JP7139345B2 - アプタマーが媒介する、ポリアデニル化シグナルのアクセシビリティによる遺伝子発現の調節 - Google Patents
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Description
本発明は、1つ又は複数のポリアデニル化シグナルのアクセシビリティ(accessibility)の、アプタマーに基づく調整による遺伝子発現の調節のためのポリヌクレオチド構築物、及びアプタマーに結合するリガンドの存在又は非存在に応答して遺伝子発現を調節するためにポリヌクレオチド構築物を使用する方法を提供する。ポリヌクレオチド構築物は、アプタマー及びエフェクターステムループを含むリボスイッチを含有し、エフェクターステムループは、ポリアデニル化シグナル配列を含む。
真核細胞におけるメッセンジャーRNA(mRNA:messenger RNA)は、5'末端キャッピング、スプライシングによるイントロンの除去並びに3'末端の切断及びポリアデニル化を含む、大規模な転写後プロセシングによってpre-mRNA転写産物から生成する。ほとんどすべての真核生物mRNAの3'末端は、20～250個のアデノシン残基のホモポリマーであるポリ(A)テールを含む。ポリ(A)テールは、タンパク質の大きな複合体によって触媒されるプロセスである切断及びポリアデニル化によって、核内でpre-mRNAに付加される。ポリ(A)テールの付加は、ポリアデニル化部位の上流に見られる高度に保存されているAATAAA(又はそのバリアントATTAAA)ポリアデニル化シグナル配列及び他の上流エレメント(「USE(upstream element)」)、並びにT又はGTリッチ下流エレメント(「DSE(downstream element)」)を含む、多数のエレメントの存在に依存する。ポリ(A)テールのmRNAへの付加は、他の機能もあるが、メッセージを分解から保護する。
Flaherty, JTら、Plos One、8巻、e63076、2013
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一態様においては、本発明は、リボスイッチを含む標的遺伝子の発現の調節のためのポリヌクレオチドカセットであって、リボスイッチが、エフェクターステムループ及びアプタマーを含み、エフェクターステムループが、ポリアデニル化シグナルを含み、アプタマーとエフェクターステムループとが、アプタマーステムの非共有アームに、及びエフェクターステムループの非共有アームに相補的な配列を含む、択一的に共有されるステムアームによって連結されている、ポリヌクレオチドカセットを提供する。一実施形態においては、アプタマーは、小分子リガンドに結合する。
実施形態においては、アプタマーステムの配列に、及びエフェクターステムループの配列に相補的な択一的に共有されるステムアームの部分は、4～8個のヌクレオチド、5～7個のヌクレオチド、5個のヌクレオチド又は6個のヌクレオチドである。実施形態においては、アプタマーステムは、6～12塩基対、7～10塩基対、8塩基対又は9塩基対である。実施形態においては、エフェクターステムループのステムは、4～24塩基対、5～20塩基対、9～14塩基対、9塩基対、10塩基対、11塩基対又は12塩基対である。
一実施形態においては、択一的に共有されるステムアームが、3'アプタマーステムアームのすべて又は一部及びエフェクターステムの5'アームのすべて又は一部を含むように、エフェクターステムループは、アプタマーの3'に位置する。一実施形態においては、択一的に共有されるステムアームが、5'アプタマーステムアームのすべて又は一部及びエフェクターステムの3'アームのすべて又は一部を含むように、エフェクターステムループは、アプタマーの5'に位置する。一実施形態においては、ポリアデニル化シグナルは、AATAAA又はATTAAAである。一実施形態においては、ポリアデニル化シグナルは、下流エレメント(DSE)である。一実施形態においては、ポリアデニル化シグナルは、上流配列エレメント(USE)である。
一実施形態においては、ポリヌクレオチドカセットは、本発明の2つのリボスイッチを含み、第1のリボスイッチのエフェクターステムループは、ポリアデニル化シグナルAATAAA又はATTAAのすべて又は部分を含み、第2のリボスイッチのエフェクターステムループは、下流エレメント(DSE)のすべて又は部分を含む。一実施形態においては、2つのリボスイッチ各々は、同じリガンドに結合するアプタマーを含む。一実施形態においては、2つのリボスイッチは、異なるリガンドに結合する異なるアプタマーを含む。
一態様においては、本発明は、
(a)本発明のポリヌクレオチドカセットのうちの1つ又は複数を、標的遺伝子の3'非翻訳領域に挿入する工程と、
(b)ポリヌクレオチドカセットを含む標的遺伝子を細胞に導入する工程と、
(c)細胞を、標的遺伝子の発現を増大するのに有効な量の、アプタマーに結合するリガンドに曝露する工程と
を含む標的遺伝子の発現を調整する方法を提供する。
(a)本発明のポリヌクレオチドカセットのうちの1つ又は複数を、標的遺伝子の3'非翻訳領域に挿入する工程と、
(b)ポリヌクレオチドカセットを含む標的遺伝子を細胞に導入する工程と、
(c)細胞を、標的遺伝子の発現を増大するのに有効な量の、アプタマーに結合するリガンドに曝露する工程と
を含む標的遺伝子の発現を調整する方法を提供する。
一実施形態においては、リガンドは、小分子である。一実施形態においては、2つのリボスイッチは、標的遺伝子の3'非翻訳領域(「UTR」)に挿入され、第1のリボスイッチのエフェクターステムループは、ポリアデニル化シグナルAATAAA又はATTAAのすべて又は部分を含み、第2のリボスイッチのエフェクターステムループは、下流エレメント(DSE)のすべて又は部分を含む。一実施形態においては、2つのリボスイッチ各々は、同じリガンドに結合するアプタマーを含む。一実施形態においては、2つのリボスイッチは、異なるリガンドに結合する異なるアプタマーを含む。一実施形態においては、2つ又はそれよりも多いポリヌクレオチドカセットは、同じアプタマーを含む。
一実施形態においては、ポリヌクレオチドカセットを含む標的遺伝子は、標的遺伝子の発現のためのベクターに組み込まれる。一実施形態においては、ベクターは、ウイルスベクターである。一実施形態においては、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される。
一態様においては、本発明は、本明細書において説明するポリヌクレオチドカセットを含有する標的遺伝子を含むベクターを提供する。一実施形態においては、ベクターは、ウイルスベクターである。一実施形態においては、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される。
一態様においては、本発明のポリヌクレオチドカセットは、標的遺伝子の発現の調節のための他の機構と組み合わせて使用される。一実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドカセットは、参照により本明細書に組み込むWO2016/126747(PCT/US2016/016234)において説明されている、アプタマーが媒介する、選択的スプライシングの調節によって標的遺伝子発現を調整する遺伝子調節カセットと組み合わせて使用される。他の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドカセットは、参照により本明細書に組み込むPCT/US2017/016303において説明されている、アプタマーが媒介する、自己切断リボザイムの調節によって標的遺伝子発現を調整する遺伝子調節カセットと組み合わせて使用される。他の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドカセットは、参照により本明細書に組み込むPCT/US2017/016279において説明されている、アプタマーが媒介する、ポリアデニル化の調整によって標的遺伝子発現を調整する遺伝子調節カセットと組み合わせて使用される。
本出願は、その全体を本明細書に組み込む2017年2月21日出願の米国仮出願第62/461,689号の優先権を主張する。本出願は、以下に列挙する配列番号を提供する配列リストを参照し、当該配列リストは、電子文書として本明細書と共に提供され、その全体を参照により本明細書に組み込む。
標的遺伝子(例えば治療用トランスジーン)の発現の調節は、様々な状況において有用又は必要である。治療用の遺伝子発現に関連して、トランスジーンの発現の調節を可能にする技術は、発現レベル及び発現のタイミングを調節することによって安全性を向上する可能性を有する。タンパク質発現を制御するように調節された系は、安全で有効な治療適用のための実用的、且つ一部の場合、本質的な役割を有する。本発明は、1つ又は複数のポリアデニル化シグナルを、アプタマーに連結するステムループ構造(エフェクターステムループ)内に隔離することによる、アプタマーに基づくポリアデニル化の調整による遺伝子発現の調節のためのポリヌクレオチド構築物、及びアプタマーに結合するリガンドの存在又は非存在に応答して遺伝子発現を調節するために構築物を使用する方法を提供する。
ポリヌクレオチド構築物は、エフェクターステムループ及びアプタマーを含む少なくとも1つのリボスイッチを含有し、エフェクターステムループは、ポリアデニル化シグナル配列を含む。アプタマーとエフェクターステムループとは、アプタマーリガンドの存在に依存してアプタマーステム又はエフェクターステムのいずれかと選択的にステムを形成し得る、共有されるステムアームによって連結されている。アプタマーリガンドが存在し、アプタマーに結合した場合、アプタマーステム(アプタマーP1ステム)は安定化し、択一的に共有されるステムアームとステムを形成する。したがって、リガンドの存在下では、エフェクターステムループによって形成されるステムループ構造は、優先されず、ポリアデニル化シグナルはアクセス可能であり、ポリアデニル化が起こることが可能になり、標的遺伝子発現の向上をもたらす。リガンドの非存在下では、エフェクターステムループは、択一的に共有されるステムアームとステム構造を形成し、それによってポリアデニル化シグナル配列を隔離し、ポリアデニル化を防止し、標的遺伝子発現を減少する。
一実施形態においては、択一的に共有されるステムアームが、3'アプタマーステムアームのすべて又は一部及びエフェクターステムループの5'アームのすべて又は一部を含むように、エフェクターステムループは、アプタマーの3'に位置する(例えば図1a及び図1bを参照のこと)。一実施形態においては、択一的に共有されるステムアームが、5'アプタマーステムアームのすべて又は一部及びエフェクターステムループの3'アームのすべて又は一部を含むように、エフェクターステムループは、アプタマーの5'に位置する(例えば図3を参照のこと)。
遺伝子調節ポリヌクレオチドカセットは、標的遺伝子のDNAの3'UTRに組み込まれた場合に、アプタマー/リガンドが媒介するポリアデニル化の調節によって標的遺伝子の発現を調節する能力を提供する、組換えDNA構築物を指す。本明細書において使用するとき、ポリヌクレオチドカセット又は構築物は、様々な供給源(例えば様々な生物、同じ生物からの様々な遺伝子等)に由来するエレメントを含む核酸(例えばDNA又はRNA)である。
リボスイッチ
ポリヌクレオチドカセットは、リボスイッチを含む。「リボスイッチ」という用語は、本明細書において使用するとき、RNAポリヌクレオチドの調節セグメント(又はリボスイッチをコードするDNA)を指す。本発明に関連するリボスイッチは、センサー領域(例えばアプタマー)及びエフェクターステムループを含有し、これらは共に、リガンド(例えば小分子)の存在を感知し、エフェクターステムループに位置するポリアデニル化配列のアクセシビリティを調整する役割を有する。一実施形態においては、リボスイッチは、組換えであり、2つ又はそれよりも多い供給源からのポリヌクレオチドを利用する。「合成」という用語は、リボスイッチに関連して本明細書において使用するとき、天然ではないリボスイッチを指す。
ポリヌクレオチドカセットは、リボスイッチを含む。「リボスイッチ」という用語は、本明細書において使用するとき、RNAポリヌクレオチドの調節セグメント(又はリボスイッチをコードするDNA)を指す。本発明に関連するリボスイッチは、センサー領域(例えばアプタマー)及びエフェクターステムループを含有し、これらは共に、リガンド(例えば小分子)の存在を感知し、エフェクターステムループに位置するポリアデニル化配列のアクセシビリティを調整する役割を有する。一実施形態においては、リボスイッチは、組換えであり、2つ又はそれよりも多い供給源からのポリヌクレオチドを利用する。「合成」という用語は、リボスイッチに関連して本明細書において使用するとき、天然ではないリボスイッチを指す。
エフェクターステムループ
