JP3398957B2 - Ｄｎａの特定部位の突然変異誘発 - Google Patents
Ｄｎａの特定部位の突然変異誘発Info
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- JP3398957B2 JP3398957B2 JP51182293A JP51182293A JP3398957B2 JP 3398957 B2 JP3398957 B2 JP 3398957B2 JP 51182293 A JP51182293 A JP 51182293A JP 51182293 A JP51182293 A JP 51182293A JP 3398957 B2 JP3398957 B2 JP 3398957B2
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Classifications
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
部位特異的突然変異誘発（本明細書では「特定部位の
突然変異誘発」とも称する。）は遺伝子発現及びタンパ
ク質の構造／機能の関連性の研究における重要な方法で
ある。プラスミドDNAの特定の塩基の突然変異を起こす
ために多様な案が開発され、それは標的配列と相補的な
塩基によりフランキングされた所望の突然変異を含むオ
リゴヌクレオチドプライマーを用いる（Smith M.（198
5）Ann.Rev.Genet.19:423−462において考察）。Mandec
ki（Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1986）83:7177−7181）
は、バクテリア宿主の形質転換に続いてプライマーをあ
らかじめ生体内で伸長する方法につき記載したが、プラ
イマーは通常試験管内で伸長される。ミスマッチ修復が
ない場合、ヘテロ２本鎖DNAのDNA複製は50％か又はそれ
以下の頻度で突然変異産物を与えると予想される。実際
の収率はこの理論的最大値よりずっと低いことが多いの
で、突然変異鎖から誘導される産物に関して選択する戦
術が開発された。例えばチミジンの代わりに数個のウラ
シル塩基が挿入された環状１本鎖DNA（ssDNA）を（du
t-,ung-E.コリ株において生産）、所望する突然変異を
有する鎖のプライマー−方向付け（primer−directed）
DNA合成のための鋳型として用いる戦術が開発された。
（Kunkel et al.（1987）Meth.Enzymol 154:367−38
2;Kunkel（1985）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488−49
2）。このDNAをウラシル−含有鋳型鎖を分解するung+株
中に形質転換し、98％もの高い頻度で突然変異産物を得
る。
突然変異誘発」とも称する。）は遺伝子発現及びタンパ
ク質の構造／機能の関連性の研究における重要な方法で
ある。プラスミドDNAの特定の塩基の突然変異を起こす
ために多様な案が開発され、それは標的配列と相補的な
塩基によりフランキングされた所望の突然変異を含むオ
リゴヌクレオチドプライマーを用いる（Smith M.（198
5）Ann.Rev.Genet.19:423−462において考察）。Mandec
ki（Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1986）83:7177−7181）
は、バクテリア宿主の形質転換に続いてプライマーをあ
らかじめ生体内で伸長する方法につき記載したが、プラ
イマーは通常試験管内で伸長される。ミスマッチ修復が
ない場合、ヘテロ２本鎖DNAのDNA複製は50％か又はそれ
以下の頻度で突然変異産物を与えると予想される。実際
の収率はこの理論的最大値よりずっと低いことが多いの
で、突然変異鎖から誘導される産物に関して選択する戦
術が開発された。例えばチミジンの代わりに数個のウラ
シル塩基が挿入された環状１本鎖DNA（ssDNA）を（du
t-,ung-E.コリ株において生産）、所望する突然変異を
有する鎖のプライマー−方向付け（primer−directed）
DNA合成のための鋳型として用いる戦術が開発された。
（Kunkel et al.（1987）Meth.Enzymol 154:367−38
2;Kunkel（1985）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488−49
2）。このDNAをウラシル−含有鋳型鎖を分解するung+株
中に形質転換し、98％もの高い頻度で突然変異産物を得
る。
他の戦術は、所望の突然変異を有する１つ、及び選択
可能マーカー、例えばアンピシリン−耐性（ampr）遺伝
子（Lewis et al.（1990）Nucleic Acids Res.18:3
439−3443）又はM13からの遺伝子IV（Carter（1987）Me
th Enzymol.154:382−403）における突然変異を復帰さ
せる第２の突然変異誘発プライマーの２つの突然変異誘
発プライマーを用いる戦術である。２つのプライマーは
復帰した選択可能マーカー及び所望の突然変異を有する
第２の鎖の合成を方向付ける。続いて復帰したマーカー
に関して選択すると所望の突然変異を有する産物が約80
％の頻度で得られる。類似の戦略では所望の突然変異を
有するプライマーを、宿主の制限／修飾系により認識さ
れる部位を破壊するプライマーにカップリングさせる
（Carter,同上）。この戦術により宿主の制限系に対し
て耐性の突然変異プラスミドを有効に回収することがで
きる。T4酵素は突然変異誘発プライマーを置換しないの
で、これらのカップリングプライマー系はプライマー伸
長のために、E.コリDNAポリメラーゼのクレノウフラグ
メントよりT4 DNAポリメラーゼを利用する方が有利で
ある（Masumune et al.（1971）J.Biol.Chem.246:269
2−2701;Nossal（1974）J.Biol.Chem.249:5668−567
6）。ミスマッチ修復−欠陥（mut Ｓ）宿主を用いると
効率はやはり向上し、復帰した選択可能マーカー及び所
望の突然変異がDNA複製の第１循環の間に共分離する可
能性が増加する（Zell et al.（1987）EMBO J.6:180
9−1815）。
可能マーカー、例えばアンピシリン−耐性（ampr）遺伝
子（Lewis et al.（1990）Nucleic Acids Res.18:3
439−3443）又はM13からの遺伝子IV（Carter（1987）Me
th Enzymol.154:382−403）における突然変異を復帰さ
せる第２の突然変異誘発プライマーの２つの突然変異誘
発プライマーを用いる戦術である。２つのプライマーは
復帰した選択可能マーカー及び所望の突然変異を有する
第２の鎖の合成を方向付ける。続いて復帰したマーカー
に関して選択すると所望の突然変異を有する産物が約80
％の頻度で得られる。類似の戦略では所望の突然変異を
有するプライマーを、宿主の制限／修飾系により認識さ
れる部位を破壊するプライマーにカップリングさせる
（Carter,同上）。この戦術により宿主の制限系に対し
て耐性の突然変異プラスミドを有効に回収することがで
きる。T4酵素は突然変異誘発プライマーを置換しないの
で、これらのカップリングプライマー系はプライマー伸
長のために、E.コリDNAポリメラーゼのクレノウフラグ
メントよりT4 DNAポリメラーゼを利用する方が有利で
ある（Masumune et al.（1971）J.Biol.Chem.246:269
2−2701;Nossal（1974）J.Biol.Chem.249:5668−567
6）。ミスマッチ修復−欠陥（mut Ｓ）宿主を用いると
効率はやはり向上し、復帰した選択可能マーカー及び所
望の突然変異がDNA複製の第１循環の間に共分離する可
能性が増加する（Zell et al.（1987）EMBO J.6:180
9−1815）。
これらの特殊化された突然変異誘発法はいくつかの要
求を課する。dut-/ung-系（Kunkel,同上）は、標的プラ
スミドがf1複製起点を有すること、F,dut-,ung-宿主へ
の標的プラスミドの形質転換、及び環状ssDNA鋳型の調
製を必要とする。標的プラスミドはM13の誘導体でなけ
ればならないか、あるいはそれらはf1起点を有していな
ければならない（「ファージミド」または「ファスミ
ド」とも称されている。）。ssDNAはヘルパーファージ
の存在下における増殖によりファージミドから生産され
る。復帰可能な選択可能マーカーを用いた系は、特殊化
されたプラスミドベクターへの標的DNAのサブクローニ
ングを必要とし、復帰したマーカーの選択を可能にする
ため（Carter,同上）、あるいは環状ssDNA鋳型の製造の
ために（Lewis et al.,同上）特定の宿主株を必要と
し得る。多数の突然変異を順に導入する場合、復帰可能
なマーカー系は通常欠陥マーカーを有する親ベクターへ
の標的DNAフラグメントの再導入を必要とする。
求を課する。dut-/ung-系（Kunkel,同上）は、標的プラ
スミドがf1複製起点を有すること、F,dut-,ung-宿主へ
の標的プラスミドの形質転換、及び環状ssDNA鋳型の調
製を必要とする。標的プラスミドはM13の誘導体でなけ
ればならないか、あるいはそれらはf1起点を有していな
ければならない（「ファージミド」または「ファスミ
ド」とも称されている。）。ssDNAはヘルパーファージ
の存在下における増殖によりファージミドから生産され
る。復帰可能な選択可能マーカーを用いた系は、特殊化
されたプラスミドベクターへの標的DNAのサブクローニ
ングを必要とし、復帰したマーカーの選択を可能にする
ため（Carter,同上）、あるいは環状ssDNA鋳型の製造の
ために（Lewis et al.,同上）特定の宿主株を必要と
し得る。多数の突然変異を順に導入する場合、復帰可能
なマーカー系は通常欠陥マーカーを有する親ベクターへ
の標的DNAフラグメントの再導入を必要とする。
発明の概要
本発明はDNAの特定部位の突然変異誘発の方法に関す
る。方法はDNA、特に環状DNA（例えば事実上いずれのプ
ラスミドも）に突然変異を誘発するのに用いることがで
き、DNAが制限酵素に関する非必須ユニーク認識部位
（制限部位）を有することのみを必要とする。本方法に
従い、非必須ユニーク制限部位を有する突然変異を誘発
するべき親DNAを用い、所望の突然変異を有するが制限
部位を含まない子孫DNAを生成する。非−突然変異親−
型DNA及び突然変異子孫DNAを制限部位で切断する酵素で
処理し、親−型DNAを切断し、突然変異DNAを切断せずに
残す。細胞が切断DNAより未切断DNAにより高い効率で形
質転換される結果、大多数の形質転換産物が突然変異DN
Aを有するようになる条件下で、酵素処理DNAを用いて細
胞を形質転換することにより、突然変異子孫DNAを選択
する。好ましい実施態様の場合DNAは環状である。制限
酵素処理により非必須ユニーク制限部位を保持している
親DNAは直鎖状となり、制限部位のない突然変異DNAは環
状のままである。環状DNAは直鎖状DNAより効率的（本明
細書では「有効」と称する場合あり。）に宿主細胞を形
質転換する。
る。方法はDNA、特に環状DNA（例えば事実上いずれのプ
ラスミドも）に突然変異を誘発するのに用いることがで
き、DNAが制限酵素に関する非必須ユニーク認識部位
（制限部位）を有することのみを必要とする。本方法に
従い、非必須ユニーク制限部位を有する突然変異を誘発
するべき親DNAを用い、所望の突然変異を有するが制限
部位を含まない子孫DNAを生成する。非−突然変異親−
型DNA及び突然変異子孫DNAを制限部位で切断する酵素で
処理し、親−型DNAを切断し、突然変異DNAを切断せずに
残す。細胞が切断DNAより未切断DNAにより高い効率で形
質転換される結果、大多数の形質転換産物が突然変異DN
Aを有するようになる条件下で、酵素処理DNAを用いて細
胞を形質転換することにより、突然変異子孫DNAを選択
する。好ましい実施態様の場合DNAは環状である。制限
酵素処理により非必須ユニーク制限部位を保持している
親DNAは直鎖状となり、制限部位のない突然変異DNAは環
状のままである。環状DNAは直鎖状DNAより効率的（本明
細書では「有効」と称する場合あり。）に宿主細胞を形
質転換する。
方法の１つの実施態様の場合、２つのオリゴヌクレオ
チドプライマーを用い、第１のオリゴヌクレオチドプラ
イマーは突然変異を起こすべき標的DNAと相補性である
が少なくとも１つのヌクレオチドにおける所望のヌクレ
オチド突然変異を含み、第２のオリゴヌクレオチドプラ
イマーは同一の鎖の非必須ユニーク制限部位と相補的で
あり、それとハイブリッド形成することができるがその
部位における少なくとも１つのヌクレオチド突然変異を
有し、その部位がプライマー（及びその相補配列）にお
いて除去される。第１プライマーが標的DNAにハイブリ
ッド形成し、第２プライマーがユニーク制限部位にハイ
ブリッド形成することができる条件下で第１及び第２プ
ライマーを１本鎖DNA（ssDNA）にアニーリングする。そ
の後DNAの新しい１本鎖を環状ssDNAの鋳型上で合成し、
連結して環状２本鎖DNA（dsDNA）を形成する。新しく合
成された鎖はユニーク制限部位がなく、標的DNAにおけ
る突然変異を含む。続いてミスマッチ修復欠陥の宿主細
胞を、環状dsDNAを用いて形質転換する。形質転換され
た細胞を培養して複製させ、新しい鎖中に２つの突然変
異を共分離させ、両鎖中にプライマー−導入突然変異を
含む環状dsDNAを製造する。培養後、環状dsDNAを形質転
換された宿主細胞から回収する。回収されたDNAを、非
必須ユニーク制限部位を切断する制限酵素で処理し、そ
の結果制限部位が残っている親DNAを切断して直鎖状DNA
を形成するが、制限部位のないDNAは切断されず、環状
のまま残る。切断された直鎖状DNAより環状DNAを有効に
細胞に吸収させる条件下で、酵素処理DNAを用いて第２
の宿主細胞を形質転換する。形質転換細胞を培養し、環
状DNAを形質転換された宿主細胞から回収し、単離され
る環状dsDNAの大部分は標的DNAにおける突然変異を含
む。
チドプライマーを用い、第１のオリゴヌクレオチドプラ
イマーは突然変異を起こすべき標的DNAと相補性である
が少なくとも１つのヌクレオチドにおける所望のヌクレ
オチド突然変異を含み、第２のオリゴヌクレオチドプラ
イマーは同一の鎖の非必須ユニーク制限部位と相補的で
あり、それとハイブリッド形成することができるがその
部位における少なくとも１つのヌクレオチド突然変異を
有し、その部位がプライマー（及びその相補配列）にお
いて除去される。第１プライマーが標的DNAにハイブリ
ッド形成し、第２プライマーがユニーク制限部位にハイ
ブリッド形成することができる条件下で第１及び第２プ
ライマーを１本鎖DNA（ssDNA）にアニーリングする。そ
の後DNAの新しい１本鎖を環状ssDNAの鋳型上で合成し、
連結して環状２本鎖DNA（dsDNA）を形成する。新しく合
成された鎖はユニーク制限部位がなく、標的DNAにおけ
る突然変異を含む。続いてミスマッチ修復欠陥の宿主細
胞を、環状dsDNAを用いて形質転換する。形質転換され
た細胞を培養して複製させ、新しい鎖中に２つの突然変
異を共分離させ、両鎖中にプライマー−導入突然変異を
含む環状dsDNAを製造する。培養後、環状dsDNAを形質転
換された宿主細胞から回収する。回収されたDNAを、非
必須ユニーク制限部位を切断する制限酵素で処理し、そ
の結果制限部位が残っている親DNAを切断して直鎖状DNA
を形成するが、制限部位のないDNAは切断されず、環状
のまま残る。切断された直鎖状DNAより環状DNAを有効に
細胞に吸収させる条件下で、酵素処理DNAを用いて第２
の宿主細胞を形質転換する。形質転換細胞を培養し、環
状DNAを形質転換された宿主細胞から回収し、単離され
る環状dsDNAの大部分は標的DNAにおける突然変異を含
む。
本発明の他の実施態様の場合、ポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）を用い、標的DNAにおける突然変異及びユニーク
制限部位を除去する突然変異がdsDNAフラグメントにお
いて連結されている長いプライマーを製造することがで
きる。典型的に長いプライマーの生成に２つのプライマ
ーが用いられるが、最初の実施態様と異なりプライマー
は環状DNAの異なる鎖（同一の鎖でなく）と相補的であ
