EA020657B1 - Специализированная многосайтовая комбинаторная сборка - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к новому способу получения множества модифицированных полинуклеотидов, имеющих разные комбинации различных мутаций во множественных сайтах, посредством специализированной многосайтовой комбинаторной сборки, включающему добавление по меньшей мере двух или по меньшей мере трех праймеров к двухцепочечному матричному полинуклеотиду в одной реакционной смеси, где праймеры не перекрываются и где каждый из праймеров содержит по меньшей мере одну мутацию, отличающуюся от других праймеров, где по меньшей мере один праймер является прямым праймером, способным отжигаться с минус-цепью матрицы, и по меньшей мере один праймер является обратным праймером, способным отжигаться с плюс-цепью матрицы, и подвергание реакционной смеси реакции полимеразной достройки для получения множества достроенных модифицированных полинуклеотидов по меньшей мере из трех праймеров. Способ можно осуществлять без использования этапа лигирования перед трансформацией клетки достроенными модифицированными полинуклеотидами. Множество достроенных модифицированных полинуклеотидов перед трансформацией клетки можно обрабатывать ферментом для разрушения матричного полинуклеотида.

Description

Настоящее изобретение, в целом, относится к способу специализированной многосайтовой комбинаторной сборки (ТМСА), как к способу получения в потомстве множества полинуклеотидов, осуществления специфических изменений в гене и переборных мутаций или изменений во множественных сайтах. Мутации или изменения конструируют и синтезируют на коротких олигонуклеотидах. Олигонуклеотиды отжигают с матричной ДНК, содержащей ген дикого типа. Для амплификации цельной ДНК применяют ДНК-полимеразу. Полученную амплифицированную ДНК выделяют из организма-хозяина. Преимуществами этого способа являются скорость, техническая простота и возможность управлять сборкой.

Описание уровня техники

В опубликованных способах осуществления изменений в гене используют, например, ПЦР пониженной точности, набор для заказного генного сайт-специфического мутагенеза от 1иуйгодеп (Оеие Ταί1ог 8Йе-б1гес1еб Ми1адеие818 Κίί™), набор для мутагенеза с быстрыми изменениями от §1га1адеие (ОшскСкаиде МШадепехй Κίί™), ПЦР с перекрыванием, а также лигирование/рекомбинацию на основе ПЦР. Обзор известных способов свидетельствует о том, что для всех этих способов характерна тенденция к изначальной трудности в создании мутации и/или модификации в отдельно взятом сайте/близлежащей области и/или трудоемкость в осуществлении модификаций во множественных областях.

Патент США 7202086 (патент '086) притязает на процесс осуществления мутагенеза с применением по меньшей мере 5 перекрывающихся или не перекрывающихся олигонуклеотидов и двухцепочечной ДНК (дцДНК) (плазмиды) для создания библиотеки мутантных генов, в которой каждая мутация представлена в среднем менее чем в 1/5 генов библиотеки. Патент '086 описывает, что раскрытое в нем изобретение отличается от предшествующего уровня техники, поскольку патент '086 требует контроля частоты мутаций во избежание избытка мутаций в одной молекуле ДНК (графа 5, строки 28-45). Желательно получать такие мутанты, каждый из которых содержит одну мутацию. Для достижения этой цели соотношение между количеством каждого мутантного олигонуклеотида и количеством матрицы должно находиться в диапазоне 0,01-100 (графа 5, строки 28-45). Эта особенность отличается от предшествующего уровня техники, когда применение нескольких олигонуклеотидов одновременно приводило к включению каждого праймера на уровне более 75% (графа 5, строки 28-45). Патент '086 требует контроля частоты мутаций во избежание избытка мутаций в одной молекуле ДНК и для получения таких мутантов, каждый из которых содержит одну мутацию.

Патент США 7132265 (патент '265) и патентная публикация США 2003/0064516 притязает на способ внесения мутаций в молекулу одноцепочечной ДНК (оцДНК), включающий отжиг праймера, синтез цепи ДНК и расщепление молекулы ДНК. Способ ТМСА использует в качестве матрицы двухцепочечную ДНК (дцДНК). Патент '265 проводит четкое разграничение между использованием оцДНК и дцДНК в качестве начального субстрата для протоколов мутагенеза (см., например, графу 6, строки 45-55).

Опубликованная патентная заявка США 2003/0194807 относится к библиотеке, в которой мутанты белка содержат отдельно взятую заданную аминокислоту в одном или более положений в определенной области, причем определенная область состоит по меньшей мере из трех аминокислот. Допустимо только одно изменение в локализации, т.е. исключаются вырожденные изменения в специфическом положении аминокислоты.

Каждая из опубликованных патентных заявок США 2006/0051748, 2006/0134624, 2004/0248131 и 2002/0083488, а также патенты США 6673610, 6335160 и 5354670 требуют лигирования синтезированной ДНК для получения потомства кольцевой ДНК с мутациями.

Далее опубликованная патентная заявка США 2006/0051748 требует применения флэпэндонуклеазы и отжига всех праймеров с одной и той же цепью ДНК. Опубликованная патентная заявка США 2006/0134624 требует применения двух праймеров последовательно (т.е. не в одной реакции). В опубликованной патентной заявке США 2004/0248131 праймеры отжигают с двумя цепями, причем эти праймеры должны содержать 2-4 комплементарные пары оснований. Патент США 6673610 и опубликованная патентная заявка США 2002/0083488 требуют применения фрагментов, полученных в результате расщепления родительской цепи ДНК, служащей мегапраймером, для получения кольцевой ДНК, которая используется в трансформации. Патент США 6335160 относится к сборке гена из перекрывающихся фрагментов и созданию рекомбинантной библиотеки. Наконец, патент США 5354670 требует два этапа трансформации и промежуточной обработки с рестрикцией.

Каждый из патентов США 7176004, 6713285, 6391548 и 5932419, а также опубликованные патентные заявки США 20040253729 и 20030032037 требуют двух праймеров для отжига с двумя разными цепями в целях инициирования амплификации в противоположных направлениях (т.е. прямого и обратного

- 1 020657 праймера) и получения комплементарных областей. Патенты США 7078389 и 5935830 требуют праймера, содержащего мутаген (например, псорален), который взаимодействует с матрицей таким образом, что образуется трехцепочечная молекула.

Опубликованная патентная заявка США 2006/0228786 требует проведения полимеризации двух цепей с применением двух разных праймеров в двух разных реакциях и с последующим отжигом синтезированных молекул оцДНК. Опубликованная патентная заявка США 2003/077613 относится к способу сборки гена и создания библиотеки, в которой собранный ген (оцДНК) отжигают с каркасной ДНК для заполнения пропусков и получения дцДНК, которую субклонируют в векторе.

Опубликованная патентная заявка США 2004/0002057 описывает способ выявления лиганда в образце, не включающий мутагенез. Опубликованная патентная заявка США 2004/0002057 описывает способ создания мутантного штамма Е.соН, связанный с использованием мутагена в культивируемых клетках.

Опубликованная патентная заявка США 2006/0199222 описывает общий способ направленной эволюции, в котором мутированную ДНК трансформируют в конкретный штамм ВасШик.

До сих пор существует потребность в улучшенном и более эффективном способе получения специфических вариантов гена и комбинаторной генной библиотеки достаточно эффективным и быстрым образом.

Сущность изобретения

Если не дано специальных определений, то все использованные в настоящем документе технические и научные термины имеют значение, которое является общепринятым при рассмотрении в контексте специалистом в области, к которой относится контекст, например химии, биохимии, клеточной биологии, молекулярной биологии или медицинских наук.

В соответствии с этим одним из предметов настоящего изобретения является способ получения множества модифицированных полинуклеотидов, имеющих разные комбинации различных мутаций во множественных сайтах, осуществленных посредством специализированной многосайтовой комбинаторной сборки. Настоящее изобретение позволяет осуществлять специфические изменения в гене и переборные мутации или изменения во множественных сайтах гена. Эти и другие предметы настоящего изобретения, которые являются более очевидными в связи с последующим подробным описанием предпочтительных вариантов осуществления изобретения, либо самостоятельно, либо в комбинациях, были реализованы, благодаря открытию способа, включающего:

(a) добавление по меньшей мере трех праймеров к двухцепочечному матричному полинуклеотиду в одной реакционной смеси, где по меньшей мере три праймера не перекрываются и где каждый по меньшей мере из трех праймеров содержит по меньшей мере одну мутацию, отличающуюся от других праймеров, где по меньшей мере один праймер является прямым праймером, способным отжигаться с минусцепью матрицы, и по меньшей мере один праймер является обратным праймером, способным отжигаться с плюс-цепью матрицы; и (b) подвергание реакционной смеси полимеразной реакции достройки для получения множества достроенных модифицированных полинуклеотидов по меньшей мере из трех праймеров.

В другом варианте осуществления изобретения способ получения множества модифицированных полинуклеотидов, содержащих представляющие интерес мутации, включает:

(a) добавление по меньшей мере двух праймеров к двухцепочечному матричному полинуклеотиду в одной реакционной смеси, где по меньшей мере два праймера не перекрываются и где каждый по меньшей мере из двух праймеров содержит по меньшей мере одну мутацию, отличающуюся от другого праймера (праймеров), где по меньшей мере один праймер является прямым праймером, способным отжигаться с минус-цепью матрицы, и по меньшей мере один праймер является обратным праймером, способным отжигаться с плюс-цепью матрицы, (b) подвергание реакционной смеси полимеразной реакции достройки для получения множества достроенных модифицированных полинуклеотидов по меньшей мере из двух праймеров, (c) обработку множества достроенных модифицированных полинуклеотидов ферментом, посредством чего разрушается матричный полинуклеотид;

(й) трансформацию клетки обработанными достроенными модифицированными полинуклеотидами, которые не были обработаны лигазой;

(е) выделение множества достроенных модифицированных полинуклеотидов из клетки;

(ί) селекцию множества достроенных модифицированных полинуклеотидов, содержащих представляющие интерес мутации.

Подробности одного или более вариантов осуществления изобретения изложены в представленном ниже сопроводительном описании. Хотя в практическом осуществлении или в тестировании настоящего изобретения можно использовать любые способы и материалы, аналогичные или равноценные, описанным в настоящем документе, в настоящее время описаны предпочтительные способы и материалы. Остальные признаки, предметы и преимущества изобретения являются очевидными из его описания и из пунктов формулы изобретения. В описании изобретения и прилагаемых пунктах формулы изобретения формы единственного числа включают ссылку на множественное число, если из контекста явно не сле- 2 020657 дует иное. Если явно не указано иное, то задействованные или рассматриваемые в настоящем документе способы являются стандартными способами, хорошо известными обычному специалисту в данной области. Примеры вариантов осуществления изобретения даны только в иллюстративных целях.

