KR20190126334A - 폴리아데닐화 신호의 압타머-매개된 접근성에 의한 유전자 발현의 조절 - Google Patents
폴리아데닐화 신호의 압타머-매개된 접근성에 의한 유전자 발현의 조절 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20190126334A KR20190126334A KR1020197027452A KR20197027452A KR20190126334A KR 20190126334 A KR20190126334 A KR 20190126334A KR 1020197027452 A KR1020197027452 A KR 1020197027452A KR 20197027452 A KR20197027452 A KR 20197027452A KR 20190126334 A KR20190126334 A KR 20190126334A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- stem
- aptamer
- target gene
- effector
- sequence
- Prior art date
Links
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 title claims abstract description 244
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 title claims abstract description 71
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 title claims description 17
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 title abstract description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 138
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 110
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims abstract description 89
- 108020004422 Riboswitch Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 57
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 57
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 42
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims abstract description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 170
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 57
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 56
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 26
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 26
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 23
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 claims description 20
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 15
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 11
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 11
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 abstract description 24
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 abstract description 6
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 84
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 46
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 45
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 42
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 42
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 34
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 25
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 22
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 15
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 15
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 14
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 12
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 12
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 11
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 11
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 7
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 5
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 4
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical group [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- -1 thioganosine Chemical compound 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 3
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 3
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 3
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 3
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 3
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 3
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 2
- 102100035673 Centrosomal protein of 290 kDa Human genes 0.000 description 2
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 2
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 2
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 2
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 2
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108010058682 Mitochondrial Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000006404 Mitochondrial Proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000012570 Opti-MEM I medium Substances 0.000 description 2
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006274 endogenous ligand Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 102000006639 indoleamine 2,3-dioxygenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004201 indoleamine 2,3-dioxygenase Proteins 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 2
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010014186 ras Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000009919 sequestration Effects 0.000 description 2
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N theophylline Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(C)C2=C1NC=N2 ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- DHPRQBPJLMKORJ-XRNKAMNCSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-7-chloro-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC(Cl)=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O DHPRQBPJLMKORJ-XRNKAMNCSA-N 0.000 description 1
- HNICUWMFWZBIFP-BSZOFBHHSA-N 13-HODE Chemical compound CCCCCC(O)\C=C\C=C/CCCCCCCC(O)=O HNICUWMFWZBIFP-BSZOFBHHSA-N 0.000 description 1
- IOOMXAQUNPWDLL-UHFFFAOYSA-N 2-[6-(diethylamino)-3-(diethyliminiumyl)-3h-xanthen-9-yl]-5-sulfobenzene-1-sulfonate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1S([O-])(=O)=O IOOMXAQUNPWDLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IBSREHMXUMOFBB-JFUDTMANSA-N 5u8924t11h Chemical compound O1[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](OC)C[C@H](O[C@@H]2C(=C/C[C@@H]3C[C@@H](C[C@@]4(O3)C=C[C@H](C)[C@@H](C(C)C)O4)OC(=O)[C@@H]3C=C(C)[C@@H](O)[C@H]4OC\C([C@@]34O)=C/C=C/[C@@H]2C)/C)O[C@H]1C.C1=C[C@H](C)[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@]11O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C3)[C@@H](OC)C2)[C@@H](C)\C=C\C=C/2[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](O)[C@H]3OC\2)O)C[C@H]4C1 IBSREHMXUMOFBB-JFUDTMANSA-N 0.000 description 1
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005508 8-azaguanine Drugs 0.000 description 1
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 description 1
- ZOEFQKVADUBYKV-MCDZGGTQSA-N Adenosine 5'-monophosphate monohydrate Chemical compound O.C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZOEFQKVADUBYKV-MCDZGGTQSA-N 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 229920002799 BoPET Polymers 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 101710198317 Centrosomal protein of 290 kDa Proteins 0.000 description 1
- QMBJSIBWORFWQT-DFXBJWIESA-N Chlormadinone acetate Chemical compound C1=C(Cl)C2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(C)=O)(OC(=O)C)[C@@]1(C)CC2 QMBJSIBWORFWQT-DFXBJWIESA-N 0.000 description 1
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000801643 Homo sapiens Retinal-specific phospholipid-transporting ATPase ABCA4 Proteins 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 201000003793 Myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000005041 Mylar™ Substances 0.000 description 1
- VQAYFKKCNSOZKM-IOSLPCCCSA-N N(6)-methyladenosine Chemical compound C1=NC=2C(NC)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O VQAYFKKCNSOZKM-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- ZAZHPBXBNGWCDV-UHFFFAOYSA-N N2-Maltulosylarginine Chemical compound OC1C(O)C(CNC(CCCNC(=N)N)C(O)=O)(O)OCC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 ZAZHPBXBNGWCDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- VQAYFKKCNSOZKM-UHFFFAOYSA-N NSC 29409 Natural products C1=NC=2C(NC)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(O)C1O VQAYFKKCNSOZKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005289 Neoplastic Cell Transformation Diseases 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 101100168117 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) con-8 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OOPDAHSJBRZRPH-UHFFFAOYSA-L Pyrvinium pamoate Chemical compound C1=CC2=CC(N(C)C)=CC=C2[N+](C)=C1C=CC(=C1C)C=C(C)N1C1=CC=CC=C1.C1=CC2=CC(N(C)C)=CC=C2[N+](C)=C1C=CC(=C1C)C=C(C)N1C1=CC=CC=C1.C12=CC=CC=C2C=C(C([O-])=O)C(O)=C1CC1=C(O)C(C([O-])=O)=CC2=CC=CC=C12 OOPDAHSJBRZRPH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091008103 RNA aptamers Proteins 0.000 description 1
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700020471 RNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000035977 Rare disease Diseases 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 102100033617 Retinal-specific phospholipid-transporting ATPase ABCA4 Human genes 0.000 description 1
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 208000027073 Stargardt disease Diseases 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 1
- PDMMFKSKQVNJMI-BLQWBTBKSA-N Testosterone propionate Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](OC(=O)CC)[C@@]1(C)CC2 PDMMFKSKQVNJMI-BLQWBTBKSA-N 0.000 description 1
- 208000002903 Thalassemia Diseases 0.000 description 1
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710185494 Zinc finger protein Proteins 0.000 description 1
- 102100023597 Zinc finger protein 816 Human genes 0.000 description 1
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine group Chemical group [C@@H]1([C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)N1C=NC=2C(N)=NC=NC12 OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229940120638 avastin Drugs 0.000 description 1
- LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N azathioprine Chemical compound CN1C=NC([N+]([O-])=O)=C1SC1=NC=NC2=C1NC=N2 LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002170 azathioprine Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 208000005980 beta thalassemia Diseases 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 229940053013 bio-mycin Drugs 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 101150038500 cas9 gene Proteins 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229960001616 chlormadinone acetate Drugs 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 208000016097 disease of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 208000011325 dry age related macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229960003704 framycetin Drugs 0.000 description 1
- PGBHMTALBVVCIT-VCIWKGPPSA-N framycetin Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O2)N)O[C@@H]1CO PGBHMTALBVVCIT-VCIWKGPPSA-N 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 102000044890 human EPO Human genes 0.000 description 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960000027 human factor ix Drugs 0.000 description 1
- 229960000900 human factor viii Drugs 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N mercaptopurine Chemical compound S=C1NC=NC2=C1NC=N2 GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001428 mercaptopurine Drugs 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 150000003146 progesterones Chemical class 0.000 description 1
- JIVSXRLRGOICGA-UHFFFAOYSA-N promazine hydrochloride Chemical compound [H+].[Cl-].C1=CC=C2N(CCCN(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 JIVSXRLRGOICGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001836 promazine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 229960001077 pyrvinium pamoate Drugs 0.000 description 1
- 239000013608 rAAV vector Substances 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- BRBKOPJOKNSWSG-UHFFFAOYSA-N sulfaguanidine Chemical compound NC(=N)NS(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=C1 BRBKOPJOKNSWSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004257 sulfaguanidine Drugs 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 229960001712 testosterone propionate Drugs 0.000 description 1
- 229960000278 theophylline Drugs 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960000707 tobramycin Drugs 0.000 description 1
- NLVFBUXFDBBNBW-PBSUHMDJSA-N tobramycin Chemical compound N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N NLVFBUXFDBBNBW-PBSUHMDJSA-N 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- MDYZKJNTKZIUSK-UHFFFAOYSA-N tyloxapol Chemical compound O=C.C1CO1.CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(O)C=C1 MDYZKJNTKZIUSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004224 tyloxapol Drugs 0.000 description 1
- 229920001664 tyloxapol Polymers 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- WAEXFXRVDQXREF-UHFFFAOYSA-N vorinostat Chemical compound ONC(=O)CCCCCCC(=O)NC1=CC=CC=C1 WAEXFXRVDQXREF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000237 vorinostat Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/16—Aptamers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Management, Administration, Business Operations System, And Electronic Commerce (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 1 이상의 폴리아데닐화 신호의 접근성의 압타머-기반 조절에 의한 유전자 발현의 조절을 위한 폴리뉴클레오티드 구조체, 및 압타머에 결합하는 리간드의 존재 또는 부재에 반응하여 유전자 발현을 조절하기 위해 구조체를 사용하는 방법을 제공한다. 폴리뉴클레오티드 구조체는 압타머 및 이펙터 스템 루프를 포함하는 리보스위치를 함유하되, 이펙터 스템 루프가 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다.
Description
발명의 분야
본 발명은 1 이상의 폴리아데닐화 신호의 접근성의 압타머-기반 조절에 의한 유전자 발현의 조절을 위한 폴리뉴클레오티드 구조체, 및 압타머에 결합하는 리간드의 존재 또는 부재에 반응하여 유전자 발현을 조절하기 위해 폴리뉴클레오티드 구조체를 사용하는 방법을 제공한다. 폴리뉴클레오티드 구조체는 압타머 및 이펙터 스템 루프(effector stem loop)를 포함하는 리보스위치를 함유하되, 이펙터 스템 루프가 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다.
발명의 배경
진핵 세포의 메신저(messenger) RNA(mRNA)는 5' 말단 캡핑(capping), 스플라이싱에 의한 인트론의 제거, 및 3' 말단 절단 및 폴리아데닐화를 포함한 광범위한 전사-후 조절에 의해 pre-mRNA 전사물로부터 생산된다. 거의 모든 진핵 mRNA의 3' 말단은 poly(A) 꼬리(poly(A) tail) - 20 내지 250 개 아데노신 잔기의 호모폴리머를 포함한다. poly(A) 꼬리는 큰 단백질 복합체에 의해 촉매화된 과정인 절단 및 폴리아데닐화에 의해 핵에서 pre-mRNA에 첨가된다. poly(A) 꼬리의 첨가는 폴리아데닐화 부위의 업스트림에서 발견된 고도로 보존된 AATAAA(또는 이의 변형 ATTAAA) 폴리아데닐화 신호 서열, 및 다른 업스트림 요소(upstream element)("USE")뿐 아니라, T 또는 GT-풍부 다운스트림 요소(downstream element)("DSE")를 포함한 다중 요소의 존재에 의존한다. mRNA에 대한 poly(A) 꼬리의 첨가는 다른 기능 중에서도 메시지의 저하를 방지한다.
발명의 요약
일 양태에서, 본 발명은 리보스위치(riboswitch)를 포함하는 표적 유전자의 발현의 조절을 위한 폴리뉴클레오티드 카세트(cassette)를 제공하되, 리보스위치가 이펙터 스템-루프(effector stem-loop) 및 압타머를 포함하고, 이펙터 스템-루프가 폴리아데닐화 신호를 포함하며, 압타머 및 이펙터 스템-루프가 압타머 스템의 비공유 암(arm) 및 이펙터 스템 루프의 비공유 암에 대해 상보적인 서열을 포함하는 교번 공유 스템 암에 의해 연결된다. 일 실시양태에서, 압타머는 소분자 리간드에 결합한다.
실시양태에서, 압타머 스템의 서열 및 이펙터 스템 루프의 서열에 대해 상보적인 교번 공유 스템 암의 부위는 4 내지 8 개 뉴클레오티드, 5 내지 7 개 뉴클레오티드, 5 개 뉴클레오티드, 또는 6 개 뉴클레오티드이다. 실시양태에서, 압타머 스템은 6 내지 12 개 염기 쌍, 7 내지 10 개 염기 쌍, 8 개 염기 쌍, 또는 9 개 염기 쌍이다. 실시양태에서, 이펙터 스템 루프의 스템은 4 내지 24 개 염기 쌍, 5 내지 20 개 염기 쌍, 9 내지 14 개 염기 쌍, 9 개 염기 쌍, 10 개 염기 쌍, 11 개 염기 쌍 또는 12 개 염기 쌍이다.
일 실시양태에서, 이펙터 스템-루프는 압타머의 3'에 위치하여, 교번 공유 스템 암이 3' 압타머 스템 암의 전부 또는 일부 및 이펙터 스템의 5' 암의 전부 또는 일부를 포함한다. 일 실시양태에서, 이펙터 스템-루프는 압타머의 5'에 위치하여, 교번 공유 스템 암이 5' 압타머 스템 암의 전부 또는 일부 및 이펙터 스템의 3' 암의 전부 또는 일부를 포함한다. 일 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호는 AATAAA 또는 ATTAAA이다. 일 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호는 다운스트림 요소(DSE)이다. 일 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호는 업스트림 서열 요소(USE)이다.
일 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 카세트는 본 발명의 2 개의 리보스위치를 포함하되, 제1 리보스위치의 이펙터 스템 루프는 폴리아데닐화 신호 AATAAA 또는 ATTAA의 전부 또는 일부를 포함하고 제2 리보스위치의 이펙터 스템 루프는 다운스트림 요소(DSE)의 전부 또는 일부를 포함한다. 일 실시양태에서, 2 개의 리보스위치는 각각 동일한 리간드에 결합하는 압타머를 포함한다. 일 실시양태에서, 2 개의 리보스위치는 상이한 리간드에 결합하는 상이한 압타머를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은
(a) 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트 중 1 이상을 표적 유전자의 3' 비번역 영역(untranslated region) 내로 삽입하는 것,
(b) 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 표적 유전자를 세포 내로 도입하는 것, 및
(c) 표적 유전자의 발현을 증가시키는데 효과적인 양으로 압타머에 결합하는 리간드에 세포를 노출시키는 것을 포함하는, 표적 유전자의 발현을 조절하는 방법을 제공한다.
일 실시양태에서, 리간드는 소분자이다. 일 실시양태에서, 2 개의 리보스위치는 표적 유전자의 3' 비번역 영역("UTR") 내로 삽입되되, 제1 리보스위치의 이펙터 스템 루프는 폴리아데닐화 신호 AATAAA 또는 ATTAA의 전부 또는 일부를 포함하고 제2 리보스위치의 이펙터 스템 루프는 다운스트림 요소(DSE)의 전부 또는 일부를 포함한다. 일 실시양태에서, 2 개의 리보스위치는 각각 동일한 리간드에 결합하는 압타머를 포함한다. 일 실시양태에서, 2 개의 리보스위치는 상이한 리간드에 결합하는 상이한 압타머를 포함한다. 일 실시양태에서, 2 이상의 폴리뉴클레오티드 카세트는 동일한 압타머를 포함한다.
