 포함하지 않는다. ASC는 지방 조직으로부터의 세포외 기질 물질(extracellular matrix material)을 포함하는, 세포를 실질적으로 포함하지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "지방(adipose)"은 개체로부터의 지방 조직을 의미한다. 용어 "지방" 및 "지방 조직(adipose tissue)"은 본 명세서에서 호환적으로 사용된다. 지방 조직은 피하 조직, 대망/내장(omental/visceral), 유방, 생식선, 또는 기타 지방 조직 부위로부터 유래된, 갈색 지방, 백색 지방, 또는 황색 지방, 또는 백색 지방 조직일 수 있다. 지방 조직은 지방세포 및 기질(stroma)을 갖는다. 지방 조직은 동물의 신체 전체에서 발견된다. 예를 들면, 포유동물에서, 지방 조직은 대망, 골수, 피하 공간(subcutaneous space) 및 대부분의 조직의 주변에서 발견한다. 바람직하게는, 지방 조직은 피하 백색 지방 조직이다. 그와 같은 세포는 일차 세포 배양물(primary cell culture) 또는 불멸화된 세포주(immortalized cell line)를 포함할 수 있다. 지방 조직은 지방(fat)을 갖는 개체로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 지방 조직은 포유동물의 조직이고, 가장 바람직하게는, 지방 조직은 인간 조직이다. 지방 조직의 편리한 공급원(source)은 지방흡입 수술이나, 지방 조직의 공급원, 또는 지방 조직을 분리하는 방법은 본 발명에 중요하지 않다.

본 명세서에서 사용된 용어 "성체(adult)"는 비-배아(non-embryonic) 또는 비-신생(non-postnatal) 청년(juvenile) 동물 또는 개체를 의미하도록 의도된다. 예를 들면, 용어 "성체 지방-유래 기질 세포(adult adipose-derived stromal cell),"는 배아 또는 청년 동물로부터 수득된 것이 아닌, 지방-유래 기질 세포를 의미한다.

"단편(fragment)" 또는 "세그먼트(segment)"는 하나 이상의 아미노산을 포함하는, 아미노산 서열의 일부, 또는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열의 일부이다. 용어 "단편" 및 "세그먼트"는 본 명세서에서 호환적으로 사용된다.

본 명세서에서 사용된, "기능성(functional)" 또는 "생리적 활성(phsiologically active)" 분자는 특징적인 성질이나 활성을 보이는 형태의 분자이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "이식(graft)"은 유리(결합되지 않은) 세포, 조직, 또는 기관이 개체로의 이식술 후, 조직으로 결합되는 과정을 의미한다.

용어 "동종이식(allograft)"은 동일 종의 다른 동물로부터 유래된, 이식된 세포, 조직, 또는 기관을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "이종이식(xenograft)"은 상이한 종의 동물로부터 유래된, 이식된 세포, 조직, 또는 기관을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "상동의(homologous)"는 두 개의 폴리머 분자, 예를 들면, 두 개의 핵산 분자, 예를 들면, 두 개의 DNA 분자 또는 두 개의 RNA 분자, 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서브유닛 서열 유사성을 의미한다. 두 분자 모두에서 서브유닛 위치가 동일한 단량체 서브유닛에 의해 차지된 경우, 예를 들면, 두 개의 DNA 분자 각각에서 하나의 위치가 아데닌에 의해 차지된 경우, 이들은 그 위치에서 상동성이다. 두 서열 간의 상동성은 일치하는 또는 상동성 위치의 갯수의 직접적인 함수이고, 예를 들면, 두 개의 화합물 서열의 위치의 절반(예를 들면, 길이가 10개의 서브유닛으로 이루어진 폴리머 중 5개의 위치)이 상동성인 경우, 이 두 서열은 50% 상동성이고, 위치의 90%, 예를 들면, 10개의 위치 중 9개의 위치가 일치되거나 상동성인 경우, 이 두 서열은 90% 상동성을 갖는다. 예로서, DNA 서열 3'ATTGCC5'과 3'TATGGC5'은 50% 상동성을 갖는다. 본 명세서에서 사용된 용어 "상동성"은 "동일성(identity)"와 동의어로 사용된다.

세포와 관련하여 사용되는 경우, 용어 "단리된(isolated)"은 단일 목적 세포(cell of interest) 또는 목적 세포의 이질적 집단, 예를 들면, 기원 조직(예를 들면, 지방 조직)에서 천연적으로 존재하는 다른 세포 종류 또는 다른 세포성 물질로부터 적어도 부분적으로 단리된, 지방-유래 기질 세포이다. 달리 말하면, 단리된 ASP는 지방세포 및 적혈구 및 결합 조직 줄기 세포의 클론성 집단을 실질적으로 포함하지 않고, 세포외 매트릭스 물질 및 지방 조직으로부터의 세포와 같은 세포들을 실질적으로 포함하지 않는다. 목적 세포가 아닌 지방 조직의 세포가 60% 이상, 또는 75% 이상, 또는 90% 이상, 및 일부 경우에, 99% 이상 불포함(free)인 경우, 지방-유래 기질 세포의 시료는 "실질적으로 순수(substantially pure)"하다. 명확성을 위해, ASC 집단의 세포의 이질적 집단 중 목적 세포는 예를 들면, 내피 세포, 간엽 줄기 세포, 섬유모세포, 평활근 세포, 혈관주위 세포, 및 지방-유래 줄기 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는 세포를 포함한다. 순도(purity)는 적절한 방법, 예를 들면, FACS(fluorescence-activated cell sorting), 또는 세포 종류를 구별하는 기타 분석법에 의해 측정될 수 있다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "정제된(purified)"은 천연 환경에서 세포, 세포 종류, 분자, 또는 화합물과 정상적으로 연관된 기타 성분 대비 세포, 세포 종류, 분자, 또는 화합물의 강화(enrichment)에 관한 것이다. 용어 "정제된"은 반드시, 특정한 세포, 세포 종류, 분자, 또는 화합물의 완전한 순도가 해당 과정 동안 달성되었다는 것을 나타내는 것은 아니다. 본 명세서에서 사용된 ASC의 "고도로 정제된(highly purified)" 집단은 순도가 90%보다 높은 ASC의 집단을 의미한다(즉, ASC의 고도로 정제된 집단은 적혈구, 지방세포, 및 지방 조직의 세포외 매트릭스의 세포와 같은 비-ASC 세포 대비, 90% 이상의 ASC 집단의 세포(즉, 내피 세포, 간엽 줄기 세포, 섬유모세포, 평활근세포, 혈관주위 세포 및 지방-유래 줄기 세포)를 포함한다).

본 명세서에서 사용된, 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 인산염 완충 생리식염수, 물, 유/수(oil/water) 또는 수/유 에멀젼과 같은 에멀젼, 및 다양한 종류의 습윤제와 같은 표준 약제학적 담체를 포함한다. 상기 용어는 또한 사람을 포함한 동물에서의 사용을 위해 미국 약전(US Pharmacopeia)에 열거되거나 또는 미국 연방 정부의 규제 기관에 의해 허가된 작용제를 포함한다.

본 명세서에서 사용된, "개체(subject)"는 치료 또는 예방적 치료가 필요한 개체 또는 동물이다. 그와 같은 동물은 포유동물, 바람직하게는 사람을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "유전자(gene)"는 mRNA 분자의 번역의 결과 원형 폴리펩티드(nascent polypeptide)에서 발견되는 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 코딩 영역은 진핵생물에서 5'-쪽은 개시 메티오닌을 코팅하는 뉴클레오티드 트리플렛 "ATG"에 의해 표시되고, 3'-쪽은 종료 코돈(즉, TAA, TAG, TGA)을 특정하는 3개의 트리플렛 중 하나에 의해 표시된다. 인트론을 포함하는 것 외에, 유전자의 게놈 형태는 또한 "5'-비번역 영역(untranlated region)" 또는 각각 5'UTR 및 3' UTR 비번역 영역(3'UTR)로 지칭되는, RNA 전사체에 존재하는 서열의 5'- 및 3'-말단에 위치한 서열을 포함할 수 있다. 이 서열들은 또한 "플랭킹(flanking)" 서열 또는 영역으로도 지칭된다(이와 같은 플랭킹 서열은 mRNA 전사체 상에 존재하는 비-번역 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치한다). 5'-플랭킹 영역은 유전자의 전사를 제어하거나 영향을 미치는 조절 서열, 예를 들면, 프로모터 및 인핸서(enhancer)를 포함할 수 있다. 3'-플랭킹 영역은 전사, 전사-후 절단(post-transcriptional cleavage) 및 폴리아데닐화(polyadenylation)를 지시하는 서열을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "엑손(exon)"은 발현된 단백질의 일부 또는 전체를 코딩하는 핵산 분자, 일반적으로 DNA의 세그먼트를 의미하는 용어의 일반적 의미를 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "발현(expression)"은 세포 내에서 유전자 생성물의 생합성, 바람직하게는 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 내재(endogenous) 유전자 또는 이종(heterologous) 유전자의 전사 및/또는 번역을 의미한다. 예를 들면, 이종 핵산 서열의 경우, 발현은 이종 핵산 서열의 mRNA로의 전사, 및 선택적으로 mRNA의 하나 이상의 폴리펩티드로의 뒤이은 번역을 포함한다. 발현은 또한 RNAi 분자의 생합성을 의미하고, 이는 RNAi 작용제, 예를 들면, siRNA, shRNA, 및 안티센스 DNA의 발현 및 전사를 의미하나, 폴리펩티드 서열로의 번역은 요구하지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "발현 작제물(expression construct)" 및 "핵산 작제물(nucleic acid construct)"은 동의어이고 적절한 숙주 세포(예를 들면, 포유동물 세포)에서 이종 표적 유전자 서열과 같은, 특정 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있는 핵산 서열을 의미한다. 원하는 이종 표적 유전자의 번역이 요구되는 경우, 이는 일반적으로 뉴클레오티드 서열의 적절한 번역을 위해 요구되는 서열을 포함한다. 코딩 영역은 목적 단백질을 코딩할 수 있으나, 또한 센스 또는 안티센스 방향의 목적 기능성 RNA, 예를 들면, 안티센스 RNA, dsRNA, 또는 비번역 RNA를 코딩할 수 있다. 본 명세서에 개시된 핵산 작제물은 키메라(chimeric) 작제물일 수 있고, 이는 그의 성분 중 하나 이상이 그의 다른 성분 중 하나 이상에 대해 이종 기원이라는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "유전자(gene)"는 특정 방식으로 유전자 생성물(예를 들면, 폴리펩티드 또는 기능성 RNA)의 발현을 조절할 수 있는 적절한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 코딩 영역을 의미한다. 유전자는 코딩 영역(개방 해독 프레임(open reading frame), ORF)의 이전(상류) 및 이후(하류)에 존재하는 DNA의 비번역 조절 영역(예를 들면, 프로모터, 인핸서, 리프레서(repressor), 등), 및 적절한 경우, 개별적인 코딩 영역(즉, 엑손) 사이의 개재 서열(intervening sequence)(즉, 3'UTR, 5'UTR, 인트론)을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "구조 유전자(structural gene)"는 mRNA로 전사되고 특정 폴리펩티드의 특징적인 아미노산의 서열로 번역되는 DNA 서열을 의미하도록 의도된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "유전자 생성물(gene product)"은 유전자로부터 전사된 RNA, 또는 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 RNA로부터 번역된 폴리펩티드를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "게놈(genome)" 또는 "게놈 DNA(genomic DNA)"는 숙주 개체의 유전성 유전 정보를 의미한다. 게놈 DNA는 핵의 DNA(염색체 DNA(chromosomal DNA)로도 지칭됨) 및 색소체(예를 들면, 엽록체) 및 기타 세포 소기관(예를 들면, 미토콘드리아)의 DNA를 포함한다. 용어 게놈 또는 게놈 DNA는 일반적으로 핵의 염색체 DNA를 의미한다.

용어 "이종 표적 유전자(heterologous target gene)" 또는 "이종 유전자 서열(heterologous gene sequence)"은 본 명세서에서 호환적으로 사용되고, 세포의 게놈 내로 도입된 핵산(예를 들면, 유전자 서열)을 의미한다. 이종 유전자 서열은 도입되는 유전자가 숙주 세포에서 천연적으로 일어나는 수준 대비 상이한 수준으로 발현되고 및/또는 천연 유전자 대비 일부 변형(예를 들면, 점 돌연변이, 선택 마커 유전자의 존재 등)을 포함하거나, 또는 유도되는 수준 대비 세포에서 정상적으로 동일한 수준에서 발현되지 않는 한, 그 세포에서 발견되는 유전자 서열을 포함할 수 있다. 이종 표적 유전자는 세포에 존재하나, 발현될 수준으로 존재하지 않을 수 있거나, 핵산 서열은 실험적 조작에 의해 변형되었고, 예를 들면, 변형은 예를 들면, 돌연변이 유발에 의해 변형된, 하나 이상의 비-천연, 합성 또는 인공 방법에 의해 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드 잔기의 치환, 부가, 결실, 역전 또는 삽입일 수 있거나, 또는 핵산은 그의 천연 또는 원형(native) 유전적 환경에 위치하지 않는다. 그와 같은 핵산 변형 방법이 기재되었다 (참조에 의해 본 명세서에 포함된, US 5,565,350; WO 00/15815). 일부 경우에, 이종 표적 유전자는 이종 유전자 또는 구조 유전자(예를 들면, 리포터 유전자, 선택 마커 유전자, 약물 내성 유전자, 성장 인자 등)의 코딩 서열, 및 mRNA 또는 단백질 생성물을 코딩하지 않는 비-코딩 조절 서열(예를 들면, 프로모터 서열, 폴리아데닐화 서열, 종료 서열, 인핸서 서열, RNA 분자, 등)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 목적 핵산 서열은 바람직하게는 이종 유전자, 예를 들면, 가치있는 형질을 코딩하고, 예를 들면, 암 치료제에서 사용하기 위한 독소 유전자, 또는 그의 단편을 코딩하는 이종 유전자 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 경우에, 이종 표적 유전자는 그 자신이 도입된 세포에 내재되지 않거나 또는 자연적으로 연관되지 않으나, 또 다른 세포에서 수득된 것이다. 이종 표적 유전자는 또한 일부 변형을 포함하는 내재 DNA 서열, 내재 DNA 서열의 비-천연 다중 카피, 또는 그에 물리적으로 연결된 또 다른 DNA 서열과 자연적으로 연관되지 않는 DNA 서열을 포함한다. 일반적으로, 반드시 그런 것은 아니나, 이종 표적 유전자는 발현될 세포에 의해 정상적으로 생성되지 않는 RNA 및 단백질을 코딩한다.

용어 "표적(target)", "표적 유전자(target gene)" 및 "표적 뉴클레오티드 서열(target nucleotide sequence)"은 본 명세서에서 균등하게 사용되고 개체에 존재하는 목적 유전자일 수 있는 표적 유전자를 의미한다. 표적 유전자는 내재되거나 또는 도입될 수 있다. 예를 들면, 표적 유전자는 공지된 기능의 유전자이거나 또는 그 기능이 알려지지 않았으나, 전체 서열 또는 부분적 서열이 알려진 유전자이다. 대안적으로, 표적 유전자 및 그의 뉴클레오티드 서열의 기능은 모두 미지(unknown)이다. 표적 유전자는 진핵생물 세포의 원형 유전자일 수 있거나, 또는 진핵생물 세포, 또는 상기 진핵생물 세포의 부모 세포(parent cell)에 예를 들면, 유전적 형질전환에 의해 이전에 도입되었던 이종 유전자일 수 있다. 이종 표적 유전자는 진핵생물 세포의 게놈에 안정적으로 통합될 수 있거나, 또는 진핵생물 세포에 염색체외 분자(extrachromosomal molecule)로서, 예를 들면, 자가복제 염색체외 분자(autonomously replicating extrachromosomal molecule)로서 존재한다. 표적 유전자는 복제, 전사, 번역 또는 표적 유전자의 발현에서 중요한 다른 과정을 조절하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 영역을 코딩하는 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 또는 표적 폴리펩티드를 코딩하는 영역 및 상기 표적 폴리펩티드의 발현을 조절하는 영역; 또는 5' UTR 또는 3' UTR 또는 인트론과 같은 비-코딩 영역을 을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 표적 유전자는 예를 들면, 목적 유전자의 전사에 의해 생성된 mRNA 분자를 의미할 수 있다.

용어 "내재적(endogenous)" 뉴클레오티드 서열은 정상적 조건 하에서 세포의 게놈에 존재하는 뉴클레오티드 서열, 즉, 정상적으로 세포 내에 존재하고, 세포 내로 또는 다른 유전적 조작 전략에 의해 도입되지 않은 뉴클레오티드 서열을 의미한다. "비-내재적(non-endogenous)" 또는 "합성(synthetic)" 서열로 지칭되는 핵산 서열은 그 전체 서열이 핵산이 도입된 세포에서 발견되지 않는 것인 서열을 의미한다. 일부 구체예에서, RNAi 표적 부위는 비-내재적 또는 합성 서열이고, 이는 전체 서열이 그 핵산 작제물이 도입된 세포 내에서 발견되지 않는다는 것을 의미한다.

용어 "필수적(essential)" 유전자는 개체 또는 세포의 증식 또는 생존에 필수적인, 생합성 효소, 수용체, 신호 전달 단백질(signal transduction protein), 구조 유전자 생성물, 또는 수송 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "상동성 DNA 서열(homologous DNA Sequence)"은 숙주 세포 또는 또 다른 DNA 서열과 본래 연관된 DNA 서열을 의미한다.

용어 "포유동물(mammal)" 또는 "포유 동물(mammalian)"은 본 명세서에서 호환적으로 사용되고, 그들의 일반적 의미를 포괄하도록 의도된다. 본 발명이 가장 바람직하게 인간에서의 효능을 의도하는 반면, 본 발명은 개, 고양이, 말과 같은 가축 포유동물(domestic mammal), 및 특별한 목적 포유동물, 예를 들면, 동물원 동물, 축산 동물(farmstock), 형질전환 동물, 설치류 등에서 사용될 수 있다.

RNAi 분자, 예를 들면, siRNA 또는 miRNA의 활성과 관련하여, 본 명세서에서 사용된, "유전자 침묵(gene silencing)" 또는 "침묵된 유전자(gene silenced)"는 세포 내에서 miRNA 또는 RNA 간섭 분자가 존재하지 않는 세포에서 발견된 mRNA 수준 대비 이종 표적 유전자의 mRNA 수준의 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 99% 이상, 약 100% 감소를 의미한다. 하나의 바람직한 구체예에서, mRNA 수준은 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 100% 감소된다. 본 명세서에서 사용된, "감소된(reduced)" 또는 "유전자 침묵"은 보다 낮은, 바람직하게는 훨씬 더 낮은 뉴클레오티드 서열의 발현을 의미하고, 보다 바람직하게는 뉴클레오티드 서열의 발현이 검출가능하지 않다.

본 명세서에서 사용된 용어 "이중-가닥 RNA(double-stranded RNA)" 분자, "RNAi 분자", 또는 "dsRNA"는 뉴클레오티드 서열의 센스 RNA 단편과 상기 뉴클레오티드 서열의 안티센스 RNA 단편으로서, 두 단편은 모두 상호 간에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이에 의해 상기 센스 RNA 단편과 안티센스 RNA 단편은 쌍을 이루고, 이중-가닥 RNA 분자를 형성하는 것인 단편을 의미한다. 일부 구체예에서, 상기 용어는 발현되는 경우, 이종 표적 유전자의 mRNA의 수준을 적어도 부분적으로 감소시킬 수 있는 이중-가닥 RNA 분자를 의미한다. 특히, RNAi 분자는 이종 표적 유전자의 비-코딩 영역에 위치한 합성 RNAi 표적 서열에 상보적이다. 본 명세서에서 사용된, "RNA 간섭(RNA interference)", "RNAi" 및 "dsRNAi"는 본 명세서에서 호환적으로 사용되고, 유전자 침묵을 수행할 수 있는 핵산 분자를 의미한다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "RNAi"는 siRNAi, shRNAi, stRNAi, 내재 microRNA 및 인공 microRNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는 간섭 RNA를 의미한다. 예를 들면, RNAi는 RNA의 하류 가공의 메카니즘과 상관없이, siRNA로 이전에 확인된 서열을 포함한다(즉, siRNA는 mRNA의 절단을 초래하는, 인 비보 가공의 특정한 방법을 갖는 것으로 사료되나, 그와 같은 서열은 본 명세서에 기재된 플랭킹 서열의 배경에서 벡터 내로 도입될 수 있다). 용어 "siRNA"는 또한 이중 가닥 RNA를 형성하는 핵산을 의미하고, 이중 가닥 RNA는 siRNA가 표적 유전자와 동일한 세포에 존재하거나 발현되는 경우, 유전자 또는 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 또는 억제할 수 있는 능력을 갖는다. 이중가닥 RNA, siRNA는 상보적 가닥에 의해 형성될 수 있다. 일 구체예에서, siRNA는 이중가닥 siRNA를 형성할 수 있는 핵산을 의미한다. siRNA의 서열은 전장(full length) 표적 유전자 또는 그의 서브서열과 일치할 수 있다. 일반적으로, siRNA는 길이가 약 10 내지 50개의 뉴클레오티드로 구성된 길이이다(예를 들면, 이중가닥 siRNA의 각각의 상보적 서열은 길이가 10 내지 22개의 뉴클레오티드로 구성된 길이이고, 이중가닥 siRNA는 길이가 약 10 내지 22개의 염기쌍이고, 바람직하게는 약 19 내지 22개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 17 내지 19개의 뉴클레오티드로 구성된 길이, 예를 들면, 길이가 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 또는 22개의 뉴클레오티드로 구성된 길이이다).

본 명세서에서 사용된 "shRNA" 또는 "작은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA)"(스템 루프(stem loop)로도 지칭됨)는 일종의 siRNA이다. 일 구체예에서, 이 shRNA는 짧은, 예를 들면, 약 10 내지 25개의 뉴클레오티드로 구성된 안티센스 가닥, 및 뒤이은 약 5 내지 약 9개의 뉴클레오티드로 이루어진 뉴클레오티드 루프, 및 유사한 센스 가닥으로 구성된다. 대안적으로, 센스 가닥은 뉴클레오티드 루프 구조를 선행하고 안티센스 가닥이 뒤따를 수 있다.

"스템-루프 구조(stem-loop structure)"는 한쪽으로는 우세하게 단일-가닥 뉴클레오티드의 영역(루프-부분)에 연결된 이중 가닥(스템 부분)을 형성하는 것으로 알려지거나 예측되는 뉴클레오티드의 영역을 포함하는 이차 구조를 갖는 핵산을 의미한다. 용어 "헤어핀(hairpin)" 및 "폴드-백(fold-back)" 구조는 또한 본 명세서에서 스템-루프 구조를 지칭하기 위해 사용된다. 그와 같은 구조가 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있고, 이 용어는 이 분야에서 공지된 의미로 일관성 있게 사용된다. 스템-루프 구조 내의 뉴클레오티드의 실제의 일차 서열은 이차 구조가 존재하는 한, 본 발명의 실시에 중요하지 않다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 바와 같이, 이차 구조는 정확한 염기쌍 형성을 요구하지 않는다. 따라서, 스템은 하나 이상의 염기 불일치를 포함할 수 있다. 대안적으로, 염기쌍 형성은 정확할 수 있고, 즉, 불일치를 포함하지 않을 수 있다. 일부 경우에, 전구체 micrRRNA 분자는 두 개 이상의 스템-루프 구조를 포함할 수 있다. 다중 스템-루프 구조는 링커, 예를 들면, 핵산 링커 또는 microRNA 플랭킹 서열 또는 다른 분자 또는 그의 조합을 통해 상호 간에 연결될 수 있다. 스템-루프 구조 내의 뉴클레오티드의 실제의 일차 서열은 이차 구조가 존재하는 한, 본 발명의 실시에 중요하지 않다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 바와 같이, 이차 구조는 정확한 염기쌍 형성을 요구하지 않는다. 따라서, 스템은 하나 이상의 염기 불일치를 포함할 수 있다. 대안적으로, 염기쌍 형성을 불일치를 포함하지 않을 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "헤어핀 RNA(hairpin RNA)"는 자가-어닐링(self-annealing) 이중 가닥 RNA 분자를 의미한다. 그의 가장 단순한 표현에서, 헤어핀 RNA는 단일 가닥 RNA 루프에 의해 연결된, 어닐링 RNA 가닥에 의해 이루어진 이중 가닥 스템으로 구성되고, "팬-핸들 RNA(pan-handle RNA)"로도 지칭된다. 그러나, 용어 "헤어핀 RNA"는 자가-어닐링 이중 가닥 RNA 서열, 및 내부 벌지(internal bulge) 및 루프를 포함하는 보다 복잡한 이차 RNA 구조를 포괄하도록 의도된다. 개조된 특이적 이차 구조는 RNA 분자의 자유 에너지에 의해 결정될 것이고, FOLDRNA (Zuker and Stiegler (1981) Nucleic Acids Res 9(1):133-48; Zuker, M. (1989) Methods Enzymol. 180, 262-288)와 같은 적절한 소프트웨어를 이용하여 상이한 상황에 대해 예측될 수 있다.

용어 "작용제(agent)"는 세포에서 정상적으로 존재하지 않거나, 또는 투여될 수준으로 존재하지 않는 물질(entity)을 의미한다. 작용제는 화학물질; 소형 분자; 핵산 서열; 핵산 유사체(nucleic acid analogue); 단백질; 펩티드; 앱타머; 항체; 또는 그의 단편을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 핵산 서열은 RNA 또는 DNA일 수 있고, 단일 가닥일 수 있거나, 이중 가닥일 수 있고, 올리고뉴클레오티드, 핵산 유사체, 예를 들면, 펩티드-핵산(PNA), 슈도-상보적 PNA(pseudo-complementary PNA, pc-PNA), LNA(locked nucleic acid) 등일 수 있다. 그와 같은 핵산 서열은 예를 들면, 단백질, 예를 들면, 전사 리프레서로 작용하는 단백질, 안티센스 분자, 리보자임, 소형 저해성 핵산 서열, 예를 들면, RNAi, shRNAi, siRNA, micro RNAi (mRNAi), 안티센스 올리고뉴클레오티드 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 단백질 및/또는 펩티드 또는 그의 단편은 목적 단백질일 수 있고, 예를 들면, 돌연변이된 단백질; 치료 단백질; 절단된(truncated) 단백질을 포함하나 이에 한정되지 않고, 상기 단백질은 세포에 정상적으로 존재하지 않거나, 또는 보다 낮은 수준으로 발현된다. 단백질은 또한 돌연변이 단백질, 유전적으로 조작된 단백질, 펩티드, 합성 펩티드, 재조합 단백질, 키메라 단백질, 항체, 미니바디(minibody), 트리바디(tribody), 인간화(humanized) 단백질, 인간화 항체, 키메라 항체, 변형된 단백질 및 그의 단편을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 작용제는 배지에 적용될 수 있고, 배지에서 작용제는 세포와 접촉하고 그의 효과를 유도한다. 대안적으로, 작용제는 세포 내에서 세포 내로의 핵산 서열의 도입의 결과 세포 내에 존재할 수 있고, 세포 내에서 그의 전사는 핵산 및/또는 단백질 환경 자극의 생성을 초래한다. 일부 구체예에서, 작용제는 화학 물질, 물질(entity), 또는 모이어티이고, 합성 및 천연 비-단백질성 물질(non-proteinaceous entity)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정한 구체예에서, 작용제는 화학적 모이어티를 갖는 소형 분자이다. 예를 들면, 화학적 모이어티는 치환 또는 비치환 알킬, 방향족, 또는 마크롤리드(macrolide)를 포함한 헤테로시클릴 모이어티, 렙토마이신(leptomicin), 및 관련 천연 생성물 또는 그의 유사체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 작용제는 원하는 활성 및/또는 특성을 갖는 것으로 알려질 수 있거나, 또는 다양한 화합물의 라이브러리로부터 선택될 수 있다.