る。第１のプライマーは環状DNAの１つの鎖の標的DNAと
相補的であるが、所望のヌクレオチド突然変異を有す
る。第２のオリゴヌクレオチドプライマーは他の鎖に現
れる非必須ユニーク制限部位と相補的であるが、その部
位が除去されるような突然変異をその部位に含む。環状
dsDNAを変性させ、第１プライマーが１本の鎖標的DNAに
ハイブリッド形成し、第２のプライマーが他の鎖のユニ
ーク制限部位にハイブリッドできる条件下で第１及び第
２プライマーをssDNAにアニーリングする。標的DNA中に
突然変異を有するが制限部位が含まない直鎖状dsDNA産
物（長いプライマー）を製造するのに十分な条件下でPC
R反応を行う。PCR産物を変性して１本鎖の長いプライマ
ーを得、続いてそれをssDNA環状標的DNAにアニーリング
し、方法の残りを上記の通りに行う。
（PCR）を用い、標的DNAにおける突然変異及びユニーク
制限部位を除去する突然変異がdsDNAフラグメントにお
いて連結されている長いプライマーを製造することがで
きる。典型的に長いプライマーの生成に２つのプライマ
ーが用いられるが、最初の実施態様と異なりプライマー
は環状DNAの異なる鎖（同一の鎖でなく）と相補的であ
る。第１のプライマーは環状DNAの１つの鎖の標的DNAと
相補的であるが、所望のヌクレオチド突然変異を有す
る。第２のオリゴヌクレオチドプライマーは他の鎖に現
れる非必須ユニーク制限部位と相補的であるが、その部
位が除去されるような突然変異をその部位に含む。環状
dsDNAを変性させ、第１プライマーが１本の鎖標的DNAに
ハイブリッド形成し、第２のプライマーが他の鎖のユニ
ーク制限部位にハイブリッドできる条件下で第１及び第
２プライマーをssDNAにアニーリングする。標的DNA中に
突然変異を有するが制限部位が含まない直鎖状dsDNA産
物（長いプライマー）を製造するのに十分な条件下でPC
R反応を行う。PCR産物を変性して１本鎖の長いプライマ
ーを得、続いてそれをssDNA環状標的DNAにアニーリング
し、方法の残りを上記の通りに行う。
本発明の方法はマーカー遺伝子の救済（rescue）にも
用いることができる。
用いることができる。
本発明の方法は簡単であり、通常の材料のみを必要と
し、迅速に行うことができる（例えば２日もの短期間
で）。問題の突然変異を有する環状DNAを高い頻度で回
収することができる（一般に約80％）。方法を行うため
の材料はキットの形態で供給することができる。
し、迅速に行うことができる（例えば２日もの短期間
で）。問題の突然変異を有する環状DNAを高い頻度で回
収することができる（一般に約80％）。方法を行うため
の材料はキットの形態で供給することができる。
図面の簡単な説明
図１はユニーク部位除去（Unique Site Eliminatio
n）、及び長−プライマーユニーク部位除去突然変異誘
発（Long−Primer Unique Site Elimination mutag
enesis）のための２つの戦術の線図である。
n）、及び長−プライマーユニーク部位除去突然変異誘
発（Long−Primer Unique Site Elimination mutag
enesis）のための２つの戦術の線図である。
図2A及び2Bは実験で用いられたプラスミドの線図であ
る。図2AはpSELneoの構造を示し、図2BはプラスミドpRS
VEd1884の構造を示す。
る。図2AはpSELneoの構造を示し、図2BはプラスミドpRS
VEd1884の構造を示す。
図３はpSELneoの突然変異のための６つの案を示す。
図４はBMH71−18 mut Ｓ形質転換物から単離したプ
ラスミドDNAの特性化を示す。
ラスミドDNAの特性化を示す。
図５はユニーク部位除去突然変異誘発の後の突然変異
プラスミドの特性化を示す。
プラスミドの特性化を示す。
図６は長−プライマーユニーク部位除去突然変異誘発
の後のpRSVEd1884単離物のHind III消化物のアガロース
ゲルの写真である。
の後のpRSVEd1884単離物のHind III消化物のアガロース
ゲルの写真である。
図７は非選択可能突然変異誘発プライマーの位置に対
する、USE（細かい平行線を引いた棒）及びLP−USE（黒
い棒）突然変異誘発の後の望まれていない突然変異の局
在を示すグラフ図である。
する、USE（細かい平行線を引いた棒）及びLP−USE（黒
い棒）突然変異誘発の後の望まれていない突然変異の局
在を示すグラフ図である。
発明の詳細な説明
ユニーク部位除去（USE）による特定部位の突然変異
誘発は、事実上いずれの複製可能な環状DNAにも適用で
きる。本方法は非必須ユニーク制限部位（すなわちDNA
の複製性に必須でなく、DNA中に１回だけ存在する制限
部位）を含む（又は含むようにされた）DNAに適用する
ことができる。これにはプラスミドDNA、ファージミドD
NA、ウィルスDNA、ファージDNA及びコスミドDNAが含ま
れる。
誘発は、事実上いずれの複製可能な環状DNAにも適用で
きる。本方法は非必須ユニーク制限部位（すなわちDNA
の複製性に必須でなく、DNA中に１回だけ存在する制限
部位）を含む（又は含むようにされた）DNAに適用する
ことができる。これにはプラスミドDNA、ファージミドD
NA、ウィルスDNA、ファージDNA及びコスミドDNAが含ま
れる。
USE法は２つの突然変異誘発オリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いる。第１のプライマーは環状DNAの領域中
に導入するべき所望の突然変異を含む。プライマーは環
状DNAの鎖の標的DNAの相補体であるが、所望のヌクレオ
チド突然変異を含む。第２のプライマーは、制限部位を
除去する突然変異を含むことを除いて同一の鎖における
いずれかの非必須ユニーク制限部位に相補的である。プ
ライマーは標準的方法により製造し、リン酸化すること
ができる。
イマーを用いる。第１のプライマーは環状DNAの領域中
に導入するべき所望の突然変異を含む。プライマーは環
状DNAの鎖の標的DNAの相補体であるが、所望のヌクレオ
チド突然変異を含む。第２のプライマーは、制限部位を
除去する突然変異を含むことを除いて同一の鎖における
いずれかの非必須ユニーク制限部位に相補的である。プ
ライマーは標準的方法により製造し、リン酸化すること
ができる。
図１（左側）はUSE法の実施態様を略示する。２つの
プライマーを環状１本鎖DNAにアニーリングする。アニ
ーリングは下記に記載する急冷（quick cooling）又は
緩冷（slow cooling）法により行うことができる。急
冷法を用いるのが好ましい。
プライマーを環状１本鎖DNAにアニーリングする。アニ
ーリングは下記に記載する急冷（quick cooling）又は
緩冷（slow cooling）法により行うことができる。急
冷法を用いるのが好ましい。
アニーリングされたプライマーを用い、２つのプライ
マー−導入突然変異を含むDNAの新しい相補鎖の合成を
方向付ける。新しい鎖のプライマー−方向付けDNA合成
は、プライマーから第２鎖DNA合成を方向付けることが
できるDNAポリメラーゼ、例えばT4 DNAポリメラーゼ、
T4 DNAリガーゼなどのDNAリガーゼ、dNTP及びATPを用
い、適した緩衝液（例えばトリス−HCl、pH7.5）中で行
うことができる。
マー−導入突然変異を含むDNAの新しい相補鎖の合成を
方向付ける。新しい鎖のプライマー−方向付けDNA合成
は、プライマーから第２鎖DNA合成を方向付けることが
できるDNAポリメラーゼ、例えばT4 DNAポリメラーゼ、
T4 DNAリガーゼなどのDNAリガーゼ、dNTP及びATPを用
い、適した緩衝液（例えばトリス−HCl、pH7.5）中で行
うことができる。
得られたDNAをバクテリアE.コリなどの宿主細胞中に
形質転換する。この形質転換段階にいずれのE.コリ株を
用いることもできるが、mut Ｓ E.コリなどのミスマ
ッチ修復−欠陥株が突然変異誘発効率が高いのでミスマ
ッチ修復−熟達（mismatch repair−proficient）株よ
り好ましい。ミスマッチ修復が減少、又は除去される
と、２つの突然変異誘発プライマーが標的DNAにおける
野生型領域にアニーリングされる時に形成される２つの
ミスマッチ領域が修復を受けない。１本鎖中に存在する
２つの突然変異はDNA複製の第１循環の間に２本のDNA鎖
が分離する時に共分離する。
形質転換する。この形質転換段階にいずれのE.コリ株を
用いることもできるが、mut Ｓ E.コリなどのミスマ
ッチ修復−欠陥株が突然変異誘発効率が高いのでミスマ
ッチ修復−熟達（mismatch repair−proficient）株よ
り好ましい。ミスマッチ修復が減少、又は除去される
と、２つの突然変異誘発プライマーが標的DNAにおける
野生型領域にアニーリングされる時に形成される２つの
ミスマッチ領域が修復を受けない。１本鎖中に存在する
２つの突然変異はDNA複製の第１循環の間に２本のDNA鎖
が分離する時に共分離する。
形質転換はエレクトロポレーションにより行うのが好
ましいが、形質転換体を与えるいずれの形質転換案も用
いることができる。形質転換体は適した抗生物質を含む
液体培地中でひとまとめに選択することができる。
ましいが、形質転換体を与えるいずれの形質転換案も用
いることができる。形質転換体は適した抗生物質を含む
液体培地中でひとまとめに選択することができる。
選択された形質転換体から環状DNAを回収し、非必須
ユニーク制限部位を認識する酵素で処理し、好ましくは
エレクトロポレーションにより適した宿主中に形質転換
する。ユニーク制限部位におけるDNA突然変異体は消化
に耐性であり、環状のままであり、バクテリアを有効に
形質転換するが、直鎖状にされた親分子はバクテリアの
形質転換において効率が低い。この形質転換の効率の差
がユニーク制限部位における突然変異を含む環状DNAの
選択のための基礎となる。この突然変異は所望の突然変
異と結合しているので、所望の突然変異を約80％の頻度
で回収することができる。
ユニーク制限部位を認識する酵素で処理し、好ましくは
エレクトロポレーションにより適した宿主中に形質転換
する。ユニーク制限部位におけるDNA突然変異体は消化
に耐性であり、環状のままであり、バクテリアを有効に
形質転換するが、直鎖状にされた親分子はバクテリアの
形質転換において効率が低い。この形質転換の効率の差
がユニーク制限部位における突然変異を含む環状DNAの
選択のための基礎となる。この突然変異は所望の突然変
異と結合しているので、所望の突然変異を約80％の頻度
で回収することができる。
標的プラスミドがユニーク非必須制限部位を有してい
なければならないという要求は容易に満たされるので、
ほとんどすべてのプラスミドがUSE法に適する。遺伝子
間領域及びポリリンカーにおける多くの制限部位が有効
な標的であり、選択可能マーカー内のユニーク部位を、
読み取り枠及びコード能力を保持したまま“ゆらぎ”位
置の塩基を変えることにより突然変異させることができ
る。ほとんどのプラスミドが共通のベクター配列を共有
しているので、事実上いずれのプラスミドの突然変異誘
発にも共有する制限部位を標的とする数個のプライマー
が必要なだけである。ほとんどのプラスミドはpBR322
（Bolivar et al.（1977）Gene ２:95−113）又はpU
C19（Yanisch−Perron et al.（1985）Gene 33:103
−119）の誘導体なので、事実上すべてのプラスミドの
突然変異誘発に数個のUSEプライマーが必要なだけであ
る。表１はpUC19（Yanisch−Perron,同上）、pBR322（B
olivar et al.,同上），（1977）Gene２:95−113）、
pBluescriptTM及びpBluescript IITM（Stratagene;La
Jolla,CA）、pSP6/T3、pSP6/T7−19及びpT7/T3α−19
（GIBCO BRL;Gaithersberg,MD）、ならびにpTZ19R（Ph
armacia;Piscataway,NJ）を含む普通のベクターのため
の１組のUSEプライマーを示す。
なければならないという要求は容易に満たされるので、
ほとんどすべてのプラスミドがUSE法に適する。遺伝子
間領域及びポリリンカーにおける多くの制限部位が有効
な標的であり、選択可能マーカー内のユニーク部位を、
読み取り枠及びコード能力を保持したまま“ゆらぎ”位
置の塩基を変えることにより突然変異させることができ
る。ほとんどのプラスミドが共通のベクター配列を共有
しているので、事実上いずれのプラスミドの突然変異誘
発にも共有する制限部位を標的とする数個のプライマー
が必要なだけである。ほとんどのプラスミドはpBR322
（Bolivar et al.（1977）Gene ２:95−113）又はpU
C19（Yanisch−Perron et al.（1985）Gene 33:103
−119）の誘導体なので、事実上すべてのプラスミドの
突然変異誘発に数個のUSEプライマーが必要なだけであ
る。表１はpUC19（Yanisch−Perron,同上）、pBR322（B
olivar et al.,同上），（1977）Gene２:95−113）、
pBluescriptTM及びpBluescript IITM（Stratagene;La
Jolla,CA）、pSP6/T3、pSP6/T7−19及びpT7/T3α−19
（GIBCO BRL;Gaithersberg,MD）、ならびにpTZ19R（Ph
armacia;Piscataway,NJ）を含む普通のベクターのため
の１組のUSEプライマーを示す。
表において標的制限部位、及び新らしく創造された部
位を遺伝子間及びポリリンカー標的部位に関して示す。
標的コドンはampr遺伝子における部位に関して示す（小
文字）。配列はpUC19におけるampr遺伝子のセンス鎖に
相補的である。新らしく形成された制限部位（又は新ら
しい部位が形成されない場合は標的制限部位）は太字で
示し、突然変異塩基に下線に引く。ベクターは以下の通
りに示す:1、pUC19;2,pBR322;3,pBluescript及びpBlues
cript II;4,pSP6/T3及びpSP6/T7−19;5,pT7/T3α−19;
6,pTZ19R。AlwN IプライマーはヌクレオチドCCA（Δ）
が欠失している。DNAがEcoR I又はSac I部位に挿入され
るとEcoR Iプライマーを用いることはできない。DNAがS
phl又はHind III部位に挿入されるとHind IIIプライマ
ーを用いることはできない。Ssp Iプライマー中の５つ
のイタリック体で示される塩基は、Ｔ及びＣ転移が省略
された場合は必要でないが、新らしいEcoR V部位は創造
されないであろう。
位を遺伝子間及びポリリンカー標的部位に関して示す。
標的コドンはampr遺伝子における部位に関して示す（小
文字）。配列はpUC19におけるampr遺伝子のセンス鎖に
相補的である。新らしく形成された制限部位（又は新ら
しい部位が形成されない場合は標的制限部位）は太字で
示し、突然変異塩基に下線に引く。ベクターは以下の通
りに示す:1、pUC19;2,pBR322;3,pBluescript及びpBlues
cript II;4,pSP6/T3及びpSP6/T7−19;5,pT7/T3α−19;
6,pTZ19R。AlwN IプライマーはヌクレオチドCCA（Δ）
が欠失している。DNAがEcoR I又はSac I部位に挿入され
るとEcoR Iプライマーを用いることはできない。DNAがS
phl又はHind III部位に挿入されるとHind IIIプライマ
ーを用いることはできない。Ssp Iプライマー中の５つ
のイタリック体で示される塩基は、Ｔ及びＣ転移が省略
された場合は必要でないが、新らしいEcoR V部位は創造
されないであろう。
これらのプライマーのいくつかはユニーク部位を他の
制限部位に変換する。新らしく形成された部位はUSE突
然変異を有する突然変異体に関する予備スクリーニング
に用いることができ、新しい部位がユニークである場合
それは“周期的”突然変異誘発（“cyclic"mutagenesi
s）戦術に用いることができる。表１のプライマーはそ
れぞれ突然変異塩基にフランキングする少なくとも10の
相補塩基を有し、通常それらはＣ又はＧで停止している
（Sambrook,J.et al.（1989）Molecular Cloning:A
Laboratory Manual（2nd.Edition,Cold Spring Harb
or Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY）。