일 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 표적 유전자가 표적 유전자의 발현을 위한 벡터에 포함된다. 일 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일 실시양태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 및 렌티바이러스 벡터로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 카세트를 함유하는 표적 유전자를 포함하는 벡터를 제공한다. 일 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일 실시양태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 및 렌티바이러스 벡터로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트는 표적 유전자의 발현의 조절을 위해 다른 메커니즘과 조합되어 사용된다. 일 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트는 본원에 참고로 포함되는 WO 2016/126747호(PCT/US2016/016234)에 기재된 바와 같이 선택적 스플라이싱(alternative splicing)의 압타머-매개된 조절에 의해 표적 유전자 발현을 조절하는 유전자 조절 카세트와 조합되어 사용된다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트는 본원에 참고로 포함되는 PCT/US2017/016303에 기재된 바와 같이 자가-절단 리보자임의 압타머-매개된 조절에 의해 표적 유전자 발현을 조절하는 유전자 조절 카세트와 조합되어 사용된다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트는 본원에 참고로 포함되는 PCT/US2017/016279에 기재된 바와 같이 폴리아데닐화의 압타머-매개된 조절에 의해 표적 유전자 발현을 조절하는 유전자 조절 카세트와 조합되어 사용된다.
도면의 간단한 설명
도 1a. 압타머의 3' 스템 암이 교번 공유 스템 암(즉, 압타머 스템 또는 이펙터 스템과 스템 구조를 형성할 수 있지만, 둘 다 동시는 아닌 스템 암)을 통해 이펙터 스템-루프의 5' 스템 암에 연결되고, 폴리아데닐화 신호 서열(이 경우에, AATAAA)이 이펙터 스템-루프의 스템에 위치하는, 본 발명의 일 실시양태에 대한 도식.
도 1b. 폴리아데닐화 신호(이 경우에, AATAAA)의 접근성이 압타머 리간드의 존재 또는 부재에 의해 조절되는, 본 발명의 일 실시양태에 대한 도식. 이펙터 스템-루프(스템에 AATAAA 서열이 내장됨)에 연결된 압타머는 3' UTR에 삽입된다. 압타머 서열이 뒤따르는 스템-루프 구조의 5' 암의 상보적 서열은 스템-루프 구조의 5' 암에 연결된다. 압타머 리간드의 부재시(상부 패널), AATAAA 서열은 이펙터 스템-루프에 의해 형성된 스템-루프 구조에 의해 차단되고, 이는 폴리아데닐화를 억제하여, 유전자 발현을 억제한다. 압타머 리간드의 존재시, 압타머/리간드 결합은 압타머 P1 스템의 형성을 가능하게 하여, 이펙터 스템-루프 구조를 파괴하고 격리된 AATAAA의 방출을 야기한다. 스템-루프 구조의 스템과 압타머 P1 스템 사이에 공유되는 서열은 두꺼운 선으로서 나타내었다.
도 1c 및 도 1d. AATAAA 접근성의 압타머-매개된 조절을 통한 루시페라아제 발현의 조절. HEK 293 세포를 지시된 구조체로 형질감염시키고 용매 대조군으로서 DMSO(도 1c) 또는 NaOH(도 1d) 또는 500 μM 구아노신(도 1c) 또는 구아닌(도 1d)으로 처치하였다. 루시페라아제 활성은 평균±S.D. (n=3)로서 표현하였으며, 유도 배수(induction fold)는 구아노신 또는 구아닌의 존재시 얻어진 루시페라아제 활성을 구아노신 또는 구아닌의 부재시 얻어진 값으로 나눈 몫으로서 표현하였다.
도 1e. AATAAA의 접근성의 압타머-매개된 조절을 통한 EGFP 발현의 조절. HEK 293 세포를 지시된 구조체로 형질감염시키고 용매 대조군으로서 NaOH 또는 500 μM 구아닌으로 처치하였다. GFP 형광 강도는 평균±S.D. (n=3)로서 표현하였으며, 유도 배수는 구아닌의 존재시 얻어진 형광 강도를 구아닌의 부재시 얻어진 값으로 나눈 몫으로서 표현하였다.
도 2a. 압타머/리간드 결합에 의해 스템-루프에서 DSE의 접근성을 조절하는 도식. 스템에 DSE 서열이 내장된 스템-루프 형성 구조를 3' UTR에 삽입한다. 압타머 서열은 스템-루프 형성 구조의 3' 암에 연결되고 스템-루프 구조의 3' 암의 상보적 서열이 뒤따른다. 압타머 리간드의 부재시(상부 패널), DSE 서열은 스템-루프 구조의 형성에 의해 차단되어, 폴리아데닐화를 억제하고 표적 유전자 발현을 억제한다. 압타머 리간드의 존재시(하부 패널), 압타머/리간드 결합은 압타머 P1 스템의 형성을 가능하게 하여, 스템-루프 구조를 파괴하고 격리된 DSE 서열의 방출을 야기한다. 이펙터 스템-루프 구조의 스템과 압타머 P1 스템 사이에 공유되는 서열은 두꺼운 선으로서 나타내었다.
도 2b 및 2c. DSE 접근성의 압타머-매개된 조절을 통한 루시페라아제 발현의 조절. HEK 293 세포를 지시된 구조체로 형질감염시키고 용매 대조군으로서 DMSO(도 2b) 또는 NaOH(도 2c) 또는 500 μM 구아노신(도 2b) 또는 구아닌(도 2c)으로 처치하였다. 루시페라아제 활성은 평균±S.D. (n=3)로서 나타내었으며, 유도 배수는 구아노신 또는 구아닌의 존재시 얻어진 루시페라아제 활성을 구아노신 또는 구아닌의 부재시 얻어진 값으로 나눈 몫으로서 표현하였다.
도 3. 합성 polyA 서열에 대한 접근의 압타머-매개된 조절을 통한 루시페라아제 발현의 조절.
도 4. 스템-루프 구조에서의 루프 서열은 polyA-기반 리보스위치 활성에 영향을 준다. stbl_ATA_Gua_1은 더욱 안정적인 TTCG 루프를 갖고, ATA_Gua_1은 GAAA 루프를 가지며, gaat_ATA_Gua_1은 GAAT 루프를 갖는다.
도 5a. 압타머를 통해 AATAAA 및 DSE 서열 둘 다의 접근성을 동시에 조절하는 도식. 각각 AATAAA 또는 DSE 서열이 내장된 2 개의 스템-루프 구조를 표적 유전자의 3' UTR에 삽입하고, 압타머들을 도 1b 및 도 2a에 기재된 바와 같이 각각의 스템-루프 구조에 연결한다. 압타머 1 및 압타머 2는 동일하거나 상이한 리간드에 결합하는 동일하거나 상이한 압타머를 나타낸다. 압타머 리간드의 부재시(상부 패널), AATAAA 및 DSE 둘 다는 스템-루프 구조에 격리되므로, 유전자 발현이 억제된다. 압타머 리간드의 존재시(하부 패널), 압타머 둘 다가 이들의 리간드에 결합할 때, AATAAA 및 DSE 서열 둘 다는 스템-루프 구조로부터 방출되어, 표적 유전자가 발현되게 한다.
도 5b. HEK 293 세포를 지시된 구조체로 형질감염시키고 용매 대조군으로서 NaOH 또는 500 μM 구아닌으로 처치하였다. 루시페라아제 활성은 평균±S.D. (n=3)로서 표현하였으며, 유도 배수는 구아닌의 존재시 얻어진 루시페라아제 활성을 구아닌의 부재시 얻어진 값으로 나눈 몫으로서 표현하였다. polyA 서열의 AATAAA 및 DSE 서열 요소 둘 다를 동시에 격리시키는 것은 ATA_DSE_Gua 구조체에서 루시페라아제 발현의 기저 수준을 더 감소시킨다.
도 6a. ATA_Gua 리보스위치가 3'UTR 내에 있고 G15 리보스위치가 루시페라아제 코딩 서열 내에 삽입되는 이중 스위치 구조체의 도식.
도 6b. 지시된 구조체로 형질감염되고 500 uM 구아닌으로 처치되거나 처치되지 않은 HEK 293 세포로부터의 루시페라아제 활성. 2 개의 스위치를 갖는 구조체 pFLuc-G15_ATA_Gua는 단일 리보스위치를 갖는 구조체에 비해 높은 배수 유도를 생성하였다.
도 7. AATAAA의 접근성의 아데닌 압타머-매개된 조절을 통한 루시페라아제 발현의 조절. HEK 293 세포를 지시된 구조체로 형질감염시키고 용매 대조군으로서 NaOH 또는 1 mM 아데닌으로 처치하였다. 루시페라아제 활성은 평균±S.D. (n=3)로서 표현하였으며, 유도 배수는 아데닌의 존재시 얻어진 루시페라아제 활성을 아데닌의 부재시 얻어진 값으로 나눈 몫으로서 표현하였다.
도 8. 실시예에서 사용된 구조체의 3' UTR. 루시페라아제 유전자에 대한 코딩 서열은 대문자로 나타내었고; AATAAA 및 DSE는 회색 음영으로 강조하였으며; 압타머 서열은 밑줄로 나타내었고; 스템-루프 서열은 물결 밑줄로 나타내었으며; P1 압타머 스템 서열은 이탤릭체로 나타내었다.
도 1a. 압타머의 3' 스템 암이 교번 공유 스템 암(즉, 압타머 스템 또는 이펙터 스템과 스템 구조를 형성할 수 있지만, 둘 다 동시는 아닌 스템 암)을 통해 이펙터 스템-루프의 5' 스템 암에 연결되고, 폴리아데닐화 신호 서열(이 경우에, AATAAA)이 이펙터 스템-루프의 스템에 위치하는, 본 발명의 일 실시양태에 대한 도식.
도 1b. 폴리아데닐화 신호(이 경우에, AATAAA)의 접근성이 압타머 리간드의 존재 또는 부재에 의해 조절되는, 본 발명의 일 실시양태에 대한 도식. 이펙터 스템-루프(스템에 AATAAA 서열이 내장됨)에 연결된 압타머는 3' UTR에 삽입된다. 압타머 서열이 뒤따르는 스템-루프 구조의 5' 암의 상보적 서열은 스템-루프 구조의 5' 암에 연결된다. 압타머 리간드의 부재시(상부 패널), AATAAA 서열은 이펙터 스템-루프에 의해 형성된 스템-루프 구조에 의해 차단되고, 이는 폴리아데닐화를 억제하여, 유전자 발현을 억제한다. 압타머 리간드의 존재시, 압타머/리간드 결합은 압타머 P1 스템의 형성을 가능하게 하여, 이펙터 스템-루프 구조를 파괴하고 격리된 AATAAA의 방출을 야기한다. 스템-루프 구조의 스템과 압타머 P1 스템 사이에 공유되는 서열은 두꺼운 선으로서 나타내었다.
도 1c 및 도 1d. AATAAA 접근성의 압타머-매개된 조절을 통한 루시페라아제 발현의 조절. HEK 293 세포를 지시된 구조체로 형질감염시키고 용매 대조군으로서 DMSO(도 1c) 또는 NaOH(도 1d) 또는 500 μM 구아노신(도 1c) 또는 구아닌(도 1d)으로 처치하였다. 루시페라아제 활성은 평균±S.D. (n=3)로서 표현하였으며, 유도 배수(induction fold)는 구아노신 또는 구아닌의 존재시 얻어진 루시페라아제 활성을 구아노신 또는 구아닌의 부재시 얻어진 값으로 나눈 몫으로서 표현하였다.
도 1e. AATAAA의 접근성의 압타머-매개된 조절을 통한 EGFP 발현의 조절. HEK 293 세포를 지시된 구조체로 형질감염시키고 용매 대조군으로서 NaOH 또는 500 μM 구아닌으로 처치하였다. GFP 형광 강도는 평균±S.D. (n=3)로서 표현하였으며, 유도 배수는 구아닌의 존재시 얻어진 형광 강도를 구아닌의 부재시 얻어진 값으로 나눈 몫으로서 표현하였다.
도 2a. 압타머/리간드 결합에 의해 스템-루프에서 DSE의 접근성을 조절하는 도식. 스템에 DSE 서열이 내장된 스템-루프 형성 구조를 3' UTR에 삽입한다. 압타머 서열은 스템-루프 형성 구조의 3' 암에 연결되고 스템-루프 구조의 3' 암의 상보적 서열이 뒤따른다. 압타머 리간드의 부재시(상부 패널), DSE 서열은 스템-루프 구조의 형성에 의해 차단되어, 폴리아데닐화를 억제하고 표적 유전자 발현을 억제한다. 압타머 리간드의 존재시(하부 패널), 압타머/리간드 결합은 압타머 P1 스템의 형성을 가능하게 하여, 스템-루프 구조를 파괴하고 격리된 DSE 서열의 방출을 야기한다. 이펙터 스템-루프 구조의 스템과 압타머 P1 스템 사이에 공유되는 서열은 두꺼운 선으로서 나타내었다.
도 2b 및 2c. DSE 접근성의 압타머-매개된 조절을 통한 루시페라아제 발현의 조절. HEK 293 세포를 지시된 구조체로 형질감염시키고 용매 대조군으로서 DMSO(도 2b) 또는 NaOH(도 2c) 또는 500 μM 구아노신(도 2b) 또는 구아닌(도 2c)으로 처치하였다. 루시페라아제 활성은 평균±S.D. (n=3)로서 나타내었으며, 유도 배수는 구아노신 또는 구아닌의 존재시 얻어진 루시페라아제 활성을 구아노신 또는 구아닌의 부재시 얻어진 값으로 나눈 몫으로서 표현하였다.
도 3. 합성 polyA 서열에 대한 접근의 압타머-매개된 조절을 통한 루시페라아제 발현의 조절.
도 4. 스템-루프 구조에서의 루프 서열은 polyA-기반 리보스위치 활성에 영향을 준다. stbl_ATA_Gua_1은 더욱 안정적인 TTCG 루프를 갖고, ATA_Gua_1은 GAAA 루프를 가지며, gaat_ATA_Gua_1은 GAAT 루프를 갖는다.
도 5a. 압타머를 통해 AATAAA 및 DSE 서열 둘 다의 접근성을 동시에 조절하는 도식. 각각 AATAAA 또는 DSE 서열이 내장된 2 개의 스템-루프 구조를 표적 유전자의 3' UTR에 삽입하고, 압타머들을 도 1b 및 도 2a에 기재된 바와 같이 각각의 스템-루프 구조에 연결한다. 압타머 1 및 압타머 2는 동일하거나 상이한 리간드에 결합하는 동일하거나 상이한 압타머를 나타낸다. 압타머 리간드의 부재시(상부 패널), AATAAA 및 DSE 둘 다는 스템-루프 구조에 격리되므로, 유전자 발현이 억제된다. 압타머 리간드의 존재시(하부 패널), 압타머 둘 다가 이들의 리간드에 결합할 때, AATAAA 및 DSE 서열 둘 다는 스템-루프 구조로부터 방출되어, 표적 유전자가 발현되게 한다.
도 5b. HEK 293 세포를 지시된 구조체로 형질감염시키고 용매 대조군으로서 NaOH 또는 500 μM 구아닌으로 처치하였다. 루시페라아제 활성은 평균±S.D. (n=3)로서 표현하였으며, 유도 배수는 구아닌의 존재시 얻어진 루시페라아제 활성을 구아닌의 부재시 얻어진 값으로 나눈 몫으로서 표현하였다. polyA 서열의 AATAAA 및 DSE 서열 요소 둘 다를 동시에 격리시키는 것은 ATA_DSE_Gua 구조체에서 루시페라아제 발현의 기저 수준을 더 감소시킨다.
도 6a. ATA_Gua 리보스위치가 3'UTR 내에 있고 G15 리보스위치가 루시페라아제 코딩 서열 내에 삽입되는 이중 스위치 구조체의 도식.
도 6b. 지시된 구조체로 형질감염되고 500 uM 구아닌으로 처치되거나 처치되지 않은 HEK 293 세포로부터의 루시페라아제 활성. 2 개의 스위치를 갖는 구조체 pFLuc-G15_ATA_Gua는 단일 리보스위치를 갖는 구조체에 비해 높은 배수 유도를 생성하였다.