본 명세서에서 사용된, 유전자의 수준의 "감소(reduction)"는 세포 또는 개체에서 단백질 또는 mRNA의 수준의 감소를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 작용제(예를 들면, RNA, mRNA, rRNA, 표적 유전자에 의해 발현되는 tRNA 및/또는 그에 의해 코딩된 단백질 생성물)의 수준의 "적어도 부분적 감소(at least a partial reduction)"는 그 수준이 본 명세서에 개시된 RNAi 작용제가 결여된 세포 또는 개체 대비 25% 이상, 바람직하게는 50% 이상 감소된다는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용된, 단백질 또는 mRNA와 같은 작용제의 수준의 "실질적 감소(substantial reduction)"는 그 수준이 상기 작용제를 감소시킬 수 있는 본 발명의 키메라 RNA 분자를 포함하지 않는 세포 또는 개체 대비 감소되고, 상기 작용제의 수준의 감소가 75% 이상, 바람직하게는 85% 이상이라는 것을 의미한다. 감소는 당업자에게 익숙한 방법에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 형질전환 단백질(transgene protein)의 감소는 예를 들면, 단백질의 면역학적 검출에 의해 결정될 수 있다. 또한, 노던 혼성화(Northern hybridization), 뉴클레아제 보호 분석(nuclease protection assay), 역전사(정량적 RT-PCR), ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), 웨스턴 블롯팅, RIA(radioimmunoassay) 또는 기타 면역분석법 및 FACS(fluorescence-activated cell analysis)와 같은 생화학적 기법이 형질전환(transgene) 단백질 또는 mRNA를 검출하기 위해 이용될 수 있다. 감소된 이식 유전자의 종류에 따라, 그의 활성 또는 개체 또는 세포의 표현형에 대한 효과도 결정될 수 있다. 단백질 양을 결정하는 방법이 당업자에게 알려져 있다. 언급될 수 있는 예는: micro-Biuret 방법 (Goa J (1953) Scand J Clin Lab Invest 5:218-222), Folin-Ciocalteau 방법 (Lowry OH et al . (1951 ) J Biol Chem 193:265-275) 또는 CBB G-250의 흡착을 측정하는 방법 (Bradford MM (1976) Analyt Biochem 72:248-254)이다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "아미노산 서열(amino acid sequence)"은 아미노산 잔기를 나타내는 약어, 문자, 캐릭터, 또는 단어의 목록을 의미한다. 아미노산은 그들의 통상적으로 알려진 3문자 심볼(three letter symbol), 또는 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission에 의해 권장된 1-문자 심볼로 지칭될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오티드는 그들의 통상적으로 인정되는 1-문자 코드에 의해 지칭될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "안티센스(antisense)"는 전사를 위한 정상적인 배향(orientation) 대비 역전되어 Watson-Crick 염기쌍을 통해 표적 유전자 mRNA 분자에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 안티센스 가닥은 표적 유전자의 발현을 방해할 수 있는 한, 다수의 상이한 방식으로 작제될 수 있다. 예를 들면, 안티센스 가닥은 그의 상보체의 전사를 가능하게 하도록 전사를 위한 그의 정상적인 배향 대비 표적 유전자의 코딩 영역(또는 그의 일부)를 역전시키는 것에 의해 작제될 수 있다 (예를 들면, 안티센스 및 센스 유전자에 의해 코딩된 RNA는 상보적일 수 있다). 또한, 안티센스 올리고뉴클레오티드 가닥은 표적 유전자와 동일한 인트론 또는 엑손 패턴을 가질 필요가 없고, 표적 유전자의 비-코딩 세그먼트는 표적 유전자 발현의 안티센스 억제를 달성하는데 있어서 코딩 세그먼트와 동일하게 효과적일 수 있다. 유전자 침묵에서, 용어 "안티센스"는 표적 유전자, 예를 들면, mRNA(messenger RNA) 서열에 상보적인 서열을 가져서, 표적 서열의 발현의 차단이 표적 서열과의 혼성화에 의해 개시되도록 하는 핵산을 의미하는 것으로 이해된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "성숙 단백질(mature protein)"은 일반적으로 전구 형태(pre-form), 예를 들면, 단백질과 추가적인 단백질 성분, 예를 들면, 특정 세포 소기관으로의 전위(translocation)를 지시하는 표적화 펩티드 또는 신호 펩티드(signal peptide)를 포함하는 전구체 단백질(pre-protein)로 합성되는 단백질을 의미한다. 전구체 단백질의 번역-후 가공(post-translation processing), 예를 들면, 전구체 단백질 성분의 절단은 성숙 단백질(mature protein)을 생성한다. 일부 경우에, 전구체 단백질은 생물학적 불활성 단백질을 포함할 수 있고, 상기 단백질은 번역-후 가공시 활성 단백질이 된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "최소 프로모터(minimal promoter)"는 기능성 프로모터를 유지하는, 프로모터 요소의 최소 핵산 영역을 의미한다.

용어 "비-코딩(non-coding)"은 발현된 단백질의 일부 또는 전부를 코딩하지 않는 핵산 분자의 서열을 의미한다. 비-코딩 서열은 인트론, 프로모터 영역, 3' 비번역 영역(3'UTR), 및 5' 비번역 영역(5'UTR)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

용어 "핵산(nucleic acid)" 및 "뉴클레오티드(nucleotide)"는 천연, 또는 합성 또는 인공 핵산 또는 뉴클레오티드를 의미한다. 용어 "핵산" 및 "뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥, 센스 또는 안티센스 형태인 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 그의 뉴클레오티드 유사체 및 폴리머 또는 그의 하이브리드를 포함한다. 달리 표시되지 않으면, 특정한 핵산 서열은 또한 암묵적으로 그의 보존적으로 변형된 변이체(conservatively modified variant) (예를 들면, 축퇴적 코돈 치환) 및 상보적 서열, 및 명시적으로 표시된 서열을 포함한다. 용어 "핵산"은 본 명세서에서 "유전자", "cDNA", "mRNA", "올리고뉴클레오티드", 및 "폴리뉴클레오티드"와 호환적으로 사용된다. 뉴클레오티드 유사체는 염기, 당 및/또는 포스페이트의 화학 구조에서 변형, 예를 들면, 5번 위치 피리미딘 변형, 8번 위치 퓨린 변형, 시토신 엑소시클릭 아민(cytosine exocyclic amine)에서의 변형, 5-브로모-우라실의 치환, 등; 및 2'-0H가 예를 들면, H, OR, R, 할로, SH, SR, NH₂, NHR, NR₂, 또는 CN으로부터 선택된 기에 의해 교체된 것인 당-변형 리보뉴클레오티드를 포함하나, 이에 한정되지 않는 2' 위치 당 변형을 포함하나, 이에 한정되지 않는 변형을 갖는 뉴클레오티드를 포함한다. shRNA는 또한 비-천연 염기, 예를 들면, 이노신 및 잔틴(xanthine), 비천연 당, 예를 들면, 2'-메톡시 리보오스, 또는 비-천연 포스포디에스테르 결합, 예를 들면, 메틸포스포네이트, 포스포로티오에이트 및 펩티드와 같은 비-천연 요소를 포함할 수 있다. 용어 "핵산", 또는 "올리고뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 본 명세서에서 호환적으로 사용되고 공유 결합에 의해 함께 결합된 두 개 이상의 뉴클레오티드를 의미한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 단일 가닥의 묘사는 또한 상보적 가닥의 서열을 정의한다. 따라서, 핵산은 또한 묘사된 단일 가닥의 상보적 가닥을 포함한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 핵산의 다수의 변이체가 주어진 핵산과 동일한 목적을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 핵산은 또한 실질적으로 동일한 핵산 및 그의 상보체를 포함한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 단일 가닥은 엄격한 혼성화(stringent hybridization) 조건 하에서 표적 서열에 혼성화할 수 있는 프로브(probe)를 제공한다. 따라서, 핵산은 또한 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화하는 프로브를 포함한다.

용어 "핵산 서열(nucleic acid sequence)"은 5'-말단에서 3'-말단으로 해독되는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일-가닥 또는 이중-가닥 폴리머를 의미한다. 핵산 서열은 염색체 DNA, 자가-복제 플라스미드, DNA 또는 RNA의 감염성 폴리머 및 주로 구조적 역할을 수행하는 DNA 또는 RNA를 의미한다. "핵산 서열"은 뉴클레오티드를 나타내는, 약어, 레터, 문자, 또는 단어의 연속된 목록을 의미한다. 일 구체예에서, 핵산은 상대적으로 짧은 핵산, 통상적으로 길이가 100개 미만의 뉴클레오티드인 "프로브"일 수 있다. 종종, 핵산 프로브는 약 50개의 뉴클레오티드로 이루어진 길이 내지 약 10개의 뉴클레오티드로 이루어진 길이이다.

핵산은 또한 단일 가닥이거나 또는 이중 가닥일 수 있거나, 또는 이중 가닥 및 단일 가닥 서열인 부분을 포함할 수 있다. 핵산은 게놈 및 cDNA인 DNA, RNA, 또는 핵산이 데옥시뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 잔틴, 하이포잔틴(hypoxanthine), 이소시토신 및 이소구아닌을 포함하는 염기의 조합을 포함할 수 있는 것인 하이브리드일 수 있다. 핵산은 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다.

핵산은 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 포함할 것이며, 그러나, 하나 이상의 상이한 결합, 예를 들면, 포스포르아미데이트(phosphoramidate), 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 포스포로디티오에이트, 또는 0-메틸포스포로아미데이트 결합 및 펩티드 핵산 백본 및 결합을 가질 수 있는 핵산 유사체가 포함될 수 있다. 기타 핵산 유사체는 양성 백본(positive backbone); 비-이온성 백본, 및 비-리보오스(non-ribose) 백본을 갖는 유사체, 예를 들면, 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국특허 제5,235,033호 및 제5,034,506호에 기재된 것들을 포함한다. 하나 이상의 비-천연 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 핵산도 또한 핵산의 하나의 정의 내에 포함된다. 변형된 뉴클레오티드 유사체는 예를 들면, 핵산 분자의 5'-말단 및/또는 3'-말단에 위치할 수 있다. 뉴클레오티드 유사체의 대표적인 예는 당-변형 리보뉴클레오티드 또는 백본-변형 리보뉴클레오티드로부터 선택될 수 있다. 그러나, 핵염기-변형 리보뉴클레오티드, 즉, 천연 핵염기(nucleobase) 대신 비-천연 핵염기, 예를 들면, 5번 위치에서 변형된 우리딘 또는 시티딘, 예를 들면, 5-(2-아미노)프로필 우리딘, 5-브로모 우리딘; 8번 위치에서 변형된 아데노신 및 구아노신, 예를 들면, 8-브로모 구아노신; 데아자 뉴클레오티드, 예를 들면, 7-데아자-아데노신; O- 및 N-알킬화 뉴클레오티드, 예를 들면, N6-메틸 아데노신을 포함하는 리보뉴클레오티드가 적합하다는 것에 주목해야 한다. 2' OH-기는 H, OR, R. 할로, SH, SR, NH₂, NHR, NR₂ 또는 CN으로부터 선택되고, 상기에서 R은 C1-C6 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 할로는 F, C1, Br 또는 I인 것인 기에 의해 대체될 수 있다. 리보오스-포스페이트 백본의 변형은 다양한 이유를 위해, 예를 들면, 생리적 환경에서 또는 바이오칩 상의 프로브로서 그와 같은 분자들의 안정성 및 반감기를 증가시키기 위해 수행될 수 있다. 천연 핵산과 유사체의 혼합물이 제조될 수 있다; 대안적으로, 상이한 핵산 유사체의 혼합물, 및 천연 핵산 및 유사체의 혼합물이 제조될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"는 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA), 또는 그의 모방체(mimetics)의 올리고머 또는 폴리머, 및 유사하게 기능하는 비-천연 부분을 갖는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 그와 같은 변형된 또는 치환된 올리고뉴클레오티드가 종종 예를 들면, 강화된 세포 흡수, 핵산 표적에 대한 증가된 친화도 및 뉴클레아제의 존재 하에서의 증가된 안정성과 같은 바람직한 특성 때문에, 원형보다 선호된다. 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 상호 간에 결합(예를 들면, 포스포디에스테르) 또는 대리 결합(substitute linkage)에 의해 공유결합된 두 개 이상의 뉴클레오모노머(nucleomonomer)를 포함한다.

용어 "작동가능한 연결(operable linkage)" 또는 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 본 명세서에서 호환적으로 사용되고, 예를 들면, 각 조절 요소가 연결된 핵산 서열의 발현을 가능하게 하거나, 변형시키거나, 촉진하거나, 또는 달리 영향을 미치기 위해 의도된 기능을 충족시킬 수 있게 하는 방식으로 조절 요소(예를 들면, 프로모터)와 발현될 핵산 서열, 및 적절한 경우, 추가적인 조절 요소(예를 들면, 종결자(terminator))의 순차적 배열을 의미하는 것으로 이해된다. 발현은 센스 또는 안티센스 RNA 대비 핵산 서열의 배열에 따라 일어날 수 있다. 이 목적을 위해, 화학적 의미에서 직접 결합이 반드시 요구되는 것은 아니다. 유전적 조절 서열, 예를 들면, 인핸서 서열은 또한 멀리 떨어진 위치로부터, 또는 실제로 다른 DNA 분자로부터 표적 서열에 대해 그들의 기능을 발휘할 수 있다. 일부 구체예에서, 배열은 재조합에 의해 발현될 핵산 서열이 프로모터로 작용하는 서열 뒤에 위치하여 두 서열이 상호 간에 공유결합에 의해 연결된 배열이다. 프로모터 서열과 재조합에 의해 발현될 핵산 서열 간의 거리는 임의의 거리일 수 있고 일부 구체예에서, 200개의 염기쌍 미만이고, 특히 100개의 염기쌍 미만, 50개의 염기쌍 미만이다. 일부 구체예에서, 전사될 핵산 서열은 전사 개시가 본 발명의 키메라 RNA의 원하는 개시와 일치할 수 있도록 프로모터 뒤에 위치한다. 작동가능한 결합, 및 발현 작제물은 이전에 기술된 통상적인 재조합 및 클로닝 기법에 의해 생성될 수 있다(예를 들면, Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY); Silhavy et al . (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY); Ausubel et al . (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc and Wiley Interscience; Gelvin et al . (Eds) (1990) Plant Molecular Biology Manual; Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, The Netherlands). 그러나, 예를 들면, 제한효소에 대한 특이적 절단 부위를 갖는 링커로서, 또는 신호 펩티드로 작용하는, 추가적인 서열이 상기 두 개의 서열 간에 배치될 수 있다. 서열의 삽입은 또한 융합 단백질의 발현을 초래할 수 있다. 일부 구체예에서, 프로모터와 발현될 핵산 서열의 결합으로 구성된 발현 작제물은 벡터 통합 형태(vector integrated form)로 존재할 수 있고 예를 들면, 형질전환에 의해 식물 게놈에 삽입될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "핵산 작제물(nucleic acid construct)"은 적어도 부분적으로 재조합 방법에 의해 생성된 핵산을 의미한다. 용어 "DNA 작제물(DNA construct)"은 데옥시리보뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 작제물을 의미한다. 핵산 작제물은 단일 가닥이거나 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산 작제물은 원형(circular)이거나 또는 직선형일 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 DNA 작제물을 수득하는 다양한 방식과 친숙하다. 작제물은 예를 들면, Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY); Silhavy et al . (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY); Ausubel et al . (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc and Wiley Interscience; Gelvin et al . (Eds) (1990) Plant Molecular Biology Manual; Kluwer Academic Pub-lisher, Dordrecht, The Netherlands에 기재된 바와 같이, 통상적인 재조합 및 클로닝 기법에 의해 제조될 수 있다.

용어 "폴리펩티드(polypeptide)", "펩티드(peptide)", "올리고펩티드(oligopeptide)", "폴리펩티드", "유전자 생성물(gene product)", "발현 생성물(expression product)" 및 "단백질"은 연속적인 아미노산 잔기들의 폴리머 또는 올리고머를 의미하는 것으로 본 명세서에서 호환적으로 이용된다.

용어 "프로모터", "프로모터 요소(promoter element)" 또는 "프로모터 서열"은 균등물이고, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 목적 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 경우, 목적 뉴클레오티드 서열의 mRNA로의 전사를 제어할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 프로모터는 반드시 그런 것은 아니나, 통상적으로 mRNA로의 전사를 조절할 목적 뉴클레오티드 서열(예를 들면, 구조 유전자의 전사 개시 부위에 근위임)의 5'(즉, 상류)에 존재하고, 전사의 개시를 위해 RNA 폴리머라아제 및 기타 전사 인자에 의한 특이적 결합을 위한 부위를 제공한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 외래 종으로부터 유래되거나, 또는 동일 종으로부터 유래되나 그의 최초 형태로부터 변형된 경우, 개체 또는 제2 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 "이종(heterologous to)"이다. 예를 들면, 이종 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터는 프로모터가 유래된 종과 상이한 종으로부터의 코딩 서열, 또는 동일한 종으로부터 유래되나, 그 프로모터와 원래 연관되지 않은 코딩 서열(예를 들면, 유전적으로 조작된 코딩 서열, 또는 상이한 생태형(ecotype) 또는 변이체로부터의 대립인자)을 의미한다. 적절한 프로모터는 발현이 일어날 숙주 세포의 유전자로부터 유래될 수 있다(예를 들면, 조직 프로모터). 프로모터가 유도성 프로모터인 경우, 전사 속도는 유도제(inducing agent)에 반응하여 증가된다. 대조적으로, 전사 속도는 프로모터가 구성적 프로모터(constitutive promoter)인 경우, 유도제에 의해 조절되지 않는다. 또한 프로모터는 암세포와 같은 특정 조직 형에서 관련된 코딩 영역의 전사에서만 활성을 갖도록 조직-특이적 또는 조직-선호(tissue preferred) 방식으로 조절될 수 있다.

프로모터에 적용되는 경우, 용어 "조직 특이적(tissue specific)"은 상이한 종류의 조직(예를 들면, 신장) 중 동일한 목적 뉴클레오티드 서열의 발현의 상대적 부재 대비, 특정한 종류의 조직(예를 들면, 간)에 대한 목적 뉴클레오티드 서열의 선택적 발현을 지시할 수 있는 프로모터를 의미한다. 프로모터의 조직 특이성은 예를 들면, 리포터 유전자를 프로모터 서열에 작동가능하게 연결시키는 것에 의해 리포터 작제물을 생성하고, 상기 리포터 작제물을 개체의 게놈, 예를 들면, 동물 모델에 도입하여 상기 리포터 작제물이 결과적으로 수득된 형질전환 동물의 모든 조직에 삽입되게 하고, 형질전환 동물의 상이한 조직에서 리포터 유전자의 발현을 검출하는 것에 의해(예를 들면 리포터 유전자에 의해 코딩된 mRNA, 단백질, 또는 단백질의 활성을 검출) 평가할 수 있다. 다른 조직에서 리포터 유전자의 발현 수준 대비, 하나 이상의 조직에서 리포터 유전자의 보다 큰 발현 수준의 검출은 해당 프로모터가 보다 큰 수준의 발현이 검출되는 것인 조직에 대해 특이적이라는 것을 보여준다.

프로모터에 적용되는 경우, 용어 "세포형 특이적(cell type specific)"은 동일한 조직 내에서 상이한 종류의 세포 중 동일한 목적 뉴클레오티드 서열의 발현의 상대적 부재 대비 특정한 종류의 세포에서 목적 뉴클레오티드 서열의 선택적 발현을 지시할 수 있는, 프로모터를 의미한다. 프로모터에 적용되는 경우, 용어 "세포형 특이적"은 단일 조직 내의 영역 중 목적 뉴클레오티드 서열의 선택적 발현을 촉진할 수 있는 프로모터를 의미한다. 프로모터의 세포형 특이성(cell type specificity)은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려진 방법, 예를 들면, GUS 활성 염색 또는 면역조직화학적 염색을 이용하여 평가될 수 있다.

프로모터와 관련하여 사용된 용어 "구성적(constitutive)"은 프로모터가 자극(예를 들면, 열 충격, 화학물질, 작용제, 빛, 등)의 부재 하에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사를 지시할 수 있다는 것을 의미한다. 통상적으로, 구성적 프로모터는 실질적으로 모든 세포 및 조직에서 이식유전자의 발현을 지시할 수 있다.

대조적으로, 본 명세서에서 사용된 용어, "조절가능한(regulatable)" 또는 "유도성(inducible)" 프로모터는 자극(예를 들면, 열 충격, 화학물질, 빛, 작용제, 등)의 존재 하에, 자극의 부재시 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사 수준과 상이한, 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사 수준을 지시할 수 있는 프로모터이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "센스(sense)"는 표적 서열과 상동성이거나 또는 동일한 서열을 갖는 핵산, 예를 들면, 단백질 전사 인자에 결합하고, 주어진 유전자의 발현에 관여하는 서열을 의미한다. 바람직한 구체예에 따르면, 센스 핵산은 목적 유전자 및 상기 목적 유전자의 발현을 가능하게 하는 요소를 포함한다.

가장 광범위한 의미에서, 본 명세서에서 기준(reference) 또는 표적 뉴클레오티드 서열 대비 뉴클레오티드 서열에 사용된 용어, "실질적으로 상보적인(substantially complementary)"은 상기 기준 또는 표적 뉴클레오티드 서열의 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열과 정확한 상보적 서열 간에 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 또는 96% 이상, 97% 이상, 또는 98% 이상, 또는 99% 이상, 또는 100%의 동일성 비율(100%는 본 발명에서 용어 "동일한(identical)"과 동등함)을 갖는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 예를 들면, 동일성은 (하기에서 달리 정의되지 않는 경우) 상기 기준 서열 대비 핵산 서열의 전체 길이의 10개 이상, 또는 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 19, 20, 21, 22, 또는 50개까지의 뉴클레오티드의 길이에 걸쳐 평가된다. 서열 비교는 Needleman and Wunsch (Needleman and Wunsch (1970) J Mol. Biol. 48: 443-453; 앞서 정의된 바와 같음)의 알고리즘에 기초한, GAP의 SEQWEB 애플리케이션, 위스콘신 대학 GCG에 의한 디폴트 GAP 분석을 이용하여 수행한다. 기준 뉴클레오티드 서열에 "실질적으로 상보적인" 뉴클레오티드 서열은 낮은 엄격성 조건 하에, 바람직하게는 중간 엄격성 조건, 가장 바람직하게는 높은 엄격성 조건(앞서 정의된 바와 같음) 하에, 기준 뉴클레오티드 서열에 혼성화한다.

가장 광범위한 의미에서, 본 명세서에서 뉴클레오티드 서열에 대해 사용되는 경우, 용어 "실질적으로 동일한(substantially identical)"은 기준 또는 표적 뉴클레오티드 서열에 일치하는 뉴클레오티드 서열로서, 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열과 기준 또는 표적 뉴클레오티드 서열 간의 동일성 비율(percentage of identity)은 60% 이상, 70% 이상, 80% 또는 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 또는 96% 이상, 97% 또는 98% 이상, 99% 이상 또는 100% (후자는 본 발명에서 용어 "동일한"과 균등함)인 것인 서열을 의미한다. 예를 들면, 동일성은 (하기에서 달리 정의되지 않는 경우) 상기 기준 서열 대비 핵산 서열의 전체 길이의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 19, 20, 21, 22개 이상과 같은 10개 내지 22개의 뉴클레오티드의 길이, 또는 50개까지의 뉴클레오티드의 길이에 걸쳐 평가된다. 서열 비교는 Needleman and Wunsch (Needleman and Wunsch (1970) J Mol. Biol. 48: 443-453; 앞서 정의된 바와 같음)의 알고리즘에 기초한, GAP의 SEQWEB 애플리케이션, 위스콘신 대학 GCG에 의한 디폴트 GAP 분석을 이용하여 수행한다. 기준 뉴클레오티드 서열에 "실질적으로 동일한(substantially identical)" 뉴클레오티드 서열은 낮은 엄격성 조건 하에, 바람직하게는 중간 엄격성 조건, 가장 바람직하게는 높은 엄격성 조건(앞서 정의된 바와 같음) 하에, 기준 뉴클레오티드 서열의 정확한 상보적 서열(즉, 이중-가닥 분자 중 그의 상응하는 가닥)에 혼성화한다. 특정한 뉴클레오티드 서열의 상동체(homologue)는 전술된 파라미터를 이용하여 측정된, 기준 아미노산 서열에 대해 24% 이상, 35% 이상, 50% 이상, 65% 이상 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 상동체에 의해 코딩된 아미노산 서열은 특정한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질과 동일한 생물학적 활성을 갖는다. 용어 "실질적으로 동일하지 않은(substantially non-identical)"은 엄격한 조건 하에 해당 핵산 서열에 혼성화하지 않는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 본 명세서에서 폴리펩티드에 대해 사용된 경우, 용어 "실질적으로 동일한"은 기준 폴리펩티드와 일치하는 단백질로서, 상기 폴리펩티드는 기준 단백질과 실질적으로 동일한 구조 및 기능을 갖는 것인 단백질을 의미하고, 예를 들면, 폴리펩티드 기능에 영향을 미치지 않는 아미노산 서열의 변화만 일어난 단백질을 의미한다. 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 대해 사용된 경우, 실질적으로 유사한 아미노산 서열과 기준 폴리펩티드 또는 아미노산 서열 간의 동일성 비율은 전술된 디폴트 GAP 분석 파라미터를 이용하여 24% 이상, 30% 이상, 45% 이상, 60% 이상 75% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상이다. 상동체는 전술된 파라미터를 이용하여 측정된 경우, 기준 폴리펩티드 또는 아미노산 서열과 24% 이상, 보다 바람직하게는 35% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 50% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 65% 이상 동일한 아미노산 서열이고, 상동체에 의해 코딩된 아미노산 서열은 기준 폴리펩티드와 동일한 생물학적 활성을 갖는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "형질전환(transformation)"은 세포, 조직 또는 개체로의 유전적 물질(예를 들면, 이식유전자, 또는 이종 핵산 분자)의 도입을 의미한다. 세포의 형질전환은 안정하거나 일시적인 것일 수 있다. 용어 "일시적 형질전환(transient transformation)" 또는 "일시적으로 형질전환된(transiently transformed)"은 이식 유전자의 숙주 세포의 게놈으로의 통합 없이, 세포 내로 하나 이상의 이식 유전자를 도입하는 것을 의미한다. 일시적 형질전환은 예를 들면, 하나 이상의 이식 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드의 존재를 검출하는, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)에 의해 검출될 수 있다. 대안적으로, 일시적 형질전환은 이식유전자(예를 들면, uid A 유전자)에 의해 코딩된 단백질(예를 들면, β-글루쿠로니다아제)의 활성을 검출하는 것에 의해 검출될 수 있다. 용어 "일시적 형질전환체(transient transformant)"는 하나 이상의 이식유전자를 일시적으로 내포한 세포를 의미한다. 대조적으로, 용어 "안정적 형질전환(stable transformation)" 또는 "안정적으로 형질전환된(stably transformed)"은 바람직하게는 감수분열을 통해 염색체 통합 및 안정적 유전성(heritability)을 초래하는, 세포의 게놈 내로의 하나 이상의 이식유전자의 도입 및 통합을 의미한다. 세포의 안정적 형질전환은 이식 유전자 중 하나 이상에 결합할 수 있는, 핵산 서열과 세포의 게놈 DNA의 서던 블롯 혼성화(Southern blot hybridization)에 의해 검출될 수 있다. 대안적으로, 세포의 안정적 형질전환은 또한 이식 유전자 서열을 증폭시키기 위한 세포의 게놈 DNA의 중합효소 연쇄 반응에 의해 검출될 수 있다. 용어 "안정적 형질전환체(stable transformant)"는 하나 이상의 이식 유전자가 게놈 DNA 내로 안정적으로 통합된, 세포를 의미한다. 따라서, 안정적 형질전환체는 안정적 형질전환체로부터의 게놈 DNA는 하나 이상의 이식 유전자를 포함하는 반면, 일시적 형질전환체로부터의 게놈 DNA는 이식 유전자를 포함하지 않는다는 점에서 일시적 형질전환체와 구별된다. 형질전환은 또한 에피염색체(epichromosome) 복제 및 유전자 발현을 포함하는 식물 바이러스 벡터의 형태로 식물 세포 내로의 유전적 물질의 도입을 포함하고, 이는 감수분열 안정성과 관련하여 가변적 특성을 보일 수 있다. 형질전환된 세포, 조직, 또는 식물은 형질전환 과정의 최종 생성물뿐 아니라, 그의 형질전환 자손을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "이식유전자(transgene)"는 실험적 조작에 의해 세포의 게놈에 도입된, 임의의 핵산 서열을 의미한다. 이식유전자는 "내재 DNA 서열(endogenous DNA 서열)", 또는 "이종 DNA 서열(heterologous DNA sequence)"(즉, "외래(foreign) DNA)"일 수 있다. 용어 "내재 DNA 서열"은 천연 서열 대비, 일부 변형(예를 들면, 점 돌연변이, 선택 마커 유전자의 존재, 등)을 포함하지 않는 한, 도입된 세포에서 자연적으로 발견되는, 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 세포, 조직, 또는 개체를 지칭할 때 용어 "형질전환(유전자 이식)(transgenic)"은 바람직하게는 목적 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 적절한 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 분자에 의해 형질전환된 것, 바람직하게는 안정적으로 형질전환된 것을 의미한다.

