JP2016536343A - 抗炎症性のタンパク質及び使用方法 - Google Patents

Abstract

対象者の炎症を軽減又は緩和するための方法及び組成物であって、治療上有効な量の、配列番号１〜３１に記されたアミノ酸配列をそれぞれ含む１つ以上の単離タンパク質、該タンパク質の生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント又はこれらの組み合わせを対象者に投与することにより炎症を軽減又は緩和することを含む、方法及び組成物が提供される。炎症は、消化管の疾患、例えば慢性胃炎、若しくはクローン病若しくは潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患など、又は呼吸器系の疾患、例えば喘息、気腫、慢性気管支炎及び慢性閉塞性肺疾患などに関連しうる。

Description

本発明は、炎症の予防及び／又は治療を行うための単離タンパク質に関する。より詳しくは、本発明は、炎症の軽減、緩和及び／又は予防を行うための組織メタロプロテアーゼ阻害タンパク質の使用に関する。

炎症は、知覚された傷害又は脅威に応答して免疫系によって仕掛けられる非特異性の反応である。炎症は先天性の防御的な応答であり、より正確に条件を合わせて行われる免疫系の適応的な応答とは区別される。炎症は、発現はより緩徐であるが局所的傷害を引き起こしている場合のある病原体のような有害物をより正確に標的とする免疫系の適応的な応答と、協調的に働くことができる。

感染に関連している一方、炎症は、多くの種類の傷害、例えば物理的な外傷、熱傷（例えば放射線、熱又は腐食性材料によるもの）、化学性刺激物又は微粒子性刺激物、細菌性又はウイルス性の病原体、及び局所酸素欠乏（虚血）などに応答して生じる。炎症は自己免疫性疾患及びアレルギー反応にも関連している。炎症は、発赤、熱感、腫脹、及び疼痛の古典的症状を含み、炎症を起こした器官又は組織の機能低下を伴う場合がある。

炎症を治療するための数多くの方法が知られているが、それらはいずれも、特に広範囲にわたる効力に関しては限界がある。よって、様々な原因に関連した炎症の軽減、緩和及び／又は予防を行うための新たな方法が必要とされている。

本発明は、炎症、及び／又は炎症に関連した疾患又は状態の、治療及び／又は予防を行うための方法及び組成物に関する。
広い形では、本発明は、炎症、及び／又は炎症に関連した疾患又は状態、例えば喘息及び炎症性腸疾患のうち少なくともいずれか一方などの、軽減、緩和及び／又は予防を行うための１つ以上の組織メタロプロテアーゼ阻害物質（ＴＭＰ）タンパク質の使用に関する。

１つの態様では、本発明は、対象者の炎症を軽減又は緩和する方法であって、治療上有効な量の、図１及び／又は図２に記されたアミノ酸配列を含む単離タンパク質、該タンパク質の生物学的に活性なフラグメント、バリアント若しくは誘導体、又はこれらの組み合わせを対象者に投与することにより、対象者の炎症を軽減又は緩和するステップを含む方法を提供する。

好ましくは、単離タンパク質は、配列番号１〜３１のうちいずれか１つに記されたアミニ酸（ａｍｉｎｉ ａｃｉｄ）配列を含む。
１つの実施形態では、この態様は、少なくとも１つの追加の作用薬を対象者に投与するステップをさらに含む。

適切には、上記の実施形態によれば、少なくとも１つの追加の作用薬は、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、アミノサリチラート、コルチコステロイド、免疫抑制薬、サイトカイン／サイトカインレセプター阻害薬（例えばＴＮＦα阻害薬、ＩＬ‐５阻害薬、ＩＬ‐１３阻害薬、ＩＬ‐１７阻害薬、及びＩＬ‐６Ｒ阻害薬）、抗生物質、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、炎症は、対象者における疾患、障害及び／又は状態、特に免疫学的な疾患、障害及び／又は状態に、関連しているか又は続発するものである。
ある実施形態では、疾患は消化管又は呼吸器系の疾患である。

