CN110199030A - 基于细胞的高通量适体筛选 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用以使用用于调控报道基因的表达的多核苷酸盒来鉴定特异性结合配体的适体或特异性结合适体的配体的基于真核细胞的筛选方法，其中所述多核苷酸盒含有在5′内含子‑选择性外显子‑3′内含子的情形下的核糖开关。所述核糖开关包含效应子区和适体以使当所述适体结合配体时，发生报道基因表达。

Description

基于细胞的高通量适体筛选
技术领域
本发明提供用以使用用于调控报道基因的表达的多核苷酸盒来鉴定在真核细胞中特异性结合配体的适体或特异性结合适体的配体的筛选方法，其中所述多核苷酸盒含有在5′内含子–选择性外显子–3′内含子的情形下的核糖开关。所述核糖开关包含效应子区和适体以使当所述适体结合配体时，发生报道基因表达。
发明背景
剪接是指内含子序列从初生前信使RNA(前mRNA)移除以及外显子接合在一起以形成mRNA所采用的过程。剪接位点是外显子与内含子之间的接合部，并且由在内含子的5′末端和3′末端的不同共有序列(即，分别是剪接供体位点和剪接接受体位点)确定。选择性前mRNA剪接或选择性剪接是一种存在于含有多个外显子的大多数人基因中的普遍过程。它通过称为剪接体的大型多组分结构来进行，所述剪接体是一批小核核糖核蛋白(snRNP)和一系列不同辅助蛋白质。通过识别各种顺式调控序列，剪接体确定外显子/内含子边界，移除内含子序列，并且将外显子一起剪接至最终可翻译信息(即mRNA)中。在选择性剪接的情况下，某些外显子可被包括或排除以使最终编码信息不同，由此改变所得表达蛋白质。
本发明利用配体/适体介导的对选择性剪接的控制来鉴定在靶标真核细胞的情形下结合的适体/配体对。在本发明之前，已通过体外筛选来产生针对多种配体的适体，然而，少许适体已被证明在细胞中有效，从而强调需要用以筛选在所选生物体中起作用的适体的系统。
发明内容
在一个方面，本发明提供一种用于选择在真核细胞中结合配体的适体的方法，其包括以下步骤：
(a)提供适体文库，
(b)将所述适体文库的成员引入用于达成配体介导的报道基因表达的多核苷酸盒中以创建核糖开关文库，
(c)将所述核糖开关文库引入真核细胞中，以及
(d)使所述真核细胞与配体接触，以及
(e)测量所述报道基因的表达，
其中所述多核苷酸盒包含侧接5′内含子和3′内含子的选择性剪接外显子，以及核糖开关，所述核糖开关包含(i)效应子区，其包含包括所述3′内含子的5′剪接位点的茎，和(ii)适体，其中所述选择性剪接外显子包含当所述选择性剪接外显子被剪接至报道基因mRNA中时与所述报道基因符合读框的终止密码子。
在一个实施方案中，适体文库包含具有一个或多个随机化核苷酸的适体。在一个实施方案中，适体文库包含具有完全随机化序列的适体。在一个实施方案中，适体文库包含长度在约15至约200个核苷酸之间的适体。在一个实施方案中，适体文库包含长度在约30与约100个核苷酸之间的适体。在一个实施方案中，适体文库包含超过100,000个适体。在一个实施方案中，适体文库包含超过1,000,000个适体。
在一个实施方案中，配体是小分子。在一个实施方案中，小分子配体对于真核细胞是外源性的。在另一实施方案中，配体是由真核细胞产生的分子，包括例如代谢物、核酸、维生素、辅因子、脂质、单糖和第二信使。
在一个实施方案中，真核细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和酵母细胞。在一个实施方案中，真核细胞源于小鼠、人、蝇(例如黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster))、鱼(例如斑马鱼(Danio rerio))或线虫(例如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans))。
在一个实施方案中，报道基因选自由荧光蛋白、荧光素酶、β-半乳糖苷酶和辣根过氧化物酶组成的组。在一个实施方案中，报道基因是细胞因子、信号传导分子、生长激素、抗体、调控性RNA、治疗性蛋白质、或肽。在一个实施方案中，当配体特异性结合适体时，报道基因的表达是当不存在配体时的报道基因表达水平的大于约10倍。在其他实施方案中，当配体特异性结合适体时的报道基因的表达是当不存在配体时的报道基因表达水平的大于约20、50、100、200、500或1,000倍。
在一个实施方案中，5′内含子和3′内含子源于人β-球蛋白基因的内含子2。在一个实施方案中，5′内含子包含与靶基因符合读框的终止密码子。在一个实施方案中，5′内含子和3′内含子的长度各自独立地是约50至约300个核苷酸。在一个实施方案中，5′内含子和3′内含子的长度各自独立地是约125至约240个核苷酸。在一个实施方案中，5′内含子和/或3′内含子已被修饰来包括内含子剪接增强子、内含子剪接增强子、5′剪接位点、3′剪接位点或分支点序列，或改变其序列。
在一个实施方案中，核糖开关的效应子区茎的长度是约7至约20个碱基对。在一个实施方案中，效应子区茎的长度是8至11个碱基对。
在一个实施方案中，选择性剪接外显子源于人二氢叶酸还原酶基因(DHFR)的外显子2、突变人威尔姆斯肿瘤(Wilms tumor)1的外显子5、小鼠钙/钙调蛋白依赖性蛋白质激酶IIδ外显子16或SIRT1外显子6。在一个实施方案中，选择性剪接外显子是经修饰DHFR外显子2。在一个实施方案中，选择性剪接外显子已在由以下项组成的组中的一者或多者方面加以修饰：改变外显子剪接沉默子的序列、改变外显子剪接增强子的序列、添加外显子剪接增强子以及添加外显子剪接供体。在一个实施方案中，选择性剪接外显子是合成的(即并非源于天然存在的外显子)。
在一个实施方案中，在引入多核苷酸盒中之前将适体文库分成较小适体文库，此包括以下步骤：
(a)提供随机化适体文库，其中所述文库中的适体包含多个5’恒定区和3’恒定区以及一个或多个随机化核苷酸，
(b)使用作为模板的所述随机化适体文库以及互补于所述5’恒定区和所述3’恒定区的第一引物和第二引物进行双循环PCR，
(c)分离所述双循环PCR的产物，以及
(d)使用互补于一子组的独特5’恒定区和3’恒定区的多种引物对所述双循环PCR的一子组的经分离产物进行PCR扩增。
在一个实施方案中，在引入真核细胞中之前将核糖开关文库分成一个或多个核糖开关子文库。在一个实施方案中，用于将核糖开关文库分成子文库的方法包括以下步骤：
(a)将适体文库引入包含基因调控多核苷酸盒的质粒中以制备核糖开关文库；
(b)将所述核糖开关文库引入细菌(例如大肠杆菌(E.coli))中；以及
(c)收集细菌克隆(例如通过挑选细菌菌落)以及提取质粒DNA以获得核糖开关的质粒子文库(在本文中称为初级子文库)；
在各实施方案中，通过将初级子文库引入细菌中，收集细菌克隆以及分离质粒DNA来从核糖开关的初级质粒子文库产生核糖开关的二级子文库。接着将初级或二级子文库引入真核细胞中，使真核细胞与配体接触，并且测量报道基因的表达以确定文库中的一个或多个适体是否在真核细胞的情形下结合配体。
在一个实施方案中，本发明包括一种结合靶标配体的适体，其中所述适体通过以上方法来选择。在本发明的实施方案中，适体包含序列SEQ ID NO:14至27。在一个实施方案中，适体序列包括序列SEQ ID NO:24。
在另一方面，本发明提供一种用于选择在真核细胞中结合适体的配体的方法，其包括以下步骤：
(a)提供配体文库，
(b)提供用于达成配体介导的报道基因表达的多核苷酸盒，
(c)将所述多核苷酸盒引入所述真核细胞中，
(d)使单独各组的所述真核细胞与所述配体文库的成员接触，和
(e)测量所述报道基因的表达，
其中所述多核苷酸盒包含侧接5′内含子和3′内含子的选择性剪接外显子，以及核糖开关，所述核糖开关包含(i)效应子区，其包含包括所述3′内含子的5′剪接位点的茎，和(ii)适体，其中所述选择性剪接外显子包含当所述选择性剪接外显子被剪接至报道基因mRNA中时与所述报道基因符合读框的终止密码子。
在一个实施方案中，配体是小分子。在一个实施方案中，小分子配体对于真核细胞是外源性的。在另一实施方案中，配体是由真核细胞产生的分子，包括例如代谢物、核酸、维生素、辅因子、脂质、单糖和第二信使。
在一个实施方案中，真核细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和酵母细胞。在一个实施方案中，真核细胞源于小鼠、人、蝇(例如黑腹果蝇)、鱼(例如斑马鱼)或线虫(例如秀丽隐杆线虫)。
在一个实施方案中，报道基因选自由荧光蛋白、荧光素酶、β-半乳糖苷酶和辣根过氧化物酶组成的组。在一个实施方案中，报道基因是细胞因子、信号传导分子、生长激素、抗体、调控性RNA、治疗性蛋白质、或肽。在一个实施方案中，当配体特异性结合适体时的报道基因的表达是当不存在配体时的报道基因表达水平的大于约10倍。在其他实施方案中，当配体特异性结合适体时报道基因的表达是当不存在配体时的报道基因表达水平的大于约20、50、100、200、500或1,000倍。
在一个实施方案中，5′内含子和3′内含子源于人β-球蛋白基因的内含子2。在一个实施方案中，5′内含子包含与靶基因符合读框的终止密码子。在一个实施方案中，5′内含子和3′内含子的长度各自独立地是约50至约300个核苷酸。在一个实施方案中，5′内含子和3′内含子的长度各自独立地是约125至约240个核苷酸。在一个实施方案中，5′内含子和/或3′内含子已被修饰来包括内含子剪接增强子、外显子剪接增强子、5′剪接位点、3′剪接位点或分支点序列，或改变其序列。
在一个实施方案中，核糖开关的效应子区茎的长度是约7至约20个碱基对。在一个实施方案中，效应子区茎的长度是8至11个碱基对。
在一个实施方案中，选择性剪接外显子源于人二氢叶酸还原酶基因(DHFR)的外显子2、突变人威尔姆斯肿瘤1的外显子5、小鼠钙/钙调蛋白依赖性蛋白质激酶IIδ外显子16或SIRT1外显子6。在一个实施方案中，选择性剪接外显子是经修饰DHFR外显子2。在一个实施方案中，选择性剪接外显子已在由以下项组成的组中的一者或多者方面加以修饰：改变外显子剪接沉默子的序列、改变外显子剪接增强子的序列、添加外显子剪接增强子以及添加外显子剪接供体。在一个实施方案中，选择性剪接外显子是合成的(即并非源于天然存在的外显子)。
在一个实施方案中，本发明包括一种通过以上方法来选择的配体。
在另一方面，本发明提供一种用于将随机化适体文库分成较小适体子文库的方法，其包括以下步骤：
(a)提供随机化适体文库，其中所述文库中的适体包含多个5′恒定区和3′恒定区以及一个或多个随机化核苷酸，