용어 "벡터(vector)"는 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미하기 위해 "플라스미드(plasmid)"와 호환적으로 사용된다. 작동가능하게 연결된 유전자 및/또는 핵산 서열의 발현을 지시할 수 있는 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터(expression vector)"로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 종종 그들의 벡터 형태로 염색체에 결합하지 않는, 원형의(circular) 이중가닥 DNA 루프를 의미하는 "플라스미드"의 형태이다. 다른 발현 벡터가 본 발명의 상이한 구체예에서 이용될 수 있고, 예를 들면, 플라스미드, 에피좀(episome), 박테리오파아지, 또는 바이러스 벡터이나 이에 한정되지 않고, 그와 같은 벡터는 숙주의 게놈에 통합될 수 있거나, 또는 특정한 세포에서 자가 복제할 수 있다. 동등한 기능을 수행하는, 당업자에 의해 알려진 발현 벡터의 다른 형태가 또한 이용될 수 있다. 발현 벡터는 코딩하는 DNA의 안정적 또는 일시적 발현을 위한 발현 벡터를 포함한다. 벡터는 플라스미드, 박테리오파아지, 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome) 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자가복제 염색체외 벡터(self replicating extrachromosomal vector) 또는 숙주 게놈 내로 통합되는 벡터일 수 있다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "벡터"는 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터의 한 종류는 게놈 통합 벡터(genome integrated vector), 또는 "통합 벡터(integrated vector)"이고, 이는 숙주 세포의 염색체 DNA 내로 통합될 수 있다. 또 다른 종류의 벡터는 에피좀 벡터(episomal vector), 즉, 염색체외 복제를 수행할 수 있는 핵산이다. 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 본 명세서에서, "플라스미드"와 "벡터"는 문맥으로부터 명확하지 않은 경우, 호환적으로 사용된다. 인 비트로에서 또는 인 비보에서 본 명세서에 기재된 RNA를 생성하도록 설계된 발현 벡터는 미토콘드리아 RNA 폴리머라아제, RNA pol I , RNA pol II, 및 RNA pol III를 포함한 RNA 폴리머라아제의 제어 하의 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 바람직하게는 내재 미토콘드리아 RNA 폴리머라아제 (예를 들면, 그와 같은 벡터가 상응하는 인간 미토콘드리아 프로모터를 이용할 수 있는 경우, 인간 미토콘드리아 RNA 폴리머라아제)를 이용하도록 설계될 수 있다. 인 비보에서 (캡핑 효소의 발현을 통해) 캡핑(capped) 메시지 또는 미캡핑(uncapped) 메시지를 생성하기 위해 미토콘드리아 폴리머라아제가 이용될 수 있다. RNA pol I , RNA pol II, 및 RNA pol III 전사물이 또한 인 비보에서 생성될 수 있다. 그와 같은 RNA는 캡핑되거나 또는 캡핑되지 않을 수 있고, 원하는 경우, 세포질 캡핑(cytoplasmic capping)이 백시니아 캡핑 효소 또는 알파 바이러스 캡핑 효소와 같은 캡핑 효소의 이용을 포함한 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다. 그와 같은 플라스미드 또는 벡터는 박테리아, 바이러스 또는 파아지로부터의 플라스미드 서열을 포함할 수 있다. 그와 같은 벡터는 염색체 벡터, 에피좀 벡터, 및 바이러스-유래 벡터, 예를 들면, 박테리아 플라스미드, 박테리오파아지, 효소 에피좀, 효모 염색체 요소, 및 바이러스로부터 유래된 벡터, 이들의 조합으로부터 유래된 벡터, 예를 들면, 플라스미드 및 박테리오파아지 유전적 요소, 코스미드(cosmid) 및 파아지미드(phagemid)로부터 유래된 벡터와 같은 벡터를 포함한다. 따라서, 하나의 예시적 벡터는 단일-가닥 또는 이중-가닥 파아지 벡터이다. 또 다른 예시적 벡터는 단일-가닥 또는 이중-가닥 RNA 또는 DNA 바이러스 벡터이다. 그와 같은 벡터는 DNA 및 RNA를 세포 내로 도입하는 공지된 기법에 의해, 세포 내로, 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 DNA로 도입될 수 있다. 파아지 및 바이러스 벡터의 경우, 벡터는 또한 바람직하게는 감염 및 형질도입(transduction)을 위한 공지된 기법에 의해 패키징되거나 또는 캡시드에 싸인(packaged or encapsidated) 바이러스로서 세포 내로 도입된다. 바이러스 벡터는 복제 가능형(replication competent)이거나 또는 복제 결함형(replication defective)일 수 있다. 후자의 경우, 바이러스 증식은 일반적으로 숙주 세포를 보완하는 경우에만 일어난다.

본 명세서에서 사용된, "이중 가닥 RNA(double stranded RNA)" 또는 "dsRNA"는 두 개의 가닥으로 이루어진 RNA 분자를 의미한다. 이중-가닥 분자는 이중-가닥 구조를 형성하기 위해 스스로 배가되는(double back) 단일 RNA 분자로 구성된 분자들을 포함한다. 예를 들면, 전구체-miRNA(pre-miRNA)로 지칭되는, 단일-가닥 miRNA가 유래된 전구체(progenitor) 분자의 스템 루프 구조 (Bartel et al. 2004. Cell 116:281-297)는 dsRNA 분자를 포함한다.

용어 "질병(disease)" 또는 "질환(disorder)"은 본 명세서에서 호환적으로 사용되고, 그에 걸린 사람이나 그와 접촉된 사람에게 기능의 수행을 중단 또는 교란시키고, 및/또는 불편, 기능장애, 고통 과 같은 증상을 유발하거나 또는 사망까지 초래하는, 신체의 상태 또는 기관의 일부의 상태의 변화를 의미한다. 질병 또는 질환은 또한 디스템퍼(distemper), 병(ailing), 아픔(ailment), 허약(amlady), 장애(disorder), 불편(sickness), 불쾌(illness), 불만(complaint), 불안(inderdisposion), 보살핌(affection)과 관련될 수 있다.

용어 "악성 종양(malignancy)" 또는 "암(cancer)"은 본 명세서에서 호환적으로 사용되고 조직에서 정상 세포 또는 비정상 세포의 불충분하게 제어되거나 또는 제어되지 않는 증식 및 신체 전체에 대한 그의 효과를 특징으로 하는 포유동물의 기관 또는 조직의 질병을 의미한다. 정의의 범위 내에서 암 질환은 양성 신생물(benign neoplasm), 이형성증(dysplasia), 과형성증(hyperplasia), 및 전이성 증식 및 기타 형질전환을 보이는 신생물, 예를 들면, 종종 암의 발생에 선행하는 백반(leukoplakia)을 포함한다. 용어 "종양(tumor)" 또는 "종양 세포(tumor cell)"는 본 명세서에서 호환적으로 사용되고, 비정상적 증식을 수행하는 세포의 조직 매스 또는 세포의 조직형을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 단어, "또는"은 특정 목록 중 하나의 일원을 의미하고 또한 그 목록의 일원들의 조합을 포함한다. 단어, "포함한다(comprise, comprising, include, including, 및 includes)"는 본 명세서에서 및 하기의 청구항에서 사용되는 경우, 하나 이상의 기재된 특성, 정수, 성분, 또는 단계의 존재를 특정하도록 의도되나, 이들은 하나 이상의 다른 특징, 정수, 성분, 단계, 또는 이들의 군의 존재 또는 첨가를 배제하지 않는다.

본 명세서 및 첨부된 청구항에서, 단수 형("a," "an," 및 "the")은 문맥상 달리 기재되지 않으면, 복수에 대한 지칭을 포함하고, 따라서, "a" 및 "an"은 본 명세서에서 관사의 문법적 객체의 하나 또는 그 이상(즉, 하나 이상)을 지칭하기 위해 사용된다. 예로서, "요소(an element)"는 하나의 요소 또는 둘 이상의 요소를 의미하고 "작용제(an agent)"를 전달하기 위한 조성물에 대한 지칭은 하나 이상의 작용제에 대한 지칭을 포함한다.

하나 이상의 기재된 요소를 "포함하는" 조성물 또는 방법은 구체적으로 기재되지 않은 다른 요소들을 포함할 수 있다. 예를 들면, ASC를 포함하는 조성물은 단리된 ASC를 포함하나, 또한, 다른 세포 종류, 또는 단백질 또는 기타 성분들을 포함할 수 있다. 추가적인 예로서, 요소 A 및 B를 포함하는 조성물은 또한 성분 A, B, 및 C로 구성된 조성물을 포함한다. 용어 "포함하는(comprising)"은 "주로 포함하나, 반드시 그것만을 포함하는 것은 아닌(including principally, but not necessary solely)"을 의미한다. 또한, "포함하다(comprise 및 comprises)"와 같은 단어 "포함하는"의 변형은 상응하게 변형된 의미를 갖는다. 용어 "필수적으로 구성된(consisting essentially)"은 "주로 포함하나, 반드시 하나 이상만은 아닌(including principally, but not necessary solely at least one)"을 의미하고, 따라서, "하나 이상, 및 임의의 조합의 선택(selection of one or more, and in any combination)"을 의미하도록 의도된다.

작동 실시예 이외의 경우, 또는 달리 표시된 경우, 본 명세서에서 성분의 양 또는 반응 조건을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약(about)"에 의해 수식된 것으로 이해되어야 한다. 용어 "약"은 본 명세서에서 대략, 약, 개략적으로, 또는 그의 범위를 의미하기 위해 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되는 경우, 상기 용어는 기재된 수치 값 이상 및 이하로 경계를 확장시키는 것에 의해 범위를 수식한다. 퍼센트(percentage)와 함께 사용된 경우, 용어 "약"은 ±1%를 의미한다.

지방-유래 기질 세포

이론에 의해 한정되기를 원치 않으면서, 지방 조직은 인간 및 다른 포유동물 종의 정상적인 발생 및 생리에서 중요하고 간과된 역할을 수행한다. 다수의 상이한 종류의 지방(fat)이 존재한다. 가장 흔한 종류는 피부 아래에 존재하는 백색 지방 조직(피하 지방), 복강 내에 존재하는 백색 지방 조직(내장 지방) 및 생식기관 주위의 백색 지방 조직(생식선 지방)이다. 성인에서 덜 흔한 것은 갈색 지방 조직(brown adipose tissue)이고, 이 조직은 신생아기 동안 열을 생성하는데 중요한 역할을 수행하고; 이 종류의 지방은 견갑골 사이에(견갑간), 주요 혈관 및 심장 주위(대동맥 주위, 심장주위), 및 신장 위(부신)에 위치한다. 지방 조직은 또한 황색 지방(yellow fat)을 포함한다. 지방 조직은 인간을 포함한 동물의 신체 전체에서 발견되고, 오메멘투름(omementurm), 골수, 피하 공간 및 대부분의 기관의 주위에 존재한다.

성체 ASC 또는 인간 지방 조직-유래 성체 기질 세포는 개체에 대한 최소한의 위험 또는 불편으로 통상적으로 수집될 수 있는 세포 공급원(cell source)을 나타낸다. 이들은 체외에서 확장되고, 독특한 계통 경로(lineage pathway)를 따라 분화되고, 유전적으로 조작되고, 자가 이식 또는 동종 이식으로서 개체 내로 재도입될 수 있다.

본 명세서에 기재된 ASC의 집단은 내피 세포, 간엽 중간 세포, 섬유모세포, 평활근 세포, 혈관주위 세포 및 지방-유래 줄기 세포 및 열거되지 않는 다른 종류의 세포들 중 하나 이상 또는 2개 이상의 세포 집단을 포함하는 세포의 이질적 집단이다. 일부 구체예에서, 지방-유래 기질 세포는 지방-유래 줄기 세포의 실질적으로 순수한 집단을 의미한다. 일부 구체예에서, 지방-유래 기질 세포는 지방-유래 재생 세포(adipose derived regenerative cell)를 의미하지 않는다. 본 발명의 방법에서 유용한 ASC는 지방세포, 연골세포, 및 골모세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 세포 종류로 분화되는 능력을 가지며, 질병 및 질환의 치료 및 외상성 손상 복구를 위한 연구, 이식, 및 조직 공학 제품의 개발을 위한 완전히 분화된 기능성 세포를 제공한다.

ASC는 중배엽, 외배엽, 또는 내배엽 계통을 갖는 세포를 생성하도록 ASC를 유도하기 위해 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려진 방법에 따라 배양될 수 있다. 분화 유도 배지에서 ASC를 적절한 시간 동안 (예를 들면, 수일 내지 1주 또는 그 이상) 배양한 후, 실제로, ASC가 원하는 계통을 수득했는지 여부를 결정하기 위해, ASC를 분석할 수 있다.

ASC 집단의 특성을 규명하는 방법은 조직학적 방법, 형태학적 방법, 생화학적 방법, 및 면역조직화학적 방법, 또는 세포 표면 마커의 이용, 또는 유전적 방법, 또는 분자적 방법, 또는 분화된 세포에 의해 분비되는 인자들을 식별하는 것에 의한 방법, 및 분화된 ASC의 유도 특성(inductive quality)에 의한 방법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

예를 들면, 본 발명의 ASC로부터 분화되는 중배엽 세포를 특징짓는 분자 마커는 MyoD, 미오신, 알파-액틴, brachyury, FOG, tbx5 FoxF1, Nkx-2.5를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 전술된 마커의 포유동물 상동체가 바람직하다.

본 발명의 ASC로부터 분화되는 외배엽 세포를 특징짓는 분자 마커는 예를 들면, N-CAM, GABA 및 표피 특이적 케라틴을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 전술된 마커의 포유동물 상동체가 바람직하다. ADSC로부터 분화하는 내배엽 세포를 특징짓는 분자 마커는 예를 들면, Xhbox8, Endo1, Xhex, Xcad2, Edd, EF1-알파, HNF3-베타, LFABP, 알부민, 인슐린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 전술된 마커의 포유동물 상동체가 바람직하다.

지방 조직은 다수의 개체에서 용이하게 접근가능하고, 풍부하다. 비만은 미국에서 유행병 특성의 상태이고, 50%를 넘는 비율의 성인이 신장 기준 권장 BMI를 초과한다.

성체 지방-유래 기질 세포(ASC)는 예를 들면, 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국특허 제7,270,996호에 개시된 방법 및 장치를 이용하여, 개체로부터 수집될 수 있다. 추가적으로, 성체 지방-유래 기질 세포(ASC)는 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국특허출원 제2008/0248003호에 개시된 배양 조건에 따라 수득되고 배양될 수 있다.

본 발명의 방법에서 유용한 ASC는 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국특허출원 제2003/0082152호 또는 WO 00/53795에 기재된 바와 같은, 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 분리될 수 있다. 일부 구체예에서, 지방 조직은 포유동물 개체, 바람직하게는 인간 개체로부터 단리된다. 일부 구체예에서, 지방의 공급원(source)은 피하 지방 조직이다. 일부 구체예에서, 지방 조직의 공급원은 대망 지방 조직(omental adipose)이다. 인간에서, 지방은 통상적으로 지방흡입에 의해 단리된다. 일부 구체예에서, 조작된 ASC가 인간 개체로 이식되는 경우, 자가 이식을 위해 지방 조직은 동일한 개체로부터 단리되는 것이 바람직하다. 대안적으로, 이식된 ASC는 동종이식이다.

인간 지방-유래 기질 세포(ASC)의 단리, 확대, 및 분화 방법이 보고되었다. 예를 들면, Burris et al. 1999, Mol Endocrinol 13:410-7; Erickson et al. 2002, Biochem Biophys Res Commun. Jan. 18, 2002; 290(2):763-9; Gronthos et al. 2001, Journal of Cellular Physiology, 189:54-63; Halvorsen et al. 2001, Metabolism 50:407-413; Halvorsen et al. 2001, Tissue Eng. 7(6):729-41; Harp et al. 2001, Biochem Biophys Res Commun 281:907-912; Saladin et al. 1999, Cell Growth & Diff 10:43-48; Sen et al. 2001, Journal of Cellular Biochemistry 81:312-319; Zhou et al. 1999, Biotechnol. Techniques 13: 513-517을 참조한다. 지방 조직-유래 기질 세포는 콜라게나아제 처리(collagenase differentiation) 및 차등 원심분리(differential centrifugation)에 의해 잘게 다져진 인간 지방 조직으로부터 수득된다[Halvorsen et al. 2001, Metabolism 50:407-413; Hauner et al. 1989, J Clin Invest 84:1663-1670; Rodbell et al. 1966, J Biol Chem 241:130-139].

지방 세포는 보충될 수 있는(replenishable) 세포 집단이라는 것이 잘 알려져 있다. 지방 흡입 또는 기타 시술에 의한 외과수술적 제거 후에도, 시간의 경과에 따라 개체 중 지방세포의 재현(recurrence)이 일어나는 것이 일반적이다. 이는 지방 조직이 자가-재생가능한 기질 줄기 세포(stromal stem cell) 및/또는 전구체를 포함한다는 것을 시사한다.

수득된 후에도, 지방 조직의 나머지로부터 본 발명의 ASC를 분리하기 위해 지방 조직이 가공된다. 수득된 지방 조직을 생리적으로 적합한 용액(physiologically-compatible solution), 예를 들면, 인산염 완충 생리적 식염수(PBS)에 의해 세척하는 것에 의해, 간엽 줄기 세포, 섬유모세포, 평활근 세포, 및 혈관주위 세포 및 지방-유래 줄기 세포의 이질적 집단을 포함하는 ASC 집단이 수득된다. 세척 단계는 지방 조직을 PBS로 세정하는 단계, 조직을 교반시키는 단계 및 조직을 침전시키는 단계로 구성된다. 세척 외에, 지방 조직은 해리된다. 해리(dissociation)는 효소에 의한 분해(enzymatic degradation) 및 중화에 의해 일어날 수 있다. 대안적으로, 또는 그와 같은 효소에 의한 처리와 함께, 기계적 교반, 초음파 에너지, 또는 열 에너지와 같은 기타 해리 방법이 이용될 수 있다. 세척, 해리, 및 침전 단계 후에 3개의 층이 형성된다. 상층은 유리 지방층이다. 중간층은 격자(lattice) 및 지방세포 응집체(adipocyte aggregate)를 포함한다. 중간층은 "지방-유래 격자 강화 분획(adipose-derived lattice enriched fraction)"으로 지칭된다.

하층(bottom layer)은 ASC 집단을 포함한다. 하층을 더 가공하여 본 명세서에 개시된 ASC를 단리시킨다. 하층의 세포 분획을 펠렛으로 농축시킨다. 세포를 농축하는 하나의 방법은 원심분리를 포함한다.

하층을 원심분리하고, 펠렛을 유지한다. 펠렛을 지방-유래 줄기 세포 및 ASC 집단 중의 다른 세포들을 포함하는 지방-유래 기질 세포 집단으로 지정한다. ASC 집단은 또한 적혈구(RBC)를 포함할 수 있다. 바람직한 방법에서, RBC는 용해되고 제거된다. RBC의 용해 및 제거 방법이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있다 (예를 들면, 저장성 배지 중 인큐베이션). 그러나, RBC는 ADSC-EF로부터 제거되지 않아도 된다.

펠렛을 1회 이상 연속적으로, 재현탁시키고 (PBS로) 세척하고, 원심분리하고, 재현탁시켜 ASC의 보다 높은 순도를 수득한다. 본 명세서에 개시된 ASC 집단은 여러 세포들 중에서, 특히, 지방-유래 줄기 세포(ADSC)를 포함하는 세포들의 이질적 집단이다. 세포되고 재현탁된 펠렛의 세포들은 유전적 조작 및 뒤이은 개체로의 이식을 위해 준비된 상태이다.

재현탁된 펠렛 중 ASC는 세포 분류(cell sorting), 크기 분별(size fractionation), 과립 상태(granularity), 밀도, 분자적 방법, 형태학적 방법, 및 면역조직학적 방법을 포함하나, 이에 한정되지 않는 방법에 의해 재현탁된 펠렛의 다른 세포들로부터 분리될 수 있다. 유동 세포 분석법(flow cytometry)에 기반한 지방-유래 기질 세포의 면역표현형은 기질 세포 연관 마커(stromal cell's associated marker), 예를 들면, CD13, CD29, CD34, CD44, CD63, CD73, CD90, CD166, 및 알데히드 데히드로게나아제 및 다중약물-내성 수송 단백질(multidrug-resistance transport protein)(ABCG2)을 포함한다. ASC는 또한 내피 세포 연관 마커, 예를 들면, CD31, CD144 또는 VE-카데린(cadherin), 혈관 내피 성장인자 수용체(vascular endothelial growth factor receptor) 2, 폰 빌리브란트 인자(von Willebrand factor)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 마커들을 발현할 수 있다.

일 구체예에서, ASC는 ASC가 작고 무과립성인 경우, 세포 크기 및 과립 상태에 근거하여 다른 세포들로부터 분리된다. 대안적으로, ASC를 펠렛의 다른 세포들로부터 분리하는 분자적 방법은 텔로미어(telomere)의 길이를 분석하는 것에 의해 수행된다. 지방-유래 줄기 세포(ADSC)는 분화된 세포보다 더 긴 텔로미어를 갖는 경향이 있다.

또 다른 구체예에서, 텔로머라아제(telomerase)의 활성을 분석하는 것에 의해 ASC를 펠렛의 다른 세포들로부터 분리하는 생화학적 방법이 이용된다. 텔로머라아제 활성은 줄기 세포-특이적 마커로서 작용할 수 있다.

또 다른 구체예에서, ASC는 펠렛의 다른 세포들로부터 면역조직화학적으로, 예를 들면, 패닝(panning), 자성 비드(magnetic bead)의 사용, 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 분리된다.

대안적으로, ASC를 포함하는 ADSC 강화 분획(ADSC enriched fraction)을 단리하는 방법은 적절한 장치를 사용하여 수행되며, 다수의 장치가 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려져 있다(예를 들면, 미국특허 제5,786,207호 참조). 그와 같은 장치는 세척 단계 및 해리 단계를 기계적으로 달성할 수 있다.

지방 조직은 조직 공학 응용을 위해 다수의 실용적 장점을 제공한다. 첫째, 지방 조직은 풍부하다. 둘째, 지방 조직은 환자에 대한 최소한의 위험을 갖는 수집 방법(harvest method)으로 수집될 수 있다. 셋째, 지방 조직은 보충될 수 있다. 기질 세포는 골수의 유핵 세포 집단의 0.01% 미만을 차지하나, 지방 조직 그램 당 약 8.6x10⁴ 또는 8.6x10⁶ 이상의 기질 세포가 존재한다 (Sen et al., 2001, J. Cell. Biochem., 81:312-319). 2 내지 4주의 생체외 확장(Ex vivo expansion)은 0.5 킬로그램의 지방 조직으로부터 최대 5억 개의 기질 세포를 생성한다.

따라서, 일부 구체예에서, 본 명세서에 개시된 조작된 ASC는 암을 가진 개체로의 이식 또는 투여를 위해 즉시 사용될 수 있거나, 또는 암을 가진 개체로의 미래의 자가 이식 또는 동종 이식을 위해 동결보존될 수 있다.

ASC는 또한 다수의 부착(adhesion) 및 표면 단백질을 발현한다. 이들은 CD9; CD29 (인테그린 베타 1); CD44 (히알루로네이트 수용체); CD49d,e (인테그린 alpha 4, 5); CD54 (ICAM1); CD55 (붕괴 가속 인자(decay accelerating factor)); CD105 (엔도글린); CD106 (VCAM-1); CD166 (ALCAM) 및 HLA-ABC (클래스 I 조직적합성(histocompatibility) 항원)와 같은 세포 표면 마커; 및 인터루킨 6, 7, 8, 11과 같은 사이토카인; 대식세포-콜로니 자극 인자(macrophage-colony stimulating factor); GM-콜로니 자극 인자; 과립구-콜로니 자극 인자(granulocyte-colony stimulating factor); 백혈병 저해 인자(leukemia inhibitory factor); 줄기 세포 인자 및 골 형성 단백질(bone morphogenetic protein)을 포함한다. 이 단백질들 중 다수가 조혈 지지 기능(hematopoietic supportive function)을 수행하고, 이들 모두는 골수 기질 세포에 의해 공통적으로 공유된다.

본 명세서에 개시된 방법에 따라 항암제를 발현하도록 조작하기에 유용한 ASC는 WO 00/5379에 기재된 방법과 같은, 당업자에게 잘 알려진 다양한 방법에 의해 단리될 수 있다. 일 구체예에서, 지방 조직은 포유동물 개체, 바람직하게는 인간 개체로부터 단리된다. 인간에서, 지방은 통상적으로 지방흡입에 의해 단리된다. 본 발명의 세포가 인간 개체로 이식되는 경우, 자가 이식을 위해 지방 조직은 동일한 개체로부터 단리되는 것이 바람직하다. 대안적으로, 이식된 세포는 동종이식이다.

본 명세서에 기재된 세포는 이전에 기재된 방법을 이용하여 지방 세포로부터 단리될 수 있다 (Zuk et al., Tissue Engineering 7:211, 2001; Katz et al., Stem Cells 23:412, 2005). 그러나, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술을 가진 자는 세포 접종 농도(cell seeding density)와 같은 배양 조건이 각 실험 조건 또는 의도된 용도를 위해 선택될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 명세서에 기재된 세포들을 단리하고 특성을 규명하기 위해 유용한 기타 기법들은 세포 마커를 이용하여 세포를 분류하는 것을 포함한다.

(참조에 의해 본 명세서에 포함된) US 2002/0076400 및 WO 00/53795는 인간 지방 조직으로부터 다능성(multipotent) 세포 집단의 생성을 기재한다. 상기 세포 집단은 지방세포, 골모세포, 연골세포, 및 근육세포로 분화될 수 있다. 전술된 문헌들은 일부 세포들은 배양물에서 15 회 이상의 세포 전달(cell transfer) 동안 인 비트로에서 그들의 다능성을 상실하지 않으면서 유지될 수 있다는 것을 기재한다. 참조에 의해 본 명세서에 포함된, 미국특허 제6,800,480호는 피더 세포-불포함 배양 시스템(feeder cell-free culture system)에서 영장류-유래 원시 줄기 세포(primate-derived primordial stem cell)를 배양하는 방법 및 이를 위한 재료를 기재한다.

지방세포 분화, 및 기타 간엽 세포 및 본 명세서에 기재되지 않은 세포의 분화를 측정하는 다수의 기법이 당업자에게 알려져 있고, 본 발명의 기법 내에 포함된다.

일 구체예에서, 지방 조직, 또는 지방 조직으로부터 유래된 ASC는 무혈청 또는 저혈청(low serum) 조건 하에서 증식 또는 분화를 지지하기 위한, 본 명세서에 기재된 다양한 배양 배지에 노출된다. 당업자는 사용된 각각의 성장 인자, 호르몬, 화합물, 영양분, 비타민, 등의 양은 사용된 배양 조건, 추가적인 분화-유도제의 양, 또는 둘 이상의 작용제가 이용되는 경우, 사용된 작용제의 조합의 수에 따라 변할 수 있다는 것을 이해할 것이다.

항암제.

본 명세서에 개시된 바와 같이, 본 발명은 지방-유래 간질 세포(ASC)를 항암제를 발현하도록 조작하는 것에 관한 것이다. 항암제는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 임의의 작용제일 수 있다. 일부 구체예에서, 항암제는 구체적으로 혈관신생 억제제 또는 호르몬, 예를 들면, 혈관신생(혈관 증식 및 내피 세포 이동) 및 신생혈관형성(neovascularization)을 촉진하는 혈관신생 촉진(pro-angiogenic) 호르몬을 배제한다.

일부 구체예에서, 항암제는 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드이다. 일부 구체예에서, 항암제가 단백질인 경우, 항암제는 아폽토시스 촉진(pro-apoptotic) 단백질이다. 아폽토시스 촉진 단백질은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있고, 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에서의 용도를 위해 포함된다. 아폽토시스 촉진 단백질의 예는 세포에서 세포 사망 경로를 유도할 수 있는 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 그와 같은 효과기(effector) 분자의 예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려진 아폽토시스 촉진 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들면, 한정 없이, TRAIL, Hsp90; TNFα; DIABLO; BAX; BID; BID; BIM; Bcl-2의 저해제; Bad; 폴리 ADP 리보오스 폴리머라아제-1 (PARP-1); SMAC(Second Mitochondria-derived Activator of Caspases); AIF(apoptosis inducing factor); Fas (Apo-1 또는 CD95로도 알려짐); Fas 리간드 (FasL), 및 그의 생물학적 활성 절단 변이체(biologically active truncated variant)를 포함한, 아폽토시스 촉진 분자의 천연 변이체 또는 재조합 또는 유전적으로 변형된 변이체가 본 명세서에 개시된 방법에 의해 ASC에 의해 발현된 아폽토시스 촉진제로서의 용도를 위해 포함된다.

일부 구체예에서, 항암제는 선택적으로 암 줄기 세포를 표적화하고, 바람직하게는 암 줄기 세포를 제거하는 단백질 또는 폴리펩티드 항암제이다. 그와 같은 항암제가 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지되고, 암 줄기 세포의 표면 상에서 발현되는 마커를 표적화하는 세포-표면 표적화 모이어티를 포함하는 항암제를 포함한다.

혈관신생은 악성 질환 및 종양 증식, 침윤, 및 전이의 발병에서 중요한 역할을 수행한다. 본 발명은 종양으로의 항암제의 전달을 위해 혈관신생을 자극하기 위해 ASC에 의존하나, 일 구체예에서, 항암제는 생체 내에서 면역 반응 및/또는 항-혈관신생 반응을 유도하는 능력을 갖는 치료 폴리펩티드를 코딩한다.

일 구체예에서, 조작된 ASC에 의해 발현되는 핵산 서열은 면역자극 활성 및 항-혈관신생 활성을 보이는 치료 유전자, 예를 들면, IL12 (Dias et al. (1998) Int J Cancer 75(1): 151-157, 및 본 명세서의 하기에서 인용된 참조문헌 참조), 인터페론-알파 (INFα) (O'Byrne et al. (2000) Eur J Cancer 36(2): 151-169, 및 명세서의 하기에서 인용된 참조문헌 참조), 또는 케모카인 (Nomura & Hasegawa (2000) Anticancer Res 20(6A):4073-4080, 및 인용된 참조문헌)을 코딩한다.