Краткое описание чертежей

Более полное понимание изобретения и многие из соответствующих ему преимуществ можно легко получить, а само изобретение и его преимущества являются более понятными из последующего подробного описания при его рассмотрении в сочетании с сопутствующими чертежами, где фиг. 1 - схематическое представление С88М™;

фиг. 2 - схематическое представление технологического маршрута эволюционного О88М™; фиг. 3 - схематическое представление специализированной многосайтовой комбинаторной сборки; фиг. 4Ά-Ό - комбинации праймеров в реакции ТМСА;

фиг. 5 - карта праймеров, отжигающихся при сборке с шестью мутациями;

фиг. 6 - распределение возможных комбинаций с шестью сайтами мутаций. Стандарт: расчетный вариант распределения в идеальной ситуации, 1А: условия реакции 1 со штаммом Е. сой ХЬ1-В1ие, 7А: условия реакции 2 со штаммом Е. сой ХЬ1-В1ие, 13А: условия реакции 3 со штаммом Е. сой ХЬ1-В1ие, в целом: данные скомбинированы из 1А, 7А и 13А; 0х: мутаций нет, 1х: единичная мутация, 2х: две мутации, 3х: три мутации, 4х: четыре мутации, 5х: пять мутаций, 6х: шесть мутаций;

фиг. 7 - статистические расчеты по сравнению с экспериментальными данными при сборке с шестью мутациями;

фиг. 8 - карта праймеров, отжигающихся при сборке с четырьмя мутациями;

фиг. 9 - распределение возможных комбинаций с четырьмя сайтами мутаций. Стандарт: расчетный вариант распределения в идеальной ситуации, 2А: условия реакции 1 со штаммом Е. сой ХЬ1-В1ие; 8А: условия реакции 2 со штаммом Е. сой ХЬ1-В1ие; 14А: условия реакции 3 со штаммом Е. сой ХЬ1-В1ие, в целом: данные скомбинированы из 2А, 8А и 14А; 0х: мутаций нет, 1х: единичная мутация, 2х: две мутации, 3х: три мутации, 4х: четыре мутации;

фиг. 10. Распределение возможных комбинаций с четырьмя сайтами. Стандарт: расчетный вариант распределения в идеальной ситуации, 2В: условия реакции 1 со штаммом Е. сой 81Ы2. 8В: условия реакции 2 со штаммом Е. сой 81Ы2, 14В: условия реакции 3 со штаммом Е. сой 81Ы2, в целом: данные скомбинированы из 2В, 8В и 14В; 0х: мутаций нет, 1х: единичная мутация, 2х: две мутации, 3х: три мутации, 4х: четыре мутации;

фиг. 11 - карта праймеров, отжигающихся при сборке из трех мутаций;

фиг. 12 - распределение возможных комбинаций с тремя сайтами мутаций. Стандарт: расчетный вариант распределения в идеальной ситуации, 15А: условия реакции 3 со штаммом Е. сой ХЬ1-В1ие; 9В: условия реакции 2 со штаммом Е. сой 81012, 15В: условия реакции 3 со штаммом Е. сой 81Ы2, в целом: данные скомбинированы из 15А, 9В и 15В; 0х: мутаций нет, 1х: единичная мутация, 2х: две мутации, 3х: три мутации;

фиг. 13 - карта праймеров, отжигающихся с 5 сайтами мутаций и 13 мутантами;

фиг. 14А, В, С - уникальные варианты комбинаций при сборке из пяти сайтов мутаций и 13 праймеров. Распределение вариантов в цикле I ТМСА (А), после цикла II (В), карта отжига праймеров (С). Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения

Способ ТМСА способен быстро и эффективно получать специфический вариант гена, содержащий множественные изменения, или комбинаторную библиотеку генов, требуя для этого минимальных затрат и усилий, и может быть специализирован для получения смещенной комбинаторной библиотеки в соответствии с потребностями. Способ ТМСА может быть осуществлен без применения этапа лигирования и, следовательно, упрощает процесс получения множественных мутаций. Потребности конкретной библиотеки варьируются посредством экспериментов. Потенциальные сайты мутаций - потребности могут быть, например, 1) рационально спланированными заменами аминокислот или 2) эмпирически определенными изменениями индивидуальных аминокислот для получения желательного эффекта на уровне фермента (определяемыми посредством С88М™ и попыток скрининга). Каждую библиотеку создают с конкретным числом потенциальных сайтов мутаций. Может являться предпочтительным создание библиотеки, смещенной в сторону потомства с большим или меньшим числом мутаций в потенциальных сайтах мутаций. Подобным образом, может являться предпочтительным создание библиотеки, в которой существует смещение в сторону конкретной мутации или сайта мутации, либо смещение в противоположную сторону.

В практическом осуществлении или в тестировании настоящего изобретения можно использовать все способы и материалы, одинаковые с описанными в настоящем документе или эквивалентные им, где подходящие способы и материалы описаны в настоящем документе. Полнее содержание всех публикаций, патентных заявок, патентов и других упомянутых в настоящем документе источников информации приведено в качестве ссылки. Кроме того, упомянутые в настоящем документе материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения, если явно не указано иное.

- 3 020657

В этой заявке авторы настоящего изобретения представляют разработанный ими способ специализированной многосайтовой комбинаторной сборки, в целом проиллюстрированный на фиг. 1. Для сравнения фиг. 1 и 2 иллюстрируют эволюционный генный сайт-насыщающий мутагенез (ΟδδΜ), в котором каждое положение мутации может содержать две или более мутации для разных аминокислот. Эволюционный ΟδδΜ™ можно применять для внесения нуклеотидных изменений в специфический ген и для мутирования каждого кодона в открытой рамке считывания по всем другим аминокислотам для одного остатка или более за один раз. Таким образом, получают библиотеку ΟδδΜ™, в которой единичный клон содержит ДНК, имеющую одно изменение, в то время как полипептиды-потомки в библиотеке, полученной способом ТМСА, могут содержать множественные мутации, предпочтительно две или более, более предпочтительно три или более, более предпочтительно четыре или более, пять или более, шесть или более, восемь или более, десять или более и более предпочтительно двенадцать или более мутаций.

Применяя способ ΟδδΜ™, можно за один раз заменить один остаток, охватывая при этом все 20 аминокислот. Библиотеку скринируют, идентифицируя повышающие мутанты. Реакция ТМСА разработана для осуществления мутаций во многих сайтах одной молекулы. Реакцию ТМСА можно использовать для комбинирования повышающих мутантов, идентифицированных в библиотеке ΟδδΜ™. В условиях реакции ТМСА можно ожидать образования множественных продуктов ПЦР. Не ожидается, что продукты ПЦР подлежат трансформации и амплификации в клетках.

В контексте настоящего изобретения термин аминокислота, как применяют в настоящем документе, относится к любому органическому соединению, которое содержит аминогруппу (-ΝΗ₂), карбоксильную группу и карбоксильную группу (-СООН) предпочтительно как свободные группы или, альтернативно, после конденсации в виде частей пептидных связей. В данной области известны двадцать природных аминокислот, к которым относятся аланин (а1а или А), аргинин (агд или К), аспарагин (аки или Ν), аспарагиновая кислота (акр или Ό), цистеин (сук или С), глутаминовая кислота (д1и или Е), глутамин (дт или О), глицин (д1у или Ο), гистидин (Ык или Н), изолейцин (йе или I), лейцин (1еи или Ь), лизин (1ук или К), метионин (ше1 или М), фенилаланин (рЬе или Р), пролин (рго или Р), серин (кег или δ), треонин (Шт или Т), триптофан (1гр или V), тирозин (Туг или Υ) и валин (уа1 или V).

Термин амплификация (полимеразная реакция достройки) означает, что количество копий полинуклеотида увеличивается.

Термин соответствует при использовании в настоящем документе означает, что полинуклеотидная последовательность гомологична (т.е. идентична, не будучи строго эволюционно связанной с ней) всей последовательности или части последовательности эталонного полинуклеотида или, что полинуклеотидная последовательность идентична эталонной полипептидной последовательности. В противопоставление этому, термин комплементарна при использовании в настоящем документе означает, что комплементарная последовательность гомологична всей последовательности или части последовательности эталонного полинуклеотида. Для иллюстрации: нуклеотидная последовательность ТАТАС соответствует эталону ТАТАС и комплементарна эталонной последовательности ΟΤΑΤΑ.

Праймер определяют в настоящем документе как цепь нуклеиновой кислоты, которая способна отжигаться с матричной нуклеиновой кислотой и служит начальной точкой для амплификации ДНК. Праймер может быть полностью или частично комплементарен специфической области матричного полинуклеотида. Некомплементарный нуклеотид определяют в настоящем документе как ошибочное спаривание. Ошибочное спаривание может быть локализовано внутри праймера или на любом конце праймера. Предпочтительно, чтобы одно ошибочное спаривание нуклеотидов, более предпочтительно два и еще более предпочтительно три или более последовательных или не последовательных ошибочных спаривания нуклеотидов являлось (являлись) локализованным(и) внутри праймера. Праймер имеет от 6 до 200 нуклеотидов, предпочтительно от 20 до 80 нуклеотидов и более предпочтительно от 43 до 65 нуклеотидов. Более предпочтительно праймер имеет 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185 или 190 нуклеотидов. Прямой праймер определяют в настоящем документе как праймер, который комплементарен минус-цепи матричного полинуклеотида. Обратный праймер определяют в настоящем документе как праймер, который комплементарен плюс-цепи матричного полинуклеотида. Предпочтительно, чтобы прямой и обратный праймеры не содержали перекрывающихся нуклеотидных последовательностей. Не содержат перекрывающихся нуклеотидных последовательностей, как определяют в настоящем документе, означает, что прямой и обратный праймеры на отжигаются с областью минус-цепи и плюс-цепи, соответственно, матричного полинуклеотида, в котором плюс-цепь и минус-цепь комплементарны друг другу. В отношении отжига праймеров в одной и той же цепью матричного полинуклеотида не содержат перекрывающихся нуклеотидных последовательностей означает, что праймеры не содержат последовательностей, комплементарных одной и той же области одной и той же цепи матричного полинуклеотида.

Плюс-цепь означает то же самое, что и смысловая цепь, поэтому ее также можно называть кодирующей или нематричной цепью. Это такая цепь, которая имеет ту же последовательность, что и мРНК (за исключением того, что вместо нуклеотидов и в ней имеются нуклеотиды Т). Другая цепь, называемая

- 4 020657 матричной цепью, минус-цепью или антисмысловой цепью, комплементарна мРНК.

Праймеры, покрывающие одну и ту же избранную область матричного полинуклеотида определяют в настоящем документе как набор вырожденных праймеров, каждый из которых содержит по меньшей мере одно вырожденное положение, в котором представляющая интерес мутация представлена рядом разных нуклеотидов в вырожденном положении, или как набор вырожденных праймеров, содержащих по меньшей мере один вырожденный кодон, который соответствует по меньшей мере одному кодону матричного полинуклеотида или комбинацию таких наборов. Например, набором праймеров для всех возможных комбинаций мутаций в трех кодонах У276Р/3282Ь, Н, Р, К или С/Ь284Р (см., например, фиг. 4, 15 или 16) являются праймеры, покрывающие одну и ту же область матрицы. Праймеры, покрывающие одну и ту же избранную область матричного полинуклеотида также могут представлять собой, например, комбинацию специфических праймеров.