別の実施形態では、疾患、障害及び／又は状態は基準療法（ｂａｓｅｌｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）に対して抵抗性である。
適切には、上記の実施形態によれば、基準療法は、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、アミノサリチラート、コルチコステロイド、免疫抑制薬、サイトカイン／サイトカインレセプター阻害薬（例えばＴＮＦα阻害薬、ＩＬ‐５阻害薬、ＩＬ‐１３阻害薬、ＩＬ‐１７阻害薬、及びＩＬ‐６Ｒ阻害薬）、抗生物質、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの基準作用薬の投与を含む。

別の態様では、本発明は、対象者の炎症を予防する方法であって、治療上有効な量の、配列番号１〜３１のうちいずれか１つに記されたアミノ酸配列を含む単離タンパク質、該タンパク質の生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント、又はこれらの組み合わせを対象者に投与することにより、対象者の炎症を軽減又は緩和するステップを含む方法を提供する。

１つの実施形態では、この態様は、少なくとも１つの追加の作用薬を対象者に投与するステップをさらに含む。
好ましくは、対象者は哺乳動物である。

より好ましくは、対象者はヒトである。
本発明のさらなる態様は、治療上有効な量の、図１及び／又は図２に記されたアミノ酸配列を含む単離タンパク質、該タンパク質の生物学的に活性なフラグメント、バリアント若しくは誘導体、又はこれらの組み合わせを、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と共に含む医薬組成物を提供する。

好ましくは、単離タンパク質は配列番号１〜３１のうちいずれか１つに記されたアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は少なくとも１つの追加の作用薬をさらに含むことができる。

少なくとも１つの追加の作用薬は、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、アミノサリチラート、コルチコステロイド、免疫抑制薬、サイトカイン／サイトカインレセプター阻害薬（例えばＴＮＦα阻害薬、ＩＬ‐５阻害薬、ＩＬ‐１３阻害薬、ＩＬ‐１７阻害薬、及びＩＬ‐６Ｒ阻害薬）、抗生物質、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択されうる。

適切には、医薬組成物は、炎症の予防又は治療を行うためのもの、及び／又は、炎症に関連した疾患又は状態の予防又は治療のためのものである。
本発明の関連する態様には、配列番号１〜３１のような、図１及び２に記されたアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメントを含む単離タンパク質；該単離タンパク質をコードする単離核酸；該単離核酸を含む遺伝子構築物；並びに／又は該遺伝子構築物を含む宿主細胞が含まれる。

本明細書全体にわたって、文脈上そうでないことが求められないかぎり、単語「〜を含む」及び「〜を含み」は、明示された整数又は整数群を含むが任意の他の整数又は整数群を排除するものではないことを意味することが理解されよう。

本明細書中で使用されるように、不定冠詞「１つの」は１個の実体を指す場合もあれば複数の実体（例えばタンパク質）を指す場合もあり、単一の実体に限定されるものと解釈又は理解されてはならない。