制限部位に変換する。新らしく形成された部位はUSE突
然変異を有する突然変異体に関する予備スクリーニング
に用いることができ、新しい部位がユニークである場合
それは“周期的”突然変異誘発（“cyclic"mutagenesi
s）戦術に用いることができる。表１のプライマーはそ
れぞれ突然変異塩基にフランキングする少なくとも10の
相補塩基を有し、通常それらはＣ又はＧで停止している
（Sambrook,J.et al.（1989）Molecular Cloning:A
Laboratory Manual（2nd.Edition,Cold Spring Harb
or Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY）。
USE突然変異誘発は、非選択可能な突然変異が第２鎖
合成の間にユニーク制限部位における突然変異と結合さ
れた時にその有効な回収を可能にする。突然変異プラス
ミドは、環状及び直鎖状プラスミドDNAの間のバクネリ
ア形質転換効率の顕著な差の故に優先的に回収される。
選択圧はユニーク部位における突然変異のみに関して課
せられるので、２つの突然変異プライマーが試験管内の
第２鎖合成の間に結合することが必須である。
合成の間にユニーク制限部位における突然変異と結合さ
れた時にその有効な回収を可能にする。突然変異プラス
ミドは、環状及び直鎖状プラスミドDNAの間のバクネリ
ア形質転換効率の顕著な差の故に優先的に回収される。
選択圧はユニーク部位における突然変異のみに関して課
せられるので、２つの突然変異プライマーが試験管内の
第２鎖合成の間に結合することが必須である。
２つの突然変異プライマーを結合する別の方法は、図
１の右側に略示する通り、PCR（Saiki et al.（198
8）Science 239:487−491）を用いることにより２つの
プライマー間のフラグメントを増幅することである。主
要なPCR産物は、両鎖中で増幅フラグメントの末端近辺
に存在する２つの突然変異を有する２本鎖DNAを含む。
結合された突然変異を有するこれらのPCR産物を変性
し、１本鎖標的DNAにアニーリングし、第２鎖合成を起
こさせることができる。かくしてPCR産物は結合された
２つの突然変異を有する長いプライマーとして機能す
る。
１の右側に略示する通り、PCR（Saiki et al.（198
8）Science 239:487−491）を用いることにより２つの
プライマー間のフラグメントを増幅することである。主
要なPCR産物は、両鎖中で増幅フラグメントの末端近辺
に存在する２つの突然変異を有する２本鎖DNAを含む。
結合された突然変異を有するこれらのPCR産物を変性
し、１本鎖標的DNAにアニーリングし、第２鎖合成を起
こさせることができる。かくしてPCR産物は結合された
２つの突然変異を有する長いプライマーとして機能す
る。
第２鎖合成反応の２本鎖産物はすべて１本の鎖に両突
然変異を有すると予想されるので、“長プライマー−US
E突然変異誘発”（LP−USE）と呼ばれるこの方法は、２
つの突然変異誘発プライマーの標的DNAへの同時アニー
リング及び続く結合反応に依存するUSE突然変異誘発よ
り有効に、両突然変異を有する産物を与える。さらにLP
−USEの場合は、PCR産物が両鎖に２つの突然変異を有す
るので標的DNAの両鎖が第２鎖合成の基質となり、好ま
しい。又，長いPCR産物と２重になった標的DNAはオリゴ
ヌクレオチドプライマーとの２本鎖より安定である。
然変異を有すると予想されるので、“長プライマー−US
E突然変異誘発”（LP−USE）と呼ばれるこの方法は、２
つの突然変異誘発プライマーの標的DNAへの同時アニー
リング及び続く結合反応に依存するUSE突然変異誘発よ
り有効に、両突然変異を有する産物を与える。さらにLP
−USEの場合は、PCR産物が両鎖に２つの突然変異を有す
るので標的DNAの両鎖が第２鎖合成の基質となり、好ま
しい。又，長いPCR産物と２重になった標的DNAはオリゴ
ヌクレオチドプライマーとの２本鎖より安定である。
USE又はLP−USE突然変異誘発法を行うための試薬はキ
ットとして得ることができる。USE又はLP−USE突然変異
誘発のためのキットは、制限部位の除去のために設計さ
れたプライマー、好ましくはミスマッチ修復欠陥株を含
み、形質転換受容性細胞として供給されるか、又は受容
性細胞の生産のための試薬と共に供給されるバクテリア
宿主株、及び場合により突然変異を誘発するべき環状DN
A（例えばプラスミド）（標的DNAを含むか、あるいは標
的DNAの挿入のための適した挿入部位を含む）から成る
ことができる。キット又は、プライマーから第２鎖合成
を方向付けることができるDNAポリメラーゼ、DNAリガー
ゼ、デオキシリボヌクレオチド（dNTP、デオキシアデノ
シン5'−三リン酸、デオキシグアノシン5'−三リン酸、
デオキシシトシン5'−三リン酸及びチミジン5'−三リン
酸）、ATP（アデノシン−5'−三リン酸）、ポリヌクレ
オチドキナーゼ、試験管内でDNA合成を促進するための
試薬（例えばバクテリオファージT4遺伝子32タンパク
質）、標的ユニーク部位を認識する制限酵素、ならびに
リン酸化反応を行うのに適した緩衝液を含むことができ
る。標的DNA中への突然変異の導入のため、又はUSEプラ
イマーを用いてDNAを増幅するためのPCRで用いるための
オリゴヌクレオチドプライマーは通常、使用者が準備す
る（合成する）。
ットとして得ることができる。USE又はLP−USE突然変異
誘発のためのキットは、制限部位の除去のために設計さ
れたプライマー、好ましくはミスマッチ修復欠陥株を含
み、形質転換受容性細胞として供給されるか、又は受容
性細胞の生産のための試薬と共に供給されるバクテリア
宿主株、及び場合により突然変異を誘発するべき環状DN
A（例えばプラスミド）（標的DNAを含むか、あるいは標
的DNAの挿入のための適した挿入部位を含む）から成る
ことができる。キット又は、プライマーから第２鎖合成
を方向付けることができるDNAポリメラーゼ、DNAリガー
ゼ、デオキシリボヌクレオチド（dNTP、デオキシアデノ
シン5'−三リン酸、デオキシグアノシン5'−三リン酸、
デオキシシトシン5'−三リン酸及びチミジン5'−三リン
酸）、ATP（アデノシン−5'−三リン酸）、ポリヌクレ
オチドキナーゼ、試験管内でDNA合成を促進するための
試薬（例えばバクテリオファージT4遺伝子32タンパク
質）、標的ユニーク部位を認識する制限酵素、ならびに
リン酸化反応を行うのに適した緩衝液を含むことができ
る。標的DNA中への突然変異の導入のため、又はUSEプラ
イマーを用いてDNAを増幅するためのPCRで用いるための
オリゴヌクレオチドプライマーは通常、使用者が準備す
る（合成する）。
キットは突然変異誘発の効率を監視するための標準DN
A（例えばプラスミド）及び標準突然変異誘発プライマ
ーも含むことができる。例えば標準DNAはLacZなどの標
識遺伝子（本明細書では「指示遺伝子」と称する場合あ
り。）に非必須ユニーク制限部位及び突然変異（例えば
フレームシフト突然変異）を含むプラスミドであること
ができる。突然変異の修復のためのプライマーが制限部
位の除去のためのプライマーと共に含まれる。典型的に
方法は、それを監視するために実験プラスミドと同時に
標準プラスミドについて行われる。
A（例えばプラスミド）及び標準突然変異誘発プライマ
ーも含むことができる。例えば標準DNAはLacZなどの標
識遺伝子（本明細書では「指示遺伝子」と称する場合あ
り。）に非必須ユニーク制限部位及び突然変異（例えば
フレームシフト突然変異）を含むプラスミドであること
ができる。突然変異の修復のためのプライマーが制限部
位の除去のためのプライマーと共に含まれる。典型的に
方法は、それを監視するために実験プラスミドと同時に
標準プラスミドについて行われる。
長プライマーの概念は“マーカー”遺伝子又は他の標
的DNAの救済の方法にも用いることができる。この目的
の場合、PCRに供することができるいずれのDNA又はRNA
からも長プライマーを製造することができる。標的DNA
（ゲノムDNA中、又はいずれかのプラスミド中、ウィル
スDNAなど）は、ちょうど突然変異誘発法の場合と同様
に第２鎖合成でUSE鋳型として用いられるDNAベクター中
にクローニングしなければならない。長プライマーの製
造のための出発プライマーは標的DNAに相補的であり、
救済するべき領域にフランキングしている。標的DNAの
どこかにユニーク制限部位（すなわち標的DNA及び標的D
NAがクローニングされるベクターDNAにおいてユニー
ク）における突然変異がなければならない。ユニーク部
位の突然変異は、例えばUSEプライマーを出発プライマ
ーとして用いることにより導入することができるが、そ
れは増幅フラグメントのいずれの部分にも存在し得る。
（言い換えると、出発プライマーの１つがUSE突然変異
を有するか、又はいずれも有していない。プライマーの
いずれもUSE突然変異を有していない場合、標的とされ
たゲノムDNA又は標的とされたいずれのDNAあるいはRNA
も、クローニングされたDNAに存在し、しかもユニーク
である部位に突然変異を有していなければならない。）
第２プライマーは、PCRで用いることができれば、それ
に対する制限はない。下記の通り、“救済される”標的
DNAは、PCR−増幅フラグメントが救済領域を含むよう
に、２つのプライマーの間に存在する。
的DNAの救済の方法にも用いることができる。この目的
の場合、PCRに供することができるいずれのDNA又はRNA
からも長プライマーを製造することができる。標的DNA
（ゲノムDNA中、又はいずれかのプラスミド中、ウィル
スDNAなど）は、ちょうど突然変異誘発法の場合と同様
に第２鎖合成でUSE鋳型として用いられるDNAベクター中
にクローニングしなければならない。長プライマーの製
造のための出発プライマーは標的DNAに相補的であり、
救済するべき領域にフランキングしている。標的DNAの
どこかにユニーク制限部位（すなわち標的DNA及び標的D
NAがクローニングされるベクターDNAにおいてユニー
ク）における突然変異がなければならない。ユニーク部
位の突然変異は、例えばUSEプライマーを出発プライマ
ーとして用いることにより導入することができるが、そ
れは増幅フラグメントのいずれの部分にも存在し得る。
（言い換えると、出発プライマーの１つがUSE突然変異
を有するか、又はいずれも有していない。プライマーの
いずれもUSE突然変異を有していない場合、標的とされ
たゲノムDNA又は標的とされたいずれのDNAあるいはRNA
も、クローニングされたDNAに存在し、しかもユニーク
である部位に突然変異を有していなければならない。）
第２プライマーは、PCRで用いることができれば、それ
に対する制限はない。下記の通り、“救済される”標的
DNAは、PCR−増幅フラグメントが救済領域を含むよう
に、２つのプライマーの間に存在する。
以下は遺伝子の野生型コピーがベクター中にクローニ
ングされた、細胞における突然変異遺伝子に関する方法
を説明する。プライマーを細胞から単離したゲノムDNA
又はRNAにアニーリングし、PCRにより突然変異遺伝子を
増幅するために用いる。プライマーの１つは、例えば突
然変異遺伝子にフランキングするDNA中に存在するユニ
ーク制限部位を標的とし、突然変異を起こさせる。PCR
に用いられる第２のプライマーは反対の鎖に（PCRにお
ける通常通り）、研究中の領域（すなわち救済するべき
突然変異遺伝子）から離れているがクローニングされた
DNA中に存在するいずれかの位置においてアニーリング
する。続いてこのPCRフラグメントを変性ベクターDNA
（又はそれがクローニングされたDNAの形態の場合は天
然のssDNA）にアニーリングし、上記の通りLP−USEを行
う。PCRフラグメントはユニーク制限部位におけるLP−U
SE突然変異に結合した救済のためのマーカーを含むの
で、LP−USE突然変異を有する突然変異体を選択すると
それらは多くの場合最初にゲノムDNA又はRNAに存在した
突然変異を有する。
ングされた、細胞における突然変異遺伝子に関する方法
を説明する。プライマーを細胞から単離したゲノムDNA
又はRNAにアニーリングし、PCRにより突然変異遺伝子を
増幅するために用いる。プライマーの１つは、例えば突
然変異遺伝子にフランキングするDNA中に存在するユニ
ーク制限部位を標的とし、突然変異を起こさせる。PCR
に用いられる第２のプライマーは反対の鎖に（PCRにお
ける通常通り）、研究中の領域（すなわち救済するべき
突然変異遺伝子）から離れているがクローニングされた
DNA中に存在するいずれかの位置においてアニーリング
する。続いてこのPCRフラグメントを変性ベクターDNA
（又はそれがクローニングされたDNAの形態の場合は天
然のssDNA）にアニーリングし、上記の通りLP−USEを行
う。PCRフラグメントはユニーク制限部位におけるLP−U
SE突然変異に結合した救済のためのマーカーを含むの
で、LP−USE突然変異を有する突然変異体を選択すると
それらは多くの場合最初にゲノムDNA又はRNAに存在した
突然変異を有する。
通常突然変異遺伝子は従来の方法：ゲノムDNAの消
化、ベクターへのフラグメントの挿入、及びライブラリ
における正しいクローンのスクリーニング（ハイブリッ
ド形成によることが最も多い）によりクローニングされ
るので、この方法は標準的マーカー救済と異なる。RNA
が用いられた場合cDNAが製造され、ベクターなどに挿入
され;PCRが用いられた場合、遺伝子フラグメントは増幅
され、おそらくPCRの間に末端に新らしい制限部位が加
えられ、フラグメントがクローニングされる。LP−USE
に基づくマーカー救済は効率が高く、サブクローニング
又は困難なスクリーニング法を必要としない。これはす
でにクローニングされた突然変異（USE突然変異）プラ
スミドのUSE選択が非常に強力なためである。PCRフラグ
メント中に挿入された他のいずれかのDNAも単に乗りに
来るだけである。
化、ベクターへのフラグメントの挿入、及びライブラリ
における正しいクローンのスクリーニング（ハイブリッ
ド形成によることが最も多い）によりクローニングされ
るので、この方法は標準的マーカー救済と異なる。RNA
が用いられた場合cDNAが製造され、ベクターなどに挿入
され;PCRが用いられた場合、遺伝子フラグメントは増幅
され、おそらくPCRの間に末端に新らしい制限部位が加
えられ、フラグメントがクローニングされる。LP−USE
に基づくマーカー救済は効率が高く、サブクローニング
又は困難なスクリーニング法を必要としない。これはす
でにクローニングされた突然変異（USE突然変異）プラ
スミドのUSE選択が非常に強力なためである。PCRフラグ
メント中に挿入された他のいずれかのDNAも単に乗りに
来るだけである。
本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、実施
例は制限ではない。
例は制限ではない。
実施例
A.方法
1.DNA操作
標準的方法（Sambrook et al.,同上）を用いること
によりプラスミドを試験管内で構築した。DNAはHolmes
及びQuigleyの方法（Holmes et al.（1981）Anal.Bio
chem.114:193−197）の修正法を用い、5mlのLB培養物を
終夜増殖させ、3000xgで10分間遠心して細胞を収穫する
ことにより調製した。細胞は0.3mlのスクロース（８
％）、Triton Ｘ−100（５％）、トリス−HCl（50mM、
pH8.0）及びEDTA（50mM）中に懸濁し、10μｌのリゾチ
ーム（10mg/ml）、RNアーゼＡ（1m/ml）及びトリス−HC
l（50mM、pH8.0）（20℃で保存）を加えた。懸濁液を短
時間混合し、100℃に１分間加熱し、12,000xgで10分間
遠心した。細胞破片をつまようじで除去し、10μｌのプ
ロナーゼ（10mg/ml;Sigma Chemical Co.;37℃で１時
間自己−消化し、80℃に２分間加熱し、−20℃で保存）
を上澄み液に加え、溶液を65℃で30分間インキュベート
した。0.2mlの5M酢酸アンモニウム、及び1mMのフェニル
メチルスルホニルフルオリドを含む1mlのイソプロパノ
ールを加え、−20℃で10分間インキュベートすることに
よりプラスミドDNAを沈澱させた。12,000xgで10分間遠
心することによりDNAを回収し、ペレットを冷エタノー
ル（80％）で濯ぎ、乾燥した。DNAを75μｌのグリセロ
ール（2.5％）、SDS（0.025％）、EDTA（0.5mM、pH8.