Расщепление ДНК относится к каталитическому расщеплению ДНК рестрикционным ферментом, который воздействует только на определенные последовательности в молекуле ДНК. Различные рестрикционные ферменты, используемые в настоящей работе, являются коммерчески доступными, а условия реакции, кофакторы и другие требования для них, использованы так, как это должно быть известно обычному специалисту в данной области. В аналитических целях обычно используют 1 мкг плазмиды или фрагмента ДНК приблизительно с 2 единицами фермента приблизительно в 20 мкл буферного раствора. В целях выделения фрагментов ДНК для конструирования плазмиды обычно от 5 до 50 мкг ДНК обрабатывают ферментом (от 20 до 250 единиц) в большем объеме. Подходящие буферы и количество субстрата для конкретных рестрикционных ферментов указываются производителем. Обычно используют время инкубации около 1 ч при 37°С, но эти условия можно варьировать в соответствии с инструкциями поставщика. После расщепления реакционную смесь можно подвергать электрофорезу в геле.

Рекомбинантные ферменты относятся к ферментам, полученным на основе методик рекомбинантной ДНК, т.е. полученным из клеток, трансформированных экзогенной конструкцией ДНК, кодирующей желательный фермент.

Синтетические ферменты представляют собой ферменты, полученные посредством химического синтеза.

Термин сайт рестрикции относится к узнаваемой последовательности, необходимой для проявления действия рестрикционного фермента и включает сайт каталитического расщепления. Принимают во внимание, что сайт расщепления может содержаться или не содержаться в пределах части сайта рестрикции (т.е. последовательности, содержащей ключевую детерминанту частоты встречаемости сайта рестрикции). Таким образом, во многих случаях релевантные сайты рестрикции содержат только последовательность небольшой неоднозначности с внутренним сайтом расщепления (например, О/ЛЛТТС в сайте ЕсоК1) или с непосредственно прилегающим сайтом расщепления (например, /ССХУСС в сайте ЕсоКИ). В других случаях релевантные сайты рестрикции ферментов (например, сайт Есо571 или СТОЛЛО (16/14)) содержат последовательность небольшой неоднозначности (например, последовательность СТОААО в сайте Есо571) с внешним сайтом расщепления (например, в участке Ν₁₆ сайта Есо571). Когда говорят, что фермент (например, рестрикционный фермент) расщепляет полинуклеотид, это надо понимать так, что рестрикционный фермент катализирует или ускоряет расщепление полинуклеотида.

Неопределенная потребность в основании применительно к сайту рестрикции относится к потребности в нуклеотидном основании, которая не задана в максимально полной мере, т.е. не является специфическим основанием (как, например, в неограничивающем примере, специфическое основание, выбранное из А, С, О и Т), но, скорее, может быть представлена любым основанием по меньшей мере из двух или более оснований. Общепринятые аббревиатуры, которые используются в данной области техники, а также в этой заявке для представления неопределенности оснований, включают следующие: К=О или А, У=С или Т, М=А или С, К=О или Т, 3=О или С, \У=А или Т, Н=А или С или Т, В=О или Т или С, У=О или С или А, Ό=Ο или А или Т, Ν=Α или С или О или Т.

Эталонная последовательность представляет собой определенную последовательность, используемую в качестве основы при сравнении последовательностей; эталонная последовательность может быть сокращенным вариантом большей последовательности, например сегментом полноразмерной последовательности кДНК или гена, представленной в списке последовательностей, или может содержать полную последовательность кДНК или гена. Обычно длина эталонной последовательности составляет по меньшей мере 20 нуклеотидов, чаще по меньшей мере 25 нуклеотидов и часто по меньшей мере 50 нуклеотидов. Поскольку каждый из двух полинуклеотидов может (1) содержать последовательность (т.е. часть полной полинуклеотидной последовательности), которая является сходной между двумя полинуклеотидами, и (2) дополнительно содержать последовательность, которая различается между двумя полинуклеотидами, сравнение последовательностей между двумя (или более) полинуклеотидами обычно проводят путем сравнения последовательностей двух полинуклеотидов в окне сравнения для идентификации и сравнения локальных областей сходства последовательностей.

Окно сравнения, как применяют в настоящем документе, относится к воображаемому сегменту, состоящему по меньшей мере из 20 смежных нуклеотидных положений, в котором можно провести сравнение полинуклеотидной последовательности с эталонной последовательностью, состоящей по

- 5 020657 меньшей мере из 20 смежных нуклеотидов, причем часть полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может содержать вставки или делеции (т.е. пропуски) порядка 20% или менее по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит вставок или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для подгонки окна сравнения можно проводить по алгоритму локальной гомологии Смита (διηίίίι апй ХУаЮгтап, Λάν Αρρΐ МаЛ, 1981; 8тйЬ апй ХУШегтагт 1. Теог. Βίοί., 1981; διηίίίι апй ХУаЮгтап. 1. Μοί. Βίοί., 1981; διηίίίι е! а1., 1. Мо1. Ενο1., 1981), по алгоритму выравнивания гомологии Нидлмена (№ей1етап апй ХУипсхск 1970), по способу поиска сходства Пирсона (Реагхоп апй Ыртап, 1988), посредством компьютерной реализации этих алгоритмов (САР, ΒΕδΤΡΙΤ, ΡΑδΤΑ и ΡΑδΤΑ в пакете программ ХУ®сопхш Сепейсх, версия 7.0, СепеОсх СотрЛет Сгоир, 575 §аепсе Ότ., МаЛхоп, ХУ1х.)„ либо посредством инспектирования, и выбирают наилучшее выравнивание (т.е. приводящее к наивысшему процентному показателю гомологии в окне сравнения), полученное различными способами.

Консервативные замены аминокислот относятся к взаимозаменяемости остатков, имеющих сходные боковые цепи. Например, группу аминокислот, имеющих алифатические боковые цепи, составляют глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; группу аминокислот, имеющих алифатическиегидроксильные боковые цепи, составляют серин и треонин; группу аминокислот, имеющих амидсодержащие боковые цепи, составляют аспарагин и глутамин; группу аминокислот, имеющих ароматические боковые цепи, составляют фенилаланин, тирозин и триптофан; группу аминокислот, имеющих основные боковые цепи, составляют лизин, аргинин и гистидин; а группу аминокислот, имеющих серосодержащие боковые цепи, составляют цистеин и метионин. Предпочтительными группами для консервативных замен аминокислот являются валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланинвалин и аспарагин-глутамин.

Термины фрагмент, производное и аналог при ссылке на эталонный полипептид включают полипептид, который сохраняет по меньшей мере одну биологическую функцию или активность, которая, по меньшей мере, является, по существу, такой же, как у эталонного полипептида. Кроме того, термины фрагмент, производное и аналог могут быть проиллюстрированы молекулой типа проформа, например пробелком с низкой активностью, который можно модифицировать посредством расщепления для получения зрелого фермента со значительно более высокой активностью.

Термин ген означает сегмент ДНК, вовлеченный в выработку полипептидной цепи; он включает области, предшествующие кодирующей области и следующие за ней (лидерная и концевая часть), а также промежуточные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами).

Термин гетерологичная означает, что последовательность одноцепочечной нуклеиновой кислоты неспособна гибридизироваться с другой последовательностью одноцепочечной нуклеиновой кислоты или комплементарной к ней. Таким образом, области гетерологии означают, что участки полинуклеотидов или полинуклеотиды в пределах своей последовательности имеют участки или области, которые неспособны гибридизироваться с другой нуклеиновой кислотой или полинуклеотидом. Такие области или участки являются, например, участками мутаций.

Термин гомологичная или гомеологичная означает, что последовательность одноцепочечной нуклеиновой кислоты может гибридизироваться с комплементарной последовательностью одноцепочечной нуклеиновой кислоты. Степень гибридизации может зависеть от многих факторов, включая количественный показатель идентичности между последовательностями и условия гибридизации, такие как температура и концентрация соли, как обсуждают ниже. Предпочтительно область идентичности составляет более приблизительно 5 п.о., более предпочтительно область идентичности составляет более 10 п.о.

Термин идентичная или идентичность означает, что две последовательности нуклеиновой кислоты имеют одинаковую последовательность или комплементарную последовательность. Таким образом, участки идентичности означает, что области или участки полинуклеотида, либо весь полинуклеотид идентичны или комплементарны участкам другого полинуклеотида либо всему полинуклеотиду.

Термин выделенный означает, что материал извлечен из его первоначальной окружающей среды (например, из природной окружающей среды, если он встречается в природе). Например, природный полинуклеотид или фермент, присутствующий в живом организме животного, не является выделенным, но тот же полинуклеотид или фермент, отделенный от части или от всех материалов, сосуществующих в природной системе, является выделенным. Такие полинуклеотиды могут быть частью вектора, и/или такие полинуклеотиды или ферменты могут быть частью композиции, но, тем не менее, являться выделенными в том смысле, что указанные вектор или композиция не являются составной частью их природной окружающей среды.

Под выделенной нуклеиновой кислотой подразумевают нуклеиновую кислоту, например, молекулу ДНК или РНК, которая непосредственно не граничит с 5' и 3' фланкирующими последовательностями, с которыми она непосредственно граничит, будучи представленной в природном геноме того организма, из которого она происходит. Таким образом, этот термин описывает, например, нуклеиновую кислоту, которая встроена в вектор, такой как плазмидный или вирусный вектор, нуклеиновую кислоту, которая встроена в геном гетерологичной клетки (или в геном гомологичной клетки, но не в тот сайт, в котором

- 6 020657 она встречается в природе); и нуклеиновую кислоту, которая существует в виде отдельной молекулы, например фрагмент ДНК, полученный в результате ПЦР-амплификации или расщепления рестрикционным ферментом, либо молекулу РНК, полученную посредством транскрипции ίη νίίτο. Этот термин также описывает рекомбинантную нуклеиновую кислоту, которая образует часть гибридного гена, кодирующую дополнительные полипептидные последовательности, которые можно использовать, например, при получении слитого белка.

Цитирование относится к процессу образования фосфодиэфирных связей между цепями нуклеиновой кислоты (§атЬгоок с1 а1., 1982, р. 146; §атЬгоок, 1989). ДНК-лигаза может соединять вместе две цепи ДНК, которые имеют одноцепочечные разрывы (разрыв в обеих комплементарных цепях ДНК). Альтернативно, двухцепочечной разрыв исправляет другой тип ДНК-лигазы с использованием комплементарной цепи в качестве матрицы, но, тем не менее, необходимо воздействие ДНК-лигазы для создания конечной фосфодиэфирной связи и полной репарации ДНК. Если не предусмотрено иное, то лигирование можно осуществлять с применением известных буферов и условий с помощью 10 единиц ДНКлигазы Т4 (лигазы) на 0,5 мкг приблизительно эквимолярного количества фрагментов ДНК, подлежащих лигированию. Продукты не лигированы относится к отсутствию образования фосфодиэфирных связей между концами нуклеиновой кислоты, полученной в результате амплификации целого кольцевого двухцепочечного матричного полинуклеотида при использовании праймеров.

Термин мутации определяют как изменения в последовательности дикого типа или в последовательности родительской нуклеиновой кислоты, а также изменения в последовательности пептида. Такие мутации могут быть точечными мутациями, такими как транзиции или трансверсии. Мутация может представлять собой изменение одного или более нуклеотидов или кодируемых аминокислотных последовательностей. Мутации могут представлять собой делеции, инсерции или дупликации.

Как применяют в настоящем документе, вырожденная нуклеотидная последовательность Ν,Ν,Ν представлена триплетами, в которых Ν может означать А, С, С или Т.