配列番号１〜６と称するアミノ酸配列。 配列番号７〜１２と称するアミノ酸配列。 配列番号１３〜１８と称するアミノ酸配列。 配列番号１９〜２６と称するアミノ酸配列。 配列番号２７〜３１と称するアミノ酸配列。 配列番号３２〜３３と称するアミノ酸配列。 図２−２、２−３と共に、二次構造の予測に基づいた組織メタロプロテアーゼ阻害物質（ＴＩＭＰ）のアミノ酸配列アライメント。ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）のＴＩＭＰ‐１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿０１０３９２．１）、ＴＩＭＰ‐２（ＮＰ＿００３２４６．１）、ＴＩＭＰ‐３（Ｐ３５６２５．２）、ＴＩＭＰ‐４（Ｑ９９７２７．１）、イエイヌ（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）のＴＩＭＰ‐２（ＡＦ１１２１１５．１）、セキショクヤケイ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）のＴＩＭＰ‐２（ＡＡＢ６９１６８．１）、アナウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）のＴＩＭＰ‐２（ＡＡＢ３５９２０．１）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）のＴＩＭＰ‐１（Ｐ１２０３２．２）、ＴＩＭＰ‐２（Ｐ２５７８５．２）、ＴＩＭＰ‐３（Ｐ３９８７６．１）、ＴＩＭＰ‐４（Ｑ９ＪＨＢ３．１）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のＴＩＭＰ（ＡＡＬ３９３５６．１）、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）のＣＲＩ‐２（Ｋ０７Ｃ１１．５）、イヌ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｃａｎｉｎｕｍ）のＴＭＰ‐１（ＡＦ３７２６５１．１）、ＴＭＰ‐２（ＥＵ５２３６９６．１）、十二指腸鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）のＴＩＭＰ‐１（ＡＢＰ８８１３１．１）、アメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）（ＮＥＣＡＭＥ＿１３１６８、ＮＥＣＡＭＥ＿０７１９１、ＮＥＣＡＭＥ＿０１０６３、ＮＥＣＡＭＥ＿０５３５６、ＮＥＣＡＭＥ＿０５３５７、ＮＥＣＡＭＥ＿１４６６４、ＮＥＣＡＭＥ＿０８４５７及びＮＥＣＡＭＥ＿０８４５８）、シジョウハイチュウ（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ ｆｉｌａｒｉａ）（１４９５３５６．２；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇａｓｓｅｒｌａｂ．ｏｒｇ）、豚腸結節虫（Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ ｄｅｎｔａｔｕｍ）（Ｅ５９ＴＥＪＭ０１ＢＵ９９Ｓ及びＥ５９ＴＥＪＭ０２ＧＲＴＫＷ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇａｓｓｅｒｌａｂ．ｏｒｇ）、豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｓｕｕｍ）（ＧＳ＿２１７３２、ＧＳ＿０４７９６、ＧＳ＿０８１９９；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｏｒｍｂａｓｅ．ｏｒｇ）、ビルハルツ住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ）Ａ＿０１７２７、マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）Ｓｍｐ＿０８７６９０及び日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）Ｓｊｐ＿００５３０５０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｄｂ．ｏｒｇ）。セイロン鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｃｅｙｌａｎｉｃｕｍ）のＡｃｅＥＳ‐２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｑ６Ｒ７Ｎ７）も含まれる。 図２−１、２−３と共に、二次構造の予測に基づいた組織メタロプロテアーゼ阻害物質（ＴＩＭＰ）のアミノ酸配列アライメント。ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）のＴＩＭＰ‐１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿０１０３９２．１）、ＴＩＭＰ‐２（ＮＰ＿００３２４６．１）、ＴＩＭＰ‐３（Ｐ３５６２５．２）、ＴＩＭＰ‐４（Ｑ９９７２７．１）、イエイヌ（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）のＴＩＭＰ‐２（ＡＦ１１２１１５．１）、セキショクヤケイ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）のＴＩＭＰ‐２（ＡＡＢ６９１６８．１）、アナウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）のＴＩＭＰ‐２（ＡＡＢ３５９２０．１）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）のＴＩＭＰ‐１（Ｐ１２０３２．２）、ＴＩＭＰ‐２（Ｐ２５７８５．２）、ＴＩＭＰ‐３（Ｐ３９８７６．１）、ＴＩＭＰ‐４（Ｑ９ＪＨＢ３．１）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のＴＩＭＰ（ＡＡＬ３９３５６．