(b)使用作为模板的所述随机化适体文库以及互补于所述5′恒定区和所述3′恒定区的第一引物和第二引物进行双循环PCR，
(c)分离所述双循环PCR的产物，以及
(d)使用互补于一子组的独特5’恒定区和3’恒定区的引物对所述双循环PCR的一子组的经分离产物进行PCR扩增。
在一个实施方案中，随机化适体文库包含具有一个或多个随机化核苷酸的适体。在一个实施方案中，随机化适体文库包含超过约100,000个适体。在一个实施方案中，随机化适体文库包含超过约1,000,000个适体。
在一个实施方案中，双循环PCR中的第一引物或第二引物包含选自由以下项组成的组的标记：生物素、地高辛(DIG)、溴脱氧尿苷(BrdU)、荧光团、例如硫醇基团的化学基团、或用于点击化学中的化学基团例如叠氮化物。
附图说明
图1a.核糖开关构建体的示意图。截短β-球蛋白内含子序列插入报道基因的编码序列中，并且含有终止密码子的突变DHFR外显子2(mDHFR)放置在插入的内含子中，由此形成三外显子基因表达平台，通过用该三外显子基因表达平台包括/排除mDHFR外显子来调控报道基因表达。形成发夹/茎结构，其包括在mDHFR外显子的下游(3′)的内含子中的的U1结合位点以及互补于U1结合位点的经工程改造序列，所述发夹/茎结构阻断U1结合，由此导致对含有终止密码子的mDHFR外显子的排除和靶基因表达。将适体序列移植在U1结合位点与它的互补序列之间，从而允许由适体/配体结合控制发夹形成。
图1b.具有含有基于不同适体的核糖开关的调控盒的构建体的剂量响应。鸟嘌呤核糖开关通过不仅应答于鸟嘌呤处理，而且也应答于鸟苷处理来诱导报道基因表达。
图1c和图1d.显示在用鸟嘌呤类似物处理后xpt-G17核糖开关诱导荧光素酶活性的图。
图1e.在用化合物处理后由xpt-G17核糖开关达成的荧光素酶活性诱导倍数。
图2.用于产生随机化适体序列的模板的示意图。适体序列(空白棒条)侧接恒定区(黑色棒条)，所述恒定区含有BsaI位点以有助于将适体克隆至基因调控盒中来产生核糖开关。
图3a至图3e.对用于将大型随机化适体文库分成较小子文库的方法的示意性描述。
图3a.用于拆分大型适体文库的两步策略的示意图。第一步骤在于将一对独特序列标签添加至各适体寡核苷酸模板中。在第一步骤之后，具有独特标签序列的模板使用对标签化序列具有特异性的引物来扩增。
图3b.用以使标签序列连接于模板的三种方法：使用在引物的5′末端含有标签序列的引物通过PCR来并有标签序列(I)；通过T4 RNA连接酶使单链模板序列与单链标签序列连接来连接标签序列(II)；通过T4 DNA连接酶使双链模板序列与双链标签序列连接来使标签序列连接于模板(III)。
图3c.双循环PCR的示意图。对于循环1，仅有在5′末端含有标签序列的反向引物JR。在第一循环之后，新合成的链在它的5′末端具有序列标签。对于循环2，将经生物素标记的正向引物JF添加至可仅使用新合成的链作为模板的PCR反应中，由此产生在5′末端与3′末端两者处均具有标签序列以及在5′端具有生物素分子的模板。
图3d.产生标签化适体文库。在用序列标签和生物素分子标记模板之后，链霉亲和素珠粒用于通过使寡聚物变性和珠粒洗涤来使经标记/标签化单链模板与其余反应组分分离。接着，使用对标签化序列具有特异性的引物(F引物和R引物)的混合物来扩增和扩大标签化模板，由此产生准备用于后续PCR的标签化适体文库，所述后续PCR使用单一一对标签序列特异性引物来产生原始适体文库的子文库。
图3e.使用拆分策略，对适体的子文库进行PCR扩增。适体文库(106，如实施例2中所产生)通过使用2个正向引物(JF1-2)和8个反向引物(JR1-8)，采用为1、2.3或4.6的模板拷贝数进行PCR来加以标签化。经分离标签化模板通过标签特异性引物F1-2和R1-8的混合物来扩大，并且使PCR产物经受用通用引物(左侧小图)、单一一对标签特异性引物F1和R1(中间小图)或单一一对非相关引物F3和R1(右侧小图)进行的PCR。水用作模板的空白对照。
图4.对用于核糖开关文库筛选的基于细胞的测定的灵敏性测试。使构建体xpt-G17与构建体SR-mut以不同分子比率混合，并且将混合构建体DNA转染至HEK-293细胞中并用鸟嘌呤处理。将荧光素酶活性的诱导倍数计算为用鸟嘌呤诱导的荧光素酶活性除以在无鸟嘌呤处理下获得的荧光素酶活性。
图5a.构建含有核糖开关的质粒文库的示意图。首先使用通用引物对单链适体寡聚物进行PCR扩增以使单链适体模板转变成双链。双链寡聚物接着用BsaI消化并连接于经BsaI消化的载体以产生具有核糖开关的构建体。接着将质粒DNA电穿孔至电感受态DH5a细胞中。收集超过5×106个菌落以涵盖初始适体文库(106)的超过99％。
图5b.将核糖开关的质粒文库分成子文库的示意图。将核糖开关的质粒文库转化至化学感受态DH5a细胞中。接着将经转化细菌涂铺至琼脂板中。从各个别琼脂板收集一定数目的细菌菌落，并且分别从个别菌落收集物提取质粒DNA。从各菌落收集物获得的质粒DNA形成核糖开关子文库。划分方法可被重复直至实现所需大小的子文库。
图5c.通过下一代测序测定的二级核糖开关子文库的独特序列组成。具有来自测序操作的超过12个读段的序列被视为真实序列。
图5d.从同一初级子文库P1S_003产生的两个二级子文库之间的独特序列组成比较。饼图指示各子文库中独特序列的数目和两个核糖开关文库之间的重叠序列的数目。
图5e.分别从不同初级子文库P1S_003和P1S_007产生的两个二级子文库之间的独特序列组成比较。饼图指示各子文库中独特序列的数目和两个核糖开关文库之间的重叠序列的数目。
图6a和图6b.使来自100个初级子文库(60k)中的6个(图6a)或100个二级子文库(大小是600)(图6b)的质粒DNA以96孔板的形式阵列化，并且转染至HEK-293细胞中。将荧光素酶活性的诱导倍数计算为用鸟嘌呤诱导的荧光素酶活性除以在无鸟嘌呤处理下获得的荧光素酶活性。
图6c.使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)作为配体获得的核糖开关子文库筛选结果。使P2核糖开关文库的子文库以96孔形式阵列化。将HEK 293细胞涂铺在96孔板中，并且用核糖开关文库DNA转染。在转染之后4小时，用100μM NAD+处理细胞。在NAD+处理之后20小时测量荧光素酶活性。将诱导倍数计算为从NAD+处理细胞获得的荧光素酶活性除以从未用NAD+处理的细胞获得的荧光素酶活性的比率。散点图中的各点代表如所指示由子文库或G17构建体获得的诱导倍数。
图6d.使用NAD+作为配体获得的核糖开关筛选结果。使各个别核糖开关构建体以96孔形式阵列化。将HEK 293细胞涂铺在96孔板中，并且用核糖开关构建体转染。在转染之后4小时，用100μM NAD+处理细胞。在NAD+处理之后20小时测量荧光素酶活性。将诱导倍数计算为从NAD+处理细胞获得的荧光素酶活性除以从未用NAD+处理的细胞获得的荧光素酶活性的比率。散点图中的各点代表如所指示由各单一核糖开关构建体或G17构建体获得的诱导倍数。
图6e和图6f.相较于G17核糖开关，具有新适体序列的构建体显示以剂量依赖性方式对NAD+处理的增强应答。用G17或具有新适体序列的构建体#46转染HEK 293细胞。在转染之后4小时，用不同剂量的NAD+处理细胞。在NAD+处理之后20小时测量荧光素酶活性。将诱导倍数计算为从NAD+处理细胞获得的荧光素酶活性除以从未用NAD+处理的细胞获得的荧光素酶活性的比率。
具体实施方式
筛选适体/配体的方法
本发明提供用以鉴定在真核细胞、组织或生物体的情形下结合配体的适体和结合适体的配体的筛选方法。在一个方面，本发明提供一种用于选择在真核细胞中结合配体的适体的方法，其包括以下步骤：
(a)提供适体文库，
(b)将所述适体文库的成员引入用于达成配体介导的报道基因表达的多核苷酸盒中，
(c)将所述含适体多核苷酸盒引入真核细胞中，以及
(d)使所述真核细胞与配体接触，以及
(e)测量所述报道基因的表达。
在另一方面，本发明提供一种用于选择在真核细胞中结合适体的配体的方法，其包括以下步骤：
(a)提供配体文库，
(b)提供用于达成配体介导的报道基因表达的多核苷酸盒，
(c)将所述多核苷酸盒引入所述真核细胞中，
(d)使单独各组的所述真核细胞与所述配体文库的成员接触，以及
(e)测量所述报道基因的表达。
在一个实施方案中，本发明提供用以鉴定结合细胞内分子的适体的方法，其包括以下步骤：
(a)提供适体文库，
(b)将所述适体文库的成员引入用于达成配体介导的报道基因表达的多核苷酸盒中，
(c)将所述含适体多核苷酸盒引入真核细胞中，以及
(d)测量所述报道基因的表达。
本发明的筛选方法利用PCT/US2016/016234中公开的基因调控多核苷酸盒，所述专利以引用的方式整体并入本文。这些基因调控盒包含在5′内含子–选择性外显子–3′内含子的情形下的核糖开关。基因调控盒是指重组DNA构建体，其在并入靶基因(例如报道基因)的DNA中时提供通过适体/配体介导的对所得前mRNA的选择性剪接来调控所述靶基因的表达的能力。基因调控盒进一步包含核糖开关，其含有共同负责感测结合适体的配体的存在以及改变对选择性外显子的剪接的感测区(例如适体)和效应子区。这些适体驱动核糖开关应答于用结合适体的配体进行的处理在2至2000倍诱导下提供对哺乳动物基因表达的调控。这个合成核糖开关的空前高度动态调控范围在本发明方法中用于提供在细胞、组织和生物体中针对所需类型的配体的新适体以及针对已知和新型适体的最优配体的筛选系统。
核糖开关
如本文所用的术语“核糖开关”是指RNA多核苷酸(或编码所述RNA多核苷酸的DNA)的调控性区段。在本发明的情形下，核糖开关含有共同负责感测配体(例如小分子)的存在以及改变对选择性外显子的剪接的感测区(例如适体)和效应子区。在一个实施方案中，核糖开关是重组的，利用来自两个或更多个来源的多核苷酸。如本文在核糖开关的情形下所用的术语“合成”是指核糖开关不是天然存在的。在一个实施方案中，感测区和效应子区由多核苷酸接头接合。在一个实施方案中，多核苷酸接头形成RNA茎(即RNA多核苷酸的双链区域)。
在用于达成配体介导的报道基因表达的多核苷酸盒的情形下，如本文所述的核糖开关文库包含相差一个或多个核苷酸的多个适体序列。因此，文库中的各适体连同感测区一起在如本文所述的5′内含子–选择性外显子–3′内含子的情形下。
效应子区
在一个实施方案中，效应子区包含3′内含子的5′剪接位点(“5′ss”)序列(即紧靠在选择性外显子的3′的内含子剪接位点序列)。效应子区包含3′内含子的5′ss序列和互补于3′内含子的5′ss序列的序列。当适体结合它的配体时，效应子区形成茎，因此阻止在选择性外显子的3′末端对剪接供体位点的剪接。在某些条件下(例如当适体未结合于它的配体时)，效应子区在提供用以到达在选择性外显子的3′末端的剪接供体位点的进路的情形下，从而导致在靶基因mRNA中包括选择性外显子。