Термин природный, как применяют в настоящем документе применительно к объекту, относится к тому факту, что объект может быть найден в природе. Например, природной является такая полипептидная или полинуклеотидная последовательность, которая присутствует в организме (включая вирусы), и которую можно выделить из природного источника, но которая не является преднамеренно модифицированной человеком в лаборатории. Обычно термин природный относится к объекту, присутствующему у индивида без патологии (без заболевания), то есть является типичным для биологического вида.

Как применяют в настоящем документе, молекула нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере одно основание или одну пару оснований, в зависимости от того, является ли она одноцепочечной или двухцепочечной соответственно. Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты может с химической точки зрения исключительно или по типу химер принадлежать к любой группе нуклеотидсодержащих молекул, как это иллюстрируется, но без ограничений, следующими группами молекул нуклеиновых кислот: РНК, ДНК, геномные нуклеиновые кислоты, негеномные нуклеиновые кислоты, природные и не встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты, а также синтетические нуклеиновые кислоты. Это включает в качестве неограничивающих примеров нуклеиновые кислоты, связанные с любыми органеллами, такими как митохондрии, рибосомная РНК и молекулы нуклеиновых кислот, состоящих по типу химер из одного или более компонентов, которые не встречаются в природе наряду с природными компонентами. В дополнение к этому молекула нуклеиновой кислоты может частично содержать один или более компонентов, не имеющих отношения к нуклеотидным основаниям, как это иллюстрируется, но, не ограничиваясь ими, аминокислотами и сахарами. Таким образом, в качестве неограничивающего примера, рибозим, который отчасти имеет нуклеотидную основу и отчасти белковую основу, можно рассматривать как молекулу нуклеиновой кислоты. В дополнение к этому в качестве неограничивающего примера молекулу нуклеиновой кислоты, меченную поддающейся выявлению группой, например радиоактивной или, в альтернативном варианте, нерадиоактивной меткой, точно так же можно рассматривать как молекулу нуклеиновой кислоты.

Термины последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая, или последовательность ДНК, кодирующая, или нуклеотидная последовательность, кодирующая специфический белок или полипептид, относятся к последовательности ДНК, которая транскрибируется и транслируется в белок или полипептид, когда она помещена под контроль соответствующих регуляторных последовательностей. Промоторная последовательность представляет собой регуляторную область ДНК, способную связывать РНК-полимеразу в клетке и инициировать транскрипцию нижележащей кодирующей последовательности (в направлении 3'). Промотор является частью последовательности ДНК. Эта область последовательности имеет на своем З'-конце стартовый кодон. Промоторная последовательность, действительно, включает минимальное число оснований с элементами, необходимыми для инициации транскрипции на уровне выявления выше фонового. Однако после того как РНК-полимераза связывается с последовательностью, а транскрипция инициируется на стартовом кодоне (3'-конец с промотором), транскрипция идет вниз, в направлении 3'. В пределах промоторной последовательности находится сайт инициации транскрипции (легко определяемый картированием с нуклеазой §1), а также домены связывания белка (консенсусные последовательности), ответственные за связывание РНК-полимеразы.

- 7 020657

Термины нуклеиновая кислота, кодирующая белок или пептид, или ДНК, кодирующая белок или пептид, или полинуклеотид, кодирующий белок или пептид и другие синонимические термины охватывают полинуклеотид, который включает только кодирующую последовательность для белка или пептида, а также полинуклеотид, который включает дополнительную кодирующую и/или некодирующую последовательность.

В соответствии с этим, в неограничивающем варианте осуществления изобретения библиотека нуклеиновых кислот состоит из коллекции одной или более молекул нуклеиновой кислоты на основе векторов. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения библиотека нуклеиновых кислот состоит из коллекции молекул нуклеиновой кислоты, не основанной на векторах. Еще в одном предпочтительном варианте осуществления изобретения библиотека нуклеиновых кислот состоит из комбинированной коллекции молекул нуклеиновой кислоты, которая частично основана на векторах и частично не связана с векторами. Предпочтительно, чтобы коллекция молекул, составляющая библиотеку, допускала возможность поиска и разделения в соответствии с отдельными разновидностями молекул нуклеиновой кислоты.

Термин олигонуклеотид (или синонимически олиго) относится или к одноцепочечному полидезоксинуклеотиду, или к двум комплементарным цепям полидезоксинуклеотида, которые можно синтезировать химически. Такие синтетические олигонуклеотиды могут иметь или не иметь 5'-фосфат. Те олигонуклеотиды, которые не имеют этого фосфата, не лигируются с другим олигонуклеотидом без добавления фосфата с помощью АТФ в присутствии киназы. Синтетический олигонуклеотид лигируется с фрагментом, который не был дефосфорилирован.

Как применяют в настоящем документе, термин родительский полинуклеотидный набор означает набор, состоящий из одного или более разных видов полинуклертида. Обычно этот термин используется по отношению к полинуклеотидному набору потомства, которое предпочтительно было получено в результате мутагенеза родительского набора, применительно к которому термины родительский, стартовый и матричный используют взаимозаменяемо.

Как применяют в настоящем документе, термин физиологические условия относится к температуре, рН, ионной силе, вязкости и тому подобным биохимическим параметрам, которые совместимы с живым организмом и/или которые обычно существуют внутриклеточно в живой культуре дрожжевых клеток или клеток млекопитающих. Например, внутриклеточные условия в дрожжевой клетке, растущей в типичных условиях лабораторной культуры, являются физиологическими условиями. Подходящие условия реакции ίη νίίτο для транскрипционных коктейлей ίη νίίτο обычно соответствуют физиологическим условиям. Как правило, физиологические условия ίη νίίτο включают 50-200 мМ ЫаС1 или КС1, рН 6,5-8,5, 20-45°С и 0,001-10 мМ двухвалентного катиона (например, Мд''. Са ), предпочтительно приблизительно 150 мМ ЫаС1 или КС1, рН 7,2-7,6, 5 мМ двухвалентного катиона и часто включают 0,01-1,0% неспецифического белка (например, ΒδΑ). Часто может присутствовать неионный детергент (Тгееп, ΝΡ-40, Ττίίοη Х-100), обычно в количестве приблизительно от 0,001 до 2%, в типичном варианте от 0,05 до 0,2% (об./об.). Специфические водные условия могут быть выбраны специалистом-практиком в соответствии с общепринятыми методами. В качестве общего руководства могут быть применены следующие забуференные водные условия: 10-250 мМ №С1, 5-50 мМ Трис-НС1, рН 5-8, с необязательным добавлением двухвалентного катиона (катионов), и/или хелаторов металлов, и/или неионных детергентов, и/или мембранных фракций, и/или противопенных средств, и/или сцинтилляторов.

Для описания последовательности двухцепочечных полинуклеотидов в настоящем документе используется стандартное правило (от 5' до 3').

Термин родственные полинуклеотиды означает, что области или участки полинуклеотидов идентичны, а области или участки полинуклеотидов гетерологичны.

Специфическая гибридизация, определяется в настоящем документе как образование гибридов между первым полинуклеотидом и вторым полинуклеотидом (например, полинуклеотидом, имеющим иную, но, по существу, идентичную последовательность с первым полинуклеотидом), причем, по существу, неродственные полинуклеотидные последовательности не образуют гибридов в смеси.

Строгие условия гибридизации означает, что гибридизация происходит только в том случае, если имеется по меньшей мере 90% идентичность, предпочтительно по меньшей мере 95% идентичность и наиболее предпочтительно по меньшей мере 97% идентичность между последовательностями. См. публикацию δαιηόΐΌοΚ еί а1., 1989, полное содержание которой приведено в настоящем документе в качестве ссылки.

Термин дикий тип означает, что полипептид не содержит каких-либо мутаций. Белок дикого типа означает, что белок содержит природную аминокислотную последовательность, а его активность находится на природном уровне.

Источники исходных полинуклеотидов можно выделять из отдельных организмов (изолятов), коллекций организмов, выращенных в определенной среде (обогащенных культур), или, наиболее предпочтительно из некультивированных организмов (образцов из окружающей среды). Для получения полинуклеотидов, кодирующих новые фенотипы биологической активности, из источников, которые находятся в окружающей среде, наиболее предпочтительно применение способа, не зависящего от куль- 8 020657 тивирования, поскольку он позволяет получить доступ к неизмененным ресурсам биологического разнообразия.

Микроорганизмы, из которых можно получать полинуклеотиды, включают прокариотические микроорганизмы, такие как ЕнЬаШепа и ЛгскасЬасЮпа. и низшие эукариотические микроорганизмы, такие как грибы, некоторые водоросли и простейшие. Полинуклеотиды можно выделять из образцов, полученных в окружающей среде, причем в этом случае нуклеиновую кислоту можно выделить без культивирования организма либо выделить из одного или более культивированных организмов. В одном из аспектов такие микроорганизмы могут представлять собой экстремофилы, в частности гипертермофилы, психрофилы, психротрофы, галофилы, барофилы и ацидофилы.

Полинуклеотиды, отобранные и выделенные так, как описано в настоящем документе выше, вводят в подходящую клетку-хозяина. Предпочтительно, чтобы отобранные полинуклеотиды уже были встроены в вектор, который включает соответствующие контрольные последовательности. Клеткой-хозяином может быть клетка высших эукариот, например клетка млекопитающего, или клетка низших эукариот, например клетка дрожжей, или предпочтительно клеткой-хозяином является прокариотическая клетка, такая как, бактериальная клетка. Введение конструкции в клетку-хозяина можно осуществлять посредством трансфекции при помощи фосфата кальция, трансфекции, опосредованной ΌΕΑΕ-декстраном, или электропорации (Όανίδ с1 а1., 1986).

В качестве репрезентативных примеров подходящих хозяев можно упомянуть: бактериальные клетки, такие как Е. сой и Ркеийотопак йиогексепк, бактериофаги, грибковые клетки, такие как дрожжи, Рюй1а ракФйк и АкрегдШик шдег, клетки насекомых, такие как ОгокорНПа §2 и §ройор!ега 819, клетки животных, такие как СНО, СО8 или клетки меланомы Вотек, аденовирусы и растительные клетки. Библиотеку ТМСА можно получать, например, в клетках Е. сой в форме плазмиды, после чего библиотеку можно вводить в других хозяев. Считается, что подбор подходящего хозяина по объяснениям в настоящем документе находится в пределах компетенции специалистов в данной области.

С конкретными ссылками на различные культуральные системы клеток млекопитающих, которые можно использовать для экспрессии рекомбинантного белка, примеры систем экспрессии млекопитающих включают линию СО8-7 почечных фибробластов обезьяны, описанную в 8У40-1гапк1огтей 81т1аи се11к киррой 1йе герйсайоп о1 еаг1у 8У40 тикайк (СШ/таи 1981), и другие линии клеток, способные экспрессировать совместимый вектор, например, линии клеток С127, 3Т3, СНО, НеЬа и ВНК. Векторы экспрессии для млекопитающих содержат репликатор, подходящий промотор и энхансер, а также любые необходимые сайты связывания рибосом, сайт полиаденилирования, сайты донора и акцептора сплайсированного фрагмента, последовательности терминации транскрипции и 5'-фланкирующие нетранскрибируемые последовательности. Последовательности ДНК, полученные при сплайсинге 8У40, и сайты полиаденилирования можно использовать для предоставления необходимых нетранскрибируемых генетических элементов.