0）、ブロモフェノールブルー（2.5％）及びキシレンシ
アノールFF（それぞれ0.0125％）中に懸濁した。各試料
を65℃に３分間加熱し、750μｌのセファロースCL−6B
（Pharmacia;Piscataway,NJ）カラム（1500xgで２分間
再回転）に適用し、1500xgで２分間遠心した。CL−6Bは
トリス−HCl（10mM、pH8.0）及びEDTA（0.5mM）中の60
％懸濁液として調製した。
によりプラスミドを試験管内で構築した。DNAはHolmes
及びQuigleyの方法（Holmes et al.（1981）Anal.Bio
chem.114:193−197）の修正法を用い、5mlのLB培養物を
終夜増殖させ、3000xgで10分間遠心して細胞を収穫する
ことにより調製した。細胞は0.3mlのスクロース（８
％）、Triton Ｘ−100（５％）、トリス−HCl（50mM、
pH8.0）及びEDTA（50mM）中に懸濁し、10μｌのリゾチ
ーム（10mg/ml）、RNアーゼＡ（1m/ml）及びトリス−HC
l（50mM、pH8.0）（20℃で保存）を加えた。懸濁液を短
時間混合し、100℃に１分間加熱し、12,000xgで10分間
遠心した。細胞破片をつまようじで除去し、10μｌのプ
ロナーゼ（10mg/ml;Sigma Chemical Co.;37℃で１時
間自己−消化し、80℃に２分間加熱し、−20℃で保存）
を上澄み液に加え、溶液を65℃で30分間インキュベート
した。0.2mlの5M酢酸アンモニウム、及び1mMのフェニル
メチルスルホニルフルオリドを含む1mlのイソプロパノ
ールを加え、−20℃で10分間インキュベートすることに
よりプラスミドDNAを沈澱させた。12,000xgで10分間遠
心することによりDNAを回収し、ペレットを冷エタノー
ル（80％）で濯ぎ、乾燥した。DNAを75μｌのグリセロ
ール（2.5％）、SDS（0.025％）、EDTA（0.5mM、pH8.
0）、ブロモフェノールブルー（2.5％）及びキシレンシ
アノールFF（それぞれ0.0125％）中に懸濁した。各試料
を65℃に３分間加熱し、750μｌのセファロースCL−6B
（Pharmacia;Piscataway,NJ）カラム（1500xgで２分間
再回転）に適用し、1500xgで２分間遠心した。CL−6Bは
トリス−HCl（10mM、pH8.0）及びEDTA（0.5mM）中の60
％懸濁液として調製した。
プラスミドDNAを、確立された方法を用いたアガロー
スゲル電気泳動（Sambrook et al.,同上）により分析
した。ゲル電気泳動により分離したDNAをNytranフィル
ター（Schleicher and Schuell;Keene,NH）に移し、
製造者の推薦する方法を用いてサザンハイブリッド分析
を行った。ランダムプライマー伸長によりDNAをα−［
32P］−dCTPで標識した（Feinberg et al.（1983）An
al.Biochem.132:6−13）。
スゲル電気泳動（Sambrook et al.,同上）により分析
した。ゲル電気泳動により分離したDNAをNytranフィル
ター（Schleicher and Schuell;Keene,NH）に移し、
製造者の推薦する方法を用いてサザンハイブリッド分析
を行った。ランダムプライマー伸長によりDNAをα−［
32P］−dCTPで標識した（Feinberg et al.（1983）An
al.Biochem.132:6−13）。
2.プラスミド
pSELneoは２段階で構築した。最初にpSV2neoからのネ
オマイシン遺伝子を有する2.1kbpのHind III/BamH Iフ
ラグメント（Southern et al.（1982）J.Mol.Appl.Ge
net.１:327−341）をpSELECT−１（Promega Corp.;Mad
ison,WI）のポリリンカー中に挿入し、pWPD1を製造し
た。pWPD1はテトラサイクリン及びカナマイシンに耐性
であるが、ampr遺伝子におけるPst I部位の欠失のため
にアンピシリンに対して感受性である。pWPD1のテトラ
サイクリン−耐性遺伝子は、pWPD1をEcoR V及びAcc Iで
消化し、Acc I部位をT4 DNAポリメラーゼで充填し、T4
DNAリガーゼで再環状化することにより欠失させた。p
SELneoと呼ばれる得られたプラスミドはカナマイシン−
耐性（Kanr）、アンピシリン−感受性（amps）、テトラ
サイクリン−感受性であり、ユニークEag I部位を有す
る。pSELneoの構造を図2Aに示す。切断可能な制限部位
を黒線で示す。間隔の開いた線で示す欠失Pst I部位はP
st Iによる消化に対して耐性である（Pst Ir）。欠陥遺
伝子は陰影をつけてあるか、又は黒く、機能性遺伝は白
い。
オマイシン遺伝子を有する2.1kbpのHind III/BamH Iフ
ラグメント（Southern et al.（1982）J.Mol.Appl.Ge
net.１:327−341）をpSELECT−１（Promega Corp.;Mad
ison,WI）のポリリンカー中に挿入し、pWPD1を製造し
た。pWPD1はテトラサイクリン及びカナマイシンに耐性
であるが、ampr遺伝子におけるPst I部位の欠失のため
にアンピシリンに対して感受性である。pWPD1のテトラ
サイクリン−耐性遺伝子は、pWPD1をEcoR V及びAcc Iで
消化し、Acc I部位をT4 DNAポリメラーゼで充填し、T4
DNAリガーゼで再環状化することにより欠失させた。p
SELneoと呼ばれる得られたプラスミドはカナマイシン−
耐性（Kanr）、アンピシリン−感受性（amps）、テトラ
サイクリン−感受性であり、ユニークEag I部位を有す
る。pSELneoの構造を図2Aに示す。切断可能な制限部位
を黒線で示す。間隔の開いた線で示す欠失Pst I部位はP
st Iによる消化に対して耐性である（Pst Ir）。欠陥遺
伝子は陰影をつけてあるか、又は黒く、機能性遺伝は白
い。
他の標的プラスミドであるpRSVEd1884を図2Bに示す。
このプラスミドはSV40及びpRSVcatの5.7kbpの誘導体で
あり、ラウス肉腫ウィルスプロモーターにより駆動され
るSV40大Ｔ抗原（large Ｔ antigen）のためのコード
領域を有する。Sequenase version2.0（U.S.Biochemic
al Corp.,Cleveland,OH）を用い、製造者の勧告通りに
２本鎖プラスミドDNAのDNA配列分析を行った。
このプラスミドはSV40及びpRSVcatの5.7kbpの誘導体で
あり、ラウス肉腫ウィルスプロモーターにより駆動され
るSV40大Ｔ抗原（large Ｔ antigen）のためのコード
領域を有する。Sequenase version2.0（U.S.Biochemic
al Corp.,Cleveland,OH）を用い、製造者の勧告通りに
２本鎖プラスミドDNAのDNA配列分析を行った。
3.プライマーの合成及びリン酸化
ホスホルアミダイト化学を用い、Biosearch モデル
8700 DNA合成機（Novato,CA）上でプライマーを合成
した。プライマーの脱保護の後、溶液を蒸発させ、DNA
を0.5mlのエタノールで濯ぎ、蒸発させ、0.2mlのdH2Oに
再懸濁した。溶液を12,000xgで10分間遠心し、上澄み液
を回収した。プライマーはさらに精製することなく使用
した。プライマー溶液の濃度は分光光度測定により決定
した。
8700 DNA合成機（Novato,CA）上でプライマーを合成
した。プライマーの脱保護の後、溶液を蒸発させ、DNA
を0.5mlのエタノールで濯ぎ、蒸発させ、0.2mlのdH2Oに
再懸濁した。溶液を12,000xgで10分間遠心し、上澄み液
を回収した。プライマーはさらに精製することなく使用
した。プライマー溶液の濃度は分光光度測定により決定
した。
プライマー（100ピコモル）、70mMのトリス−HCl、pH
7.6、MgCL2（10mM）、DTT（5mM）、0.1mMのATP及びT4ポ
リヌクレオチドキナーゼ（10単位;New England Biola
bs;Beverly,MA）を20μｌの体積において37℃で２時間
インキュベートすることにより、リン酸化を行った。
7.6、MgCL2（10mM）、DTT（5mM）、0.1mMのATP及びT4ポ
リヌクレオチドキナーゼ（10単位;New England Biola
bs;Beverly,MA）を20μｌの体積において37℃で２時間
インキュベートすることにより、リン酸化を行った。
合成された２つの突然変異誘発プライマーを表２に示
す。
す。
“ampr"プライマー（配列番号:1）は、欠失Pst I部位
を再創造することによりpSELneoにアンピシリン−耐性
を復帰させる。新しいPst I部位を太字で示し、突然変
異塩基に下線を引く。Eag Irプライマー（配列番号:2）
はネオミシン遺伝子におけるユニークEag I部位をPst I
部位に変換し、Eag I−耐性（Eag Ir）プラスミドを製
造する。Eag Irプライマーにより導入される突然変異は
ネオミシン遺伝子のコード能力を変更せず、かくして突
然変異及び非突然変異産物の両方がkanrである。
を再創造することによりpSELneoにアンピシリン−耐性
を復帰させる。新しいPst I部位を太字で示し、突然変
異塩基に下線を引く。Eag Irプライマー（配列番号:2）
はネオミシン遺伝子におけるユニークEag I部位をPst I
部位に変換し、Eag I−耐性（Eag Ir）プラスミドを製
造する。Eag Irプライマーにより導入される突然変異は
ネオミシン遺伝子のコード能力を変更せず、かくして突
然変異及び非突然変異産物の両方がkanrである。
pRSVEd1884におけるユニークBamH I部位にフランキン
グする領域に相補的な２つ（プライマー6A（配列番号:1
7）及び6B（配列番号:18））を含む、合成された22の他
の突然変異誘発プライマー（配列番号12−33）を表３に
示す。
グする領域に相補的な２つ（プライマー6A（配列番号:1
7）及び6B（配列番号:18））を含む、合成された22の他
の突然変異誘発プライマー（配列番号12−33）を表３に
示す。
表３において、各プライマーに関してＴ抗原遺伝子内
の標的コドン及びコドン位置の示す。プライマー内の突
然変異塩基に下線を引く。プライマー6A（配列番号:1
7）及び6B（配列番号:18）は、BamH I部位の選択可能突
然変異を導入するために用いた。これらのプライマーは
BamH I部位をKpn I部位に変換することによりそれを破
壊する。残りのプライマー（配列番号:12−16及び19−3
3）は、大Ｔ抗原遺伝子の種々の領域に突然変異を導入
するために設計された。
の標的コドン及びコドン位置の示す。プライマー内の突
然変異塩基に下線を引く。プライマー6A（配列番号:1
7）及び6B（配列番号:18）は、BamH I部位の選択可能突
然変異を導入するために用いた。これらのプライマーは
BamH I部位をKpn I部位に変換することによりそれを破
壊する。残りのプライマー（配列番号:12−16及び19−3
3）は、大Ｔ抗原遺伝子の種々の領域に突然変異を導入
するために設計された。
4.USEによる特定部位の突然変異誘発
pSELneoの突然変異誘発は以下の通りに行った。いず
れか１つ又は両方のリン酸化プライマー（25ピコモル;
0.2μｇ）、pSELneo（0.025ピコモル;0.1μｇ）、トリ
ス−HCl（20mM、pH7.5）、MgCl2（10mM）及びNaCl（50m
M）を含む20μｌの溶液を100℃に３分間加熱した。アニ
ーリング混合物を含む管を氷浴中に直接入れるか（急
冷）、又は管を25℃で10分間インキュベートし、続いて
それを氷浴中に入れる（緩冷）ことによりプライマーを
アニーリングした。トリス−HCl（100mM、pH7.5）、５
μｌのdH2O、１μｌのT4 DNAポリメラーゼ（３単位、N
ew England Biolabs）及び１μｌのT4 DNAリガーゼ
（400単位、New England Biolabs）を含む３μｌの溶
液を加えることにより、プライマー−方向付けDNA合成
を行った。反応物を37℃で90分間インキュベートし、SD
S（0.25％）及びEDTA（5mM、pH8.0）を含む３μｌの溶
液を加えて65℃に５分間加熱することにより停止した。
DNAをセファロース CL−6Bを通してスピンカラムクロ
マトグラフィーにより精製した。２μｌの溶離物を用
い、Gene Pulser（Biorad;Richmond,CA）を用いて製造
者の勧告に従ったエレクトロポレーションによりE.コリ
株BMH71−18 mut Ｓ（Zell et al.（1987）EMBO
J.６:1809−1815）を形質転換した。
れか１つ又は両方のリン酸化プライマー（25ピコモル;
0.2μｇ）、pSELneo（0.025ピコモル;0.1μｇ）、トリ
ス−HCl（20mM、pH7.5）、MgCl2（10mM）及びNaCl（50m
M）を含む20μｌの溶液を100℃に３分間加熱した。アニ
ーリング混合物を含む管を氷浴中に直接入れるか（急
冷）、又は管を25℃で10分間インキュベートし、続いて
それを氷浴中に入れる（緩冷）ことによりプライマーを
アニーリングした。トリス−HCl（100mM、pH7.5）、５
μｌのdH2O、１μｌのT4 DNAポリメラーゼ（３単位、N
ew England Biolabs）及び１μｌのT4 DNAリガーゼ
（400単位、New England Biolabs）を含む３μｌの溶
液を加えることにより、プライマー−方向付けDNA合成
を行った。反応物を37℃で90分間インキュベートし、SD
S（0.25％）及びEDTA（5mM、pH8.0）を含む３μｌの溶
液を加えて65℃に５分間加熱することにより停止した。
DNAをセファロース CL−6Bを通してスピンカラムクロ
マトグラフィーにより精製した。２μｌの溶離物を用
い、Gene Pulser（Biorad;Richmond,CA）を用いて製造
者の勧告に従ったエレクトロポレーションによりE.コリ
株BMH71−18 mut Ｓ（Zell et al.（1987）EMBO
J.６:1809−1815）を形質転換した。
エレクトロポレーションに続き、細胞を1mlのSOC培地
（Sambrook et al.,同上）に再懸濁し、37℃で１時間
インキュベートした。一時BMH71−18形質転換体の数を
決定するために、この溶液のアリコートをアンピシリン
（100μg/ml）又はカナマイシン（40μg/ml）のいずれ
かを含むLB寒天平板上で平板培養した。アンピシリン又
はカナマイシンを含む5mlのLBを残りの細胞に加え、細
胞上澄み液を37℃で終夜インキュベートした。5mlの上
記の培養からプラスミドDNAを調製し、0.5μｇの量を20
μｌの体積でEag I（５単位、New England Biolabs）
で消化するか、あるいは処理しなかった。消化及び非消
化の両方のDNAをCL−6Bスピンカラムクロマトグラフィ
ーにより精製してからE.コリ株DH5α中にエレクトロポ
レーションした。形質転換細胞を、最初のBMH71−18 m
ut Ｓ 形質転換体の選択に用いたものと同一の抗生物
質を含むLB平板上に平板培養し、37℃で終夜インキュベ
ートした。上記のampr又はkanrコロニーから調製した突
然変異プラスミドを、Eag I又はPst IとCla Iを用いた
消化により同定した。amprプライマーが用いられ、突然
変異誘発法の間にampr突然変異体に関して選択圧が適用
されない場合、ampr突然変異体は、アンピシリンを含む
LB平板にKanr形質転換体をレプリカ平板培養することに
より同定される。
（Sambrook et al.,同上）に再懸濁し、37℃で１時間
インキュベートした。一時BMH71−18形質転換体の数を
決定するために、この溶液のアリコートをアンピシリン
（100μg/ml）又はカナマイシン（40μg/ml）のいずれ
かを含むLB寒天平板上で平板培養した。アンピシリン又
はカナマイシンを含む5mlのLBを残りの細胞に加え、細
胞上澄み液を37℃で終夜インキュベートした。5mlの上
記の培養からプラスミドDNAを調製し、0.5μｇの量を20