１）、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）のＣＲＩ‐２（Ｋ０７Ｃ１１．５）、イヌ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｃａｎｉｎｕｍ）のＴＭＰ‐１（ＡＦ３７２６５１．１）、ＴＭＰ‐２（ＥＵ５２３６９６．１）、十二指腸鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）のＴＩＭＰ‐１（ＡＢＰ８８１３１．１）、アメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）（ＮＥＣＡＭＥ＿１３１６８、ＮＥＣＡＭＥ＿０７１９１、ＮＥＣＡＭＥ＿０１０６３、ＮＥＣＡＭＥ＿０５３５６、ＮＥＣＡＭＥ＿０５３５７、ＮＥＣＡＭＥ＿１４６６４、ＮＥＣＡＭＥ＿０８４５７及びＮＥＣＡＭＥ＿０８４５８）、シジョウハイチュウ（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ ｆｉｌａｒｉａ）（１４９５３５６．２；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇａｓｓｅｒｌａｂ．ｏｒｇ）、豚腸結節虫（Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ ｄｅｎｔａｔｕｍ）（Ｅ５９ＴＥＪＭ０１ＢＵ９９Ｓ及びＥ５９ＴＥＪＭ０２ＧＲＴＫＷ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇａｓｓｅｒｌａｂ．ｏｒｇ）、豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｓｕｕｍ）（ＧＳ＿２１７３２、ＧＳ＿０４７９６、ＧＳ＿０８１９９；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｏｒｍｂａｓｅ．ｏｒｇ）、ビルハルツ住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ）Ａ＿０１７２７、マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）Ｓｍｐ＿０８７６９０及び日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）Ｓｊｐ＿００５３０５０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｄｂ．ｏｒｇ）。セイロン鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｃｅｙｌａｎｉｃｕｍ）のＡｃｅＥＳ‐２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｑ６Ｒ７Ｎ７）も含まれる。 図２−１、２−２と共に、二次構造の予測に基づいた組織メタロプロテアーゼ阻害物質（ＴＩＭＰ）のアミノ酸配列アライメント。ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）のＴＩＭＰ‐１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿０１０３９２．１）、ＴＩＭＰ‐２（ＮＰ＿００３２４６．１）、ＴＩＭＰ‐３（Ｐ３５６２５．２）、ＴＩＭＰ‐４（Ｑ９９７２７．１）、イエイヌ（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）のＴＩＭＰ‐２（ＡＦ１１２１１５．１）、セキショクヤケイ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）のＴＩＭＰ‐２（ＡＡＢ６９１６８．１）、アナウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）のＴＩＭＰ‐２（ＡＡＢ３５９２０．１）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）のＴＩＭＰ‐１（Ｐ１２０３２．２）、ＴＩＭＰ‐２（Ｐ２５７８５．２）、ＴＩＭＰ‐３（Ｐ３９８７６．１）、ＴＩＭＰ‐４（Ｑ９ＪＨＢ３．１）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のＴＩＭＰ（ＡＡＬ３９３５６．１）、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）のＣＲＩ‐２（Ｋ０７Ｃ１１．５）、イヌ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｃａｎｉｎｕｍ）のＴＭＰ‐１（ＡＦ３７２６５１．１）、ＴＭＰ‐２（ＥＵ５２３６９６．１）、十二指腸鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）のＴＩＭＰ‐１（ＡＢＰ８８１３１．１）、アメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）（ＮＥＣＡＭＥ＿１３１６８、ＮＥＣＡＭＥ＿０７１９１、ＮＥＣＡＭＥ＿０１０６３、ＮＥＣＡＭＥ＿０５３５６、ＮＥＣＡＭＥ＿０５３５７、ＮＥＣＡＭＥ＿１４６６４、ＮＥＣＡＭＥ＿０８４５７及びＮＥＣＡＭＥ＿０８４５８）、シジョウハイチュウ（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ ｆｉｌａｒｉａ）（１４９５３５６．２；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇａｓｓｅｒｌａｂ．ｏｒｇ）、豚腸結節虫（Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ ｄｅｎｔａｔｕｍ）（Ｅ５９ＴＥＪＭ０１ＢＵ９９Ｓ及びＥ５９ＴＥＪＭ０２ＧＲＴＫＷ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇａｓｓｅｒｌａｂ．ｏｒｇ）、豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｓｕｕｍ）（ＧＳ＿２１７３２、ＧＳ＿０４７９６、ＧＳ＿０８１９９；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｏｒｍｂａｓｅ．ｏｒｇ）、ビルハルツ住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ）Ａ＿０１７２７、マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）Ｓｍｐ＿０８７６９０及び日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）Ｓｊｐ＿００５３０５０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｄｂ．ｏｒｇ）。セイロン鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｃｅｙｌａｎｉｃｕｍ）のＡｃｅＥＳ‐２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｑ６Ｒ７Ｎ７）も含まれる。 ４個のネトリンドメイン含有タンパク質の構造比較。Ａｃ‐ＴＭＰ‐２（Ｈｓ‐ＴＩＭＰ‐２を基にしたホモロジーモデル）、Ｈｓ‐ＴＩＭＰ‐２（ＰＤＢ登録コード１ｂｒ９）、ＡｃｅＥＳ‐２（ＰＤＢ登録コード３ｎｓｗ）、及びＳｈ‐ＴＩＭＰ（Ａ＿０１７２７；Ｈｓ‐ＴＩＭＰ‐２を基にしたホモロジーモデル）のネトリンドメインは青色に着色され、システイン側鎖残基は黄色のスティックとして表されている。赤色の強調されたエリアはＭＭＰとの相互作用の領域を示す。これらの領域は、図２のアライメントに基づいてＡｃ‐ＴＭＰ‐２、ＡｃｅＥＳ‐２及びＳｈ‐ＴＩＭＰについて推測されている。寄生生物のタンパク質であるＡｃ‐ＴＭＰ‐２及びＳｈ‐ＴＩＭＰ並びにヒトのＨｓ‐ＴＩＭＰ‐２は、同じドメイン内ジスルフィド結合パターンを共有している。対して、ＡｃｅＥＳ‐２は２つの分子内ジスルフィド結合を備えた異なるパターンを有している。Ｎ末端のシステインを係合しているジスルフィド結合（Ｃｙｓ３‐Ｃｙｓ６２）は、Ａｃ‐ＴＭＰ‐２、Ｓｈ‐ＴＩＭＰ及びＨｓ‐ＴＩＭＰ‐２に見出されるものを思わせる。他方のジスルフィド結合（Ｃｙｓ７７‐Ｃｙｓ８４）はＡｃｅＥＳ‐２に特有である。Ｈｓ‐ＴＩＭＰ‐２のＣ末端ドメインは赤紫色で表されている。Ａｃ‐ＴＭＰ‐２及びＳｈ‐ＴＩＭＰのＣ末端ドメインは単に例証のために灰色で示されており、これらのドメインの三次元構造はコンピュータ計算上又は実験上のいずれの証拠にも基づいていない。比較によるモデル化は、図２に示された構造に基づく配列アライメントに基づいてＭＯＤＥＬＬＥＲ［５９］を使用して実施された。 ベイズ推定に基づいた組織メタロプロテアーゼ阻害物質（ＴＩＭＰ）の系統発生学的関係。各クレードを裏付ける事後確率が示されている。ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）のＴＩＭＰ‐１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿０１０３９２．１）、ＴＩＭＰ‐２（ＮＰ＿００３２４６．１）、ＴＩＭＰ‐３（Ｐ３５６２５．２）、ＴＩＭＰ‐４（Ｑ９９７２７．１）、セキショクヤケイ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）のＴＩＭＰ‐２（ＡＡＢ６９１６８．１）、イエイヌ（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）のＴＩＭＰ‐２（ＡＦ１１２１１５．１）、アナウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）のＴＩＭＰ‐２（ＡＡＢ３５９２０．１）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のＴＩＭＰ（ＡＡＬ３９３５６．１）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）のＴＩＭＰ‐１（Ｐ１２０３２．２）、ＴＩＭＰ‐２（Ｐ２５７８５．２）、ＴＩＭＰ‐３（Ｐ３９８７６．１）、ＴＩＭＰ‐４（Ｑ９ＪＨＢ３．１）、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）のＣＲＩ‐２（Ｋ０７Ｃ１１．５）、イヌ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｃａｎｉｎｕｍ）のＴＭＰ‐１（ＡＦ３７２６５１．１）、ＴＭＰ‐２（ＥＵ５２３６９６．１）、十二指腸鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）のＴＩＭＰ‐１（ＡＢＰ８８１３１．１）、アメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）（ＮＥＣＡＭＥ＿１３１６８、ＮＥＣＡＭＥ＿０７１９１、ＮＥＣＡＭＥ＿０１０６３、ＮＥＣＡＭＥ＿０５３５６、ＮＥＣＡＭＥ＿０５３５７、ＮＥＣＡＭＥ＿１４６６４、ＮＥＣＡＭＥ＿０８４５７及びＮＥＣＡＭＥ＿０８４５８）、シジョウハイチュウ（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ ｆｉｌａｒｉａ）（１４９５３５６．２；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇａｓｓｅｒｌａｂ．ｏｒｇ）、豚腸結節虫（Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ ｄｅｎｔａｔｕｍ）（Ｅ５９ＴＥＪＭ０１ＢＵ９９Ｓ及びＥ５９ＴＥＪＭ０２ＧＲＴＫＷ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇａｓｓｅｒｌａｂ．ｏｒｇ）、 並びに豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｓｕｕｍ）（ＧＳ＿２１７３２、ＧＳ＿０４７９６、ＧＳ＿０８１９９；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｏｒｍｂａｓｅ．ｏｒｇ）。