效应子区的茎部分应具有足够长度(和GC含量)以在配体结合适体后实质上阻止对选择性外显子的选择性剪接，而当配体不足量存在时也允许到达剪接位点。在本发明的实施方案中，除3′内含子的5′ss序列和它的互补序列之外，效应子区的茎部分也包含茎序列。在本发明的实施方案中，这个额外茎序列包括来自适体茎的序列。茎部分的长度和序列可使用已知技术来修改以鉴定当不存在配体时允许达成靶基因的可接受背景表达以及当存在配体时允许达成靶基因的可接受表达水平的茎。如果茎例如太长，那么它可能在存在或不存在配体下遮掩用以到达3′内含子的5′ss序列的进路。如果茎太短，那么它可能不形成能够隔绝3′内含子的5′ss序列的稳定茎，在所述情况下，选择性外显子将在存在或不存在配体下被剪接至靶基因信息中。在一个实施方案中，效应子区茎的总长度在约7个碱基对至约20个碱基对之间。在一些实施方案中，茎的长度在约8个碱基对至约11个碱基对之间。在一些实施方案中，茎的长度是8个碱基对至11个碱基对。除茎的长度之外，也可改变茎的GC碱基对含量以改进茎的稳定性。
适体/配体
如本文所用的术语“适体”是指特异性结合配体的RNA多核苷酸(或编码所述RNA多核苷酸的DNA)或被筛选以鉴定与配体的特异性结合的RNA多核苷酸(即预期适体)。适体文库是包含具有与文库的其他成员相差至少一个核苷酸的核苷酸序列的多个预期适体的预期适体集合。
术语“配体”是指由适体特异性结合的分子或关于结合一种或多种适体的能力加以筛选的预期配体。配体文库是配体和/或预期配体的集合。
在一个实施方案中，配体是低分子量(小于约1,000道尔顿(Dalton))分子，包括例如脂质、单糖、第二信使、辅因子、金属离子、其他天然产物和代谢物、核酸以及大多数治疗性药物。在一个实施方案中，配体是具有2个或更多个核苷酸碱基的多核苷酸。
在一个实施方案中，配体选自由以下项组成的组：8-氮杂鸟嘌呤、5'单磷酸腺苷单水合物、两性霉素B(amphotericin B)、阿维菌素B1(avermectin B1)、咪唑硫嘌呤(azathioprine)、乙酸氯地孕酮(chlormadinone acetate)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、盐酸莫立昔嗪(moricizine hydrochloride)、N6-甲基腺苷、辅酶I(nadide)、孕酮(progesterone)、盐酸丙嗪(promazine hydrochloride)、双羟萘酸吡维铵(pyrviniumpamoate)、磺胺胍(sulfaguanidine)、丙酸睾酮(testosterone propionate)、硫代鸟苷(thioguanosine)、泰洛沙泊(Tyloxapol)和伏立诺他(Vorinostat)。
在某些实施方案中，本发明方法用于鉴定结合多核苷酸盒中的适体，由此导致报道基因的表达的是细胞内分子的配体(即内源性配体)。举例来说，可使具有含有用于达成适体/配体介导的表达的多核苷酸盒的报道基因的细胞暴露于诸如热、生长、转化或突变的条件，从而导致可结合适体并导致所述报道基因的表达的细胞信号传导分子、代谢物、肽、脂质、离子(例如Ca2+)等的变化。因此，本发明方法可用于鉴定应答于细胞内的细胞状态变化来结合细胞内配体的适体，所述变化包括例如细胞信号传导、细胞代谢或突变的变化。在另一实施方案中，本发明用于鉴定结合存在于分化细胞中的细胞内配体的适体。举例来说，本发明方法可用于鉴定存在于诱导多能干细胞中的配体或结合所述配体的适体。在一个实施方案中，本发明方法可用于筛选对体内细胞分化的应答或体内细胞生理变化。
适体配体也可为在特定生理/病理状况诸如致癌性转化下显著增加的细胞内源性组分–这些组分可包括第二信使分子诸如GTP或GDP、钙；脂肪酸或不当代谢的脂肪酸诸如在乳腺癌的情况下的13-HODE(Flaherty,JT等,Plos One,第8卷,e63076,2013，其以引用的方式并入本文)；氨基酸或氨基酸代谢物；糖酵解路径中的通常在癌细胞中或在代谢疾病的情况下在正常细胞中具有较高水平的代谢物；以及癌症相关分子诸如Ras或突变Ras蛋白、在肺癌的情况下的突变EGFR、在许多类型的癌症的情况下的吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)。内源性配体包括在乳腺癌的情况下的孕酮代谢物，如由JP Wiebe(Endocrine-RelatedCancer(2006)13:717–738，其以引用的方式并入本文)所公开。内源性配体也包括在肾癌的情况下由于关键代谢酶的突变而水平增加的代谢物，诸如乳酸、谷胱甘肽、犬尿氨酸，如由Minton,DR和Nanus,DM(Nature Reviews,Urology,第12卷,2005，其以引用的方式并入本文)所公开。
适体与配体结合的特异性可根据相较于所述适体对无关分子的解离常数，所述适体对它的配体的比较解离常数(Kd)来确定。因此，配体是相比于与无关物质的结合，以更大亲和力结合适体的分子。通常，，适体对它的配体的Kd将是适体与无关分子的Kd的至少约10倍小。在其他实施方案中，Kd将是至少约20倍小、至少约50倍小、至少约100倍小以及至少约200倍小。适体的长度将通常在约15与约200个核苷酸之间。更通常，适体的长度将在约30与约100个核苷酸之间。
可作为核糖开关的一部分并入以及通过本发明方法来筛选的适体可为天然存在的适体或其修饰形式、或通过指数富集对配体进行系统进化(SELEX)来加以重新设计或合成筛选的适体。结合小分子配体的适体的实例包括但不限于茶碱(theophylline)、多巴胺(dopamine)、磺酰罗丹明B(sulforhodamine B)以及纤维二糖卡那霉素A、青紫霉素(lividomycin)、妥布霉素(tobramycin)、新霉素B(neomycin B)、紫霉素(viomycin)、氯霉素(chloramphenicol)、链霉素(streptomycin)、细胞因子、细胞表面分子和代谢物。对于识别小分子的适体的综述，参见例如Famulok,Science 9:324-9(1999)以及McKeague,M.和DeRosa,M.C.J.Nuc.Aci.2012。在另一实施方案中，适体是互补性多核苷酸。
在一个实施方案中，对适体进行预筛选以在体外结合特定小分子配体。用于设计适体的所述方法包括例如SELEX。用于使用SELEX来设计选择性结合小分子的适体的方法例如公开于以引用的方式并入本文的美国专利号5,475,096、5,270,163以及Abdullah Ozer,等人，Nuc.Aci.2014中。SELEX方法的修改形式描述于以引用的方式并入本文的美国专利号5,580,737和5,567,588中。
用于鉴定适体的先前选择技术通常涉及制备含有随机化区域或诱变区域的具有所需长度的DNA或RNA分子的大型汇合物。举例来说，用于适体选择的寡核苷酸汇合物可能含有具有20-100个随机化核苷酸的区域，所述区域侧接长度是约15-25个核苷酸以及适用于结合PCR引物的具有确定序列的区域。寡核苷酸汇合物使用标准PCR技术或允许扩增所选核酸序列的其他手段来扩增。当需要RNA适体时，可在体外转录DNA汇合物以产生RNA转录物的汇合物。接着使RNA或DNA寡核苷酸的汇合物经受基于它们特异性结合所需配体的能力所进行的选择。选择技术包括例如亲和色谱法，但可使用将允许基于核酸特异性结合另一分子的能力来选择它们的任何方案。用于鉴定在细胞内结合小分子以及起作用的适体的选择技术可涉及基于细胞的筛选方法。在亲和色谱法的情况下，使寡核苷酸与已固定在管柱中的基材上或磁珠上的靶标配体接触。优选在盐浓度、温度和模拟正常生理条件的其他条件存在下关于配体结合来选择寡核苷酸。汇合物中结合配体的寡核苷酸被保留在管柱或珠粒上，并且非结合序列被洗除。接着通过PCR(通常在洗脱之后)来使结合配体的寡核苷酸扩增(如果利用RNA转录物，那么在逆转录之后)。持续总计约3至10轮迭代选择程序来对所选序列重复选择过程。接着使用标准程序来对所得寡核苷酸进行扩增、克隆和测序以鉴定能够结合靶标配体的寡核苷酸的序列。一旦已鉴定适体序列，所述适体即可通过从包含诱变适体序列的寡核苷酸的汇合物开始进行额外各轮选择来进一步优化。
在一个实施方案中，用于本发明中的适体或适体文库包含一个或多个在体外适体筛选中鉴定的适体。在一个实施方案中，在体外适体筛选中鉴定的适体具有一个或多个被随机化来创建用于本发明方法中的预期适体文库的核苷酸。
选择性外显子
是本发明的基因调控多核苷酸盒的一部分的选择性外显子可为能够被转录成前mRNA以及选择性剪接至靶基因的mRNA中的任何多核苷酸序列。是本发明的基因调控盒的一部分的选择性外显子含有至少一个抑制翻译的序列以使当选择性外显子被包括在靶基因mRNA中时，靶基因从那个mRNA的表达被阻止或降低。在一优选实施方案中，选择性外显子含有当选择性外显子通过剪接来被包括在靶基因mRNA中时与靶基因符合读框的终止密码子(TGA、TAA、TAG)。在各实施方案中，除终止密码子之外或作为终止密码子的替代物，选择性外显子包含当选择性外显子通过剪接来被并入靶基因mRNA中时降低或实质上阻止翻译的其他序列，包括例如导致mRNA降解的微小RNA结合位点。在一个实施方案中，选择性外显子包含导致mRNA降解的miRNA结合序列。在一个实施方案中，选择性外显子编码多肽序列，其使含有这个多肽序列的蛋白质的稳定性降低。在一个实施方案中，选择性外显子编码多肽序列，其引导含有这个多肽序列的蛋白质达成降解。
选择性外显子的基础或背景剪接水平可通过改变外显子剪接增强子(ESE)序列和外显子剪接抑制子(ESS)序列和/或通过将ESE或ESS序列引入选择性外显子中来优化。对选择性外显子的序列的所述变化可使用本领域中已知的方法来实现，所述方法包括但不限于定点诱变。或者，具有所需序列(例如包含选择性外显子的全部或一部分)的寡核苷酸可从商业来源获得，并且克隆至基因调控盒中。对ESS和ESE序列的鉴定可通过本领域中已知的方法来实现，包括例如使用ESEfinder 3.0(Cartegni,L.等人，ESEfinder:a web resourceto identify exonic splicing enhancers.Nucleic Acid Research,2003,31(13):3568-3571)和/或其他可用资源。