リボスイッチのエフェクターステムループは、センサー領域(例えばアプタマー)に結合するリガンドの非存在下では、ステム構造(すなわち、二本鎖領域)を形成し、ポリアデニル化シグナル配列のアクセシビリティを低減するRNA配列(又はRNA配列をコードするDNA)を含む。一実施形態においては、エフェクターステムループは、ポリアデニル化シグナル配列及びポリアデニル化シグナル配列に相補的な配列を含む。一部の実施形態においては、エフェクターステムループのステム部分は、ポリアデニル化シグナル配列の一部のみを含む。一部の実施形態においては、ポリアデニル化シグナル配列のすべて又は部分は、エフェクターステムループのループ部分に位置する。
リボスイッチのエフェクターステムループは、センサー領域(例えばアプタマー)に結合するリガンドの非存在下では、ステム構造(すなわち、二本鎖領域)を形成し、ポリアデニル化シグナル配列のアクセシビリティを低減するRNA配列(又はRNA配列をコードするDNA)を含む。一実施形態においては、エフェクターステムループは、ポリアデニル化シグナル配列及びポリアデニル化シグナル配列に相補的な配列を含む。一部の実施形態においては、エフェクターステムループのステム部分は、ポリアデニル化シグナル配列の一部のみを含む。一部の実施形態においては、ポリアデニル化シグナル配列のすべて又は部分は、エフェクターステムループのループ部分に位置する。
ポリアデニル化シグナル配列は、AATAAA(又は関連配列)、下流配列エレメント(DSE)(例えばT又はGTリッチリッチ配列)又は上流配列エレメント(USE)を含む、標的遺伝子から転写されたmRNAの効率的なポリアデニル化に関連する標的遺伝子の3'UTRの任意の配列であってもよい。一部の実施形態においては、ポリアデニル化シグナル配列は、標的遺伝子の3'UTRからの内因性配列である。他の実施形態においては、ポリアデニル化シグナル配列は、外因性配列(例えば異なる遺伝子又は異なる生物からの配列)又は合成ポリアデニル化シグナル配列である。
エフェクターステムループのステムアームのうちの1つは、アプタマーのステムを介してアプタマーに連結される(例えば図1a、図1b及び図2aを参照のこと)。アプタマーがそのリガンドに結合していない場合、エフェクターステムループは、ポリアデニル化シグナル配列へのアクセスを阻害する状況にあり、ポリアデニル化を阻害し、メッセージの分解をもたらす。アプタマーがそのリガンドに結合した場合、エフェクターステムループは、ポリアデニル化シグナル配列へのアクセスを阻害しないコンフォメーションであり、メッセージのポリアデニル化及び標的遺伝子発現の増大を可能にする。
エフェクターステムループのステム部分は、アプタマーリガンドが十分な量で存在しない場合、ステムループ構造形成を促進し、それによってポリアデニル化シグナル配列へのアクセシビリティを阻害するのに十分な長さ(及びGC含有量)のものであるべきである。本発明の実施形態においては、エフェクターステムループのステム部分は、ポリアデニル化シグナル配列及びその相補配列に加えてステム配列を含む。ステム部分の長さ及び配列は、リガンドが存在していない場合に標的遺伝子の許容可能なバックグラウンド発現を可能にし、リガンドが存在している場合に標的遺伝子の許容可能な発現レベルを可能にするステムを特定するために、公知の技術を使用して改変することができる。ステムが、例えば長すぎる場合、それは、リガンドの存在下又は非存在下でポリアデニル化シグナル配列へのアクセスを覆い隠し得る。ステムが短すぎる場合、それは、ポリアデニル化シグナル配列を隔離することができる安定なステムループ構造を形成しない場合があり、その場合、(標的遺伝子の発現をもたらす)メッセージのポリアデニル化は、リガンドの存在下又は非存在下で起こる。一実施形態においては、エフェクターステムの全長(すなわち、エフェクターステムループのステム形成部分)は、4～24塩基対、5～20塩基対、9～14塩基対、9塩基対、10塩基対、11塩基対又は12塩基対である。ステムの長さに加えて、ステムのGC塩基対含有量は、ステムの安定性を改変するために変えることができる。一部の実施形態においては、エフェクター領域ステムは、エフェクター領域ステムの相補部分と塩基対形成しない1つ又は複数の適合しないヌクレオチドを含有する。
択一的に共有されるステムアーム
エフェクターステムループとアプタマーとは、エフェクターステムループの非共有アーム及びアプタマーステムの非共有アームの両方に相補的な配列を含む択一的に共有されるステムアームを介して連結されている。非共有アーム上のアプタマー及びエフェクターステムの両方に相補的な配列のために、共有されるステムアームは、アプタマーリガンドの存在に依存して、アプタマーステム又はエフェクターステムのいずれかとステムを選択的に形成し得る(が、同時に両方とステムを形成しない)。実施形態においては、アプタマーステムの配列に、及びエフェクターステムループの配列に相補的な択一的に共有されるステムアームの部分(すなわち、択一的に共有される配列)は、4～8個のヌクレオチド、5～7個のヌクレオチド、5個のヌクレオチド又は6個のヌクレオチドである。一部の実施形態においては、択一的に共有されるステムアームは、非共有エフェクターステム又はアプタマーステムのうちの1つのみに相補的な追加の配列を含む。一部の実施形態においては、択一的に共有される配列に加えて、択一的に共有されるステムアームは、(a)非共有エフェクターステムアームに相補的であるが、非共有アプタマーステムアームに相補的でない配列;(b)非共有アプタマーステムアームに相補的であるが、非共有エフェクターステムアームに相補的でない配列;又は(c)これらの両方を含む。
エフェクターステムループとアプタマーとは、エフェクターステムループの非共有アーム及びアプタマーステムの非共有アームの両方に相補的な配列を含む択一的に共有されるステムアームを介して連結されている。非共有アーム上のアプタマー及びエフェクターステムの両方に相補的な配列のために、共有されるステムアームは、アプタマーリガンドの存在に依存して、アプタマーステム又はエフェクターステムのいずれかとステムを選択的に形成し得る(が、同時に両方とステムを形成しない)。実施形態においては、アプタマーステムの配列に、及びエフェクターステムループの配列に相補的な択一的に共有されるステムアームの部分(すなわち、択一的に共有される配列)は、4～8個のヌクレオチド、5～7個のヌクレオチド、5個のヌクレオチド又は6個のヌクレオチドである。一部の実施形態においては、択一的に共有されるステムアームは、非共有エフェクターステム又はアプタマーステムのうちの1つのみに相補的な追加の配列を含む。一部の実施形態においては、択一的に共有される配列に加えて、択一的に共有されるステムアームは、(a)非共有エフェクターステムアームに相補的であるが、非共有アプタマーステムアームに相補的でない配列;(b)非共有アプタマーステムアームに相補的であるが、非共有エフェクターステムアームに相補的でない配列;又は(c)これらの両方を含む。
アプタマー/リガンド
一実施形態においては、センサー領域は、アプタマーを含む。「アプタマー」という用語は、本明細書において使用するとき、リガンドに特異的に結合するRNAポリヌクレオチドを指す。アプタマーは、アプタマーステムを介してエフェクターステムループに連結される。アプタマーステムは、典型的にアプタマーの部分である配列(例えば野生型アプタマーステム配列)を含んでも、含まなくてもよい。そのため、アプタマーステムについての言及は、アプタマーステムが任意の特定の配列を含むことを意味しない。したがって、アプタマーステムは、アプタマーからの配列及び/又はリガンド/アプタマー結合に際してステムを形成することができる追加の配列を含み得る。
一実施形態においては、センサー領域は、アプタマーを含む。「アプタマー」という用語は、本明細書において使用するとき、リガンドに特異的に結合するRNAポリヌクレオチドを指す。アプタマーは、アプタマーステムを介してエフェクターステムループに連結される。アプタマーステムは、典型的にアプタマーの部分である配列(例えば野生型アプタマーステム配列)を含んでも、含まなくてもよい。そのため、アプタマーステムについての言及は、アプタマーステムが任意の特定の配列を含むことを意味しない。したがって、アプタマーステムは、アプタマーからの配列及び/又はリガンド/アプタマー結合に際してステムを形成することができる追加の配列を含み得る。
上記に説明するエフェクターステムループのステムと同様に、アプタマーステムループは、アプタマーリガンドの存在下ではアプタマーがアプタマーステムを形成し、リガンドが存在しない場合はエフェクターステムループがステムを形成するように、十分な長さ(及びGC含有量)であるべきである。アプタマーステムの長さ及び配列は、リガンドが存在しない場合の標的遺伝子の許容されるバックグラウンド発現、及びリガンドが存在する場合の標的遺伝子の許容される発現レベルを可能にするステムを特定するために公知の技術を使用して改変することができる。実施形態においては、アプタマーステムは、6～12塩基対、7～10塩基対、8塩基対又は9塩基対である。
「リガンド」という用語は、アプタマーが特異的に結合する分子を指す。一実施形態においては、リガンドは、例えば脂質、単糖、セカンドメッセンジャー、補因子、金属イオン、他の天然生成物及び代謝産物、核酸並びにほとんどの治療用薬物を含む低分子量(約1,000ダルトン未満の)分子である。一実施形態においては、リガンドは、2個又はそれよりも多いヌクレオチド塩基を有するポリヌクレオチドである。
一実施形態においては、リガンドは、8-アザグアニン、アデノシン5'-一リン酸一水和物、アムホテリシンB、エバーメクチンB1、アザチオプリン、クロルマジノン酢酸塩、メルカプトプリン、モリシジン塩酸塩、N6-メチルアデノシン、ナダイド、プロゲステロン、プロマジン塩酸塩、ピルビニウムパモ酸塩、スルファグアニジン、テストステロンプロピオン酸エステル、チオグアノシン、チロキサポール及びボリノスタットからなる群から選択される。
また、アプタマーリガンドは、発癌性形質転換等の特異的生理学的/病理学的状態下で顕著に増大する細胞内因性成分である場合があり、これらは、セカンドメッセンジャー分子、例えばGTP又はGDP、カルシウム;脂肪酸又は乳がんにおける13-HODE等の不正確に代謝された脂肪酸(参照により本明細書に組み込むFlaherty, JTら、Plos One、8巻、e63076、2013);アミノ酸又はアミノ酸代謝産物;通常がん細胞において、又は代謝疾患においては正常細胞においてより高レベルを有する解糖経路における代謝産物;及びがん関連分子、例えばRas又は変異Rasタンパク質、肺がんにおける変異EGFR、多くの種類のがんにおけるインドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO:indoleamine-2,3-dioxygenase)を含み得る。内因性リガンドは、JP Wiebe(参照により本明細書に組み込むEndocrine-Related Cancer(2006)13:717～738頁)によって開示されている乳がんにおけるプロゲステロン代謝産物を含む。また、内因性リガンドは、Minton, DR及びNanus, DM(参照により本明細書に組み込むNature Reviews, Urology、12巻、2005)によって開示されている、腎がんにおいてキー代謝酵素における変異から生ずるレベルの増大を有する代謝産物、例えば乳酸塩、グルタチオン、キヌレニンを含む。
アプタマーは、意図される標的分子(すなわち、リガンド)と複合体を形成することができる結合領域を有する。結合の特異性は、アプタマーの非関連分子についての解離定数と比較した、アプタマーのそのリガンドについての相対的解離定数(Kd)の点で定義することができる。したがって、リガンドは、非関連材料に対してよりも大きなアフィニティでアプタマーに結合する分子である。典型的に、アプタマーのそのリガンドについてのKdは、非関連分子でのアプタマーのKdより少なくとも約10倍小さい。他の実施形態においては、Kdは、少なくとも約20倍小さく、少なくとも約50倍小さく、少なくとも約100倍小さく、少なくとも約200倍小さい。アプタマーは典型的に、長さが約15～約200個のヌクレオチドである。より通常には、アプタマーは、長さが約30～約100個のヌクレオチドである。
リボスイッチの部分として組み込まれ得るアプタマーは、天然アプタマー若しくはその改変、又は新規に設計し、且つ/若しくはexponential enrichment(SELEX)法によるリガンドの系統的発展若しくは他のスクリーニング方法を通してスクリーニングしたアプタマーであり得る。小分子リガンドに結合するアプタマーの例として、テオフィリン、ドパミン、スルホローダミンB、セロビオース、カナマイシンA、リビドマイシン、トブラマイシン、ネオマイシンB、バイオマイシン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、サイトカイン、細胞表面分子及び代謝産物が挙げられるが、これらに限定されない。小分子を認識するアプタマーの概略については、例えばFamulok、Science 9:324～9頁(1999)並びにMcKeague, M.及びDeRosa, M.C.J. Nuc. Aci. 2012(それらの両方を参照により本明細書に組み込む)を参照されたい。別の実施形態においては、アプタマーは、相補的ポリヌクレオチドである。