도 7. AATAAA의 접근성의 아데닌 압타머-매개된 조절을 통한 루시페라아제 발현의 조절. HEK 293 세포를 지시된 구조체로 형질감염시키고 용매 대조군으로서 NaOH 또는 1 mM 아데닌으로 처치하였다. 루시페라아제 활성은 평균±S.D. (n=3)로서 표현하였으며, 유도 배수는 아데닌의 존재시 얻어진 루시페라아제 활성을 아데닌의 부재시 얻어진 값으로 나눈 몫으로서 표현하였다.
도 8. 실시예에서 사용된 구조체의 3' UTR. 루시페라아제 유전자에 대한 코딩 서열은 대문자로 나타내었고; AATAAA 및 DSE는 회색 음영으로 강조하였으며; 압타머 서열은 밑줄로 나타내었고; 스템-루프 서열은 물결 밑줄로 나타내었으며; P1 압타머 스템 서열은 이탤릭체로 나타내었다.
발명의 상세한 설명
본 출원은 2017년 2월 21일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/461,689호의 우선권을 주장하며, 이는 그 전체가 본원에 포함된다. 본 출원은 하기 열거된 서열번호를 제공하는 서열 목록을 원용하며, 이는 전자 문서로서 본원에 제공되며 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
표적 유전자(예를 들어, 치료 전이유전자)의 발현의 조절은 다양한 상황에서 유용하거나 필요하다. 유전자의 치료적 발현의 맥락에서, 전이유전자의 조절된 발현을 가능하게 하는 기술은 발현의 수준 및 이의 타이밍을 조절하는 것에 의해 안전성을 향상시킬 수 있는 가능성을 갖는다. 단백질 발현을 제어하기 위해 조절된 시스템은 안전하고 효과적인 치료 적용을 위해 실용적이고, 일부 경우에 필수적인 역할을 갖는다. 본 발명은 압타머에 연결되는 스템-루프 구조(이펙터 스템-루프)에서 1 이상의 폴리아데닐화 신호를 격리시키는 것에 의한 폴리아데닐화의 압타머-기반 조절에 의한 유전자 발현의 조절을 위한 폴리뉴클레오티드 구조체, 및 압타머에 결합하는 리간드의 존재 또는 부재에 반응하여 유전자 발현을 조절하기 위해 구조체를 사용하는 방법을 제공한다.
폴리뉴클레오티드 구조체는 이펙터 스템-루프 및 압타머를 포함하는 적어도 하나의 리보스위치를 함유하되, 이펙터 스템-루프가 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다. 압타머 및 이펙터 스템-루프는 압타머 리간드의 존재에 따라 압타머 스템 또는 이펙터 스템을 갖는 스템을 교대로 형성할 수 있는 공유 스템 암에 의해 연결된다. 압타머 리간드가 존재하고 압타머에 결합될 때, 압타머 스템(압타머 P1 스템)은 안정화되고 교번 공유 스템 암을 갖는 스템을 형성한다. 따라서, 리간드의 존재시, 이펙터 스템-루프에 의해 형성된 스템-루프 구조는 비선호되고 폴리아데닐화 신호가 접근가능해지며, 이는 폴리아데닐화가 발생하게 하여 표적 유전자 발현을 향상시킨다. 리간드의 부재시, 이펙터 스템-루프는 교번 공유 스템 암을 갖는 스템 구조를 형성하여, 폴리아데닐화 신호 서열을 격리시키며, 폴리아데닐화를 막고 표적 유전자 발현을 감소시킨다.
일 실시양태에서, 이펙터 스템 루프는 압타머의 3'에 위치하여, 교번 공유 스템 암이 3' 압타머 스템 암의 전부 또는 일부 및 이펙터 스템 루프의 5' 암의 전부 또는 일부를 포함한다(예를 들어, 도 1 a 및 1b 참고). 일 실시양태에서, 이펙터 스템 루프는 압타머의 5'에 위치하여, 교번 공유 스템 암이 5' 압타머 스템 암의 전부 또는 일부 및 이펙터 스템 루프의 3' 암의 전부 또는 일부를 포함한다(예를 들어, 도 3 참고).
유전자 조절 폴리뉴클레오티드 카세트는, 3' UTR에서의 표적 유전자의 DNA 내로 포함될 때, 폴리아데닐화의 압타머/리간드 매개된 조절에 의해 표적 유전자의 발현을 조절하는 능력을 제공하는 재조합 DNA 구조체를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드 카세트 또는 구조체는 상이한 공급원(예를 들어, 상이한 유기체, 동일한 유기체로부터의 상이한 유전자 등)으로부터 유래된 요소를 포함하는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)이다.
리보스위치
폴리뉴클레오티드 카세트는 리보스위치를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "리보스위치"는 RNA 폴리뉴클레오티드(또는 리보스위치를 코딩하는 DNA)의 조절 세그먼트를 지칭한다. 본 발명의 맥락에서 리보스위치는, 리간드(예를 들어, 소분자)의 존재를 감지하는 것 및 이펙터 스템-루프에 위치한 폴리아데닐화 서열의 접근성을 조절하는 것을 함께 담당하는 센서 영역(예를 들어, 압타머) 및 이펙터 스템-루프를 함유한다. 일 실시양태에서, 리보스위치는 2 이상의 공급원으로부터의 폴리뉴클레오티드를 이용한 재조합체이다. 리보스위치의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같은 용어 "합성"은 자연적으로 발생하지 않는 리보스위치를 지칭한다.
이펙터 스템-루프
리보스위치의 이펙터 스템-루프는, 센서 영역(예를 들어, 압타머)에 결합하는 리간드의 부재시, 폴리아데닐화 신호 서열의 접근성을 감소시키는 스템 구조(즉, 이중-가닥 영역)를 형성하는 RNA 서열(또는 RNA 서열을 코딩하는 DNA)을 포함한다. 일 실시양태에서, 이펙터 스템-루프는 폴리아데닐화 신호 서열 및 폴리아데닐화 신호 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 스템-루프의 스템 부위는 폴리아데닐화 신호 서열의 부위만을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호 서열의 전부 또는 일부는 이펙터 스템-루프의 루프 부위에 위치한다.
폴리아데닐화 신호 서열은 AATAAA(또는 관련 서열), 다운스트림 서열 요소(DSE)(예를 들어, T 또는 GT-풍부 풍부 서열), 또는 업스트림 서열 요소(USE)를 포함한 표적 유전자로부터 전사된 mRNA의 효율적인 폴리아데닐화에 관련된 표적 유전자의 3' UTR에서의 임의의 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호 서열은 표적 유전자의 3' UTR로부터의 내인성 서열이다. 다른 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호 서열은 외인성 서열(예를 들어, 상이한 유전자 또는 상이한 유기체로부터의 서열) 또는 합성 폴리아데닐화 신호 서열이다.
이펙터 스템-루프의 스템 암 중 하나는 압타머의 스템을 통해 압타머에 연결된다(예를 들어, 도 1a, 1b, 및 2a 참고). 압타머가 이의 리간드에 결합되지 않을 때, 이펙터 스템-루프는 폴리아데닐화 신호 서열에 대한 접근을 억제하는 맥락에서, 폴리아데닐화를 억제하고 메시지의 저하를 야기한다. 압타머가 이의 리간드에 결합될 때, 이펙터 스템-루프는 폴리아데닐화 신호 서열에 대한 접근을 억제하지 않는 입체 구조로, 메시지의 폴리아데닐화 및 표적 유전자 발현 증가를 허용한다.
이펙터 스템-루프의 스템 부위는 스템-루프 구조 형성을 촉진하여 압타머 리간드가 충분한 양으로 존재하지 않을 때 폴리아데닐화 신호 서열에 대한 접근성을 억제하기에 충분한 길이(및 GC 함량)여야 한다. 본 발명의 실시양태에서, 이펙터 스템-루프의 스템 부위는 폴리아데닐화 신호 서열 및 이의 상보적 서열 이외의 스템 서열을 포함한다. 스템 부위의 길이 및 서열은 어떠한 리간드도 존재하지 않을 때 표적 유전자의 허용 가능한 배경 발현 및 리간드가 존재할 때 표적 유전자의 허용 가능한 발현 수준을 허용하는 스템을 확인하기 위해 알려진 기술을 사용하여 변형될 수 있다. 스템이 예를 들어, 지나치게 긴 경우에, 이는 리간드의 존재 또는 부재시 폴리아데닐화 신호 서열에 대한 접근을 숨길 수 있다. 스템이 지나치게 짧은 경우에, 이는 폴리아데닐화 신호 서열을 격리시킬 수 있는 안정적인 스템-루프 구조를 형성할 수 없으며, 이러한 경우에 메시지의 폴리아데닐화(표적 유전자의 발현을 야기함)는 리간드의 존재 또는 부재시 발생할 것이다. 일 실시양태에서, 이펙터 스템(즉, 이펙터 스템-루프의 스템-형성 부위)의 총 길이는 4 내지 24 개 염기 쌍, 5 내지 20 개 염기 쌍, 9 내지 14 개 염기 쌍, 9 개 염기 쌍, 10 개 염기 쌍, 11 개 염기 쌍 또는 12 개 염기 쌍이다. 스템의 길이 이외에, 스템의 GC 염기 쌍 함량이 변경되어 스템의 안정성을 변형시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 이펙터 영역 스템은 이펙터 영역 스템의 상보적 부위와 염기 쌍을 형성하지 않는 1 이상의 미스매치된(mismatched) 뉴클레오티드를 함유한다.
교번 공유 스템 암
이펙터 스템-루프 및 압타머는 이펙터 스템-루프의 비-공유 암 및 압타머 스템의 비-공유 암 둘 다에 대해 상보적인 서열을 포함하는 교번 공유 스템 암을 통해 연결된다. 비공유 암 상의 압타머 및 이펙터 스템 둘 다에 대해 상보적인 서열로 인해, 공유 스템 암은 압타머 리간드의 존재에 따라 압타머 스템 또는 이펙터 스템과 스템을 교대로(그러나 둘다 동시는 아님) 형성할 수 있다. 실시양태에서, 압타머 스템의 서열 및 이펙터 스템 루프의 서열에 대해 상보적인 교번 공유 스템 암의 부위(즉, 교번 공유 서열)는 4 내지 8 개 뉴클레오티드, 5 내지 7 개 뉴클레오티드, 5 개 뉴클레오티드, 또는 6 개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 교번 공유 스템 암은 비공유 이펙터 스템 또는 압타머 스템 중 하나에 대해서만 상보적인 추가 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 교번 공유 서열 이외에, 교번 공유 스템 암은 (a) 비공유 이펙터 스템 암에 대해 상보적이지만, 비공유 압타머 스템 암에 대해 상보적이지 않은 서열; (b) 비공유 압타머 스템 암에 대해 상보적이지만, 비공유 이펙터 스템 암에 대해 상보적이지 않은 서열; 또는 (c) 둘 다를 포함한다.
압타머/리간드
일 실시양태에서, 센서 영역은 압타머를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "압타머"는 리간드에 특이적으로 결합하는 RNA 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 압타머는 압타머 스템을 통해 이펙터 스템-루프에 연결된다. 압타머 스템은 통상적으로 압타머의 일부인 서열(예를 들어, 야생형 압타머 스템 서열)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 이와 같이, 압타머 스템에 대한 참고는 압타머 스템이 임의의 특별한 서열을 포함한다는 것을 의미하지 않는다. 따라서, 압타머 스템은 압타머로부터의 서열 및/또는 리간드/압타머 결합시 스템을 형성할 수 있는 추가 서열을 포함할 수 있다.
상기 논의된 이펙터 스템-루프의 스템과 마찬가지로, 압타머 스템 루프는 압타머 리간드의 존재시 압타머가 압타머 스템을 형성하고 리간드가 존재하지 않을 때 이펙터 스템-루프가 스템을 형성하기에 충분한 길이(및 GC 함량)여야 한다. 압타머 스템의 길이 및 서열은 어떠한 리간드도 존재하지 않을 때 표적 유전자의 허용 가능한 배경 발현 및 리간드가 존재할 때 표적 유전자의 허용 가능한 발현 수준을 허용하는 스템을 확인하기 위해 알려진 기술을 사용하여 변형될 수 있다. 실시양태에서, 압타머 스템은 6 내지 12 개 염기 쌍, 7 내지 10 개 염기 쌍, 8 개 염기 쌍, 또는 9 개 염기 쌍이다.
용어 "리간드"는 압타머에 의해 특이적으로 결합되는 분자를 지칭한다. 일 실시양태에서, 리간드는 예를 들어, 지질, 단당류, 2 차 메신저, 보조-인자, 금속 이온, 다른 천연 생성물 및 대사물질, 핵산뿐 아니라, 대부분의 치료 약물을 포함한 소분자량(약 1,000 달톤 미만) 분자이다. 일 실시양태에서, 리간드는 2 이상의 뉴클레오티드 염기를 갖는 폴리뉴클레오티드이다.
일 실시양태에서, 리간드는 8-아자구아닌, 아데노신 5'-모노포스페이트 모노하이드레이트, 암포테리신 B, 아버멕틴 B1, 아자티오프린, 클로르마디논 아세테이트, 메르캅토퓨린, 모리시진 하이드로클로라이드, N6-메틸아데노신, 나디드(nadide), 프로게스테론, 프로마진 하이드로클로라이드, 피르비늄 파모에이트, 설파구아니딘, 테스토스테론 프로피오네이트, 티오구아노신, 틸록사폴 및 보리노스타트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
압타머 리간드는 또한 특정 생리학적/병리학적 조건 하에서, 예컨대 종양발생 형질전환을 유의하게 증가시키는 세포 내인성 성분일 수 있으며 - 이들은 2 차 메신저 분자, 예컨대 GTP 또는 GDP, 칼슘; 지방산, 또는 잘못 대사작용된 지방산, 예컨대 유방암에서의 13-HODE(본원에 참고로 포함되는 Flaherty, JT et al., Plos One, Vol. 8, e63076, 2013); 아미노산 또는 아미노산 대사물질; 대사 질환의 암 세포 또는 정상 세포에서 보통 높은 수준을 갖는 해당과정에서의 대사물질; 및 암-연관 분자, 예컨대 Ras 또는 돌연변이 Ras 단백질, 폐암에서의 돌연변이 EGFR, 많은 유형의 암에서의 인돌레아민-2,3-디옥시게나아제(IDO)를 포함할 수 있다. 내인성 리간드는 JP Wiebe(본원에 참고로 포함되는 Endocrine-Related Cancer (2006) 13:717-738)에 의해 개시된 바와 같이 유방암에서의 프로게스테론 대사물질을 포함한다. 내인성 리간드는 또한 Minton, DR 및 Nanus, DM(본원에 참고로 포함되는 Nature Reviews, Urology, Vol. 12, 2005)에 의해 개시된 바와 같이 락테이트, 글루타티온, 카이뉴레닌과 같은 신장암에서의 핵심 대사 효소에서의 돌연변이로부터 야기된 증가된 수준을 갖는 대사물질을 포함한다.
압타머는 의도된 표적 분자(즉, 리간드)와 복합체를 형성할 수 있는 결합 영역을 갖는다. 결합의 특이성은 비관련 분자에 대한 압타머의 해리 상수(Kd)와 비교한 이의 리간드에 대한 압타머의 상대적 해리 상수의 측면에서 정의될 수 있다. 따라서, 리간드는 비관련 물질에 비해 큰 친화도로 압타머에 결합하는 분자이다. 통상적으로, 이의 리간드에 대한 압타머의 Kd는 비관련 분자에 대한 압타머의 Kd에 비해 적어도 약 10 배 작을 것이다. 다른 실시양태에서, Kd는 적어도 약 20 배, 적어도 약 50 배, 적어도 약 100 배, 및 적어도 약 200 배 작을 것이다. 압타머는 통상적으로 약 15 내지 약 200 개 뉴클레오티드 길이일 것이다. 더욱 일반적으로, 압타머는 약 30 내지 약 100 개 폴리뉴클레오티드 길이일 것이다.