일부 구체예에서, ASC에 의해 발현되는 항암제는 세포의 사망을 촉진하는 분자일 수 있고, 예를 들면, cre 재조합효소 (Cre), 아폽토시스 촉진 유전자(pro-apoptotic gene), 세포독소(cytotoxin) 분자, 면역독소(immunotoxin) 분자 및 그의 단편 또는 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 세포독성 분자는 예를 들면, 식물 할로독소(plant halotoxin), 식물 헤미독소(plant hemitoxin), 세균 독소(bacterial toxin), 탄저병 독소(antrax toxin), 디프테리아 독소(diptherial toxin, DT), 슈도모나스 내독소(pseudomonal endotoxin), 스테릅토라이신(sterptolysin) O, 사포린 (SAP), PAP(pokeweek antiviral protein), 브리오딘(bryodin) 1, 부가닌(bouganin) 및 젤로닌(gelonin) 및 그의 단편 또는 변이체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 항암제는 세포를 하나 이상의 이차 작용제(secondary agent)에 감작시키는 분자, 예를 들면, 세포를 하나 이상의 이차 작용제, 예를 들면, β-글루토니다아제, 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(hypoxanethine-guiane phosphoribosynltransferase), β-락타마아제, 카록스블에스테라아제(caroxblesterase) HCE1, 퍼옥시다아제 효소에 감작시키는 항암제이다. 일부 구체예에서, 항암제는 아폽토시스 촉진 유전자, 또는 그의 단편 또는 변이체이다.

일부 구체예에서, ASC에 의해 발현되는 아폽토시스 촉진제는 핵산 작용제, 예를 들면, RNAi 분자 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은 핵산 분자이다. 일부 구체예에서, 본 명세서에 개시된 방법에서 유용한 RNA 간섭 (RNAi) 작용제는 예를 들면, 안티센스 뉴클레오티드 산(antisense nucleotide acid), 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), 아비미르(avimir) 또는 그의 변이체 또는 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, RNAi 작용제는 shRNA 분자이다. 그와 같은 구체예에서, RNAi 분자는 그 용어가 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 필수적 유전자(예를 들면, 세포 생존을 위해 필요한 단백질을 코딩하는 유전자) 또는 대안적으로 암 표적 유전자를 유전자 침묵시킬 것이다. RNAi 항암제에 의해 유전자 침묵되는 암 표적 유전자의 예는 예를 들면, HER2/Her-2, BRAC1과 BRAC2, Rb, p53 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이와 같은 단백질 중 하나에 대한 siRNA 분자를 설계하는 것은 당업자에게 일상적이다.

일부 구체예에서, 항암제는 개체에서 암-유발 발암유전자를 유전자 침묵시키는 RNAi이고, 상기 개체는 발암유전자(즉, 비정상적인 암-유발 유전자) 및 정상적 유전자를 모두 포함한다. 암-유발 유전자는 폴리뉴클레오티드 서열의 차이에 의해 유전자의 정상 카피와 다르다. 그와 같은 암-유발 유전자는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있고, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항암제게 의해 유전자 침묵 대상으로 포함되며, 예를 들면, ABL1, BCL1, BCL2, BCL6, CBFA2, CBL, CSF1R, ERBA, ERBB, EBRB2, FGR, FOS, FYN, HRAS, JUN, LCK, LYN, MYB, MYC, NRAS, RET 또는 SRC과 같은 발암유전자; BRCA1 또는 BRCA2와 같은 종양 억제자 유전자(tumor suppressor gene); 부착 분자(adhesion molecule); 사이클린 키나아제(cyclin kinase) 및 그의 저해제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 발생 유전자(developmental gene), 발암유전자, 및 효소를 포함한 잠재적인 표적 유전자의 예시적 목록, 및 본 발명에 따라 치료될 수 있는 암의 목록은 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된, WO 99/32619에서 발견될 수 있다.

일부 구체예에서, 항암제는 암 줄기 세포를 선택적으로 표적화하고, 바람직하게는 이를 제거하는 RNAi 항암제이다. 그와 같은 RNAi 항암제는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있고, 암 줄기 세포에서 특이적으로 발현되는 유전자를 유전자 침묵시키는 RNAi 항암제를 포함한다.

일부 구체예에서, 항암제를 코딩하는 핵산 서열은 항암제의 발현이 특이적으로 암 세포를 죽일 수 있게 하고, 예를 들면, 면역독소 분자 등을 코딩할 수 있다.

일부 구체예에서, 항암제는 구체적으로 혈관신생 억제제 또는 혈관의 형성을 저해하거나, 또는 혈관신생, 예를 들면, 내피 세포의 이동을 저해하는 작용제를 배제한다.

또 다른 구체예에서, 항암제는 구체적으로 호르몬 또는 호르몬 스테로이드를 배제한다. 일부 구체예에서, 상기 배제된 호르몬은 사이토카인, 또는 인간 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, 신경 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자(insulin-like growth factor), 조혈 줄기 세포 성장 인자(hemopoietic stem cell growth factor), 섬유모세포 성장 인자 패밀리(fibroblast growth factor family)의 일원, 혈소판-유래 성장 인자 패밀리의 일원, 혈관 및 내피 세포 성장 인자, TGFb 패밀리의 일원(골 형성 인자(bone morphogenic factor) 포함), 산성 및 염기성 섬유모세포 성장 인자(acdic and basic fibroblast growth factor), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 표피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장 인자(transforming growth factor) α(TGFα) 및 β (TGFβ), 혈소판-유래 내피 성장 인자(platelet-derived endothelial growth factor, PDEGF), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor) α (TNFα), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), 인슐린 유사 성장 인자, 에리쓰로포이에틴 (EPO), 콜로니 자극 인자(colony stimulating factor, CSF), 대식세포-CSF, 과립구/대식세포 CSF 및 일산화질소 합성효소(nitric oxide synthase, NOS) 또는 선천성 질환(예를 들면, 영양 실조)에 대한 특이적 효소을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 항암제는 구체적으로 조직 내에서 혈관신생을 유도하거나 조직 내에서 신생혈관형성을 촉진하는 혈관신생 호르몬 (예를 들면, 혈관 성장 인자, 혈관 및 내피 세포 성장 인자(vascular and endothelial cell growth factor) 등)을 배제한다.

일부 구체예에서, 항암제는 아폽토시스 촉진제이다. 일부 구체예에서, 상기 아폽토시스 촉진제는 RNAi 작용제이다. 일부 구체예에서, RNAi 아폽토시스 촉진제는 항-아폽토시스 분자(생존 분자(survival molecule) 또는 생존 인자(survival factor)로도 알려짐)를 유전자 침묵시킨다. 그와 같은 분자의 예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자에 의해 잘 알려진 다수의 항-아폽토시스 분자, 예를 들면, Bcl-2; Bcl-XL; Hsp27; 아폽토시스 저해제(inhibitors of apoptosis, IAP) 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

일부 구체예에서, ASC에 의해 발현되는 아폽토시스 촉진제는 제2 작용제(즉, 전구체 약물)를 활성화시키는 단백질(예를 들면, 효소)이다. 예를 들면, 그러나, 이론에 의해 한정되기를 원치 않으면서, 항암제는 티로신 키나아제, 예를 들면, β-글루쿠로니다아제 활성일 수 있다. β-글루쿠로니다아제는 9-아미노캄포테신 및 p-히드록시 아닐린 머스타드(p-hydroxy aniline mustard)와 같은 저독성 전구체 약물을 활성화시키거나, 또는 유사체, 예를 들면, N-[4-독소루비신-N-카르보닐(옥시메틸)페닐] O-β-글루쿠로닐 카르바메이트(DOX-GA3)가 독소루비신(DOX)의 항종양 효과를 향상시키기 위해 개발되었다. 전구체 약물 DOX-GA3은 원래 종양 부위에서 특이적으로 높은 세포 독성 효과를 발휘하도록 인간 β-글루쿠로니다아제(GUS)에 의해 활성 분자 또는 약물로 활성화되도록 설계되었다. 그와 같은 전구체약물의 효능은 또한 항암제의 조합 화학- 및 방사선요법(combined chemo- and radio-therapy of anti-cancer)(CCRTC) 전략에서 적절한 방사선핵종(radionuclide)의 내포에 의해 크게 강화될 수 있다. 일부 구체예에서, 전구체 약물은 또한 항암제의 효율적인 전달을 위해 리포좀을 변형시키기 위해 이용될 수 있다 (Chen et al, current medicinal chemistry; 2003 3;139-150; Chen et al, cancer Gene Ther, 2006;).

또 다른 구체예에서, ASC에 의해 발현되는 아폽토시스 촉진제는 예를 들면, 기생충 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei)(Tb)로부터 유래된 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, HGPRT)이고, 이는 퓨린 유사체인 알로퓨리놀(allopurinol)을 그의 인간 상동체보다 더 높은 효율로 상응하는 뉴클레오티드로 전환시킬 수 있고, 따라서, 전구체약물 알로퓨리놀을 세포독성 대사산물로 활성화시킬 수 있다 (Trudeau et al, 2001; Human Gene Ther; 12:1673 -1680). 또 다른 구체예에서, 효과기 분자는 슈모모나스 슈도알칼리게네스(Pseudomonas pseudoalcaligenes) JS45로부터 유래된 박테리아 니트로벤젠 니트로리덕타아제(NbzA)일 수 있고, 이는 디니트로벤즈아미드 암 전구체 약물 CB1954 및 항생제 전구체(proantibiotic) 니트로퓨라존(nitrofurazone)을 활성화시킨다 (Berne et al, 2006; Biomacromolecules, 7;2631-6).

또 다른 구체예에서, ASC에 의해 발현되는 아폽토시스 촉진제는 전구체 약물 데스아세틸빈블라스틴-3-카르복시산 히드라지드(DAVLBHYD) 또는 다른 유사체로부터 활성제 또는 약물을 생성하는 β-락타마아제(lactamase)이다. 그와 같은 구체예에서, 효과기 단백질인 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae) 베타-락타마아제 (bL)는 페닐렌디아민 머스타드(PDM)의 세팔로스포린 전구체약물인 항암제 전구체 약물 7-(4-카르복시부탄아미도)세팔로스포린 머스타드(CCM)를 활성화시킨다 (Svensson et al, 1999; J Med Chem., 41:1507-12).

또 다른 구체예에서, ASC에 의해 발현되는 아폽토시스 촉진제는 항바이러스 약물, 예를 들면, 항바이러스 약물로 통상적으로 이용되고 효과기 분자인 카르복실에스테라아제 HEC1을 위한 이차 작용제로서 작용할 수 있는 오셀타미비르(Oseltamivir)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 약물을 촉매하는 분자일 수 있다 (Shi et al, 2006; J Pharmacol Exp Ther.).

일 구체예에서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 전구체 약물/효소 조합은 ASC에 의해 발현된 아폽토시스 촉진제로서 이용될 수 있고, 본 명세서에 개시된 방법에서 사용하기 위해 포함될 수 있으며, 예를 들면, 광역학 치료(photodynamic therapy)에서 독성 라디칼을 생성하는 효소를 포함하며(Wardman et al, 2001; Scientific Yearbook, 2001-2002 참조), 예를 들면, 퍼옥시다아제 유전자가 효과기 분자로서 이용될 수 있다.

발현 시스템( Expression System )

일부 구체예에서, 항암제는 ASC로부터 발현되고, 상기 항암제는 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열에 의해 코딩된다. 따라서, 상기 프로모터의 활성화는 항암제의 발현을 가져온다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 특정한 프로모터, 예를 들면, 구성적 프로모터 및 항암제의 발현을 선택적으로 작동시키거나 또는 중단시키기 위한 유도성 프로모터가 이용될 수 있다.

프로모터는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 잘 알려져 있으며, 적절한 프로모터가 항암제의 발현을 위해 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 프로모터는 구성적 프로모터, 또는 그의 단편, 또는 그의 유도체이다. 대안적인 구체예에서, 프로모터는 조직-특이적, 또는 세포-특이적 프로모터, 또는 그의 단편, 또는 그의 유도체이다.

일부 구체예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항암제를 코딩하는 핵산 서열은 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는 프로모터를 선택적으로 더 포함할 수 있다: 인핸서, 5' 비번역 영역(untranslated regions) (5'UTR), 3' 비번역 영역 (3'UTR), 및 리프레서(repressor) 서열; 구성적 프로모터, 유도성 프로모터; 조직 특이적 프로모터, 세포-특이적 프로모터 또는 그의 변이체. 사용될 수 있는 조직-특이적 프로모터의 예는 알부민, 림프-특이적(lymphoid specific) 프로모터, T-세포 프모로터, 신경미세섬유 프로모터, 췌장 특이적 프로모터, 유청(milk whey) 프로모터; hox 프로모터, α-태아단백질 프로모터, 인간 LIMK2 유전자 프로모터, FAB 프로모터, 인슐린 유전자 프로모터, 트랜스피레틴(transphyretin), 알파.1-안티트립신, 플라스미노겐 활성자 저해제 타입 1(plasminogen activator inhibitor type 1, PAI-1), 아포리포프로테인 MBP(myelin basic protein) 유전자, GFAP 프로모터, OPSIN 프로모터, NSE, Her2, erb2, 및 그의 단편 및 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이용될 수 있는 다른 프로모터의 예는 테트라사이클린, 메탈로티오닌, 엑디손(ecdysone), 포유동물 바이러스(mammalian virus)(예를 들면, 아데노바이러스 후기 프로모터(late promoter); 및 MMTV-LTR(mouse mammary tumor virus long terminal repeat)) 및 기타 스테로이드-반응성 프로모터, 라파마이신 반응성 프로모터 및 이들의 변이체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

일부 구체예에서, ASC는 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 마커 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 핵산 서열에 의해 선택적으로 형질도입될 수 있고, 상기 마커 유전자의 발현은 표적 유전자를 발현하는 세포를 식별한다. 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 벡터 또는 상이한 벡터에 존재할 수 있다.

일부 구체예에서, 뉴클레오티드 작제물은 선택적으로 하나 이상의 마커 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하고, 상기 마커 유전자의 발현은 제1 리프레서 프로모터(repressor promoter) 서열에 작동가능하게 연결되고, 상기 마커 유전자의 발현은 표적 유전자를 발현하는 세포를 식별한다. 일부 구체예에서, 핵산 서열은 선택적으로 내부 리보솜 표적 부위(IRES) 및/또는 다중 클로닝 뉴클레오티스 서열 부위로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 더 포함할 수 있다. 대안적으로, 일부 구체예에서, 본 명세서에 개시된 핵산 및 시스템은 제1 리프레서 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 마커 유전자 또는 그의 단편을 더 포함한다.

프로모터

본 명세서에서 사용된 용어 "프로모터(promoter)"는 핵산 서열, 예를 들면, 이종 표적 유전자, RNAi 작용제, 또는 리프레서 단백질을 코딩하는 핵산의 발현을 조절하는 서열을 의미한다. 프로모터는 구성적, 유도성, 또는 억제성(represible), 또는 조직-특이적일 수 있다. "프로모터"는 전사의 개시 및 속도를 조절할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열의 영역인 제어 서열이다. 프로모터는 조절 단백질 및 분자, 예를 들면, RNA 폴리머라아제 및 기타 전사 인자가 결합할 수 있는 유전적 요소(genetic element)를 포함할 수 있다. 구 "작동가능하게 연결된(operable linked)", "작동가능하게 배치된(operatively positioned)", "작동가능하게 결합된(operatively linked)", "제어 하에 있는(under control)" 및 "전사 제어 하에 있는(under transcriptional control)"은 프로모터가 핵산 서열에 대해 그 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어하기 위한 정확한 기능적 위치 및/또는 배향으로 존재한다는 것을 의미한다. 프로모터는 "인핸서(enhancer)"와 함께 이용되거나 또는 함께 이용되지 않을 수 있고, 인핸서는 핵산 서열의 전사 활성화에 관여하는 시스-작용 조절 서열(cis-acting regulatory sequence)을 의미한다.

프로모터는 코딩 세그먼트 및/또는 엑손의 상류에 위치한 5' 비-코딩 서열을 단리하는 것에 의해 수득될 수 있는 것과 같이, 유전자 또는 서열과 본래 회합된 서열일 수 있다. 그와 같은 프로모터는 "내재(endogenous)"로 지칭될 수 있다. 마찬가지로, 인핸서는 해당 서열의 하류 또는 상류에 위치한, 핵산 서열과 본래 회합된 서열일 수 있다. 대안적으로, 코딩 핵산 세그먼트를 재조합 또는 이종 프로모터의 제어 하에 배치하는 것에 의해 특정한 장점을 얻을 수 있으며, 재조합 또는 이종 프로모터는 본래의 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 회합되지 않은 프로모터를 의미한다. 재조합 또는 이종 인핸서는 또한 그의 본래의 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 회합되지 않은 인핸서를 의미한다. 그와 같은 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 및 다른 원핵생물 세포, 바이러스 세포, 또는 진핵생물 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인핸서, 및 "천연(naturally occurring)"이 아닌 프로모터 또는 인핸서, 즉, 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소, 및/또는 발현을 변화시키는 돌연변이를 포함하는 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 합성에 의해 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 생성하는 것 외에, 서열은 재조합 클로닝 및/또는 본 명세서에 개시된 조성물과 함께 PCR^TM을 포함한 핵산 증폭 기술을 이용하여 생성될 수 있다(각각 참조에 의해 본 명세서에 포함된, 미국특허 제4,683,202호 및 미국특허 제5,928,906호 참조). 또한, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비-핵 세포 소기관(non-nuclear organelle) 내에서 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 제어 서열도 이용될 수 있는 것으로 고려된다.

A. 억제성 및 유도성 프로모터( Repressible and Inducible promoter )

(i) 유도성 프로모터

유도성 프로모터는 유도물질(inducer)이 존재하지 않거나, 그의 영향 하에 있지 않거나, 또는 그와 접촉하지 않는 경우에 비해, 유도물질의 존재 시, 또는 유도물질의 영향 하에서, 또는 유도물질과의 접촉시 추가적인 전사 활성을 갖는 것을 특징으로 한다. 유도물질은 내재적일 수 있거나, 또는 유도성 프로모터로부터의 발현의 유도에서 활성을 갖도록 투여된, 일반적으로 외래 화합물 또는 단백질일 수 있다. 일부 구체예에서, 유도제(inducer agent), 즉, 화합물 또는 단백질은 그 자체로 폴리뉴클레오티드의 전사 또는 발현의 결과물이고(즉, 리프레서 단백질일 수 있고), 그 자체로 유도성 프로모터 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 유도성 프로모터의 예는 테트라사이클린, 메탈로티오닌, 엑디손, 포유동물 바이러스(예를 들면, 아데노바이러스 후기 프로모터; 및 MMTV-LTR(mouse mammary tumor virus long terminal repeat)) 및 기타 스테로이드-반응성 프로모터, 라파마이신 반응성 프로모터 및 이들의 변이체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 방법 및 시스템에서 유용한 유도성 프로모터는 진핵생물 숙주 개체에서 기능할 수 있다. 바람직한 구체예는 포유동물 유도성 프로모터를 포함하나, 다른 개체로부터 유래된 유도성 프로모터 및 진핵생물 숙주에서 기능하도록 설계된 합성 프로모터가 이용될 수 있다. 본 발명의 유도성 프로모터의 중요한 기능적 특징은 외래에서 적용된 작용제, 예를 들면, 환경성 유도제(environmental inducing agent)로의 노출에 의한 궁극적인 유도성(inducibility)이다. 적절한 환경성 유도제는 열에 대한 노출, 다양한 스테로이드성 화합물, 이가 양이온(Cu⁺² 및 Zn⁺² 포함), 갈락토오스, 테트라사이클린, IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토시드), 및 기타 천연 및 합성 유도제 및 무상 유도물질(gratuitous inducer)을 포함한다.

본 명세서에 개시된 핵산 작제물 및 시스템은 두 개의 메카니즘 중 하나에 의한 진핵생물 프로모터의 유도성을 포함한다. 본 발명의 특정한 구체예에서, 핵산 작제물은 전사 활성자(transcriptional activator)에 의존적일 수 있는 적절한 유도성 프로모터를 포함하고, 상기 전사 활성자는 환경성 유도제에 의존적이다. 일부 구체예에서, 유도성 프로모터는 환경성 유도제에 의해 불활성화되는 전사 리프레서에 의해 억제될 수 있다. 따라서, 유도성 프로모터는 전사 활성자를 양성으로 활성화시키는 환경성 작용제에 의해 유도되는 프로모터이거나, 또는 전사 리프레서를 음성으로 조절하는 환경성 작용제에 의해 억제되는 프로모터에 의해 유도되는 프로모터일 수 있다. 예를 들면, 실시예에서 입증되는 바와 같이, 하나의 사용된 유도성 프로모터는 LacO 시스템이고, 이 시스템에서, 외래에서 첨가된 작용제 IPTG의 첨가가 전사 리프레서 LacI를 음성으로 조절한다.

본 명세서에 개시된 방법 및 시스템에서 유용한 유도성 프로모터는 환경성 유도제의 작용에 의한 유도를 받는 잠재 전사 활성자(latent transcriptional activator)에 의한 작용에 의해 제어되는 프로모터를 포함한다. 바람직한 예는 효모 ACE1 전사 활성자에 의한 구리-의존적 활성화의 대상인 효모 유전자 CUP1, CRS5, 및 SOD1의 구리-유도성 프로모터를 포함한다(예를 들면, Strain and Culotta, 1996; Hottiger et al., 1994; Lapinskas et al., 1993; 및 Gralla et al., 1991 참조). 대안적으로, ACE1 전사 활성자와 독립적으로 작동되는 효모 유전자 CTT1 (세포질 카탈라아제(cytosolic catalase) T를 코딩함)의 구리 유도성 프로모터(Lapinskas et al., 1993)가 이용될 수 있다. 이 유전자들의 효과적인 유도를 위해 요구되는 구리 농도는 효모 및 초파리 세포를 포함한 대부분의 세포 시스템에 의해 견뎌질 수 있도록 적절하게 낮다. 대안적으로, 하기를 포함하는, 다른 천연 유도성 프로모터가 이용될 수 있다: 스테로이드 유도성 유전자 프로모터 (예를 들면, Oligino et al. (1998) Gene Ther. 5: 491-6 참조); 효모의 갈락토오스 유도성 프로모터 (예를 들면, Johnston (1987) Microbiol Rev 51: 458-76; Ruzzi et al. (1987) Mol Cell Biol 7: 991-7 참조); 및 다양한 열 충격(heat shock) 유전자 프로모터. 다수의 진핵생물 전사 활성자는 다양한 진핵생물 숙주 세포에서 기능하는 것으로 확인되었고, 따라서, 예를 들면, 효모에서 확인된 다수의 유도성 프로모터가 포유동물 숙주 세포에서의 사용을 위해 개조될 수 있다. 예를 들면, 포유동물 세포를 위한 독특한 합성 전사 유도 시스템이 GAL4 결합 부위를 포함하는 포유동물 프로모터를 유도하는 GAL4-에스트로겐 수용체 융합 단백질에 기반하여 개발되었다 (Braselmann et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90: 1657-61). 특정한 유도제에 의존적인 전사 활성자에 반응하는 이들 및 기타 유도성 프로모터가 본 발명에서 사용하기에 적합하다.

본 명세서에 개시된 방법 및 시스템에서 유용한 유도성 프로모터는 또한, 환경성 유도제의 작용에 의한 불활성화의 대상인 리프레서에 의해 억제되는 프로모터를 포함한다. 예는 적합한 리프레서-결합 오퍼레이터(operator) 서열을 내포하도록 조작된 진핵생물 프로모터를 전사에 의해 억제할 수 있는 원핵생물 리프레서를 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 바람직한 리프레서는 생리학적 양성 유도제(physiologically benign inducing agent)에 의한 불활성화에 민감하다. 따라서, lac 리프레서 단백질이 lacO 오퍼레이터 서열을 포함하도록 조작된 진핵생물 프로모터의 발현을 제어하기 위해 이용되는 경우, IPTG에 의한 숙주 세포의 처리는 조작된 프로모터로부터 lacO 오퍼레이터의 해리를 유발하고 전사가 일어날 수 있게 할 것이다. 마찬가지로, tet 리프레서가 tetO 오퍼레이터 서열을 포함하도록 조작된 진핵생물 프로모터의 발현을 제어하기 위해 이용되는 경우, 테트라사이클린에 의한 숙주 세포의 처리는 조작된 프로모터로터 tet 리프레서의 해리를 유발하고 전사가 일어날 수 있게 할 것이다.

본 명세서에 개시된 방법 및 시스템에서 유용한 유도성 프로모터는 pH, 온도, 방사선, 삼투압, 생리적 식염수 구배(saline gradient), 세포 표면 결합 및 하나 이상의 외부 또는 내부 작용제의 농도의 변화와 같은 하나 이상의 생리학적 조건에 의해 유도될 수 있다. 외부 작용제는 아미노산 및 아미노산 유사체, 사카라이드 및 폴리사카라이드, 핵산, 전사 활성자 및 리프레서, 사이토카인, 독소, 석유-기반 화합물(petroleum-based compound), 금속 함유 화합물, 염, 이온, 효소 기질 유사체 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 특정한 구체예에서, 유도성 프로모터는 환경 조건의 변화, 예를 들면, 화학물질, 금속, 방사선, 또는 영양분의 농도 변화 또는 pH의 변화에 반응하여 활성화되거나 또는 억제된다.

또한, 본 명세서에 개시된 방법 및 시스템에서 유용한 유도성 프로모터는 파아지 유도성 프로모터, 영양분 유도성 프로모터, 온도 유도성 프로모터, 방사선 유도성 프로모터, 금속 유도성 프로모터, 호르몬 유도성 프로모터, 스테로이드 유도성 프로모터, 및/또는 이들의 하이브리드 및 조합일 수 있다. 이온화 방사선에 의해 유도될 수 있는 프로모터가 특정한 구체예에서, 특히, 유전자 발현이 UV 또는 x-선과 같은 이온화 방사선으로의 노출에 의해 암 세포에서 국소적으로 유도되는 경우인 암의 유전자 요법에서 이용될 수 있다. 방사선 유도성 프로모터는 fos 프로모터, c-jun 프로모터, 또는 Egr-1 프로모터의 하나 이상의 CArG 도메인의 비-한정적 예를 포함한다. 유도성 프로모터의 예는 시토크롬 P450 유전자, 열 충격 단백질 유전자, 메탈로티오네인(metallothionein) 유전자, 에스트로겐 유전자 프로모터와 같은 호르몬-유도성 유전자, 등과 같은 유전자로부터의 프로모터를 포함한다.

추가적인 구체예에서, 본 명세서에 개시된 방법 및 시스템에서 유용한 유도성 프로모터는 Zn^{2 +} 메탈로티오네인 프로모터, 메탈로티오네인-1 프로모터, 인간 메탈로티오네인 IIA 프로모터, lac 프로모터, lacO 프로모터, MMTV 초기 프로모터(mouse mammary tumor virus early promoter), MMTV LTR 프로모터(mouse mammary tumor virus LTR promoter), 트리오스 데히드로게나아제 프로모터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제 프로모터, SV 40(simian virus 40) 초기 프로모터 또는 RMSV(retroviral myeloproliferative sarcoma virus) 프로모터일 수 있다.

유도성 프로모터의 예는 포유동물 프로바신(probasin) 프로모터, 락트알부민 프로모터, GRP78 프로모터, 또는 박테리아 테트라사이클린-유도성 프로모터를 포함한다. 다른 예는 열 충격, 스테로이드 호르몬, 중금속, 포르볼(phorbol) 에스테르, 아데노바이러스 E1A 요소, 인터페론, 및 혈청 유도성 프로모터를 포함한다.

생체 내 용도를 위한 본 명세서에 개시된 방법 및 시스템에서 유용한 유도성 프로모터는 생물학적으로 적합한 작용제(biologically compatible agent)에 반응하는 프로모터, 예를 들면, 정의된 동물 조직에 통상적으로 존재하는 프로모터를 포함할 수 있다. 일 예는 종양 괴사 인자에 의해 유도되는, 인간 PAI-1 프로모터이다. 추가적인 적절한 예는 다양한 독소 및 기타 작용제에 의해 유도되는, 시토크롬 450 유전자 프로모터; 다양한 스트레스에 의해 유도되는, 열 충격 단백질 유전자, 호르몬-유도성 유전자, 예를 들면, 에스트로겐 유전자 프로모터이다.

유도성 프로모터는 Cu^{2 +}, Zn^{2 +}, 테트라사이클린, 테트라사이클린 유사체, 엑디손, 글루코코르티코이드, 타목시펜, 또는 lac 오페론 (LacO)의 유도물질에 의해 유도될 수 있다. 프로모터는 엑디손, 글루코코르티코이드, 또는 타목시펜에 의해 유도될 수 있다. 특정한 구체예에서, 유도성 프로모터는 파아지 유도성 프로모터, 영양분 유도성 프로모터, 온도 유도성 프로모터, 방사선 유도성 프로모터, 금속 유도성 프로모터, 호르몬 유도성 프로모터, 스테로이드 유도성 프로모터, 또는 이들의 조합이다. 방사선 유도성 프로모터의 예는 fos 프로모터, jun 프로모터, 또는 erg 프로모터를 포함한다.

본 발명의 고려된 범위 내에서 이용될 수 있는 유전자 발현을 위한 시스템은 프로게스테론, 에스트로겐, 및/또는 엑디손과 같은 화합물을 이용한 조절 시스템을 포함한다.