アプタマー/リガンドを特定するための方法
一実施形態においては、アプタマーは、特定の小分子リガンドに結合するように設計される。特定のリガンドに結合するアプタマーを設計及び選択するための方法は、参照により本明細書に組み込むWO/2018/025085において開示されている。アプタマーをスクリーニングするための他の方法として、例えば、SELEX法が挙げられる。SELEX法を使用して小分子を選択的に結合するアプタマーを設計するための方法は、例えば参照により本明細書に組み込む米国特許第5,475,096号、同第5,270,163号及びAbdullah Ozerら Nuc. Aci. 2014において開示されている。SELEX法の改変は、参照により本明細書に組み込む米国特許第5,580,737号及び同第5,567,588号において説明されている。
一実施形態においては、アプタマーは、特定の小分子リガンドに結合するように設計される。特定のリガンドに結合するアプタマーを設計及び選択するための方法は、参照により本明細書に組み込むWO/2018/025085において開示されている。アプタマーをスクリーニングするための他の方法として、例えば、SELEX法が挙げられる。SELEX法を使用して小分子を選択的に結合するアプタマーを設計するための方法は、例えば参照により本明細書に組み込む米国特許第5,475,096号、同第5,270,163号及びAbdullah Ozerら Nuc. Aci. 2014において開示されている。SELEX法の改変は、参照により本明細書に組み込む米国特許第5,580,737号及び同第5,567,588号において説明されている。
アプタマーを特定するための選択技術は一般的に、ランダム化又は突然変異誘発される領域を含有する所望の長さのDNA又はRNA分子の大きなプールを調製することを含む。例えば、アプタマー選択のためのオリゴヌクレオチドプールは、約15～25個のヌクレオチド長であり、PCRプライマーの結合に有用である定義された配列の領域に隣接した、20～100個のランダム化ヌクレオチドの領域を含有し得る。オリゴヌクレオチドプールを、標準のPCR技術、又は選択した核酸配列の増幅を可能にする他の手段を使用して増幅する。RNAアプタマーが所望される場合、DNAプールをin vitroで転写して、RNA転写産物のプールを生成してもよい。その後、RNA又はDNAオリゴヌクレオチドのプールを、所望のリガンドに特異的に結合するそれらの能力に基づいた選択に供する。選択技術として、例えばアフィニティクロマトグラフィーが挙げられるが、別の分子に特異的に結合するそれらの能力に基づいた核酸の選択を可能にする任意のプロトコールを使用してもよい。小分子に結合し、細胞内で機能するアプタマーを特定するための選択技術は、細胞ベースのスクリーニング法を含み得る。アフィニティクロマトグラフィーの場合、オリゴヌクレオチドを、カラム内の、又は磁気ビーズ上の基質上に固定した標的リガンドと接触させる。オリゴヌクレオチドを好ましくは、正常生理学条件を模倣する塩濃度、温度及び他の条件の存在下でリガンド結合について選択する。リガンドに結合するプール中のオリゴヌクレオチドを、カラム又はビーズ上に保持し、非結合配列を洗い流す。その後、リガンドに結合するオリゴヌクレオチドを、(通常、溶離後に)PCRによって(RNA転写産物を利用した場合、逆転写後に)増幅する。選択した配列について、全部で約3～10回の反復ラウンドの選択手技分、選択方法を繰り返す。その後、得られたオリゴヌクレオチドを増幅し、クローニングし、標準の手技を使用して配列決定して、標的リガンドに結合することができるオリゴヌクレオチドの配列を特定する。アプタマー配列を特定すると、突然変異誘発したアプタマー配列を含むオリゴヌクレオチドのプールから開始する追加のラウンドの選択を行うことによって、アプタマーを更に最適化してもよい。
1又は複数ラウンドのin vitro選択(例えばSELEX法)の後に、in vivoアプタマースクリーニングを使用してもよい。例えば、Konig, J.ら(参照により本明細書に組み込むRNA. 2007,13(4):614～622頁)は、SELEX法と、アプタマーのin vivo選択のための酵母3ハイブリッド系とを組み合わせることを説明している。
標的遺伝子
本発明の遺伝子調節カセットは、ポリアデニル化されているmRNAを有する標的細胞、組織又は生物において発現され得る任意の標的遺伝子の発現を調節するために使用され得るプラットホームである。「標的遺伝子」という用語は、適切な条件下で細胞に導入し、RNAに転写、翻訳及び/又は発現することができるポリヌクレオチドを指す。或いは、標的遺伝子は、標的細胞にとって内因性であり、本発明の遺伝子調節カセットは、標的遺伝子の3'UTRに位置付けられる。標的遺伝子の例は、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。一実施形態においては、標的遺伝子は、組換えDNA構築物が転写される細胞にとって外因性である。別の実施形態においては、標的遺伝子は、組換えDNA構築物が転写される細胞にとって内因性である。
本発明の遺伝子調節カセットは、ポリアデニル化されているmRNAを有する標的細胞、組織又は生物において発現され得る任意の標的遺伝子の発現を調節するために使用され得るプラットホームである。「標的遺伝子」という用語は、適切な条件下で細胞に導入し、RNAに転写、翻訳及び/又は発現することができるポリヌクレオチドを指す。或いは、標的遺伝子は、標的細胞にとって内因性であり、本発明の遺伝子調節カセットは、標的遺伝子の3'UTRに位置付けられる。標的遺伝子の例は、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。一実施形態においては、標的遺伝子は、組換えDNA構築物が転写される細胞にとって外因性である。別の実施形態においては、標的遺伝子は、組換えDNA構築物が転写される細胞にとって内因性である。
本発明による標的遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子であってもよい。標的遺伝子は、例えば、構造タンパク質、酵素、細胞シグナル伝達タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、亜鉛フィンガータンパク質、ホルモン、輸送タンパク質、増殖因子、サイトカイン、細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、膜貫通タンパク質、細胞質タンパク質、核タンパク質、受容体分子、RNA結合タンパク質、DNA結合タンパク質、転写因子、翻訳装置、チャネルタンパク質、モータータンパク質、細胞接着分子、ミトコンドリアタンパク質、代謝酵素、キナーゼ、ホスファターゼ、交換因子、シャペロンタンパク質及びこれらのうちのいずれかのモジュレーターをコードする遺伝子であってもよい。実施形態においては、標的遺伝子は、エリスロポエチン(Epo:erythropoietin)、ヒト成長ホルモン(hGH:human growth hormone)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN:transcription activator-like effector nucleases)、ヒトインスリン、CRISPR関連タンパク質9(cas9)、又は例えば治療用抗体を含む免疫グロブリン(又はその部分)をコードする。
発現構築物
本発明は、標的遺伝子をコードし、本明細書において説明する遺伝子調節カセットを含有するポリヌクレオチドの標的細胞への導入のための組換えベクターの使用を企図する。多くの実施形態においては、本発明の組換えDNA構築物は、ホスト細胞におけるDNAの複製及びその細胞における適切なレベルでの標的遺伝子の発現を提供するDNAセグメントを含む追加のDNAエレメントを含む。当業者は、発現制御配列(プロモーター、エンハンサー等)は、標的細胞において標的遺伝子の発現を促進するそれらの能力に基づいて選択されることを理解する。「ベクター」は、in vitro又はin vivoのいずれかでホスト細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む、組換えプラスミド、酵母人工染色体(YAC:yeast artificial chromosome)、ミニ染色体、DNAミニサークル又はウイルス(ウイルス由来配列を含む)を意味する。一実施形態においては、組換えベクターは、ウイルスベクター又は多数のウイルスベクターの組合せである。
本発明は、標的遺伝子をコードし、本明細書において説明する遺伝子調節カセットを含有するポリヌクレオチドの標的細胞への導入のための組換えベクターの使用を企図する。多くの実施形態においては、本発明の組換えDNA構築物は、ホスト細胞におけるDNAの複製及びその細胞における適切なレベルでの標的遺伝子の発現を提供するDNAセグメントを含む追加のDNAエレメントを含む。当業者は、発現制御配列(プロモーター、エンハンサー等)は、標的細胞において標的遺伝子の発現を促進するそれらの能力に基づいて選択されることを理解する。「ベクター」は、in vitro又はin vivoのいずれかでホスト細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む、組換えプラスミド、酵母人工染色体(YAC:yeast artificial chromosome)、ミニ染色体、DNAミニサークル又はウイルス(ウイルス由来配列を含む)を意味する。一実施形態においては、組換えベクターは、ウイルスベクター又は多数のウイルスベクターの組合せである。
アプタマーが媒介する、標的細胞、組織又は生物における標的遺伝子の発現のためのウイルスベクターは、本分野で公知であり、アデノウイルス(AV:adenoviral)ベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV:adeno-associated virus)ベクター、レトロウイルス及びレンチウイルスベクター並びに単純ヘルペスウイルス1型(HSV1:Herpes simplex type 1)ベクターを含む。
アデノウイルスベクターは、例えば、E1及びE3領域における欠失を通して複製欠損にしたヒトアデノウイルス2型及びヒトアデノウイルス5型に基づくベクターを含む。転写カセットを、E1領域に挿入し、組換えE1/E3欠失AVベクターを産出してもよい。また、アデノウイルスベクターは、ウイルスコード配列を含有しない、ヘルパー依存性高性能アデノウイルスベクター(高性能「gutless」又は「gutted」ベクターとしても知られる)を含む。これらのベクターは、ウイルスDNA複製及びパッケージングに必要なシス作用エレメント、主に末端逆位配列(ITR:inverted terminal repeat sequence)及びパッケージングシグナル(ψ)を含有する。これらのヘルパー依存性AVベクターゲノムは、数百塩基対～最大で約36kbの外来DNAを運搬する可能性を有する。
組換えアデノ随伴ウイルス「rAAV(recombinant adeno-associated virus)」ベクターは、非限定的にAAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-7及びAAV-8、AAV-9、AAV-10等を含む、任意のアデノ随伴ウイルス血清型に由来する任意のベクターを含む。rAAVベクターは、全体的又は部分的に欠失したAAV野生型遺伝子のうちの1つ又は複数、好ましくはRep及び/又はCap遺伝子を有し得るが、機能的隣接ITR配列を保持している。機能的ITR配列は、AAVゲノムのレスキュー、複製、パッケージング及び染色体組込みの可能性のために保持される。ITRは、配列が機能的レスキュー、複製及びパッケージングを提供する限り、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、(例えばヌクレオチドの挿入、欠失又は置換によって)変えてもよい。
或いは、他の系、例えばレンチウイルスベクターを、本発明の実施形態において使用することができる。レンチウイルスベースの系は、非分裂及び分裂細胞、例えばCNSの非分裂細胞に形質導入し、細胞をターゲティング適用に有用にさせることができる。レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルスに由来し、そのウイルスと同様に、宿主ゲノムに組み込まれ、長期遺伝子発現の可能性を提供する。