在一个实施方案中，选择性外显子对于靶基因是外源性的，但它可源于起源于靶基因将在其中表达的生物体的序列。在一个实施方案中，选择性外显子是合成序列。在一个实施方案中，选择性外显子是天然存在的外显子。在另一实施方案中，选择性外显子源于已知外显子的全部或一部分。在这个情形下，“源于”是指含有选择性外显子的序列与天然存在的外显子或其一部分大致上同源，但可含有各种突变，例如用以引入将与靶标报道基因序列符合读框的终止密码子，或用以引入或缺失外显子剪接增强子和/或引入或缺失外显子剪接抑制子。在一个实施方案中，选择性外显子源于人二氢叶酸还原酶基因(DHFR)的外显子2、突变人威尔姆斯肿瘤1的外显子5、小鼠钙/钙调蛋白依赖性蛋白质激酶IIδ外显子16或SIRT1外显子6。
5′内含子序列和3′内含子序列
选择性外显子侧接5′内含子序列和3′内含子序列。可用于基因调控盒中的5′内含子序列和3′内含子序列可为可被剪接出靶基因，从而视存在或不存在结合适体的配体而定，产生靶基因mRNA或产生在mRNA中包含选择性外显子的靶基因的任何序列。5′内含子和3′内含子各自具有为发生剪接所必需的序列，即剪接供体序列、剪接接受体序列和分支点序列。在一个实施方案中，基因调控盒的5′内含子序列和3′内含子序列源于一个或多个天然存在的内含子或其一部分。在一个实施方案中，5′内含子序列和3′内含子序列源于截短人β-球蛋白内含子2(IVS2Δ)。在其他实施方案中，5′内含子序列和3′内含子序列源于SV40mRNA内含子(用于来自Clontech的pCMV-LacZ载体中)、人磷酸丙糖异构酶(TPI)基因的内含子6(Nott Ajit,等人，RNA.2003,9:6070617)、或来自人因子IX的内含子(SumikoKurachi等人，J.Bio.Chem.1995,270(10),5276)、靶基因的自身内源性内含子、或含有足以达成经调控剪接的元件(Thomas A.Cooper,Methods 2005(37):331)的任何基因组片段或合成内含子(Yi Lai,等人，Hum Gene Ther.2006:17(10):1036)。
在一个实施方案中，本发明的选择性外显子和核糖开关被工程改造来处于靶基因的内源性内含子中。也就是说，内含子(或大致上类似的内含子序列)天然存在于靶基因的那个位置处。在这个情况下，紧靠在选择性外显子的上游的内含子序列被称为5′内含子或5′内含子序列，并且紧靠在选择性外显子的下游的内含子序列被称为3′内含子或3′内含子序列。在这个情况下，内源性内含子被修饰来含有侧接于选择性外显子的5′末端和3′末端的剪接接受体序列和剪接供体序列。
本发明的基因调控盒中的剪接供体位点和剪接接受体位点可被修饰以得以强化或弱化。也就是说，剪接位点可通过标准克隆方法、定点诱变等来被修饰以更接近于剪接供体或接受体的共有序列。更类似于剪接共有序列的剪接位点倾向于促进剪接，因此得以强化。与剪接共有序列的类似性较小的剪接位点倾向于阻碍剪接，因此得以弱化。最常见类别的内含子(U2)的剪接供体的共有序列是A/C A G||G T A/G A G T(其中||表示外显子/内含子边界)。剪接接受体的共有序列是C A G||G(其中||表示外显子/内含子边界)。在剪接供体和接受体位点处的特定核苷酸的频率描述于本领域中(参见例如Zhang,M.Q.,Hum MolGenet.1988.7(5):919-932)。可调整5′剪接位点和3′剪接位点的强度以调节对选择性外显子的剪接。
可对基因调控盒中的5′内含子和3′内含子进行额外修饰以调节剪接，包括修饰、缺失和/或添加内含子剪接增强子元件和/或内含子剪接抑制子元件，和/或修饰分支位点序列。
在一个实施方案中，5′内含子已被修饰来含有将与报道基因符合读框的终止密码子。5′内含子序列和3′内含子序列也可被修饰来移除可用可公开获得的软件鉴定的隐蔽剪接位点(参见例如Kapustin,Y.等人，Nucl.Acids Res.2011.1-8)。可调整5′内含子序列和3′内含子序列的长度以例如满足病毒表达构建体的大小要求。在一个实施方案中，5′内含子序列和3′内含子序列的长度独立地是约50至约300个核苷酸。在一个实施方案中，5′内含子序列和3′内含子序列的长度独立地是约125至约240个核苷酸。
报道基因
本发明的筛选方法利用用于调控可在靶标细胞、组织或生物体中表达的靶基因(例如报道基因)的表达的基因调控盒。报道基因可为其表达可用于检测配体与基因调控盒中的适体的特异性相互作用的任何基因。在一个实施方案中，报道基因编码荧光蛋白，包括绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色荧光蛋白、红色荧光蛋白或可开关荧光蛋白。在另一实施方案中，报道基因编码荧光素酶，包括例如萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶或分泌性长腹水蚤荧光素酶。在一个实施方案中，报道基因是β-半乳糖苷酶。在一个实施方案中，报道体是辣根过氧化物酶(HRP)。在一个实施方案中，报道基因选自由以下项组成的组：核蛋白质、转运体、细胞膜蛋白质、细胞骨架蛋白质、受体、生长激素、细胞因子、信号传导分子、调控性RNA、抗体和治疗性蛋白质或肽。
表达构建体
本发明涵盖使用重组载体来向靶标细胞中引入编码报道基因以及含有本发明的基因调控盒的多核苷酸。在许多实施方案中，本发明的重组DNA构建体包括额外DNA元件，所述元件包括提供DNA在宿主细胞中的复制以及靶基因在那个细胞中在适当水平下的表达的DNA区段。普通技术人员了解的是基于表达控制序列(启动子、增强子等)促进报道基因在靶标细胞中的表达的能力对它们进行选择。“载体”意指包含待在体外或在体内递送至宿主细胞中的多核苷酸的重组质粒、酵母人工染色体(YAC)、小型染色体、DNA小环或病毒(包括病毒源性序列)。在一个实施方案中，重组载体是病毒载体或多个病毒载体的组合。用于达成适体介导的在靶标细胞中的报道基因表达的病毒载体在本领域中是已知的，并且包括腺病毒(AV)载体、腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒和慢病毒载体、以及1型单纯性疱疹(HSV1)载体。
用于将适体文库分成子文库的方法
本发明的另一方面提供用以将大型寡核苷酸文库分成较小子文库的方法以及用以制备基于适体的合成核糖开关的细胞测定可筛选质粒文库的方法。本发明的一个方面提供一种用于将寡核苷酸文库分成较小子文库的方法，其包括以下步骤：
(a)提供寡核苷酸文库，其中所述文库中的寡核苷酸包含多个5′恒定区和3′恒定区，
(b)使用作为模板的所述寡核苷酸文库以及互补于所述5′恒定区和所述3′恒定区的第一引物和第二引物进行双循环PCR，
(c)分离所述双循环PCR的产物，和
(d)使用互补于一子组的独特5′恒定区和3′恒定区的引物对所述双循环PCR的一子组的经分离产物进行PCR扩增。
在一个实施方案中，寡核苷酸文库是含有一个或多个随机化核苷酸的随机化适体文库。适体序列侧接含有用于后续克隆的限制位点的左侧恒定区和右侧恒定区。
在一个实施方案中，双循环PCR中的第一引物或第二引物包含选自由以下项组成的组的标记：生物素、地高辛(DIG)、溴脱氧尿苷(BrdU)、荧光团、例如硫醇基团的化学基团、或用于点击化学中的化学基团例如叠氮化物。这些分子可连接于寡核苷酸，并且可将它们的相互作用分子诸如针对生物素的链霉亲和素或经修饰形式的亲和素、针对DIG或BrdU或荧光团的抗体、或用以形成二硫化物的第二硫醇基团、针对叠氮化物的炔基团固定在固体表面上以有助于分离经标记寡核苷酸。
一旦适体文库被分成适体子文库，就将一个或多个子文库中的适体引入基因调控多核苷酸盒中以产生核糖开关文库，并且通过本文提供的方法来关于配体结合加以筛选。
用于将核糖开关文库分成子文库的方法
在一个方面，本发明提供一种用于将核糖开关文库分成子文库的方法。如本文所用的核糖开关文库是包含例如如本文以及PCT/US2016/016234中所述的基因调控多核苷酸盒的质粒文库，其包含多个适体，其中所述文库中的个别成员包含不同于所述文库的其他成员的适体序列。在各实施方案中，核糖开关文库中的适体包含一个或多个随机化核苷酸。在各实施方案中，质粒核糖开关文库由通过本文所述的方法来创建的适体子文库产生。
用于将核糖开关文库分成子文库的方法包括以下步骤：
(a)将适体文库引入包含本文所述的基因调控多核苷酸盒的质粒中以制备核糖开关文库；
(b)将所述核糖开关文库引入细菌(例如大肠杆菌)中；
(c)收集细菌克隆(例如通过挑选细菌菌落)以及提取质粒DNA以获得核糖开关的质粒子文库(在本文中称为初级子文库)；
(d)任选地，通过将初级子文库引入细菌中，收集细菌克隆以及分离质粒DNA来从核糖开关的初级质粒子文库产生核糖开关的二级子文库。
用于将序列引入质粒中以产生文库的方法在本领域中是已知的，用于将质粒引入细菌中以及获得细菌克隆的方法在本领域中也是已知的。含有质粒核糖开关文库的成员的细菌克隆可通过涂铺细菌以及挑选个别菌落来收集。来自这些克隆的汇合质粒形成子文库。收集的细菌克隆的数目决定核糖开关子文库的大小(独特成员的数目)，并且可产生多个子文库。可进一步划分一个或多个初级子文库以创建二级子文库来进一步降低子文库的大小。使用本文所述的方法，通过将一个或多个子文库引入真核细胞中，使所述细胞暴露于目标配体，以及测量由基因调控多核苷酸盒所致的报道基因表达来筛选子文库。应答于配体的报道基因表达增加指示文库的一个或多个成员包含在核糖开关的情形下的结合配体的适体。因此，可被筛选的子文库的大小可由用于测量报道基因表达的测定的灵敏性决定。在本发明的实施方案中，子文库包含约50至约600个独特成员(但一些成员可在其他子文库中得以重复)。
应了解和预期可由本领域普通技术人员进行符合本文公开的本发明的原理的变化，并且意图所述修改将被包括在本发明的范围内。本文引用的所有参考文献都据此以引用的方式整体并入本文。以下实施例进一步说明本发明，但不应被解释为限制本发明的范围。
实施例1
使用基于剪接的基因调控核糖开关进行的基于哺乳动物细胞的适体/配体筛选。
程序：
构建核糖开关：如以引用的方式并入本文的PCT/US2016/016234(特别是实施例3至6)中所述构建核糖开关。合成截短人β-球蛋白内含子序列，并且插入萤火虫荧光素酶基因的编码序列中。合成突变人DHFR外显子2，并且使用Golden gate克隆策略来插入这个截短β-球蛋白内含子序列的中间。将包括xpt-G/A1、ydhl-G/A2、yxj3、add4、gdg6-G/A5的适体(关于所述适体的引文以引用的方式并入本文)合成为在5′末端具有个别地互补于两个不同BsaI位点的4核苷酸突出部分的寡核苷酸(“寡聚物”)(IDT)，退火并连接于经BsaI消化的mDHFR-Luci接受载体。