Клетки-хозяева, содержащие представляющие интерес полинуклеотиды, можно культивировать в общепринятой питательной среде, модифицированной соответствующим образом для активации промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов. Условия культивирования, такие как температура, рН и т.п., являются применявшимся ранее для клеток-хозяев, выбранных для экспрессии, и должны быть очевидными для среднего специалиста.

В качестве репрезентативных примеров экспрессирующих векторов, которые можно использовать, стоит упомянуть вирусные частицы, бакуловирус, фаг, плазмиды, фагмиды, космиды, фосмиды, искусственные бактериальные хромосомы, вирусную ДНК (например, осповакцины, аденовируса, вируса птичьей оспы, вируса ложного бешенства и производные 8У40), искусственные хромосомы на основе Р1, дрожжевые плазмиды, дрожжевые искусственные хромосомы и любые другие векторы, специфичные для представляющих интерес конкретных хозяев (таких как бациллы, аспергиллы и дрожжи). Таким образом, ДНК можно включить, например, в любой из множества экспрессирующих векторов для экспрессии полипептида. Такие векторы включают хромосомные, нехромосомные и синтетические последовательности ДНК. Большое число подходящих векторов известны специалисту в данной области и являются коммерчески доступными. В качестве примера можно привести следующие векторы. Бактериальные: векторы рОЕ (Ц1адеп), плазмиды рВ1ие8сйр1, векторы рИН, векторы 1атЬйа-2АР (8йа1адепе), р!гс99а, рКК223-3, рОР54(1 рК1Т2Т (Рйагташа); эукариотические: рХТ1, р§С5 (8йа1адепе), р8УК3, рВРУ, рМ8С, р8УЪ8У40 (Рйагташа). Однако можно использовать любую другую плазмиду или другой вектор при том условии, что они могут реплицироваться и сохранять жизнеспособность в организме хозяина. По настоящему изобретению можно использовать как низкокопийные, так и высококопийные векторы.

Предпочтительный тип вектора для использования в настоящем изобретении содержит точку начала репликации 1-фактора. ί-Фактор (или фактор фертильности) у Е. сой представляет собой плазмиду, которая с высокой частотой осуществляет перенос самой себя во время конъюгации и менее частый перенос бактериальной хромосомы, как таковой. Особенно предпочтительный вариант осуществления изобретения заключается в использовании клонирующих векторов, упоминаемых под названием фосмиды или векторов искусственной бактериальной хромосомы (ВАС). Их можно получать из 1-фактора Е. сой, который способен стабильно интегрировать крупные сегменты геномной ДНК. При интеграции с ДНК из

- 9 020657 смешанного некультивированного образца из внешней среды это позволяет получить крупные геномные фрагменты в форме стабильной библиотеки ДНК из внешней среды.

Другим предпочтительным типом вектора для использования по настоящему изобретению является космидный вектор. Космидные векторы были первоначально сконструированы для клонирования и размножения крупных сегментов геномной ДНК. Клонирование в космидных векторах подробно описано в Мо1еси1аг С1ои1ид: А 1аЬога1огу Мапиа1 (ЗатЬгоок с1 а1., 1989).

Последовательность ДНК в экспрессирующем векторе функционально связана с соответствующей контрольной последовательностью (последовательностями) экспрессии (промотором) для управления синтезом РНК. Специфические поименованные бактериальные промоторы включают 1ас1, ΗκΖ. Т3, Т7, др1. 1атЬба Р_к, Рь и 1гр. Эукариотические промоторы включают немедленно-ранний промотор СМУ, промотор тимидинкиназы НЗУ, поздний и ранний промоторы ЗУ40, ЬТК ретровируса и промотор металлотионеина-Ι мыши. Подбор соответствующего вектора и промотора полностью находится в компетенции обычного специалиста в данной области. Экспрессирующий вектор содержит также сайт связывания рибосом для инициации трансляции и терминатор транскрипции. Вектор также может включать соответствующие последовательности для амплификации экспрессии. Промоторные области можно выбирать из любого желательного гена с применением векторов с САТ (хлорамфеникол-трансферазой) или других векторов с селективными маркерами.

В дополнение к этому экспрессирующие векторы предпочтительно содержат один или более генов селективных маркеров. предоставляющих фенотипический признак для отбора трансформированных клеток-хозяев. например дигидрофолатредуктазу или устойчивость к неомицину для культуры эукариотических клеток либо устойчивость к тетрациклину или ампициллину для Е. сой.

Обычно рекомбинантные экспрессирующие векторы включают точки начала репликации и селективные маркеры. позволяющие трансформацию клеток-хозяев. например ген устойчивости к ампициллину для Е. сой и ген ТКР 1 для З. Сегеу181ае, а также промотор, полученный из гена с высокой экспрессией для управления транскрипцией нижележащей структурной последовательности. Такие промоторы можно получать из оперонов, кодирующих, среди прочего, гликолитические ферменты, такие как 3фосфоглицераткиназа (РОК), α-фактор, кислая фосфатаза или белки теплового шока. Гетерологичную структурную последовательность объединяют в соответствующей фазе с последовательностями инициации и терминации трансляции, а также предпочтительно с лидерной последовательностью, способной управлять секрецией транслируемого белка в периплазматическое пространство или внеклеточную среду.

Стратегия клонирования позволяет осуществлять экспрессию как через управляемые вектором, так и через эндогенные промоторы; работа промотора вектора может быть важной для экспрессии генов, эндогенные промоторы которых не функционируют в Е. сой.

Предпочтительно, чтобы ДНК, выделенную или полученную из микроорганизмов, можно было вставить в вектор или плазмиду перед использованием зондов для отбора ДНК. Предпочтительно, чтобы такие векторы или плазмиды содержали регуляторные последовательности для экспрессии, включая промоторы, энхансеры и т.п. Такие полинуклеотиды могут быть частью вектора и/или композиции, но все еще быть выделенными в том смысле, что указанный вектор или композиция не являются частью их природной окружающей среды. Особенно предпочтительные фаг или плазмида, а способы введения и упаковки в них подробно описаны в способе, указанном в настоящем документе.

Любой источник нуклеиновой кислоты в очищенной форме можно использовать в качестве стартовой нуклеиновой кислоты (также определяемой как матричный полинуклеотид). Таким образом, в способе можно применять ДНК или РНК, включая матричную РНК, причем указанная ДНК или РНК может быть одноцепочечной и предпочтительно двухцепочечной. В дополнение к этому можно использовать гибрид ДНК-РНК, который содержит по одной цепи каждой из них. Последовательность нуклеиновой кислоты можно варьировать по длине в зависимости от размера последовательности нуклеиновой кислоты, подлежащей мутагенезу. Предпочтительно, чтобы специфическая последовательность нуклеиновой кислоты имела длину от 50 до 50000 пар оснований и более предпочтительно 50-11000 пар оснований.

Нуклеиновую кислоту можно получать из любого источника, например из плазмид, таких как рВК322, из клонированной ДНК или РНК либо из природной ДНК или РНК из любого источника, включая бактерии, дрожжи, вирусы и высшие организмы, такие как растения или животные. ДНК или РНК можно экстрагировать из крови или тканевого материала. Матричный полинуклеотид можно получать посредством амплификации, применяя цепную реакцию полинуклеотидов (ПЦР, см. патент США № 4683202 и патент США № 4683195). В альтернативном варианте полинуклеотид может присутствовать в векторе, присутствующем в клетке, причем достаточное количество нуклеиновой кислоты можно получать, культивируя указанную клетку и экстрагируя нуклеиновую кислоту из клеток способами, известными в данной области.

Первоначальную небольшую популяцию специфических последовательностей нуклеиновой кислоты, имеющих мутации, можно получать множеством разных способов. Мутации можно получать посредством ПЦР, допускающей ошибки. ПЦР, допускающая ошибки, использует условия полимеризации с низкой точностью для введения небольшого числа точечных мутаций в длинную последовательность случайным образом. В альтернативном варианте мутации в матричный полинуклеотид можно вводить

- 10 020657 посредством направляемого олигонуклеотидами мутагенеза. При направляемом олигонуклеотидами мутагенезе из полинуклеотида удаляют короткую последовательность, используя расщепление рестрикционным ферментом, и замещают ее синтетическим полинуклеотидом, в котором различные основания, присутствующие в первоначальном источнике, были изменены. Последовательность полинуклеотида также можно изменять посредством химического мутагенеза. Химические мутагены включают, например, бисульфит натрия, азотистую кислоту, гидроксиламин, гидразин или муравьиную кислоту. Другие средства, которые являются аналогами предшественников нуклеотидов, включают нитрозогуанидин, 5бромурацил, 2-аминопурин или акридин. Обычно эти средства добавляют в реакцию ПЦР вместо предшественника нуклеотидов, внося, таким образом, мутации в последовательность. Можно также использовать интеркалирующие средства, такие как профлавин, акрифлавин, хинакрин и т.п. Случайный мутагенез полинуклеотидной последовательности также достигают при помощи рентгеновского или ультрафиолетового облучения. Обычно мутагенизированные таким способом плазмидные полинуклеотиды вводят в Е. сой и размножают как пул или библиотеку гибридных плазмид.

В альтернативном варианте в природе можно найти небольшую смешанную популяцию специфических нуклеиновых кислот, в которой они могут состоять из разных аллелей одного и того же гена или из одного и того же гена от разных, но родственных биологических видов (т.е. родственных генов). В альтернативном варианте они могут представлять собой родственные последовательности ДНК, обнаруженные у одного биологического вида, например гены иммуноглобулинов.

После получения смешанной популяции специфических последовательностей нуклеиновой кислоты полинуклеотиды можно использовать напрямую или вставлять в соответствующий клонирующий вектор, применяя способы, хорошо известные в данной области.

Выбор вектора зависит от размера полинуклеотидной последовательности и от клетки-хозяина, используемой в способах по этому изобретению. Матрицы по этому изобретению могут представлять собой плазмиды, фаги, космиды, фагмиды, вирусы (например, ретровирусы, вирус парагриппа, вирусы герпеса, реовирусы, парамиксовирусы и т.п.) или их избранные фрагменты (например, белок оболочки, гликопротеин шипа, белок капсида). Например, космиды и фагмиды предпочтительны в том случае, если специфическая последовательность нуклеиновой кислоты, подлежащая мутагенезу, велика, поскольку эти векторы способны стабильно размножать крупные полинуклеотиды.

Для простоты способ ТМСА по изобретению пояснен на примере сборки шести точечных мутаций в шести разных сайтах.

Во-первых, конструируют и синтезируют шесть праймеров. Каждый праймер содержит точечную мутацию по сравнению с последовательностью дикого типа. Три олигонуклеотида конструируют как прямые праймеры, а еще три - как обратные праймеры для отжига с геном (фиг. 5). Все шесть олигонуклеотидов смешивают вместе и используют для вызова реакций ТМСА в условиях, которые описаны в примерах. Затем завершившиеся реакции ТМСА верифицируют в агарозных гелях для того, чтобы определить, оказались ли они успешными. К реакционным смесям после ТМСА добавляют рестрикционный фермент Όρπί, чтобы разрушить матричную кольцевую ДНК. Для того чтобы фермент Όρπί мог подействовать, матричная ДНК должна происходить из хозяина Е. сой, клетки которого способны метилировать ДНК. Реакционными смесями, прошедшими обработку Όρπί, трансформируют клетки Е. сой для выделения ДНК с желательными мутациями. Трансформанты скринируют посредством секвенирования или другого подходящего анализа.