また、遺伝子調節カセットを含有する標的遺伝子を運搬するプラスミド、YAC、ミニ染色体及びミニサークルを含むポリヌクレオチドは、例えば担体としてカチオン性脂質、ポリマー又は両方を使用する非ウイルスベクター系によって細胞又は生物に導入することができる。また、コンジュゲートしたポリ-L-リジン(PLL:poly-L-lysine)ポリマー及びポリエチレンイミン(PEI:polyethylenimine)ポリマー系は、ベクターを細胞に送達するために使用することができる。ベクターを細胞に送達するための他の方法は、細胞培養物及び生物両方について、ハイドロダイナミック注入法及びエレクトロポレーション法並びに超音波の使用を含む。遺伝子送達のためのウイルス及び非ウイルス送達系の概略については、Nayerossadat, N.ら(参照により本明細書に組み込むAdv Biomed Res. 2012;1:27頁)を参照されたい。
標的遺伝子の発現を調整する方法
一態様においては、本発明は、(a)本発明の1つ又は複数の遺伝子調節ポリヌクレオチドカセットを標的遺伝子の3'UTRに挿入する工程;(b)遺伝子調節カセットを含む標的遺伝子を細胞に導入する工程;(c)細胞をアプタマーに結合するリガンドに曝露する工程による、標的遺伝子(例えば治療用遺伝子)の発現を調整する方法を提供する。一実施形態においては、リガンドは、小分子である。態様においては、標的細胞における標的遺伝子の発現は、それが導入された細胞に所望の特性を与えるか、又は代わりに所望の治療結果をもたらす。標的細胞は、真核細胞、例えば哺乳動物細胞である。実施形態においては、標的細胞は、例えば脂肪、中枢神経系(CNS:central nervous system)、筋肉、心臓、眼、肝臓等を含む標的組織からのヒト細胞である。
一態様においては、本発明は、(a)本発明の1つ又は複数の遺伝子調節ポリヌクレオチドカセットを標的遺伝子の3'UTRに挿入する工程;(b)遺伝子調節カセットを含む標的遺伝子を細胞に導入する工程;(c)細胞をアプタマーに結合するリガンドに曝露する工程による、標的遺伝子(例えば治療用遺伝子)の発現を調整する方法を提供する。一実施形態においては、リガンドは、小分子である。態様においては、標的細胞における標的遺伝子の発現は、それが導入された細胞に所望の特性を与えるか、又は代わりに所望の治療結果をもたらす。標的細胞は、真核細胞、例えば哺乳動物細胞である。実施形態においては、標的細胞は、例えば脂肪、中枢神経系(CNS:central nervous system)、筋肉、心臓、眼、肝臓等を含む標的組織からのヒト細胞である。
一実施形態においては、1つ又は複数の遺伝子調節カセットを、標的遺伝子の3'非翻訳領域に挿入する。一実施形態においては、単一の遺伝子調節カセットを、標的遺伝子の3'UTRに挿入する。一実施形態においては、2つのリボスイッチは、標的遺伝子の3'非翻訳領域に挿入され、第1のリボスイッチのエフェクターステムループは、ポリアデニル化シグナルAATAAA(又はATTAA)のすべて又は部分を含み、第2のリボスイッチのエフェクターステムループは、下流エレメント(DSE)のすべて又は部分を含む。
一実施形態においては、多数の遺伝子調節カセットを標的遺伝子に挿入する場合、単一のリガンドを使用して標的遺伝子の発現を調整することができるように、それら各々は、同じアプタマーを含有し得る。他の実施形態においては、多数の遺伝子調節カセットを標的遺伝子に挿入する場合、多数の様々な小分子リガンドへの曝露が標的遺伝子発現を調整するように、各々が、様々なアプタマーを含有してもよい。
本発明のポリヌクレオチドカセットは、標的遺伝子の発現の調節のための他の機構と組み合わせて使用してもよい。一実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドカセットを、参照により本明細書に組み込むWO2016/126747において説明されている、アプタマーが媒介する選択的スプライシングの調節によって標的遺伝子発現を調整する遺伝子調節カセットと組み合わせて使用する。また、本発明は、参照により本明細書に組み込むPCT/US2017/016303及びPCT/US1207/016279において説明されているポリヌクレオチド構築物及び方法と組み合わせてもよい。
治療方法及び医薬組成物
本発明の一態様は、遺伝子療法によって送達される治療用タンパク質のレベルを調節する方法を提供する。この実施形態においては、「標的遺伝子」は、治療用タンパク質をコードし得る。「標的遺伝子」は、細胞にとって内因性又は外因性のタンパク質をコードし得る。
本発明の一態様は、遺伝子療法によって送達される治療用タンパク質のレベルを調節する方法を提供する。この実施形態においては、「標的遺伝子」は、治療用タンパク質をコードし得る。「標的遺伝子」は、細胞にとって内因性又は外因性のタンパク質をコードし得る。
アプタマー駆動リボスイッチを伴う調節カセットを含有する治療用遺伝子配列は、in vitro又はex vivoで、例えばベクターによって標的細胞に送達される。「標的遺伝子」の細胞特異性は、ベクター内のプロモーター又は他のエレメントによって制御され得る。標的遺伝子及びポリヌクレオチドカセットを含有するベクター構築物の送達、並びに調節される標的遺伝子の安定なトランスフェクションをもたらす標的組織のトランスフェクションは、治療用タンパク質を生成することにおける第1の工程である場合が多い。
しかしながら、標的遺伝子配列内の調節カセットの存在のために、標的遺伝子は顕著なレベルで発現しない(又はより低レベルで発現する)、すなわち、それは、調節カセットリボスイッチ内に含有されるアプタマーに結合する特異的リガンドの非存在下では「オフ状態」である。アプタマー特異的リガンドが投与された(又は投与なしでも十分な量で存在する)場合のみ、標的遺伝子発現が活性化される又は増大する。
ポリヌクレオチドカセットを伴う標的遺伝子を含有するベクター構築物の送達、及び活性化リガンドの送達は一般的に、時間が離れている。活性化リガンドの送達は、標的遺伝子がいつ発現されるか、及びタンパク質発現レベルを制御する。リガンドは、非限定的に、経口、筋内(IM:intramuscular)、静脈内(IV:intravenous)、眼内又は局所を含むいくつかの経路によって送達され得る。
リガンドの送達のタイミングは、標的遺伝子の活性化についての要求に依存する。例えば、標的遺伝子によってコードされる治療用タンパク質が定常的に必要とされる場合、経口小分子リガンドを、毎日又は1日多数回送達して、標的遺伝子の連続的活性化、及びしたがって治療用タンパク質の連続的発現を確実にしてもよい。標的遺伝子が長期作用効果を有する場合、誘導リガンドは、より少ない頻度で投薬され得る。
本発明は、調節ポリヌクレオチドカセットのリボスイッチ内のアプタマーに特異的なリガンドの一時的投薬によって決定される様式で、治療用トランスジーンの発現が一時的に制御されることを可能にする。リガンド投与時のみの治療用トランスジーンの発現の増大は、標的遺伝子がリガンドの非存在下ではオフになることを可能にすることによって、遺伝子療法治療の安全性を増大する。
様々なリガンドが標的遺伝子を活性化することを可能にするために、様々なアプタマーを使用することができる。本発明のある特定の実施形態においては、調節カセットを含有する各治療用遺伝子は、カセット内に特定の小分子によって活性化される特異的アプタマーを有する。このことは、各治療用遺伝子は、その中に収容されているアプタマーに特異的なリガンドによってのみ活性化することができることを意味する。これらの実施形態においては、各リガンドは、1つの治療用遺伝子のみを活性化する。このことは、いくつかの異なる「標的遺伝子」を1つの個体に送達することができ、各々が各標的遺伝子内に収容されている調節カセット内に含有されるアプタマーに特異的なリガンドの送達に際して活性化される可能性が得られる。
本発明は、任意の治療用タンパク質(例えばエリスロポエチン(EPO)又は治療用抗体)が、その遺伝子が身体に送達され得ると、活性化リガンドが送達された場合に身体によって生成されることを可能にする。この治療用タンパク質送達方法は、体外でそのような治療用タンパク質、例えばがんにおいて使用されるか、又は炎症性疾患若しくは自己免疫疾患を遮断するための抗体を製造し、その後それを注射又は点滴することを置換し得る。調節される標的遺伝子を含有する身体は、遺伝子特異的リガンドが投与された場合にオンになる、生物製剤製造工場になる。
治療用タンパク質の投薬の投薬レベル及びタイミングは、治療効果にとって重要であり得る。例えば、がんのためのAVASTIN(抗VEGF抗体)の送達において。本発明は、治療用タンパク質レベル及び効果についてのモニタリングに応答して投薬の容易さを増大する。
一実施形態においては、標的遺伝子は、特定のDNA配列をターゲティングし、編集し得るヌクレアーゼをコードし得る。そのようなヌクレアーゼとして、Cas9、ヌクレアーゼを含有する亜鉛フィンガー又はTALENが挙げられる。これらのヌクレアーゼの場合、ヌクレアーゼタンパク質は、標的内因性遺伝子を編集するのに十分な短期間の間のみ必要とされ得る。しかしながら、非調節ヌクレアーゼ遺伝子が身体に送達された場合、このタンパク質は、細胞の残りの寿命の間存在し得る。ヌクレアーゼの場合、ヌクレアーゼが存在するのが長ければ長いほど、オフターゲット編集のリスクが増大する。そのようなタンパク質の発現の調節は、顕著な安全性利益を有する。この場合、調節カセットを含有するヌクレアーゼ標的遺伝子を含有するベクターを、体内の適切な細胞に送達し得る。標的遺伝子は、カセット特異的リガンドの非存在下では「オフ」状態であり、そのため、ヌクレアーゼは生成しない。活性化リガンドが投与された場合のみ、ヌクレアーゼが生成する。十分な編集が起こることを可能にするのに十分な時間が経過したとき、リガンドを回収し、再び投与しない。このようにして、ヌクレアーゼ遺伝子は、その後「オフ」状態になり、更なるヌクレアーゼは生成せず、編集は停止する。このアプローチは、いくつかの遺伝性網膜症、例えばCEP290における変異によって引き起こされるLCA10、及びABCA4における変異によって引き起こされるシュタルガルト病を含む、遺伝子状態を修正するために使用され得る。
特異的リガンド投与に際してのみ活性化される治療用タンパク質をコードする調節される標的遺伝子の投与は、治療用遺伝子を調節して、多くの様々な種類の疾患を治療するために使用してもよく、例えば治療用抗体でのがん、免疫調節タンパク質若しくは抗体での免疫障害、調節される遺伝子としての抗C5抗体若しくは抗体断片での代謝疾患、PNH等の奇病、又は治療用抗体での眼球血管新生、及び免疫調節タンパク質での乾燥AMDがある。
多種多様な特異的疾患及び状態の治療を可能にする、多種多様な特異的標的遺伝子は、本発明における使用のために好適である。例えば、インスリン又はインスリンアナログ(好ましくはヒトインスリン又はヒトインスリンのアナログ)は、I型糖尿病、II型糖尿病又は代謝症候群を治療するための標的遺伝子として使用してもよく;ヒト成長ホルモンは、成長障害を有する小児又は成長ホルモンが不足している成人を治療するための標的遺伝子として使用してもよく;エリスロポエチン(好ましくはヒトエリスロポエチン)は、慢性腎疾患のための貧血、骨髄形成異常症のための貧血又はがん化学療法のための貧血を治療するための標的遺伝子として使用してもよい。
本発明は、単一の遺伝子欠損によって引き起こされる疾患、例えば嚢胞性線維症、血友病、筋ジストロフィー、地中海貧血症又は鎌状赤血球貧血症を治療するためにとりわけ好適であり得る。したがって、ヒトβ-、γ-、δ-又はζ-グロブリンは、β-地中海貧血症又は鎌状赤血球貧血症を治療するための標的遺伝子として使用してもよく;ヒト第VIII因子又は第IX因子は、血友病A又は血友病Bを治療するための標的遺伝子として使用してもよい。
本発明において使用されるリガンドは一般的に、1つ又は複数の薬学的に許容される担体と組み合わせて、患者への投与に好適な医薬組成物を形成する。薬学的に許容される担体として、医薬分野で一般的に使用される溶媒、結合剤、希釈剤、崩壊剤、潤滑剤、分散媒体、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤等が挙げられる。医薬組成物は、錠剤、ピル、カプセル、トローチ等の形態であってもよく、それらの意図される投与経路と適合するように配合される。投与経路の例として、非経口、例えば静脈内、皮内、鼻内、皮下、経口、吸入、経皮(局所)、経粘膜及び直腸が挙げられる。
リガンドを含む医薬組成物は、標的遺伝子を望ましく調節するのに十分なリガンドの量が患者に送達されるような投薬スケジュールで患者に投与される。リガンドが小分子であり、投与形態が錠剤、カプセル等である場合、好ましくは、医薬組成物は、0.1mg～10gのリガンド;0.5mg～5gのリガンド;1mg～1gのリガンド;2mg～750mgのリガンド;5mg～500mgのリガンド;又は10mg～250mgのリガンドを含む。