詳細な説明
本発明は、炎症及び／又は炎症性の疾患又は状態、例えば喘息及び／又は炎症性腸疾患などの、軽減、緩和及び／又は予防を行うための方法に関する。

本発明は、少なくとも部分的には、配列番号１〜３１などの、図１及び２に記されたアミノ酸配列を含む１つ以上の組織メタロプロテアーゼ阻害タンパク質（ＴＭＰ）が、対象者の炎症及び／又は炎症性の疾患又は状態の、軽減、緩和及び／又は予防を行うのに有用となりうるという予期せぬ発見に基づいている。

配列番号１〜３１などの、図１及び２のタンパク質は、ヒト、イヌ及びマウスなどの哺乳動物、ニワトリなどの鳥類、昆虫、ワーム並びに原生動物を含めた複数の異なる動物門、綱、目、属及び／又は種のいずれからも得ることができる。

特定の態様では、本発明は、配列番号１〜３１などの、図１及び／又は２に記されたアミノ酸配列をそれぞれ含む１つ以上の単離タンパク質、又は該タンパク質の生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント又はこれらの組み合わせの、炎症及び／又は炎症性の疾患又は状態の軽減、緩和及び／又は予防を行うための使用を企図している。

配列番号１〜３１などの、図１及び２に記されたそれぞれのアミノ酸配列を含む単離タンパク質は、組織メタロプロテアーゼ阻害物質又は「ＴＭＰ」若しくは「ＴＩＭＰ」タンパク質と総称されうるが、この１つ以上の単離タンパク質は必ずしもこの特定の生物学的活性を有するものではないと理解されるべきである。更に、１つ以上のタンパク質がこの生物学的活性を有していても、それは必ずしも該単離タンパク質の抗炎症特性にとって不可欠でも必要でもない。

１つの態様では、本発明は、対象者の炎症を軽減又は緩和する方法であって、治療上有効な量の、配列番号１〜３１などの、図１及び／又は２に記されたアミノ酸配列をそれぞれ含む１つ以上の単離タンパク質、又は該タンパク質の生物学的に活性なフラグメント、誘導体若しくはバリアント、又はこれらの組み合わせを対象者に投与することにより、対象者の炎症を軽減又は緩和するステップを含む方法を提供する。

別の態様では、本発明は、対象者の炎症を予防する方法であって、治療上有効な量の、配列番号１〜３１などの、図１及び２のうち少なくともいずれか一方に記されたアミノ酸配列をそれぞれ含む１つ以上の単離タンパク質、又は該タンパク質の生物学的に活性なフラグメント、誘導体若しくはバリアント、又はこれらの組み合わせを対象者に投与することにより、対象者の炎症を予防するステップを含む方法を提供する。

対象者の炎症を軽減する場合のように、「軽減する」によって意味されるのは、炎症に関連した症状、様相、若しくは特徴（例えば発赤、熱感、腫脹、及び／又は疼痛）を、又は対象者が炎症に関連した症状、様相、若しくは特徴を経験する時間の長さを、弱めるか又は短縮させることである。そのような軽減は、対象者に有益となるように絶対的なものである必要はない。対象者の炎症を緩和する場合のように、「緩和する」によって意味されるのは、炎症に関連した症状、様相、又は特徴（例えば発赤、熱感、腫脹、及び／又は疼痛）の重症度又は重篤度の軽減である。そのような緩和は、対象者に有益となるように絶対的なものである必要はない。対象者の炎症の軽減及び／又は緩和は、定性的及び定量的いずれの方法及び基準も含む、当業者に既知の任意の方法又は基準を使用して決定可能である。