转染：在转染前一天，将3.5×104个HEK 293细胞涂铺在96孔平底板中。将质粒DNA(500ng)添加至管或96孔U形底板中。单独地，将TransIT-293试剂(Mirus；1.4μL)添加至50μL Opti-mem I培养基(Life Technologies)中，并且使其在室温(RT)下搁置5分钟。接着，将50μL的这个稀释转染试剂添加至DNA中，混合，并且在室温下孵育20分钟。最后，将7μL的这个溶液添加至96孔板中具有细胞的孔中。
对所培养细胞的萤火虫荧光素酶测定：在培养基更换之后24小时，将板从孵育器移除，并且在实验室工作台上平衡至室温持续数分钟，接着进行吸取。添加Glo溶解缓冲液(Promega，100μL，室温)，并且使板在室温下维持至少5分钟。接着，通过50μL湿磨来混合孔内含物，并且使20μL各样品与20μL已在glo溶解缓冲液中稀释至10％的bright-glo试剂(Promega)混合。在不透明白色384孔板上使96个孔分隔。在室温下孵育5分钟之后，使用Tecan机器以500毫秒读取时间测量发光。将荧光素酶活性表示为平均相对光单位(RLU)±S.D.，并且将诱导倍数计算为以鸟嘌呤处理获得的荧光素酶活性除以在无鸟嘌呤处理下获得的荧光素酶活性。
结果：
以荧光素酶作为报道基因起始，通过将人β-球蛋白内含子插入萤火虫荧光素酶的编码序列的中间，以及将含有终止密码子的突变人DHFR外显子2插入内含子部分中来创建基因表达平台。因此，报道基因表达由包括或排除含有与报道基因符合读框的终止密码子的mDHFR外显子来控制。在这个系统中，mRNA中由U1结合位点和所插入互补序列形成的发夹结构阻断对mDHFR外显子的包括，因此使得能够达成靶基因表达(图1a)。为使发夹结构的形成可调控，由此使靶基因表达可由小分子控制，我们将合成适体(茶碱)或天然适体(xpt-G/A、yxj、ydhl-A/G、add-A/G适体)或杂合适体gdg6-G/A移植至这个基于剪接的基因调控平台中介于U1结合位点与它的互补序列之间，并且产生调控哺乳动物细胞中的基因表达的合成核糖开关。通过使用我们的基于剪接的基因调控盒以及将不同适体插入我们的合成核糖开关构建体中，我们显示了在哺乳动物细胞的情形下对配体的不同功能性应答。具有鸟嘌呤适体的那些核糖开关对鸟嘌呤以及鸟苷起应答，如图1b中所示。xpt-鸟嘌呤核糖开关xpt-G17(公开于PCT/US2016/016234中，参见例如SEQ ID NO.:15，以引用的方式并入本文)在用它的天然配体处理的情况下产生报道基因表达的高度动态诱导范围。
尽管基于天然适体的核糖开关在调控哺乳动物细胞中的基因表达方面具有高度动态范围，但那些天然适体的配体的性质限制它们在体内的可适用性。在利用我们的采用核糖开关的高度动态基因调控平台的情况下，我们首先选择一列在N2位置处具有不同化学基团的鸟嘌呤类似物以测试它们对xpt-G17核糖开关的活性。如图1c中所示，在500μM浓度下，若干N2化合物在具有xpt-G17构建体的细胞中诱导荧光素酶活性，其中N2-苯氧乙酰基鸟嘌呤最强力(1303倍诱导)，如图1d中所示。为使用作潜在配体的化合物的清单扩大，Prestwick文库(1280个临床核准药物的集合)在100μM下用于筛选用以在哺乳动物细胞的情形下使已知适体活化的最优配体。如由初级筛选获得的图1e中所示，鸟嘌呤核糖开关xpt-G17不仅对鸟嘌呤起应答，而且也对如图1e中所示的8-氮杂鸟嘌呤、辅酶I、N6-甲基腺苷、丙酸睾酮、5’单磷酸腺苷单水合物、两性霉素B、硫鸟嘌呤、泰洛沙泊、孕酮和乙酸氯地孕酮以及如表1中所列的许多其他化合物起应答。引起兴趣的是，显示对xpt-G17核糖开关具有活性的这些化合物中的一些在结构上极其不同于鸟嘌呤或鸟苷。用其他8个嘌呤核糖开关进一步筛选Prestwick文库，并且获得可在诱导荧光素酶活性方面使核糖开关活化的许多化合物(表1)。这些结果显示核糖开关系统在发现在细胞环境中针对已知适体的潜在最优配体方面具有重要用途，从而进一步强调产生在将需要核糖开关在其内部起作用的细胞的情形下的适体的重要性。
表1.
以下提供用于Prestwick文库筛选中的核糖开关的序列，其具有以大写字母表示的茎序列和以小写字母表示的适体序列：
xpt-A8(SEQ ID NO：1)：
add-G6(SEQ ID NO：2)：
add-A6(SEQ ID NO：3)：
gdg6-A8(SEQ ID NO：4)：
gdg6-G8(SEQ ID NO：5)：
Ydhl-G8(SEQ ID NO：6)：
Ydhl-A6(SEQ ID NO：7)：
yxj-A6(SEQ ID NO：8)：
实施例2
设计和合成适体文库。
程序
为产生适体文库，使适体中在根据晶体结构6，7而鉴定为潜在参与配体结合的位置处的核苷酸随机化。为有助于将适体构建至核糖开关中，使适体区域侧接具有IIs型限制酶(例如BsaI)切割位点的恒定区。这个含有具有随机化碱基的适体序列的153bp超聚体寡核苷酸由IDT合成：GACTTCGGTCTCATCCAGAGAATGAAAAAAAAATCTTCAGTAGAAGGTAATGTATANNNGCGTGGATATGGCACGCNNGNNNNCNCCGGGCACCGTAAATGTCCGACTACATTACGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGAAGAGACCAGACGG(N代表随机核苷酸)(SEQ ID NO:9)。为在适体文库中产生更大序列多样性，可使在更多位置处的碱基随机化。完全随机序列也可用于产生适体文库。
结果
如实施例1中所述，我们已成功构造应答于小分子配体处理来调控哺乳动物基因表达的合成核糖开关。一个核糖开关xpt-G17含有在基于剪接的基因表达盒中的xpt-G鸟嘌呤适体。使用荧光素酶作为报道基因，我们实现应答于鸟嘌呤处理的高度动态范围的基因调控，其中在高浓度的鸟嘌呤下达成2000倍诱导。由适体/配体介导的选择性剪接构建体达成的这个空前动态范围的基因调控活性提供一种用以筛选在哺乳动物细胞中针对所需配体的适体，或筛选结合和活化已知适体的配体的系统。
xpt-G17被选作用以构造起始核糖开关文库的平台。设计寡核苷酸序列的构型以在之后克隆步骤中替换原始xpt-G鸟嘌呤适体。使xpt-G鸟嘌呤适体中在基于结晶学分析而得知对鸟嘌呤结合至关重要的位置处的核苷酸随机化。初始，使10个位置随机化，此产生具有1,048,576个适体序列的文库。当使超过10个位置随机化时，可产生大于106个序列的文库。尽管xpt-G鸟嘌呤适体骨架序列在此处选择性用于随机化，但类似方法可用于产生具有其他已知适体或不具有已知配体的甚至完全随机序列的适体文库。尽管我们在此处选择xpt-G17作为平台，但重要的是应注意具有不同适体的核糖开关或基于除剪接以外的机理的核糖开关也可作为起始平台用于产生随机化适体序列。
实施例3
将大型随机化适体文库分成较小适体子文库。
程序
寡核苷酸(寡聚物)：JF组或JR组的引物具有互补于合成适体寡聚物中的恒定区的3’部分序列和含有随机20聚体寡聚物序列的5’部分序列。F组或R组的引物互补于JF引物或JR引物中的随机20聚体寡聚物序列。所有引物都在IDT合成。JF引物在5’末端用生物素标记(IDT)。将合成寡聚物在无DNA酶和RNA酶的水中混悬至100μM作为储备溶液，并且稀释至所需浓度并使用Nanodrop机器或OliGreen方法(ThermoFisher)来定量。
双循环PCR扩增：为添加生物素化寡聚物标签，遵循制造商方案使用Pfx PlatinumPCR试剂盒以10μl的反应体积进行双循环PCR扩增。寡聚物模板在所需拷贝数下用于PCR反应中(适体文库中每个寡聚物序列1至5个拷贝)。对于第一循环的扩增，仅包括反向引物JR。扩增在以下条件下操作：在94℃下持续2分钟，接着94℃持续10秒，采用以每分钟0.5℃下降的从66℃至52℃的降落程序进行退火。接着使聚合酶反应在68℃下延伸20秒，随后冷却至4℃。接着将10μl的不具有模板，但含有生物素化正向引物(生物素-JF)的PCR混合物添加至第一循环PCR管中以使用相同PCR步骤进行第二循环的扩增。PCR产物准备用于与链霉亲和素珠粒一起孵育。
分离生物素化寡核苷酸(寡聚物)：2x结合和洗涤缓冲液(BW缓冲液)由具有2MNaCl的1xTE缓冲液(Ambion)制得。将Dynabeads M-270链霉亲和素(ThermoFisher)(SA珠粒)在室温下用20μM酵母tRNA溶液(Ambion)阻断10分钟，并且用1x BW缓冲液洗涤两次，并再混悬于与所用珠粒的初始体积相同的体积的2xBW缓冲液中。将50μl的这些经处理珠粒连同100μl的2xBW缓冲液和30μl的水一起添加至PCR产物中。遵循制造商方案，使200μl的生物素化寡聚物和SA珠粒混合物在室温下孵育60分钟，接着使珠粒在95℃下变性5分钟，立刻在冰上冷却并用1xBW缓冲液洗涤一次，用水洗涤两次，每次5分钟。尽可能多地移除洗涤溶液，并且经洗涤珠粒准备用于PCR反应。
寡聚物序列标签特异性PCR：将具有生物素化PCR产物的珠粒添加至总计50μl的PCR混合物中，使用Pfx Platinum PCR试剂盒。引物是F组和R组引物的混合物。PCR在94℃下预热2分钟，经受28个循环的94℃持续15秒、62℃持续30秒、68℃持续20秒，以及在68℃下额外延伸2分钟。使PCR产物冷却至12℃，并且准备用于第二轮PCR。对于第二轮PCR扩增，来自第一轮PCR的1μl PCR产物用作模板，并且单一一对F引物和R引物用于扩增用互补序列加以标签化的模板。PCR反应在94℃下预热，并且用25个循环的94℃持续15秒、60℃持续30秒、68℃持续20秒，以及在68℃下额外延伸2分钟来扩增。
结果
尽管使用通过指数富集对配体进行系统进化(SELEX)进行的体外选择8,9已广泛应用于筛选通常具有1013至1014个序列的大型适体文库以产生针对广泛范围的配体(包括代谢物、维生素辅因子、金属离子、蛋白质以及甚至完整细胞10)的众多适体，但用于基于细胞的对所述大型随机化适体文库的筛选的方法尚未被开发。此外，由SELEX产生的少许适体已被证明在细胞环境中有效，从而强调在将需要适体起作用所处的细胞环境中筛选适体的重要性。为使所选适体在细胞内起作用，特定适体与它的配体的结合必须具有功能性结果–其不能通过SELEX来测试，所述SELEX仅基于在体外条件下的配体结合来选择适体。开发基于哺乳动物细胞的适体筛选的一个挑战是基于适体的核糖开关应答于配体处理具有低度动态基因调控范围。除这个基本限制之外，在哺乳动物细胞的情况下的固有低下基因转导效率对筛选大于105个序列的文库施加另一阻碍。然而，我们开发了在配体处理后可产生多达数千倍基因表达诱导的合成核糖开关。这个高度动态范围的基因调控提供基于细胞的用于筛选适体/配体的系统的基础。为在真核细胞的情况下从具有高度序列多样性的大型适体文库选择适体，本发明提供多种策略和方法来将大型适体文库划分/拆分成较小子文库，所述子文库可被克隆至核糖开关盒中以产生可通过基于哺乳动物细胞的测定来筛选的质粒文库。