医薬組成物は、1日当たり1回又は1日当たり多数回(例えば1日当たり2、3、4、5回又はそれよりも多く)投薬してもよい。或いは、医薬組成物は、1日当たり1回よりも少ない頻度で、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13若しくは14日毎に1回、又は1カ月に1回若しくは数カ月毎に1回投薬してもよい。本発明の一部の実施形態においては、医薬組成物は、少数回のみ、例えば1、2、3回等、患者に投与してもよい。
本発明は、標的遺伝子によってコードされる治療用タンパク質の発現の調節の必要のある患者を治療する方法を提供する。本方法は、アプタマーのためのリガンドを含む医薬組成物を患者に投与する工程であって、患者が、以前に標的遺伝子を含む組換えベクターを投与されており、標的遺伝子が、1つ又は複数のポリアデニル化シグナルのアクセシビリティを通してアプタマーのリガンドによって標的遺伝子の発現を調節する能力を提供する、本発明の遺伝子調節カセットを含有する、工程を含む。リガンドの投与は、治療用タンパク質の発現を増大する。
製造物品及びキット
また、本明細書において説明する方法における使用のためのキット又は製造物品が提供される。態様においては、キットは、好適な包装中に(例えば遺伝子調節カセットを含有する標的遺伝子を含むベクターの送達のための組成物について)本明細書において説明する組成物を含む。本明細書において説明する(眼科注射用組成物等の)組成物に好適な包装は、本分野において公知であり、例えばバイアル(例えば密閉バイアル)、容器、アンプル、瓶、ジャー、フレキシブルな包装(例えば密閉マイラ又はプラスチック袋)等を含む。これらの製造物品は、更に滅菌及び/又は密閉してもよい。
また、本明細書において説明する方法における使用のためのキット又は製造物品が提供される。態様においては、キットは、好適な包装中に(例えば遺伝子調節カセットを含有する標的遺伝子を含むベクターの送達のための組成物について)本明細書において説明する組成物を含む。本明細書において説明する(眼科注射用組成物等の)組成物に好適な包装は、本分野において公知であり、例えばバイアル(例えば密閉バイアル)、容器、アンプル、瓶、ジャー、フレキシブルな包装(例えば密閉マイラ又はプラスチック袋)等を含む。これらの製造物品は、更に滅菌及び/又は密閉してもよい。
また、本発明は、本明細書において説明する組成物を含むキットを提供し、本明細書において説明する使用等の組成物を使用する方法についての教示を更に含み得る。本明細書において説明するキットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ及び例えば本明細書において説明する任意の方法を含む投与を行うための教示を有する包装インサートを含む、商業的観点及びユーザーの立場から望ましい他の材料を更に含んでもよい。例えば、一部の実施形態においては、キットは、本発明の遺伝子調節カセットを含む標的遺伝子の発現のためのrAAV、注射に好適な薬学的に許容される担体、並びに緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ及び注射を行うための教示を有する包装インサートのうちの1つ又は複数を含む。一部の実施形態においては、キットは、眼内注射、筋内注射、静脈内注射等に好適である。
「ホモロジー」及び「相同の」は、本明細書において使用するとき、2つのポリヌクレオチド配列間又は2つのポリペプチド配列間の同一性の百分率を指す。1つの配列の別の配列に対する対応は、本分野において公知の技術によって決定することができる。例えば、ホモロジーは、配列情報を整列し、容易に入手可能なコンピュータプログラムを使用することによる、2つのポリペプチド分子の直接比較によって決定することができる。2つのポリヌクレオチド又は2つのポリペプチド配列は、適切な挿入又は欠失を伴って最適に整列した後、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%のヌクレオチド又はアミノ酸がそれぞれ、上記の方法を使用して決定される通り、定義された分子の長さにわたり適合する場合、互いに「実質的に相同」である。
参照ポリペプチド又は核酸配列についての「配列同一性パーセント」は、配列を整列し、必要に応じてギャップを導入して最大配列同一性パーセントを達成した後の、参照ポリペプチド又は核酸配列におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドと同一の、候補配列におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドの割合として定義される。アミノ酸又は核酸配列同一性パーセントを決定する目的のための整列は、当業者に公知の方法で、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR社)ソフトウェアを含む公に入手可能なコンピュータソフトウェアプログラムを使用して達成することができる。
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、本明細書において使用するとき、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語は、一本鎖、二本鎖若しくは多数鎖DNA若しくはRNA、ゲノムDNA、cDNA、DNA-RNAハイブリッド、若しくはプリン及びピリミジン塩基を含むポリマー、又は他の天然ヌクレオチド塩基、化学若しくは生化学修飾ヌクレオチド塩基、非天然ヌクレオチド塩基若しくは誘導ヌクレオチド塩基を含むが、これらに限定されない。
「異種の」又は「外因性の」は、あるものが比較されるか、又はそれが導入されるか、若しくは組み込まれる実体の残りのそれとは遺伝子型として別個の実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学技術によって異なる細胞種に導入されたポリヌクレオチドは、異種のポリヌクレオチドである(そして、発現すると、異種のポリペプチドをコードし得る)。同様に、ウイルスベクターに組み込まれた細胞配列(例えば遺伝子又はその部分)は、ベクターについて異種のヌクレオチド配列である。
本明細書において開示する本発明の原理における変形は、当業者によって行うことができると理解及び予測されるべきであり、そのような改変は本発明の範囲内に含まれるべきであると意図される。以下の実施例は、本発明を更に例示するが、いかなるようにも本発明の範囲を限定するとは解釈されるべきではない。本明細書において引用するすべての参考文献は、それら全体を参照により本明細書に組み込む。
(実施例1)
アプタマーが媒介する、ポリAシグナルエレメントAATAAAのアクセシビリティの調整による標的遺伝子発現の調節
実験手技:
プラスミド構築物:pEGFP-C1ベクター(Clontech社)中のEGFP遺伝子を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子コード配列で置換して、SV40 earlyポリアデニル化シグナル配列を含有するpFLuc-SV40ベクターを産生した。xpt-グアニンアプタマー、エフェクターステムループ構造及びSV40 earlyポリA配列についての配列を含有するDNAセグメントを合成した(IDT社)。合成したDNA断片を、HpaI及びMluI制限酵素で消化し、HpaI及びMluIで消化したpFLuc-SV40にクローニングした。構築物の配列を、DNAシークエンシング(Genewiz社)によって評価した。
アプタマーが媒介する、ポリAシグナルエレメントAATAAAのアクセシビリティの調整による標的遺伝子発現の調節
実験手技:
プラスミド構築物:pEGFP-C1ベクター(Clontech社)中のEGFP遺伝子を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子コード配列で置換して、SV40 earlyポリアデニル化シグナル配列を含有するpFLuc-SV40ベクターを産生した。xpt-グアニンアプタマー、エフェクターステムループ構造及びSV40 earlyポリA配列についての配列を含有するDNAセグメントを合成した(IDT社)。合成したDNA断片を、HpaI及びMluI制限酵素で消化し、HpaI及びMluIで消化したpFLuc-SV40にクローニングした。構築物の配列を、DNAシークエンシング(Genewiz社)によって評価した。
トランスフェクション及びアプタマーリガンド処理:3.5×104個のHEK293細胞を、トランスフェクション前日に96ウェル平底プレートに播種した。プラスミドDNA(500ng)を、管又は96ウェルU底プレートに添加した。別々に、TransIT-293試薬(Mirus社;1.4μl)を50μlのopti-mem I培地(Life Technologies社)に添加し、室温(「RT(room temperature)」)で5分間静置した。その後、50μlのこの希釈したトランスフェクション試薬をDNAに添加し、混合し、RTで20分間インキュベートした。最後に、7μlのこの溶液を、96ウェルプレート中の細胞のウェルに添加した。トランスフェクションの4時間後、培地を吸引し、(i)DMSO(0.5%)若しくは500μMグアノシン;又は(ii)溶媒対照としてのNaOH(2mM)若しくは500μMグアニンを含む新しい培地を添加した。誘導倍率を、アプタマーリガンドの存在下で得たルシフェラーゼ活性を、アプタマーリガンドの非存在下で得た値で割った商として表した。
培養細胞のホタルルシフェラーゼアッセイ:培地交換の24時間後、プレートをインキュベーターから除去し、ラボの作業台上でRTまで数分間平衡化し、その後吸引した。Glo-溶解緩衝液(Promega社、100μL、RT)を添加し、プレートをRTで少なくとも5分間置いた。その後、ウェル内容物を50μLの摩砕剤によって混合し、20μLの各試料を、glo-溶解緩衝液中で10%に希釈した20μLのbright-glo試薬(Promega社)と混合した。96ウェルを、不透明白色384ウェルプレート上に間隔をあけて配置した。RTでの5分のインキュベーション後、Tecan機を使用して500ミリ秒の読取り時間により発光を測定した。ルシフェラーゼ活性を、相対光ユニット(RLU:relative light unit)平均値±S.D.として表した。
トランスフェクション及びGFP蛍光の測定:3.5×104個のHEK293細胞を、トランスフェクション前日に96ウェル平底プレートに播種した。プラスミドDNA(500ng)を、管又は96ウェルU底プレートに添加した。別々に、TransIT-293試薬(Mirus社;1.4μL)を50μLのOpti-mem I培地(Life Technologies社)に添加し、RTで5分間静置した。その後、50μLのこの希釈したトランスフェクション試薬をDNAに添加し、混合し、RTで20分間インキュベートした。最後に、7μLのこの溶液を、96ウェルプレート中の細胞のウェルに添加した。GFP蛍光強度を、Tecanプレートリーダーによって484nmの励起波長、510nmの発光波長及び5nmの励起帯域幅を使用して測定した。GFP蛍光強度を、GFP構築物が産生した値からトランスフェクションなしの細胞が産生した値を引いた値として表した。
結果:
mRNAの3'末端のポリアデニル化されたテールは、mRNA安定性、核外移行及び翻訳効率において重要な役割を果たす。pre-mRNAポリアデニル化のプロセスを調節し、それによって標的遺伝子発現を調節するために、ポリアデニル化配列エレメントAATAAA(又はその近いバリアント)又はT若しくはGTリッチ下流配列エレメント(DSE)のアクセシビリティを調整する戦略を開発した。
mRNAの3'末端のポリアデニル化されたテールは、mRNA安定性、核外移行及び翻訳効率において重要な役割を果たす。pre-mRNAポリアデニル化のプロセスを調節し、それによって標的遺伝子発現を調節するために、ポリアデニル化配列エレメントAATAAA(又はその近いバリアント)又はT若しくはGTリッチ下流配列エレメント(DSE)のアクセシビリティを調整する戦略を開発した。
1つの戦略(戦略1)においては、図1a及び図1bのステムループ構造(エフェクターステムループ)において例示する通り、AATAAAポリアデニル化シグナル配列エレメントは、ステムループ形成構造(エフェクターステムループ)のステム内に埋め込まれている。アプタマーの3'末端は、5'アプタマーステムの一部に相補的、且つエフェクターステムループの3'ステムアームの一部に相補的な配列を含有する、共有されるステムアームによって、このステムループ形成構造の5'末端に連結した(例えば図1a及び図1bを参照のこと)。この配置においては、アプタマーリガンドの非存在下では、ステムループ構造は、AATAAAエレメントを隔離し、それによってポリアデニル化及び遺伝子発現を抑制する。しかしながら、アプタマーリガンドの存在下では、アプタマー/リガンド結合は、アプタマーP1ステムの形成をもたらし、それによってステムループ構造を破壊し、これはAATAAAエレメントの隔離からの解放及び後続の遺伝子発現をもたらす。したがって、この遺伝子エレメントの配置は、アプタマーリガンド応答性オンリボスイッチを創出する。