対象者の炎症の軽減又は緩和とは対象者の炎症を治療する方法である、ということは理解されるべきである。本明細書中で使用されるように、「治療する」（又は「治療」）は、炎症の兆候又は症状を該兆候又は症状が生じ始めた後に改善する治療的介入を指す。用語「改善する」は、炎症に関しては、治療の任意の観察可能な有益な効果を指す。有益な効果は、当業者に既知の任意の方法又は基準を使用して決定可能である。

本明細書中で使用されるように、「予防する」（又は「予防」）とは、炎症の症状、様相、又は特徴を予防又は軽減するために、その症状、様相、又は特徴の発症に先立って開始される一連の行為を指す。そのような予防は、対象者に有益となるように絶対的なものである必要はない、ということは理解されるべきである。「予防的な」治療とは、炎症の兆候を示していないか、又は初期の兆候のみを示す対象者に、炎症の症状、様相、又は特徴を生じるリスクを減少させる目的で施用される治療である。

本明細書中で使用されるように、「炎症」とは様々な種類の傷害又は感染に対する良く知られた局所的な応答であって、発赤、熱感、腫脹、及び疼痛を特徴とし、さらには機能不全又は運動性低下を含んでいる場合の多い、応答を指す。炎症は、感染を阻止して初期病巣からの感染の広がりを予防するための初期の防御機構に相当する。炎症における主要な事象には、血流を増加させる毛細血管の拡張、微小血管系構造の変化、血液循環からの血漿並びにタンパク質及び白血球の逸脱の発生、並びに、白血球の毛細血管からの遊出及び傷害又は感染の部位における蓄積、が挙げられる。

炎症は多くの場合、対象者の疾患、障害及び／又は状態、例えば免疫学的な疾患、障害及び／又は状態（例えば自己免疫性の疾患、障害及び／又は状態など）並びにアレルギー反応に、関連しているか、又は続発する。例示的な免疫学的な疾患、障害及び／又は状態には、限定するものではないが、アジソン病、強直性脊椎炎、セリアック病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多巣性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、クローン病、脱髄性ニューロパチー、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン‐バレー症候群、橋本脳症、橋本甲状腺炎、低ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、インスリン依存型糖尿病（１型）、若年性関節炎、川崎症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋梗塞後症候群、原発性胆汁性肝硬変症、乾癬、特発性肺線維症、ライター症候群、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、潰瘍性大腸炎、血管炎、白斑、及びウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。

当業者には理解されるように、消化管の疾患（例えば慢性胃炎又は炎症性腸疾患、例えばクローン病若しくは潰瘍性大腸炎など）並びに呼吸器系の疾患（例えば喘息、気腫、慢性気管支炎、及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））は炎症性要素を有しており、よって開示された方法を使用する治療に特に適している。

１つの実施形態では、本発明は対象者の炎症性腸疾患の治療及び／又は予防を行う方法を提供する。１つの実施形態では、炎症性腸疾患はクローン病又は潰瘍性大腸炎である。
別の実施形態では、本発明は対象者の喘息の治療及び／又は予防を行う方法を提供する。

同様に当業者には理解されるように、対象者の疾患、障害及び／又は状態に関連しているか又は続発する炎症は、該疾患、障害及び／又は状態が、基準療法、例えば、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、アミノサリチラート、コルチコステロイド、免疫抑制薬、サイトカイン／サイトカインレセプター阻害薬（例えばＴＮＦα阻害薬、ＩＬ‐５阻害薬、ＩＬ‐１３阻害薬、ＩＬ‐１７阻害薬、及びＩＬ‐６Ｒ阻害薬）、抗生物質、並びにこれらの組み合わせを含む基準療法に抵抗性であるときに生じることが多い。「抵抗性である」によって、治療、特に第１選択の治療に対する耐性が意図される。

用語「対象者」はヒト対象者及び動物対象の両方を含んでいる。例えば、対象者への投与とは、ヒト対象者又は動物対象への投与を含むことができる。好ましくは、対象者はヒトである。しかしながら、本発明による治療的用途は、哺乳動物、例えば飼育動物及びコンパニオンアニマル、馬のような興行用動物、家畜、並びに実験動物などにも適用可能となりうる。