발현 작제물(expression construct)은 또한 화학적 유도성 프로모터 (review article: Gatz et al. (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48:89-108)를 포함할 수 있고, 그에 의해 이종 표적 유전자의 발현이 특정 시점에 조절될 수 있다. 그와 같은 프로모터, 예를 들면, 살리실산-유도성 프로모터 (WO 95/19443), 벤젠술폰아미드-유도성 프로모터 (EP 0 388 186), 테트라사이클린-유도성 프로모터 (Gatz et al. (1991) Mol Gen Genetics 227:229-237), 아브시스산-유도성 프로모터 (EP 0 335 528) 또는 에탄올-시클로헥사논-유도성 프로모터 (WO 93/21334)가 마찬가지로 이용될 수 있다. 또한 적절한 것은 외부에서 첨가된 안정화제(safener), 예를 들면, N,N-디알릴-2,2-디클로로아세트아미드(WO 93/01294)에 의해 활성화될 수 있고, 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물의 다수의 조직에서 작동가능한, 글루타치온-S 트랜스퍼라아제 이소형 II 유전자 (GST-II-27)의 프로모터이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 추가적인 예시적 유도성 프로모터는 구리에 반응하는 ACE1 시스템으로부터의 프로모터를 포함한다(Mett et al. PNAS 90: 4567-4571 (1993)). 예시적인 유도성 프로모터는 스테로이드 호르몬 유전자로부터의 유도성 프로모터이고, 그의 전사 활성은 글루코코르티코스테로이드 호르몬에 의해 유도된다 (Schena et al. (1991) Proc Nat'l Acad Sci USA 88:10421).

( ii ) 리프레서 프로모터( Repressor promoter )

본 발명에서 고려되는 프로모터는 종종 본 명세서에서 "리프레서 프로모터"로 지칭되는, 조건적 프로모터(conditional promoter)를 포함한다. 조건적 프로모터 또는 리프레서 프로모터는 특정 조건 하에서만 활성을 갖는 프로모터이다. 예를 들면, 조건적 프로모터는 화학적 화합물, 또는 "리프레서 단백질(repressor protein)"로 지칭되는 특정한 단백질과 같은 특정한 리프레서 물질(repressor agent)이 존재하는 경우, 비활성이거나 또는 억제될 수 있다. 리프레서 물질이 더 이상 존재하지 않는 경우, 전사가 활성화되거나 또는 탈-억제된다. 조건적 프로모터의 예는 메티오닌 농도의 함수로 조절될 수 있는 프로모터 Met25 (Kerjan P. et al., 1986), 또는 갈락토오스 농도의 함수로 조절될 수 있는 프로모터 GAL1 또는 GAL10 (Johnston and Davis, 1984)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

리프레서 프로모터는 그의 전사 촉진 능력이 프로모터를 억제하고, 따라서, 그 프로모터의 영향 하에 있는 폴리뉴클레오티드의 전사를 감소, 저해, 또는 억제하기 위해 작용하는 화합물 또는 단백질인, 리프레서의 존재 또는 작용에 적어도 부분적으로 반응하는 것인 프로모터이다. 억제성 프로모터(repressible promoter)는 리프레서가 존재하지 않거나, 그의 영향 하에 있지 않거나, 또는 그와 접촉하지 않는 경우에 비해, 리프레서가 존재하거나, 그의 영향 하에 있거나, 또는 그와 접촉한 경우에 보다 낮은 전사 활성을 초래하는 것을 특징으로 한다. 리프레서는 내재적일 수 있거나, 또는 억제성 프로모터의 억제에서 활성을 갖도록 투여되는, 정상적으로 외부에서 유래된 화합물 또는 단백질일 수 있다. 리프레서, 즉, 화합물 또는 단백질의 제공은 그 자체로 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있는 폴리뉴클레오티드의 전사 또는 발현의 결과일 수 있다.

특정한 구체예에서, 본 명세서에 개시된 핵산 작제물은 핵산 작제물의 RNAi 작용제의 발현을 전사적으로 조절할 수 있는 리프레서 프로모터를 포함한다. 일부 구체예에서, 리프레서 프로모터에 대한 리프레서 단백질(repressor protein to the repressor promoter)의 발현은 유도성 프로모터 또는 구성적 프로모터에 의해 전사적으로 제어될 수 있다.

일부 구체예에서, 외부 자극에 의해 제어될 수 있는 프로모터가 본 발명의 방법 및 조성물에서 이용된다. 외부 자극에 의해 제어될 수 있는 프로모터의 예는, 예를 들면, P_L 프로모터, P_R 프로모터, P_re 프로모터, P_rm 프로모터, P'_R 프로모터, T₇ 후기 프로모터, trp 프로모터, tac 프로모터, lac 프로모터, gal 프로모터, ara 프로모터 또는 recA 프로모터 또는 그의 단편을 포함한다. 특정한 구체예에서, 이와 같은 프로모터의 오러레이터 서열이 본 발명의 핵산 작제물 및 시스템에서 이용된다.

본 발명의 특정한 구체예에서, 발현의 제어는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 성분을 포함하는 특정한 시스템의 이용을 통해 생성된다. 원핵생물 및 진핵생물 모두에서, DNA 상의 특정한 부위에 대한 친화도를 갖는 폴리펩티드가 유전자의 전사적 발현을 조절하고, 유전자의 특정한 부위에서 DNA와, 본 명세서에서 "리프레서 단백질" 또는 "리프레서"로 지칭되는 폴리펩티드 간의 상호작용이 예를 들면, DNA가 RNA 폴리머라아제에 접근할 수 없게 하는 것에 의해 전사를 방해한다.

통상적으로, 본 명세서에 개시된 LTRi 작제물은 하나 이상의 tet 오퍼레이터 (tetO) 서열에 작동가능하게 연결된 RANi 작용제를 포함한다. tetO 서열은 예를 들면, 본 명세서에 내용 전체가 참조에 의해 포함된, Hillen & Wissmann, "Topics in Molecular and Structural Biology," in Protein-Nucleic Acid Interaction, Saeger & Heinemann, eds., Macmillan, London, 1989, Vol. 10, pp. 143-162에 의해 수득될 수 있다. 본 발명의 실시에서 이용될 수 있는 다른 tetO 서열이 Genbank로부터 수득될 수 있고 및/또는 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된, Waters, S. H. et al. (1983) Nucl. Acids Res. 11:6089-6105; Hillen, W. and Schollmeier, K. (1983) Nucl. Acids Res. 11:525-539; Stuber, D. and Bujard, H. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:167-171; Unger, B. et al. (1984) Nucl Acids Res. 12:7693-7703; 및 Tovar, K. et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 215:76-80에 개시된다. tet 오퍼레이터 서열의 1개, 2개 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 또는 그 이상의 카피가 이용될 수 있고, 일부 구체예에서, 보다 많은 수의 그와 같은 서열은 강화된 범위의 조절을 가능하게 한다.

그러나, 다른 리프레서 도메인은 ERD 또는 SID 전사 리프레서 도메인을 포함하고, 예를 들면, 전사 리프레서로 작용하는 전사 인자 및 전사 인자 도메인은, 예를 들면, MAD (예를 들면, Sommer et al., 1998; Gupta et al., 1998; Queva et al., 1998; Larsson et al., 1997; Laherty et al., 1997; and Cultraro et al., 1997 참조); FKHR (forkhead in rhapdosarcoma gene; Ginsberg et al., 1998; Epstein et al., 1998); EGR-1 (early growth response gene product-1; Yan et al., 1998; and Liu et al., 1998); ets2 리프레서 인자 리프레서 도메인 (ERD; Sgouras et al, 1995); 및 MAD smSIN3 상호작용 도메인 (SID; Ayer et al., 1996)을 포함한다.

DNA-결합 단백질은 직접 결합 메카니즘을 통한 억제와 관련된 구체예에서 이 폴리펩티드가 실제로 어떻게 DNA 분자와 접촉하고, 유전자 발현에 영향을 미치기 위해 상호작용하는 지를 결정하기 위해 광범위하게 규명되었다. 이 폴리펩티드의 일부 비-한정적 예는 구조 모티프 알파-헬릭스-턴-알파-헬릭스(alpha-helix-turn-alpha-helix)(H-T-H)를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 이 단백질은 대략 팔린드롬(palindromic) 서열을 갖는 특정한 오퍼레이터 서열에서 DNA에 이량체 또는 사량체로서 결합한다. B-형태 DNA의 주요 그루브(major groove) 중의 두 개의 부위 및 그 주위에서 각 단량체의 두 개의 인접한 알파 헬릭스에 의해 이루어진 접촉이 DNA와 이 단백질들 간의 인터페이스의 주요 특징이다. 이 방식으로 결합하는 단백질은 H-T-H 영역에서 서열 유사성(sequence similarity)을 공유하나, 다른 영역에서 유사성의 정도는 다양하다. 이 그룹의 단백질은, 예를 들면, 잠재성 박테리오파아지 리프레서 단백질(temperate bacteriophage repressor protein) 및 Cro 단백질, GalR, LacI, LexA, 및 TrpR과 같은 박테리아 대사 리프레서 단백질, 박테리아 활성자 단백질(bacterial activator protein) CAP 및 듀얼 활성자/리프레서(dual activator/repressor) 단백질 AraC, 박테리아 트랜스포손 및 플라스미드 TetR 단백질, 효모 교배형 조절자(yeast mating type regulator) 단백질 MATal 및 MATalpha2 및 진핵생물 호메오박스 단백질(eukaryotic homeobox protein)을 포함한다.

기타 리프레서는 H-T-H 결합 단백질에 대한 서열 상동성을 거의 또는 전혀 갖지 않고, H-T-H 결합 모티프를 갖지 않는다. 대략적인 팔린드롬 서열 대칭성을 갖는 오퍼레이터와의 결합이 이 그룹의 일부 단백질, 예를 들면, 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 박테리오파아지 P22 Mnt 단백질 (VERS87a) 및 대장균 TyrR 리프레서 단백질 (DEFE86)에서 관찰된다. 이 그룹의 다른 단백질들은 부분적으로 대칭성인 오퍼레이터 서열(살모넬라 티피뮤리움 파아지 P22 Arc 단백질, VERS87b; 대장균 Fur 단백질, DEL087; 플라스미드 R6K pi 단백질, FILU85) 또는 비-대칭성인 오퍼레이터 서열(phage Mu repressor, KRAU86)에 결합한다.

당업자는 본 발명에서 이용되는 리프레서 및/또는 DNA 결합 도메인이 돌연변이가 이 성분들의 개별적인 기능에 유해하게 영향을 미치지 않는 한, 야생형 대비 돌연변이를 포함할 수 있고, 이와 같은 돌연변이 성분들이 본 발명의 방법 및 조성물에서 이용될 수 있다는 것을 인식한다.

B. 유도제 및 유도성 시스템

본 명세서에 개시된 작용제의 투여 또는 제거는 이종 표적 유전자의 전사의 작동(on) 상태 또는 중단(off) 상태 간의 전환을 가져온다. 여러 소형 분자 리간드가 조직 배양 세포 및/또는 형질전환 동물 모델에서 조절된 유전자 발현을 매개하는 것으로 확인되었다. 이들은 FK1012 및 라파마이신 면역억제 약물(rapamycin immunosupressive drug)(Spencer et al., 1993; Magari et al., 1997), 프로게스테론 길항제 미페프리스톤 (RU486) (Wang, 1994; Wang et al., 1997), 테트라사이클린 항생제 유도체 (Gossen and Bujard, 1992; Gossen et al., 1995; Kistner et al., 1996), 및 곤충 스테로이드 호르몬 엑디손 (No et al., 1996)을 포함한다. 이 참조문헌 모두는 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.

추가적인 예로서, Yao는 참조에 의해 본 명세서에 포함된, 미국특허 제6,444,871호에서, 테트라사이클린 내성(tet) 리프레서 단백질이 포유동물 세포에서 전사를 조절하는 것을 알려진 폴리펩티드와 융합된 시스템인, 테트라사이클린 내성(tet) + 오페론과 결합된 원핵생물 요소를 개시한다. 상기 융합 단백질은 tet 오퍼레이터 서열의 배치에 의해 특정한 부위로 향하게 되었다. 예를 들면, tet 리프레서가 트랜스활성자(transactivator) (VP16)와 융합되고 선택된 유전자의 프로모터로부터 상류에 위치한 tet 오퍼레이터 서열에 표적화되었다(Gussen et al., 1992; Kim et al., 1995; Hennighausen et al., 1995). 상기 융합 단백질의 tet 리프레서 부분은 오퍼레이터에 결합하고, 이에 의해 VP16 활성자를 전사의 유도가 요구되는 특정한 부위로 표적화시킨다. 대안적인 접근방법은 tet 리프레서를 KRAB 리프레서 도메인에 융합시키고, 이 단백질을 유전자의 상류에 수백 bp(base pair) 떨어진 곳에 위치한 오퍼레이터에 표적화시키는 것이었다. 이 시스템을 이용하여, tet 리프레서 단독의 경우는 아니나, 키메라 단백질은 CMV-조절 유전자 발현의 10배 내지 15배 억제를 생성할 수 있다는 것을 발견했다 (Deuschle et al., 1995).

본 명세서의 방법 및 시스템에서 유용한 리프레서 프로모터의 일 예는 3가지 상이한 방식에 의해 유전자 발현을 조절하기 위해 이용된 대장균의 Lac 리프레서(lacR)/오퍼레이터/유도물질 시스템이다: (1) 프로모터 부위에 적절하게 배치된 lac 오퍼레이터에 의한 전사 개시의 방지(Hu and Davidson, 1987; Brown et al., 1987; Figge et al., 1988; Fuerst et al., 1989; Deuschle et al., 1989; (2) LacR/오퍼레이터 복합체에 의한 신장 동안 전사하는 RNA 폴리머라아제 II의 차단 (Deuschle et al. (1990); 및 (3) LacR과 HSV(herpes simples virus) VP16(virion protein 16) 간의 융합에 대응한 프로모터의 활성화 (Labow et al., 1990; Baim et al., 1991).

Lac 시스템의 일 버전에서, lac 오퍼레이터-연결 서열의 발현은 LacR-VP16 융합 단백질에 의해 구성적으로 활성화되고 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)의 존재시 중단(turn off)된다 (Labow et al. (1990), cited supra). 상기 시스템의 또 다른 버전에서, IPTG의 존재시 lac 오퍼레이터에 결합하는 lacR-VP16 변이체가 이용되고, 이는 세포의 온도를 증가시키는 것에 의해 강화될 수 있다 (Baim et al. (1991), cited supra). 따라서, 본 발명의 일부 구체예에서, Lac 시스템의 화합물이 이용된다. 예를 들면, lac 오퍼레이터 (LacO)는 조직 특이적 프로모터와 작동가능하게 연결될 수 있고, 이종 표적 유전자 및 Tet^R과 같은 제1 리프레서 단백질의 전사 및 발현을 제어할 수 있다. 따라서, siRNA의 발현(및 따라서, 이종 표적 유전자의 유전자 침묵)은 이종 표적 유전자의 발현 대비 역으로 조절되어, IPTG의 존재는 RNAi 발현의 저해 및 이종 표적 유전자 발현의 유도를 초래한다.

대장균의 테트라사이클린 (Tc) 내성 시스템의 성분들은 진핵생물 세포에서 기능하는 것으로 확인되었고 유전자 발현을 조절하기 위해 이용되었다. 예를 들면, 테트라사이클린의 부재시 tet 오퍼레이터 (tetO) 서열에 결합하고, 유전자 전사를 억제하는 Tet 리프레서 (TetR)는 tet 오퍼레이터 서열을 포함하는 프로모터로부터 전사를 억제하기 위해 충분히 높은 농도로 식물 세포에서 발현되었다(Gatz, C. et al. (1992) Plant J. 2:397-404). 본 발명의 일부 구체예에서, Tet 리프레서 시스템이 유사하게 이용된다.

온도-유도성 유전자 조절 시스템, 예를 들면, VP16 트랜스 활성자(transactivator)에 융합된 열 충격 반응성 조절자, rheA를 갖는 융합 단백질의 형태로 저온-유도성(cold-inducible) 트랜스 활성자를 포함하는 예시적인 TIGR 시스템이 또한 본 발명에서 이용될 수 있다 (Weber et al,. 2003a). 이 융합 온도센서(thermosensor)에 반응성인 프로모터는 최소 프로모터(minimal promoter), 예를 들면, 인간 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 프로모터(immediate early promoter)의 최소 버전에 작동가능하게 연결된 rheO 요소를 포함한다. 37℃의 허용(permissive) 온도에서, 저온-유도성 트랜스 활성자는 대표적인 rheO-CMV_min 프로모터를 트랜스활성화시켜, 표적 유전자의 발현을 가능하게 한다. 41℃에서, 저온-유도성 트랜스 활성자는 rheO 프로모터를 더 이상 트랜스활성화시키지 않는다.

본 발명에서 유용한 다른 구체예는 에리트로마이신(erythromycin), 클라리트로마이신(clarithromycin), 및 록시트로마이신(roxithromycin)과 같은 마크롤리드 항생제(macrolide antibiotic)에 반응하는 억제성(E_off) 및 유도성(E_on) 시스템을 갖는 대장균으로부터 유래된 에리트로마이신-내성 레귤론(regulon)을 포함한다(Weber et al., 2002). E_off 시스템은 에리트로마이신-의존적 트랜스 활성자를 이용하고, 마크롤리드 항생제의 제공은 이식 유전자의 발현을 억제한다. E_on 시스템에서, 리프레서의 오퍼레이터로의 결합은 이식 유전자 발현의 억제를 초래한다. 이때, 마크롤리드의 존재시, 유전자 발현이 유도된다.

Fussenegger 등 (2000)은 스트렙토마이세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor)의 스트렙토그라민(streptogramin) 내성 오페론에 의해 코딩된 Pip(프리스티나마이신-유도 단백질) 리프레서를 이용한 억제성 및 유도성 시스템으로서, 상기 시스템은 스트렙토그라민-타입 항생제(예를 들면, 프리스티나마이신, 비르기니아마이신(virginiamycin), 및 시네르시드(Synercid))에 반응하는 것인 시스템을 기재한다. Pip DNA-결합 도메인은 예를 들면, VP16 트랜스 활성화 도메인 또는 KRAB 침묵화(silencing) 도메인에 융합된다. 예를 들면, 프리스티나마이신의 존재 또는 부재는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 그들의 개별적인 방식으로, PipON 및 PipOFF 시스템을 조절한다.

이식 유전자 발현 시스템의 또 다른 예는 쿼럼 센싱(quorum-sensing) (리프레서의 오퍼레이터 부위로의 결합을 방해하여, 표적 레귤론의 탈억제(derepression)를 초래하는, 확산성(diffusable) 신호 분자를 갖는 특정한 원핵생물 분자 컴뮤니케이션 시스템을 의미함) 시스템을 이용한다. 예를 들면, Weber 등 (2003b)은 융합 단백질이 결합하는 개별적인 오퍼레이터를 갖는 키메라 프로모터를 조절하는 트랜스 활성화 도메인에 대한 스트렙토마이세스 코엘리컬러 쿼럼-센싱(sending) 수용체를 포함하는 융합 단백질을 이용한다. 그 발현은 SCB1 및 MP133과 같은, 무독성 부티로락톤에 의해 미세-조정된다.

특정한 구체예에서, 상호 간에 기능적으로 적합한 다중조절 다중유전자 치료 유전자 발현 시스템(multiregulated multigene therapeutic gene expression system)이 본 발명에서 이용된다 (예를 들면, Kramer et al. (2003) 참조). 예를 들면, Weber 등 (2002)에서, 마크롤리드-반응성 에리트로마이신 내성 레귤론 시스템이 스트렙토그라민 (PIP)-조절 및 테트라사이클-조절 발현 시스템과 함께 이용된다.

일부 구체예에서, 유도성 프로모터는 열-유도성(heat-inducible) 프로모터일 수 있다. 열 충격 유전자(예를 들면, hsp20-30, hsp27, hsp40, hsp60, hsp70, 및 hsp90) 중 열-반응성 요소를 포함하나, 이에 한정되지 않는 열-유도성 프로모터가 본 발명의 방법에 따라 이용될 수 있다. Easton et al. (2000) Cell Stress Chaperones 5(4):276-290; Csermely et al. (1998) Pharmacol Ther 79(2): 129-1 68; Ohtsuka & Hata (2000) Int J Hyperthermia 16(3):231-245; 및 그에 인용된 참조문헌을 참조한다. 열 충격 단백질 및 열-반응성 프로모터 요소에 대한 서열 유사성(sequence similarity)이 또한 원래 다른 기능을 특징으로 가졌던 유전자에서 인식되었고, 열 유도성을 부여하는 DNA 서열은 개시된 유전자 요법 벡터에서 사용하기에 적합하다. 예를 들면, 글루코오스-반응성 유전자 (예를 들면, grp94, grp78, 모르탈린/grp75) (Merrick et al. (1997) Cancer Lett 119(2): 185-1 90; Kiang et al. (1998) FASEB J 12(14):1571-16-579), 칼레티큘린(calreticulin) (Szewczenko-Pawlikowski et al. (1997) Mol Cell Biochem 177(1-2): 145-152); 클러스테린 (Viard et al. (1999) J Invest Dermatol 112(3):290-296; Michel et al. (1997) Biochem J 328(Ptl):45-50; Clark & Griswold (1997) J Androl 18(3):257-263), 조직 적합성(histocompatibility) 클래스 I 유전자 (HLA-G) (Ibrahim et al. (2000) Cell Stress Chaperones 5(3):207-218), 및 아밀로이드 전구체 단백질의 Kunitz 프로테아제 이소형 (Shepherd et al. (2000) Neuroscience 99(2):31 7-325)의 발현이 열에 반응하여 상향조절된다.

클러스테린의 경우, 열-유도성을 위해 충분한 14개의 염기쌍 요소가 기술되었다(Michel et al. (1997) Biochem J 328(Pt1):45-50). 유사하게, 칼레티큘린 프로모터 영역에 10-염기쌍 및 14-염기쌍 요소를 포함하는 2 서열 유닛이 열-유도성을 부여하는 것을 확인되었다 (Szewczenko-Pawlikowski et al. (1997) Mol Cell Biochem 177(1-2): 145-1 52). 열이 아닌 자극에 반응하는 다른 프로모터가 이용될 수 있다. 예를 들면, 모르탈린(mortalin) 프로모터는 낮은 투여량의 이온화 방사선에 의해 유도되고 (Sadekova (1997) Int J Radiat Biol 72(6):653-660), hsp27 프로모터는 17.베타.-에스트라디올 및 에스트로겐 수용체 아고니스트에 의해 유도되며 (Porter et al. (2001) J Mol Endocrinol 26(1):31-42), HLA-G 프로모터는 아비산염에 의해 유도되고, hsp 프로모터는 광역학 요법(photodynamic therapy)에 의해 활성화될 수 있다 (Luna et al. (2000) Cancer Res 60(6): 1637-1 644). 적절한 프로모터는 조직-특이적 활성화와 같은 인자를 내포할 수 있다. 예를 들면, hsp70은 스트레스 상태(stressed)의 신경모세포종 세포에서 전사적으로 손상된다 (Drujan & De Maio (1999) 12(6):443-448). 모르탈린 프로모터는 인간 뇌 종양에서 상향-조절된다 (Takano et al. (1997) Exp Cell Res 237(1):38-45). 본 발명의 방법에서 이용된 프로모터, 예를 들면, 모르탈린 (Takano et al. (1997) Exp Cell Res 237(1):38-45), hsp27 및 칼레티큘린 (Szewczenko-Pawlikowski et al. (1997) Mol Cell Biochem 177(1-2): 145-1 52; Yu et al. (2000) Electrophoresis 21(14):3058-3068), grp94 및 grp78 (Gazitet al. (1999) Breast Cancer Res Treat 54(2): 135-146), hsp27, hsp70, hsp73, 및 hsp90 (Cardillo et al. (2000) Anticancer Res 20(6B):4579-4583; Strik et al. (2000) Anticancer Res 20(6B):4457-4552)에 대한 프로모터가 전술된 바와 같은 종양 세포에서 선택적 상향-조절을 보일 수 있다.

C. 조직-특이적 프로모터

본 발명의 특정한 양태에서, 조직-특이적 프로모터가 특정한 세포 또는 조직(예를 들면, 지방 세포)에서 항암제를 발현하기 위해 이용된다. 따라서, 조직-특이적 프로모터의 이용은 항암제의 발현 조절의 추가적인 수준을 제공하여, 예를 들면, 항암제가 ASC에서만 발현되게 할 수 있다.

분자 생물학 분야의 당업자는 일반적으로 단백질 발현을 위한 프로모터와 세포 종류 조합의 용도를 알고 있고, 예를 들면, 참조에 의해 본 명세서에 포함된 Sambrook et al. (1989)을 참조한다. 이용되는 프로모터는 구성적이거나, 조직-특이적이거나, 유도성일 수 있고, 및/또는 재조합 단백질 및/또는 펩티드의 대량 생산에서 유리하도록, 도입된 DNA 세그먼트의 고수준 발현을 지시하기 위해 적절한 조건 하에 유용할 수 있다. 프로모터는 이종기원이거나 또는 내재적인 것일 수 있다. 특정한 구체예에서, 본 발명에서 이용된 프로모터는 조직-특이적 프로모터이다.

다양한 프로모터가 동물, 포유동물 또는 인간 개체에서 서열을 발현하기 위해 당해 기술 분야에서 현재 이용되고 있다. 대부분의 프로모터는 조직-특이성이 결여되어 있고, 유리하게 본 명세서에서 제공된 교시와 조합될 수 있다. 예를 들면, 프로모터는 perbB2 프로모터, 유청 산성 단백질(whey acidic protein) 프로모터, 스트로멜리신(stromelysin) 3 프로모터, 전립선 특이적 항원 프로모터, 프로바신(probasin) 프로모터로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

일부 구체예에서, 기타 조직 특이적 프로모터는 예를 들면, 알부민 (간-특이적, Pinkert et al., (1987)), 림프 특이적 프로모터(lymphoid specific promoter) (Calame and Eaton, 1988), 특히, T-세포 수용체 (Winoto and Baltimore, (1989)) 및 면역글로불린의 프로모터; Banerji et al., (1983); Queen and Baltimore, 1983), 뉴런 특이적 프로모터 (예를 들면, 신경미세섬유(neurofilament) 프로모터; Byrne and Ruddle, 1989), 췌장 특이적 프로모터 (Edlund et al., (1985)) 또는 유선 특이적 프로모터 (유청 프로모터, 미국특허 제4,873,316호 및 유럽출원공개 제264,166호) 및 발생적으로 조절되는 프로모터(developmentally regulated promoter) 예를 들면, 마우스 혹스 프로모터(murine hox promoter)(Kessel and Cruss, Science 249:374-379 (1990)) 또는 α-태아단백질(fetoprotein) 프로모터(Campes and Tilghman, Genes Dev. 3:537-546 (1989))를 포함하나, 이에 한정되지 않고, 참조 문헌 각각의 내용은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 바람직하게는, 프로모터는 개별적인 세포 종류에서 구성적이다.

조직-특이적 프로모터 또는 요소의 실체, 및 그들의 활성을 규명하는 분석법이 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 그와 같은 영역의 예는 인간 LIMK2 유전자 (Nomoto et al. 1999), 소마토스타틴(somatostatin) 수용체 2 유전자 (Kraus et al., 1998), 마우스 부고환 레티노산-결합 유전자(murine epididymal retinoic acid-binding gene) (Lareyre et al., 1999), 인간 CD4 (Zhao-Emonet et al., 1998), 마우스 알파2 (XI) 콜라겐 (Tsumaki, et al., 1998), D1A 도파민 수용체 유전자 (Lee, et al., 1997), 인슐린-유사 성장 인자 II (Wu et al., 1997), 인간 혈소판 내피 세포 부착 분자(human platelet endothelial cell adhesion molecule)-1 (Almendro et al., 1996), 및 SM22.알파 프로모터를 포함한다. 조직-특이적 프로모터 및/또는 조절 요소가 특정한 구체예에서, 유용할 것이다. 본 발명의 발현 벡터와 함께 이용될 수 있는 그와 같은 조직-특이적 프로모터의 다른 예는 결장 표피 세포에 특이적인 간 지방산 결합(FAB) 단백질; 췌장 세포에 특이적인 인슐린 유전자; 간세포에 특이적인, 트랜스피레틴(transphyretin), .알파.1-안티트립신, 플라스미노겐 활성자 저해제 타입 1(PAI-1), 아포리포프로테인 AI 및 LDL 수용체 유전자; 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)에 특이적인 MBP(myelin basic protein) 유전자; 신경교 세포에 특이적인, GFAP(glial fibrillary acidic protein) 유전자; 눈의 표적화를 위해 특이적인 OPSIN으로부터의 프로모터; 및 신경 세포에 특이적인 NSE(neural-specific enolase) 프로모터를 포함한다.

덱틴(dectin)-1 및 덱틴-2 프로모터도 본 발명에서 유용한 것으로 고려된다. 또한, 프로모터/인핸서 조합(Eukaryotic Promoter Data Base EPDB)이 또한 올리고사카라이드 가공 효소, 단백질 폴딩 부속 단백질(protein folding accessory protein), 선택 마커 단백질 또는 목적 이종 단백질(heterologous protein of interest)을 코딩하는 구조 유전자의 발현을 구동하기 위해 이용될 수 있다. 대안적으로, 암 유전자 요법과 같은 유전자 요법을 위한 조직-특이적 프로모터가 본 발명에서 이용될 수 있다.