SV40 earlyポリA配列を伴うxpt-グアニンアプタマーを使用して、この戦略を試験し、SV40の3'UTRのAATAAAエレメントの上流の配列が、ポリアデニル化に不可欠であることが示された。この戦略を使用して、4つの構築物、ATA_Gua_1～4(配列番号1～4)を産生し、各々は、ステムループ構造の5'末端に連結した同じxpt-グアニンアプタマー配列、及びステムループ構造のステム内に埋め込まれたAATAAA配列エレメントを有した。私たちは、ステムループ構造のステムについての長さ及び配列組成は、ステムループ構造の安定性、したがって遺伝子発現のための隔離されたAATAAAエレメントの使用可能性に影響を及ぼし得ると考えた。それゆえ、構築物の各々において、それぞれ、9、10、12及び14塩基対(bp)ステムを創出した。アプタマーP1ステムは、8bpであった。図1cにおいて示す通り、アプタマーリガンドグアノシンの非存在下では、すべての構築物からのルシフェラーゼ活性は、ほぼ同様であり、対照構築物pFLuc-SV40(データ示さず)より低く、AATAAAエレメントは、ステムループ構造によって隔離されていることを示した。グアノシン処理に際して、各構築物は、DMSO処理(対照)試料と比較して高いルシフェラーゼ活性を示し、ATA_Gua_1は、6.7倍の誘導を生じた。
アプタマーリガンドとしてグアニンを使用して、これらの構築物を更に試験した。図1dにおいて示す通り、グアニン処理の非存在下では、構築物ATA_Gua_1～4の基礎レベル発現は低減し、ATA_Gua_4は、最も低い基礎発現(pFLuc対照ベクターの16%)を有した。グアニン処理に際して、ルシフェラーゼ発現は、グアニンなしの試料と比較して向上し、すべての構築物について約2.5倍の誘導を生じた。
また、これらのリボスイッチ構築物(戦略1)を使用して、GFP発現を調節した。ルシフェラーゼ遺伝子の比較的低い基礎レベル発現を有する(図1c、図1d)ATA_Gua_2及び4構築物を使用して、pEGFP_ATA_Gua_2及び4構築物を産生した。図1eにおいて示す通り、グアニン処理の非存在下では、pEGFP-C1構築物と比較した場合、GFP発現は減少する。グアニン処理は、(ATA_Gua_2及びATA_Gua_4構築物について、それぞれ)GFP発現の1.5及び1.6倍増大を生成した。しかしながら、対照構築物は、グアニン処理に応答したGFP発現の増大を有しなかった。
このデータは、リガンド応答性哺乳動物オンリボスイッチは、隣接するアプタマーを介してステムループ構造のポリアデニル化シグナル配列エレメントのアクセシビリティを調整することによる標的遺伝子発現の調節で有効であることを示す。アプタマーP1ステム及びエフェクターステムループ構造のステムの長さ及び配列を最適化することを通して、基礎発現レベルを低下させること、及び構築物の標的遺伝子発現の誘導を増大することによって、誘導倍率は改善することができる。この試験した遺伝子エレメントの配置においては、グアニンアプタマー及びSV40 earlyポリA配列を利用した。同様の戦略を使用して、合成ポリA配列を含む様々なポリA配列を調整することにおいて、様々なアプタマーを使用するリボスイッチを産生することができる。
(実施例2)
下流配列エレメントのアクセシビリティを介した、アプタマー/リガンドが媒介するポリアデニル化による標的遺伝子発現の調整
実験手技:
実施例1において説明する通り。
下流配列エレメントのアクセシビリティを介した、アプタマー/リガンドが媒介するポリアデニル化による標的遺伝子発現の調整
実験手技:
実施例1において説明する通り。
結果:
T又はGTリッチ下流配列エレメント(DSE)のアクセシビリティを調整することを通してポリアデニル化を調整するために、別の戦略(戦略2)を開発した。この戦略においては、図2aにおいて例示する通り、DSE配列がステムループ構造のステム内に埋め込まれている、ステムループ構造を創出した。アプタマー配列を、ステムループ構造の3'アームの相補配列が後に続くこのステムループ構造の3'末端に連結した。この配置においては、アプタマーリガンドの非存在下では、ステムループ構造はDSE配列を隔離し、ポリアデニル化を阻害し、それによって遺伝子発現を抑制する。しかしながら、アプタマーリガンドの存在下では、アプタマー/リガンド結合は、アプタマーP1ステムの形成をもたらし、エフェクターステムループ構造を破壊し、DSE配列を隔離から解放し、遺伝子発現を可能にする。したがって、実施例1において示す戦略と同様に、この遺伝子エレメントの配置は、アプタマーリガンド応答性オンリボスイッチを創出する。
T又はGTリッチ下流配列エレメント(DSE)のアクセシビリティを調整することを通してポリアデニル化を調整するために、別の戦略(戦略2)を開発した。この戦略においては、図2aにおいて例示する通り、DSE配列がステムループ構造のステム内に埋め込まれている、ステムループ構造を創出した。アプタマー配列を、ステムループ構造の3'アームの相補配列が後に続くこのステムループ構造の3'末端に連結した。この配置においては、アプタマーリガンドの非存在下では、ステムループ構造はDSE配列を隔離し、ポリアデニル化を阻害し、それによって遺伝子発現を抑制する。しかしながら、アプタマーリガンドの存在下では、アプタマー/リガンド結合は、アプタマーP1ステムの形成をもたらし、エフェクターステムループ構造を破壊し、DSE配列を隔離から解放し、遺伝子発現を可能にする。したがって、実施例1において示す戦略と同様に、この遺伝子エレメントの配置は、アプタマーリガンド応答性オンリボスイッチを創出する。
SV40 earlyポリA配列を伴うxpt-グアニンアプタマーを使用して、この戦略を試験し、DSE配列が、SV40の3'UTRのAATAAAエレメントと共に、pre-mRNAポリアデニル化についての役割を有することが示された。この戦略を使用して、4つの構築物DSE_Gua_1～4(配列番号5～8)を産生し、各々は、ステムループ構造の3'末端に連結した同じxpt-グアニンアプタマー配列、及びステムループ構造のステム内に埋め込まれたDSE配列を有した。私たちは、ステムループ構造のステムについての長さ及び配列組成は、ステムループ構造の安定性、したがって遺伝子発現のための隔離されたDSE配列の使用可能性に影響を及ぼし得ると考えた。それゆえ、これらの構築物の各々において、それぞれ、9、10、12及び14塩基対(bp)ステムを創出した。8bp又は9bpのアプタマーP1ステムを、これらの構築物において利用した。図2bにおいて示す通り、アプタマーリガンドグアノシンの非存在下では、構築物DSE_Gua_1～3からのルシフェラーゼ活性は、ほぼ同様であり、DSE_Gua_4が最も低く、対照構築物pFLuc-SV40(データ示さず)より低く、DSEエレメントは、アプタマーリガンドの非存在下ではステムループ構造によって隔離されていることを示した。一方で、グアノシン処理に際して、各構築物は、DMSO処理試料と比較した場合、高いルシフェラーゼ活性を示し、例えばDSE_Gua_2は、3.7倍の誘導を生じた。
また、アプタマーリガンドとしてグアニンを使用して、これらの構築物を試験した。図2cにおいて示す通り、グアニン処理の非存在下では、ルシフェラーゼ活性は、対照構築物pFLucと比較した場合、構築物DSE_Gua_1～3について約68%、及び構築物DSE_Gua_4について80%まで減少した。グアニンの存在下では、ルシフェラーゼ発現は、グアニン処理なしの試料と比較した場合、すべての構築物について約2.4倍増大した。ステムループ構造のステム、及びアプタマーP1ステムの長さ及び配列を最適化することを通して、基礎レベル発現を低下させること、及び構築物の遺伝子発現の誘導を増大することによって、誘導倍率は更に改善することができる。これらのデータは、アプタマーを介してポリアデニル化配列エレメントのアクセシビリティを調整することを通して遺伝子発現を調節する、アプタマーリガンド応答性哺乳動物オンリボスイッチの創出を更に示す。この試験した遺伝子エレメントの配置においては、グアニンアプタマー及びSV40 earlyポリA配列を使用した。同様の戦略を使用して、合成ポリA配列を含む様々なポリA配列を調整することにおいて、様々なアプタマーを含有するリボスイッチを産生することができる。
(実施例3)
3'UTRの合成ポリA配列エレメントのアクセシビリティを調整するためのグアニンアプタマーの使用
実験手技:
プラスミド構築:合成ポリA(SPA)(参照により本明細書に組み込むLevitt, N.ら、Definition of an efficient synthetic poly(A) site、Genes & Development. 1989;3:1019～1025頁)若しくは本明細書でmtSPAと命名したpGLuc-Basic_2(NEB社)からのSPA、又はxpt-グアニンアプタマー、ステムループ構造及び合成ポリA配列についての配列を含有するDNA断片を合成した(IDT社)。合成したDNA断片を、XhoI及びNheI制限酵素で消化し、XhoI及びXbaIで消化したCon8構築物にクローニングして、Con8-SPA(配列番号9)、SPA_ATA_Gua(配列番号10)、SPA_DSE_Gua(配列番号11)、mtCon8-SPA(配列番号12)及びmtSPA_ATA_Gua(配列番号13)を産生した。構築物の配列を、DNAシークエンシング(Genewiz社)によって評価した。
3'UTRの合成ポリA配列エレメントのアクセシビリティを調整するためのグアニンアプタマーの使用
実験手技:
プラスミド構築:合成ポリA(SPA)(参照により本明細書に組み込むLevitt, N.ら、Definition of an efficient synthetic poly(A) site、Genes & Development. 1989;3:1019～1025頁)若しくは本明細書でmtSPAと命名したpGLuc-Basic_2(NEB社)からのSPA、又はxpt-グアニンアプタマー、ステムループ構造及び合成ポリA配列についての配列を含有するDNA断片を合成した(IDT社)。合成したDNA断片を、XhoI及びNheI制限酵素で消化し、XhoI及びXbaIで消化したCon8構築物にクローニングして、Con8-SPA(配列番号9)、SPA_ATA_Gua(配列番号10)、SPA_DSE_Gua(配列番号11)、mtCon8-SPA(配列番号12)及びmtSPA_ATA_Gua(配列番号13)を産生した。構築物の配列を、DNAシークエンシング(Genewiz社)によって評価した。
培養細胞のトランスフェクション、アプタマーリガンド処理及びルシフェラーゼアッセイ:実施例1に説明する通り。
結果:
アプタマーが媒介する、SV40ポリA配列のアクセシビリティの調整を介した標的遺伝子発現の調節を、実施例1及び2において示す。また、アプタマー調整ポリアデニル化を、合成ポリA配列(SPA)を使用して試験した。実施例1において示すのと同じ戦略を使用して、ステムループ構造の5'末端に連結したxpt-グアニンアプタマー配列、及びステムループ構造のステム内に埋め込まれた合成ポリA配列のAATAAA配列エレメントを有する、構築物SPA_ATA_Guaを産生した。また、構築物SPA_DSE_Guaを、実施例2において示すのと同じ戦略を使用して産生した。図3において示す通り、グアニン処理の非存在下では、ステムループ構造とxpt-グアニンアプタマーとの連結は、SPA_ATA_Gua構築物においてルシフェラーゼ活性の低減をもたらさず、合成ポリA配列のAATAAA配列エレメントのステムループにおける非効率的な隔離を示唆した。これに取り組むために、Con8-SPAと比較した場合、2ntの相違を有するが、同様の機能性を示す、別のSPA配列(mtSPA)を使用した。ステムを強化するために、2GC塩基対をステムに付加し、ポリA配列の7nt及びその相補配列と共に、9bpステムを産生した。このmtSPA_ATA_Gua構築物で、ルシフェラーゼ活性の基礎レベル発現は、グアニン処理の非存在下でmtCon8-SPAと比較した場合、減少した。一方で、グアニン処理の存在下では、ルシフェラーゼ活性は、グアニン処理なしの試料と比較した場合、1.7倍までわずかにアップレギュレートされた。構築物SPA_DSE_Guaで、xpt-グアニンアプタマー配列は、ステムループ構造の3'末端に連結され、DSE配列は、ステムループ構造のステム内に埋め込まれていた。図3において示す通り、グアニン処理は、グアニン処理なしの試料と比較した場合、1.9倍までSPA_DSE_Gua構築物のルシフェラーゼ活性をアップレギュレートした。これらの結果は、ポリA配列エレメントのアクセシビリティを調整することによって、標的遺伝子発現の調節が可能になることを示す。