拆分大型适体文库的策略在于首先在合成随机化适体寡聚物序列的5′末端与3′末端两者处添加一对独特序列(如实施例2中所述)。在这个策略的第二步骤中，用独特寡聚物序列连接(标签化/标记)的适体序列可使用互补于各对序列标签的单一一对引物来扩增，由此产生不同适体子文库(图3a)。标签化和PCR的这个两步方法可被迭代来将文库拆分以获得所需大小。
为使独特序列对连接于模板，我们已开发多种方法(图3b)。一种方法在于使用PCR来将独特序列并入模板中(PCR方法)。其他方法包括使用T4 RNA连接酶来使单链序列标签连接于单链模板，以及通过T4 DNA连接酶来使双链序列标签连接于通过对单链寡核苷酸模板进行PCR扩增来产生的双链模板(连接方法)。我们已开发和测试双循环PCR方法(图3c)，并且当前处于测试用以添加独特序列标签的连接方法的过程中。
对于使用PCR方法来连接序列标签以产生标签化适体文库，设计一组PCR引物(JF和JR)。这组引物在引物的5’部分中含有标签序列，并且在引物的3’部分中含有互补于合成适体寡聚物中的恒定区的序列。为避免由使用高拷贝数的模板通过多循环常规PCR所产生的异质性11，双循环PCR被开发来在各循环时在模板的一个末端连接序列标签(图3c)。在这个双循环PCR中，随机化寡聚物模板的拷贝数被保持最小以降低各模板被超过一对标签序列连接的机会。为分离和纯化标签化模板，我们用生物素分子标记JF引物，以使磁性链霉亲和素珠粒可用于使生物素化标签化模板与其余反应组分分离(图3d)。由于我们在PCR标签化的情况下起始采用的模板的拷贝数较低，所以使用对连接于模板的标签序列具有特异性的一组引物(J引物和F引物)的混合物，通过PCR来扩增和扩大经分离生物素化标签化模板，从而产生在末端具有独特序列对的适体的文库(随机化适体的标签化文库)。这个PCR产物接着充当用单一一对J引物和R引物进行的PCR的模板以扩增各标签化模板，由此产生原始适体文库的子文库。
在其中使用2个经生物素标记的JF引物(JF1和JF2)和8个反向JR引物(JR1至JR8)的试探性研究中，产生总计16对独特序列标签。在通过用模板在分别代表初始随机化适体文库的63％、90％或99％的1、2.3或4.6个拷贝下进行PCR来产生标签化文库之后，不同引物用于测试拆分策略。如图3e的左侧小图上所示，标签化模板由互补于适体中的恒定区的引物(通用引物)扩增，此扩增文库中的每个模板。当使用对添加的标签序列具有特异性的单一一对引物(F1和R1)(中间小图)，而非未包括在标签化中的一对引物(F3和R1)时，相较于用通用引物扩增的产物，标签化模板在低得多的数量下被扩增，从而指示仅文库的一部分(1/16)被扩增。因此，原始文库被分成较小子文库。
实施例4
用于文库筛选的基于细胞的测定的灵敏性
程序：
DNA构建体：在DNA构建体SR-Mut中稀释含有xpt-G17核糖开关的质粒DNA构建体以获得不同比率的这两种DNA构建体。接着将混合构建体G17和SR-mut质粒DNA转染至HEK 293细胞中。如实施例1中所述进行转染和荧光素酶测定。
结果：
用于文库筛选的基于细胞的测定的灵敏性决定为了在筛选中使最少1个阳性命中物显得与文库的其余部分不同，适体-核糖开关质粒文库可有多么复杂或所述文库的大小可有多大。视所选报道基因而定，测定可关于荧光素酶活性、荧光蛋白的荧光强度或生长激素/细胞因子释放，并且遗传元件可通过短暂转染或通过病毒转导例如AAV、腺病毒、慢病毒等来递送。
在此处，我们选择短暂转染来递送质粒DNA，并且使用萤火虫荧光素酶作为报道基因，利用xpt-G17构建体作为阳性核糖开关对照载体，使用已在开发xpt-G17核糖开关期间在哺乳动物细胞的情况下广泛测试和使用的测定。构建体SR-mut用作阴性对照载体，其与xpt-G17构建体具有相同遗传元件，例外之处是不存在鸟嘌呤适体序列，因此不应答于鸟嘌呤处理来使基因表达活化。将这两种构建体混合在一起以模拟汇合文库情况，但实际核糖开关文库由于由核苷酸随机化产生的巨大分子多样性而更加复杂。当相较于未处理细胞时，用100％xpt-G17构建体DNA转染的细胞在用500μM的鸟嘌呤处理后产生2000倍荧光素酶活性诱导。当xpt-G17构建体DNA用SR-mut构建体DNA稀释时，用混合DNA转染的细胞显示较低倍荧光素酶活性诱导。如图3中所示，当鸟嘌呤应答性xpt-G17构建体与非应答性阴性SR-mut构建体的比率降低时，诱导倍数降低，但当2000个分子中存在1个阳性构建体时仍然可产生2.3倍诱导，从而指示有可能从配体非应答性核糖开关的混合物回收1个配体应答性核糖开关。
对于除上述测定以外的测定，应测试测定的灵敏性以为确定待筛选的子文库汇合物的大小提供指导。
实施例5
构建汇合的基于适体的核糖开关质粒文库以及将较大核糖开关文库分成较小可筛选子文库。
程序：
构建核糖开关的汇合质粒文库：使用Platinum Pfx试剂盒(Invitrogen)对含有具有随机化碱基的适体序列的超聚体寡聚物(对于序列设计和组成，参见实施例2)进行PCR扩增以产生双链DNA片段，并且使产生的PCR产物在4％琼脂糖凝胶上跑动。将具有153bp大小的DNA加以凝胶纯化(Qiagen)，并且用BsaI酶(NEB)消化。接着使用T4 DNA连接酶(Roche)，以1:5载体与插入物比率使经BsaI消化的DNA片段连接于如实施例1中所述的经BsaI消化的接受载体(mDHFR-Luci接受体)。遵循制造商说明书(Invitrogen)，用连接产物转化ElectroMAX DH5α-E感受态细胞，并且将其涂铺于琼脂板上。汇合和收集细菌菌落，并且提取DNA以获得核糖开关的质粒文库(P1)。
类似方法用于产生较小质粒核糖开关文库(P2)，其中使在适体中5个位置的核苷酸碱基随机化，从而产生总计1024个不同适体序列(其中N表示随机化位置)：GACTTCGGTCTCATCCAGAGAATGAAAAAAAAATCTTCAGTAGAAGGTAATGTATANNNGCGTGGATATGGCACGCNNGTTTCTACCGGGCACCGTAAATGTCCGACTACATTACGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGAAGAGACCAGACGG(SEQ ID NO:10)
转化化学感受态DH5α：227pg质粒DNA用于转化50μl感受态细胞以获得1:10质粒DNA和细菌细胞比率。在37℃下在不振荡下孵育30分钟之后，将经转化细胞涂铺于琼脂板上，并且汇合和收集菌落以使用96形式小型制备试剂盒(Qiagen)进行DNA提取以获得核糖开关的汇合质粒子文库。
下一代测序(NGS)：来自二级或三级核糖开关子文库的质粒DNA用作模板，并且以下引物用于产生含有随机化适体序列的PCR扩增子：DHFR_F：5′-GACTTCGGTCTCATCCAGAGAATGAAAAAAAAATCTTCAGTAGAAGGTAATG-3′(SEQ ID NO:11)；IVS_R：5′-CCGTCTGGTCTCTTCACTGTTATTCTTTAGAATGGTGCG-3′(SEQ ID NO:12)。使PCR产物经受使用Illumina MiSeq 2x150bp双端平台进行的NGS以产生各样品的约700K个读段，并且进行后续生物信息学分析以达成独特序列鉴定和相对丰度计算(服务由Genewiz提供)。显示来自测序操作的12个或超过12个读段的序列被视为真实序列。
结果
为通过基于细胞的测定来筛选适体，通过将适体文库克隆至mDHFR-Luci接受载体中来产生核糖开关的质粒文库(图5a)。产生的构建体含有与构建体xpt-G17中相同的遗传元件构型，唯一差异在适体序列方面。我们以如实施例2中所述产生的适体文库起始，所述适体文库是包含106个独特序列的随机化适体文库。为确保代表初始适体文库的大于99.9％，从琼脂板收集总计7.5×106个菌落，此是适体文库中序列的数目的7.5倍。从所收集菌落提取的质粒DNA形成由106个独特核糖开关组成的质粒文库(P1)。
为将质粒文库分成足够小型以使用所开发的基于细胞的测定来筛选的子文库，利用如图5b中概述的策略，其涉及汇合较小数目的经转化细菌菌落以及提取DNA以制备核糖开关的质粒子文库。划分质粒文库的这个过程可持续数轮进行以获得所需大小的子文库，其中单一阳性事件(即导致报道基因表达的特异性适体/配体结合)可基于被开发来筛选文库，从而分别产生初级子文库、二级子文库或三级子文库的基于细胞的测定的灵敏性来检测。将子文库的大小计算为n(子文库)＝m(代表倍数)*N(初始文库大小)/d(划分倍数)。“划分倍数”表示待获得的子文库的总数，并且可为如所需的任何数目。在此处，为了易于计算，我们选择100作为划分倍数。对于第一轮划分，收集6×106个菌落，此是初始质粒文库中核糖开关的数目的6倍，以获得代表大于99％(106)。对于第二轮划分，选择对初级子文库的1倍代表。对于我们构造的具有106个核糖开关的质粒文库(P1)，其中N＝106，m＝6，d＝100，各个别子文库的大小是n＝6×104。将总计6×106个细菌菌落收集至100个个别管中，并且从各个别管提取DNA以产生核糖开关的初级质粒子文库(P1S_001至P1S_100)。使用相同策略以及以子文库P1S_001作为一实例起始，将初级子文库进一步分成100个甚至更小的二级子文库，命名为P1S_001_001至P1S_001_100。因此，通过进行两轮划分，产生了在各自中具有600个核糖开关的二级质粒子文库。核糖开关子文库可通过第3轮划分过程来进一步划分以产生三级质粒子文库。
相同方法用于划分含有1024个独特适体序列的质粒核糖开关文库P2。通过收集100份总计5000个菌落，产生了100个初级子文库P2S_001至P2S_100，其中各子文库含有约50个核糖开关。
为测定以上产生的核糖开关文库的组成和品质，对推测在各子文库中含有600个核糖开关序列的二级核糖开关质粒子文库进行下一代测序(NGS)。随机选择四个二级子文库，其中两个二级子文库从初级子文库P1S_003产生，并且另外两个二级子文库分别从初级子文库P1S_007和P1S_048产生。如图5c中所示，各二级子文库含有约500或600个独特序列，这与被收集来产生二级子文库的菌落的数目一致。对NGS数据的进一步分析指示在从同一初级子文库(P1S_003)产生的两个二级子文库(P1S_003_004和P1S_003_041)之间，39个序列含于两个文库中(图5d)。当比较源于不同初级子文库P1S_003和P1S_007的两个二级子文库P1S_003_004和P1S_007_021时，仅3个序列为两个子文库所共有(图5e)。这些结果指示使用上述策略，产生了具有准备用于基于哺乳动物细胞的筛选的所需数目的独特序列的质粒核糖开关子文库。