리보스위치의 일부로서 포함될 수 있는 압타머는 자연 발생 압타머, 또는 이의 변형, 또는 새롭게 설계되고/되거나 지수 증식에 의한 리간드의 계통적 진화(systemic evolution of ligands by exponential enrichment)(SELEX) 또는 다른 스크리닝 방법을 통해 스크리닝된 압타머일 수 있다. 소분자 리간드에 결합하는 압타머의 예는, 비제한적으로, 테오필린, 도파민, 설포로다민 B, 셀로비오스, 카나마이신 A, 리비도마이신, 토브라마이신, 네오마이신 B, 비오마이신, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 사이토카인, 세포 표면 분자, 및 대사물질을 포함한다. 소분자를 인식하는 압타머의 검토에 대해 예를 들어, Famulok, Science 9:324-9 (1999) 및 McKeague, M. & DeRosa, M.C. J. Nuc. Aci. 2012(둘 다 본원에 참고로 포함됨)를 참고한다. 다른 실시양태에서, 압타머는 상보적 폴리뉴클레오티드이다.
압타머/리간드를 확인하기 위한 방법
일 실시양태에서, 압타머는 특별한 소분자 리간드에 결합하도록 설계된다. 특별한 리간드에 결합하는 압타머를 설계 및 선택하기 위한 방법은 본원에 참고로 포함되는 WO/2018/025085호에 개시되어 있다. 압타머를 스크리닝하기 위한 다른 방법은 예를 들어, SELEX를 포함한다. SELEX를 사용하여 소분자에 선택적으로 결합하는 압타머를 설계하기 위한 방법은 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,475,096호, 제5,270,163호, 및 Abdullah Ozer, et al. Nuc. Aci. 2014에 개시되어 있다. SELEX 과정의 변형은 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,580,737호 및 제5,567,588호에 기재되어 있다.
압타머를 확인하기 위한 선택 기술은 일반적으로 무작위화되거나 돌연변이 생성되는 영역을 함유하는 소망하는 길이의 DNA 또는 RNA 분자의 큰 풀(pool)을 제작하는 것을 포함한다. 예를 들어, 압타머 선택을 위한 올리고뉴클레오티드 풀은, 약 15-25 개 뉴클레오티드 길이이고 PCR 프라이머의 결합을 위해 유용한 정의된 서열의 영역이 측면배치된 20-100 개의 무작위화된 뉴클레오티드의 영역을 함유할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 풀은 표준 PCR 기술, 또는 선택된 핵산 서열의 증폭을 허용하는 다른 수단을 사용하여 증폭된다. DNA 풀은 시험관내(in vitro)에서 전사되어, RNA 압타머를 소망할 때 RNA 전사물의 풀을 생산할 수 있다. RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드의 풀은 그 다음에 소망하는 리간드에 특이적으로 결합하는 이들의 능력에 기초하여 선택된다. 선택 기술은 예를 들어, 친화도 크로마토그래피를 포함하나, 다른 분자에 특이적으로 결합하는 이들의 능력에 기초한 핵산의 선택을 허용할 임의의 프로토콜이 사용될 수 있다. 소분자에 결합하는 압타머 및 세포 내에서의 기능을 확인하기 위한 선택 기술은 세포 기반 스크리닝 방법을 포함할 수 있다. 친화도 크로마토그래피의 경우에, 올리고뉴클레오티드는 칼럼 내 기질 상에 또는 자성 비드 상에 고정된 표적 리간드와 접촉된다. 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 정상 생리학적 조건을 모방한 염 농도, 온도, 및 다른 조건의 존재시 리간드 결합에 대해 선택된다. 리간드에 결합하는 풀에서의 올리고뉴클레오티드는 칼럼 또는 비드 상에 함유되며, 비결합 서열은 유실된다. 리간드에 결합하는 올리고뉴클레오티드는 그 다음에 PCR에 의해(보통 용출 후) 증폭된다(RNA 전사물이 이용되는 경우 역전사 후). 선택 과정은 총 약 3 내지 10 반복 라운드의 선택 절차 동안 선택된 서열에 대해 반복된다. 그 결과 얻어진 올리고뉴클레오티드는 그 다음에 표적 리간드에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드의 서열을 확인하기 위해, 표준 절차를 사용하여 증폭, 클로닝, 및 시퀀싱된다. 일단 압타머 서열이 확인되면, 압타머는 돌연변이화 생성된 압타머 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 풀로부터 출발하는 선택의 추가 라운드를 수행하는 것에 의해 추가로 최적화될 수 있다.
생체내(in vivo) 압타머 스크리닝은 1 회 이상 라운드의 시험관내 선택(예를 들어, SELEX) 후에 사용될 수 있다. 예를 들어, Konig, J. et al.(본원에 참고로 포함되는 RNA. 2007, 13(4):614-622)은 압타머의 생체내 선택을 위해 SELEX 및 효모 3-하이브리드 시스템을 조합하는 것을 기재한다.
표적 유전자
본 발명의 유전자 조절 카세트는 표적 세포, 조직 또는 유기체에서 발현될 수 있는 임의의 표적 유전자의 발현을 폴리아데닐화되는 mRNA로 조절하기 위해 사용될 수 있는 플랫폼이다. 용어 "표적 유전자"는 세포 내로 도입되고 RNA 내로 전사될 수 있으며 적절한 조건 하에서 번역 및/또는 발현되는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 대안적으로, 표적 유전자는 표적 세포에 대해 내인성이고, 본 발명의 유전자 조절 카세트는 표적 유전자의 3' UTR 내에 위치한다. 표적 유전자의 예는 치료 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 일 실시양태에서, 표적 유전자는 재조합 DNA 구조체가 전사될 세포에 대해 외인성이다. 다른 실시양태에서, 표적 유전자는 재조합 DNA 구조체가 전사될 세포에 대해 내인성이다.
본 발명에 따른 표적 유전자는 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있다. 표적 유전자는 예를 들어, 구조적 단백질, 효소, 세포 시그널링 단백질, 미토콘드리아 단백질, 징크 핑거 단백질, 호르몬, 수송 단백질, 성장 인자, 사이토카인, 세포내 단백질, 세포외 단백질, 막관통 단백질, 세포질 단백질, 핵 단백질, 수용체 분자, RNA 결합 단백질, DNA 결합 단백질, 전사 인자, 번역 기구, 통로 단백질, 운동 단백질, 세포 접착 분자, 미토콘드리아 단백질, 대사 효소, 키나아제, 포스파타아제, 교환 인자, 샤페론 단백질, 및 이들 중 임의의 것의 조절인자를 코딩하는 유전자일 수 있다. 실시양태에서, 표적 유전자는 에리스로포이에틴(Epo), 인간 성장 호르몬(hGH), 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 인간 인슐린, CRISPR 연관 단백질 9(cas9), 또는 예를 들어, 치료 항체를 포함한 면역글로불린(또는 이의 부위)을 코딩한다.
발현 구조체
본 발명은 표적 유전자를 코딩하고 본원에 기재된 유전자 조절 카세트를 함유하는 폴리뉴클레오티드의 표적 세포 내로의 도입을 위한 재조합 벡터의 사용을 고려한다. 많은 실시양태에서, 본 발명의 재조합 DNA 구조체는 숙주 세포에서 DNA의 복제 및 상기 세포에서 적절한 수준으로의 표적 유전자의 발현을 위해 제공되는 DNA 세그먼트를 포함하는 추가 DNA 요소를 포함한다. 당업자는 발현 대조군 서열(프로모터, 인핸서 등)이 표적 세포에서 표적 유전자의 발현을 촉진시키는 이들의 능력에 기초하여 선택된다는 것을 인식한다. "벡터"는 시험관내 또는 생체내에서 숙주 세포 내로 전달될 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 플라스미드, 효모 인공 염색체(yeast artificial chromosome)(YAC), 소형 염색체, DNA 소형-고리 또는 바이러스(바이러스 유래 서열을 포함함)를 의미한다. 일 실시양태에서, 재조합 벡터는 바이러스 벡터 또는 다중 바이러스 벡터의 조합이다.
표적 세포, 조직, 또는 유기체에서 표적 유전자의 압타머-매개된 발현을 위한 바이러스 벡터는 당업계에 알려져 있으며 아데노바이러스(AV) 벡터, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터, 및 단순포진 1 형(Herpes simplex type 1)(HSV1) 벡터를 포함한다.
아데노바이러스 벡터는 예를 들어, E1 및 E3 영역에서의 결실을 통해 결함적인 복제가 이루어진 인간 아데노바이러스 2 형 및 인간 아데노바이러스 5 형을 기본으로 하는 것들을 포함한다. 전사 카세트는 E1 영역 내로 삽입되어, 재조합 E1/E3-결실된 AV 벡터를 산출할 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 또한 바이러스 코딩 서열을 함유하지 않는 헬퍼-의존성 고-성능 아데노바이러스 벡터(고-성능 "거틀리스(gutless)" 또는 "거티드(gutted)" 벡터로서도 알려짐)를 포함한다. 이들 벡터는 바이러스 DNA 복제 및 패키징을 위해 필요한 cis-작용성 요소, 주로 역전 말단 반복 서열(inverted terminal repeat sequence)(ITR) 및 패키징 신호(ψ)를 함유한다. 이들 헬퍼-의존성 AV 벡터 게놈은 수백 개의 염기 쌍에서 최대 대략 36 kb의 외래 DNA를 운반할 가능성을 갖는다.
재조합 아데노-연관 바이러스 "rAAV" 벡터는, 비제한적으로, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-7 및 AAV-8, AAV-9, AAV-10 등을 포함한 임의의 아데노-연관 바이러스 혈청형으로부터 유래된 임의의 벡터를 포함한다. rAAV 벡터는 전체적으로 또는 부분적으로 결실된 1 이상의 AAV 야생형 유전자, 바람직하게는 Rep 및/또는 Cap 유전자를 가질 수 있지만, 기능적 측면배치된 ITR 서열을 함유할 수 있다. 기능적 ITR 서열은 AAV 게놈의 구조(rescue), 복제, 패키징 및 잠재적 염색체 통합을 위해 함유된다. ITR은 야생형 뉴클레오티드 서열일 필요가 없으며, 서열이 기능적 구조, 복제 및 패키징을 제공하는 한 변경될 수 있다(예를 들어, 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의함).
대안적으로, 다른 시스템, 예컨대 렌티바이러스 벡터가 본 발명의 실시양태에서 사용될 수 있다. 렌티바이러스-기반 시스템은 비-분열뿐 아니라 분열 세포를 형질도입하여, 이들이 예를 들어 CNS의 비-분열 세포를 표적화하는 적용을 위해 유용하도록 할 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스로부터 유래되며, 상기 바이러스와 마찬가지로 장기(long-term) 유전자 발현에 대한 가능성을 제공하는 숙주 세포 내로 통합된다.
유전자 조절 카세트를 함유하는 표적 유전자를 운반하는 플라스미드, YAC, 소형염색체 및 소형고리를 포함한 폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들어, 담체로서 양이온 지질, 중합체, 또는 둘 다를 사용한 비바이러스 벡터 시스템에 의해 세포 또는 유기체 내로 도입될 수 있다. 콘쥬게이트된 폴리-L-라이신(PLL) 중합체 및 폴리에틸렌이민(PEI) 중합체 시스템이 또한 벡터를 세포로 전달하기 위해 사용될 수 있다. 세포 배양액 및 유기체 둘 다의 경우에서, 벡터를 세포로 전달하기 위한 다른 방법은 유체역학적 주입(hydrodynamic injection) 및 전기천공법 및 초음파의 사용을 포함한다. 유전자 전달을 위한 바이러스 및 비-바이러스 전달 시스템의 검토에 대해서는 Nayerossadat, N. et al.(본원에 참고로 포함되는 Adv Biomed Res. 2012; 1:27)을 참고한다.
표적 유전자의 발현을 조절하는 방법
일 양태에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 1 이상의 유전자 조절 폴리뉴클레오티드 카세트를 표적 유전자의 3' UTR 내로 삽입하는 것; (b) 유전자 조절 카세트를 포함하는 표적 유전자를 세포 내로 도입하는 것; 및 (c) 세포를 압타머에 결합하는 리간드에 노출시키는 것에 의해 표적 유전자(예를 들어, 치료 유전자)의 발현을 조절하는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 리간드는 소분자이다. 양태에서, 표적 세포에서 표적 유전자의 발현은 그것이 도입된 세포에게 소망하는 특성을 부여하거나, 이와 달리 소망하는 치료 결과를 야기한다. 표적 유전자는 진핵 세포, 예를 들어 포유동물 세포이다. 실시양태에서, 표적 세포는 예를 들어, 지방, 중추신경계(CNS), 근육, 심장, 눈, 간 등을 포함한 표적 조직으로부터의 인간 세포이다.
일 실시양태에서, 1 이상의 유전자 조절 카세트는 표적 유전자의 3' 비번역 영역 내로 삽입된다. 일 실시양태에서, 단일 유전자 조절 카세트는 표적 유전자의 3' UTR 내로 삽입된다. 일 실시양태에서, 2 개의 리보스위치는 표적 유전자의 3' 비번역 영역 내로 삽입되되, 제1 리보스위치의 이펙터 스템 루프는 폴리아데닐화 신호 AATAAA(또는 ATTAA)의 전부 또는 일부를 포함하고 제2 리보스위치의 이펙터 스템 루프는 다운스트림 요소(DSE)의 전부 또는 일부를 포함한다.
일 실시양태에서, 다중 유전자 조절 카세트가 표적 유전자 내로 삽입될 때, 이들은 각각 동일한 압타머를 함유하여 단일 리간드가 표적 유전자의 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 다중 유전자 조절 카세트가 표적 유전자 내로 삽입될 때, 각각은 상이한 압타머를 함유하여 다수의 상이한 소분자 리간드에 대한 노출이 표적 유전자 발현을 조절할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트는 표적 유전자의 발현의 조절을 위해 다른 메커니즘과 조합되어 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트는 본원에 참고로 포함되는 WO 2016/126747호에 기재된 바와 같이 선택적 스플라이싱의 압타머-매개된 조절에 의해 표적 유전자 발현을 조절하는 유전자 조절 카세트와 조합되어 사용된다. 본 발명은 또한 본원에 참고로 포함되는 PCT/US2017/016303 및 PCT/US1207/016279에 기재된 폴리뉴클레오티드 구조체 및 방법과 조합되어 사용될 수 있다.
치료 방법 및 약학 조성물
본 발명의 일 양태는 유전자 요법에 의해 전달된 치료 단백질의 수준을 조절하는 방법을 제공한다. 본 실시양태에서, "표적 유전자"는 치료 단백질을 코딩할 수 있다. "표적 유전자"는 세포에 대해 내인성 또는 외인성인 단백질을 코딩할 수 있다.
압타머-구동된 리보스위치를 갖는 조절 카세트를 함유하는 치료 유전자 서열은 예를 들어, 벡터에 의해 시험관내 또는 생체외(ex vivo)에서 표적 유전자에게 전달된다. "표적 유전자"의 세포 특이성은 프로모터 또는 벡터 내의 다른 요소에 의해 제어될 수 있다. 표적 유전자 및 폴리뉴클레오티드 카세트를 함유하는 벡터 구조체의 전달, 및 조절된 표적 유전자의 안정적인 형질감염을 야기하는 표적 조직의 형질감염은 보통 치료 단백질을 생산하는 것에서 제1 단계이다.