アプタマーが媒介する、SV40ポリA配列のアクセシビリティの調整を介した標的遺伝子発現の調節を、実施例1及び2において示す。また、アプタマー調整ポリアデニル化を、合成ポリA配列(SPA)を使用して試験した。実施例1において示すのと同じ戦略を使用して、ステムループ構造の5'末端に連結したxpt-グアニンアプタマー配列、及びステムループ構造のステム内に埋め込まれた合成ポリA配列のAATAAA配列エレメントを有する、構築物SPA_ATA_Guaを産生した。また、構築物SPA_DSE_Guaを、実施例2において示すのと同じ戦略を使用して産生した。図3において示す通り、グアニン処理の非存在下では、ステムループ構造とxpt-グアニンアプタマーとの連結は、SPA_ATA_Gua構築物においてルシフェラーゼ活性の低減をもたらさず、合成ポリA配列のAATAAA配列エレメントのステムループにおける非効率的な隔離を示唆した。これに取り組むために、Con8-SPAと比較した場合、2ntの相違を有するが、同様の機能性を示す、別のSPA配列(mtSPA)を使用した。ステムを強化するために、2GC塩基対をステムに付加し、ポリA配列の7nt及びその相補配列と共に、9bpステムを産生した。このmtSPA_ATA_Gua構築物で、ルシフェラーゼ活性の基礎レベル発現は、グアニン処理の非存在下でmtCon8-SPAと比較した場合、減少した。一方で、グアニン処理の存在下では、ルシフェラーゼ活性は、グアニン処理なしの試料と比較した場合、1.7倍までわずかにアップレギュレートされた。構築物SPA_DSE_Guaで、xpt-グアニンアプタマー配列は、ステムループ構造の3'末端に連結され、DSE配列は、ステムループ構造のステム内に埋め込まれていた。図3において示す通り、グアニン処理は、グアニン処理なしの試料と比較した場合、1.9倍までSPA_DSE_Gua構築物のルシフェラーゼ活性をアップレギュレートした。これらの結果は、ポリA配列エレメントのアクセシビリティを調整することによって、標的遺伝子発現の調節が可能になることを示す。
(実施例4)
ポリAに基づくリボスイッチの調節可能性を向上させるためにステムループ構造のループ配列を調整すること
実験手技:
実施例1において説明する通り。
ポリAに基づくリボスイッチの調節可能性を向上させるためにステムループ構造のループ配列を調整すること
実験手技:
実施例1において説明する通り。
結果:
実施例1及び2におけるポリA配列に連結したアプタマー及びステムループ構造を有するすべての構築物で、ルシフェラーゼの基礎レベル発現は、対照ベクターの20～45%まで低減する。標的遺伝子発現の誘導されるレベルは、最大で対照構築物の80%に達するが、基礎レベル発現のために、誘導倍率は、より低くなる。基礎発現を低減するために、ステムループ構造を強化又は安定化して、アプタマー/リガンド結合の非存在下でAATAAA又はDSE配列エレメントを有効に隔離又は遮断することができる。ステムループ構造の安定性を強化するために、ルシフェラーゼ遺伝子の基礎レベル発現に対するステムループ構造のループの配列組成の効果を試験した。ATA_Gua_1のGAAAループ配列を、より安定なループ配列TTCG(V.P. Antao、S. Y. Lai及びI. Tinoco、A thermodynamic study of unusually stable RNA and DNA hairpins. Nucleic Acids Research. 1991;19(21):5901～5905頁)で置換し、構築物Stbl_ATA_Gua_1(配列番号14)を産生した。図4において示す通り、ATA_Gua_1と比較して、Stbl_ATA_Gua_1は、グアニン処理の非存在下でより低いルシフェラーゼ活性を発現し、AATAAAシグナルの隔離の改善を示唆した。一方で、グアニン処理の存在下では、Stbl_ATA_Gua_1について誘導されたルシフェラーゼ活性は、ATA_Gua_1と同様であり、したがってより高い誘導倍率を生じた。対照的に、GAATループを含有する構築物であるgaat_ATA_Gua_1(配列番号15)は、ATA_Gua_1又はstbl_ATA_Gua_1より高い基礎レベルルシフェラーゼを発現し、これらの2つの構築物よりわずかに低い誘導倍率を生じた。これらの結果は、より厳格な標的遺伝子調節が、ステムループ構造を改変することを通して達成され得ることを示す。
実施例1及び2におけるポリA配列に連結したアプタマー及びステムループ構造を有するすべての構築物で、ルシフェラーゼの基礎レベル発現は、対照ベクターの20～45%まで低減する。標的遺伝子発現の誘導されるレベルは、最大で対照構築物の80%に達するが、基礎レベル発現のために、誘導倍率は、より低くなる。基礎発現を低減するために、ステムループ構造を強化又は安定化して、アプタマー/リガンド結合の非存在下でAATAAA又はDSE配列エレメントを有効に隔離又は遮断することができる。ステムループ構造の安定性を強化するために、ルシフェラーゼ遺伝子の基礎レベル発現に対するステムループ構造のループの配列組成の効果を試験した。ATA_Gua_1のGAAAループ配列を、より安定なループ配列TTCG(V.P. Antao、S. Y. Lai及びI. Tinoco、A thermodynamic study of unusually stable RNA and DNA hairpins. Nucleic Acids Research. 1991;19(21):5901～5905頁)で置換し、構築物Stbl_ATA_Gua_1(配列番号14)を産生した。図4において示す通り、ATA_Gua_1と比較して、Stbl_ATA_Gua_1は、グアニン処理の非存在下でより低いルシフェラーゼ活性を発現し、AATAAAシグナルの隔離の改善を示唆した。一方で、グアニン処理の存在下では、Stbl_ATA_Gua_1について誘導されたルシフェラーゼ活性は、ATA_Gua_1と同様であり、したがってより高い誘導倍率を生じた。対照的に、GAATループを含有する構築物であるgaat_ATA_Gua_1(配列番号15)は、ATA_Gua_1又はstbl_ATA_Gua_1より高い基礎レベルルシフェラーゼを発現し、これらの2つの構築物よりわずかに低い誘導倍率を生じた。これらの結果は、より厳格な標的遺伝子調節が、ステムループ構造を改変することを通して達成され得ることを示す。
(実施例5)
3'UTRのポリA配列のAATAAA及びDSEの両方のアクセシビリティを同時に調整すること。
実験手技:
ATA_Gua_1及びDSE_Gua_1スイッチを含有する配列を合成し、HpaI及びMluIで消化したpFLucベクターにクローニングして、ATA_DSE_Gua構築物(配列番号16)を産生した。
3'UTRのポリA配列のAATAAA及びDSEの両方のアクセシビリティを同時に調整すること。
実験手技:
ATA_Gua_1及びDSE_Gua_1スイッチを含有する配列を合成し、HpaI及びMluIで消化したpFLucベクターにクローニングして、ATA_DSE_Gua構築物(配列番号16)を産生した。
培養細胞のトランスフェクション及びルシフェラーゼアッセイ:実施例1において説明する通り。
結果:
標的遺伝子発現を調節するための第3の戦略(戦略3)を、図5aにおいて例示する通り、戦略1及び戦略2を組み合わせることによって開発し、それによってAATAAA及びDSE配列の両方のアクセシビリティを同時に調整した。この配置においては、アプタマーリガンドの非存在下では、AATAAA及びDSE配列の両方は、ステムループ構造によって隔離され、それゆえ遺伝子発現は抑制される。各ステムループ構造は、同じ又は異なるリガンド分子に応答し得るアプタマー配列に接続する。本質的なポリA配列エレメントの両方を同時に遮断することは、リガンドの非存在下での遺伝子発現の基礎レベルを低下し得る。アプタマーリガンドの存在下では、アプタマー/リガンド結合は、アプタマーP1ステムの形成を促進し、ステムループ構造を破壊し、AATAAA及びDSE配列の両方を隔離から解放する。この配置においては、遺伝子は、両方のアプタマーのリガンドが存在する場合のみ、効率的に発現することができ、標的遺伝子発現のより厳格な調節を可能にする可能性がある。
標的遺伝子発現を調節するための第3の戦略(戦略3)を、図5aにおいて例示する通り、戦略1及び戦略2を組み合わせることによって開発し、それによってAATAAA及びDSE配列の両方のアクセシビリティを同時に調整した。この配置においては、アプタマーリガンドの非存在下では、AATAAA及びDSE配列の両方は、ステムループ構造によって隔離され、それゆえ遺伝子発現は抑制される。各ステムループ構造は、同じ又は異なるリガンド分子に応答し得るアプタマー配列に接続する。本質的なポリA配列エレメントの両方を同時に遮断することは、リガンドの非存在下での遺伝子発現の基礎レベルを低下し得る。アプタマーリガンドの存在下では、アプタマー/リガンド結合は、アプタマーP1ステムの形成を促進し、ステムループ構造を破壊し、AATAAA及びDSE配列の両方を隔離から解放する。この配置においては、遺伝子は、両方のアプタマーのリガンドが存在する場合のみ、効率的に発現することができ、標的遺伝子発現のより厳格な調節を可能にする可能性がある。
実際に、図5bにおいて示す通り、グアニン処理の非存在下では、ATA_Gua_1及びDSE_Gua_1は、それぞれ、45%及び35%低減した一方で、ステムループ構造を通してAATAAA及びDSE配列の両方を隔離すると(ATA_DSE_Gua)、対照構築物pFLucの20%までルシフェラーゼ発現は更に低減した。グアニン処理の存在下では、非処理試料と比較した場合、ATA_DSE_Gua試料においてルシフェラーゼ活性は約2.1倍回復し、より厳格な遺伝子調節を示した。
(実施例6)
標的遺伝子の調節可能性を向上するためのポリAに基づくリボスイッチと第2のリボスイッチとの組合せ使用
実験手技:
Golden Gateクローニング法を使用して、G15リボスイッチカセット(参照により本明細書に組み込むWO2016/126747の実施例5及び8並びに配列番号46を参照のこと)又はアプタマーを伴わない対照カセットを、pFLucにクローニングして、pFLuc-G15又はpFLuc-Con1を産生した。構築物pFLuc-G15_ATA_Guaを産生するために、グアニンアプタマー、ステムループ構造及びSV40ポリA配列を含有する断片を、HpaI及びMluI消化によってATA_Gua_1構築物から放出し、同じ制限酵素で消化したpFLuc-G15構築物にクローニングした。
標的遺伝子の調節可能性を向上するためのポリAに基づくリボスイッチと第2のリボスイッチとの組合せ使用
実験手技:
Golden Gateクローニング法を使用して、G15リボスイッチカセット(参照により本明細書に組み込むWO2016/126747の実施例5及び8並びに配列番号46を参照のこと)又はアプタマーを伴わない対照カセットを、pFLucにクローニングして、pFLuc-G15又はpFLuc-Con1を産生した。構築物pFLuc-G15_ATA_Guaを産生するために、グアニンアプタマー、ステムループ構造及びSV40ポリA配列を含有する断片を、HpaI及びMluI消化によってATA_Gua_1構築物から放出し、同じ制限酵素で消化したpFLuc-G15構築物にクローニングした。
培養細胞のトランスフェクション及びルシフェラーゼアッセイ:実施例1において説明する通り。
結果:
ATA_Gua及びDSE_Guaリボスイッチを含有する発現構築物は、ある程度の標的遺伝子の基礎発現を有する。これらのスイッチと第2のスイッチとのタンデムの組合せ使用は、基礎発現を制限し、それゆえ遺伝子の調節可能性を向上し得る。
ATA_Gua及びDSE_Guaリボスイッチを含有する発現構築物は、ある程度の標的遺伝子の基礎発現を有する。これらのスイッチと第2のスイッチとのタンデムの組合せ使用は、基礎発現を制限し、それゆえ遺伝子の調節可能性を向上し得る。
これを示すために、G15リボスイッチを、ポリAに基づくリボスイッチと組み合わせた。G15リボスイッチは、xpt-グアニンアプタマーによって調整される選択的スプライシング機構に基づき、一部の基礎レベル発現を有し、それはアプタマーリガンドグアニン処理に応答した誘導倍率を低減する。pFLuc-G15構築物からの基礎レベル発現を低減するために、ポリA配列を、ATA_Gua_1で置換し、pFLuc-G15-ATA_Gua構築物を産生した(図6a)。図6bにおいて示す通り、アプタマーリガンド(グアニン)の非存在下では、pFLuc-G15のルシフェラーゼの基礎レベル発現は、pFLuc-Con1対照構築物と比較した場合、実質的に低減する。二重スイッチを有する構築物であるpFLuc-G15-ATA_Guaは、pFLuc-G15と比較した場合、更に低減した基礎レベル発現を有する。グアニン処理の存在下では、ルシフェラーゼ活性の誘導されるレベルは、pFLuc-G15よりわずかに低いが、ATA_Gua_1構築物からの誘導されるルシフェラーゼ活性と同じであり、ATA_Gua_1及びpFLuc-G15構築物の両方より高い誘導倍率を生じる(図6b)。