조직-특이적 프로모터의 예는 근육 및 심장 조직에서 발현을 지시하기 위해 이용된 크레아틴 키나아제의 프로모터, 및 B 세포에서 발현을 위한 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 기타 조직 특이적 프로모터는 인간 평활근 알파-액틴 프로모터를 포함한다. 예시적인 간에 대한 조직-특이적 발현 요소는 HMG-COA 리덕타아제 프로모터, 스테롤 조절 요소(sterol regulatory element) 1, 포스포에놀 피루베이트 카르복시 키나아제(PEPCK) 프로모터, 인간 C-반응성 단백질 (CRP) 프로모터, 인간 글루코키나아제 프로모터, 콜레스테롤 L7-알파 히드로일라아제 (CYP-7) 프로모터, 베타-갈락토시다아제 알파-2,6 시알릴트랜스퍼라아제 프로모터, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 (IGFBP-1) 프로모터, 알돌라아제 B 프로모터, 인간 트랜스페린 프로모터, 및 콜라겐 타입 I 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 전립선에 대한 조직-특이적 발현 요소는 PAP(prostatic acid phosphatase) 프로모터, PSP 94(prostatic secretory protein of 94) 프로모터, 전립선 특이적 항원 복합체 프로모터, 및 hgt-1(human glandular kallikrein) 유전자 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 위 조직에 대한 조직-특이적 발현 요소는 인간 H⁺/K⁺-ATPase 알파 서브유닛 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 췌장에 대한 조직-특이적 발현 요소는 PAP(pancreatitis associated protein promoter), 엘라스타아제 1 전사 인핸서, 췌장 특이적 아밀라아제 및 엘라스타아제 인핸서 프로모터, 및 췌장 콜레스테롤 에스테라아제 유전자 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 자궁 내막에 대한 조직-특이적 발현 요소는 자궁글로빈(uteroglobin) 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 부신 세포에 대한 조직-특이적 발현 요소는 콜레스테롤 곁사슬 절단(SCC) 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 전신 신경계(general nervous system)에 대한 조직-특이적 발현 요소는 감마-감마 에놀라아제(뉴런-특이적 에놀라아제, NSE) 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 뇌에 대한 조직-특이적 발현 요소는 신경미세섬유 중쇄(NF-H) 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 림프구에 대한 조직-특이적 발현 요소는 인간 CGL-l/그란자임(granzyme) B 프로모터, TdT(terminal deoxy transferase), 람다 5, VpreB, 및 lck (lymphocyte specific tyrosine protein kinase p561ck) 프로모터, 인간 CD2 프로모터 및 그의 3' 전사 인핸서, 및 인간 NK 및 T 세포 특이적 활성화 (NKG5) 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 클론에 대한 조직-특이적 발현 요소는 pp60c-src 티로신 키나아제 프로모터, OSN(organ-specific neoantigen) 프로모터, 및 결장-특이적 항원-P 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

일부 구체예에서, 유방 세포에 대한 조직-특이적 발현 요소는 예를 들면, 인간 알파-락트알부민 프로모터이나, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 폐에 대한 조직-특이적 발현 요소는 CFTR(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) 유전자 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

목적 조직에서 발현의 특이성을 보조하는 기타 요소는 분비 리더 서열(secretion leader sequence), 인핸서, 핵 국재화 신호(nuclear localization signal), 엔도좀 분해성(endosmolytic) 펩티드, 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 이 요소들은 특이성을 보조하기 위해 목적 조직으로부터 유래된다. 일반적으로, 인 비보 발현 요소는 필요한 경우, 전사의 개시와 관련된 5' 비-전사 및 5' 비-번역 서열을 포함할 것이다. 그들은 선택적으로 인핸서 서열 또는 상류 활성자 서열(upstream activator sequence)를 포함한다.

D. 구성적 프로모터

본 명세서에 개시된 바와 같이 ASC에 의해 발현될 항암제를 코딩하는 핵산 서열에서 유용한 구성적 프로모터의 예는 예를 들면, Boshart 등, (1985)에 의해 교시된 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터 IE, HSV-Tk (McKnight et al., (1984)) 및 β-액틴 프로모터(예를 들면, Ng 등, (1985)에 의해 기재된 바와 같은 인간 β-액틴 프로모터)와 같은 편재성 발현 프로모터(ubiquitously expressing promoter) 및, 이식 유전자의 통합 부위(integration) 독립적 발현을 가능하게 하는 제어 영역과 조합된 프로모터 (Grosveld et al., (1987))를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

구성적 포유동물 프로모터는 폴리머라아제 프로모터 및 하기 유전자에 대한 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다: HPTR(hypoxanthine phosphoribosyl transferase), 아데노신 데아미나아제(adenosine deaminase), 피루베이트 키나아제, 및 베타-액틴. 진핵생물 세포에서 구성적으로 기능하는 예시적인 바이러스 프로모터는 시미언 바이러스(simian virus), 파필로마 바이러스, 아데노바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), RSV(Rous sarcoma virus), 사이토메갈로바이러스, MLV(moloney leukemia virus) 및 기타 레트로바이러스의 LTR(long terminal repeat), 및 헤르페스 심플렉스 바이러스의 티미딘 키나아제 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 기타 구성적 프로모터가 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자에게 알려져 있다.

유도성 프로모터는 유도제의 존재 하에 발현되며, 금속-유도성 프로모터 및 스테로이드-조절 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터는 특정한 금속 이온의 존재 하에 전사를 촉진하기 위해 유도된다. 기타 유도성 프로모터가 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자에게 알려져 있다.

E. 기타 조절 요소

코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 특이적 개시 신호가 또한 요구될 수 있다. 이 신호는 ATG 개시 코돈 또는 인접 서열을 포함한다. ATG 개시 코돈을 포함한, 외래 번역 조절 서열이 제공되어야 할 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자는 용이하게 이를 결정할 수 있고 필요한 신호를 제공할 수 있을 것이다. 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해 원하는 코딩 서열의 해독 프레임과 "동일 프레임 내에(in-frame)" 존재해야 한다. 외래 번역 조절 서열 및 개시 코돈은 천연적이거나 또는 합성된 것일 수 있다. 발현의 효율은 적절한 전사 인핸서 요소의 내포에 의해 증가될 수 있다.

본 발명의 특정한 구체예에서, IRES(internal ribosome entry site)의 이용이 다중 유전자(multigene) 또는 다중시스트론(polycistronic) 메시지를 생성하기 위해 적용된다. IRES 요소는 5'-메틸화 Cap 의존성 번역의 리보솜 스캐닝 모델을 우회하고 내부 부위에서 번역을 개시할 수 있다 (Pelletier and Sonenberg, 1988). 피코알엔에이바이러스(picornavirus) 패밀리의 두 개의 일원(소아마비 및 뇌심근염(encephalomyocarditis)) 유래의 IRES 요소, 및 포유동물 메시지로부터의 IRES(Macejak and Sarnow, 1991)가 개시되었다. IRES 요소는 이종 개방 해독 프레임에 연결될 수 있다. 다중 개방 해독 프레임은 함께 전사되고, 각각 IRES에 의해 분리된, 다중시스트론 메시지를 생성할 수 있다. IRES 요소에 의해, 각각의 개방 해독 프레임은 효율적인 번역을 위해 리보솜에 접근가능하다. 복수의 유전자가 단일 메시지를 전사하기 위해 단일 프로모터/인핸서를 이용하여 효율적으로 번역될 수 있다 (참조에 의해 본 명세서에 포함된, 미국특허 제5,925,565호 및 제5,935,819호 참조).

일부 구체예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같이 ASC에 의해 발현될 항암제를 코딩하는 핵산 서열은 벡터를 처리(digest)하기 위해 표준 재조합 기술과 함께 이용될 수 있는, 복수 개의 제한효소 인식 부위를 포함하는 핵산 영역인, 다중 클로닝 부위(MCS)를 더 포함할 수 있다(참조에 의해 본 명세서에 포함된, Carbonelli et al., 1999, and Cocea, 1997 참조). "제한효소 처리(restriction enzyme digestion)"는 핵산 분자 중의 특이적 위치에서만 기능하는 효소에 의한 핵산 분자의 촉매적 절단(catalytic cleavage)을 의미한다. 이와 같은 제한 효소의 다수가 상업적으로 구매가능하다. 그와 같은 효소의 이용은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자에 의해 널리 이해된다. 빈번하게, 벡터는 MCS 내부를 절단하여 상기 벡터에 외래 서열이 라이게이션될 수 있게 하는 제한 효소를 이용하여 선형화되거나 또는 단편화될 수 있다. "라이게이션(ligation)"은 상호 간에 연속적이거나 또는 연속적이지 않을 수 있는, 두 개의 핵산 단편 간에 포스포디에스테르 결합을 형성하는 과정을 의미한다. 제한 효소 및 라이게이션 반응을 포함하는 기법이 재조합 기술의 분야에서 당업자에게 잘 알려져 있다. 일부 구체예에서, 다중 클로닝 부위는 하나의 이종 표적 유전자를 또 다른 이종 표적 유전자로 대체하기 위해 본 명세서에 개시된 바와 같이 핵산 작제물 및 조성물에서 유용하다.

대부분의 전사된 진핵생물 RNA 분자는 일차 전사물(primary transcript)로부터 인트론을 제거하기 위해 RNA 스플라이싱을 수행할 것이다. 게놈 진핵생물 서열을 포함하는 벡터는 단백질 발현을 위한 전사물의 적절한 가공을 보장하기 위해 공여체 및/또는 수용체 스플라이싱 부위를 필요로 할 수 있다. (참조에 의해 본 명세서에 포함된, Chandler et al., 1997 참조.)

일부 구체예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ASC에 의해 발현될 항암제를 코딩하는 핵산 서열은 하나 이상의 종결 신호를 더 포함할 수 있다. "종결 신호(termination signal)" 또는 "종결자(terminator)"는 RNA 폴리머라아제에 의한 RNA 전사물의 특이적 종결에 관여하는 DNA 서열로 구성된다. 따라서, 특정한 구체예에서, RNA 전사물의 생성을 종결시키는 종결 신호가 고려된다. 바람직한 메시지 수준을 달성하기 위해 생체 내에서 종결자가 필요할 수 있다.

F. 항암제를 코딩하는 핵산 서열의 기타 성분 .

A.리포터 유전자 및 선택적 마커 유전자

본 발명의 특정한 구체예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같이 발현될 항암제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 ASC는 핵산 작제물 중에 마커를 포함하는 것에 의해 생체 외에서(in vitro) 또는 생체 내에서 식별될 수 있다. 그와 같은 마커는 ASC에 식별가능한 변화를 부여하여, 발현 벡터를 포함하고 및/또는 항암제를 발현하는 ASC의 용이한 식별을 가능하게 한다. 일반적으로, 선택 마커(selectable marker)는 선택을 가능하게 하는 특성을 부여하는 마커이다. 양성 선택 마커는 마커의 존재가 그의 선택을 가능하게 하는 것인 마커이고, 음성 선택 마커는 그의 존재가 선택을 방지하는 것인 마커이다. 양성 선택 마커의 예는 약물 내성 마커이다.

리포터 유전자가 항암제를 발현하는 ASC를 식별하는 경우, 리포터 유전자 및/또는 선택 마커의 위치는 항암제를 코딩하는 핵산의 하류이고(즉, 3') 상기 항암제의 발현과 동일한 전사 제어(즉, 프로모터) 하에 있어서, 항암제의 발현이 일어나는 경우, 리포터 유전자의 발현도 일어난다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 항암제를 코딩하는 핵산 서열은 형질전환체(transformant)의 클로닝 및 식별을 보조할 약물 선택 마커를 더 포함하고, 예를 들면, 네오마이신, 퓨로마이신, 히그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티딘올에 대한 내성을 부여하는 유전자가 유용한 선택 마커이다. 조건의 구현에 근거하여 형질전환체의 구별을 가능하게 하는 표현형을 부여하는 마커 외에, 비색(colorimetic) 분석에 근거한, GFP와 같은 선별(screenable) 마커를 포함한, 다른 종류의 마커도 고려된다. 대안적으로, 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제 (tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 (CAT)와 같은 선별 효소(scrrenable enzyme)가 이용될 수 있다. 당업자는 가능하게는 FACS 분석과 함께, 면역학적 마커를 이용하는 방법을 알 것이다. 사용되는 마커는 유전자 산물을 코딩하는 핵산과 동시에 발현될 수 있는 한, 중요한 것을 사료되지 않는다. 선택 및 선별 마커의 추가적인 예가 당업자에게 잘 알려져 있다.

리포터 유전자는 용이하게 정량가능한 단백질을 코딩하고, 그들의 색 또는 효소 활성을 통해, 형질감염 효율, 발현 부위, 또는 발현의 배수(time of expression)의 평가를 가능하게 한다. 일부 구체예에서, (Schenborn and Groskreutz (1999) Mol Biotechnol 13(1):29-44) 녹색 형광 단백질 (GFP) (Haseloff et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(6):2122-2127; Sheen et al. (1995) Plant J 8(5):777-784; Reichel et al. 1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(12):5888-5893; Chui et al. (1996) Curr Biol 6:325-330; Leffel et al. (1997) Biotechniques. 23(5):912-8; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep16:267-271 ; WO 97/41228), 클로람페니콜 트랜스퍼라아제, 루시퍼라아제 (Millar et al.(1992) Plant Mol Biol Rep 10:324-414; Ow et al. (1986) Science 234:856-859), 에쿼린(aequorin) 유전자 (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3): 1259-1268), β-갈락토시다아제, R 로커스(locus) 유전자(식물 조직 중 안토시아닌 색소의 생성(적색 착색)을 조절하여, 추가적인 부수적 물질이나 발색 기질의 첨가 없이 프로모터 활성의 직접적인 분석을 가능하게 함) (Dellaporta et al. (1988) In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11:263-282; Ludwig et al. (1990) Science 247:449)와 같은 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 유용하고, β-글루쿠로니다아제 (GUS)가 특히 바람직하다(Jefferson (1987b) Plant Mol Bio. Rep., 5:387-405; Jefferson et al.(1987) EMBO J 6:3901-3907). β-글루쿠로니다아제 (GUS) 발현은 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-글루쿠론산과 조직의 인큐베이션 후, 청색에 의해 검출되고, 박테리아 루시퍼라아제 (LUX) 발현은 발광에 의해 검출되며, 반딧불이 루시퍼라아제(LUC) 발현은 루시페린과의 인큐베이션 후 발광에 의해 검출되고, 갈락토시다아제 발현은 조직을 5-브로모-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노시드로 염색한 후, 밝은 청색(bright blue color)에 의해 검출된다. 리포터 유전자는 또한 항생제 내성 마커에 대한 대안으로 평가가능(scorable) 마커로 이용될 수 있다. 그와 같은 마커는 이종 표적 유전자의 발현의 존재를 검출하거나 또는 그 수준을 평가하기 위해 이용된다.

항암제를 코딩하는 핵산 서열의 ASC 로의 도입

형질감염은 지방-유래 기질 세포(ASC)와 같은 수용 세포(recipient cell)에 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산 작제물을 도입하는 것이다. 일부 구체예에서, 상기 ASC는 암을 갖는 개체로부터 유래된다. 효율적인 형질감염은 핵산 작제물의 원하는 세포로의 도입을 촉진하는 벡터를 요구하고, 일부 구체예에서, 염색체로의 통합(chromosomal integration)을 위한 메카니즘을 제공하고, 그 핵산에 의해 코딩된 형질 또는 단백질의 적절한 발현을 제공할 수 있다. 세포 형질감염을 위한 효율적이고, 신뢰가능하고, 안전한 벡터의 설계 및 작제가 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 본 발명에서, 본 명세서에 개시된 핵산 작제물의 표적 세포, 조직, 또는 개체로의 전달 및 게놈 삽입을 매개할 수 있는 벡터가 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 고려된다.

바이러스 벡터:

본 발명은 또한 ASC에 프로모터에 작동가능하게 연결된 항암제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물 또는 벡터로 형질도입(transduce)을 수행하는 방법을 제공한다.

벡터는 바이러스 벡터 또는 비-바이러스(non-viral) 벡터일 수 있다. 적절한 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 레트로바이러스, 슈도타입 레트로바이러스(pseudotyped retrovirus), 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스(Semiliki forest virus), 및 바큘로바이러스(baculovirus)를 포함한다. 적절한 비-바이러스 벡터는 플라스미드, 유중수 에멀젼(water-oil emulsion), 폴리에틸렌 이민, 덴드리머(dendrimer), 미셀(micelle),마이크로캡슐(microcapsule), 리포좀, 및 양이온성 지질을 포함한다. 유전자 요법 작제물(gene therapy construct)을 위한 폴리머 담체가 Goldman et al (1997) Nat Biotechnol 15:462 및 미국특허 제4,551,482호 및 제5,714,166호에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. 펩티드 담체가 미국특허 제5,574,172호에 기재된다.

적절한 경우, 두 종류 이상의 벡터가 함께 이용될 수 있다. 예를 들면, 플라스미드 벡터가 리포좀과 함께 이용될 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, 본 명세서에 개시된 핵산 작제물이 아데노바이러스, 플라스미드, 또는 리포좀과 함께 이용되고, 각각이 본 명세서에서 하기에 더 설명된다.

바람직한 경우, 벡터, 특히, 바이러스 벡터가 본 발명의 작제물의 핵산을 형질전환 또는 형질감염될 세포의 게놈으로 통합시키기 위해 선택될 수 있다. 특정한 세포 마커에 대한 친화도를 갖는 복합체에 리간드를 포함시키는 것이 또한 생체 내에서 상기 복합체의 전달을 강화시킬 수 있다.

리간드는 항체, 세포 표면 마커, 바이러스 펩티드 등을 포함하고, 이들은 복합체를 종양 혈관구조(tumor vasculature) 또는 종양 혈관 구조와 결합된 내피 세포, 또는 종양 세포 자체로 귀소(home)시키도록 작용한다. 복합체는 작제물 또는 작제물에 의해 코딩된 분비 치료 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 항체 리간드는 Her2/neu (verb-b2 조류 적혈구모세포 백혈병 바이러스 발암유전자 상동체(avian erythroblastic leukemia viral oncogene homologue) 2), CEA (carcinoembryonic antigen), 페리틴 수용체, 또는 종양 혈관구조와 연관된 마커 (인테그린, 조직 인자, 또는 베타-피브로넥틴 이소형)와 같은 종양 마커에 대해 특이적인 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 항체 또는 기타 리간드가 당해 분야에서 알려진 바와 같이, 리포좀 및 바이러스와 같은 담체에 커플링될 수 있다. 예를 들면, Neri et al. (1997) Nat BioTechnology 15:1271; Kirpotin et al. (1997) Biochemistry 36:66; Cheng (1996) Human Gene Therapy 7:275; Pasqualini et al. (1997) Nat Biotechnology 15:542; Park et al. (1997) Proc Am Ass Cane Res 38:342 (1997); Nabel (1997) "Vectors for Gene Therapy" in Current Protocols in Human Genetics on CDROM, John Wiley & Sons, New York, N.Y.; 미국특허 제6,071,890호; 및 유럽특허 제 0 439 095호 참조. 대안적으로, 레트로바이러스의 슈도타이핑(pseudotyping)이 특정한 세포로 바이러스를 표적화시키기 위해 이용될 수 있다(Marin et al. (1997) MoI Med Today 3:396).

본 발명의 바이러스 벡터는 바람직하게는 장애를 가지며(disabled), 예를 들면, 복제-결함(replication-deficient)이다. 즉, 이들은 복제를 위해 요구되는 하나 이상의 기능성 유전자가 결핍되어, 생체 내에서 비제어 복제(uncontorlled replication)가 방지되고, 바이러스 감염의 바람직하지 않은 부작용이 회피된다. 바람직하게는, 치료 유전자를 바이러스 외피(viral coat) 또는 캡시드(capsid)에 결합시켜 바이러스 게놈을 패키징하기 위해 요구되는 최소한의 게놈 요소를 제외하고는 모든 바이러스 게놈이 제거된다. 예를 들면, LTR(Long Terminal Repeat) 또는 ITR(Inverted Terminal Repeat) 및 패키징 신호(packaging signal)를 제외하고는 모든 바이러스 게놈을 결실시키는 것이 바람직하다. 아데노바이러스의 경우, 결실은 통상적으로 E1 영역에서 이루어지고, 선택적으로, E2, E3 및/또는 E4 영역 중 하나 이상에서 이루어진다. 레트로바이러스의 경우, 복제를 위해 요구되는 유전자, 예를 들면, env 및/또는 gag/pol이 결실될 수 있다.

서열의 결실은 재조합 수단에 의해, 예를 들면, 적절한 제한 효소에 의한 처리(digestion), 및 뒤이은 재라이게이션(religation)을 포함하는 수단에 의해 달성될 수 있다. 복제 가능 자가-제어 또는 자가-파괴(replication competent self-limiting or self-destructing) 바이러스 벡터가 또한 이용될 수 있다. 본 발명의 핵산 작제물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 적절한 수단에 의해 바이러스 게놈에 내포될 수 있다. 통상적으로, 그와 같은 내포(incorporation)는 핵산 작제물을 바이러스의 게놈 중의 적절한 제한효소 인식 부위(restriction site) 내로 라이게이션시키는 것에 의해 수행될 것이다. 그 후, 바이러스 게놈은 적절한 절차에 의해 바이러스 외피 또는 캡시드 내로 패키징될 수 있다. 특히, 적절한 패키징 세포주(packaging cell line)가 본 발명의 바이러스 벡터를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 이와 같은 패키징 세포주는 그들의 게놈 내에 복제-결함 게놈으로부터 결실된 유전자를 포함하기 때문에, 본 발명의 복제-결함 바이러스 게놈을 보완한다. 따라서, 패키징 세포주의 이용은 배양물에서 본 발명의 바이러스 벡터가 생성될 수 있게 한다. 레트로바이러스를 위한 적절한 패키징 세포주는 PA317 세포, .psi.-2 세포, CRE 세포, CRIP 세포, E-86-GP 세포, 및 293GP 세포의 유도체를 포함한다. 세포주 293 세포는 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스를 위해 이용될 수 있다.

유전자 요법 작제물을 세포 내로 도입하는 적절한 방법은 세포, 또는 세포 매스로의 직접적인 주사, 입자-매개 유전자 전달(particle-mediated gene transfer), 전기천공, DEAE-Dextran 형질감염, 리포좀-매개 형질감염, 바이러스 감염, 및 이들의 조합을 포함한다. 전달 방법은 벡터 종류, 코딩된 유전자의 독성, 및 치료대상 상태 등의 고려에 근거하여 선택된다.

다양한 종류의 바이러스가 벡터를 위한 기반을 형성했다. 바이러스 감염은 바이러스 게놈의 숙주 세포 내로의 도입을 포함한다. 이 특성은 바이러스 기반 벡터에서 유전자 전달 비히클로서의 용도를 위해 함께 선택(co-opt)된다. 사용된 바이러스는 종종 세포를 형질감염시키기 위해 필요한 다수의 형질 및 능력을 갖는 병원성 바이러스 종으로부터 유래된다. 그러나, 모든 바이러스가 세포 주기의 모든 단계에서 모든 세포 종류를 성공적으로 형질감염시키는 것은 아니다. 따라서, 바이러스 벡터의 개발에서, 바이러스 게놈은 종종 형질전환 유전자 작제물(이식 유전자) 또는 기타 핵산의 유용성 및 효과를 강화시키기 위해 변형된다. 동시에, 그들의 질병 유발 능력을 경감시키거나 또는 제거하기 위해 변형이 도입될 수 있다. 따라서, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스 (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988); 아데노-연관 바이러스 (AAV) (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Hermonat and Muzycska, 1984); 및 헤르페스바이러스와 같은 바이러스로부터 유래된 바이러스 벡터가 본 발명에서 이용될 수 있다. 이들은 종종 다양한 포유동물 세포를 위해 여러 매력적인 특성을 부여한다 (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990). 백시니아 바이러스 (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988), 신드비스(sindbis) 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 및 헤르페스 심플렉스 바이러스와 같은 바이러스로부터 유래된 기타 바이러스 벡터도 또한 이용될 수 있다.

프로모터에 작동가능하게 연결된 항암제를 코딩하는 핵산 서열을 ASC에 형질감염시키기 위한 벡터가 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있다. CMV 프로모터와 같은, 강력한 비-특이적 프로모터를 이용한 과발현이 이용될 수 있으나, 발현 작제물 상에 조직- 또는 세포-특이적 프로모터를 포함시키는 것이 유용할 수 있다. 예를 들면, 지방 세포 프로모터 또는 기타 세포-타입-특이적 프로모터의 이용이 유리할 수 있다. 바이러스 벡터가 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있고 본 명세서에서 상세하게 검토된다.

이 벡터들은 본 발명의 방법에서의 사용을 위해 용이하게 개조될 수 있다. 발현될 유전자(예를 들면, TRAIL, BAX와 같은 아폽토시스 촉진 유전자, 또는 발암유전자에 대한 RNAi 작용제와 같은 핵산 저해제 및 기타 본 명세서에 개시된 항암제와 같은 항암제)를 코딩하는 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 선택된 발현/전달 벡터에 삽입하기 위해 재조합 DNA/분자 생물학 기법을 이용한 적절한 조작에 의해, 본 명세서에 기재된 방법의 실시를 위한 다수의 균등한 벡터가 생성될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자는 클로닝된 유전자가 단백질의 아미노산 서열을 변경시키기 위해 용이하게 조작될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

발현 벡터 및 숙주 세포의 예는 BL21, BL21(DE3) 및 AD494(DE3), Rosetta (DE3), 및 Origami(DE3) ((Novagen®)과 같은 대장균 숙주 세포에서 단백질 발현을 위한, pET 벡터 (Novagen®), pGEX 벡터 (GE Life Sciences), 및 pMAL 벡터 (New England labs. Inc.); CHO, COS, HEK-293, Jurkat, 및 MCF-7과 같은 포유동물 세포주에서 발현을 위한, 강력한 CMV 프로모터-기반 pcDNA3.1 (Invitrogen™ Inc.) 및 pCIneo 벡터(Promega); 아데노바이러스-매개 유전자 전달 및 포유동물 세포에서의 발현을 위한, 복제 불능(replication incompetent) 아데노바이러스 벡터 pAdeno X, pAd5F35, pLP-Adeno-X-CMV (Clontech®), pAd/CMV/V5-DEST, pAd-DEST 벡터 (Invitrogen™ Inc.); 레트로바이러스-매개 유전자 전달 및 포유동물 세포에서의 발현을 위한 Clontech로부터의 Retro-X 시스템과 사용하기 위한 pLNCX2, pLXSN, 및 pLAPSN 레트로바이러스 벡터; 렌티바이러스-매개 유전자 전달 및 포유동물 세포에서의 발현을 위한, pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™, 및 pLenti6.2/V5-GW/lacZ (INVITROGEN™ Inc.); 아데노-연관 바이러스-매개 유전자 전달 및 포유동물 세포에서의 발현을 위한, pAAV-MCS, pAAV-IRES-hrGFP, 및 pAAV-RC 벡터(Stratagene®)와 같은 아데노바이러스-연관 바이러스 발현 벡터; 스포도페라 프루기페르다(Spodopera frugiperda)9 (Sf9) 및 Sf11 곤충 세포주에서의 발현을 위한, BACpak6 바큘로바이러스 (Clontech®) 및 pFastBac™ HT (Invitrogen™ Inc.); 드로소필라 슈나이더(Drosophila Schneider) S2 세포에서의 발현을 위한 pMT/BiP/V5-His (Invitrogen™ Inc.); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서의 발현을 위한 피키아 발현 벡터 pPICZα, pPICZ, pFLDα 및 pFLD (Invitrogen™ Inc.) 및 피키아 메타놀리카(P. methanolica)에서의 발현을 위한 벡터 pMETα 및 pMET; 효모 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)에서의 발현을 위한, pYES2/GS 및 pYD1 (Invitrogen™ Inc.) 벡터이다. 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii)에서 이종 단백질의 대량 발현의 최근 진보가 Griesbeck C. 등, 2006 Mol. Biotechnol. 34:213-33 및 Fuhrmann M. 2004, Methods Mol Med. 94:191-5에 의해 기재된다. 외래 이종 코딩 서열이 핵, 엽록체, 및 미토콘드리아의 게놈 내에 상동성 재조합(homologous recombination)에 의해 삽입된다. 스펙티노마이신 또는 스트렙토마이신에 대한 내성을 부여하는, 가장 만능의 염록체 선택 마커 아미노글리코시드 아데닐 트랜스퍼라아제(aadA)를 갖는 엽록체 발현 벡터 p64가 엽록체에서 외래 단백질을 발현시키기 위해 이용될 수 있다. 생물학적 유전자 총 방법(biolistic gene gun method)이 벡터를 조류(algae)에 도입하기 위해 이용된다. 엽록체에 도입된 후, 외래 DNA가 유전자 총 입자로부터 방출되고 상동성 재조합을 통해 엽록체 게놈 내에 삽입된다.