그러나, 표적 유전자 서열 내의 조절 카세트의 존재로 인해, 표적 유전자는 상당한 수준으로 발현되지 않으며(또는 낮은 수준으로 발현되며), 즉 이는 조절 카세트 리보스위치 내에 함유된 압타머에 결합하는 특이적 리간드의 부재시 "오프 상태(off state)"에 있다. 압타머 특이적 리간드가 투여될(또는 이와 달리, 충분한 양으로 존재할) 때에만, 표적 유전자 발현이 활성화되거나 증가된다.
폴리뉴클레오티드 카세트를 갖는 표적 유전자를 함유하는 벡터 구조체의 전달 및 활성화 리간드의 전달은 일반적으로 시간이 분리된다. 활성화 리간드의 전달은 표적 유전자가 발현될 시기뿐 아니라 단백질 발현의 수준을 제어할 것이다. 리간드는, 비제한적으로, 경구, 근육내(IM), 정맥내(IV), 안내, 또는 국소를 포함한 다수의 경로에 의해 전달될 수 있다.
리간드의 전달의 타이밍은 표적 유전자의 활성화에 대한 요구에 의존할 것이다. 예를 들어, 표적 유전자에 의해 코딩된 치료 단백질이 지속적으로 필요한 경우에, 경구 소분자 리간드가 매일, 또는 매일 다수회 투여되어, 표적 유전자의 연속적인 활성을 보장할 수 있으므로, 치료 단백질의 연속적인 발현을 보장할 수 있다. 표적 유전자가 장기 작용 효과를 갖는 경우, 유도 리간드는 덜 자주 투여될 수 있다.
본 발명은 치료 전이유전자의 발현이 조절 폴리뉴클레오티드 카세트의 리보스위치 내의 압타머에 대해 특이적인 리간드의 일시적 투여에 의해 결정되는 방식으로 일시적으로 제어되게 한다. 리간드를 투여할 때 만의 치료 전이유전자의 발현 증가는 표적 유전자가 리간드의 부재시 오프되게 하여 유전자 요법 치료의 안전성을 증가시킨다.
상이한 리간드가 표적 유전자를 활성화시키게 하기 위해 상이한 압타머가 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 조절 카세트를 함유하는 각각의 치료 유전자는 특이적 소분자에 의해 활성화될 카세트 내의 특이적 압타머를 가질 것이다. 이는 각각의 치료 유전자가 그 내부에 하우징된(housed) 압타머에 대해 특이적인 리간드에 의해서만 활성화될 수 있다는 것을 의미한다. 이들 실시양태에서, 각각의 리간드는 하나의 치료 유전자만을 활성화시킬 것이다. 이는 몇몇의 상이한 "표적 유전자"가 하나의 개체에게 전달될 수 있고, 각각이 각각의 표적 유전자에 하우징된 조절 카세트 내에 함유된 압타머에 대해 특이적 리간드의 전달시 활성화될 것이라는 가능성을 허용한다.
본 발명은 유전자가 신체에 전달될 수 있는 임의의 치료 단백질(예컨대 에리스로포이에틴(EPO) 또는 치료 항체)이 활성화 리간드가 전달될 때 신체에 의해 생산되게 한다. 이 치료 단백질 전달 방법은, 그 다음에 주입되거나 투입되는 이러한 치료 단백질, 예를 들어 암에서 또는 염증성이나 자가면역성 질환을 차단하기 위해서 사용되는 항체의 신체 외부에서의 제조를 대체할 수 있다. 조절된 표적 유전자를 함유하는 신체는 생물제제 제조 공장이 되며, 이는 유전자-특이적 리간드가 투여될 때 스위치가 켜진다.
치료 단백질의 투여 수준 및 투여 타이밍은 치료 효과에 중요할 수 있다. 예를 들어, 암에 대한 AVASTIN(항-VEGF 항체)의 전달에서. 본 발명은 치료 단백질 수준 및 효과에 대한 모니터링에 반응하여 투여의 용이성을 증가시킨다.
일 실시양태에서, 표적 유전자는 특별한 DNA 서열을 표적화하고 편집할 수 있는 뉴클레아제를 코딩할 수 있다. 이러한 뉴클레아제는 Cas9, 뉴클레아제를 함유한 징크 핑거, 또는 TALEN을 포함한다. 이들 뉴클레아제의 경우에, 뉴클레아제 단백질은 표적 내인성 유전자를 편집하기 위해 충분한 짧은 기간 동안만 필요할 수 있다. 그러나, 비조절된 뉴클레아제 유전자가 신체에 전달되는 경우, 이 단백질은 세포의 나머지 수명 동안 존재할 수 있다. 뉴클레아제의 경우에, 긴 뉴클레아제가 존재할수록 표적-외 편집의 위험이 증가한다. 이러한 단백질의 발현의 조절은 상당한 안전성 이점을 갖는다. 이 경우에, 조절 카세트를 함유하는 뉴클레아제 표적 유전자를 함유하는 벡터는 신체에서 적절한 세포에게 전달될 수 있다. 표적 유전자는 카세트-특이적 리간드의 부재시 "오프" 상태에 있어, 어떠한 뉴클레아제도 생산되지 않는다. 활성화 리간드가 투여될 때에만, 뉴클레아제가 생산된다. 충분한 편집이 발생하게 하는 충분한 시간이 흐른 때, 리간드는 중단되고 다시 투여되지 않을 것이다. 따라서, 뉴클레아제 유전자는 그 후에 "오프" 상태로 있으며 어떠한 추가 뉴클레아제도 생산되지 않고 편집이 중지된다. 이 접근법은 다수의 유전성 망막병증, 예컨대 CEP290에서의 돌연변이에 의해 야기된 LCA10 및 ABCA4에서의 돌연변이에 의해 야기된 스타르가르트병(Stargardt's Disease)을 포함한 유전적 병태를 바로잡기 위해 사용될 수 있다.
특이적 리간드 투여시에만 활성화되는 치료 단백질을 코딩하는 조절된 표적 유전자의 투여는 치료 유전자를 조절하여 많은 상이한 유형의 질환, 예를 들어 치료 항체를 이용한 암, 면역 조절 단백질 또는 항체를 이용한 면역 장애, 대사 질환, 조절된 유전자로서 항-C5 항체 또는 항체 단편을 이용한 희귀 질환, 예컨대 PNH, 또는 치료 항체를 이용한 눈 혈관신생, 및 면역 조절 단백질을 이용한 건성 AMD를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
광범위한 특이적 질환 및 병태의 치료를 허용하는 광범위한 특이적 표적 유전자가 본 발명에서의 사용을 위해 적합하다. 예를 들어, 인슐린 또는 인슐린 유사체(바람직하게는, 인간 인슐린 또는 인간 인슐린의 유사체)가 I 형 당뇨병, II 형 당뇨병, 또는 대사 증후군을 치료하기 위한 표적 유전자로서 사용될 수 있고; 인간 성장 호르몬이 성장 장애를 갖는 아동 또는 성장 호르몬-결핍 성인을 치료하기 위한 표적 유전자로서 사용될 수 있으며; 에리스로포이에틴(바람직하게는, 인간 에리스로포이에틴)이 만성 신장 질환으로 인한 빈혈, 골수이형성증으로 인한 빈혈, 또는 암 화학요법으로 인한 빈혈을 치료하기 위한 표적 유전자로서 사용될 수 있다.
본 발명은 단일 유전자 결함에 의해 야기된 질환, 예컨대 낭성 섬유증, 혈우병, 근위축증, 지중해빈혈, 또는 겸상 적혈구 빈혈을 치료하기 위해 특히 적합할 수 있다. 따라서, 인간 β-, γ-, δ-, 또는 ξ-글로빈은 β-지중해빈혈 또는 겸상 적혈구 빈혈을 치료하기 위한 표적 유전자로서 사용될 수 있고; 인간 인자 VIII 또는 인자 IX는 혈우병 A 또는 혈우병 B를 치료하기 위한 표적 유전자로서 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 리간드는 일반적으로 1 이상의 약학적 허용 담체와 조합되어, 환자에 대한 투여를 위해 적합한 약학 조성물을 형성한다. 약학적 허용 담체는 제약 업계에서 일반적으로 사용되는 용매, 바인더, 희석제, 붕괴제, 윤활제, 분산매, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학 조성물은 정제, 알약, 캡슐, 트로키(troch) 등의 형태일 수 있으며, 이들의 의도된 투여 경로와 양립 가능하도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어 정맥내, 피내, 비강내, 피하, 경구, 흡입, 경피(국소), 점막경유, 및 직장을 포함한다.
리간드를 포함하는 약학 조성물은 표적 유전자를 바람직하게 조절하기에 충분한 리간드의 양이 환자에게 전달되도록 하는 투여 스케쥴로 환자에게 투여된다. 리간드가 소분자이고 투여량 형태가 정제, 캡슐 등일 때, 바람직하게는 약학 조성물은 0.1 mg 내지 10 g의 리간드; 0.5 mg 내지 5 g의 리간드; 1 mg 내지 1 g의 리간드; 2 mg 내지 750 mg의 리간드; 5 mg 내지 500 mg의 리간드; 또는 10 mg 내지 250 mg의 리간드를 포함한다.
약학 조성물은 매일 1 회 또는 매일 다수회(예를 들어, 매일 2, 3, 4, 5 회 이상) 투여될 수 있다. 대안적으로, 약학 조성물은 매일 1 회에 비해 덜 자주, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14 일마다 1 회, 또는 매달 1 회 또는 수개월마다 1 회 투여될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 적은 횟수, 예를 들어 1 회, 2 회, 3 회 등으로만 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명은 표적 유전자에 의해 코딩된 치료 단백질의 발현 조절이 필요한 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 환자에게 압타머에 대한 리간드를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하되, 환자는 이전에 표적 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 투여받았으며, 표적 유전자는 1 이상의 폴리아데닐화 신호의 접근성을 통한 압타머의 리간드에 의해 표적 유전자의 발현을 조절하는 능력을 제공하는 본 발명의 유전자 조절 카세트를 함유한다. 리간드의 투여는 치료 단백질의 발현을 증가시킨다.
제조 물품 및 키트
또한, 본원에 기재된 방법에서 사용하기 위한 제조 키트 또는 물품이 제공된다. 양태에서, 키트는 적합한 패키징 내에 본원에 기재된 조성물(예를 들어, 유전자 조절 카세트를 함유하는 표적 유전자를 포함하는 벡터의 전달을 위한 조성물에 대한 것)을 포함한다. 본원에 기재된 조성물(예컨대, 주입용 눈 조성물)을 위해 적합한 패키징은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 바이알(vial)(예컨대, 실링된 바이알), 관, 앰플, 병, 단지, 유동성 패키징(예를 들어, 실링된 마일라(Mylar) 또는 비닐 봉지) 등을 포함한다. 이들 제조 물품은 추가로 멸균 및/또는 실링될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 조성물을 포함하는 키트를 제공하며 조성물을 사용하는 방법, 예컨대 본원에 기재된 사용에 대한 설명서(들)를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 키트는 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 시린지, 및 예를 들어, 본원에 기재된 방법을 포함한 투여를 수행하기 위한 설명서를 갖는 패키지 삽입물을 포함하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 키트는 본 발명의 유전자 조절 카세트를 포함하는 표적 유전자의 발현을 위한 rAAV, 주입을 위해 적합한 약학적 허용 담체, 및 다음 중 1 이상을 포함한다: 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 시린지, 및 주입을 수행하기 위한 설명서를 갖는 패키지 삽입물. 일부 실시양태에서, 키트는 안내 주입, 근육내 주입, 정맥내 주입 등을 위해 적합하다.
본원에 사용된 바와 같은 "상동" 또는 "상동성"은 2 개의 폴리뉴클레오티드 서열 사이 또는 2 개의 폴리펩티드 서열 사이의 동일성의 퍼센트를 지칭한다. 하나의 서열 대 다른 것 사이의 상응성은 당업계에 알려진 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 상동은 서열 정보를 정렬하는 것 및 용이하게 이용 가능한 컴퓨터 프로그램을 사용하는 것에 의한 2 개의 폴리펩티드 분자의 직접 비교에 의해 결정될 수 있다. 2 개의 폴리뉴클레오티드 또는 2 개의 폴리펩티드 서열은 적절한 삽입 또는 결실로 최적으로 정렬된 후에, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 및 적어도 약 95%의 뉴클레오티드 또는 아미노산이 각각 상기 방법을 사용하여 결정된 바와 같은 특정 길이의 분자를 초과하여 매칭될 때 서로 "실질적으로 상동성"이다.
기준 폴리펩티드 또는 핵산 서열에 대한 "퍼센트 서열 동일성"은, 서열을 정렬시키는 것 및 필요한 경우 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입하는 것 후에, 기준 폴리펩티드 또는 핵산 서열에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 퍼센트로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 또는 핵산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은 당업자에게 알려진 방식으로, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 포함하여 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 달성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합 형태인 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 지칭한다. 따라서, 이 용어는, 비제한적으로, 단일-, 이중- 또는 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기, 또는 다른 천연, 화학적 또는 생화학적 변형된, 비-천연, 또는 유도체 합성된(derivatized) 뉴클레오티드 염기를 포함하는 중합체를 포함한다.
"이종성" 또는 "외인성"은 그것이 비교되거나 그것이 도입되거나 포함되는 나머지 개체의 것과 유전자형으로 별개인 개체로부터 유래된 것을 의미한다. 예를 들어, 유전자 조작 기술에 의해 상이한 세포 유형 내로 도입된 폴리뉴클레오티드는 이종성 폴리뉴클레오티드이다(또한, 발현될 때 이종성 폴리펩티드를 코딩할 수 있음). 유사하게는, 바이러스 벡터 내로 포함되는 세포 서열(예를 들어, 유전자 또는 이의 부위)은 벡터에 대해 이종성 뉴클레오티드 서열이다.
본원에 개시된 발명의 원리에서의 변형이 당업자에 의해 이루어질 수 있음이 이해 및 예상되어야 하며 이러한 변형은 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다. 다음 실시예는 본 발명을 추가로 예시하지만, 임의의 방식으로 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다. 본원에 언급된 모든 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
실시예
실시예 1. polyA 신호 요소 AATAAA의 접근성의 압타머-매개된 조절에 의한 표적 유전자 발현의 조절
실험 절차:
플라스미드 구조체: pEGFP-C1 벡터(Clontech)에서 EGFP 유전자를 반딧불이 루시페라아제 유전자 코딩 서열로 치환하여 SV40 초기 폴리아데닐화 신호 서열을 함유하는 pFLuc-SV40 벡터를 생성하였다. xpt-구아닌 압타머의 서열, 이펙터 스템 루프 구조 및 SV40 초기 polyA 서열을 함유하는 DNA 세그먼트를 합성하였다(IDT). 합성된 DNA 단편을 HpaI 및 MluI 제한 효소로 분해하고 HpaI 및 MluI로 분해된 pFLuc-SV40 내로 클로닝하였다. 구조체 서열을 DNA 시퀀싱(Genewiz)에 의해 확인하였다.
형질감염 및 압타머 리간드 처치: 3.5 x104 HEK 293 세포를 형질감염 전날에 96-웰 넓적 바닥 플레이트에 위치시켰다. 플라스미드 DNA(500 ng)를 튜브 또는 96-웰 U-바닥 플레이트에 첨가하였다. 별도로, TransIT-293 시약(Mirus; 1.4 μL)을 50 μL opti-mem I 배지(Life Technologies)에 첨가하고, 5 분 동안 실온("RT")에 두었다. 그 다음에 50 μL의 이 희석된 형질감염 시약을 DNA에 첨가하고, 혼합하였으며, RT에서 20 분 동안 항온처리하였다. 마지막으로, 7 μL의 이 용액을 96-웰 플레이트에서의 세포의 웰에 첨가하였다. 형질감염 4 시간 후에, 배지를 흡입하고, (i) DMSO(0.5%) 또는 500 μM 구아노신; 또는 (ii) 용매 대조군으로서 NaOH(2mM) 또는 500 μM 구아닌을 갖는 새로운 배지를 첨가하였다. 유도 배수는 압타머 리간드의 존재시 얻어진 루시페라아제 활성을 압타머 리간드의 부재시 얻어진 값으로 나눈 몫으로서 표현하였다.