これらの結果は、より高い基礎レベル発現を有する2つのスイッチをタンデムに組み合わせることによって、より厳格なスイッチが産生され得ることを示す。この二重スイッチにおけるアプタマーは、本明細書において示す通り、同じ若しくは異なるリガンドに結合する同じ若しくは異なるアプタマー、又は様々なリガンドに応答するアプタマーであり得る。
(実施例7)
3'UTRのポリA配列エレメントAATAAAのアクセシビリティを調整するためのアデニンアプタマーの使用
実験手技:
プラスミド構築:アデニンアプタマーydhl-A(参照により本明細書に組み込むM. Mandal及びR.R. Breaker、Adenine riboswitches and gene activation by disruption of a transcription terminator. Nature Structural & Molecular Biology. 2004;11:29～35頁)、ステムループ構造及びSV40 earlyポリA配列についての配列を含有するDNA断片を合成した(IDT社)。合成したDNA断片を、HpaI及びMluI制限酵素で消化し、HpaI及びMluIで消化したpFLuc-SV40にクローニングした。構築物の配列を、DNAシークエンシング(Genewiz社)によって評価した。
3'UTRのポリA配列エレメントAATAAAのアクセシビリティを調整するためのアデニンアプタマーの使用
実験手技:
プラスミド構築:アデニンアプタマーydhl-A(参照により本明細書に組み込むM. Mandal及びR.R. Breaker、Adenine riboswitches and gene activation by disruption of a transcription terminator. Nature Structural & Molecular Biology. 2004;11:29～35頁)、ステムループ構造及びSV40 earlyポリA配列についての配列を含有するDNA断片を合成した(IDT社)。合成したDNA断片を、HpaI及びMluI制限酵素で消化し、HpaI及びMluIで消化したpFLuc-SV40にクローニングした。構築物の配列を、DNAシークエンシング(Genewiz社)によって評価した。
培養細胞のトランスフェクション及びルシフェラーゼアッセイ:実施例1において説明する通り。
トランスフェクションの4時間後、培地を吸引し、NaOH(1mM)又は1mMアデニン(Calbiochem社)を含む新しい培地を添加した。誘導倍率を、アプタマーリガンドの存在下で得たルシフェラーゼ活性を、アプタマーリガンドの非存在下で得た値で割った商として表した。
結果:
標的遺伝子発現を制御するための追加のアプタマー/リガンド対の使用を研究した。実施例1において示すのと同じ戦略により、AATAAA配列エレメントがSL構造の9bpステム内に埋め込まれているステムループ(SL:stem-loop)構造(安定なTTCGループ)を挿入した。このSL構造の5'末端に、SL構造の5'アームの相補配列及びそれに続くアデニンアプタマーydhl-A配列を、3'UTRにおいて挿入し、構築物ATA_Ydhl(配列番号17)を産生した。この構築物において、ydhlアプタマーP1ステムの長さは、10bpである。図7において示す通り、アデニン処理の非存在下では、ATA_Ydhl構築物は、おそらくAATAAA配列エレメントのアクセシビリティの遮断を通して、対照pFLuc構築物の約52%である低減したレベルのルシフェラーゼを発現した。アデニンの存在下では、ルシフェラーゼ発現は、アデニン処理なしの試料と比較した場合、アデニン処理の存在下での対照pFLuc構築物の約82%まで向上した。アデニン処理は、アプタマー非関連機構を通して対照構築物においてルシフェラーゼ活性を約2.5倍増大した。しかしながら、ATA_ydhl構築物は、ルシフェラーゼ発現の4.0倍増大を生じ、アデニン/アプタマー特異的効果を示した。
標的遺伝子発現を制御するための追加のアプタマー/リガンド対の使用を研究した。実施例1において示すのと同じ戦略により、AATAAA配列エレメントがSL構造の9bpステム内に埋め込まれているステムループ(SL:stem-loop)構造(安定なTTCGループ)を挿入した。このSL構造の5'末端に、SL構造の5'アームの相補配列及びそれに続くアデニンアプタマーydhl-A配列を、3'UTRにおいて挿入し、構築物ATA_Ydhl(配列番号17)を産生した。この構築物において、ydhlアプタマーP1ステムの長さは、10bpである。図7において示す通り、アデニン処理の非存在下では、ATA_Ydhl構築物は、おそらくAATAAA配列エレメントのアクセシビリティの遮断を通して、対照pFLuc構築物の約52%である低減したレベルのルシフェラーゼを発現した。アデニンの存在下では、ルシフェラーゼ発現は、アデニン処理なしの試料と比較した場合、アデニン処理の存在下での対照pFLuc構築物の約82%まで向上した。アデニン処理は、アプタマー非関連機構を通して対照構築物においてルシフェラーゼ活性を約2.5倍増大した。しかしながら、ATA_ydhl構築物は、ルシフェラーゼ発現の4.0倍増大を生じ、アデニン/アプタマー特異的効果を示した。
Claims (34)
- リボスイッチを含む、標的遺伝子の発現の調節のためのポリヌクレオチドカセットであって、リボスイッチが、エフェクターステムループ及びアプタマーを含み、エフェクターステムが、ポリアデニル化配列を含み、アプタマーとエフェクターステムループとが、アプタマーステムの非共有アームに及びエフェクターステムループの非共有アームに相補的な配列を含む択一的に共有されるステムアームによって連結されており、
標的遺伝子の発現が、アプタマーに結合するリガンドの存在下で増大し、
ポリアデニル化配列が、AATAAA又はATTAAA、あるいは下流エレメント(DSE)を含むポリアデニル化シグナルを含む、ポリヌクレオチドカセット。 - アプタマーが、小分子リガンドに結合する、請求項1に記載のポリヌクレオチドカセット。
- アプタマーステムの配列に及びエフェクターステムループの配列に相補的である、択一的に共有されるステムアームの部分が、4～8個のヌクレオチド、5～7個のヌクレオチド、5個のヌクレオチド又は6個のヌクレオチドである、請求項1に記載のポリヌクレオチドカセット。
- アプタマーステムが、6～12塩基対、7～10塩基対、8塩基対又は9塩基対である、請求項1に記載のポリヌクレオチドカセット。
- エフェクターステムループのステムが、4～24塩基対、5～20塩基対、9～14塩基対、9塩基対、10塩基対、11塩基対又は12塩基対である、請求項1に記載のポリヌクレオチドカセット。
- 択一的に共有されるステムアームが、3'アプタマーステムアームのすべて又は一部及びエフェクターステムの5'アームのすべて又は一部を含むように、エフェクターステムループが、アプタマーの3'に位置する、請求項1から5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
- ポリアデニル化配列が、ポリアデニル化シグナルAATAAA又はATTAAAである、請求項6に記載のポリヌクレオチドカセット。
- 択一的に共有されるステムアームが、5'アプタマーステムアームのすべて又は一部及びエフェクターステムの3'アームのすべて又は一部を含むように、エフェクターステムループが、アプタマーの5'に位置する、請求項1から5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
- ポリアデニル化配列が、下流エレメント(DSE)である、請求項8に記載のポリヌクレオチドカセット。
- 第1のリボスイッチのエフェクターステムループが、ポリアデニル化シグナルAATAAA又はATTAAAのすべて又は部分を含み、第2のリボスイッチのエフェクターステムループが、下流エレメント(DSE)のすべて又は部分を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の2つのリボスイッチを含むポリヌクレオチドカセット。
- 2つのリボスイッチ各々が、同じリガンドに結合するアプタマーを含む、請求項10に記載のポリヌクレオチドカセット。
- 2つのリボスイッチが、異なるリガンドに結合する異なるアプタマーを含む、請求項10に記載のポリヌクレオチドカセット。
- 標的遺伝子の発現を調整するin vitro又はex vivo方法であって:
a.1つ又は複数の、請求項1から5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセットを標的遺伝子の3'非翻訳領域に挿入する工程と、
b.ポリヌクレオチドカセットを含む標的遺伝子を細胞に導入する工程と、
c.細胞を、標的遺伝子の発現を増大するのに有効な量で、アプタマーに結合するリガンドに曝露する工程と
を含む方法。 - リガンドが、小分子である、請求項13に記載の方法。
- 択一的に共有されるステムアームが、3'アプタマーステムアームのすべて又は一部及びエフェクターステムの5'アームのすべて又は一部を含むように、エフェクターステムループが、アプタマーの3'に位置する、請求項13に記載の方法。
- ポリアデニル化配列が、ポリアデニル化シグナルAATAAA又はATTAAAである、請求項15に記載の方法。
- 択一的に共有されるステムアームが、5'アプタマーステムアームのすべて又は一部及びエフェクターステムの3'アームのすべて又は一部を含むように、エフェクターステムループが、アプタマーの5'に位置する、請求項13に記載の方法。
- ポリアデニル化配列が、下流エレメント(DSE)である、請求項17に記載のポリヌクレオチドカセット。
- 2つのリボスイッチが、標的遺伝子の3'UTRに挿入され、第1のリボスイッチのエフェクターステムループが、ポリアデニル化シグナルAATAAA又はATTAAAのすべて又は部分を含み、第2のリボスイッチのエフェクターステムループが、下流エレメント(DSE)のすべて又は部分を含む、請求項13又は14に記載の方法。
- 2つのリボスイッチ各々が、同じリガンドに結合するアプタマーを含む、請求項19に記載の方法。
- 2つのリボスイッチが、異なるリガンドに結合する異なるアプタマーを含む、請求項19に記載の方法。
- 2つ又はそれよりも多いポリヌクレオチドカセットが、同じアプタマーを含む、請求項19に記載の方法。
- ポリヌクレオチドカセットを含む標的遺伝子が、標的遺伝子の発現のためのベクターに組み込まれる、請求項13から22のいずれか一項に記載の方法。
- 標的遺伝子が、アプタマーが媒介する選択的スプライシングの調節によって標的遺伝子発現を調整する遺伝子調節カセットを更に含む、請求項13から22のいずれか一項に記載の方法。
- ベクターが、ウイルスベクターである、請求項23に記載の方法。
- ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項25に記載の方法。
- 請求項1から12のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセットを含有する標的遺伝子を含むベクター。
- ウイルスベクターである、請求項27に記載のベクター。
- ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項28に記載のベクター。
- 標的遺伝子が、アプタマーが媒介する選択的スプライシングの調節によって標的遺伝子発現を調整する遺伝子調節カセットを更に含む、請求項27に記載のベクター。
- 請求項1から12のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット又は請求項27から30のいずれか一項に記載のベクターを含む、がん、免疫障害、代謝疾患、眼球血管新生、乾燥AMD、I型糖尿病、II型糖尿病、代謝症候群、成長障害若しくは成長ホルモン不足、慢性腎疾患を原因とする貧血、骨髄形成異常症を原因とする貧血、がん化学療法を原因とする貧血、嚢胞性線維症、血友病、筋ジストロフィー、地中海貧血症、鎌状赤血球貧血症、血友病A又は血友病Bの治療剤。
- 請求項1から12のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット又は請求項27から30のいずれか一項に記載のベクターを含む、標的遺伝子の発現の調節剤。
- 請求項1から12のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット又は請求項27から30のいずれか一項に記載のベクターを含む、医薬。
- 請求項1から12のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット又は請求項27から30のいずれか一項に記載のベクター、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
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