Способ по изобретению не ограничивается шестью сайтами. Этим способом можно собирать большее или меньшее число положений. Он также не ограничивается единственным изменением в одном положении. Можно конструировать множественные праймеры для охвата разных изменений в одном и том же положении с одним изменением в каждом праймере. Клетки Е. сой использованы для демонстрации, однако в этом способе можно применять и других бактериальных хозяев. Способом по изобретению можно не только вводить точечные мутации, этим способом также можно осуществлять делеции, инсерции или множественные мутации с вырожденными праймерами.

Реакции ТМСА можно изменять с помощью концентрации праймера, Тт праймера (температуру отжига с матрицей), ДНК-полимеразы, концентрации матрицы, комбинации праймеров и разных хозяев для управления сборкой изменений в разных сайтах.

Сборку можно проводить ίπ νίϋΌ или ίπ утуо, либо комбинируя оба подхода.

Фиг. 5 иллюстрирует карту праймеров, отжигающихся с геном. Основное применение способа по изобретению заключается в комбинаторной переборке повышающих мутантов ΟδδΜ™. Однако способ по изобретению может быть также полезен, например, для любых других применений, перечисленных ниже.

1. ТМСА можно использовать для осуществления специфических изменений в гене, включая мутацию, делецию и инсерцию.

2. ТМСА можно использовать для получения специфического варианта гена на основе гена дикого типа.

3. ТМСА можно использовать для комбинирования мутации, делеции или инсерции.

4. ТМСА можно использовать для изготовления контролируемым образом комбинаторной библио- 11 020657 теки мутации, делеции или инсерции.

5. ТМСА можно использовать для получения комбинаторной многосайтовой библиотеки ΟδδΜ™.

В целом, настоящее изобретение относится к способу получения в потомстве множества полинуклеотидов, имеющих разные комбинации различных мутаций во множественных сайтах. Указанный способ можно частично осуществлять, комбинируя по меньшей мере одну или более из следующих стадий.

Получение информации о последовательности полинуклеотида (первого или матричного). Например, последовательность может представлять собой последовательность быть дикого типа, мутированного дикого типа или не встречающуюся в природе. Информация о последовательности может относиться ко всему полинуклеотиду или к его частичным областям, представляющим интерес, таким как последовательность, кодирующая сайт связывания, определяющая специфичность связывания, катализ или субстратную специфичность. Полинуклеотид может содержать такую последовательность, как открытая рамка считывания, ген, последовательность, кодирующая полипептид, или последовательность, кодирующая фермент, с сигнальной или секреторной последовательностью, либо без них.

Идентификация трех или более мутаций, представляющих интерес, на протяжении последовательности полинуклеотида, например мутаций в 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 20 или более положениях. Мутации могут представлять собой изменения на уровне полинуклеотидной последовательности или мутации в аминокислотной последовательности, кодируемой полинуклеотидной последовательностью, например кодонами. Положения могут быть заранее определены посредством абсолютного положения или в контексте окружающих остатков либо гомологии. Предпочтительно известны последовательности, фланкирующие положения мутаций с каждой стороны. Каждое положение мутации может содержать две или более мутации, таких как мутации разных аминокислот. Такие мутации можно идентифицировать, применяя генный сайт-насыщающий мутагенез (ΟδδΜ), как описано выше, а также в патентах США №№ 6171820, 6562594 или 6764835.

Получение праймеров, содержащих представляющие интерес мутации, по отношению к матричной последовательности.

Праймеры могут представлять собой синтетические олигонуклеотиды. Предпочтительно праймер получают для каждой представляющей интерес мутации. Мутации могут представлять собой изменения в одном или более нуклеотидах либо в кодируемой последовательности аминокислот, инсерции или делеции. Таким образом, для положения, имеющего 3 представляющих интерес мутации, можно использовать в этом положении 3 праймера. Праймер также можно получать в виде пула праймеров, содержащих вырожденное положение, чтобы представляющая интерес мутация находилась в диапазоне любого нуклеотида или встречающихся в природе аминокислот, либо в подмножестве этого диапазона. Например, можно получать пул праймеров с преимуществом мутациям для остатков алифатических аминокислот.

Праймеры можно получать как прямые или обратные праймеры, предпочтительно как по меньшей мере один прямой праймер и по меньшей мере один обратный праймер и более предпочтительно как относительно уравновешенное число праймеров каждого типа (например, 3 прямых и 4 обратных). 3 прямых праймера могут быть выбраны из относительно смежных с аналогично смежными обратными праймерами, например 1Р, 2Р, 3Р, 4К, 5К, 6К, 7К. Когда мутации тесно позиционированы вместе, может оказаться удобным применение праймеров, которые содержат мутации более чем в одном положении или различные комбинации мутаций во многих положениях.

Получение полинуклеотида, содержащего матричный полинуклеотид.

Предпочтительно, чтобы полинуклеотид был кольцевым, более предпочтительно сверхспиральным, таким как плазмида или вектор для клонирования, секвенирования или экспрессии. Полинуклеотид может быть одноцепочечным (оцДНК) и предпочтительно двухцепочечным (дцДНК). Например, по способу ТМСА подвергают сверхспиральную (сс) матрицу дцДНК этапу нагревания при 95°С в течение 1 мин, матрица не становится оцДНК (см. Ьеуу, ΝΑΚ, 28 (12):е57(1-уи) (2000), что показывает, что нагревание сс дцДНК при 95°С в течение 5 мин не приводит к образованию молекул оцДНК и является обратимым, если молекулы охлаждают после нагревания (стр. ίί-ίίί, фиг. 2)).

Добавление праймеров к матричному полинуклеотиду в реакционной смеси при таких условиях, которые позволяют праймерам отжигаться с полинуклеотидом.

Предпочтительно праймеры добавляют к полинуклеотиду в единственной реакционной смеси, но можно добавлять их во множественных реакциях в соответствии с дизайном эксперимента.

Проведение полимераэной достройки праймеров, предпочтительно позволяющее проводить достройку полностью вокруг матричной кольцевой молекулы.

Продукты достройки (в соответствии с данными в настоящем документе определениями потомство или модифицированный достроенный полинуклеотид) можно амплифицировать общепринятыми способами.

Продукты можно анализировать по длине, последовательности, желательным свойствам нуклеиновых кислот или экспрессировать в виде полинуклеотидов и/или полипептидов. Другие способы анализа включают гибридизацию ίη-κίΐιι. скрининг по последовательности или скрининг по экспрессии. Анализ может включать один или более циклов скрининга и отбор по желательному свойству.

Продуктами также можно трансформировать в клетке или другой системе экспрессии, такой как

- 12 020657 бесклеточная система. Бесклеточная система может содержать ферменты, имеющие отношение к репликации, репарации, рекомбинации, транскрипции или трансляции ДНК. Иллюстративные хозяева включают клетки и линии клеток бактерий, дрожжей, растений и животных, в том числе, Е. сой, РкеиДошоиак Лиогс5ссп5. РюЫа раЧогк и АкрегдШик шдег. Например, в качестве хозяина могут быть использованы штаммы Е. сой ХЬ1-В1ие или 81Ы2. При использовании Е. сой с Όρηί (что можно использовать для удаления ненужной матрицы после реакции), матричная ДНК может происходить из хозяина Е. сой, который способен метилировать ДНК. Клетки можно использовать для экспрессии полинуклеотидовпотомков.

Полинуклеотиды или полипептидные продукты экспрессии можно выделять из клеток и анализировать по длине, последовательности, желательным свойствам нуклеиновых кислот или экспрессировать в виде полипептидов. Анализ может включать один или более циклов скрининга и отбор по желательному свойству.

Способ по изобретению можно реализовать с одним и тем же праймером или с разными праймерами при разных условиях реакции, чтобы способствовать получению продуктов, имеющих разные комбинации или разное число мутаций, например при условиях 1А, 7А и 13А, проиллюстрированных в примерах.

Посредством осуществления вышеописанного способа изобретение относится также к одному или более полинуклеотидам, полученным этим способом, которые можно скринировать или отбирать по желательному свойству. Один или более полинуклеотидов-потомков можно экспрессировать в виде полипептидов и, необязательно, скринировать или отбирать по желательному свойству. Таким образом, изобретение относится к полинуклеотидам и полипептидам, полученным способом по изобретению, а также к библиотекам таких полинуклеотидов и полипептидов. Кроме того, изобретение относится к скринингу библиотек и к отбору из них для получения одного или более полинуклеотидов или полипептидов.

В одном из аспектов изобретения предпочтительный способ получения множества модифицированных полинуклеотидов включает:

(a) добавление по меньшей мере трех праймеров к двухцепочечному матричному полинуклеотиду в одной реакционной смеси, где по меньшей мере три праймера не перекрываются и где каждый по меньшей мере из трех праймеров содержит по меньшей мере одну мутацию, отличающуюся от других праймеров, где по меньшей мере один праймер является прямым праймером, способным отжигаться с минусцепью матрицы, и по меньшей мере один праймер является обратным праймером, способным отжигаться с плюс-цепью матрицы, и (b) подвергание реакционной смеси полимеразной реакции достройки для получения на множества достроенных модифицированных полинуклеотидов по меньшей мере из трех праймеров.

В другом аспекте изобретения клетку трансформируют множеством достроенных продуктов, которые не были обработаны лигазой. Еще в одном аспекте изобретения множество достроенных модифицированных полинуклеотидов выделяют из клетки. Еще в одном варианте осуществления изобретения выделенное множество достроенных модифицированных полинуклеотидов анализируют, например, посредством экспрессии по меньшей мере одного из множества достроенных модифицированных полинуклеотидов и анализа экспрессированного с него полипептида. Еще в одном варианте осуществления изобретения проводят селекцию множества достроенных модифицированных полинуклеотидов, содержащих представляющие интерес мутации.

В одном из вариантов осуществления изобретения матричный полинуклеотид представляет собой кольцевую ДНК, например плазмидную или векторную ДНК. Еще в одном варианте осуществления изобретения кольцевая ДНК представляет собой сверхспиральную ДНК.

Еще в одном аспекте изобретения можно получать информацию о последовательности, относящуюся к матричному полинуклеотиду, и идентифицировать в матричном полинуклеотиде три или более представляющие интерес мутации. Еще в одном варианте осуществления изобретения продукты, полученные посредством достройки полимеразой, можно анализировать перед трансформацией клетки множеством достроенных модифицированных полинуклеотидов.

Еще в одном аспекте изобретения продукты, полученные посредством достройки полимеразой, обрабатывают ферментом, предпочтительно рестрикционным ферментом и еще более предпочтительно рестрикционным ферментом ΌρηΣ, тем самым, разрушая матричную полинуклеотидную последовательность. Обработанными продуктами трансформируют клетку, предпочтительно клетку Е.сой.