일 구체예에서, 발현 벡터는 렌티바이러스, 아데노바이러스, 또는 아데노-연관 바이러스와 같은, 바이러스 벡터이다. 재조합 아데노바이러스의 생성을 위한 단순화된 시스템이 예를 들면, He TC. et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:2509-2514, 1998에 의해 제시된다. 목적 유전자가 먼저, 셔틀 벡터(shuttle vector), 예를 들면, pAdTrack-CMV 내로 클로닝된다. 결과적으로 수득된 플라스미드를 제한효소 PmeI에 의해 처리하여 선형화시키고, 뒤이어, 아데노바이러스 백본 플라스미드, 예를 들면, Stratagene^®'s AdEasy™ Adenoviral Vector System의 pAdEasy-1과 함께, 대장균 BJ5183 세포 내로 형질전환시킨다. 재조합 아데노바이러스 벡터를 카나마이신 내성에 대해 선택하고, 제한효소 분석에 의해 재조합을 확인한다. 최종적으로, 선형화된 재조합 플라스미드를 아데노바이러스 패키징 세포주, 예를 들면, HEK 293 세포 (E1-형질감염 인간 배아 신장 세포) 또는 911 (E1-형질감염 인간 배아 망막 세포) (Human Gene Therapy 7:215-222, 1996)에 형질감염시킨다. HEK 293 세포 내에 재조합 아데노바이러스가 생성된다.

일 구체예에서, 바람직한 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이고, 조혈 세포의 유전 질환 및 다양한 종류의 암을 위한 유전자 요법용 렌티바이러스의 용도의 다수의 예가 존재하며, 이 참조문헌들은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다(Klein, C. and Baum, C. (2004), Hematol. J., 5:103-111; Zufferey, R et. al. (1997), Nat. Biotechnol., 15:871-875; Morizono, K. et. al. (2005), Nat.Med., 11:346-352; Di Domenico, C. et. al. (2005). Hum.Gene Ther., 16:81-90). HIV-1 기반 렌티바이러스는 MoMLV(Moloney Leukemia Virus)-기반 레트로바이러스 시스템보다 더 광범위한 숙주 범위에 효과적으로 형질도입을 수행할 수 있다. 재조합 렌티바이러스의 제조는 pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™, 또는 Invitrogen™ Inc의 VIRAPOWER™ Lentiviral Expression 시스템과 함께 pLenti 벡터를 이용하여 수행될 수 있다.

일 구체예에서, 발현 바이러스 벡터는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터일 수 있다. rAAV 벡터를 이용하여, 유전자가 다수의 다양한 인간 및 비-인간(non-human) 세포주 또는 조직을 포함한 광범위한 숙주 세포에 전달될 수 있다. AAV는 비-병원성이고, 면역 반응을 유발하지 않기 때문에, 다수의 전-임상 연구가 탁월한 안전성 프로파일을 보고했다. rAAV는 광범위한 세포 종류에 형질도입을 수행할 수 있고, 형질도입은 활성 숙주 세포 분열에 의존적이지 않다. 높은 역가(titer), > 10⁸ 바이러스 입자/ml가 상층액 중에 용이하게 수득되고, 추가적인 농축에 의해 10¹¹-10¹² 바이러스 입자/ml가 수득된다. 이식 유전자가 숙주 게놈에 삽입되어, 발현이 장기간 지속되고 안정하다.

AAV-2가 아닌 대안적인 AAV 혈청형의 이용 (Davidson et al (2000), PNAS 97(7)3428-32; Passini et al (2003), J. Virol 77(12):7034-40)은 상이한 세포 유주성(tropism) 및 증가된 형질도입 능력을 보였다. 뇌암과 관련하여, 뇌로의 신규한 주사 기법, 구체적으로 전도 촉진 전달(convection enhanced delivery)의 개발 (CED; Bobo et al (1994), PNAS 91(6):2076-80; Nguyen et al (2001), Neuroreport 12(9):1961-4)은 뇌의 넓은 영역에 AAV 벡터로 형질도입하는 능력을 유의성 있게 강화시켰다.

AAV 벡터의 대량 제조는 패키징 세포주: 키메라 DNA 코딩 서열을 갖는 AAV 벡터, AAV rep 및 cap 유전자를 포함하는 AAV RC 벡터, 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 pDF6의 합류 도달전(subconfluent) 293 세포의 50 x 150 mm 플레이트로의 3-플라스미드 공형질감염(three-plasmid cotransfection)에 의해 수행된다. 형질감염 후 3일 뒤에 세포를 수집하고, 3회의 동결-해동 사이클에 의해 또는 초음파 처리(sonication)에 의해 바이러스를 방출시킨다.

그 후, 벡터의 혈청형(serotype)에 따라, AAV 벡터를 두 개의 상이한 방법에 의해 정제한다. AAV2 벡터는 헤파린에 대한 친화도에 근거하여 단일-단계 중력-유동 컬럼 정제(single-step gravity-flow column purification) 방법에 의해 정제된다 (Auricchio, A., et. al., 2001, Human Gene therapy 12;71-6; Summerford, C. and R. Samulski, 1998, J. Virol. 72:1438-45; Summerford, C. and R. Samulski, 1999, Nat. Med. 5: 587-88). AAV2/1 및 AAV2/5 벡터는 현재 3개의 순차적 CsCl 구배에 의해 정제된다.

재조합 렌티바이러스는 분열(dividing) 포유동물 세포 또는 비분열(non-dividing) 포유동물 세포에서 항암제를 코딩하는 핵산, 또는 그의 융합 또는 절단된 핵산의 전달 및 발현의 장점을 갖는다. HIV-1 기반 렌티바이러스는 MoMLV(Moloney Leukemia Virus)-기반 레트로바이러스 시스템보다 더 넓은 숙주 범위에 효과적으로 형질도입을 수행할 수 있다. 재조합 렌티바이러스의 제조는 pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™ 또는 Invitrogen으로부터의 ViraPower™ Lentiviral Expression 시스템과 함께 pLenti 벡터를 이용하여 달성될 수 있다.

재조합 아데노바이러스를 생성하기 위한 단순화된 시스템이 He TC. et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514, 1998에 의해 제시된다. 먼저 목적 유전자를 셔틀 벡터, 예를 들면, pAdTrack-CMV에 클로닝시킨다. 결과적으로 수득된 플라스미드를 제한효소 PmeI에 의해 처리하여 선형화시키고, 뒤이어, 아데노바이러스 백본 플라스미드, 예를 들면, Stratagene's AdEasy™ Adenoviral Vector System의 pAdEasy-1과 함께, 대장균 BJ5183 세포 내로 형질전환시킨다. 재조합 아데노바이러스 벡터를 카나마이신 내성에 대해 선택하고, 제한효소 분석에 의해 재조합을 확인한다. 최종적으로, 선형화된 재조합 플라스미드를 아데노바이러스 패키징 세포주, 예를 들면, HEK 293 세포 (E1-형질감염 인간 배아 신장 세포) 또는 911 (E1-형질감염 인간 배아 망막 세포) (Human Gene Therapy 7:215-222, 1996)에 형질감염시킨다. HEK 293 세포 내에 재조합 아데노바이러스가 생성된다.

일 구체예에서, 항암제 또는 융합체를 코딩하는 핵산, 또는 그의 절단된 핵산 및/또는 그의 변이체를 포함하는 AAV 바이러스 벡터가 이용된다. 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터는 다수의 상이한 인간 및 비-인간 세포주 또는 조직을 포함한 광범위한 숙주 세포에 적용될 수 있다. AAV는 비-병원성이고, 면역 반응을 유발하지 않기 때문에, 다수의 전-임상 연구가 탁월한 안전성 프로파일을 보고했다. rAAV는 광범위한 세포 종류에 형질도입을 수행할 수 있고, 형질도입은 활성 숙주 세포 분열에 의존적이지 않다. 높은 역가(titer), > 10⁸ 바이러스 입자/ml가 상층액 중에 용이하게 수득되고, 추가적인 농축에 의해 10¹¹-10¹² 바이러스 입자/ml가 수득된다. 이식 유전자가 숙주 게놈에 삽입되어, 발현이 장기간 지속되고 안정하다.

AAV-2가 아닌 대안적인 AAV 혈청형의 이용 (Davidson et al (2000), PNAS 97(7)3428-32; Passini et al (2003), J. Virol 77(12):7034-40)은 상이한 세포 유주성 및 증가된 형질도입 능력을 보였다. 뇌암과 관련하여, 뇌로의 신규한 주사 기법, 구체적으로 전도 촉진 전달의 개발 (CED; Bobo et al (1994), PNAS 91(6):2076-80; Nguyen et al (2001), Neuroreport 12(9):1961-4)은 뇌의 넓은 영역에 AAV 벡터로 형질도입하는 능력을 유의성 있게 강화시켰다.

AAV 벡터의 대량 제조는 패키징 세포주: 코딩 핵산을 운반하는 AAV 벡터, AAV rep 및 cap 유전자를 포함하는 AAV RC 벡터, 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 pDF6의 합류 도달전 293 세포의 50 x 150 mm 플레이트로의 3-플라스미드 공형질감염(three-plasmid cotransfection)에 의해 수행된다. 형질감염 후 3일 뒤에 세포를 수집하고, 3회의 동결-해동 사이클에 의해 또는 초음파 처리(sonication)에 의해 바이러스를 방출시킨다.

그 후, 벡터의 혈청형에 따라, AAV 벡터를 두 개의 상이한 방법에 의해 정제한다. AAV2 벡터는 헤파린에 대한 친화도에 근거하여 단일-단계 중력-유동 컬럼 정제 방법에 의해 정제된다 (Auricchio, A., et. al., 2001, Human Gene therapy 12;71-6; Summerford, C. and R. Samulski, 1998, J. Virol. 72:1438-45; Summerford, C. and R. Samulski, 1999, Nat. Med. 5: 587-88). AAV2/1 및 AAV2/5 벡터는 현재 3개의 순차적 CsCl 구배에 의해 정제된다.

레트로바이러스 벡터가 핵산 작제물 및 siRNA 발현 작제물의 전달을 위해 유용한 것으로 당업계에 알려져 있다. 예를 들면, 레트로바이러스가 siRNA 발현 카세트의 포유동물 세포로의 전달을 위한 효율적인 벡터라고 개시하는, 참조에 의해 본 명세서에 포함된 Devroe 및 Silver (2002)의 본문을 참조한다. Barton 및 Medzhitov (2002)는 siRNA 발현 작제물의 레트로바이러스 도입이 일차 세포에서 유전자의 안정한 불활성화를 초래한다고 개시한다.

렌티바이러스는 그들의 통합전 복합체(preintegration complex)의 핵 친화성(karyophilic) 특성 때문에 비분열(nondividing) 세포를 감염시킬 수 있고, 핵공(nucleopore)을 통한 능동 유입(active import)를 가능하게 하는 레트로바이러스의 서브그룹이다.

렌티바이러스는 소 렌티바이러스 그룹, 말(equine) 렌티바이러스 그룹, 고양이(feline) 렌티바이러스 그룹, 양/염소(ovinecaprine) 렌티바이러스 그룹 및 영장류 렌티바이러스 그룹의 일원들을 포함한다. 유전자 요법용 렌티바이러스 벡터의 개발이 Klimatcheva et al., (1999)에서 검토된다. 유전자 요법을 위해 적합한 렌티바이러스 벡터의 설계 및 용도가, 예를 들면, 미국특허 제6,531,123호; 미국특허 제6,207,455호; 및 미국특허 제6,165,782호에 기재된다(각각은 참조에 의해 구체적으로 본 명세서에 포함됨). 렌티바이러스의 예는 HIV-1, HIV-2, HIV-1/HIV-2 슈도형(pseudotype), HIV-1/SIV, FIV, CAEV(caprine arthritis encephalitis virus), 말 전염성 빈혈 바이러스(equine infectious anemia virus) 및 소 면역결핍 바이러스(bovine immunodeficiency virus)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. HIV-1도 사용을 위해 포함된다.

렌티바이러스 벡터는 유전자 요법을 위해 큰 장점을 제공한다. 이들은 장기 발현을 요구하는 표적 세포의 염색체로 안정적으로 통합된다. 또한, 이들은 바이러스 유전자를 전달하기 않아서, 세포독성 T 세포에 의해 파괴될 수 있는 형질도입된 세포를 생성하는 문제를 방지한다. 또한, 이들은 상대적으로 큰 클로닝 용량(cloning capacity)을 가져서, 임상적 응용을 가능하게 한다. 또한, 다른 레트로바이러스와 대조적으로, 렌티바이러스는 비분열 세포에 형질도입을 수행할 수 있다. 이는 조혈계(hematopoietic system), 뇌, 간, 폐, 및 근육과 같은 조직을 위한 유전자 요법의 측면에서 매우 중요하다. 예를 들면, HIV-1으로부터 유래된 벡터는 이식 유전자의 뉴런, 간세포, 및 근육세포와 같은 세포로의 효율적인 생체 내 및 생체 외(ex vivo) 전달, 통합, 및 안정한 발현을 가능하게 한다 (Blomer et al., 1997; Kafri et al., 1997; Naldini et al., 1996a; 1996b).

렌티바이러스 게놈 및 프로바이러스 DNA는 레트로바이러스에서 발견되는 3개의 유전자 gag, pol 및 env를 가지며, 이들은 두 개의 LTR(long terminal repeat)에 의해 둘러싸인다. gag 유전자는 내부 구조(매트릭스, 캡시드 및 뉴클레오캡시드) 단백질을 코딩하고, pol 유전자는 RNA-의존성 DNA 폴리머라아제(RNA-directed DNA polymerase)(역 전사효소), 프로테아제, 및 인테그라아제(integrase)를 코딩하며, env 유전자는 바이러스 외피 당단백질(envelop glycoprotein)을 코딩한다. 5' 및 3' LTR은 비리온(virion) RNA의 전사 및 폴리아데닐화를 촉진하기 위해 작용한다. LTR은 바이러스 복제를 위해 필요한 모든 다른 시스-작용 서열을 포함한다. 렌티바이러스는 vif, vpr, tat, rev, vpu, nef 및 vpx를 포함한 추가적인 유전자를 갖는다.

5' LTR에 인접하여 게놈의 역전사(tRNA 프라이머 결합 부위) 및 바이러스 RNA의 입자로의 효율적인 캡슐화(Psi 부위)를 위해 필요한 서열이 존재한다. 캡슐화(encapsulation)(또는 레트로바이러스 RNA의 감염성 비리온으로의 패키징)를 위해 필요한 서열이 바이러스 게놈으로부터 결실되는 경우, 시스 결함(cis defect)은 게놈 RNA의 캡슐화를 방해한다. 그러나, 결과적으로 수득된 돌연변이체는 모든 비리온 단백질의 합성을 지시할 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 당업계에 잘 알려져 있으며, 참조에 의해 본 명세서에 포함된, Naldini et al., (1996a and 1996b); Zufferey et al., (1997); Dull et al. (1998); 미국특허 제6,013,516호 및 미국특허 제5,994,136호를 참조한다. 일반적으로, 이 벡터들은 플라스미드-기반이거나 바이러스-기반이고, 외래 핵산의 내포, 선택, 및 핵산의 숙주 세포로의 전달을 위해 필수적인 서열을 갖도록 구성된다.

따라서, HIV-1(human immunodeficiency virus type 1)으로부터 유래된 렌티바이러스 벡터는 생체 외(in vitro) 및 생체 내에서 비-유사분열성(non-mitotic) 세포로의 이식 유전자의 효율적인 전달, 통합 및 장기 발현을 매개할 수 있다 (Naldini et al., 1996a; Naldini et al., 1996b; Blomer et al., 1997).

레트로바이러스 게놈에서, 모든 필요한 시스-작용 요소들을 포함하는 단일 RNA 분자가 모든 코딩 서열을 운반한다. 따라서, 벡터 제조 시스템의 생물안전성(biosafety)이 복제 가능 재조합체(replication competent recombinant, RCR)의 재생성을 위해 요구되는 교차(crossover)의 횟수를 최대화하기 위해 다양한 성분들을 코딩하는 서열을 가능한 한 많은 수의 독립적인 유닛에 분포시키는 것에 의해 달성된다. 렌티바이러스 입자가 숙주 생성자 세포(host producer cell), 예를 들면, 293 인간 배아 신장 세포에서 비리온 패키징 요소와 벡터 게놈을 동시-발현시키는 것에 의해 생성된다. HIV-1-기반 벡터의 경우, 비리온의 코어(core) 및 효소 성분은 HIV-1으로부터 유래되고, 외피 단백질은 이종 바이러스, 가장 흔하게는 그의 G 단백질의 높은 안정성 및 광범위한 유주성 때문에 VSV로부터 유래된다. 전체 세트의 유전자가 발병을 위해 필수적이나 바이러스 유전적 운반(virus genetic cargo)을 위해 불필요한 병독성(virulence) 인자를 코딩하는 것인 HIV의 게놈 복잡성이 실질적으로 임상적으로 허용가능한 벡터 시스템의 개발에 기여한다.

다중 감쇠 패키징 시스템(multiply attenuated packaging system)은 통상적으로 HIV-1의 9개의 유전자 중 3개의 유전자, 비리온 주요 구조 단백질을 코딩하는 gag, 레트로바이러스-특이적 효소를 담당하는 pol, 및 효율적인 gag 및 pol 발현을 위해 필요한 전사-후 조절자(post-transcriptional regultor)를 코딩하는 rev만을 포함한다 (Dull, et al., 1998). 게놈의 60% 정도가 완전히 제거되었기 때문에, 그와 같이 광범위하게 결실된 패키징 시스템으로터, 부모 바이러스는 재구성될 수 없다. HIV-기반 패키징 시스템의 하나의 버전에서, Gag/Pol, Rev, VSV G 및 벡터가 별개의 DNA 유닛으로부터 생성된다. 또한, 벡터와 헬퍼 서열 간의 중복(overlap)이 수십 뉴클레오티드로 감소되어, 상동성 재조합의 기회가 최소화된다.

HIV 타입 1 (HIV-1) 기반 벡터 입자는 소위 생성자 세포, 예를 들면, 293T 인간 배아 신장 세포에서 비리온 패키징 요소와 벡터 게놈을 동시 발현시키는 것에 의해 생성될 수 있다. 이 세포들은 다수의 플라스미드에 의해 일시적으로 형질감염될 수 있다. 통상적으로, 3개 내지 4개의 플라스미드가 이용되나, 그 숫자는 렌티바이러스 성분들이 별개의 유닛으로 분리된 정도에 따라 더 클 수 있다. 일반적으로, 하나의 플라스미드가 HIV-1으로부터 유래된, 코어 및 비리온의 효소 성분들을 코딩한다. 이 플라스미드는 패키징 플라스미드(packaging plasmid)로 지칭된다. 또 다른 플라스미드가 외피 단백질을 코딩하며, 가장 흔하게는, 높은 안정성 및 광범위한 유주성 때문에, VSV(vesicular stomatitis virus)의 G 단백질(VSV G9)을 코딩한다. 이 플라스미드는 외피 발현 플라스미드(envelop expression plasmid)로 지칭될 수 있다. 또 다른 플라스미드는 표적 세포, 즉, 벡터 자체로 전달될 게놈을 코딩하고, 전달 벡터(transfer vector)로 지칭된다. 밀리리터 당 수백만 개의 형질도입 유닛의 역가(TU/ml)를 갖는 재조합 바이러스가 이 기법 및 그의 변형에 의해 생성될 수 있다. 초원심분리 후에, 약 10⁹ TU/ml의 농축된 스톡이 수득될 수 있다.

벡터 자체가 표적 세포로 전달될 유일한 유전적 물질이다. 벡터는 일반적으로 캡슐화, 역 전사 및 핵으로의 유입(nuclear import) 및 통합을 위해 필요한 시스-작용 요소들에 의해 둘러싸인 이식유전자 카세트를 포함한다. 발암레트로바이러스 벡터(oncoretroviral vector)에 의해 이전에 수행된 바와 같이, 렌티바이러스 벡터는 표적 세포로 전달된 후 바이러스 LTR(long terminal repeat)의 전사 능력을 상실한다는 점에서 "자가-불활성화(self-inactivating)"하도록 제조되었다 (Zufferey, et al. 1998). 이 변형은 또한 복제 가능 재조합체(RCR)의 출현 위험을 더 감소시키고, 프로모터 간섭(promoter interference)과 연관된 문제를 방지한다. 이 벡터들, 또는 그들의 성분들은 SIN 벡터 또는 SIN 함유 벡터로 알려져 있다. SIN 설계는 참조에 의해 본 명세서에 포함된, Zufferey et al., 1998 및 미국특허 제5,994,136호에 보다 상세하게 기재된다.

이식유전자 발현을 증가시키는 것이 일부 구체예에서, 특히, 중간 활성(moderately active) 프로모터를 갖는 본 발명의 렌티바이러스 작제물을 포함하는 구체예에서 요구될 수 있다. 전사후 조절 요소(post-transcriptional regulatory element, PRE)의 한 종류는 유전자 발현을 촉진할 수 있는, 발현 카세트 내에 위치한 인트론이다. 그러나, 인트론은 렌티바이러스의 생활사 사건 동안 스플라이싱에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 인트론이 PRE로 이용되는 경우, 이들은 벡터 게놈 전사물에 대해 반대 배향으로 배치되어야 할 수 있다.

스플라이싱 사건에 의존하지 않는 전사후 조절 요소는 바이러스 생활사(virus life cycle) 동안 제거되지 않는 장점을 제공한다. 일부 예는 헤르페스 심플렉스 바이러스의 전사후 가공 요소, B형 간염 바이러스의 전사후 조절 요소(HPRE), 및 우드척(woodchuck) 간염 바이러스의 전사후 조절 요소(WPRE)이다. 이들 중에서, WPRE는 HPRE에서 발견되지 않는 추가적인 시스-작용 요소를 포함하기 때문에 가장 바람직하다 (Donello et al., 1998). 이 조절 요소는 이식 유전자의 RNA 전사물 내에 포함되도록 벡터 내에, 그러나, 이식 유전자 전사 유닛의 종결 코돈의 하류에 위치한다. 본 발명 및 Zufferey et al., 1999에서 입증된 바와 같이, WPRE 요소는 렌티바이러스 벡터에서 원하는 이식 유전자의 유전자 발현을 촉진하고 강화하기 위한 유용한 도구이다. WPRE는 참조에 의해 본 명세서에 포함된, 미국특허 제6,136,597호에서 규명되고 설명된다. 상기 특허에서 설명된 바와 같이, WPRE는 핵으로부터 세포질로의 RNA의 효율적인 수송을 매개하는 RNA 유출(export) 요소이다. WPRE는 시스-작용 핵산 서열의 삽입에 의해 상기 서열과 이식 유전자가 단일 전사물 내에 포함되도록 하는 것에 의해 이식 유전자의 발현을 강화한다. 센스 배향의 WPRE의 존재는 이식 유전자 발현을 7 내지 10배 증가시키는 것으로 확인되었다. 인트론은 일반적으로 레트로바이러스 입자의 형성을 초래하는 일련의 사건 동안 스플라이싱에 의해 제거되므로, 레트로바이러스 벡터는 완전한 인트론-포함 유전자 대신, cDNA 형태의 서열을 전달한다. 인트론은 일차 전사물과 스플라이싱 기구(splicing machinery)의 상호작용을 매개한다. 스플라이싱과 수송 기구 간의 커플링 때문에 스플라이싱 기구에 의한 RNA의 가공이 그들의 세포질로의 유출을 촉진하므로, cDNA는 종종 비효율적으로 발현된다. 따라서, 벡터 중 WPRE의 내포는 이식 유전자의 증가된 발현을 가져온다.

항암제를 코딩하는 핵산 서열과 같은 핵산 서열의 세포의 핵으로의 도입은 핵산의 핵막을 통한 핵으로의 유입을 요구한다. 렌티바이러스는 능동 핵 유입 시스템(active nuclear import system)을 이용하고, 이는 비-분열 세포에서 효율적으로 복제하는 능력의 기반을 형성한다. 이 능동 유입 시스템은 역 전사를 위한 특이적 양식(modality)을 포함한 복잡한 일련의 사건들에 의존한다. 특히, HIV-1에서, pol 유전자 내에 위치한, cPPT(central polypurine tract)가 하류 플러스 가닥의 합성을 개시하고, 플러스 가닥 합성은 또한 3' PPT(polypurine tract)에서 개시된다. 짧은 DNA 분자의 가닥 전달 후에, 상류 플러스 가닥 합성이 개시되고, 게놈의 중심에 도달할 때까지 진행된다. cTS(central termination sequence)에서, 가닥 전위(strand displacement) 모드로 기능할 때, HIV-1 역전사효소가 방출된다(그의 주형으로부터 분리)(Charneau, et al., 1994). 수득되는 순 결과는 게놈의 중심에 길이가 99개의 뉴클레오티드로 구성되는 안정한 플랩(flap)을 갖는 이중 가닥 DNA 분자이다. 이 중심 "플랩(flap)"은 핵 유입을 촉진한다 (Zennou, et al., 2000).

항암제에 대한 클로닝된 유전자(즉, 아폽토시스 촉진 유전자, 세포독소, 면역독소 등)가 인 비트로 돌연변이 유발(in vitro mutagenesis)에 대한 잘 알려진 다양한 기법에 의해 조작될 수 있고, 특히, 본 명세서에서 뮤테인(mutein), 또는 변이체 또는 돌연변이체로 지칭되는, 천연 인간 단백질의 변이체를 생성하기 위해 조작될 수 있고, 이 변이체들은 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 이용될 수 있다. 본 발명에서 유용한, 항암제(즉, 아폽토시스 촉진 분자, 세포독소 분자, 등)의 뮤테인의 일차 구조의 변형은 예를 들면, 결실, 첨가, 및 치환을 포함할 수 있다. 치환은 보존적이거나 또는 비-보존적일 수 있다. 천연 단백질과 뮤테인 간의 차이는 일반적으로 바람직한 특성을 보존하고, 바람직하지 않는 특성을 경감시키거나 또는 제거하며, 원하는 특성 또는 새로운 특성을 부가한다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 아폽토시스 촉진 분자인 항암제는 천연(즉, 야생형) 아폽토시스 촉진 단백질 또는 그의 기능성 뮤테인 또는 변이체의 50개 이상의 아미노산으로 구성된 아폽토시스 촉진 폴리펩티드일 수 있다.

일부 구체예에서, 폴리펩티드 (즉, 세포독성 분자, 아폽토시스 촉진 분자, 등)인 발현된 항암제는 또한 융합 폴리펩티드일 수 있고, 예를 들면, 생성물을 원하는 위치에 표적화하는 폴리펩티드, 또는 예를 들면, 필요한 경우, 그의 정제를 촉진하는 택(tag)에 융합된 폴리펩티드일 수 있다. 발현된 폴리펩티드, 즉, 발현된 항암제 폴리펩티드(예를 들면, 아폽토시스 촉진 분자, 면역독소 및 세포독성 분자 등)의 안정성을 증가시키는 폴리펩티드 서열로의 융합이 또한 고려된다. 예를 들면, 혈청 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민으로의 융합은 항암제 폴리펩티드의 순환 반감기를 증가시킬 수 있다. 택 및 융합 파트너는 필요한 경우, 절단가능하도록 설계될 수 있다. 구체적으로 고려되는 또 다른 변형은 폴리머로의 부착, 즉, 공유결합에 의한 부착이다. 일 양태에서, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG)와 같은 폴리머가 그들이 접합된 단백질의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있다. 폴리펩티드 작용제의 페길화(PEGylation) 방법이 예를 들면, 사용되는 PEG 폴리머의 크기 등의 고려와 같이, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자에게 잘 알려져 있다. 또 다른 양태에서, 생분해성 또는 흡수성(absorbable) 폴리머가 폴리펩티드 작용제의 연장된, 종종 국소화된 방출을 제공할 수 있다. 수주 동안, 또는 수개월 동안 단백질을 방출할 수 있는, 그와 같은 합성 생체흡수성(bioabsorbable), 생체적합성 폴리머는 예를 들면, 폴리-α-히드록시산(예를 들면, 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 및 그들의 공중합체), 폴리무수물(polyanhydride), 폴리오르토에스테르, 폴리에틸렌 글리콜과 폴리부틸렌 테레프탈레이트의 세그먼트화 블록 공중합체(segmented block copolymers of polyethylene glycol and polybutylene terephtalate) (POLYACTIVE^TM), 티로신 유도체 폴리머, 또는 폴리(에스테르-아미드)를 포함할 수 있다. 약물 전달 물질 및 이식물의 제조에서 이용되는 적절한 생체흡수성 폴리머는 예를 들면, 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된, 미국특허 제4,968,317호 및 제5,618,563호, 및 특히, S. W. Shalaby, Carl Hanser Verlag에 의해 편집된 "Biomedical Polymers", Munich, Vienna, New York, 1994 및 전술된 문헌에서 인용된 다수의 참조 문헌에서 검토된다. 선택되어야 하는 특정한 생체흡수성 폴리머는 치료 대상 환자에 따라 결정될 것이다.

암의 치료를 위한 항암제 발현 조작 ASC 의 용도

본 발명의 일 양태는 개체에서 암을 치료 및/또는 예방하는 방법으로서, 개체에게 조작된 ASC를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 조작된 ASC는 항암제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 방법을 제공한다.