μｌの体積でEag I（５単位、New England Biolabs）
で消化するか、あるいは処理しなかった。消化及び非消
化の両方のDNAをCL−6Bスピンカラムクロマトグラフィ
ーにより精製してからE.コリ株DH5α中にエレクトロポ
レーションした。形質転換細胞を、最初のBMH71−18 m
ut Ｓ 形質転換体の選択に用いたものと同一の抗生物
質を含むLB平板上に平板培養し、37℃で終夜インキュベ
ートした。上記のampr又はkanrコロニーから調製した突
然変異プラスミドを、Eag I又はPst IとCla Iを用いた
消化により同定した。amprプライマーが用いられ、突然
変異誘発法の間にampr突然変異体に関して選択圧が適用
されない場合、ampr突然変異体は、アンピシリンを含む
LB平板にKanr形質転換体をレプリカ平板培養することに
より同定される。
Deng et al.（1992）Anal Biochem.（印刷中）に
記載のUSE突然変異誘発を用いることにより、又は以下
のLP−USE突然変異誘発を用いることにより特定の突然
変異をプラスミドpRSVEd1884中に導入した。“長プライ
マー”は標準的条件を用いることにより（例えばSambro
ok et al.,同上を参照）30サイクルのPCR反応で製造
した。増幅フラグメントをDeng et al.,（同上）に記
載の通りにCl−6Bスピンカラムクロマトグラフィー（Ph
armacia,Piscataway,NJ）により精製し、Hind IIIで消
化したファージλDNAの標準溶液を用いたアガロースゲ
ル電気泳動を用いてPCR産物の濃度を評価した。
記載のUSE突然変異誘発を用いることにより、又は以下
のLP−USE突然変異誘発を用いることにより特定の突然
変異をプラスミドpRSVEd1884中に導入した。“長プライ
マー”は標準的条件を用いることにより（例えばSambro
ok et al.,同上を参照）30サイクルのPCR反応で製造
した。増幅フラグメントをDeng et al.,（同上）に記
載の通りにCl−6Bスピンカラムクロマトグラフィー（Ph
armacia,Piscataway,NJ）により精製し、Hind IIIで消
化したファージλDNAの標準溶液を用いたアガロースゲ
ル電気泳動を用いてPCR産物の濃度を評価した。
約100ピコモルのPCR産物を、T4ポリヌクレオチドキナ
ーゼ及びATPを用いてリン酸化した（例えばsambrook e
t al.,同上を参照）。リン酸化PCR産物の４分の１を、
20mMのトリス−HCl、pH7.5、10mMのMgCl2、及び50mMのN
aClを含む溶液中で0.025ピコモルの標的プラスミドと混
合した。混合物を100℃で３分間加熱し、標的プラスミ
ド及びPCR産物を変性し、続いて４℃に急冷した。DNAを
室温で30分間アニーリングし、続いて100mMのトリス−H
Cl（pH7.5）、5mMの各dNTP、10mMのATP及び20mMのDTT、
2.5μｌのT4 DNAリガーゼ（1000単位）、及び１μｌの
T4 DNAポリメラーゼ（3000単位）を含む３μｌの溶液
を加えることにより第２鎖合成を行った。37℃で５−30
分間合成を行ってから、0.25％のSDS及び5mMのEDTA（pH
8.0）を含む３μｌの溶液を加えて反応を停止し、65℃
に５分間加熱した。DNAをDeng et al.（同上）に記載
の通りにセファロースCL−6Bを通してスピンカラムクロ
マトグラフィーにより精製した。Gene Pulser（Bio−R
ad;Richmond,CA）を用い、製造者の勧告に従い、２μｌ
の溶離物を用いてE.コリ株BMH71−18 mut Ｓ（Zell
et al.（1987）EMBO J.６:1809−1815）を形質転換し
た。残りの段階（BMH mut Ｓ 形質転換体のひとまと
めの増殖、プラスミドDNAの消化、及びE.コリ株DH5αの
形質転換）は、第２鎖合成反応を５−30分間行う以外は
上記に記載の通りに行った。
ーゼ及びATPを用いてリン酸化した（例えばsambrook e
t al.,同上を参照）。リン酸化PCR産物の４分の１を、
20mMのトリス−HCl、pH7.5、10mMのMgCl2、及び50mMのN
aClを含む溶液中で0.025ピコモルの標的プラスミドと混
合した。混合物を100℃で３分間加熱し、標的プラスミ
ド及びPCR産物を変性し、続いて４℃に急冷した。DNAを
室温で30分間アニーリングし、続いて100mMのトリス−H
Cl（pH7.5）、5mMの各dNTP、10mMのATP及び20mMのDTT、
2.5μｌのT4 DNAリガーゼ（1000単位）、及び１μｌの
T4 DNAポリメラーゼ（3000単位）を含む３μｌの溶液
を加えることにより第２鎖合成を行った。37℃で５−30
分間合成を行ってから、0.25％のSDS及び5mMのEDTA（pH
8.0）を含む３μｌの溶液を加えて反応を停止し、65℃
に５分間加熱した。DNAをDeng et al.（同上）に記載
の通りにセファロースCL−6Bを通してスピンカラムクロ
マトグラフィーにより精製した。Gene Pulser（Bio−R
ad;Richmond,CA）を用い、製造者の勧告に従い、２μｌ
の溶離物を用いてE.コリ株BMH71−18 mut Ｓ（Zell
et al.（1987）EMBO J.６:1809−1815）を形質転換し
た。残りの段階（BMH mut Ｓ 形質転換体のひとまと
めの増殖、プラスミドDNAの消化、及びE.コリ株DH5αの
形質転換）は、第２鎖合成反応を５−30分間行う以外は
上記に記載の通りに行った。
B.結果
1.実験設計
図３に図示する６種の案のそれぞれを用いることによ
りpSELneoプラスミドを突然変異誘発した。欠陥遺伝子
は陰影があるか又は黒であり、機能性遺伝子は白であ
る。６種の案（Ａ−Ｆ）を示す。amprプライマー（配列
番号:1、黒矢印）はampr遺伝子を修復し、Pst I部位を
復帰させ、Pst I−感受性部位、Pst Isを創造する。Eag
Irプライマー（配列番号:2、白矢印）はユニークEag I
部位を除去し、それをPst I部位に変換することによりE
ag Ir部位を創造する。プライマー−方向付けDNA合成に
より第2DNA鎖が生産される。BMH71−18 mut Ｓ 形質
転換体は、アンピシリン又はカナマイシン培地を用いる
ことにより選択される。アンピシリン培地中における増
殖はampr突然変異体に関する段階１の選択を構成する
（陰影付きの四角）。Eag Ir突然変異はneo読み取り枠
を変更しないのでカナマイシン培地中における増殖は形
質転換体を選択するか突然変異体を選択しない。得られ
たDNAのEag Iによる消化はEag Ir突然変異体に関する段
階２の選択を構成する（案Ａ、Ｃ及びE;陰影付き四
角）。各突然変異誘発法に関して予測される結果を図３
の下部の表に示す。マイナスの印は特定の産物に対する
選択圧を示す。プラスの印は、産物が回収可能であるが
必ずしも選択されているとは限らないことを示し、陰影
付きの四角は選択された産物を示す。方法Ｆにおいては
選択圧が適用されなかったのですべての産物が回収可能
であるが、いずれも選択されていない。Eag Irプライマ
ーを単独で用いると（案Ａ及びＢ）、ampr産物を形成す
ることはできない（N.A.の印の四角、適用不可能）。
りpSELneoプラスミドを突然変異誘発した。欠陥遺伝子
は陰影があるか又は黒であり、機能性遺伝子は白であ
る。６種の案（Ａ−Ｆ）を示す。amprプライマー（配列
番号:1、黒矢印）はampr遺伝子を修復し、Pst I部位を
復帰させ、Pst I−感受性部位、Pst Isを創造する。Eag
Irプライマー（配列番号:2、白矢印）はユニークEag I
部位を除去し、それをPst I部位に変換することによりE
ag Ir部位を創造する。プライマー−方向付けDNA合成に
より第2DNA鎖が生産される。BMH71−18 mut Ｓ 形質
転換体は、アンピシリン又はカナマイシン培地を用いる
ことにより選択される。アンピシリン培地中における増
殖はampr突然変異体に関する段階１の選択を構成する
（陰影付きの四角）。Eag Ir突然変異はneo読み取り枠
を変更しないのでカナマイシン培地中における増殖は形
質転換体を選択するか突然変異体を選択しない。得られ
たDNAのEag Iによる消化はEag Ir突然変異体に関する段
階２の選択を構成する（案Ａ、Ｃ及びE;陰影付き四
角）。各突然変異誘発法に関して予測される結果を図３
の下部の表に示す。マイナスの印は特定の産物に対する
選択圧を示す。プラスの印は、産物が回収可能であるが
必ずしも選択されているとは限らないことを示し、陰影
付きの四角は選択された産物を示す。方法Ｆにおいては
選択圧が適用されなかったのですべての産物が回収可能
であるが、いずれも選択されていない。Eag Irプライマ
ーを単独で用いると（案Ａ及びＢ）、ampr産物を形成す
ることはできない（N.A.の印の四角、適用不可能）。
Eag Irプライマー（配列番号:2）のみをpSELneoにア
ニールすると、BMH71−18 mut ｓ 形質転換体はカナ
マイシン培地における増殖により選択される（図３、案
Ａ及びＢ）。両プライマーを用いた場合、形質転換体は
ampr突然変異体に関して選択するアンピシリン培地にお
ける増殖（段階１の選択；図３、案Ｃ及びＤ）、又はカ
ナマイシン培地における増殖のいずれかにより選択され
る。後者の場合、amprプラスミドに関する選択圧はなか
った（すなわち段階１の選択なし、図３、案Ｅ及び
Ｆ）。
ニールすると、BMH71−18 mut ｓ 形質転換体はカナ
マイシン培地における増殖により選択される（図３、案
Ａ及びＢ）。両プライマーを用いた場合、形質転換体は
ampr突然変異体に関して選択するアンピシリン培地にお
ける増殖（段階１の選択；図３、案Ｃ及びＤ）、又はカ
ナマイシン培地における増殖のいずれかにより選択され
る。後者の場合、amprプラスミドに関する選択圧はなか
った（すなわち段階１の選択なし、図３、案Ｅ及び
Ｆ）。
BMH71−18 mut Ｓ 形質転換体をひとまとめに増殖
させた後、プラスミドDNAを単離した。この時点で、DH5
αを形質転換する前にEag IでDNAを処理することにより
Eag Ir突然変異体に関する選択を課することができた
（図3;“段階２の選択”）。Eag Iを用いた処理によりE
ag I−感受性（Eag Is）野生型プラスミドが直鎖状とさ
れ、E.コリを形質転換する能力が低下する。突然変異
体、Eag Irプラスミドは環状のままであり、E.コリを有
効に形質転換する。Eag I消化を省略することにより、E
ag Ir及び野生型（Eag Is）プラスミドの両方を回収す
ることができる。“形質転換体に関して選択する”方法
と“突然変異体に関して選択する”方法を区別すること
が重要である。例えばBMH71−18 mut Ｓ 形質転換体
はカナマイシン培地における増殖により“選択”するこ
とができるが、この方法はampr又はEag Ir突然変異体に
関する選択圧を負荷しない。突然変異体は形質転換体を
段階１でアンピシリン培地において増殖させ（適用可能
な場合）、及び／又は段階２でDNAをEag Iで消化するこ
とにより選択される。
させた後、プラスミドDNAを単離した。この時点で、DH5
αを形質転換する前にEag IでDNAを処理することにより
Eag Ir突然変異体に関する選択を課することができた
（図3;“段階２の選択”）。Eag Iを用いた処理によりE
ag I−感受性（Eag Is）野生型プラスミドが直鎖状とさ
れ、E.コリを形質転換する能力が低下する。突然変異
体、Eag Irプラスミドは環状のままであり、E.コリを有
効に形質転換する。Eag I消化を省略することにより、E
ag Ir及び野生型（Eag Is）プラスミドの両方を回収す
ることができる。“形質転換体に関して選択する”方法
と“突然変異体に関して選択する”方法を区別すること
が重要である。例えばBMH71−18 mut Ｓ 形質転換体
はカナマイシン培地における増殖により“選択”するこ
とができるが、この方法はampr又はEag Ir突然変異体に
関する選択圧を負荷しない。突然変異体は形質転換体を
段階１でアンピシリン培地において増殖させ（適用可能
な場合）、及び／又は段階２でDNAをEag Iで消化するこ
とにより選択される。
2.pSELneoの突然変異誘発
環状２本鎖DNAが特定部位の突然変異誘発のための有
効な出発材料か否かを決定するために、Eag Irプライマ
ー（配列番号:2）、又はEag Irプライマー（配列番号:
2）とamprプライマー（配列番号:1）の両方を用いるこ
とによりpSELneoを突然変異誘発した（図３、案Ａ−
Ｄ）。プライマーを上記の通りにゆっくり、又は急速に
pSELneoにアニーリングした。形質転換された細胞のア
リコートをカナマイシンを含むLB平板上で平板培養する
ことによりBMH71−18 mut Ｓ 形質転換効率を決定
し、アリコートをアンピシリン平板上で平板培養するこ
とによりamprプライマーによる突然変異誘発を検定し
た。結果を下表４に示す。
効な出発材料か否かを決定するために、Eag Irプライマ
ー（配列番号:2）、又はEag Irプライマー（配列番号:
2）とamprプライマー（配列番号:1）の両方を用いるこ
とによりpSELneoを突然変異誘発した（図３、案Ａ−
Ｄ）。プライマーを上記の通りにゆっくり、又は急速に
pSELneoにアニーリングした。形質転換された細胞のア
リコートをカナマイシンを含むLB平板上で平板培養する
ことによりBMH71−18 mut Ｓ 形質転換効率を決定
し、アリコートをアンピシリン平板上で平板培養するこ
とによりamprプライマーによる突然変異誘発を検定し
た。結果を下表４に示す。
材料及び方法で記載した通りにpSELneoを突然変異誘
発した、BMH71−18 mut Ｓ 形質転換体のアリコート
を40μg/mlのカナマイシン又は100μg/mlのアンピシリ
ンを含むLB平板上で平板培養し、それぞれ形質転換体又
は突然変異体の数を決定した。２回の実験の場合の一時
kanr又はampr形質転換体の合計数を示す。
発した、BMH71−18 mut Ｓ 形質転換体のアリコート
を40μg/mlのカナマイシン又は100μg/mlのアンピシリ
ンを含むLB平板上で平板培養し、それぞれ形質転換体又
は突然変異体の数を決定した。２回の実験の場合の一時
kanr又はampr形質転換体の合計数を示す。
amprプライマー（配列番号:1）が含まれる場合（図
３、案Ｃ）、ampr突然変異体が容易に得られ、環状２本
鎖DNAが突然変異誘発のための有効な出発材料であるこ
とを示した。このプライマーがない場合、ampr産物は回
収されなかった。緩及び急アニーリング法の両方が有効
であったが、急アニーリングは約２倍多いampr突然変異
体を与えた。
３、案Ｃ）、ampr突然変異体が容易に得られ、環状２本
鎖DNAが突然変異誘発のための有効な出発材料であるこ
とを示した。このプライマーがない場合、ampr産物は回
収されなかった。緩及び急アニーリング法の両方が有効
であったが、急アニーリングは約２倍多いampr突然変異
体を与えた。
3.USE突然変異誘発の効率
選択圧を抗生物質に対する耐性（段階１）、酵素消化
（段階２）、又は両方に関して適用した場合のEag Ir突
然変異誘発の効率を比較した。両プライマーが用いられ
た場合に（図３、案Ｃ及びＤ）段階１の選択を適用し、
Eag Irプライマー（配列番号:2）が単独で用いられた場
合（図３、案Ａ及びＢ）には省略した。BMH71−18 mut
Ｓ 形質転換体の終夜培養から単離したプラスミドDN
AをEag Iで処理するか（段階２の選択；図３、案Ａ及び
Ｃ）、又は未処理のままとし（図３、案Ｂ及びＤ）、そ
の後DH5α中に形質転換した。DH5α形質転換体は、最初
のBMH71−18 mut Ｓ 形質転換体の選択に用いたもの
と同一の抗生物質を含むLB平板上で平板培養したので、
DH5α形質転換段階の間にampr突然変異体に関する選択
圧がさらに加えられることはなかった。
（段階２）、又は両方に関して適用した場合のEag Ir突
然変異誘発の効率を比較した。両プライマーが用いられ