实施例6
基于哺乳动物细胞的对针对所选配体的新适体的筛选。
如实施例5中所述，构建100个在各汇合物中包含60k个核糖开关的初级质粒子文库(P1S_001至P1S_100)，并且通过使用相同策略进一步划分初级子文库P1S_001来产生100个在各自中由600个核糖开关组成的二级质粒子文库(P1S_001_001至P1S_001_100)。可使汇合文库以96孔形式阵列化以有助于高通量筛选。使用如实施例1中所述的荧光素酶报道体测定，针对作为测试配体的针对初始适体序列的鸟嘌呤来对初级子文库P1S_001至006以及P1S_001的子文库进行初级筛选。通过来自初级子文库或二级子文库的构建体来产生的基础荧光素酶活性水平显著不同于在xpt-G17构建体的情况下的基础荧光素酶活性水平(数据未显示)，从而表明由在所选位置处使碱基随机化达成的适体序列变化在各种程度上影响含有终止密码子的外显子的包括/排除，因此影响基础荧光素酶表达。在鸟嘌呤处理之后，尽管用60k初级子文库P1S_005转染的细胞相较于未处理细胞产生1.8倍荧光素酶活性诱导(图6a)，但在使用鸟嘌呤作为配体时未发现超过2倍荧光素酶诱导。然而，在鸟嘌呤处理后，100个二级子文库中的7个产生超过2倍荧光素酶活性诱导，其中子文库P1S_001_075产生7.8倍诱导(图6b)。在实施例4中所述的灵敏性测定中，当在500个非配体应答性分子之中存在1个xpt-G17核糖开关时，检测到6.3倍诱导。基于这个灵敏性测试，来自对子文库P1S_001_075的这个初级筛选的结果(7.8倍)表明在600个核糖开关中存在1个在功能上等效于xpt-G17的核糖开关，或存在诱导荧光素酶活性的总和与在xpt-G17的情况下的诱导荧光素酶活性类似的若干较弱核糖开关。
为进一步证明本发明的基于哺乳动物细胞的筛选可适用于含有功能性适体的核糖开关以及为发现具有应答于所需配体的改进活性的新适体，以96孔形式采用NAD+来筛选质粒核糖开关文库P2的子文库。在xpt-鸟嘌呤适体中随机化位置处的核苷酸碱基已与核糖开关活性调谐相关联，并且命名为调谐框(Stoddard,等人，J Mol Biol.2013年5月27日；425(10):1596-611)。因此，在这些位置处的核苷酸的变化会潜在产生具有应答于配体处理的改变核糖开关活性的序列。归因于鸟嘌呤的性质以及它在体内的低度可适用性，所以选择NAD+作为潜在新适体的配体。这个配体选择基于由针对亲本xpt-G17核糖开关筛选Prestwick化合物文库获得的以上结果，以及发现NAD+可调控鸟嘌呤核糖开关，从而在100μM浓度下产生约40倍诱导。为试图产生针对NAD+的具有改进核糖开关活性的适体序列，我们使用荧光素酶作为报道基因来产生和筛选P2(在适体中的以上提及的5个位置处具有核苷酸变化)的子文库。如图6c中所示，在各自中具有约50个核糖开关的多个子文库应答于用100μM NAD+处理产生超过10倍荧光素酶表达诱导，其中一个子文库P2S_002产生37倍诱导，而单一xpt-G17核糖开关构建体应答于用NAD+在相同浓度下处理显示32倍诱导。
这些筛选结果指示在产生超过10倍荧光素酶表达诱导的子文库中的约50个核糖开关之中，存在可产生最小10倍诱导的核糖开关，假定文库中的所有核糖开关都对NAD+处理起应答。在产生高于由G17产生的诱导倍数的37倍诱导的子文库P2S_002中，存在至少1个相比于G17更好地起作用的核糖开关。为进一步证明这个，筛选96个源于子文库P2S_002的单一构建体。如图6d中所示，尽管多个构建体丧失诱导或相比于G17产生更小程度诱导，但许多单一构建体相比于G17构建体产生更高倍诱导，从而指示调谐框中的核苷酸变化显著影响在细胞的情况下应答于配体处理的核糖开关活性。使用这个方法，我们鉴定了许多不同调谐框序列(如表2中所示)，在所述调谐框序列的情况下，在NAD+处理后，相比于G17构建体，核糖开关产生更高倍荧光素酶诱导，其中多个适体序列产生超过100倍诱导。
表2.具有在哺乳动物细胞中应答于配体NAD+的改进报道基因表达的核糖开关。调谐框序列是加下划线的。
进一步测试一个新构建体#46。如图6e和图6f中所示，新构建体#46以剂量依赖性方式对NAD+处理进行应答，并且当相较于G17构建体时，在诱导报道基因表达水平方面以及在诱导倍数方面显示优越改进。新构建体也具有应答于鸟嘌呤处理的改进基因调控(数据未显示)。
因此，本发明提供一种方法，其中相对大型核糖开关文库可被分成可通过基于哺乳动物细胞的测定来筛选的较小核糖开关子文库。此外，从核糖开关文库开始，发现了在哺乳动物细胞中具有改进核糖开关活性的新序列。
参考文献：
1.Mandal，Maumita，Benjamin Boese，Jeffrey E.Barrick，Wade C.Winkler，andRonald R.Breaker.“Riboswitches Control Fundamental Biochemical Pathways inBacillus Subtilis and Other Bacteria.”Cell 113，no.5(May 30，2003)：577-86.
2.Mandal，Maumita，and Ronald R.Breaker.“Adenine Riboswitches and GeneActivation by Disruption of a Transcription Terminator.”Nature Structural&Molecular Biology 11，no.1(January 2004)：29-35.doi：10.1038/nsmb710.
3.Mulhbacher，Jerome，and Daniel A.Latontaine.“Ligand RecognitionDeterminants of Guanine Riboswitches.”Nucleic Acids Research 35，no.16(2007)：5568-80.doi：10.1093/nar/gkm572.
4.Serganov，Alexander，Yu-Ren Yuan.Olga Pikovskaya，Anna Polonskaia，LucyMalinina.Anh Tuan Phan.Claudia Hobartner，Ronald Micura.Ronald R.Breaker，andDinshaw J.Patel.“Structural Basis for Discriminative Regulation of GeneExpression by Adenine-and Guanine-Sensing mRNAs.”Chemistry&Biology 11.no.12(December 2004)：1729-41.doi：10.1016/j.chembiol.2004.11.018.
5.Edwards，Andrea L.，and Robert T.Batey.“A Structural Basis for theRecognition of 2’-deoxyguanosine by the Purine Riboswitch.”Journal ofMolecular Biology 385，no.3(January 23,2009)：938-48.doi：10.1016/j.jmb.2008.10.074.
6.Batey，Robert T.，Sunny D.Gilbert，and Rebecca K.Montange.“Structureof a Natural Guanine-Responsive Riboswitch Complexed with the MetaboliteHypoxanthine.”Nature 432，no.7015(November 18.2004)：411-15.doi：10.1038/nature03037.
7.Serganov，Alexander.Yu-Ren Yuan，Olga Pikovskaya，Anna Polonskaia，LucyMalinina，Anh Tuan Phan.Claudia Hobartner，Ronald Micura，Ronald R.Breaker，andDinshaw J.Patel.“Structural Basis for Discriminative Regulation of GeneExpression by Adenine-and Guanine-Sensing mRNAs.”Chemistry&Biology 11，no.12(December 2004)：1729-41.doi：10.1016/j.chembiol.2004.11.018.
8.Ellington，A.D.，and J.W.Szostak.“In Vitro Selection of RNA MoleculesThat Bind Specific Ligands.”Nature 346，no.6287(August 30，1990)：818-22.doi：10.1038/346818a0.
9.Tuerk，C.，and L.Gold.“Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment：RNA Ligands to Bacteriophage T4 DNA Polymerase.”Science(New York，N.Y.)249，no.4968(August 3，1990)：505-10.
10.Ozer，Abdullah，John M.Pagano，and John T.Lis.“New TechnologiesProvide Quantum Changes in the Scale，Speed，and Success of SELEX Methods andAptamer Characterization.”Molecular Therapy.Nucleic Acids 3(2014)：e183.doi：10.1038/mtna.2014.34.
11.Kebschull，Justus M.，and Anthony M.Zador.“Sources of PCR-InducedDistortions in High-Throughput Sequencing Data Sets.”Nucleic Acids Research43，no.21(December 2，2015)：e143.doi：10.1093/nar/gkv717.