배양된 세포의 반딧불이 루시페라아제 에세이: 배지 교환 24 시간 후, 플레이트를 인큐베이터에서 제거하고, RT까지 수분 동안 랩 벤치 상에서 평형시킨 다음에, 흡입하였다. Glo-용해 완충액(Promega, 100 μL, RT)을 첨가하고, 플레이트를 RT에서 적어도 5 분 동안 유지시켰다. 그 다음에, 웰 내용물을 50 μL 분쇄물에 의해 혼합하고, 20 μL의 각각의 샘플을 glo-용해 완충액 중 10%까지 희석된 20 μL의 브라이트(bright)-glo 시약(Promega)과 혼합하였다. 96 웰을 불투명한 백색 384-웰 플레이트 상에 위치시켰다. RT에서 5-분 항온처리 후, 500 mSec 판독 시간으로 Tecan 기구를 사용하여 발광을 측정하였다. 루시페라아제 활성은 평균 상대적 광 단위(relative light unit)(RLU)±S.D로서 표현하였다.
형질감염 및 GFP 형광의 측정: 3.5 x10^4 HEK 293 세포를 형질감염 전날에 96-웰 넓적 바닥 플레이트에 위치시켰다. 플라스미드 DNA(500 ng)를 튜브 또는 96-웰 U-바닥 플레이트에 첨가하였다. 별도로, TransIT-293 시약(Mirus; 1.4 μL)을 50 μL Opti-mem I 배지(Life Technologies)에 첨가하고, 5 분 동안 RT에 두었다. 그 다음에 50 μL의 이 희석된 형질감염 시약을 DNA에 첨가하고, 혼합하였으며, RT에서 20 분 동안 항온처리하였다. 마지막으로, 7 μL의 이 용액을 96-웰 플레이트에서의 세포의 웰에 첨가하였다. GFP 형광 강도를 484 nm의 여기 파장, 510 nm의 방출 파장 및 5 nm의 여기 대역폭을 사용하여, Tecan 플레이트 판독기에 의해 측정하였다. GFP 형광 강도는 형질감염 없이 세포에 의해 생성된 값에 의해 감산된 GFP 구조체에 의해 생성된 값으로서 표현하였다.
결과:
mRNA의 3' 말단의 폴리아데닐화된 꼬리는 mRNA 안정성, 핵외수송 및 번역 효율에서 중요한 역할을 수행한다. pre-mRNA 폴리아데닐화의 과정을 조절하여 표적 유전자 발현을 조절하기 위해, 폴리아데닐화 서열 요소 AATAAA(또는 이의 근접한 변형) 또는 T 또는 GT-풍부 다운스트림 서열 요소(DSE)의 접근성을 조절하는 전략을 개발하였다.
일 전략(전략 1)에서, 도 1a 및 1b에 예시된 바와 같이, 스템-루프 구조(이펙터 스템 루프)는 AATAAA 폴리아데닐화 신호 서열 요소가 스템-루프 형성 구조(이펙터 스템-루프)의 스템에 내장된다. 압타머의 3' 말단을, 5' 압타머 스템 암의 부위에 대해 상보적이고 이펙터 스템-루프의 3' 스템 암의 부위에 대해 상보적인 서열을 함유하는 공유 스템 암에 의해 이 스템 루프 형성 구조의 5' 말단에 연결하였다(예를 들어, 도 1a 및 도 1b 참고). 이 구성에서, 압타머 리간드의 부재시, 스템-루프 구조는 AATAAA 요소를 격리시켜, 폴리아데닐화 및 유전자 발현을 억제한다. 그러나, 압타머 리간드의 존재시, 압타머/리간드 결합은 압타머 P1 스템의 형성을 야기하여, 스템-루프 구조를 파괴하고, 이는 격리된 AATAAA 요소의 방출 및 후속 유전자 발현을 야기한다. 따라서, 유전자 요소의 이 구성은 압타머 리간드-반응성 온(on)-리보스위치를 생성한다.
이 전략을 SV40 초기 polyA 서열을 갖는 xpt-구아닌 압타머를 사용하여 시험하였으며, SV40 3' UTR에서 AATAAA 요소의 서열 업스트림은 폴리아데닐화를 위해 필수적인 것으로 나타났다. 이 전략을 사용하여, 각각 스템-루프 구조의 5' 말단에 연결된 동일한 xpt-구아닌 압타머 서열 및 스템-루프 구조의 스템에 내장된 AATAAA 서열 요소를 갖는 4 개의 구조체 ATA_Gua_1 내지 4(서열번호: 1-4)를 생성하였다. 본 발명자들은 스템-루프 구조의 스템에 대한 길이 및 서열 조성이 스템-루프 구조의 안정성에 영향을 미치므로, 유전자 발현을 위해 격리된 AATAAA 요소의 이용 가능성에 영향을 미칠 수 있다는 것을 합리화하였다. 따라서, 각각의 구조체에서 각각 9, 10, 12 및 14 개 염기 쌍(bp) 스템을 생성하였다. 압타머 P1 스템은 8 bp였다. 도 1c에 나타낸 바와 같이, 압타머 리간드 구아노신의 부재시, 루시페라아제 활성은 대략 모든 구조체에서 유사하였으며, 대조군 구조체 pFLuc-SV40(데이터는 나타내지 않음)에 비해 낮았고, 이는 AATAAA 요소가 스템-루프 구조에 의해 격리되었음을 나타낸다. 구아노신 처치시, 각각의 구조체는 DMSO 처치된 (대조군) 샘플과 비교하여 루시페라아제 활성 향상을 나타내었으며, ATA_Gua_1은 6.7-배 유도를 생성하였다.
이들 구조체를 압타머 리간드로서 구아닌을 사용하여 추가로 시험하였다. 도 1d에 나타낸 바와 같이, 구아닌 처치의 부재시, 구조체 ATA_Gua_1 내지 4의 기저 수준 발현은 감소하였으며, ATA_Gua_4는 최저 기저 발현(pFLuc 대조군 벡터의 16%)을 가졌다. 구아닌 처치시, 루시페라아제 발현은 구아닌 없는 샘플과 비교하여 향상되었으며, 모든 구조체에 대해 대략 2.5-배 유도를 생성하였다.
이들 리보스위치 구조체(전략 1)를 또한 GFP 발현을 조절하기 위해 사용하였다. 루시페라아제 유전자에서 상대적으로 낮은 기저 수준을 갖는 ATA_Gua_2 및 4 구조체(도 1c, 1d)를 사용하여 pEGFP_ATA_Gua_2 및 4 구조체를 생성하였다. 도 1e에 나타낸 바와 같이, 구아닌 처치의 부재시, GFP 발현은 pEGFP-C1 구조체와 비교하였을 때 감소된다. 구아닌 처치는 GFP 발현에서 1.5 및 1.6-배 증가(각각 ATA_Gua_2 및 ATA_Gua_4 구조체의 경우)를 생산하였다. 그러나, 대조군 구조체는 구아닌 처치에 반응하여 GFP 발현에서 증가를 갖지 않았다.
이 데이터는 리간드-반응성 포유동물 온-리보스위치가 인접한 압타머를 통한 스템-루프 구조에서의 폴리아데닐화 신호 서열의 접근성을 조절하는 것에 의해 표적 유전자 발현을 조절하는 것에 효과적이라는 것을 나타낸다. 배수 유도는 압타머 P1 스템 및 이펙터 스템-루프 구조에서의 스템의 길이 및 서열을 최적화하는 것을 통해 기저 발현 수준을 감소시키고 구조체의 유도된 표적 유전자 발현을 증가시키는 것에 의해 개선될 수 있다. 유전자 요소의 이 시험된 구성에서, 구아닌 압타머 및 SV40 초기 polyA 서열을 사용하였다. 유사한 전략이 합성 polyA 서열을 포함한 다양한 polyA 서열을 조절하는데 다양한 압타머를 사용하여 리보스위치를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
실시예 2. 다운스트림 서열 요소의 접근성을 통한 압타머/리간드 매개된 폴리아데닐화에 의한 표적 유전자 발현의 조절.
실험 절차: 실시예 1에 기재된 바와 같음.
결과:
T 또는 GT-풍부 다운스트림 서열 요소(DSE)의 접근성을 조절하는 것을 통해 폴리아데닐화를 조절하기 위한 다른 전략(전략 2)을 개발하였다. 이 전략에서, 도 2a에 예시된 바와 같이, DSE 서열이 스템-루프 구조의 스템에 내장된 스템-루프 구조를 생성하였다. 압타머 서열을 스템-루프 구조의 3' 암의 상보적 서열이 뒤따르는 이 스템-루프 구조의 3' 말단에 연결하였다. 이 구성에서, 압타머 리간드의 부재시, 스템-루프 구조는 DSE 서열을 격리시키고, 폴리아데닐화를 억제하여, 유전자 발현을 억제한다. 그러나, 압타머 리간드의 존재시, 압타머/리간드 결합은 압타머 P1 스템의 형성을 야기하며, 이펙터 스템-루프 구조를 파괴하고, 격리된 DSE 서열을 방출시키며, 유전자 발현을 허용한다. 따라서, 실시예 1에 나타낸 전략과 유사하게, 유전자 요소의 이 구성은 압타머 리간드-반응성 온-리보스위치를 생성한다.
이 전략을 SV40 초기 polyA 서열을 갖는 xpt-구아닌 압타머를 사용하여 시험하였으며, DSE 서열은 SV40 3' UTR에서 AATAAA 요소와 함께 pre-mRNA 폴리아데닐화를 담당하는 것으로 나타났다. 이 전략을 사용하여, 각각 스템-루프 구조의 스템에 내장된 DSE 서열을 갖는 스템-루프 구조의 3' 말단에 연결된 동일한 xpt-구아닌 압타머 서열을 갖는 4 개의 구조체 DSE_Gua_1 내지 4(서열번호: 5-8)를 생성하였다. 본 발명자들은 스템-루프 구조의 스템에 대한 길이 및 서열 조성이 스템-루프 구조의 안정성에 영향을 미치므로, 유전자 발현을 위해 격리된 DSE 서열의 이용 가능성에 영향을 미칠 수 있다는 것을 합리화하였다. 따라서, 각각의 이들 구조체에서 각각 9, 10, 12 및 14 개 염기 쌍(bp) 스템을 생성하였다. 8 bp 또는 9 bp의 압타머 P1 스템을 이들 구조체에서 사용하였다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, 압타머 리간드 구아노신의 부재시, 루시페라아제 활성은 구조체 DSE_Gua_1 내지 3에서 대략 유사하였으며, DSE_Gua_4는 최소이고, 대조군 구조체 pFLuc-SV40(데이터는 나타내지 않음)에 비해 낮았으며, 이는 DSE 요소가 압타머 리간드의 부재시 스템-루프 구조에 의해 격리되었음을 나타낸다. 반면에, 구아노신 처치시, 각각의 구조체는 DMSO 처치된 샘플과 비교하였을 때, 루시페라아제 활성 향상을 나타내었으며, DSE_Gua_2는 예를 들어, 3.7-배 유도를 생성하였다.
이들 구조체를 또한 압타머 리간드로서 구아닌을 사용하여 시험하였다. 도 2c에 나타낸 바와 같이, 구아닌 처치의 부재시, 루시페라아제 활성은 대조군 구조체 pFLuc와 비교하였을 때, 대략 구조체 DSE_Gua_1 내지 3의 경우 68%, 및 구조체 DSE_Gua_4의 경우 80%까지 감소하였다. 구아닌의 존재시, 루시페라아제 발현은 구아닌 처치 없는 샘플과 비교하였을 때 모든 구조체에서 대략 2.4-배 증가하였다. 배수 유도는 압타머 P1 스템뿐 아니라, 스템-루프 구조에서의 스템의 길이 및 서열을 최적화하는 것을 통해 기저 발현 수준을 감소시키고 구조체의 유도된 유전자 발현을 증가시키는 것에 의해 추가로 개선될 수 있다. 이들 데이터는 압타머를 통해 폴리아데닐화 서열 요소의 접근성을 조절하는 것을 통한 유전자 발현을 조절하는 압타머 리간드-반응성 포유동물 온-리보스위치의 생성을 추가로 나타낸다. 유전자 요소의 이 시험된 구성에서, 구아닌 압타머 및 SV40 초기 polyA 서열을 사용하였다. 유사한 전략이 합성 polyA 서열을 포함한 다양한 polyA 서열을 조절하는데 다양한 압타머를 함유하는 리보스위치를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
실시예 3. 3'UTR에서 합성 polyA 서열 요소의 접근성을 조절하기 위한 구아닌 압타머의 사용
실험 절차:
플라스미드 구축: 합성 polyA(SPA)(본원에 참고로 포함되는 Levitt, N. et al., Definition of an efficient synthetic poly(A) site, Genes & Development. 1989; 3:1019-1025)에 대한 서열, 또는 본원에서 mtSPA로서 명명된 pGLuc-Basic_2 (NEB)로부터의 SPA, 또는 xpt-구아닌 압타머, 스템 루프 구조 및 합성 polyA 서열을 함유하는 DNA 단편을 합성하였다(IDT). 합성된 DNA 단편을 XhoI 및 NheI 제한 효소로 분해하고 XhoI 및 XbaI로 분해된 Con8 구조체 내로 클로닝하여, Con8-SPA(서열번호 9), SPA_ATA_Gua(서열번호 10), SPA_DSE_Gua(서열번호 11), mtCon8-SPA(서열번호 12) 및 mtSPA_ATA_Gua(서열번호 13)를 생성하였다. 구조체 서열을 DNA 시퀀싱(Genewiz)에 의해 확인하였다.
배양된 세포의 형질감염, 압타머 리간드 처치 및 루시페라아제 에세이: 실시예 1에 기재된 바와 같음.
결과:
SV40 polyA 서열의 접근성의 압타머-매개된 조절을 통한 표적 유전자 발현의 조절을 실시예 1 및 2에 나타내었다. 압타머-조절된 폴리아데닐화를 또한 합성 polyA 서열(SPA)을 사용하여 시험하였다. 실시예 1에 나타낸 바와 동일한 전략을 사용하여, xpt-구아닌 압타머 서열이 스템-루프 구조의 5' 말단에 연결되고 합성 polyA 서열의 AATAAA 서열 요소가 스템-루프 구조의 스템에 내장된 구조체 SPA_ATA_Gua를 생성하였다. 구조체 SPA_DSE_Gua를 또한 실시예 2에 나타낸 바와 동일한 전략을 사용하여 생성하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 구아닌 처치의 부재시, 스템-루프 구조와 xpt-구아닌 압타머의 연결은 SPA_ATA_Gua 구조체에서 루시페라아제 활성 감소를 야기하지 않았으며, 이는 합성 polyA 서열의 AATAAA 서열 요소의 스템-루프에서 비효율적인 격리를 암시한다. 이를 해결하기 위해, Con8-SPA와 비교하였을 때 2 nt 차이를 갖지만, 유사한 기능성을 나타내는 다른 SPA 서열(mtSPA)을 사용하였다. 스템을 강화하기 위해, 2 GC 염기 쌍을 7 nt의 polyA 서열 및 이의 상보적 서열과 함께 스템에 첨가하고, 9bp 스템을 생성하였다. 이 mtSPA_ATA_Gua 구조체에 대해, 루시페라아제 활성의 기저 수준 발현은 구아닌 처치의 부재시 mtCon8-SPA와 비교하였을 때 감소되었다. 반면에, 구아닌 처치의 존재시, 루시페라아제 활성은 구아닌 처치가 없는 샘플과 비교하였을 때 1.7 배까지 약간 상향조절되었다. 구조체 SPA_DSE_Gua에 대해, xpt-구아닌 압타머 서열을 스템-루프 구조의 스템에 내장된 DSE 서열을 갖는 스템-루프 구조의 3' 말단에 연결하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 구아닌 처치는 SPA_DSE_Gua 구조체의 루시페라아제 활성을 구아닌 처치가 없는 샘플과 비교하였을 때 1.9 배까지 상향조절하였다. 이들 결과는 polyA 서열 요소의 접근성을 조절하는 것에 의한 표적 유전자 발현의 조절성을 나타낸다.