た場合に（図３、案Ｃ及びＤ）段階１の選択を適用し、
Eag Irプライマー（配列番号:2）が単独で用いられた場
合（図３、案Ａ及びＢ）には省略した。BMH71−18 mut
Ｓ 形質転換体の終夜培養から単離したプラスミドDN
AをEag Iで処理するか（段階２の選択；図３、案Ａ及び
Ｃ）、又は未処理のままとし（図３、案Ｂ及びＤ）、そ
の後DH5α中に形質転換した。DH5α形質転換体は、最初
のBMH71−18 mut Ｓ 形質転換体の選択に用いたもの
と同一の抗生物質を含むLB平板上で平板培養したので、
DH5α形質転換段階の間にampr突然変異体に関する選択
圧がさらに加えられることはなかった。
Eag I−消化及び非消化試料の両方を、アガロースゲ
ル電気泳動を用いて調べた。いくつかの試料はエチジウ
ムブロミド−染色ゲルにおいて検出可能な環状DNAを有
していなかったで、［32P］−標識pSELneoをこれらのDN
Aのサザンブロットにハイブリッド形成させた。方法及
び結果を図４にまとめる。図４の上部に示す通り、緩
（Ｓ）又は急（Ｑ）アニーリング法に続いてBMH71−18
mut Ｓ 形質転換体からDNAを単離した。これらのDN
AをEag Iで処理するか（＋）、又は処理しなかった
（−）。
ル電気泳動を用いて調べた。いくつかの試料はエチジウ
ムブロミド−染色ゲルにおいて検出可能な環状DNAを有
していなかったで、［32P］−標識pSELneoをこれらのDN
Aのサザンブロットにハイブリッド形成させた。方法及
び結果を図４にまとめる。図４の上部に示す通り、緩
（Ｓ）又は急（Ｑ）アニーリング法に続いてBMH71−18
mut Ｓ 形質転換体からDNAを単離した。これらのDN
AをEag Iで処理するか（＋）、又は処理しなかった
（−）。
ampr突然変異体に関する段階１の選択を細胞に適用す
ると１−４列のDNAを生ずるが、５−８列のDNAは生じな
い。DNAを0.8％アガロースゲル上で分離し、Nytranフィ
ルター（Schleicher and Schuell;Keene,NH）に移
し、［32P］−標識pSELneoにハイブリッド形成した。オ
ートラジオグラフィーを室温で30分間行った。ニック環
状、直鎖状及びスーパーコイルの形態が示された位置に
移動する。
ると１−４列のDNAを生ずるが、５−８列のDNAは生じな
い。DNAを0.8％アガロースゲル上で分離し、Nytranフィ
ルター（Schleicher and Schuell;Keene,NH）に移
し、［32P］−標識pSELneoにハイブリッド形成した。オ
ートラジオグラフィーを室温で30分間行った。ニック環
状、直鎖状及びスーパーコイルの形態が示された位置に
移動する。
図４の下部はDH5αの形質転換を記載したものであ
る。上記の各DNAのアリコートをDH5αに形質転換し、得
られた形質転換体の数（x10-3）を示す。各DNAの場合
の、未処理試料に対するEag I−処理により得られた形
質転換体の数の比率を下に示す。
る。上記の各DNAのアリコートをDH5αに形質転換し、得
られた形質転換体の数（x10-3）を示す。各DNAの場合
の、未処理試料に対するEag I−処理により得られた形
質転換体の数の比率を下に示す。
ampr突然変異に関する段階１の選択圧が適用された場
合、Eag I消化後により多量の環状DNAが存在し、この結
果は非選択Eag Ir突然変異が多くの場合、段階１で選択
されるampr突然変異とカップリングしているという考え
と一致する（図4;2列と６列及び４列の８列を比較され
たい）。緩アニーリングより急アニーリングを用いた場
合に、BMH71−18 mut Ｓ 培養からのDNAのより多く
がEag Irであり、この差は第１段階の選択を行っても行
わなくても明らかであった。
合、Eag I消化後により多量の環状DNAが存在し、この結
果は非選択Eag Ir突然変異が多くの場合、段階１で選択
されるampr突然変異とカップリングしているという考え
と一致する（図4;2列と６列及び４列の８列を比較され
たい）。緩アニーリングより急アニーリングを用いた場
合に、BMH71−18 mut Ｓ 培養からのDNAのより多く
がEag Irであり、この差は第１段階の選択を行っても行
わなくても明らかであった。
予想通り、DH5α形質転換効率は各試料中の環状DNAの
量に比例した。これらの結果は上記の結果と平行してお
り、急アニーリングが緩アニーリングより有効な突然変
異誘発法であることを示唆している。
量に比例した。これらの結果は上記の結果と平行してお
り、急アニーリングが緩アニーリングより有効な突然変
異誘発法であることを示唆している。
４種の突然変異誘発法（図３、案Ａ−Ｄ）のそれぞれ
を、緩又は急アニーリングを用いることにより２通りの
方法で行った。各突然変異誘発法による16のDH5α形質
転換体からのプラスミドDNAをPst I及びCla Iで消化
し、0.8％アガロースゲル上で移動させ、エチジウムブ
ロミドで染色し、写真に撮った。親プラスミドは２つの
Pst I部位及び１つのCla I部位を有し、4.1kbpのフラグ
メント及び２つの共移動するフラグメントを与える。am
prプライマーは4.1kbpフラグメント中にPst I部位を導
入し、2.9kbp及び1.2kbpのフラグメントを生ずる。Eag
Irプライマーは共移動するフラグメントの１つにPst I
部位を導入し、140bpのフラグメント（見えない）及び
共移動するフラグメントよりわずかに速く移動する第２
のフラグメントを生ずる。これらの実験の結果を表６に
まとめる。上記の通りに分析した16のDH5α形質転換体
（図３、案Ｃから）、及びpSELneo（“P"列）からのプ
ラスミドDNAが図５に示されている。Hind IIIで消化し
たλDNAを“λ”と記す列で移動させた。16の単離物は
すべてネオミシン遺伝子中に新らしいPst I部位を有す
るが、１つは小さい欠失を有する。16のすべてがアンピ
シリンに対する耐性を与えるが、16中の15がampr遺伝子
中に新らしいPst I部位を有する。
を、緩又は急アニーリングを用いることにより２通りの
方法で行った。各突然変異誘発法による16のDH5α形質
転換体からのプラスミドDNAをPst I及びCla Iで消化
し、0.8％アガロースゲル上で移動させ、エチジウムブ
ロミドで染色し、写真に撮った。親プラスミドは２つの
Pst I部位及び１つのCla I部位を有し、4.1kbpのフラグ
メント及び２つの共移動するフラグメントを与える。am
prプライマーは4.1kbpフラグメント中にPst I部位を導
入し、2.9kbp及び1.2kbpのフラグメントを生ずる。Eag
Irプライマーは共移動するフラグメントの１つにPst I
部位を導入し、140bpのフラグメント（見えない）及び
共移動するフラグメントよりわずかに速く移動する第２
のフラグメントを生ずる。これらの実験の結果を表６に
まとめる。上記の通りに分析した16のDH5α形質転換体
（図３、案Ｃから）、及びpSELneo（“P"列）からのプ
ラスミドDNAが図５に示されている。Hind IIIで消化し
たλDNAを“λ”と記す列で移動させた。16の単離物は
すべてネオミシン遺伝子中に新らしいPst I部位を有す
るが、１つは小さい欠失を有する。16のすべてがアンピ
シリンに対する耐性を与えるが、16中の15がampr遺伝子
中に新らしいPst I部位を有する。
いくつかの場合に、単離されたDNAは突然変異体及び
親プラスミドの混合物を含んだ。E.コリを再形質転換す
ることによりこれらの混合物から突然変異プラスミドを
単離するのは比較的容易なので、混合単離物を含んで表
５における突然変異誘発効率を算出した。
親プラスミドの混合物を含んだ。E.コリを再形質転換す
ることによりこれらの混合物から突然変異プラスミドを
単離するのは比較的容易なので、混合単離物を含んで表
５における突然変異誘発効率を算出した。
１つ又は両方の突然変異誘発プライマーを急速に、又
はゆっくりとpSELneoにアニーリングした。ampr突然変
異体はアンピシリン培地中でBMH71−18 mut Ｓ 形質
転換体を増殖させることにより段階１の間に選択した。
Eag Ir突然変異体は、BMH71−18 mut Ｓ 形質転換体
から単離したDNAをEag Iで消化することにより段階２の
選択の間に選択した。各組からの16の単離物をEag Iを
用いて、及びPst I/Cla Iを用いてマッピングした。Eag
Irプラスミドを有する単離物（正確）、又はEag Ir及
びEag Isプラスミドの混合物（混合）を有する単離物の
数を示す。Eag Ir突然変異誘発頻度は、正確及び混合単
離物の合計を16で割った数として算出し、パーセントで
表した（頻度）。
はゆっくりとpSELneoにアニーリングした。ampr突然変
異体はアンピシリン培地中でBMH71−18 mut Ｓ 形質
転換体を増殖させることにより段階１の間に選択した。
Eag Ir突然変異体は、BMH71−18 mut Ｓ 形質転換体
から単離したDNAをEag Iで消化することにより段階２の
選択の間に選択した。各組からの16の単離物をEag Iを
用いて、及びPst I/Cla Iを用いてマッピングした。Eag
Irプラスミドを有する単離物（正確）、又はEag Ir及
びEag Isプラスミドの混合物（混合）を有する単離物の
数を示す。Eag Ir突然変異誘発頻度は、正確及び混合単
離物の合計を16で割った数として算出し、パーセントで
表した（頻度）。
急アニーリング法を用いると第１段階及び第２段階選
択の両方の場合に、16の単離物中の14が両突然変異を有
するが、緩アニーリングを用いると16中の９が両突然変
異を有する。興味深いことに、緩アニーリングの後に単
離される不正確な産物のほとんどが欠失から生じた。こ
れらの欠失産物は図４に示すオートラジオグラフの下の
領域で見ることができる。急アニーリング条件下ではほ
とんど欠失産物は単離されず、急アニーリングを用いた
場合にオートラジオグラフィー時間を延長してもサザン
ハイブリッド形成分析によって全く検出されない。
択の両方の場合に、16の単離物中の14が両突然変異を有
するが、緩アニーリングを用いると16中の９が両突然変
異を有する。興味深いことに、緩アニーリングの後に単
離される不正確な産物のほとんどが欠失から生じた。こ
れらの欠失産物は図４に示すオートラジオグラフの下の
領域で見ることができる。急アニーリング条件下ではほ
とんど欠失産物は単離されず、急アニーリングを用いた
場合にオートラジオグラフィー時間を延長してもサザン
ハイブリッド形成分析によって全く検出されない。
段階１又は段階２の選択のいずれかを適用した場合に
回収された産物の約80％がEag Ir突然変異を有し（表
５）、高頻度におけるEag Ir突然変異体の回収に１つの
選択圧で十分であることを示した。これらの結果はさら
に、ユニーク制限部位を含まないプラスミドに関する選
択圧がその有効な回収を可能にするのに十分な強さであ
ることを示しており、ユニーク制限部位における選択可
能な突然変異と結合されれば、非選択突然変異を高頻度
で回収することが可能であることを示唆している。
回収された産物の約80％がEag Ir突然変異を有し（表
５）、高頻度におけるEag Ir突然変異体の回収に１つの
選択圧で十分であることを示した。これらの結果はさら
に、ユニーク制限部位を含まないプラスミドに関する選
択圧がその有効な回収を可能にするのに十分な強さであ
ることを示しており、ユニーク制限部位における選択可
能な突然変異と結合されれば、非選択突然変異を高頻度
で回収することが可能であることを示唆している。
図３、案Ｅ及びＦに図示する実験は、ユニーク部位の
除去に関する選択を非選択突然変異の高頻度の回収に用
いることができるか否かを調べるために行ったものであ
る。これらの実験の場合ampr及びEag Ir突然変異の役割
が逆転され、すなわちDH5αの形質転換の前にEag Iで消
化することによりEag Ir突然変異体が選択され（図３、
案Ｅ）、ampr突然変異体は選択されなかった（すべての
形質転換体をカナマイシン培地中で増殖させる）。標準
実験の場合（図３、案Ｆ）、突然変異体選択は課せられ
なかった。ampr突然変異を有するプラスミドはアンピシ
リンを含むLB培地に最低100のkanr形質転換体をレプリ
カ平板培養することにより同定した。２回の独立した実
験において、Eag I−選択圧を適用した場合にkanr形質
転換体の80％がamprであった。選択圧を適用しない場
合、ampr突然変異は約５％の頻度で回収された。かくし
てUSEによる突然変異誘発は、非選択突然変異の回収に
有効な案である。
除去に関する選択を非選択突然変異の高頻度の回収に用
いることができるか否かを調べるために行ったものであ
る。これらの実験の場合ampr及びEag Ir突然変異の役割
が逆転され、すなわちDH5αの形質転換の前にEag Iで消
化することによりEag Ir突然変異体が選択され（図３、
案Ｅ）、ampr突然変異体は選択されなかった（すべての
形質転換体をカナマイシン培地中で増殖させる）。標準
実験の場合（図３、案Ｆ）、突然変異体選択は課せられ
なかった。ampr突然変異を有するプラスミドはアンピシ
リンを含むLB培地に最低100のkanr形質転換体をレプリ
カ平板培養することにより同定した。２回の独立した実
験において、Eag I−選択圧を適用した場合にkanr形質
転換体の80％がamprであった。選択圧を適用しない場
合、ampr突然変異は約５％の頻度で回収された。かくし
てUSEによる突然変異誘発は、非選択突然変異の回収に
有効な案である。
4.USE及びLP−USEを用いたpRSVEd1884の突然変異誘発
USE及びLP−USE突然変異誘発の効率を比較するため
に、ユニークBamH I部位をKpn I部位に変換することに
より除去する２つの相補的プライマー（プライマー6A及
び6B、表３）を含む３つの突然変異誘発プライマーを用
いて、同一の突然変異をプラスミドpRSVEd1884に導入し
た。第３のプライマー（21A、表３）はＴ抗原遺伝子中
のサイレント突然変異を導入し、pRSVEd1884の３つのHi
nd III部位の１つを破壊する。プライマー21A及びプラ
イマー6Aを対にすることにより、USE突然変異誘発を用
いた第２鎖合成の間にBamH I及びHind III部位における
突然変異が結合される。PCR反応においてプライマー21A
とプライマー6Bを対にすると、BamH I及びHind III突然
変異が結合された1469bpのフラグメントが得られ、それ
を続いてLP−USE突然変異誘発に用いることができる。
得られる突然変異を制限マッピングにより容易に同定す
ることができ、プラスミド候補の分析が容易になるので
これらのプライマーの対を最初の試験のために選んだ。
に、ユニークBamH I部位をKpn I部位に変換することに
より除去する２つの相補的プライマー（プライマー6A及
び6B、表３）を含む３つの突然変異誘発プライマーを用
いて、同一の突然変異をプラスミドpRSVEd1884に導入し
た。第３のプライマー（21A、表３）はＴ抗原遺伝子中
のサイレント突然変異を導入し、pRSVEd1884の３つのHi
nd III部位の１つを破壊する。プライマー21A及びプラ
イマー6Aを対にすることにより、USE突然変異誘発を用
いた第２鎖合成の間にBamH I及びHind III部位における
突然変異が結合される。PCR反応においてプライマー21A
とプライマー6Bを対にすると、BamH I及びHind III突然
変異が結合された1469bpのフラグメントが得られ、それ
を続いてLP−USE突然変異誘発に用いることができる。
得られる突然変異を制限マッピングにより容易に同定す
ることができ、プラスミド候補の分析が容易になるので
これらのプライマーの対を最初の試験のために選んだ。
LP−USE突然変異誘発は上記の通りに行った。PCR増幅
段階を加える他に、USE及びLP−USE法における唯一の重
要な差は第２鎖合成反応を進行させる時間の長さに関す
る。第２鎖合成反応物は、USEの場合30分間インキュベ
ートされ、LP−USEの場合５−30分間であった。E.コリ
株BMH71−18 mut Ｓ（Zellet al.（1987）EMBO J.