일부 구체예에서, 본 발명은 암을 가진 개체를 치료하는 방법으로서, ASC는 상기 암이 치료될 개체와 동일한 개체로부터 수득되는 것인 방법에 관한 것이다. 상기 ASC는 본 명세서에 기재된 방법에 따라 하나 이상의 항암제를 발현하는 조작된 ASC를 생성하기 위해 생체 외에서 유전적으로 변형된다(즉, 상기 ASC는 프로모터에 작동가능하게 연결된 항암제를 코딩하는 핵산 서열에 의해 생체 외에서 형질도입된다). 일부 구체예에서, 상기 조작된 ASC는 조작된 ASC의 실질적으로 순수한 집단을 수득하기 위해 선택적으로 증식될 수 있다. 그 후, 상기 조작된 ASC는 암을 가진 개체에게 투여된다. 항암제를 발현하는 조작된 ASC의 투여는 임의의 적절한 수단, 예를 들면, 전신 투여, 또는 국소 투여, 예를 들면, 종양으로의 직접 주사에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 조작된 ASC는 암 또는 종양 세포 매스에 혈액을 공급하는 혈관형성 네트워크(vascularization network)에 정맥내로 투여된다.

국제특허출원 WO09/076548 ("548 출원")에 개시된 바와 같이, 지방 조직 및 지방-유래 재생 세포(adipose-derived regenerative cell)(즉, 지방 유래 줄기 세포)의 암의 치료를 위한 용도가 보고되었다. '548 출원은 종양 부위, 또는 그 주위에 지방 조직을 투여하는 것을 검토하나, 상기 출원은 지방-유래 기질 세포의 이질적 집단(내피 세포, 간엽 줄기 세포, 섬유모세포, 평활근 세포, 혈관주위 세포, 또는 지방-유래 줄기 세포의 집단 중 하나 이상을 포함함), 및 열거되지 않은 추가적인 다른 세포 종류를 암을 가진 개체에게 이용하거나 투여하는 것은 개시하거나, 암시하거나 또는 언급하지 않는다. 추가적으로, 이 '548 출원은 개체 내의 종양 또는 암 부위에 항암제를 전달하기 위한 전달 수단으로 이용하기 위해 이 세포들을 조작하는 것은 검토하거나 시사하지 않는다. 미국특허출원 2009/0181456 ("456 출원")은 혈관신생을 촉진하고 상처 봉합(wound closure)을 촉진하고, 손상되거나, 퇴행되거나, 제거된 근육의 복구 및 관절 연골 결함의 복구를 위한 유전적으로 변형된 지방-유래 줄기 세포(ADSC)를 검토한다. 특히, 이 '456 출원은 항암제, 또는 특히, 아폽토시스 촉진제(pro-apoptotic agent)를 발현하도록 이 세포들을 조작하는 것은 검토하거나 시사하지 않는다. 이 '456 출원은 지방 조직으로부터 유래된 세포들의 이질적 집단(즉, 본 명세서에 개시된 지방 유래 기질 세포의 이질적 집단)이 아닌, 지방 조직으로부터 유래된 줄기 세포(ADSC)를 조작하는 것을 검토하고, 동질적인 지방-유래 줄기 세포 집단을 외상, 혈관 손상 및 종양 절제에 의한 근육 손실의 영역에서 근육 성장의 촉진을 포함한, 세포 성장을 촉진하는 분자를 이용하여 조작하는 것을 검토하므로, 정반대이다. 이 '456 출원은 또한 혈관신생 억제제를 발현하는 것을 개시하고, 따라서, 당업자는 암을 가진 개체의 치료를 위해 '456 출원에 기재된 세포를 사용하지 않을 것이다. 제5,980,887호 특허 ('887 특허)도 성장을 촉진하고, 특히, 손상된 혈관의 내피 증식을 촉진하고, 특히, 허혈성 질환에서 혈관신생을 촉진하기 위해 혈관신생 촉진제(pro-angiogenic agent) 및 혈관신생 억제제를 발현하는 조작된 배아-세포 유래 내피 세포를 검토한다. 따라서, '456 출원과 같이, '887 특허는 조작된 세포를 이용하여 세포 증식을 촉진하는 것을 검토하며, 이는 아폽토시스 촉진제를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 항암제를 발현하는 조작된 세포에 의해 암세포의 세포 증식을 억제하고자 하는 본 발명과 정 반대이다.

일부 구체예에서, 조작된 ASC는 두 종 이상의 항암제, 예를 들면, 2종 이상, 또는 3종 이상, 또는 4종 이상, 또는 5종 이상의 항암제를 발현한다. 일부 구체예에서, 조작된 ASC가 2종 이상의 항암제를 발현하는 경우, 상기 항암제는 동일한 종류(즉, 폴리펩티드 항암제) 또는 상이한 종류의 항암제(즉, 폴리펩티드 항암제 및 RNAi 항암제)일 수 있다. 일부 구체예에서, 조작된 ASC가 2종 이상의 항암제를 발현하는 경우, 상기 항암제는 동일한 핵산 서열에 코딩되거나(예를 들면, IRES 서열에 의해 분리됨), 또는 별개의 핵산 서열에 코딩될 수 있다. 일부 구체예에서, 조작된 ASC가 2종 이상의 항암제를 발현하는 경우, 상기 항암제는 동일한 프로모터 또는 상이한 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있고, 예를 들면, 상이한 프로모터가 이용되는 경우, 하나의 항암제를 코딩하는 핵산 서열이 지방-조직 프로모터와 같은 조직 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 제2 항암제를 코딩하는 핵산 서열은 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.

따라서, 일부 구체예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같이 항암제를 발현하는 ASC는 암의 치료를 위해 유용하다. 일부 구체예에서, 암, 질환, 또는 질병 또는 악성 종양은 조직에서 정상 또는 비정상 세포의 불충분하게 제어되거나(poorly controlled) 또는 제어되지 않는 증식을 특징으로 하는 포유동물의 기관 또는 조직의 질병 및 그의 신체 전체에 대한 영향을 의미한다. 일부 구체예에서, 암은 양성 신생물(benign neoplasm), 이형성증(dysplasia), 과형성증(hyperplasia), 및 전이성 증식 또는 기타 형질전환을 보이는 신생물, 예를 들면, 종종 암의 발병에 선행하는 백반증을 포함한다. 세포 및 조직은 정상 세포보다 더 빠르게 증식하고, 주변의 건강한 조직이나 신체의 다른 조직을 대체하거나, 이에 침투하여 전이성 증식을 수행하고, 비정상적인 형태 및 크기를 갖고, 핵세포질비(nucleocytoplasmatic ratio)의 변화, 핵 다염성(nuclear polychromasia)을 보이고, 궁극적으로 중단될 수 있는 경우, 암성이다. 암성 세포 및 조직은 부종양 증후군(paraneoplastic syndrome)을 유발하는 경우 신체 전체에 영향을 미칠 수 있거나, 또는 암이 필수적인 기관 또는 조직 내에서 발생한 경우, 정상적인 기능이 손상되거나 중지될 수 있고, 치명적 결과가 초래될 수 있다. 일부 경우에, 필수적인 기관의 기능이 암이나 암세포에 의해 약화되는 경우, 원발성 또는 전이성 암은 해당 개체 또는 포유동물의 사망을 초래할 수 있다. 악성 암은 확산되는 경향을 갖는 암이고 치료되지 않으면 사망을 유발할 수 있다. 양성 종양은 그들의 위치, 크기, 또는 부종양 부작용(paraneoplastic side effect)에 의해 정상적인 신체 기능을 방해하는 경우, 사망을 초래할 수 있으나, 일반적으로 사망을 유발하지 않는다.

암을 가진 개체에 항암제를 코딩하는 발현 벡터를 갖도록 조작된(즉, 핵산이 도입된) ASC의 집단을 투여하는 능력은 개체에서 다양한 양성 및 악성 종양(예를 들면, 복수 및 고형 종양, 암종, 백혈병, 림프종, 흑색종, 육종)의 치료를 위해 유용하다. 일부 목적 종양 종류는 유방 암종, 결장 암종, 폐 암종, 난소 암종, 췌장 암종, 전립선 암종, 신장 암종 및 고환 암종이다.

따라서, 항암제를 발현하는, 조작된 ASC에 의해 치료될 수 있는 암의 예는 예를 들면, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 귀리세포(oat cell) 암, 유두(papillary) 암, 세기관지(bronchiolar) 암, 편평세포암, 이행상피암(transitional cell), 워커(Walker), 백혈병(예를 들면, B-세포성, T-세포성, HTLV, 급성 또는 만성 림프구성, 비만 세포성, 골수성), 조직구종(histiocytoma), 조직구 증식증(histiocytosis), 호지킨병(Hodgkin disease), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma), 형질세포종(plasmacytoma), 세망내피증(reticuloendotheliosis), 선종(adenoma), 선암종(adenocarcinoma), 선-섬유종(adeno-fibroma), 선림프종(adenolymphoma), 법랑모세포종(ameloblastoma), 혈관각화종(angiokeratoma), 호산구 증가를 동반한 혈관림프증식증(angiolymphoid hyperplasia with eosinophilia), 경화 혈관종(sclerosing angioma), 혈관종증(angiomatosis), 아푸도마(apudoma), 인두 상피종(branchioma), 악성 카르시노이드 증후군(malignant carcinoid syndrome), 카르시노이드 심장병(carcinoid heart disease), 암육종(carcinosarcoma), 백악질종(cementoma), 담관종(cholangioma), 진주종(cholesteatoma), 연골육종(chondrosarcoma), 연골모세포종(chondroblastoma), 연골육종, 척색종(chordoma), 분리종(choristoma), 두개인두종(craniopharyngioma), 연골종(chrondroma), 원주종(cylindroma), 낭선암종(cystadeno-carcinoma), 낭선종(cystadenoma), 엽상 낭육종(cystosarcoma phyllodes), 미분화세포종(dysgerminoma), 뇌실막종(ependymoma), 유잉 육종(Ewing sarcoma), 섬유종(fibroma), 섬유육종(fibrosarcoma), 거대 세포 종양(giant cell tumor), 신경절 신경종(ganglioneuroma), 교모세포종(glioblastoma), 사구맥관종(glomangioma), 과립막 세포종(granulosa cell tumor), 음양모세포종(gynandroblastoma), 과오종(hamartoma), 혈관내피종(hemangioendo-thelioma), 혈관종(hemangioma), 혈관주위 세포종(hemangiopericytoma), 혈관육종(hemangiosarcoma), 간암(hepatoma), 췌도세포 종양(islet cell tumor), 카포시 육종(Kaposi sarcoma), 평활근종(leiomyoma), 평활근육종(leiomyosarcoma), 백혈육종(leukosarcoma), 레이디그 세포 종양(Leydig cell tumor), 지방종(lipoma), 지방육종(liposarcoma), 림프관종(lymphangioma), 림프관근종(lymphangiomyoma), 림프관육종(lymphangiosarcoma), 수모세포종(medulloblastoma), 뇌수막종(meningioma), 간엽종(mesenchymoma), 중신종(mesonephroma), 중피종(mesothelioma), 근육모세포종(myoblastoma), 근종(myoma), 근육종(myosarcoma), 점액종(myxoma), 점액육종(myxosarcoma), 신경집종(neurilemmoma), 신경종(neuroma), 신경모세포종(neuro-blastoma), 신경상피종(neuroepithelioma), 신경섬유종(neurofibroma), 신경섬유종증(neurofibromatosis), 치아종(odontoma), 골종(osteoma), 골육종(osteosarcoma), 유두종(papilloma), 부신경절종(paraganglioma), 비크롬친화세포 부신경절종(paraganglioma nonchromaffin), 송과체종(pinealoma), 횡문근종(rhabdomyoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 세르톨리 세포종(Sertoli cell tumor), 기형종(teratoma), 난포막 세포 종양(theca cell tumor), 및 세포가 이형성이 되거나, 불멸화되거나, 또는 형질전환된 것인 기타 질환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

일부 구체예에서, 항암제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 조작된 ASC를 포함하는 조성물이 투여되는 개체는 이전에 종양 절제를 받은 바 없다. 일부 구체예에서, 본 명세서에 개시된 조작된 ASC를 포함하는 조성물은 암을 가진 개체에서 근육 재생을 촉진하기 위해 투여되지 않는다. 일부 구체예에서, 본 명세서에 개시된 조작된 ASC를 포함하는 조성물은 개체로부터 종양이 제거된 위치 또는 병변 부위에 투여되지 않는다.

암을 갖는 개체로의 항암제를 발현하는 조작된 ASC 의 투여

항암제를 발현하는 조작된 ASC의 집단이 단독으로, 또는 다른 세포, 조직, 조직 단편, VEGF 및 기타 공지된 혈관신생 또는 동맥신생(arteriogenic) 성장 인자와 같은 성장인자, 생물학적 활성제 또는 비활성 화합물, 흡수성 플라스틱 스카폴드(resorbable plastic scaffold), 또는 이 집단의 전달, 효능, 내약성(tolerability), 또는 기능을 강화하도록 의도된 기타 첨가제와 함께 적용될 수 있다. ASC 집단은 또한 구조적 또는 치료적 목적의 유도를 위해 세포의 기능을 변화시키거나, 강화시키거나, 또는 보충하는 방식으로 DAN의 삽입에 의해 또는 세포 배양물 중 배치(placement)에 의해 변형될 수 있다. 예를 들면, 줄기 세포를 위한 유전자 전달 기법이 (Morizono et al., 2003; Mosca et al., 2000)에 개시된 바와 같이, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자에 의해 알려져 있고, 바이러스 형질감염(viral transfection) 기법, 및 보다 구체적으로 (Walther and Stein, 2000) 및 (Athanasopoulos et al., 2000)에 개시된 바와 같이, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus) 유전자 전달 기법을 포함할 수 있다. 비-바이러스 기반 기법(non-viral based technique)이 또한 (Murarnatsu et al., 1998)에 개시된 바와 같이 수행될 수 있다. 또 다른 양태에서, 항암제를 발현하는 조작된 ASC에 선택적으로 혈관신생 촉진성 성장 인자를 코딩하는 유전자가 형질도입될 수 있다.

항암제를 발현하는 조작된 ASC의 유효량을 포함하는 약제학적 조성물도 본 발명에 의해 고려된다. 이 조성물은 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 담체, 첨가제 또는 부형제와 조합된, 유효한 갯수(effective number)의 세포를 포함한다. 본 발명의 특정한 양태에서, 세포는 이식을 필요로 하는 개체에게 멸균 식염수로 투여된다. 본 발명의 다른 양태에서, 세포는 HBSS(Hanks Balanced Salt Solution) 또는 Isolyte S, pH 7.4로 투여된다. 무혈청 세포 배지의 사용을 포함한, 다른 방식들도 이용될 수 있다. 일 구체예에서, 세포는 혈장, 또는 우태혈청, 및 DMSO로 투여된다. 세포의 개체로의 전신 투여가 일부 적응증에서 바람직할 수 있고, 다른 적응증 또는 암 종류에서 질병 부위 및/또는 종양 부위 또는 그 부근으로의 직접 투여가 바람직할 수 있다.

항암제를 발현하는 조작된 ASC의 집단을 포함하는 조성물은 선택적으로 원하는 목적, 예를 들면, 암을 치료하기 위한 항암제를 발현하는 조작된 ASC의 재구성과 같은 목적을 위한 서면 설명서와 함께 적절한 용기로 포장될 수 있다.

일 구체예에서, 항암제를 발현하는 조작된 ASC를 포함하는 조성물이 분화제(differentiation agent)와 함께 투여된다. 일 구체예에서, 항암제를 발현하는 조작된 ASC가 개체로 투여되기 위해 분화제와 조합된다. 또 다른 구체예에서, 상기 항암제를 발현하는 조작된 ASC는 상기 분화제와 별도로 개체에게 투여된다. 선택적으로, 항암제를 발현하는 조작된 ASC가 분화제와 별도로 투여되는 경우, ASC와 분화제의 투여에서 시간적 분리(temporal separation)가 있다. 시간적 분리는 약 1분 미만 내지 약 수시간 또는 수일의 범위일 수 있다. 투여의 최적 시기 및 순서의 결정은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자에 의해 용이하게 일상적으로 결정된다.

약제학적 조성물

항암제를 발현하는 조작된 ASC를 포함하는 조성물은 다른 약물과 조합될 수 있고, 일부 구체예에서, 동일한 의학적 적응증의 치료를 위한 또 다른 작용제와 함께 조합될 수 있다. 예를 들면, 항암제를 발현하는 조작된 ASC의 집단을 포함하는 조성물은 하나 이상의 항암제 또는 암 치료법, 예를 들면, 외과수술, 방사선 또는 화학요법제(chemotherapeutic agent) (예를 들면, 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 미토마이신(mitomycin) C, 5-플루오로우라실(5-FU), 메토트렉세이트(MTX), 탁솔, 빈크리스틴, 및 시스플라틴)와 조합될 수 있다. 본 발명의 범위 내에서 이용될 수 있는 올리고뉴클레오티드 화합물과 관련된, 약제학적 조성물 및 그의 제조, 투여, 및 투여량(dosing)에 대한 추가적인 적절한 교시가 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국특허 출원 제20040146902호에 기재된다.

항암제를 발현하는 조작된 ASC를 포함하는 조성물과 함께 개체에게 병용-투여될 수 있는 용어 "암 약물(cancer drug)"은 개체에서 암에 부정적으로 영향을 미칠 수 있는, 예를 들면, 암 세포를 사멸시키거나, 암세포에서 아폽토시스를 유도하거나, 암세포의 증식 속도를 감소시키거나, 전이성 세포의 갯수를 감소시키거나, 종양의 크기를 감소시키거나, 종양 증식을 저해하거나, 종양 또는 암세포로의 혈액 공급을 감소시키거나, 암세포 또는 종양에 대한 면역 반응을 촉진시키거나, 암의 진행을 예방하거나 또는 억제하거나, 또는 암을 갖는 개체의 수명을 증가시킬 수 있는 작용제, 화합물, 또는 물질이다. 항암 요법은 생물학적 작용제(생물요법), 화학요법제, 및 방사선 요법제를 포함한다. 화학요법과 생물학적 요법의 조합(즉, 항암제를 포함하는 조작된 ASC를 포함하는 조성물의 투여)은 생화학요법(biochemotherapy)으로 알려져 있다.

또 다른 구체예에서, 암 치료법은 화합요법을 포함하고, 방사선 요법을 더 포함한다. 대안적인 구체예에서, 치료법은 항-EGFR 항체 또는 그의 생물학적 균등물의 투여를 포함한다.

조작된 ASC 세포의 개체로의 투여와 함께(동시에, 이전에, 또는 이후에) 이용될 수 있는 화학요법 및 치료 항암제 또는 암 약물은 탁솔(Taxol), 사이토칼라신(Cytochalasin) B, 그라미시딘(Gramicidin) D, 에티디움 브로마이드, 에메틴(Emetine), 미토마이신(Mitomycin), 에토포시드(Etoposide), 테노포시드(Tenoposide), 빈크리스틴(Vincristine), 빈블라스틴(Vinblastine), 캄포테신(camptothecin)(CPT), 콜히친(Colchicin), 독소루비신(Doxorubicin), 다우노루비신(Daunorubicin), 미톡산트론(Mitoxantrone), 미트라마이신(Mithramycin), 액티노마이신(Actinomycin) D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로파놀롤(Propranolol), 및 퓨로마이신(Puromycin) 및 그의 유사체 또는 그의 상동체와 같은 세포독성제를 포함한다. 치료제는 대사길항물질 (예를 들면, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈(Cytarabine), 5-플루오로우라실, 데카르바진(Decarbazine)), 알킬화제 (예를 들면, 메클로레타민(Mechlorethamine), 티오테파(Thiotepa), 클로람부실(Chlorambucil), 메팔란(Melphalan), 카르무스틴(Carmustine)(BCNU), 로무스틴(Lomustine)(CCNU), 사이클로포스파미드(Cyclophosphamide), 부술판(Busulfan), 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신(Mitomycin) C, 시스-디클로로디아민 플래티늄 (II)(DDP), 시스플라틴), 안트라사이클린(anthracycline)(예를 들면, 다우노루비신(이전에 다우노마이신으로 지칭됨) 및 독소루비신), 항생제(예를 들면, 닥티노마이신(Dactinomycin)(이전에 액티노마이신으로 지칭됨), 블레오마이신, 미트라마이신(Mithramycin), 및 안트라마이신 (AMC)), 유사분열 저해제(anti-mitotic agent)(예를 들면, 빈크리스틴 및 빈블라스틴) 및 선택적 아폽토시스 물질(selective apoptotic agent), 예를 들면, APTOSYN®(엑시술린드), PANZEM®(2-메톡시에스트라디올), 및 프로테아솜 저해제(proteasome inhibitor)인 VELCADE®(보르테조미브)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

난소암의 치료를 위한 대표적인 항암제는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 에토포시드, 멜팔란(Melphalan), 시스플라틴, 카르보플라틴, CPT, 파클리탁셀, 안트라사이클린(예를 들면, 독소루비신), 헥사메틸아민 (알트레타민), 프로게스틴 (예를 들면, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트), 5-플루오로우라실 + 류코보린(Leucovorin) (폴산 길항제를 중화시킴), 이포스파미드(Ifosfamide), 또는 토포테칸.

유방암의 치료를 위한 대표적인 항암제는 독소루비신, PANZEM®(2-메톡시에스트라디올), 파클리탁셀, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 도세탁셀, 티오테파, 시스플라틴, 타목시펜 및 포레미펜과 같은 에스트로겐 수용체 조절제, 에스트로겐(예를 들면, 디에틸스틸베스트롤), 안드로겐(예를 들면, 플루옥시메스테론), 고나도프로핀-분비 호르몬(GnRH), 아나스트로졸, 아로마타아제 저해제 (항신생물제), 비노렐빈 타르트레이트, 겜시타빈 히드로클로라이드, 프로게스틴 (예를 들면, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트), 트라스투주마브 (HERCEPTIN®), 및 사이클로포스파미드를 포함할 수 있다. 결장암의 치료를 위한 항암제는 옥살리플라틴, 5-플루오로우라실, 또는 류코보린을 포함할 수 있다.

전립선암의 치료를 위한 대표적인 항암제는 항-안드로겐(anti-androgen) (예를 들면, 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 시프로테론, 메게스트롤) 및 황체호르몬 분비 호르몬(Leuteinizing Hormone-Releasing Hormone) 유사체 (예를 들면, 부세렐린, 고세렐린, 류프롤리드(Leuprolide))를 포함할 수 있다. 간암 치료를 위한 항암제는 5-플루오로우라실, 류코보린, 랄티트렉세드(Raltitrexed), 미토마이신 C, 및 CPT-1을 포함할 수 있다. 폐암의 치료를 위한 항암제는 파클리탁셀, 카르보플라틴, 비노렐빈 타르트레이트, 겜시타빈 히드로클로라이드, 에토포시드, 독소루비신, 이포스파미드, 도세탁셀, 사이클로포스파미드, 메토트렉세이트, 로무스틴 (CCNU), 토포테칸 히드로클로라이드, 및 시스플라틴을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 암 치료는 단독으로, 또는 종양의 외과수술에 의한 절제와 조합된, 유전적으로 조작된 성체 ASC와, 플루오로피리미딘 (예를 들면, 5-FU), 옥살리플라틴, CPT-11, (예를 들면, 이리노테칸) 플라티늄 약물 또는 세툭시마브(cetuximab) 항체와 같은 항 EGFR 항체, 또는 이와 같은 요법의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 화학요법 약물의 투여를 포함한다.

추가적인 양태에서, 치료는 종양 또는 주요 종양 매스가 제거된 위치에 유전적으로 조작된 성체 ASC를 투여하는 것과 조합된 방사선 요법 및/또는 종양 매스의 외과 수술에 의한 절제를 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명은 RCC를 갖거나, 또는 RCC를 발병할 증가된 위험을 갖는 것으로 확인된 개체에 항암 조합 요법을 투여하는 것을 포함하고, 상기에서, 탁솔, 사이클로포스파미드, 시스플라틴, 간시클로비르 등과 같은 항암제의 조합이 이용된다. 항암 요법은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있고, 본 발명의 방법에서의 사용을 위해 포함된다. 화학요법은 알킬화제, 유사분열 저해제(mitotic inhibitor), 항생제, 또는 대사길항물질, 항-혈관신생제(anti-angliogenic agent) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 화학요법은 CPT-11, 테모졸로미드, 또는 플라틴 화합물의 투여를 포함할 수 있다. 방사선 요법은 예를 들면, x-선 조사, w-조사, β-조사, 또는 마이크로파를 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 화학요법제는 세포독성형(cytotoxic form)으로 활성화될 수 있는 전구체 약물의 형태일 수 있다. 화학요법제는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자에 의해 일반적으로 알려져 있고 본 발명에서 사용을 위해 포함된다. 예를 들면, 종양 및 신경아교종의 치료를 위한 화학요법제는 테모졸로미드 (Temodar), 프로카르바진 (Matulane), 및 로무스틴 (CCNU)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 정맥내로 투여되는 (IV, 정맥 내로 삽입된 주사바늘을 통해) 화학요법제는 빈크리스틴 (Oncovin 또는 Vincasar PFS), 시스플라틴 (Platinol), 카르무스틴 (BCNU, BiCNU), 및 카르보플라틴 (Paraplatin), 멕소트렉세이트(Mexotrexate) (Rheumatrex 또는 Trexall), 이리노테칸 (CPT-11); 에를로티니브(erlotinib); 옥살리플라틴(oxalipatin); 안트라사이클린-이다루비신 및 다우노루비신; 독소루비신; 멜팔란 및 클로람부실과 같은 알킬화제; 시스-플래티늄, 메토트렉세이트, 및 빈데신 및 빈블라스틴과 같은 알칼로이드를 포함한다.

일 구체예에서, 본 발명의 핵산 작제물을 포함하는 약제학적 작용제가 개체에게 투여될 수 있다. 개체의 예는 포유동물, 예를 들면, 인간 및 다른 영장류; 소, 돼지, 말, 및 농경(농업) 동물; 개, 고양이, 및 기타 사육 애완동물; 생쥐, 쥐, 및 인간을 제외한 형질전환 동물(transgenic non-human animal)을 포함한다.

본 발명은 한정하는 것으로 해석되어서는 안 되는 하기의 실시예에 의해 더 예시된다. 본 출원 전체에서 인용된 모든 참조문헌의 내용, 및 모든 수치 및 표는 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 발명은 본 명세서에 기재된 특정한 방법, 프로토콜, 및 시약 등에 한정되지 않고, 변할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용된 용어는 특정한 구체예 만을 설명하기 위한 목적이고, 본 발명의 범위를 한정하도록 의도되지 않고, 본 발명의 범위는 청구항에 의해서만 정의된다.

참조문헌

본 명세서에서 인용된 논문, 특허 및 특허출원을 포함한 참조문헌은 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 모두 포함된다.

Claims (20)

1. 개체에서 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 개체에게 지방 조직으로부터 유래된 지방-유래 기질 세포(ASC)의 단리된 집단을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 ASC의 단리된 집단 중 하나 이상의 ASC는 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1 핵산 서열을 포함하고, 상기 제1 핵산 서열은 하나 이상의 항암제를 코딩하고, 상기 하나 이상의 항암제를 코딩하는 제1 핵산 서열의 발현은 암의 치료를 위한 것인 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 ASC의 단리된 집단은 상기 조성물이 투여되는 개체와 동일한 개체로부터 수득되는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 항암제는 핵산, 단백질, 펩티드, siRNA, 안티센스 핵산, asRNA, RNAi, miRNA, 항체 및 Fc 단편, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 지방-유래 기질 세포(ASC)의 집단을 포함하는 조성물은 전신으로 투여되거나 또는 종양에 국소로 투여되는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 항암제는 아폽토시스 촉진 분자(pro-apoptotic molecule) 또는 그의 아폽토시스 촉진 단편인 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 항암제는 혈관신생 억제제(anti-angiogenic) 또는 혈관신생-촉진제(pro-angiogenic agent)가 아닌 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 항암제를 코딩하는 제1 핵산 서열은 분비 서열(secretory sequence)도 코딩하는 것인 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 ASC는 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 핵산 서열은 하나 이상의 세포 사망 유전자(cell death gene)을 코딩하는 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 개체는 포유동물 개체인 것인 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 포유동물 개체는 인간 개체인 것인 방법.
11. 제9항에 있어서, 상기 포유동물 개체는 종양의 절제를 받은 적이 없는 것인 방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 지방 조직으로부터 유래된 ASC의 단리된 집단을 포함하는 조성물의 투여는 개체로부터 종양이 절제된 위치에 투여되지 않는 것인 방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 ASC는 체외에서(ex vivo) 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1 핵산 서열에 의해 형질감염된 것인 방법.
14. 제1항에 있어서, 상기 항암제는 폴리펩티드인 것인 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 약물 전구체(pro-drug)를 활성화시키는 단백질인 것인 방법.
16. 제1항에 있어서, 상기 항암제는 발암유전자의 저해제인 것인 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 발암유전자의 저해제는 상기 발암유전자에 대한 RNAi 분자인 것인 방법.
18. 제16항에 있어서, 상기 발암유전자는 HER2/Her-2, BRAC1과 BRAC2, Rb, p53, 및 이들의 변이체로 구성된 암 유전자의 군으로부터 선택되는 것인 방법.
19. 제17항에 있어서, 상기 발암유전자는 HER2/Her-2, BRAC1과 BRAC2, Rb, p53, 및 이들의 변이체로 구성된 암 유전자의 군으로부터 선택되는 것인 방법.
20. 제1항에 있어서, 상기 암은 고형 종양(solid tumor)인 것인 방법.