Еще в одном варианте осуществления изобретения можно использовать по меньшей мере два, предпочтительно по меньшей мере три, более предпочтительно по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять, по меньшей мере десять, по меньшей мере одиннадцать, по меньшей мере двенадцать или более праймеров. В одном из вариантов осуществления изобретения каждый праймер содержит единичную точечную мутацию (фиг. 4А). Еще в одном варианте осуществления изобретения два прямых или два обратных праймера содержат отличающееся изменение в одном и том же положении матричного полинуклеотида (фиг. 4В). Еще в одном аспекте изобретения по меньшей мере один праймер содержит по меньшей мере два изменения в разных положениях матричного полинуклеотида (фиг. 4С). Еще в одном

- 13 020657 варианте осуществления изобретения по меньшей мере один праймер содержит по меньшей мере два изменения в разных положениях и по меньшей мере два прямых или два обратных праймера содержат отличающееся изменение в одном и том же положении матричного полинуклеотида (фиг. 4Ό).

В одном из вариантов осуществления изобретения прямые праймеры объединяют в прямую группу, а обратные праймеры объединяют в обратную группу, где праймеры в прямой группе и праймеры в обратной группе независимо друг от друга нормализуют до равной концентрации в соответствующей группе независимо от положений в последовательности матричного нуклеотида и где после нормализации в реакционную смесь добавляют равное количество прямых и обратных праймеров. При этом способе нормализации комбинация некоторых положений может оказаться смещенной. Смещение может происходить, например, вследствие относительно низкой концентрации праймера в одном из положений, содержащем единственный праймер, по сравнению с другим положением, содержащим множественные праймеры. Термин позиционное смещение относится к полученным полинуклеотидам, которые имеют выраженное предпочтение для включения праймеров в одном положении по сравнению с другими положениями в пределах группы прямых или обратных праймеров. Это приводит к комбинации модифицированных полинуклеотидов, которая может иметь высокий процентный показатель мутаций в положении одного праймера, но низкий процентный показатель мутаций в другом положении в пределах его группы прямых и обратных праймеров. Такое смещение невыгодно тогда, когда цель ТМСА заключается в получении полинуклеотидов-потомков, содержащих все возможные комбинации изменений по отношению к матрице. Смещение можно скорректировать, например, посредством нормализации праймеров для выравнивания их пула в каждом положении. Проведением двух циклов по способу ТМСА можно увеличить выход желательных полинуклеотидов-потомков, содержащих множественные изменения по сравнению с матрицей, причем в цикле II используют некоторые варианты, полученные из цикла I.

Еще в одном варианте осуществления изобретения нормализацию праймеров осуществляют, организуя праймеры в множественные группы в зависимости от их локализации на матричном полинуклеотиде, причем праймеры, покрывающие одну и ту же избранную область матрицы, попадают в одну группу; нормализуя сгруппированные праймеры в пределах каждой группы до равной концентрации; объединяя прямые праймеры в пределах одной группы в прямую группу и нормализуя концентрацию между каждой группой прямых праймеров для ее выравнивания; объединяя обратные праймеры в пределах одной группы объединяют в обратную группу и нормализуют концентрацию между каждой группой обратных праймеров для ее выравнивания; и добавляя в реакционную смесь равное количество объединенных прямых и обратных праймеров. Для позиционных комбинаций не наблюдали какого-либо смещения.

Один из вариантов осуществления изобретения относится к набору вырожденных праймеров, каждый из которых содержит вырожденное положение, где представляющая интерес мутация представляет собой ряд разных нуклеотидов в вырожденном положении. Другой вариант осуществления изобретения относится к набору вырожденных праймеров, содержащих по меньшей мере один вырожденный кодон, который соответствует по меньшей мере одному кодону матричного полинуклеотида, а также по меньшей мере одну смежную последовательность, которая гомологична последовательности, прилегающей к кодону последовательности матричного полинуклеотида. Еще в одном варианте осуществления изобретения вырожденный кодон представляет собой Ν,Ν,Ν и кодирует любую из 20 встречающихся в природе аминокислот. В другом варианте осуществления изобретения вырожденный кодон кодирует менее 20 аминокислот, встречающихся в природе.

В другом варианте осуществления изобретения предпочтительный способ получения множества модифицированных полинуклеотидов, содержащих представляющие интерес мутации, включает:

(a) добавление по меньшей мере двух праймеров к двухцепочечному матричному полинуклеотиду в одной реакционной смеси, где по меньшей мере два праймера не перекрываются и где каждый по меньшей мере из двух праймеров содержит по меньшей мере одну мутацию, отличающуюся от другого праймера (праймеров), где по меньшей мере один праймер является прямым праймером, способным отжигаться с минус-цепью матрицы, и по меньшей мере один праймер является обратным праймером, способным отжигаться с плюс-цепью матрицы, (b) подвергание реакционной смеси полимеразной реакции достройки для получения на выходе множества достроенных модифицированных полинуклеотидов по меньшей мере из двух праймеров, (c) обработку множества достроенных модифицированных полинуклеотидов ферментом, посредством чего разрушается матричный полинуклеотид, (й) трансформацию клетки обработанными достроенными модифицированными полинуклеотидами, которые не были обработаны лигазой, (е) выделение множества достроенных модифицированных полинуклеотидов из клетки, и (ί) селекцию множества достроенных модифицированных полинуклеотидов, содержащих представляющие интерес мутации.

Последующие примеры показывают, что единичные мутации во множественных сайтах матрицы или гена можно успешно комбинировать в простой одинарной реакционной смеси, которая, неожиданно, основана на известных способах получения мутаций. Распределение всех возможных комбинаций в эксперименте хорошо отображает характер распределения на основе статистического расчета. Реакции

- 14 020657 можно специализировать для получения смещенных комбинаций, основанных на потребности.

В рамках технологии О88М™ в способе ТМСА не используют комплементарные праймеры, отжигающиеся как с положительной, так и с отрицательной цепями матричного полинуклеотида. Рациональное ожидание после удлинения в термическом циклировании, включающем праймеры, как это описано для настоящего изобретения ТМСА (прямые и обратные группы в одной реакции термического цикла), по-видимому, представляет собой исключительную коллекцию амплифицированных линейных полинуклеотидов, определяемых индивидуальными парами прямых и обратных праймеров. Настройка условий ТМСА почти идентична стандартным условиям ПЦР. Можно было бы ожидать получения множественных продуктов ПЦР в реакции ТМСА, где каждый продукт может иметь меньше полного набора мутаций, охватываемых набором праймеров, используемых в одной реакции, например менее 6 мутаций при использовании 6 праймеров, каждый из которых содержит 1 мутацию. Кроме того, не ожидают, что продукты ПЦР подлежат трансформации и амплификации в клетках. Неожиданно, способом ТМСА можно получать специфический вариант гена, содержащий множественные изменения в одной молекуле, причем этот способ можно осуществить без применения этапа лигирования, таким образом, упрощая процесс получения множественных мутаций.

Примеры

Пример 1. Иллюстративный протокол способа ТМСА показан ниже Реакции ТМСА

I

Обработка Ррп!

I

Трансформация хозяина

Скрининг

1. Подбор условий реакций ТМСА Условия 1

буфер Ρίυ 10х	'2, 5 мкл
ϋΜ5Ο	2,5 мкл
ΟΝΤΡ(10 мМ)	0,5 мкл
матрица ДНК (25 нг/мкл)	1 мкл
РТи ТигЬо	0,5 мкл
вода	14 мкл
прямой праймер (5 мкМ)	2 мкл
обратный праймер (5 мкМ)	2 мкл
Всего	2 5 мкл
Условия 2
буфер Р£х Асси	5 мкл
матрица ДНК (25 нг/мкл)	1 мкл
Ρϊχ Ассиргз.те	0,4 мкл
вода	37,б мкл
прямой праймер (5 мкМ)	3 мкл
обратный праймер (5 мкМ)	3 мкл
Всего	50 мкл
Условия 3
буфер Р£х Асси	2,5 мкл
матрица ДНК (25 нг/мкл)	1 мкл
Ρϊχ Ассирггте .	0,2 мкл

- 15 020657

вода		17,3 мкл
прямой праймер (5 мкМ)	2 мкл
обратный	праймер (5 мкМ)	2 мкл
Итого		2 5 мкл
	Циклирование
	КоЬосус1ег	Регк1П-Е1тег
Начальная	95°С; 1 мин	9 5°С; 3 мин
денатурация
Денатурация	95°С; 45 сек	95йС; 45 сек	1
Отжиг	50°С; 1 мин	50йС; 45 сек	1 20 циклов
Удлинение	68°С;	68°С;
	2 мин/т.п.о.	2 мин/т.п.о.
Окончательная	68°С, 5 мин	68°С, 5 мин
достройка	4°С,	4°С,
	неопределенно	неопределенно

2. Разделение 50 реакционных смесей ТМСА в агарозном геле для определения успешности прохождения реакций.

3. Разбавление 10 Ед. рестрикционного фермента Όρηί в 3 мкл воды и 1 мкл буфера 4 (йот Еи§1аиб Вю1аЪ). Добавление к каждой реакционной смеси 5 мкл разбавленного фермента. Инкубация при 37° в течение 4-8 ч.

4. Трансформация реакционными смесями, обработанными Όρη1, клеток Е. сой по общепринятому способу трансформации.

5. Скрининг полученных колоний секвенированием или желательным анализом.

Пример 2.

В первом эксперименте для комбинирования были выбраны шесть сайтов гена (фиг. 5). Подобраны условия реакций с применением прямых праймеров в трех сайтах и трех обратных праймеров в трех остальных сайтах. Варианты продуктов реакций идентифицировали секвенированием. Имели место шестьдесят четыре возможные различные комбинации. В условиях 1 преобладали варианты с меньшим числом сайтов мутаций (фиг. 6). В условиях 2 и 3 преобладали варианты с большим числом сайтов мутаций (фиг. 6). Распределение всех возможных комбинаций в объединенных данных (всего) было похожим на характер распределения, полученный по статистическим расчетам (фиг. 6). Одна кривая на фиг. 7 показывает ожидаемое покрытие (%) вариантов, а другая кривая показывает вероятность полного покрытия при скрининге от нуля до шестисот клонов. Кружки на кривой ожидаемого покрытия (%), (то есть 78, 95, 99 и 100%), показывают ожидаемое покрытие при скрининге 96, 192, 288 или 384 клонов. Квадраты ниже кривой ожидаемого покрытия (%), (то есть 70, 91, 95 и 98%), показывают реальное покрытие по экспериментальным данным. Данные показывают почти идеальное совпадение ожидаемого и фактического покрытия.

Таблица 1

Сборка шести мутаций

Условия	Скрининг	Уникальных клонов	Уникальных клонов
1А	1,5х	69% (44/64)	69% (44/64)
1А	Зх	80% (51/64)	80% (51/64)
7А	1,5х	63% (40/64)	75% (42/64)
13А	1,5х	61% (39/64)	67% (43/64)
13А	Зх	76% (49/64)	80% (51/64)
1А+7А	Зх	91% (58/64)	91% (58/64)
1А+7А	4,5х	94% (60/64)	94% (60/64)
1А+13А	Зх	91% (58/64)	91% (58/64)
1А+13А	4, 5х	95% (61/64)	95% (61/64)
1А+13А	бх	98% (63/64)	98% (63/64)

Пример 3.