６1809−1815）へのエレクトロポレーションの後、形質
転換細胞の10％をアンピシリンを含むLB寒天平板上で平
板培養し、一次形質転換体の数を評価した。残りの形質
転換体をアンピシリンを含む5mlのLB培地中で終夜増殖
させることによりひとまとめに拡大した。これらの培養
から調製したDNAをBamH Iで消化し、Deng et al.（同
上）により以前に記載された通りにDH5α中に形質転換
した。いくつかの場合にBamH I消化が不完全であり、非
突然変異BamH I−感受性プラスミドを有するDH5α形質
転換体のパーセントテージが高かった。BMH71−18 mut
Ｓから単離したDNAの完全な消化は、DH5α又はHB101
から単離したDNAのようには容易でない。非突然変異体
バックグラウンド頻度を減少させるために、いくつかの
実験の場合に以下のような第２循環のBamH I選択を含ん
だ。1000以上の一次（primary）DH5αコロニーから調製
したプラスミドDNAをBamH Iで消化し、DH5α中に再形質
転換し、二次DH5α形質転換体を得た。BamH I、Hind II
I及びKpn I消化を用いた制限マッピングにより、一次及
び二次DH5α形質転換体の両方から単離したプラスミドD
NAにおける突然変異を同定した。
段階を加える他に、USE及びLP−USE法における唯一の重
要な差は第２鎖合成反応を進行させる時間の長さに関す
る。第２鎖合成反応物は、USEの場合30分間インキュベ
ートされ、LP−USEの場合５−30分間であった。E.コリ
株BMH71−18 mut Ｓ（Zellet al.（1987）EMBO J.
６1809−1815）へのエレクトロポレーションの後、形質
転換細胞の10％をアンピシリンを含むLB寒天平板上で平
板培養し、一次形質転換体の数を評価した。残りの形質
転換体をアンピシリンを含む5mlのLB培地中で終夜増殖
させることによりひとまとめに拡大した。これらの培養
から調製したDNAをBamH Iで消化し、Deng et al.（同
上）により以前に記載された通りにDH5α中に形質転換
した。いくつかの場合にBamH I消化が不完全であり、非
突然変異BamH I−感受性プラスミドを有するDH5α形質
転換体のパーセントテージが高かった。BMH71−18 mut
Ｓから単離したDNAの完全な消化は、DH5α又はHB101
から単離したDNAのようには容易でない。非突然変異体
バックグラウンド頻度を減少させるために、いくつかの
実験の場合に以下のような第２循環のBamH I選択を含ん
だ。1000以上の一次（primary）DH5αコロニーから調製
したプラスミドDNAをBamH Iで消化し、DH5α中に再形質
転換し、二次DH5α形質転換体を得た。BamH I、Hind II
I及びKpn I消化を用いた制限マッピングにより、一次及
び二次DH5α形質転換体の両方から単離したプラスミドD
NAにおける突然変異を同定した。
LP−USE法を用い、非選択突然変異が高い効率で単離
された。これら実験の結果を図６に示し、２つの独立し
たLP−USE実験の組の結果のまとめを表６に示す。
された。これら実験の結果を図６に示し、２つの独立し
たLP−USE実験の組の結果のまとめを表６に示す。
プライマー6B（BamH I）及び21A（Hind III）を用いて
増幅した1498bpのフラグメントをLP−USE突然変異誘発
に用い、第２鎖合成反応時間は５−30分の範囲とした。
（＊）で記した反応の場合、T4 DNAポリメラーゼ及びT
4 DNAリガーゼを省略した。一次BMH71−18 mut Ｓ
形質転換体の数はエレクトロポレーションの１時間後に
細胞のアリコートを平板培養することにより評価した。
DH5の場合、形質転換混合物全体を１つの平板上で平板
培養した。BamH I突然変異体の割合は、BamH I−耐性突
然変異体の数／一次及び二次DH5コロニーからスクリー
ニングされたプラスミドの数として示す。Kpn I及びHin
d III突然変異体の割合は、Kpn I又はHind III突然変異
体の数/BamH I−耐性突然変異体として示す（＋を除
く。10のBamH I−感受性単離物もHind III突然変異に関
して調べた）。ND＝決定せず。
増幅した1498bpのフラグメントをLP−USE突然変異誘発
に用い、第２鎖合成反応時間は５−30分の範囲とした。
（＊）で記した反応の場合、T4 DNAポリメラーゼ及びT
4 DNAリガーゼを省略した。一次BMH71−18 mut Ｓ
形質転換体の数はエレクトロポレーションの１時間後に
細胞のアリコートを平板培養することにより評価した。
DH5の場合、形質転換混合物全体を１つの平板上で平板
培養した。BamH I突然変異体の割合は、BamH I−耐性突
然変異体の数／一次及び二次DH5コロニーからスクリー
ニングされたプラスミドの数として示す。Kpn I及びHin
d III突然変異体の割合は、Kpn I又はHind III突然変異
体の数/BamH I−耐性突然変異体として示す（＋を除
く。10のBamH I−感受性単離物もHind III突然変異に関
して調べた）。ND＝決定せず。
最高の突然変異体の収率は、第２鎖合成反応が５分間
の場合に得られた。PCR産物プライマー及びT4 DNAポリ
メラーゼの両方が省略された場合、BMH71−18 mut Ｓ
形質転換の頻度は10分の１以下に減少した。PCR産物
をアニーリングしたが、試験管内の第２鎖合成を省略し
た場合のBMH71−18 mut Ｓ 形質転換頻度は、第２鎖
合成が含まれた場合の頻度と同様であった。しかし試験
管内合成を行わないと、一次DH5α形質転換体からBamH
I−耐性突然変異体（又は２重突然変異体）が回収され
なかった。DH5α形質転換体から単離して集められたDNA
に第２循環のBamH I選択を適用した後、BamH I−耐性突
然変異体は第２鎖合成を行わなくても回収された。しか
しこの場合、BamH I耐性突然変異体のいずれも非選択Hi
nd III突然変異を有していなかった（表６、実験２）。
の場合に得られた。PCR産物プライマー及びT4 DNAポリ
メラーゼの両方が省略された場合、BMH71−18 mut Ｓ
形質転換の頻度は10分の１以下に減少した。PCR産物
をアニーリングしたが、試験管内の第２鎖合成を省略し
た場合のBMH71−18 mut Ｓ 形質転換頻度は、第２鎖
合成が含まれた場合の頻度と同様であった。しかし試験
管内合成を行わないと、一次DH5α形質転換体からBamH
I−耐性突然変異体（又は２重突然変異体）が回収され
なかった。DH5α形質転換体から単離して集められたDNA
に第２循環のBamH I選択を適用した後、BamH I−耐性突
然変異体は第２鎖合成を行わなくても回収された。しか
しこの場合、BamH I耐性突然変異体のいずれも非選択Hi
nd III突然変異を有していなかった（表６、実験２）。
標準的USE突然変異誘発法を用いることにより同一の
突然変異を導入した。合計20の一次DH5α形質転換体を
特性化した。20のすべてがBamH I−耐性/Kpn I−感受性
突然変異を有し、20中の16が非選択可能Hind III突然変
異を有し、80％の突然変異誘発効率を与えた。
突然変異を導入した。合計20の一次DH5α形質転換体を
特性化した。20のすべてがBamH I−耐性/Kpn I−感受性
突然変異を有し、20中の16が非選択可能Hind III突然変
異を有し、80％の突然変異誘発効率を与えた。
5.LP−USE及びUSE突然変異誘発へのPCR産物の長さ及び
プライマーの分離距離の影響 PCR産物の長さ又はプライマーを隔てている距離がそ
れぞれLP−USE又はUSE突然変異誘発効率に影響を与える
か否かを決定するために、表７に記載する通り、25種の
プライマーの対を用いてこれらの方法を行った。
プライマーの分離距離の影響 PCR産物の長さ又はプライマーを隔てている距離がそ
れぞれLP−USE又はUSE突然変異誘発効率に影響を与える
か否かを決定するために、表７に記載する通り、25種の
プライマーの対を用いてこれらの方法を行った。
Ｔ抗原遺伝子中に突然変異を導入するために設計され
たプライマーのそれぞれを、BamH I部位におけるUSE−
及びLP−USE−選択可能突然変異の導入に用いたプライ
マー6A又はプライマー6B（表３を参照）のいずれかと対
にした。
たプライマーのそれぞれを、BamH I部位におけるUSE−
及びLP−USE−選択可能突然変異の導入に用いたプライ
マー6A又はプライマー6B（表３を参照）のいずれかと対
にした。
Hind III部位を除去する21A（配列番号:33）を除くす
べてのプライマーにより導入された突然変異はDNA配列
分析により同定された。プライマー21A（配列番号:33）
を除くすべてのプライマーの場合にLP−USE第２鎖合成
は30分間行った（表６を参照）。プライマー分離距離は
突然変異の位置から測定した。結合の割合は、同定され
た非選択突然変異体の数／スクリーニングされた数を示
す。
べてのプライマーにより導入された突然変異はDNA配列
分析により同定された。プライマー21A（配列番号:33）
を除くすべてのプライマーの場合にLP−USE第２鎖合成
は30分間行った（表６を参照）。プライマー分離距離は
突然変異の位置から測定した。結合の割合は、同定され
た非選択突然変異体の数／スクリーニングされた数を示
す。
USE及びLP−USE法の両方の場合にプライマー分離距離
は181−1966bpの範囲であり、第２鎖合成反応物は30分
間インキュベートした。BamH I−耐性突然変異は制限部
位を破壊もせず、創造もしないで、プライマー21A（配
列番号:33）を除くすべてのプライマーの場合に非選択
突然変異は、BamH I−耐性突然変異体のDNA配列分析に
より同定した。
は181−1966bpの範囲であり、第２鎖合成反応物は30分
間インキュベートした。BamH I−耐性突然変異は制限部
位を破壊もせず、創造もしないで、プライマー21A（配
列番号:33）を除くすべてのプライマーの場合に非選択
突然変異は、BamH I−耐性突然変異体のDNA配列分析に
より同定した。
これらの実験の結果は、長いPCR産物が小さいPCR産物
よりLP−USE突然変異誘発プライマーとして有効性が低
いことを示している（表７を参照）。しかしLP−USE実
験が第２鎖合成反応物を30分間インキュベートして行わ
れ、プライマー6Bと21Aの1469bp PCR産物を用いた場
合、反応時間を長くすると突然変異誘発の効率が低下す
ることが示されたことに注意するのが重要である。対照
的にUSEを用いた場合、プライマー分離距離と突然変異
効率の間に明らかな関連性はなかった。USE突然変異誘
発が30分より短時間の合成反応で調べられていないこと
にも注意されたい。
よりLP−USE突然変異誘発プライマーとして有効性が低
いことを示している（表７を参照）。しかしLP−USE実
験が第２鎖合成反応物を30分間インキュベートして行わ
れ、プライマー6Bと21Aの1469bp PCR産物を用いた場
合、反応時間を長くすると突然変異誘発の効率が低下す
ることが示されたことに注意するのが重要である。対照
的にUSEを用いた場合、プライマー分離距離と突然変異
効率の間に明らかな関連性はなかった。USE突然変異誘
発が30分より短時間の合成反応で調べられていないこと
にも注意されたい。
6.LP−USE及びUSE突然変異誘発の忠実度
Tag DNAポリメラーゼはPCRの間に高い割合の取り込
み違いを起こすことが知られているので、PCR増幅段階
の付加が望まれていない突然変異の頻度を増加させるか
否かを決定する試験を行った。Ｔ抗原遺伝子における突
然変異に関してスクリーニングされた47種のプラスミド
のそれぞれからの約200bpの配列情報を、望まれていな
い突然変異の存在に関して分析した。
み違いを起こすことが知られているので、PCR増幅段階
の付加が望まれていない突然変異の頻度を増加させるか
否かを決定する試験を行った。Ｔ抗原遺伝子における突
然変異に関してスクリーニングされた47種のプラスミド
のそれぞれからの約200bpの配列情報を、望まれていな
い突然変異の存在に関して分析した。
この分析により、望まれていない突然変異がUSE及びL
P−USE法の両方において同等の比率で導入されたことが
示された。LP−USE突然変異誘発の後に、2690bp中で１
つの望まれていない突然変異が見いだされ、USEの場合
は6099bp中に４つの望まれていない突然変異が見いださ
れ、平均比率が約1:2200bpである。この比率は平均の大
きさの遺伝子において約１つの望まれていない突然変異
を与えると予想されるが、望まれていない突然変異のほ
とんどが突然変異誘発プライマー配列の非常に近く又は
その中に見いだされたことに注意するのが重要である
（図７を参照）。約9000の配列決定された塩基対におい
て、プライマー部位から150bp以上離れて観察された望
まれていない突然変異はわずか１つであった。LP−USE
の場合に見いだされた１つの望まれていない突然変異が
ライマー配列内に存在し、USE突然変異誘発の後も望ま
れていない突然変異がプライマー配列内に見いだされた
ので、この望まれていないLP−USE突然変異はおそらくP
CR増幅の間に導入されたのでないであろう。
P−USE法の両方において同等の比率で導入されたことが
示された。LP−USE突然変異誘発の後に、2690bp中で１
つの望まれていない突然変異が見いだされ、USEの場合
は6099bp中に４つの望まれていない突然変異が見いださ
れ、平均比率が約1:2200bpである。この比率は平均の大
きさの遺伝子において約１つの望まれていない突然変異
を与えると予想されるが、望まれていない突然変異のほ
とんどが突然変異誘発プライマー配列の非常に近く又は
その中に見いだされたことに注意するのが重要である
（図７を参照）。約9000の配列決定された塩基対におい
て、プライマー部位から150bp以上離れて観察された望
まれていない突然変異はわずか１つであった。LP−USE
の場合に見いだされた１つの望まれていない突然変異が
ライマー配列内に存在し、USE突然変異誘発の後も望ま
れていない突然変異がプライマー配列内に見いだされた
ので、この望まれていないLP−USE突然変異はおそらくP
CR増幅の間に導入されたのでないであろう。
同等事項
当該技術分野における熟練者は、日常的実験のみを用
いて本明細書に記載の特別な方法に対する多数の同等事
項を認識するか、又は突き止めることができるであろ
う。そのような同等事項は本発明の範囲内に含まれ、以
下の請求の範囲により網羅されると考える。
いて本明細書に記載の特別な方法に対する多数の同等事
項を認識するか、又は突き止めることができるであろ
う。そのような同等事項は本発明の範囲内に含まれ、以
下の請求の範囲により網羅されると考える。
配列表
配列番号:1
配列の長さ:27
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴
特徴を表す記号:misc_feature
存在位置:1..27
他の情報:/標識＝amprプライマー
配列
配列番号:2
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴
特徴を表す記号:misc_feature
存在位置:1..24
他の情報:/標識＝Eag Iプライマー
配列
配列番号:3
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴
特徴を表す記号:misc_feature
存在位置:1..24
他の情報:/標識＝Ast II プライマー
配列
配列番号:4
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴
特徴を表す記号:misc_feature
存在位置:1..24
他の情報:/標識＝Afl III プライマー
配列
配列番号:5
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴
特徴を表す記号:misc_feature
存在位置:1..20
他の情報:/標識＝AlwN I プライマー
配列
配列番号:6
配列の長さ:22
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴
特徴を表す記号:misc_feature
存在位置:1..22
他の情報:/標識＝Bsa I プライマー
配列
配列番号:7
配列の長さ:22
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴
特徴を表す記号:misc_feature
存在位置:1..22
他の情報:/標識＝EcoR I プライマー
配列
配列番号:8
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴
特徴を表す記号:misc_feature
存在位置:1..24
他の情報:/標識＝Hind III プライマー
配列
配列番号:9
配列の長さ:22
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴
特徴を表す記号:misc_feature
存在位置:1..22
他の情報:/標識＝Sca I プライマー
配列
配列番号:10
配列の長さ:29
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴
特徴を表す記号:misc_feature
存在位置:1..29
他の情報:/標識＝Ssp I プライマー
配列
配列番号:11
配列の長さ:22
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴
特徴を表す記号:misc_feature
存在位置:1..22
他の情報:/標識＝Xmn I プライマー
配列
配列番号:12
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴：プライマー１
配列
配列番号:13
配列の長さ:26
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴：プライマー２
配列
配列番号:14
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴：プライマー３
配列
配列番号:15
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴：プライマー4B
配列
配列番号:16
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴：プライマー５
配列
配列番号:17
配列の長さ:26
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴：プライマー6A
配列
配列番号:18
配列の長さ:26
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴：プライマー6B
配列
配列番号:19
配列の長さ:26
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴：プライマー７
配列
配列番号:20
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴：プライマー８
配列
配列番号:21
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴：プライマー９
配列
配列番号:22
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴：プライマー10B
配列
配列番号:23
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴：プライマー11
配列
配列番号:24
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴：プライマー12B
配列
配列番号:25
配列の長さ:25
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴：プライマー13
配列
配列番号:26
配列の長さ:26
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴：プライマー14B
配列
配列番号:27
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴：プライマー15B
配列
配列番号:28
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴：プライマー16B
配列
配列番号:29
配列の長さ:25
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴：プライマー17
配列
配列番号:30
配列の長さ:27
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴：プライマー18B
配列
配列番号:31
配列の長さ:26
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴：プライマー19B
配列
配列番号:32
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴：プライマー20
配列
配列番号:33
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
直接の起源：合成
配列の特徴：プライマー21A
配列
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 デング，ウイン・ピー
アメリカ合衆国マサチユセツツ州02215
ボストン・アパートメント３・パークド
ライブ207
(56)参考文献 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，Ｖｏｌ．18，Ｎｏ．12（1990)
ｐ．3439−3443
Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．34，Ｎｏ．２−３
（1985）ｐ．315−323
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (27)
- 【請求項１】（ａ）非必須ユニーク制限部位を含む複製
可能な環状の親DNAから、非突然変異親型DNA及び所望の
突然変異を含むが制限部位を含まない突然変異子孫DNA
を作出し、 （ｂ）非突然変異親型DNA及び突然変異子孫DNAを、該ユ
ニーク制限部位で切断して非突然変異親型DNAを直鎖状
にするが、突然変異子孫DNAは環状のまま残こす酵素で
処理し、そして （ｃ）環状DNAが直鎖状DNAより高い効率で形質転換され
て大部分の形質転換体が突然変異子孫DNAを有するよう
になる条件下で宿主細胞を段階（ｂ）で得られる酵素処
理DNAを用いて形質転換することにより突然変異子孫DNA
に関して選択することを特徴とする突然変異DNAの生産
方法。 - 【請求項２】救済するべき突然変異遺伝子を含むプライ
マーを用いて子孫DNAを生成することを特徴とする、突
然変異DNAの標的救済のための請求項１記載の方法。 - 【請求項３】複製可能な親DNAが二本鎖であることを特
徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項４】（ａ）非必須ユニーク制限部位及び突然変
異を起こすべき標的DNAを含む環状一本鎖DNA（ssDNA）
を準備し、 （ｂ）標的DNAと相補的であるが所望のヌクレオチド突
然変異を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、及
び同一鎖の非必須ユニーク制限部位と相補的であるが該
ユニーク制限部位が除去されるようなヌクレオチド突然
変異を該ユニーク制限部位に含む第２のオリゴヌクレオ
チドプライマーを準備し、 （ｃ）第１のプライマーが標的DNAにハイブリッド形成
し、第２のプライマーが該ユニーク制限部位にハイブリ
ッド形成するような条件下で第１及び第２のプライマー
を環状ssDNAにアニールし、 （ｄ）環状ssDNAの鋳型上で該ユニーク制限部位を含ま
ずそして標的DNA中に突然変異を含むDNAの新しい鎖を合
成し、 （ｅ）DNAの新しい鎖を連結して環状二本鎖DNA（dsDN
A）を合成し、 （ｆ）ミスマッチ修復欠陥である宿主細胞を環状dsDNA
で形質転換し、 （ｇ）宿主細胞を培養し、DNAの新しい鎖を複製及び共
分離させて、両鎖にプライマー導入突然変異を含む環状
dsDNAを生産し、 （ｈ）形質転換され、培養された宿主細胞から環状dsDN
Aを単離し、 （ｉ）単離された環状dsDNAを、非必須ユニーク制限部
位を切断し、該ユニーク制限部位を含む親型環状DNAを
切断して直鎖状の親型DNAを形成するが、該ユニーク制
限部位が除去された環状の突然変異子孫DNAを切断せず
に環状のまま残す制限酵素で処理し、 （ｊ）環状の突然変異子孫DNAが直鎖状の親型DNAより一
層効率的に宿主細胞に取り込まれる条件下で第２の宿主
細胞を段階（ｉ）の制限酵素で処理されたDNAにより形
質転換し、 （ｋ）形質転換された宿主細胞を培養し、そして （ｌ）形質転換された宿主細胞から、大部分が標的DNA
中に突然変異を含む環状dsDNAを場合により単離する、 ことを特徴とする部位特異的突然変異誘発の方法。 - 【請求項５】突然変異を起こすべき標的DNAを含むDNAが
プラスミドDNA、コスミドDNA、ウィルスDNA、ファスミ
ドDNA又はバクテリオファージDNAであることを特徴とす
る請求項４記載の方法。 - 【請求項６】DNAがpUC19、pBR322、pBluescriptTM、pBl
uescript IITM、pSP6/T3、pSP6/T7−19、pT7/T3α−19
及びpTZ19Rから成る群より選ばれることを特徴とする請
求項５記載の方法。 - 【請求項７】第２のオリゴヌクレオチドプライマーが配
列表において配列番号:1−33として挙げたプライマー、
又はそれらの相補的プライマーから選ばれることを特徴
とする請求項６記載の方法。 - 【請求項８】第２のオリゴヌクレオチドプライマーが新
しい制限部位を創造することを特徴とする請求項４記載
の方法。 - 【請求項９】DNAの新しい鎖が、第１及び第２のオリゴ
ヌクレオチドプライマーからのDNAをT4ポリメラーゼを
用いて伸長し、続いてT4リガーゼを用いて連結すること
により合成されることを特徴とする請求項４記載の方
法。 - 【請求項１０】ミスマッチ修復欠陥細胞株が大腸菌（Es
cherichia coli）BMH71−18 mut Ｓ株であることを
特徴とする請求項４記載の方法。 - 【請求項１１】宿主細胞がエレクトロポレーションによ
り形質転換されることを特徴とする請求項４記載の方
法。 - 【請求項１２】（ａ）非必須ユニーク制限部位及び突然
変異を起こすべき標的DNAを含む複製可能な環状の二本
鎖DNAを準備し、 （ｂ）１つの鎖の標的DNAと相補的であるが所望のヌク
レオチド突然変異を含む第１オリゴヌクレオチドプライ
マーを準備し、そして他の鎖の非必須ユニーク制限部位
と相補的であるが該ユニーク制限部位が除去されるよう
なヌクレオチド突然変異を該ユニーク制限部位に含む第
２のオリゴヌクレオチドプライマーを準備し、 （ｃ）環状dsDNAを変性して環状ssDNAを形成し、 （ｄ）第１のオリゴヌクレオチドプライマーが１つの鎖
の標的DNAにハイブリッド形成し、第２のオリゴヌクレ
オチドプライマーが該ユニーク制限部位において他の鎖
にハイブリッド形成するような条件下で第１及び第２の
オリゴヌクレオチドプライマーを環状ssDNAにアニール
し、 （ｅ）標的DNA中に突然変異を含むが該ユニーク制限部
位を含まない直鎖状dsDNA産物を生産するのに十分な条
件下でポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、 （ｆ）該dsDNA産物を直鎖状ssDNAに変性し、 （ｇ）直鎖状ssDNAを環状ssDNAにアニールし、 （ｈ）環状ssDNAの鋳型上でDNAの新しい鎖を合成し、 （ｉ）該ユニーク制限部位を含まずに標的DNA中に突然
変異を含むDNAの新しい鎖を連結して環状の二本鎖DNA
（dsDNA）を形成し、 （ｊ）ミスマッチ修復欠陥である宿主細胞を段階（ｉ）
の環状dsDNAで形質転換し、 （ｋ）形質転換された宿主細胞を培養して段階（ｉ）の
環状dsDNAを複製させ、 （ｌ）形質転換され、培養された宿主細胞から複製され
た環状dsDNAを単離し、 （ｍ）単離された環状dsDNAAを、非必須ユニーク制限部
位を切断し、該ユニーク制限部位を含む親型環状dsDNA
を切断して直鎖状の親型dsDNAを形成するが該ユニーク
制限部位が除去された環状突然変異子孫DNAは切断せず
に環状のまま残す制限酵素で処理し、 （ｎ）環状の突然変異dsDNAが直鎖状の親型dsDNAより一
層効率的に細胞に取り込まれる条件下で第２の宿主細胞
を段階（ｍ）の酵素で処理されたdsDNAにより形質転換
し、 （ｏ）形質転換された宿主細胞を培養し、そして （ｐ）形質転換された宿主細胞から、大部分が標的DNA
中に突然変異を含む環状dsDNAを場合により単離する ことを特徴とする部位特異的突然変異誘発の方法。 - 【請求項１３】突然変異を起こすべき標的DNAを含む環
状ssDNAがプラスミドDNAであることを特徴とする請求項
12記載の方法。 - 【請求項１４】プラスミドDNAがpUC19、pBR322、pBlues
criptTM、pBluescript IITM、pSP6/T3、pSP6/T7−19、p
T7/T3α−19及びpTZ19Rから成る群より選ばれることを
特徴とする請求項13記載の方法。 - 【請求項１５】第２のオリゴヌクレオチドプライマーが
配列表において配列番号１−33として挙げたプライマー
から選ばれることを特徴とする請求項14記載の方法。 - 【請求項１６】第２のオリゴヌクレオチドプライマーが
新しい制限部位を創造することを特徴とする請求項12記
載の方法。 - 【請求項１７】DNAの新しい鎖が、第１及び第２のオリ
ゴヌクレオチドプライマーからのDNAをT4ポリメラーゼ
を用いて伸長し、続いてT4リガーゼを用いて連結するこ
とにより合成されることを特徴とする請求項12記載の方
法。 - 【請求項１８】ミスマッチ修復欠陥細胞株が大腸菌BMH7
1−18 mut Ｓ株であることを特徴とする請求項12記載
の方法。 - 【請求項１９】宿主細胞がエレクトロポレーションによ
り形質転換されることを特徴とする請求項12記載の方
法。 - 【請求項２０】（ａ）ミスマッチ修復欠陥であるバクテ
リア宿主細胞、及び （ｂ）DNAの非必須ユニーク制限部位と相補的である
が、該ユニーク制限部位が除去されるようなヌクレオチ
ド突然変異を該ユニーク制限部位に含むオリゴヌクレオ
チドプライマー （ｃ）非必須ユニーク制限部位、及び標識遺伝子が不活
性となるように該標識遺伝子中に突然変異を含む対照の
DNA、及び （ｄ）該突然変異を修復するためのオリゴヌクレオチド
プライマー、 を含む、DNAの部位特異的突然変異誘発を行うためのキ
ット。 - 【請求項２１】さらに （ａ）オリゴヌクレオチドプライマーから第２鎖のDNA
合成をもたらしうるDNAポリメラーゼ及びDNAリガーゼ、 （ｂ）デオキシアデノシン5'−三リン酸、デオキシグア
ノシン5'−三リン酸、デオキシシトシン5'−三リン酸、
及びチミジン5'−三リン酸を含むデオキシリボヌクレオ
チド、 （ｃ）ユニーク制限部位の切断のための制限酵素、 （ｄ）ATP（アデノシン5'−三リン酸）及びポリヌクレ
オチドキナーゼ、 （ｅ）試験管内のDNA合成を促進する試薬、及び （ｆ）リン酸化反応、PCR反応、DNA合成反応、制限酵素
消化及びDNA精製を行うための緩衝液、 を含む請求項20記載のキット。 - 【請求項２２】DNAがプラスミドDNAであることを特徴と
する請求項20記載のキット。 - 【請求項２３】ミスマッチ修復欠陥宿主が大腸菌BMH71
−18 mut Ｓ株であることを特徴とする請求項20記載
のキット。 - 【請求項２４】DNAポリメラーゼがT4 DNAポリメラーゼ
であり、リガーゼがT4 DNAリガーゼであることを特徴
とする請求項21記載のキット。 - 【請求項２５】ポリヌクレオチドキナーゼがT4ポリヌク
レオチドキナーゼであることを特徴とする請求項21記載
のキット。 - 【請求項２６】DNA合成の促進のための試薬がT4遺伝子3
2タンパク質であることを特徴とする請求項21記載のキ
ット。 - 【請求項２７】対照プライマーの少なくとも１つが標識
遺伝子における突然変異を除去し、それにより遺伝子活
性を復帰させることを特徴とする請求項20記載のキッ
ト。
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
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