실시예 4. polyA-기반 리보스위치의 조절성을 향상시키기 위한 스템-루프 구조체의 루프 서열 조절
실험 절차: 실시예 1에 기재된 바와 같음.
결과:
실시예 1 및 2에서 polyA 서열에 연결된 압타머 및 스템 루프 구조를 갖는 모든 구조체에 대해, 루시페라아제의 기저 수준 발현은 대조군 벡터의 20 내지 45%까지 감소하였다. 표적 유전자 발현의 유도 수준이 대조군 구조체의 최대 80%에 도달하는 것을 통해, 기저 수준 발현은 배수 유도가 감소되도록 야기한다. 기저 발현을 감소시키기 위해, 스템-루프 구조를 강화하거나 안정화시켜, 압타머/리간드 결합의 부재시 AATAAA 또는 DSE 서열 요소를 효율적으로 격리시키거나 차단할 수 있다. 스템-루프 구조의 안정성을 강화하기 위해, 루시페라아제 유전자의 기저 수준 발현에 대한 스템-루프 구조의 루프의 서열 조성의 효과를 시험하였다. ATA_Gua_1에서의 GAAA 루프 서열을 더욱 안정적인 루프 서열인 TTCG로 치환하여(V.P. Antao, S. Y. Lai and I. Tinoco, A thermodynamic study of unusually stable RNA and DNA hairpins. Nucleic Acids Research. 1991; 19(21):5901-5905), 구조체 Stbl_ATA_Gua_1(서열번호 14)을 생성하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, ATA_Gua_1과 비교하여, Stbl_ATA_Gua_1은 구아닌 처치의 부재시 더 낮은 루시페라아제 활성을 발현하였으며, 이는 AATAAA 신호의 개선된 격리를 암시한다. 반면에, 구아닌 처치의 존재시, Stbl_ATA_Gua_1에 대해 유도된 루시페라아제 활성은 ATA_Gua_1과 유사하였으며, 높은 유도 배수를 생성하였다. 반대로, GAAT 루프를 함유하는 구조체, gaat_ATA_Gua_1(서열번호 15)은 ATA_Gua_1 또는 stbl_ATA_Gua_1에 비해 높은 기저 수준 루시페라아제를 발현하였으며, 이들 2 개의 구조체에 비해 약간 낮은 배수 유도를 생성하였다. 이들 결과는 더욱 엄격한 표적 유전자 조절이 스템-루프 구조 변형을 통해 달성될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 5. 3' UTR에서 polyA 서열의 AATAAA 및 DSE 둘 다의 접근성의 동시 조절.
실험 절차:
ATA_Gua_1 및 DSE_Gua_1 스위치를 함유하는 서열을 합성하고 HpaI 및 MluI 분해된 pFLuc 벡터 내로 클로닝하여 ATA_DSE_Gua 구조체(서열번호 16)를 생성하였다.
배양된 세포의 형질감염 및 루시페라아제 에세이: 실시예 1에 기재된 바와 같음.
결과:
도 5a에 예시된 바와 같은 표적 유전자 발현을 조절하기 위한 제3 전략(전략 3)을 전략 1 및 전략 2를 조합하여 AATAAA 및 DSE 서열 둘 다의 접근성을 동시에 조절하는 것에 의해 개발하였다. 이 구성에서, 압타머 리간드의 부재시, AATAAA 및 DSE 서열 둘 다를 스템-루프 구조에 의해 격리시키므로, 유전자 발현이 억제된다. 각각의 스템-루프 구조를 동일하거나 상이한 리간드 분자에 대해 반응할 수 있는 압타머 서열에 연결한다. 필수 polyA 서열 요소 둘 다를 차단하는 것은 리간드(들)의 부재시 유전자 발현의 기저 수준을 감소시킬 수 있다. 압타머 리간드의 존재시, 압타머/리간드 결합은 압타머 P1 스템의 형성을 가능하게 하여, 스템-루프 구조를 파괴하고 격리된 AATAAA 및 DSE 서열 둘 다를 방출한다. 이 구성에서, 유전자는 압타머 둘 다에 대한 리간드가 존재할 때에만 효율적으로 발현할 수 있으며, 이는 잠재적으로 표적 유전자 발현의 더욱 엄격한 조절을 허용한다.
사실, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 구아닌 처치의 부재시, 스템-루프 구조(ATA_DSE_Gua)를 통해 AATAAA 및 DSE 서열 둘 다를 격리시키는 것은 루시페라아제 발현을 대조군 구조체 pFLuc의 20%까지 추가로 감소시킨 한편, ATA_Gua_1 및 DSE_Gua_1은 각각 45% 및 35% 감소하였다. 구아닌 처치의 존재시, 루시페라아제 활성은 미처치된 샘플과 비교하였을 때 ATA_DSE_Gua 샘플에서 대략 2.1 배 회복되었으며, 이는 더욱 엄격한 유전자 조절을 나타낸다.
실시예 6. 표적 유전자 조절성을 향상시키기 위한 polyA-기반 리보스위치 및 제2 리보스위치의 조합된 사용
실험 절차:
Golden Gate 클로닝 전략을 사용하여, G15 리보스위치 카세트(본원에 참고로 포함되는 WO 2016/126747호의 실시예 5 및 8 및 서열번호 46 참고) 또는 압타머가 없는 대조군 카세트를 pFLuc 내로 클로닝하여 pFLuc-G15 또는 pFLuc-Con1을 생성하였다. 구조체 pFLuc-G15_ATA_Gua를 생성하기 위해, 구아닌 압타머, 스템 루프 구조 및 SV40 polyA 서열을 함유하는 단편을 HpaI 및 MluI 분해에 의해 ATA_Gua_1 구조체로부터 방출시키고 동일한 제한 효소로 분해된 pFLuc-G15 구조체 내로 클로닝하였다.
배양된 세포의 형질감염 및 루시페라아제 에세이: 도 1에 기재된 바와 같음.
결과:
ATA_Gua 및 DSE_Gua 리보스위치를 함유하는 발현 구조체는 표적 유전자의 기저 발현 정도를 갖는다. 이들 스위치와 제2 스위치의 동시의(in tandem) 조합된 사용은 기저 발현을 엄격하게 할 수 있으므로, 유전자 조절성을 향상시킬 수 있다.
이를 입증하기 위해, G15 리보스위치를 polyA-기반 리보스위치와 조합하였다. G15 리보스위치는 xpt-구아닌 압타머-조절된 선택적 스플라이싱 메커니즘을 기본으로 하며 동일한 기저 수준 발현을 갖고, 이는 압타머 리간드 구아닌 처치에 반응하여 배수 유도를 감소시킨다. pFLuc-G15 구조체로부터의 기저 수준 발현을 감소시키기 위해, polyA 서열을 ATA_Gua_1로 치환하여, pFLuc-G15-ATA_Gua 구조체(도 6a)를 생성하였다. 도 6b에 나타낸 바와 같이, 압타머 리간드(구아닌)의 부재시, pFLuc-G15의 루시페라아제의 기저 수준 발현은 pFLuc-Con1 대조군 구조체와 비교하였을 때 상당히 감소하였다. 이중 스위치를 갖는 구조체인 pFLuc-G15-ATA_Gua는 pFLuc-G15와 비교하였을 때 추가로 감소된 기저 수준 발현을 갖는다. 구아닌 처치의 존재시, 루시페라아제 활성의 유도된 수준은 pFLuc-G15에 비해 약간 낮았으나, ATA_Gua_1 구조체로부터의 유도된 루시페라아제 활성과 동일하였으며, ATA_Gua_1 및 pFLuc-G15 구조체 둘 다에 비해 높은 배수 유도를 생성하였다(도 6b).
이들 결과는 더욱 엄격한 스위치가 높은 기저 수준 발현을 갖는 2 개의 스위치를 동시에 조합하는 것에 의해 생성될 수 있다는 것을 나타낸다. 이 이중 스위치에서의 압타머는 본원에 나타낸 바와 같이 동일하거나 상이한 리간드에 결합하는 동일하거나 상이한 압타머, 또는 상이한 리간드에 반응하는 압타머일 수 있다.
실시예 7. 3'UTR에서 polyA 서열 요소 AATAAA의 접근성을 조절하기 위한 아데닌 압타머의 사용
실험 절차:
플라스미드 구축: 아데닌 압타머 ydhl-A(본원에 참고로 포함되는 M. Mandal and R.R. Breaker, Adenine riboswitches and gene activation by disruption of a transcription terminator. Nature Structural & Molecular Biology. 2004; 11: 29-35)에 대한 서열, 스템 루프 구조 및 SV40 초기 polyA 서열을 함유하는 DNA 단편을 합성하였다(IDT). 합성된 DNA 단편을 HpaI 및 MluI 제한 효소로 분해하고 HpaI 및 MluI로 분해된 pFLuc-SV40 내로 클로닝하였다. 구조체 서열을 DNA 시퀀싱(Gnenewiz)에 의해 확인하였다.
배양된 세포의 형질감염 및 루시페라아제 에세이: 실시예 1에 기재된 바와 같음.
형질감염 4 시간 후에, 배지를 흡입하고, NaOH(1 mM) 또는 1 mM 아데닌을 갖는 새로운 배지(Calbiochem)를 첨가하였다. 유도 배수는 압타머 리간드의 존재시 얻어진 루시페라아제 활성을 압타머 리간드의 부재시 얻어진 값으로 나눈 몫으로서 표현하였다.
결과:
표적 유전자 발현을 제어하기 위한 추가 압타머/리간드 쌍의 사용을 연구하였다. 실시예 1에 나타낸 바와 동일한 전략으로, 스템-루프(SL) 구조(안정적인 TTCG 루프)를 삽입하였으며, AATAAA 서열 요소는 SL 구조의 9bp 스템에 내장된다. 이 SL 구조의 5' 말단에 대해, 아데닌 압타머 ydhl-A 서열이 뒤따르는 SL 구조의 5' 암의 상보적 서열을 3' UTR 내에 삽입하였으며, 이는 구조체 ATA_Ydhl(서열번호 17)을 생성하였다. 이 구조체에서, ydhl 압타머 P1 스템의 길이는 10 bp이다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 아데닌 처치의 부재시, ATA_Ydhl 구조체는 아마도 AATAAA 서열 요소의 접근성의 차단을 통해 루시페라아제의 수준을 대조군 pFLuc 구조체의 대략 52%까지 감소시켰다. 아데닌의 존재시, 루시페라아제 발현은 아데닌 처치가 없는 샘플과 비교하였을 때, 아데닌 처치의 존재시 대조군 pFLuc 구조체의 대략 82%까지 향상되었다. 아데닌 처치는 압타머-비관련 메커니즘을 통해 루시페라아제 활성을 대조군 구조체에서 2.5-배 증가시켰다. 그러나, ATA_ydhl 구조체는 루시페라아제 발현에서 4.0-배 증가를 생성하였으며, 이는 아데닌/압타머 특이적 효과를 나타낸다.
SEQUENCE LISTING
<110> MeiraGTx UK II Limited
Guo, Xuecui
Han, Joonhee
Zhong, Zhaojing
<120> REGULATION OF GENE EXPRESSION BY APTAMER-MEDIATED ACCESSIBILITY
OF POLYADENYLATION SIGNALS
<130> 162027.48676
<150> US 62/461,689
<151> 2017-02-21
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 332
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 1
aaggccaaga agggcggaaa gatcgccgtg taagccatac cacatttgta gaggttttac 60
ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg 120
ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 180
atttctaaag gtataatcgc gtggatatgg cacgcaagtt tctaccgggc accgtaaatg 240
tccgactacc tttatttcga aagaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt 300
ttgtccaaac tcatcaatgt atcttaacgc gt 332
<210> 2
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 2
aaggccaaga agggcggaaa gatcgccgtg taagccatac cacatttgta gaggttttac 60
ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg 120
ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 180
atttcacata aagcataatc gcgtggatat ggcacgcaag tttctaccgg gcaccgtaaa 240
tgtccgactg ctttatttcg aaagaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg 300
tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttaacg cgt 333
<210> 3
<211> 335
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 3
aaggccaaga agggcggaaa gatcgccgtg taagccatac cacatttgta gaggttttac 60
ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg 120
ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 180
atttaataaa gataatcgcg tggatatggc acgcaagttt ctaccgggca ccgtaaatgt 240
ccgactcttt atttgtgcga aagcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt 300
ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttaa cgcgt 335
<210> 4
<211> 337
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 4
aaggccaaga agggcggaaa gatcgccgtg taagccatac cacatttgta gaggttttac 60
ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg 120
ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 180
attttaaagc aataatcgcg tggatatggc acgcaagttt ctaccgggca ccgtaaatgt 240
ccgacttgct ttatttgtgc gaaagcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt 300
gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt aacgcgt 337
<210> 5
<211> 331
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 5
aaggccaaga agggcggaaa gatcgccgtg taagccatac cacatttgta gaggttttac 60
ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg 120
ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 180
atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc gaaaggacaa 240
accataatcg cgtggatatg gcacgcaagt ttctaccggg caccgtaaat gtccgactgg 300
tttgtaaact catcaatgta tcttaacgcg t 331
<210> 6
<211> 332
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 6
aaggccaaga agggcggaaa gatcgccgtg taagccatac cacatttgta gaggttttac 60
ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg 120
ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 180
atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc gaaaggacaa 240
accaataatc gcgtggatat ggcacgcaag tttctaccgg gcaccgtaaa tgtccgactt 300
ggtttgaaac tcatcaatgt atcttaacgc gt 332
<210> 7
<211> 335
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 7
aaggccaaga agggcggaaa gatcgccgtg taagccatac cacatttgta gaggttttac 60
ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg 120
ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 180
atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc gaaaggacaa 240
accacaataa tcgcgtggat atggcacgca agtttctacc gggcaccgta aatgtccgac 300
ttgtggttta aactcatcaa tgtatcttaa cgcgt 335
<210> 8
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 8
aaggccaaga agggcggaaa gatcgccgtg taagccatac cacatttgta gaggttttac 60
ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg 120
ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 180
atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc gaaaggacaa 240
accacaacat aatcgcgtgg atatggcacg caagtttcta ccgggcaccg taaatgtccg 300
actgttgtgg aaactcatca atgtatctta acgcgt 336
<210> 9
<211> 158
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 9
aaggccaaga agggcggaaa gatcgccgtg taaggatcca agcttatcga taccgtcgac 60
ctcgagggcc cagatctgcg gccgcaataa aagatcttta ttttcattag atctgtgtgt 120
tggttttttg tgtgtctaga aataattctt actgtcat 158
<210> 10
<211> 228
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 10
aaggccaaga agggcggaaa gatcgccgtg taaggatcca agcttatcga taccgtcgac 60
ctcgagggcc cagatctgcg gcaaaaggta taatcgcgtg gatatggcac gcaagtttct 120
accgggcacc gtaaatgtcc gactaccttt tattggaaac aataaaagat ctttattttc 180
attagatctg tgtgttggtt ttttgtgtgt ctagaaataa ttcttact 228
<210> 11
<211> 228
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 11
aaggccaaga agggcggaaa gatcgccgtg taaggatcca agcttatcga taccgtcgac 60
ctcgagggcc cagatctgcg gccgcaataa aagatcttta ttttcattag atctgtgtgt 120
tggttttttg tgtgtcgaaa gacacacaat ataatcgcgt ggatatggca cgcaagtttc 180
taccgggcac cgtaaatgtc cgactattgt gtggaaataa ttcttact 228
<210> 12
<211> 153
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 12
aaggccaaga agggcggaaa gatcgccgtg taaggatcca agcttatcga taccgtcgac 60
ctcgagggcc cagatctgcg gccgcaataa aatatcttta ttttcattac atctgtgtgt 120
tggttttttg tgtgtctaga aataattctt act 153
<210> 13
<211> 229
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 13
aaggccaaga agggcggaaa gatcgccgtg taaggatcca agcttatcga taccgtcgac 60
ctcgagggcc cagatctgcg gaaaaggtat aatcgcgtgg atatggcacg caagtttcta 120
ccgggcaccg taaatgtccg actacctttt attgcgaaag caataaaata tctttatttt 180
cattacatct gtgtgttggt tttttgtgtg tctagaaata attcttact 229
<210> 14
<211> 332
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 14
aaggccaaga agggcggaaa gatcgccgtg taagccatac cacatttgta gaggttttac 60
ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg 120
ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 180
atttctaaag gtataatcgc gtggatatgg cacgcaagtt tctaccgggc accgtaaatg 240
tccgactacc tttatttctt cggaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt 300
ttgtccaaac tcatcaatgt atcttaacgc gt 332
<210> 15
<211> 332
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 15
aaggccaaga agggcggaaa gatcgccgtg taagccatac cacatttgta gaggttttac 60
ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg 120
ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 180
atttctaaag gtataatcgc gtggatatgg cacgcaagtt tctaccgggc accgtaaatg 240
tccgactacc tttatttcga atgaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt 300
ttgtccaaac tcatcaatgt atcttaacgc gt 332
<210> 16
<211> 407
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 16
aaggccaaga agggcggaaa gatcgccgtg taagccatac cacatttgta gaggttttac 60
ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg 120
ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 180
atttctaaag gtataatcgc gtggatatgg cacgcaagtt tctaccgggc accgtaaatg 240
tccgactacc tttatttcga aagaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt 300
ttgtccgaaa ggacaaacca taatcgcgtg gatatggcac gcaagtttct accgggcacc 360
gtaaatgtcc gactggtttg taaactcatc aatgtatctt aacgcgt 407
<210> 17
<211> 334
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 17
aaggccaaga agggcggaaa gatcgccgtg taagccatac cacatttgta gaggttttac 60
ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg 120
ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 180
atttcaataa aggtataacc tcaataatat ggtttgaggg tgtctaccag gaaccgtaaa 240
atcctgatta cctttatttc ttcggaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg 300
gtttgtccaa actcatcaat gtatcttaac gcgt 334
Claims (30)
- 리보스위치(riboswitch)를 포함하는 표적 유전자의 발현의 조절을 위한 폴리뉴클레오티드 카세트로서, 리보스위치가 이펙터 스템 루프(effector stem loop) 및 압타머를 포함하고, 이펙터 스템이 폴리아데닐화 신호를 포함하며, 압타머 및 이펙터 스템 루프가 압타머 스템의 비공유 암(arm) 및 이펙터 스템 루프의 비공유 암에 대해 상보적인 서열을 포함하는 교번 공유 스템 암에 의해 연결되는, 폴리뉴클레오티드 카세트.