Во втором эксперименте для комбинирования были выбраны четыре сайта гена (фиг. 8). Подобраны условия реакций с применением прямых праймеров в двух сайтах и двух обратных праймеров в остальных двух сайтах. Варианты продуктов реакций идентифицировали секвенированием. Имели место шестнадцать возможных различных комбинаций. Подобно первому эксперименту, в условиях 1 получали

- 16 020657 больше вариантов с меньшим числом сайтов мутаций, а в условиях 2 и 3 получали больше вариантов с большим числом сайтов мутаций (фиг. 9 и 10). Распределение всех возможных комбинаций в объединенных данных (всего) было похожим на характер распределения, полученный по статистическим расчетам (фиг. 9 и 10).

Таблица 2

Сборка четырех мутаций

Условия	Скрининг	Уникальных клонов	Уникальных клонов
2А	2х	75% (12/16)	81% (13/16)
8А	2х	62% (10/16)	87% (14/16)
14А	2х	68% (11/16)	75% (12/16)
2А+8А	4х	93% (15/16)	100% (16/16)
2А+14А	4х	93% (15/16)	93% (15/16)
2В	2х	75% (12/16)	75% (12/16)
8В	2х	50% (8/16)	68% (11/16)
14В	2х	75% (12/16)	87% (14/16)
2В+8В	4х	81% (13/16)	81% (13/16)
2В+14В	4х	87% (14/16)	87% (14/16)

Пример 4.

В третьем эксперименте для комбинирования были выбраны три сайта гена (фиг. 11). Подобраны условия реакций с применением прямых праймеров в двух сайтах и одного обратного праймера в третьем сайте. Варианты продуктов реакций идентифицировали секвенированием. В этом случае имели место восемь возможных различных комбинаций. В условиях 9В все 8 вариантов были выделены при секвенировании 24 клонов. См. фиг. 12.

Пример 5.

Были отобраны 13 повышающих мутантов О88М™ (5 сайтов) для улучшения термостабильности и повышения специфической активности липазы (фиг. 13). Три сайта (N1688, Ν171Ε и М176\У) были сгруппированы вместе и находились в одном праймере. Размер библиотеки составил 6x6x2x2x2=288. Условия реакций подбирали следующим способом: прямые праймеры были сгруппированы в прямую группу, а обратные праймеры были сгруппированы в обратную группу, причем праймеры в прямой группе и праймеры в обратной группе независимо друг от друга были нормализованы, чтобы создать равную концентрацию в соответствующей группе независимо от положений в последовательности матричного нуклеотида, и после нормализации в реакционную смесь добавляли равное количество прямых и обратных праймеров. Комбинации положений 1 и 2 были смещены (фиг. 13 и 14А, В, С). Для комбинаций в положениях 1 и 2 была получена меньшая процентная доля возможных уникальных вариантов по сравнению с комбинациями в положениях 1 и 3 или в положениях 2 и 3. Были проведены два цикла реакций ТМСА. В цикле II были использованы некоторые из вариантов, полученных в цикле I. После секвенирования 720 клонов (2,5х покрытие библиотеки) были получены 46% из 288 уникальных вариантов цикла I. Секвенирование с покрытием 1х означает, что число секвенированных вариантов (потомства) равно числу возможных уникальных вариантов, следовательно, покрытие 2,5х указывает, что число секвенированных вариантов (потомства) в 2,5 раза превышает возможное число уникальных вариантов (288). Были проведены два цикла реакций ТМСА. В цикле II были в качестве матричных полинуклеотидов использованы некоторые из вариантов, полученных в цикле I. Праймеры, использованные для каждой реакции ТМСА в цикле II, специализировали для получения вариантов, недостижимых в цикле I. После цикла II были получены 95,5% из 288 уникальных вариантов. После скрининга из этой библиотеки были получены десять повышающих мутантов (фиг. 14А, В, С).

Примеры показывают, что способ ТМСА позволяет эффективно создавать комбинаторные библиотеки. Положения мутантов задают некоторые ограничения, но для преодоления этих ограничений можно разрабатывать альтернативы. Новые улучшенные модификации значительно уменьшают смещение. Для преодоления некоторого смещения можно проводить многократные циклы реакции ТМСА. Показано, что способ ТМСА эффективен для множества ферментов и векторных систем. Ограничение по размеру вектора может достигать 11 т.п.о.

Очевидно, что в свете изложенных выше информационных сведений возможны множественные модификации и варианты настоящего изобретения. Следовательно, надо понимать, что в пределах сферы прилагаемых пунктов формулы изобретения это изобретение может быть практически реализовано иначе, чем это конкретно описано в настоящем документе.

Claims (14)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ получения множества мутированных полинуклеотидов, включающий:

   (a) получение информации о последовательности матричного полинуклеотида и идентификация трех или более представляющих интерес мутаций в матричном полинуклеотиде;

   (b) добавление по меньшей мере трех праймеров к двухцепочечному матричному полинуклеотиду в одной реакционной смеси, где по меньшей мере три праймера не перекрываются и где каждый по меньшей мере из трех праймеров содержит по меньшей мере одну мутацию, отличающуюся от других праймеров, где по меньшей мере один праймер является прямым праймером, способным к отжигу с минусцепью матрицы, и по меньшей мере один праймер является обратным праймером, способным к отжигу с плюс-цепью матрицы, и (c) проведение полимеразной реакции достройки в реакционной смеси с получением множества достроенных мутированных полинуклеотидов по меньшей мере из трех праймеров.
2. 2. Способ по п.1, дополнительно включающий трансформацию клетки множеством достроенных продуктов, которые не были обработаны лигазой; и необязательно, дополнительно включающий выделение множества достроенных модифицированных полинуклеотидов из клетки; и необязательно, дополнительно включающий анализ множества достроенных модифицированных полинуклеотидов; и необязательно, в котором анализ включает экспрессию по меньшей мере одного из множества достроенных модифицированных полинуклеотидов и анализ экспрессированного с них полипептида; и необязательно, дополнительно включающий селекцию множества достроенных модифицированных полинуклеотидов, содержащих представляющие интерес мутации.
3. 3. Способ по п.1, дополнительно включающий анализ множества достроенных модифицированных полинуклеотидов, полученных посредством достройки полимеразой.
4. 4. Способ по п.1, дополнительно включающий обработку множества достроенных модифицированных полинуклеотидов ферментом, посредством чего разрушается матричный полинуклеотид, происходит трансформация клетки обработанными достроенными модифицированными полинуклеотидами, выделение множества достроенных модифицированных полинуклеотидов из клетки и селекция множества достроенных модифицированных полинуклеотидов, содержащих представляющие интерес мутации.
5. 5. Способ по п.4, в котором клетка представляет собой клетку Е.сой.
6. 6. Способ по п.4, в котором фермент представляет собой фермент рестрикции; и необязательно, где фермент рестрикции представляет собой фермент рестрикции Όρηί и клетка представляет собой клетку Е.сой.
7. 7. Способ по п.1, в котором добавляют по меньшей мере четыре праймера; или в котором добавляют по меньшей мере пять праймеров; или в котором добавляют по меньшей мере шесть праймеров; или в котором добавляют по меньшей мере восемь праймеров; или в котором добавляют по меньшей мере двенадцать праймеров; или в котором каждый праймер содержит единичную точечную мутацию; или в котором по меньшей мере два прямых праймера содержат отличающееся изменение в одном и том же положении матричного полинуклеотида; или в котором по меньшей мере два обратных праймера содержат отличающееся изменение в одном и том же положении матричного полинуклеотида; или в котором по меньшей мере один праймер содержит по меньшей мере два изменения в разных положениях матричного полинуклеотида; или в котором по меньшей мере один праймер содержит по меньшей мере два изменения в разных положениях и по меньшей мере два прямых или два обратных праймера содержат отличающееся изменение в одном и том же положении матричного полинуклеотида; или в котором по меньшей мере одна мутация выбрана из группы, состоящей из изменения в одном или более нуклеотидах либо в кодируемых последовательностях аминокислот, инсерции и делеции.
8. 8. Способ по п.1, в котором матричный полинуклеотид представляет содой кольцевую двухцепочечную ДНК.
9. 9. Способ по п.1, в котором по меньшей мере один праймер представляет собой набор вырожденных праймеров, каждый из которых содержит вырожденное положение, где представляющая интерес мутация представлена рядом разных нуклеотидов в вырожденном положении.
10. 10. Способ по п.1, в котором по меньшей мере один праймер представляет собой набор вырожденных праймеров, содержащих по меньшей мере один вырожденный кодон, соответствующий по меньшей мере одному кодону в матричном полинуклеотиде, а также по меньшей мере одну смежную последовательность, которая гомологична последовательности, прилегающей к кодону в матричном полинуклеотиде; необязательно, в котором вырожденный кодон представляет собой триплет Ν,Ν,Ν, кодирующий природную аминокислоту; или в котором вырожденный кодон может кодировать менее 20 природных аминокислот.
11. 11. Способ по п.1, в котором прямые праймеры объедены в прямую группу, а обратные праймеры объединены в обратную группу, где праймеры в прямой группе и праймеры в обратной группе независимо друг от друга нормализуют до равной концентрации в соответствующей группе независимо от по- 18 020657 ложений в матричном полинуклеотиде и где после нормализации в реакционную смесь добавляют равное количество прямых и обратных праймеров.
12. 12. Способ по п.1, дополнительно включающий перед стадией (Ь) организацию праймеров в множественные группы в зависимости от их локализации на матричном полинуклеотиде, причем праймеры, покрывающие одну и ту же избранную область матрицы, попадают в одну группу, нормализацию сгруппированных праймеров в пределах каждой группы для выравнивания концентрации, объединение прямых праймеров в пределах одной группы в прямую группу и нормализацию концентрации между каждой группой прямых праймеров для выравнивания, объединение обратных праймеров в пределах одной группы в обратную группу и нормализацию концентрации между каждой группой обратных праймеров для выравнивания и добавление в реакционную смесь равного количества объединенных прямых и обратных праймеров.
13. 13. Способ по п.1, дополнительно включающий проведение двух циклов со стадиями от (Ь) до (с), и использование полинуклеотидов, полученных в первом цикле, в качестве матричных полинуклеотидов для второго цикла.
14. 14. Способ получения множества модифицированных полинуклеотидов, содержащих представляющие интерес мутации, включающий:

    (a) добавление по меньшей мере двух праймеров к двухцепочечному матричному полинуклеотиду в одной реакционной смеси, где по меньшей мере два праймера не перекрываются и где каждый по меньшей мере из двух праймеров содержит по меньшей мере одну мутацию, отличающуюся от другого праймера (праймеров), где по меньшей мере один праймер является прямым праймером, способным отжигаться с минус-цепью матрицы, и по меньшей мере один праймер является обратным праймером, способным отжигаться с плюс-цепью матрицы, (b) проведение полимеразной реакции достройки в реакционной смеси с получением множества достроенных модифицированных полинуклеотидов по меньшей мере из двух праймеров, (c) обработку множества достроенных модифицированных полинуклеотидов ферментом, посредством чего разрушается матричный полинуклеотид, (б) трансформацию клетки обработанными достроенными модифицированными полинуклеотидами, которые не были обработаны лигазой, (е) выделение множества достроенных модифицированных полинуклеотидов из клетки, и (£) селекцию множества достроенных модифицированных полинуклеотидов, содержащих представляющие интерес мутации.