Claims (46)

1.一种用于选择在真核细胞中结合配体的适体的方法，其包括以下步骤：
(a)提供适体文库，
(b)将所述适体文库的成员引入用于达成配体介导的报道基因表达的多核苷酸盒中以创建核糖开关文库，
(c)将所述核糖开关文库引入真核细胞中，以及
(d)使所述真核细胞与配体接触，以及
(e)测量所述报道基因的表达，
其中所述多核苷酸盒包含侧接5′内含子和3′内含子的选择性剪接外显子，以及核糖开关，所述核糖开关包含(i)效应子区，其包含包括所述3′内含子的5′剪接位点的茎，和(ii)适体，其中所述选择性剪接外显子包含当所述选择性剪接外显子被剪接至报道基因mRNA中时与所述报道基因符合读框的终止密码子。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述适体文库包含具有一个或多个随机化核苷酸的适体。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述配体是小分子。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述配体是由所述真核细胞产生的分子，其选自由代谢物、核酸、维生素、辅因子、脂质、单糖和第二信使组成的组。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述真核细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和酵母细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述报道基因选自由荧光蛋白、荧光素酶、β-半乳糖苷酶和辣根过氧化物酶组成的组。
7.如权利要求1所述的方法，其中当所述配体特异性结合所述适体时所述报道基因的表达是当不存在所述配体时的报道基因表达水平的大于约10倍。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述5′内含子和所述3′内含子源于人β-球蛋白基因的内含子2。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述5′内含子和所述3′内含子的长度各自独立地是约50至约300个核苷酸。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述5′内含子和所述3′内含子的长度各自独立地是约125至约240个核苷酸。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述效应子区茎的长度是约7至约20个碱基对。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述效应子区茎的长度是8至11个碱基对。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述选择性剪接外显子源于由以下项组成的组：人二氢叶酸还原酶基因的外显子2、突变人威尔姆斯肿瘤1的外显子5、小鼠钙/钙调蛋白依赖性蛋白质激酶IIδ外显子16和SIRT1外显子6。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述选择性剪接外显子是来自人DHFR的经修饰外显子2。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述选择性剪接外显子是合成的。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述选择性剪接外显子已通过由以下项组成的组中的一者或多者来修饰：改变外显子剪接增强子的序列、改变外显子剪接沉默子的序列、添加外显子剪接增强子，以及添加外显子剪接沉默子。
17.如权利要求1所述的方法，其中在引入所述多核苷酸盒中之前将所述适体文库分成较小适体文库，此包括以下步骤：
a.提供随机化适体文库，其中所述文库中的适体包含多个5′恒定区和3′恒定区以及一个或多个随机化核苷酸，
b.使用作为模板的所述随机化适体文库以及互补于所述5′恒定区和所述3′恒定区的第一引物和第二引物进行双循环PCR，
c.分离所述双循环PCR的产物，以及
d.使用互补于一子组的独特5′恒定区和3′恒定区的引物对所述双循环PCR的一子组的经分离产物进行PCR扩增。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述双循环PCR中的所述第一引物或所述第二引物包含选自由以下项组成的组的标记：生物素、地高辛(DIG)、溴脱氧尿苷(BrdU)、荧光团和用于点击化学中的化学基团。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中将所述核糖开关文库在引入所述真核细胞中之前分成一个或多个核糖开关子文库。
20.如权利要求19所述的方法，其中将所述核糖开关文库再分成子文库，此包括以下步骤：
(a)将所述核糖开关文库引入细菌中；
(b)收集细菌克隆并提取质粒DNA以获得核糖开关的质粒子文库来产生一个或多个初级子文库；
(c)任选地，通过将初级子文库引入细菌中、收集细菌克隆以及分离质粒DNA来从核糖开关的初级质粒子文库产生核糖开关的二级子文库。
21.一种用于选择在真核细胞中结合适体的配体的方法，其包括以下步骤：
(a)提供配体文库，
(b)提供用于达成配体介导的报道基因表达的多核苷酸盒，
(c)将所述多核苷酸盒引入所述真核细胞中，
(d)使单独各组的所述真核细胞与所述配体文库的成员接触，以及
(e)测量所述报道基因的表达，
其中所述多核苷酸盒包含侧接5′内含子和3′内含子的选择性剪接外显子，以及核糖开关，所述核糖开关包含(i)效应子区，其包含包括所述3′内含子的5′剪接位点的茎，和(ii)适体，其中所述选择性剪接外显子包含当所述选择性剪接外显子被剪接至报道基因mRNA中时与所述报道基因符合读框的终止密码子。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述配体是小分子。
23.如权利要求21或22所述的方法，其中所述配体是由所述真核细胞产生的分子。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述配体是代谢物、核酸、维生素、辅因子、脂质、单糖和第二信使。
25.如权利要求21所述的方法，其中所述真核细胞选自由哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和酵母细胞组成的组。
26.如权利要求21所述的方法，其中所述报道基因选自由荧光蛋白、荧光素酶、β-半乳糖苷酶和辣根过氧化物酶组成的组。
27.如权利要求21所述的方法，其中所述报道基因选自由细胞因子、信号传导分子、生长激素、抗体、调控性RNA、治疗性蛋白质、或肽组成的组。
28.如权利要求21所述的方法，其中当所述配体特异性结合所述适体时所述报道基因的表达是当不存在所述配体时的报道基因表达水平的大于约10倍。
29.如权利要求21所述的方法，其中所述5′内含子和所述3′内含子源于人β-球蛋白基因的内含子2。
30.如权利要求21所述的方法，其中所述5′内含子和所述3′内含子的长度各自独立地是约50至约300个核苷酸。
31.如权利要求21所述的方法，其中所述5′内含子和所述3′内含子的长度各自独立地是约125至约240个核苷酸。
32.如权利要求21所述的方法，其中所述效应子区茎的长度是约7至约20个碱基对。
33.如权利要求21所述的方法，其中所述效应子区茎的长度是8至11个碱基对。
34.如权利要求21所述的方法，其中所述选择性剪接外显子源于由以下项组成的组：人二氢叶酸还原酶基因的外显子2、突变人威尔姆斯肿瘤1的外显子5、小鼠钙/钙调蛋白依赖性蛋白质激酶IIδ外显子16和SIRT1外显子6。
35.如权利要求21所述的方法，其中所述选择性剪接外显子是来自人DHFR的经修饰外显子2。
36.如权利要求21所述的方法，其中所述选择性剪接外显子是合成的。
37.如权利要求21所述的方法，其中所述选择性剪接外显子已通过由以下项组成的组中的一者或多者来修饰：改变外显子剪接增强子的序列、改变外显子剪接沉默子的序列、添加外显子剪接增强子以及添加外显子剪接沉默子。
38.一种用于将随机化适体文库分成较小适体子文库的方法，其包括以下步骤：
a.提供随机化适体文库，其中所述文库中的适体包含多个5′恒定区和3′恒定区以及一个或多个随机化核苷酸，
b.使用作为模板的所述随机化适体文库以及互补于所述5′恒定区和所述3′恒定区的第一引物和第二引物进行双循环PCR，
c.分离所述双循环PCR的产物，和
d.使用互补于一子组的独特5′恒定区和3′恒定区的引物对所述双循环PCR的一子组的经分离产物进行PCR扩增。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述随机化适体文库包含具有一个或多个随机化核苷酸的适体。
40.如权利要求38所述的方法，其中所述随机化适体文库包含超过约100,000个适体。
41.如权利要求38所述的方法，其中所述随机化适体文库包含超过约1,000,000个适体。
42.如权利要求38所述的方法，其中所述双循环PCR中的所述第一引物或所述第二引物包含选自由以下项组成的组的标记：生物素、地高辛(DIG)、溴脱氧尿苷(BrdU)、荧光团和用于点击化学中的化学基团。
43.一种通过如权利要求1-20所述的方法选择的适体。
44.一种通过如权利要求21-37所述的方法选择的配体。
45.一种由包括序列SEQ ID NO:14至27的序列编码的适体。
46.一种由包括序列SEQ ID NO:24的序列编码的适体。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2018009370A (es) 2016-02-02 2018-11-12 Meiragtx Uk Ii Ltd Regulacion de expresion genica a través de poliadenilacion modulada por aptámeros.
JP7139345B2 (ja) 2017-02-21 2022-09-20 メイラジーティーエックス・ユーケー・ザ・セカンド・リミテッド アプタマーが媒介する、ポリアデニル化シグナルのアクセシビリティによる遺伝子発現の調節
EP3755800A1 (en) 2018-02-21 2020-12-30 Bristol-Myers Squibb Company Camk2d antisense oligonucleotides and uses thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040126882A1 (en) * 2000-06-15 2004-07-01 Ellington Andrew D Regulatable, catalytically active nucleic acids
US20110111411A1 (en) * 2009-11-10 2011-05-12 Smolke Christina D Protein-Responsive RNA Control Devices and Uses Thereof
CN102277377A (zh) * 2005-02-09 2011-12-14 巴斯福植物科学有限公司 在单子叶植物中调控表达的表达盒
US20150175981A1 (en) * 2012-05-31 2015-06-25 Novozymes A/S of Krogshoejvej 36 Selection in fungi

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5567588A (en) 1990-06-11 1996-10-22 University Research Corporation Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US5580737A (en) 1990-06-11 1996-12-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity nucleic acid ligands that discriminate between theophylline and caffeine
WO1991019813A1 (en) 1990-06-11 1991-12-26 The University Of Colorado Foundation, Inc. Nucleic acid ligands
US6423493B1 (en) * 1998-10-26 2002-07-23 Board Of Regents The University Of Texas System Combinatorial selection of oligonucleotide aptamers
US8008071B2 (en) * 1999-11-08 2011-08-30 University Of South Florida Compositions and methods for detecting intracellular glucose and analogs thereof
WO2004028464A2 (en) 2002-09-27 2004-04-08 University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for modification of splicing of pre-mrna
MX2007005491A (es) 2004-11-08 2007-09-27 Univ Yale Diseno de compuesto basado en la estructura que involucra riboconmutadores.
WO2007035532A2 (en) * 2005-09-15 2007-03-29 Duke University Focused libraries, functional profiling, laser selex and deselex
AU2008227458A1 (en) 2007-03-22 2008-09-25 Yale University Methods and compositions related to riboswitches that control alternative splicing
MX2009012647A (es) 2007-05-29 2009-12-14 Univ Yale Metodos y composiciones relacionadas con ribointerruptores que controlan la separacion alternativa y proceso de arn.
AU2014205648B2 (en) * 2013-01-10 2017-05-04 Dharmacon, Inc. Templates, libraries, kits and methods for generating molecules
CA2975735A1 (en) * 2015-02-02 2016-08-11 Meiragtx Uk Ii Limited Regulation of gene expression by aptamer-mediated modulation of alternative splicing
GB201506440D0 (en) 2015-04-16 2015-06-03 Univ Wageningen Riboswitch-controlled screening and selection of desired biocatalysts
US10011870B2 (en) * 2016-12-07 2018-07-03 Natera, Inc. Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040126882A1 (en) * 2000-06-15 2004-07-01 Ellington Andrew D Regulatable, catalytically active nucleic acids
CN102277377A (zh) * 2005-02-09 2011-12-14 巴斯福植物科学有限公司 在单子叶植物中调控表达的表达盒
US20110111411A1 (en) * 2009-11-10 2011-05-12 Smolke Christina D Protein-Responsive RNA Control Devices and Uses Thereof
US20150175981A1 (en) * 2012-05-31 2015-06-25 Novozymes A/S of Krogshoejvej 36 Selection in fungi

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
STEPHANIE J. CULLER等: "Reprogramming cellular behavior with RNA controllers responsive to endogenous proteins", 《SCIENCE.》 *
ZEFENG WANG等: "Systematic Identification and Analysis of Exonic Splicing Silencers", 《CELL》 *

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20240183T1 (hr) 2024-04-26
CN110199030B (zh) 2023-12-12
RS65228B1 (sr) 2024-03-29
PL3494229T3 (pl) 2024-03-25
WO2018025085A2 (en) 2018-02-08
MX2019001239A (es) 2019-07-04
EP3494229A2 (en) 2019-06-12
AU2017306657B2 (en) 2022-12-08
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