- 제1항에 있어서,
압타머가 소분자 리간드에 결합하는 폴리뉴클레오티드 카세트. - 제1항에 있어서,
압타머 스템의 서열 및 이펙터 스템 루프의 서열에 대해 상보적인 교번 공유 스템 암의 부위가 4 내지 8 개 뉴클레오티드, 5 내지 7 개 뉴클레오티드, 5 개 뉴클레오티드, 또는 6 개 뉴클레오티드인 폴리뉴클레오티드 카세트. - 제1항에 있어서,
압타머 스템이 6 내지 12 개 염기 쌍, 7 내지 10 개 염기 쌍, 8 개 염기 쌍, 또는 9 개 염기 쌍인 폴리뉴클레오티드 카세트. - 제1항에 있어서,
이펙터 스템 루프의 스템이 4 내지 24 개 염기 쌍, 5 내지 20 개 염기 쌍, 9 내지 14 개 염기 쌍, 9 개 염기 쌍, 10 개 염기 쌍, 11 개 염기 쌍 또는 12 개 염기 쌍인 폴리뉴클레오티드 카세트. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
이펙터 스템 루프가 압타머의 3'에 위치하여, 교번 공유 스템 암이 3' 압타머 스템 암의 전부 또는 일부 및 이펙터 스템의 5' 암의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드 카세트. - 제6항에 있어서,
폴리아데닐화 신호가 AATAAA 또는 ATTAAA인 폴리뉴클레오티드 카세트. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
이펙터 스템 루프가 압타머의 5'에 위치하여, 교번 공유 스템 암이 5' 압타머 스템 암의 전부 또는 일부 및 이펙터 스템의 3' 암의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드 카세트. - 제8항에 있어서,
폴리아데닐화 신호가 다운스트림 요소(downstream element)(DSE)인 폴리뉴클레오티드 카세트. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 2 개의 리보스위치를 포함하되, 제1 리보스위치의 이펙터 스템 루프가 폴리아데닐화 신호 AATAAA 또는 ATTAAA의 전부 또는 일부를 포함하고 제2 리보스위치의 이펙터 스템 루프가 다운스트림 요소(DSE)의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드 카세트.
- 제10항에 있어서,
2 개의 리보스위치가 각각 동일한 리간드에 결합하는 압타머를 포함하는 폴리뉴클레오티드 카세트. - 제10항에 있어서,
2 개의 리보스위치가 상이한 리간드에 결합하는 상이한 압타머를 포함하는 폴리뉴클레오티드 카세트. - a. 제1항 내지 제5항의 폴리뉴클레오티드 카세트 중 1 이상을 표적 유전자의 3' 비번역 영역(untranslated region) 내로 삽입하는 것,
b. 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 표적 유전자를 세포 내로 도입하는 것, 및
c. 표적 유전자의 발현을 증가시키는데 효과적인 양으로 압타머에 결합하는 리간드에 세포를 노출시키는 것을 포함하는, 표적 유전자의 발현을 조절하는 방법. - 제13항에 있어서,
리간드가 소분자인 방법. - 제13항에 있어서,
이펙터 스템 루프가 압타머의 3'에 위치하여, 교번 공유 스템 암이 3' 압타머 스템 암의 전부 또는 일부 및 이펙터 스템의 5' 암의 전부 또는 일부를 포함하는 방법. - 제15항에 있어서,
폴리아데닐화 신호가 AATAAA 또는 ATTAAA인 방법. - 제13항에 있어서,
이펙터 스템 루프가 압타머의 5'에 위치하여, 교번 공유 스템 암이 5' 압타머 스템 암의 전부 또는 일부 및 이펙터 스템의 3' 암의 전부 또는 일부를 포함하는 방법. - 제17항에 있어서,
폴리아데닐화 신호가 다운스트림 요소(DSE)인 폴리뉴클레오티드 카세트. - 제13항 또는 제14항에 있어서,
2 개의 리보스위치가 표적 유전자의 3' UTR 내로 삽입되되, 제1 리보스위치의 이펙터 스템 루프가 폴리아데닐화 신호 AATAAA 또는 ATTAAA의 전부 또는 일부를 포함하고 제2 리보스위치의 이펙터 스템 루프가 다운스트림 요소(DSE)의 전부 또는 일부를 포함하는 방법. - 제19항에 있어서,
2 개의 리보스위치가 각각 동일한 리간드에 결합하는 압타머를 포함하는 방법. - 제19항에 있어서,
2 개의 리보스위치가 상이한 리간드에 결합하는 상이한 압타머를 포함하는 방법. - 제19항에 있어서,
2 이상의 폴리뉴클레오티드 카세트가 동일한 압타머를 포함하는 방법. - 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 표적 유전자가 표적 유전자의 발현을 위한 벡터에 포함되는 방법. - 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
표적 유전자가 선택적 스플라이싱(alternative splicing)의 압타머-매개된 조절에 의해 표적 유전자 발현을 조절하는 유전자 조절 카세트를 추가로 포함하는 방법. - 제23항에 있어서,
벡터가 바이러스 벡터인 방법. - 제25항에 있어서,
바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 및 렌티바이러스 벡터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법. - 제1항 내지 제12항의 폴리뉴클레오티드 카세트를 함유하는 표적 유전자를 포함하는 벡터.
- 제27항에 있어서,
벡터가 바이러스 벡터인 벡터. - 제28항에 있어서,
바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 및 렌티바이러스 벡터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 벡터. - 제27항에 있어서,
표적 유전자가 선택적 스플라이싱의 압타머-매개된 조절에 의해 표적 유전자 발현을 조절하는 유전자 조절 카세트를 추가로 포함하는 벡터.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201762461689P | 2017-02-21 | 2017-02-21 | |
| US62/461,689 | 2017-02-21 | ||
| PCT/US2018/019056 WO2018156658A1 (en) | 2017-02-21 | 2018-02-21 | Regulation of gene expression by aptamer-mediated accessibility of polyadenylation signals |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20190126334A true KR20190126334A (ko) | 2019-11-11 |
| KR102645079B1 KR102645079B1 (ko) | 2024-03-08 |
Family
ID=63254106
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020197027452A KR102645079B1 (ko) | 2017-02-21 | 2018-02-21 | 폴리아데닐화 신호의 압타머-매개된 접근성에 의한 유전자 발현의 조절 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20200010836A1 (ko) |
| EP (1) | EP3585443A4 (ko) |
| JP (1) | JP7139345B2 (ko) |
| KR (1) | KR102645079B1 (ko) |
| CN (1) | CN110636868B (ko) |
| AU (1) | AU2018224048A1 (ko) |
| BR (1) | BR112019017444A2 (ko) |
| CA (1) | CA3054294A1 (ko) |
| EA (1) | EA201991928A1 (ko) |
| IL (1) | IL268819B1 (ko) |
| MX (1) | MX2019009972A (ko) |
| NZ (1) | NZ756568A (ko) |
| SG (1) | SG11201907700XA (ko) |
| WO (1) | WO2018156658A1 (ko) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115698292A (zh) | 2020-03-24 | 2023-02-03 | 梅里特斯英国第二有限公司 | 与硫胺类似物和衍生物结合的适体 |
| WO2023131811A2 (en) | 2021-12-15 | 2023-07-13 | Meiragtx Uk Ii Limited | Polycistronic expression of gut peptides |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010528616A (ja) * | 2007-05-29 | 2010-08-26 | イェール ユニバーシティー | オルタナティブスプライシングとｒｎａのスプライシングを調節するリボスイッチに関連する方法と組成物 |
| WO2010141085A1 (en) * | 2009-06-02 | 2010-12-09 | Biorelix Pharmaceuticals, Inc. | Methods for screening and identifying compounds |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5270163A (en) | 1990-06-11 | 1993-12-14 | University Research Corporation | Methods for identifying nucleic acid ligands |
| ES2110444T3 (es) | 1990-06-11 | 1998-02-16 | Nexstar Pharmaceuticals Inc | Ligandos de acidos nucleicos. |
| US5567588A (en) | 1990-06-11 | 1996-10-22 | University Research Corporation | Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX |
| US5580737A (en) | 1990-06-11 | 1996-12-03 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | High-affinity nucleic acid ligands that discriminate between theophylline and caffeine |
| AU2005294211B2 (en) * | 2004-10-07 | 2011-08-11 | Yale University | Glycine riboswitches, methods for their use, and compositions for use with glycine riboswitches |
| RS61924B1 (sr) * | 2015-02-02 | 2021-06-30 | Meiragtx Uk Ii Ltd | Regulacija genske ekspresije putem aptamerom posredovane modulacije alternativnog splajsovanja |
| EP4159856A1 (en) * | 2015-06-18 | 2023-04-05 | The Broad Institute, Inc. | Novel crispr enzymes and systems |
| JP7089502B2 (ja) | 2016-08-03 | 2022-06-22 | メイラジーティーエックス・ユーケー・ザ・セカンド・リミテッド | アプタマーのためのハイスループット細胞系スクリーニング |
-
2018
- 2018-02-21 NZ NZ756568A patent/NZ756568A/en unknown
- 2018-02-21 IL IL268819A patent/IL268819B1/en unknown
- 2018-02-21 US US16/487,223 patent/US20200010836A1/en not_active Abandoned
- 2018-02-21 BR BR112019017444A patent/BR112019017444A2/pt unknown
- 2018-02-21 CA CA3054294A patent/CA3054294A1/en active Pending
- 2018-02-21 WO PCT/US2018/019056 patent/WO2018156658A1/en unknown
- 2018-02-21 AU AU2018224048A patent/AU2018224048A1/en active Pending
- 2018-02-21 KR KR1020197027452A patent/KR102645079B1/ko active IP Right Grant
- 2018-02-21 EA EA201991928A patent/EA201991928A1/ru unknown
- 2018-02-21 CN CN201880026346.5A patent/CN110636868B/zh active Active
- 2018-02-21 EP EP18758507.0A patent/EP3585443A4/en active Pending
- 2018-02-21 MX MX2019009972A patent/MX2019009972A/es unknown
- 2018-02-21 SG SG11201907700XA patent/SG11201907700XA/en unknown
- 2018-02-21 JP JP2019545770A patent/JP7139345B2/ja active Active
-
2023
- 2023-03-03 US US18/177,938 patent/US20240093209A1/en active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010528616A (ja) * | 2007-05-29 | 2010-08-26 | イェール ユニバーシティー | オルタナティブスプライシングとｒｎａのスプライシングを調節するリボスイッチに関連する方法と組成物 |
| US20100221821A1 (en) * | 2007-05-29 | 2010-09-02 | Yale University | Methods and compositions related to riboswitches that control alternative splicing and rna processing |
| WO2010141085A1 (en) * | 2009-06-02 | 2010-12-09 | Biorelix Pharmaceuticals, Inc. | Methods for screening and identifying compounds |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL268819A (en) | 2019-10-31 |
| IL268819B1 (en) | 2024-03-01 |
| MX2019009972A (es) | 2020-01-15 |
| US20240093209A1 (en) | 2024-03-21 |
| EP3585443A4 (en) | 2020-12-16 |
| WO2018156658A1 (en) | 2018-08-30 |
| SG11201907700XA (en) | 2019-09-27 |
| JP7139345B2 (ja) | 2022-09-20 |
| JP2020508057A (ja) | 2020-03-19 |
| NZ756568A (en) | 2024-03-22 |
| EA201991928A1 (ru) | 2020-01-09 |
| CA3054294A1 (en) | 2018-08-30 |
| BR112019017444A2 (pt) | 2020-04-14 |
| AU2018224048A1 (en) | 2019-09-12 |
| KR102645079B1 (ko) | 2024-03-08 |
| CN110636868A (zh) | 2019-12-31 |
| CN110636868B (zh) | 2024-03-15 |
| EP3585443A1 (en) | 2020-01-01 |
| US20200010836A1 (en) | 2020-01-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230220382A1 (en) | Regulation of gene expression via aptamer-mediated control of self-cleaving ribozymes | |
| US20240191239A1 (en) | Regulation of gene expression through aptamer-modulated polyadenylation | |
| US20240093209A1 (en) | Regulation of Gene Expression by Aptamer-Mediated Accessibility of Polyadenylation Signals | |
| US20240002862A1 (en) | Regulation of gene expression by aptamer-modulated rnase p cleavage |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |