JP7089502B2 - アプタマーのためのハイスループット細胞系スクリーニング - Google Patents
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Description
(a)アプタマーのライブラリを提供することと、
(b)アプタマーのライブラリのメンバーを、レポーター遺伝子の発現であってリガンドが介在する発現のためのポリヌクレオチドカセットに導入してリボスイッチのライブラリを作り出すことと、
(c)リボスイッチのライブラリを真核細胞に導入することと、
(d)該真核細胞をリガンドに接触させることと、
(e)レポーター遺伝子の発現を測定することとを含む、真核細胞にてリガンドと結合するアプタマーを選択する方法を提供し、
その際、ポリヌクレオチドカセットは、5’イントロン及び3’イントロンが隣接する選択的にスプライシングされるエキソンと、(i)3’イントロンの5’スプライス部位を含むステムを含むエフェクター領域及び(ii)アプタマーを含むリボスイッチとを含み、該選択的にスプライシングされるエキソンは、該選択的にスプライシングされるエキソンがレポーター遺伝子のmRNAにスプライシングされる際、レポーター遺伝子とインフレームである終止コドンを含む。
(a)ライブラリにおけるアプタマーが複数の5’及び3’定常領域と1以上の無作為化ヌクレオチドとを含む無作為化アプタマーライブラリを提供すること、
(b)鋳型としての無作為化アプタマーライブラリと5’及び3’定常領域に対して相補的である第1のプライマーと第2のプライマーとを用いた2サイクルPCRを行うこと、
(c)2サイクルPCRの産物を単離すること、及び
(d)固有の5’及び3’定常領域のサブセットに対して相補的な複数のプライマーを用いて2サイクルPCRの単離された産物のサブセットをPCR増幅すること。
(a)遺伝子調節ポリヌクレオチドカセットを含むプラスミドにアプタマーのライブラリを導入してリボスイッチライブラリを作製すること、
(b)細菌(たとえば、E.coli)にリボスイッチライブラリを導入すること、及び
(c)細菌クローンを回収し(たとえば、細菌コロニーを摘み取ることによって)、プラスミドDNAを抽出してリボスイッチのプラスミドサブライブラリ(本明細書では一次サブライブラリと呼ぶ)を得ること。
(a)リガンドのライブラリを提供することと、
(b)レポーター遺伝子の発現であってリガンドが介在する発現のためのポリヌクレオチドカセットを提供することと、
(c)真核細胞にポリヌクレオチドカセットを導入することと、
(d)真核細胞の個々のグループをリガンドのライブラリのメンバーに接触させることと、
(e)レポーター遺伝子の発現を測定することとを含む、真核細胞にてアプタマーと結合するリガンドを選択する方法を提供し、
その際、ポリヌクレオチドカセットは、5’イントロン及び3’イントロンが隣接する選択的にスプライシングされるエキソンと、(i)3’イントロンの5’スプライス部位を含むステムを含むエフェクター領域及び(ii)アプタマーを含むリボスイッチとを含み、選択的にスプライシングされるエキソンは、選択的にスプライシングされるエキソンがレポーター遺伝子のmRNAにスプライシングされる際、レポーター遺伝子とのインフレームである終止コドンを含む。
(a)ライブラリにおけるアプタマーが複数の5’及び3’定常領域と1以上の無作為化ヌクレオチドとを含む無作為化アプタマーライブラリを提供すること、
(b)鋳型としての無作為化アプタマーライブラリと5’及び3’定常領域に対して相補的である第1のプライマーと第2のプライマーとを用いて2サイクルPCRを行うこと、
(c)2サイクルPCRの産物を単離すること、及び
(d)固有の5’及び3’定常領域のサブセットに対して相補的なプライマーを用いて2サイクルPCRの単離された産物のサブセットをPCR増幅すること。
本発明は、真核性の細胞、組織または生物の背景でリガンドに結合するアプタマー、及びアプタマーに結合するリガンドを特定するスクリーニング法を提供する。一態様では、本発明は、以下のステップを含む、真核細胞にてリガンドと結合するアプタマーを選択する方法を提供する:
(a)アプタマーのライブラリを提供すること、
(b)レポーター遺伝子の発現であってリガンドが介在する発現のためのポリヌクレオチドカセットにアプタマーのライブラリのメンバーを導入すること、
(c)真核細胞にアプタマーを含有するポリヌクレオチドカセットを導入すること、
(d)真核細胞をリガンドに接触させること、及び
(e)レポーター遺伝子の発現を測定すること。
(a)リガンドのライブラリを提供すること、
(b)レポーター遺伝子の発現であってリガンドが介在する発現のためのポリヌクレオチドカセットを提供すること、
(c)真核細胞にポリヌクレオチドカセットを導入すること、
(d)真核細胞の個々の基をリガンドのライブラリのメンバーに接触させること、及び
(e)レポーター遺伝子の発現を測定すること。
(a)アプタマーのライブラリを提供すること、
(b)レポーター遺伝子の発現であってリガンドが介在する発現のためのポリヌクレオチドカセットにアプタマーのライブラリのメンバーを導入すること、
(c)アプタマーを含有するポリヌクレオチドカセットを真核細胞に導入すること、及び
(d)レポーター遺伝子の発現を測定すること。
「リボスイッチ」という用語は本明細書で使用されるとき、RNAポリヌクレオチド(またはRNAポリヌクレオチドをコードするDNA)の調節性セグメントを指す。本発明の文脈でのリボスイッチは、リガンド(たとえば、小分子)の存在を検知すること及び選択的エキソンへのスプライシングを変えることに一緒に関与するセンサー領域(たとえば、アプタマー)とエフェクター領域とを含有する。一実施形態では、リボスイッチは、2以上の供給源に由来するポリヌクレオチドを利用する、組換え体である。「合成の」という用語はリボスイッチの文脈にて本明細書で使用されるとき、天然に存在しないリボスイッチを指す。一実施形態では、センサー領域及びエフェクター領域はポリヌクレオチドのリンカーによって連結される。一実施形態では、ポリヌクレオチドのリンカーはRNAステム(すなわち、二本鎖であるRNAポリヌクレオチドの領域)を形成する。
一実施形態では、エフェクター領域は3’イントロンの5’スプライス部位(「5’ss」)配列(すなわち、選択的エキソンのすぐそばの3’であるイントロンスプライス部位配列)を含む。エフェクター領域は3’イントロンの5’ss配列と3’イントロンの5’ss配列に対して相補的な配列とを含む。アプタマーがそのリガンドと結合すると、エフェクター領域はステムを形成し、従って選択的エキソンの3’末端でのスプライスドナー部位へのスプライシングを妨げる。ある特定の条件下では(たとえば、アプタマーがそのリガンドに結合しない場合)、エフェクター領域は選択的エキソンの3’末端でのスプライスドナー部位へのアクセスを提供するという状況下にあり、標的遺伝子mRNAにおける選択的エキソンの包含につながる。
「アプタマー」という用語は本明細書で使用されるとき、リガンドに特異的に結合するRNAポリヌクレオチド(またはRNAポリヌクレオチドをコードするDNA)またはリガンドへの特異的な結合(すなわち、予想されるアプタマー)を特定するためにスクリーニングされているRNAポリヌクレオチドを指す。アプタマーのライブラリは、ライブラリの他のメンバーとは少なくとも1つのヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を有する複数の予想されるアプタマーを含む予想されるアプタマーの集まりである。
本発明の遺伝子調節ポリヌクレオチドカセットの一部である選択的エキソンは、プレmRNAに転写されることができ、標的遺伝子のmRNAに選択的にスプライシングされることができるポリヌクレオチド配列であることができる。本発明の遺伝子調節カセットの一部である選択的エキソンは、選択的エキソンが標的遺伝子のmRNAに含まれる場合、そのmRNAからの標的遺伝子の発現が妨げられるまたは低減されるように翻訳を抑制する少なくとも1つの配列を含有する。好ましい実施形態では、選択的エキソンがスプライシングによって標的遺伝子のmRNAに含まれる場合、選択的エキソンは、標的遺伝子とのインフレームである終止コドン(TGA、TAA、TAG)を含有する。ある実施形態では、選択的エキソンがスプライシングによって標的遺伝子のmRNAに組み込まれ、たとえば、mRNAの分解を招くマイクロRNA結合部位を含む場合、選択的エキソンは、終止コドンに加えて、または終止コドンの代替として、翻訳を低減するまたは実質的に妨げる他の配列を含む。一実施形態では、選択的エキソンは、mRNAの分解を生じるmiRNA結合配列を含む。一実施形態では、選択的エキソンは、ポリペプチド配列をコードし、その配列は、このポリペプチド配列を含有するタンパク質の安定性を低減する。一実施形態では、選択的エキソンは、このポリペプチド配列を含有するタンパク質を分解に向けるポリペプチド配列をコードする。
選択的エキソンには5’及び3’のイントロン配列が隣接する。遺伝子調節カセットで使用することができる5’及び3’のイントロン配列は、アプタマーと結合するリガンドの存在または非存在に応じて、標的遺伝子からスプライシングで切り出され、標的遺伝子mRNAまたはmRNAに選択的エキソンを含む標的遺伝子を作り出す配列であることができる。5’及び3’のイントロンはそれぞれ、スプライシングが生じるのに必要な配列、すなわち、スプライスドナー、スプライスアクセプター及び分岐点配列を有する。一実施形態では、遺伝子調節カセットの5’及び3’のイントロン配列は1以上の天然に存在するイントロンまたはその一部に由来する。一実施形態では、5’及び3’のイントロン配列は切り詰めたヒトベータグロビンのイントロン2(IVS2Δ)に由来する。他の実施形態では、5’及び3’のイントロン配列は、SV40mRNAのイントロン(ClontechのpCMV-LacZベクターで使用された)、ヒトのトリオースリン酸イソメラーゼ(TPI)のイントロン6(Nott Ajit,et al.RNA.2003,9:6070617)、またはヒトの第IX因子のイントロン(Sumiko Kurachi,et al.J.Bio.Chem.1995,270(10),5276)、標的遺伝子自体の内在性イントロン、または調節されたスプライシングに十分である要素(Thomas,A.Cooper,Methods,2005(37):331)を含有するゲノム断片もしくは合成イントロン(Yi Lai,et al.Hum.Gene Ther.2006:17(10):1036)に由来する。
本発明のスクリーニング法は、標的の細胞、組織または生物で発現させることができる標的遺伝子(たとえば、レポーター遺伝子)の発現を調節するのに使用される遺伝子調節カセットを利用する。レポーター遺伝子は、その発現を使用して遺伝子調節カセットにおけるリガンドのアプタマーとの特異的な相互作用を検出することができる任意の遺伝子であることができる。一実施形態では、レポーター遺伝子は、たとえば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、オレンジ蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質または切替可能な蛍光タンパク質を含む蛍光タンパク質をコードする。別の実施形態では、レポーター遺伝子は、たとえば、ホタルルシフェラーゼ、Renillaルシフェラーゼ、または分泌型Gaussiaルシフェラーゼを含むルシフェラーゼ酵素をコードする。一実施形態では、レポーター遺伝子はβ-ガラクトシダーゼである。一実施形態では、レポーターは西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)である。一実施形態では、レポーター遺伝子は核タンパク質、トランスポーター、細胞膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、受容体、成長ホルモン、サイトカイン、シグナル伝達分子、調節性RNA、抗体、及び治療用のタンパク質またはペプチドから成る群から選択される。
本発明は、レポーター遺伝子をコードし、且つ本発明の遺伝子調節カセットを含有するポリヌクレオチドを標的細胞に導入するための組換えベクターの使用を企図する。多数の実施形態では、本発明の組換えDNA構築物には、宿主細胞におけるDNAの複製及びその細胞における適当なレベルでの標的遺伝子の発現を提供するDNAセグメントを含む追加のDNA要素が含まれる。当業者は、発現制御配列(プロモーター、エンハンサー等)が標的細胞にてレポーター遺伝子の発現を促進するその能力に基づいて選択されることを十分に理解する。「ベクター」は、試験管内または生体内のいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む組換えプラスミド、酵母人工染色体(YAC)、ミニ染色体、DNAミニサークルまたはウイルス(ウイルスに由来する配列を含む)を意味する。一実施形態では、組換えベクターはウイルスベクターまたは複数のウイルスベクターの組み合わせである。標的細胞におけるレポーター遺伝子のアプタマーが介在する発現についてのウイルスベクターは当該技術で既知であり、それには、アデノウイルス(AV)ベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、レトロウイルス及びレンチウイルスベクター、単純性ヘルペス1型(HSV1)ベクターが挙げられる。
(a)ライブラリにおけるオリゴヌクレオチドが複数の5’及び3’定常領域を含むオリゴヌクレオチドライブラリを提供すること、
(b)鋳型としてのオリゴヌクレオチドライブラリと、5’及び3’定常領域に相補的である第1のプライマーと第2のプライマーとを用いた2サイクルPCRを行うことと、
(c)2サイクルPCRの産物を単離すること、及び
(d)固有の5’及び3’定常領域のサブセットに相補的なプライマーを用いて2サイクルPCRの単離した産物のサブセットをPCRで増幅すること。
一態様では、本発明はリボスイッチのライブラリをサブライブラリに分割する方法を提供する。リボスイッチのライブラリは本明細書で使用されるとき、たとえば、本明細書及びPCT/US2016/016234に記載されているような、ライブラリの個々のメンバーがライブラリの他のメンバーとは異なるアプタマー配列を含む複数のアプタマーを含む遺伝子調節ポリヌクレオチドカセットを含むプラスミドライブラリである。実施形態では、リボスイッチのライブラリにおけるアプタマーは1以上の無作為化したヌクレオチドを含む。実施形態では、プラスミドリボスイッチライブラリは本明細書に記載されている方法によって作り出されるアプタマーのサブライブラリから生成された。
(a)本明細書に記載されている遺伝子調節ポリヌクレオチドカセットを含むプラスミドにアプタマーのライブラリを導入してリボスイッチライブラリを作製すること、
(b)リボスイッチライブラリを細菌(たとえば、E.coli)に導入すること、
(c)細菌クローンを回収し(たとえば、細菌コロニーを摘み取ることによって)、プラスミドDNAを抽出してリボスイッチのプラスミドサブライブラリ(本明細書では一次サブライブラリと呼ぶ)を得ること、
(d)任意で、一次サブライブラリを細菌に導入し、細菌クローンを回収し、プラスミドDNAを単離することによってリボスイッチの一次プラスミドサブライブラリからリボスイッチの二次サブライブラリを生成すること。
スプライシングに基づく遺伝子調節リボスイッチを用いたアプタマー/リガンドについての哺乳類細胞系スクリーニング
手順
リボスイッチの構築
リボスイッチは、参照によって本明細書に組み入れられるPCT/US2016/016234(具体的には実施例3~6)に記載されているように構築した。切り詰めたヒトベータグロビンのイントロン配列を合成し、ホタルルシフェラーゼ遺伝子のコーディング配列に挿入した。変異体ヒトDHFRのエキソン2を合成し、ゴールデンゲートクローニング戦略を用いてこの切り詰めたベータグロビンのイントロン配列の真ん中に挿入した。独立して2つの異なるBsaI部位に相補的であり(IDT)、アニーリングし、BsaIで消化したmDHFR-Luci-アクセプターベクターにライゲーションされている5’末端で4ヌクレオチドのオーバーハングを持つオリゴヌクレオチド(「オリゴ」)としてxpt-G/A1、ydhl-G/A2、yxj3、add4、gdg6-G/A5(アプタマーについての引用は参照によって本明細書に組み入れられる)を含むアプタマーを合成した。
形質移入の前日に、3.5×104個のHEK-293細胞を96穴平底プレートに播いた。プラスミドDNA(500ng)を試験管または96穴U底プレートに加えた。これとは別に、TransIT-293試薬(Mirus;1.4μL)を50μLのOpti-mem I培地(Life Technologies)に加え、室温(RT)で5分間静置した。次いで、この希釈した形質移入試薬50μLをDNAに加え、混合し、RTで20分間インキュベートした。最終的にこの溶液7μLを96穴プレートの細胞のウェルに加えた。
培地交換の24時間後、プレートをインキュベータから取り出し、実験台にて数分間RTに対して平衡化し、次いで吸引した。Glo溶解緩衝液(Promega、100μL、RT)を加え、プレートをRTで少なくとも5分間維持した。次いで、ウェルの内容物を50μLの倍散剤によって混合し、各試料20μLを、Glo溶解緩衝液で10%に希釈したブライトglo試薬(Promega)20μLと混合した。96のウェルを不透明な白色の384穴プレートに配置した。RTでの5分間のインキュベートに続いて、500ミリ秒の読み取り時間でTecan機器を用いて発光を測定した。ルシフェラーゼ活性は平均の相対的な光単位(RLU)±SDとして表し、誘導倍率はグアニン処理をしないで得られたルシフェラーゼ活性で割ったグアニン処理によって得られたルシフェラーゼ活性として算出した。
レポーター遺伝子としてのルシフェラーゼで出発して、ヒトβ-グロビンのイントロンをホタルルシフェラーゼのコーディング配列の真ん中に挿入し、変異体終止コドンを含有するヒトDHFRのエキソン2をイントロン部分に挿入することによって遺伝子発現のプラットフォームを作り出した。レポーター遺伝子の発現は、従ってレポーター遺伝子とインフレームである終止コドンを含有するmDHFRエキソンの包含または排除によって、制御される。このシステムでは、U1結合部位及び挿入された相補的配列によって形成されたmRNAにおけるヘアピン構造がmDHFRエキソンの包含を阻止し、よって標的遺伝子の発現を可能にする(図1a)。調節可能なヘアピン構造を形成するために、従って小分子によって制御可能な標的遺伝子の発現を行うために、我々は、合成アプタマー(テオフィリン)または天然のアプタマー(xpt-G/A、yxj、ydhl-A/G、add-A/Gアプタマー)またはハイブリッドアプタマーgdg6-G/Aを、U1結合部位とその相補的配列との間で、このスプライシングに基づく遺伝子調節プラットフォームに移植し、哺乳類細胞にて遺伝子発現を調節する合成リボスイッチを生成した。我々のスプライシングに基づく遺伝子調節カセットを用い、我々の合成リボスイッチ構築物に様々なアプタマーを挿入することによって、我々は哺乳類細胞の背景にてリガンドに対する様々な機能的な応答を明らかにした。グアニンアプタマーを持つリボスイッチは図1bで示すようにグアニンと同様にグアノシンに応答する。xpt-グアニンリボスイッチであるxpt-G17(参照によって本明細書に組み入れられるPCT/US2016/016234で開示されている、たとえば、配列番号15を参照のこと)は、その天然のリガンド処理によってリガンドに応答してレポーター遺伝子発現の高いダイナミックレンジの誘導を生じた。
xpt-A8(配列番号1):
GTAATGTataatcgcgtggatatggcacgcaagtttctaccgggcaccgtaaatgtccgattACATTAC
add-G6(配列番号2):
GTAATGTGtataatcctaatgatatggtttgggagtttctaccaagagccttaaactcttgactaCACATTAC
add-A6(配列番号3):
GTAATGTGtataatcctaatgatatggtttgggagtttctaccaagagccttaaactcttgattaCACATTAC
gdg6-A8(配列番号4):
GTAATGTacagggtagcataatgggctactgaccccgccgggaaacctatttcccgattACATTAC
gdg6-G8(配列番号5):
GTAATGTacagggtagcataatgggctactgaccccgccgggaaacctatttcccgactACATTAC
Ydhl-G8(配列番号6):
GTAATGTataacctcaataatatggtttgagggtgtctaccaggaaccgtaaaatcctgactACATTAC
Ydhl-A6(配列番号7):
GTAATGTGtataacctcaataatatggtttgagggtgtctaccaggaaccgtaaaatcctgattaCACATTAC
yxj-A6(配列番号8):
GTAATGTGtatatgatcagtaatatggtctgattgtttctacctagtaaccgtaaaaaactagattaCACATTAC
アプタマーライブラリの設計及び合成
手順
アプタマーライブラリを生成するために、リガンド結合に関与する可能性があるような結晶構造6,7から特定されているアプタマーにおける位置でのヌクレオチドを無作為化した。アプタマーのリボスイッチへの構築を促進するために、IIs型制限酵素(たとえば、BsaI)の切断部位を持つ定常領域をアプタマー領域に隣接させた。無作為化した塩基を持つアプタマー配列を含有するこの153bpのウルトラマーオリゴヌクレオチドをIDTによって合成した:GACTTCGGTCTCATCCAGAGAATGAAAAAAAAATCTTCAGTAGAAGGTAATGTATANNNGCGTGGATATGGCACGCNNGNNNNCNCCGGGCACCGTAAATGTCCGACTACATTACGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGAAGAGACCAGACGG(Nは無作為ヌクレオチドを表す)(配列番号9)。アプタマーライブラリにてさらなる配列多様性を生成するために、さらなる位置にて塩基を無作為化することができる。完全に無作為な配列を用いてアプタマーライブラリを生成することができる。
実施例1に記載されているように、我々は、小分子リガンドの処理に応答して哺乳類の遺伝子発現を調節する合成リボスイッチを成功裏に作成した。スプライシングに基づく遺伝子発現カセットにてxpt-Gグアニンアプタマーを含有するリボスイッチの1つであるxpt-G17。レポーター遺伝子としてルシフェラーゼを用いて、我々はグアニン処理に応答して高濃度のグアニンで2000に誘導倍率を伴う遺伝子調節の高いダイナミックレンジを達成した。アプタマー/リガンドが介在する選択的スプライシングの構築物による遺伝子調節活性のこの例を見ないダイナミックレンジは、哺乳類細胞における所望のリガンドに対するアプタマーについてスクリーニングする、または既知のアプタマーと結合し、活性化するリガンドについてスクリーニングするシステムを提供する。
大きな無作為化アプタマーライブラリをアプタマーの小さなサブライブラリに分けること
手順
オリゴヌクレオチド(オリゴ)
プライマーのJFまたはJRのセットは、合成されたアプタマーオリゴにおける定常領域に相補的な3’部分配列及び無作為な20量体オリゴ配列を含有する5’部分配列を有する。プライマーのFまたはRのセットは、JFまたはJRのプライマーにおける無作為20量体オリゴ配列に対して相補的である。プライマーはすべてIDTで合成される。JFプライマーは5’末端にてビオチンで標識された(IDT)。合成されたオリゴは、ストック溶液として100μMにDNA分解酵素及びRNA分解酵素を含まない水にて懸濁し、所望の濃度に希釈し、Nanodrop機器またはOliGreen法(ThermoFisher)を用いて定量した。
ビオチン化オリゴ・タグを付加するために、10μLの反応体積にて製造元のプロトコールに従ってPfxプラチナPCRキットを用いて2サイクルPCR増幅を行った。PCR反応では所望のコピー数でオリゴ鋳型を使用した(アプタマーライブラリにてオリゴ配列当たり1~5コピー)。増幅の第1のサイクルについては逆行プライマーJRのみを含めた。増幅は、94℃で2分間、次いで94℃で10秒間、1分当たり0.5℃で66℃から52℃まで下降するタッチダウンプログラムによるアニーリングで実行した。次いでポリメラーゼ反応が68℃で20秒間あり、その後4℃までの冷却が続いた。次いで鋳型を含まないが、ビオチン化した順行プライマー(ビオチンJF)を含有するPCR混合物10μLを、同じPCRステップを用いた増幅の第2サイクルのために第1サイクルのPCR試験管に加えた。PCR産物はストレプトアビジン・ビーズとのインキュベートの準備ができた。
2×結合及び洗浄緩衝液(BW緩衝液)を2MのNaClと共に1×TE緩衝液(Ambion)で作った。DynabeadsM-270ストレプトアビジン(ThermoFisher)(SAビーズ)を20μMの酵母tRNA溶液(Ambion)で室温にて10分間ブロックし、1×BW緩衝液で2回洗浄し、使用したビーズの最初の体積と同じ体積の2×BW緩衝液に再懸濁した。50μLのこれら処理したビーズを100μLの2×BW緩衝液及び30μLの水と一緒にPCR産物に加えた。製造元のプロトコールに従って、200μLのビオチン化したオリゴとSAビーズの混合物を室温で60分間インキュベートし、次いで95℃にて5分間、ビーズを変性させ、直ちに氷上で冷却し、1×BW緩衝液で1回、水で2回5分間洗浄した。洗浄溶液をできるだけ多く取り除き、洗浄したビーズはPCR反応の準備ができた。
ビオチン化したPCR産物を伴うビーズを、PfxプラチナPCRキットを用いて合計50μLのPCRミックスに加えた。プライマーはF及びRのセットプライマーの混合物である。PCRは94℃で2分間予備加熱し、94℃で15秒間、62℃で30秒間、68℃で20秒間、及び68℃で2分間の追加の伸長の28サイクルに供した。PCR産物を12℃に冷却し、PCRの2回目に備えた。2回目のPCR増幅については、1回目のPCRに由来するPCR産物1μLを鋳型として用い、F及びRのプライマーの単一ペアを使用して相補的配列でタグを付けた鋳型を増幅した。PCR反応は94℃で予備加熱し、94℃で15秒間、60℃で30秒間、68℃で20秒間、及び68℃で2分間の追加の伸長の25サイクルで増幅した。
指数関数的増加によるリガンドの系統的展開(SELEX)8,9を用いた試験管内の選択は、代謝産物、ビタミン補因子、金属イオン、タンパク質、及び全細胞さえも含む広範囲のリガンドに対する多数のアプタマーを生成するための普通1013~1014の配列を伴う大きなアプタマーライブラリをスクリーニングするのに広範に適用されているが10、そのような大きな無作為化アプタマーライブラリの細胞系スクリーニングの方法はまだ開発されていない。さらに、SELEXによって生成されたアプタマーのほとんどが細胞環境では有効ではないことが判明し、アプタマーを、それらが機能することが求められる細胞環境にてスクリーニングすることの重要性を強調している。選択したアプタマーが細胞内で機能するために、特定のアプタマーのそのリガンドへの結合は機能的な結果を有さなければならず、それは、試験管内の条件下でリガンド結合にのみ基づいてアプタマーを選択するSELEXを介しては調べることができない。アプタマーについての哺乳類細胞に基づく選別を開発する難題の1つは、リガンド処理に応答したアプタマーに基づくリボスイッチの遺伝子調節のダイナミックレンジが低いことである。この基本的な限界に加えて、哺乳類細胞における本質的な低い遺伝子導入効率が105配列より大きいスクリーニングライブラリに対して別の障壁を課している。しかしながら、我々は、リガンド処理の際、遺伝子発現の数千倍の誘導まで生成することができる合成リボスイッチを開発した。この高いダイナミックレンジの遺伝子調節はアプタマー/リガンドをスクリーニングするための細胞系システムの基礎を提供する。高い配列多様性を有する大きなアプタマーライブラリから真核細胞にてアプタマーを選択するために、本発明は、大きなアプタマーライブラリを、リボスイッチカセットにクローニングして哺乳類細胞系のアッセイを介してスクリーニング可能であるプラスミドライブラリを生成することができる小さなサブライブラリに分割する/分ける複数の戦略及びアプローチを提供する。
ライブラリのスクリーニングに対する細胞系アッセイの感度
手順
DNA構築物
xpt-G17リボスイッチを含有するプラスミドDNA構築物をDNA構築物SR-Mutにてこれら2つのDNA構築物の様々な比に希釈した。次いで、混合した構築物G17とSR-mutのプラスミドDNAをHEK-293細胞に形質移入した。形質移入及びルシフェラーゼアッセイを実施例1に記載されているように行った。
ライブラリのスクリーニングについての細胞系アッセイの感度は、最低1つの陽性のヒットが選別におけるライブラリの残りから突出するためにアプタマー・リボスイッチのプラスミドライブラリがどれほど複雑でそのサイズがどれほど大きくてもよいかを決定する。アッセイは選択されるレポーター遺伝子に応じてルシフェラーゼ活性、蛍光タンパク質の蛍光強度、または成長ホルモン/サイトカインの放出についてのものであることができ、遺伝要素は、一時的な形質移入またはウイルス、たとえば、AAV、アデノウイルス、レンチウイルス等の形質導入によって送達することができる。
プールしたアプタマーに基づくリボスイッチのプラスミドライブラリの構築及び大きなリボスイッチライブラリの小さなスクリーニング可能なサブライブラリへの分割
手順
リボスイッチのプールしたプラスミドライブラリの構築
二本鎖DNA断片を生成するためにプラチナPfxキット(Invitrogen)を用いて、無作為化した塩基を伴ったアプタマー配列(配列の設計及び組成については実施例2を参照のこと)を含有するウルトラマーオリゴをPCRで増幅し、生成したPCR産物を4%アガロースゲル上で泳動した。153bpサイズのDNAをゲル精製(Qiagen)し、BsaI酵素(NEB)で消化した。次いでT4DNAリガーゼ(Roche)を用いてベクターの挿入物に対する1:5の比で実施例1に記載されているようにBsaI消化したDNA断片をBsaI消化したアクセプターベクターにライゲーションした(mDHFR-Luci-アクセプター)。製造元の指示書(Invitrogen)に従って、エレクトロMAX DH5α-Eコンピテント細胞をライゲーション産物で形質転換し、寒天プレート上に播いた。細菌コロニーをプールし、回収し、DNAを抽出してリボスイッチのプラスミドライブラリ(P1)を得た。
227pgのプラスミドDNAを用いて50μLのコンピテント細胞を形質転換して1:10比のプラスミドDNAと細菌細胞を得た。振盪せずに37℃で30分間インキュベートした後、形質転換した細胞を寒天プレート上に播き、96形式のミニプレップキット(Qiagen)を用いてDNA抽出のためにコロニーをプールし、回収してリボスイッチのプールしたプラスミドサブライブラリを得た。
二次または三次のリボスイッチサブライブラリに由来するプラスミドDNAを鋳型として用い、以下のプライマーを用いて無作為化アプタマー配列を含有するPCRアンプリコンを生成した:DHFR_F:5’-GACTTCGGTCTCATCCAGAGAATGAAAAAAAAATCTTCAGTAGAAGGTAATG-3’(配列番号11);IVS_R:5’-CCGTCTGGTCTCTTCACTGTTATTCTTTAGAATGGTGCG-3’(配列番号12)。PCR産物を、Illumina MiSeq 2×150bpのペアエンドプラットフォームを用いたNGSに供して各試料についておよそ700Kの読み取りを生成し、固有の配列の特定及び相対的存在量の算出のためにその後のバイオインフォマティクス解析に供した(Genewizによって提供されているサービス)。配列決定の実行から12以上の読み取りを示した配列を真の配列と見なす。
細胞系アッセイによってアプタマーをスクリーニングするために、アプタマーライブラリをmDHFR-Luci-アクセプターベクターにクローニングすることによってリボスイッチのプラスミドライブラリを生成した(図5a)。生成された構築物は構築物xpt-G17と同じ構成の遺伝要素を含有し、唯一の差異はアプタマー配列にあった。我々は、実施例2に記載されているように生成されたアプタマーライブラリから始め、それは106の固有の配列を含む無作為化アプタマーライブラリである。当初のアプタマーライブラリの99.9%を超える再現を保証するために、アプタマーライブラリにおける配列の数の7.5倍である合計7.5×106のコロニーを寒天プレートから回収した。回収したコロニーから抽出したプラスミドDNAは106の固有のリボスイッチから成るプラスミドライブラリ(P1)を形成する。
選択したリガンドに対する新しいアプタマーについての哺乳類細胞系スクリーニング
実施例5に記載されているように、各プールにて60Kのリボスイッチを含む100の一次プラスミドサブライブラリ(P1S_001~P1S_100)を構築し、同じ戦略を用いて一次サブライブラリP1S_001をさらに分割することによってそれぞれ600のリボスイッチから成る100の二次プラスミドサブライブラリ(P1S_001_001~P1S_001_100)を生成した。プールしたライブラリを96穴形式に並べてハイスルースクリーニングを促進することができる。一次サブライブラリP1S_001~006ならびにP1S_001のサブライブラリに対して、当初のアプタマー配列に対するものである、試験リガンドとしてのグアニンに対する、実施例1に記載されているようなルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて予備選別を行った。一次サブライブラリまたは二次サブライブラリに由来する構築物によって生成されたルシフェラーゼ活性の基本レベルはxpt-G17構築物のそれとは有意に異なった(データは示さず)。これは選択された位置で塩基を無作為化することによるアプタマー配列における変化が終止コドン含有エキソンの包含/排除に様々な程度で影響を及ぼし、従ってルシフェラーゼの基底発現に影響を与えることを示唆している。グアニン処理に続いて、60Kの一次サブライブラリP1S_005で形質移入した細胞は未処理の細胞に比べてルシフェラーゼ活性の1.8倍の誘導を生成したが(図6a)、リガンドとしてグアニンを使用した場合、ルシフェラーゼの2倍を超える誘導は見いだされなかった。しかしながら、100の二次サブライブラリのうち7つはグアニン処理の際、ルシフェラーゼ活性の2倍を超える誘導を生じ、サブライブラリP1S_001_075は7.8倍の誘導を生成した(図6b)。実施例4に記載されている感度アッセイでは、500のリガンド非応答分子の間でxpt-G17リボスイッチが1つあった場合、6.3倍の誘導が検出された。この感度試験に基づいて、サブライブラリP1S_001_075のこの予備スクリーニングからの結果(7.8倍)は600のうちでxpt-G17と機能的に同等であるリボスイッチが1つある、または誘導されたルシフェラーゼ活性の合計がxpt-G17のそれに匹敵する幾つかの弱いリボスイッチがあることを示唆している。
1.Mandal,Maumita,Benjamin Boese,Jeffrey E.Barrick,Wade C.Winkler,and Ronald R.Breaker.“Riboswitches Control Fundamental Biochemical Pathways in Bacillus Subtilis and Other Bacteria.”Cell,113,no.5(May,30,2003):577-86.
2.Mandal,Maumita,and Ronald R.Breaker.“Adenine Riboswitches and Gene Activation by Disruption of a Transcription Terminator.”Nature Structural & Molecular Biology,11,no.1(January,2004):29-35.doi:10.1038/nsmb710.
3.Mulhbacher,Jerome,and Daniel A.Lafontaine.“Ligand Recognition Determinants of Guanine Riboswitches.”Nucleic Acids Research,35,no.16(2007):5568-80.doi:10.1093/nar/gkm572.
4.Serganov,Alexander,Yu-Ren Yuan,Olga Pikovskaya,Anna Polonskaia,Lucy Malinina,Anh Tuan Phan,Claudia Hobartner,Ronald Micura,Ronald R.Breaker,and Dinshaw J.Patel.“Structural Basis for Discriminative Regulation of Gene Expression by Adenine- and Guanine-Sensing mRNAs.”Chemistry & Biology,11,no.12(December,2004):1729-41.doi:10.1016/j.chembiol.2004.11.018.
5.Edwards,Andrea L.,and Robert T.Batey.“A Structural Basis for the Recognition of 2’-deoxyguanosine by the Purine Riboswitch.”Journal of Molecular Biology,385,no.3(January,23,2009):938-48.doi:10.1016/j.jmb.2008.10.074.
6.Batey,Robert T.,Sunny D.Gilbert,and Rebecca K.Montange.“Structure of a Natural Guanine-Responsive Riboswitch Complexed with the Metabolite Hypoxanthine.”Nature,432,no.7015(November,18,2004):411-15.doi:10.1038/nature03037.
7.Serganov,Alexander,Yu-Ren Yuan,Olga Pikovskaya,Anna Polonskaia,Lucy Malinina,Anh Tuan Phan,Claudia Hobartner,Ronald Micura,Ronald R.Breaker,and Dinshaw J.Patel.“Structural Basis for Discriminative Regulation of Gene Expression by Adenine- and Guanine-Sensing mRNAs.”Chemistry & Biology,11,no.12(December,2004):1729-41.doi:10.1016/j.chembiol.2004.11.018.
8.Ellington,A.D.,and J.W.Szostak.“In Vitro Selection of RNA Molecules That Bind Specific Ligands.”Nature,346,no.6287(August,30,1990):818-22.doi:10.1038/346818a0.
9.Tuerk,C.,and L.Gold.“Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment:RNA Ligands to Bacteriophage T4 DNA Polymerase.”Science,(New York,N.Y.)249,no.4968(August,3,1990):505-10.
10.Ozer,Abdullah,John M.Pagano,and John T.Lis.“New Technologies Provide Quantum Changes in the Scale,Speed,and Success of SELEX Methods and Aptamer Characterization.”Molecular Therapy.Nucleic Acids,3(2014):e183.doi:10.1038/mtna.2014.34.
11.Kebschull,Justus M.,and Anthony M.Zador.“Sources of PCR-Induced Distortions in High-Throughput Sequencing Data Sets.”Nucleic Acids Research,43,no.21(December,2,2015):e143.doi:10.1093/nar/gkv717
Claims (19)
- 真核細胞にてリガンドと結合するアプタマーを選択する方法であって、以下のステップ:
(a)アプタマーのライブラリを提供することと、
(b)レポーター遺伝子の発現であって前記リガンドが介在する発現のためのポリヌクレオチドカセットに、前記アプタマーのライブラリのメンバーを導入してリボスイッチのライブラリを作り出すことと、
(c)真核細胞に前記リボスイッチのライブラリを導入することと、
(d)前記真核細胞をリガンドに接触させることと、
(e)前記レポーター遺伝子の発現を測定することとを含み、
前記ポリヌクレオチドカセットは、5’イントロン及び3’イントロンが隣接する選択的にスプライシングされるエキソンと、(i)前記3’イントロンの5’スプライス部位配列を含むステムを含むエフェクター領域及び(ii)アプタマーを含むリボスイッチとを含み、
前記選択的にスプライシングされるエキソンは、前記選択的にスプライシングされるエキソンが前記レポーター遺伝子のmRNAにスプライシングされる際、前記レポーター遺伝子とインフレームである終止コドンを含む、前記方法。 - 以下のステップを含む、前記ポリヌクレオチドカセットに導入する前に前記アプタマーのライブラリをさらに小さなアプタマーライブラリに分割する、請求項1に記載の方法:
(a)無作為化アプタマーライブラリであって、前記ライブラリにおける前記アプタマーが複数の5’及び3’の定常領域と1以上の無作為化されたヌクレオチドとを含む、前記無作為化アプタマーライブラリを提供すること、
(b)鋳型としての前記無作為化アプタマーライブラリと、各プライマーが複数のタグ配列の1つを含む前記5’及び3’の定常領域に相補的である第1のプライマーと第2のプライマーとを用いて2サイクルPCRを行うこと、
(c)前記2サイクルPCRの産物を単離すること、及び
(d)5’及び3’のタグ配列のサブセットに相補的であるプライマーを用いて2サイクルPCRの単離された産物のサブセットをPCRで増幅すること。 - 前記リボスイッチのライブラリが、前記真核細胞に導入される前にリボスイッチの1以上のサブライブラリに分割される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記リボスイッチのライブラリが、以下のステップを含んで、サブライブラリにさらに分割される、請求項3に記載の方法:
(a)前記リボスイッチライブラリを細菌に導入すること、
(b)細菌クローンを回収し、プラスミドDNAを抽出してリボスイッチのプラスミドサブライブラリを得、1以上の一次サブライブラリを生成すること。 - さらに、一次サブライブラリを細菌に導入し、細菌クローンを回収し、プラスミドDNAを単離することによってリボスイッチの一次プラスミドサブライブラリからリボスイッチの二次サブライブラリを生成することを含む、請求項4に記載の方法。
- 真核細胞にてアプタマーと結合するリガンドを選択する方法であって、
以下のステップ:
(a)リガンドのライブラリを提供することと、
(b)レポーター遺伝子の発現であって前記リガンドが介在する発現のためのポリヌクレオチドカセットを提供することと、
(c)前記真核細胞に前記ポリヌクレオチドカセットを導入することと、
(d)前記真核細胞の個々のグループをリガンドの前記ライブラリのメンバーに接触させることと、
(e)前記レポーター遺伝子の発現を測定することとを含み、
前記ポリヌクレオチドカセットは、5’イントロン及び3’イントロンが隣接する選択的にスプライシングされるエキソンと、(i)前記3’イントロンの5’スプライス部位配列を含むステムを含むエフェクター領域及び(ii)アプタマーを含むリボスイッチとを含み、
前記選択的にスプライシングされるエキソンは、前記選択的にスプライシングされるエキソンが前記レポーター遺伝子のmRNAにスプライシングされる際、前記レポーター遺伝子とインフレームである終止コドンを含む、前記方法。 - 前記リガンドが
(a)小分子である、または
(b)代謝産物、核酸、ビタミン、補因子、脂質、単糖類及びセカンドメッセンジャーから成る群から選択される、真核細胞によって産生される分子である、
請求項1、3及び6のいずれか一項に記載の方法。 - 前記真核細胞が哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞及び酵母細胞から成る群から選択される、請求項1、3及び6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子が、
(a)蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼ、または
(b)サイトカイン、シグナル伝達分子、成長ホルモン、抗体、調節性RNA、治療用のタンパク質またはペプチド
から成る群から選択される、請求項1、3及び6のいずれか一項に記載の方法。 - 前記レポーター遺伝子の前記発現が、前記リガンドが存在しない場合の前記レポーター遺伝子の発現レベルよりも、前記リガンドが特異的に前記アプタマーと結合する場合の方が10倍を超えて高い、請求項1、3及び6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記5’及び3’イントロンが、
(a)ヒトβ-グロビン遺伝子のイントロン2に由来する、
(b)それぞれ独立して50~300ヌクレオチドの長さである、または
(c)それぞれ独立して125~240ヌクレオチドの長さである、
請求項1、3及び6のいずれか一項に記載の方法。 - 前記エフェクター領域のステムが、
(a)7~20塩基対の長さである、または
(b)8~11塩基対の長さである、
請求項1、3及び6のいずれか一項に記載の方法。 - 前記選択的にスプライシングされるエキソンが、
(a)ヒトのジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子のエキソン2、変異体ヒトウィルムス腫瘍1のエキソン5、マウスのカルシウム/カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼIIデルタのエキソン16及びSIRT1のエキソン6から成る群に由来する、
(b)ヒトDHFRに由来する修飾されたエキソン2である、
(c)合成のものである、または
(d)エキソンスプライスエンハンサーの配列を変えること、エキソンスプライスサイレンサーの配列を変えること、エキソンスプライスエンハンサーを付加すること、及びエキソンスプライスサイレンサーを付加することから成る群の1以上によって修飾されている、
請求項1、3及び6のいずれか一項に記載の方法。 - 以下のステップを含む、無作為化アプタマーライブラリをさらに小さなアプタマーサブライブラリに分ける方法:
(a)無作為化アプタマーライブラリであって、前記ライブラリにおける前記アプタマーが複数の5’及び3’の定常領域と1以上の無作為化したヌクレオチドとを含む、前記無作為化アプタマーライブラリを提供すること、
(b)鋳型としての前記無作為化アプタマーライブラリと、各プライマーが複数のタグ配列の1つを含む前記5’及び3’の定常領域に相補的である第1のプライマーと第2のプライマーとを用いて2サイクルPCRを行うこと、
(c)前記2サイクルPCRの産物を単離すること、及び
(d)5’及び3’のタブ配列のサブセットに相補的であるプライマーを用いて前記2サイクルPCRの前記単離された産物のサブセットをPCRで増幅すること。 - 前記アプタマーライブラリが1以上の無作為化したヌクレオチドを有するアプタマーを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記無作為化アプタマーライブラリが100,000を超えるアプタマーを含む、または、前記無作為化アプタマーライブラリが1,000,000を超えるアプタマーを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記2サイクルPCRにおける第1のプライマーまたは第2のプライマーが、ビオチン、ジゴキシゲニン(DIG)、ブロモデオキシウリジン(BrdU)、蛍光色素分子、及びクリック化学で使用される化学基から成る群から選択される標識を含む、請求項2または14に記載の方法。
- 配列番号14~27の配列を含む配列によってコードされるアプタマー。
- 配列番号24の配列を含む配列によってコードされるアプタマー。
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Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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---|---|---|---|---|
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JP2008518630A (ja) | 2004-11-08 | 2008-06-05 | イェール ユニバーシティ | リボスイッチ、リボスイッチによる、構造を基礎とする化合物設計、ならびにリボスイッチの使用方法およびリボスイッチを伴う組成物 |
US20110111411A1 (en) | 2009-11-10 | 2011-05-12 | Smolke Christina D | Protein-Responsive RNA Control Devices and Uses Thereof |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
Cell, 2004, Vol.119, pp.831-845 |
Nat. Biotechnol., 2013, Vol.31, pp.453-457 |
Nuc. Acids Res., 2007, Vol.35, pp.4179-4185 |
Science, 2010, Vol.330, pp.1251-1255 |
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