「投与」によって意図されるのは、選ばれた経路による対象者への組成物（例えば、配列番号１〜３１などの、図１及び／又は２に記されたアミノ酸配列をそれぞれ含む１つ以上の単離タンパク質、又は該タンパク質の生物学的に活性なフラグメント、誘導体若しくはバリアント、又はこれらの組み合わせを含むことにより対象者の炎症を軽減又は緩和するための医薬組成物）の導入である。

用語「治療上有効な量」とは、特定の作用薬を用いた治療を受けている対象者において所望の効果を達成するのに十分な、その作用薬の量について述べている。例えば、これは、炎症の軽減、緩和及び／又は予防を行うのに必要な、配列番号１〜３１などの、図１及び／又は２に記されたアミノ酸配列をそれぞれ含む１つ以上の単離タンパク質、又は該タンパク質の生物学的に活性なフラグメント、誘導体若しくはバリアント、又はこれらの組み合わせを含む組成物の量であることが可能である。いくつかの実施形態では、「治療上有効な量」は、炎症の症状を軽減又は除去するのに十分である。他の実施形態では、「治療上有効な量」は、所望の生物学的効果を達成するのに十分な量、例えば、炎症に関連した発赤、熱感、腫脹及び／又は疼痛を減少させるのに有効な量である。

理想的には、作用薬の治療上有効な量とは、対象者において実質的な細胞傷害効果を引き起こさずに所望の結果を導くのに十分な量である。炎症の軽減、緩和及び／又は予防を行うために有用な、作用薬、例えば配列番号１〜３１などの、図１及び／又は２に記されたアミノ酸配列をそれぞれ含む１つ以上の単離タンパク質、又は該タンパク質の生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント、又はこれらの組み合わせの有効な量は、治療を受けている対象者、あらゆる関連する疾患、障害及び／又は状態の種類及び重症度、並びに治療用組成物の投与の方式に応じて変化することになろう。

配列番号１〜３１などの、図１及び／又は２に記されたアミノ酸配列をそれぞれ含む１つ以上の単離タンパク質、又は該タンパク質の生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント、又はこれらの組み合わせを含む、治療上有効な量の組成物は、一連の治療の間に、単回投薬で投与されてもよいし、又は数回の投薬で、例えば毎日、投与されてもよい。しかしながら、投与の頻度は、施用される調製物、治療を受けている対象者、炎症の重症度、及び治療法又は組成物の適用方式に依存する。

本発明に関しては、「単離（された）」によって意味されるのは、その天然の状態から取り出されたか又は他の方法で人為操作に供された物質である。単離された物質は、その天然の状態においては該物質に通常伴っている構成要素をほぼ含まないか若しくは本質的に含まない場合もあれば、その天然の状態においては該物質に通常伴っている構成要素と一緒に人工的な状態にあるように操作される場合もある。単離された物質には、天然型及び組換え型の物質が含まれる。用語「単離（された）」はさらに、「富化（された）」、「精製（された）」及び／又は「合成（の）」などの用語も包含する。合成には組換え合成及び化学的合成が含まれる。

本明細書中で使用されるように、「フラグメント」とは、配列番号１〜３１などの、図１及び２に記されたタンパク質のうちいずれか１つの、６、１０、１２、１５、２０、３０、４０、５０ ６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０又は１９０個以下の連続したアミノ酸を含む単離タンパク質のドメイン、部分、領域又は部分配列を述べている。

１つの特定の実施形態では、フラグメントは、配列番号１〜３１などの、図１及び／又は２に記されたアミノ酸配列を含む単離タンパク質の、Ｎ末端のドメイン、部分、部分配列若しくは領域であるか、又は前記ドメイン、部分、部分配列若しくは領域に相当する。適切には、１つ又は複数の、Ｎ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸は、抗炎症活性をほとんど損なうことなく欠失させることができる。例えば、短縮型のポリペプチド又はタンパク質は、完全長又は野生型のタンパク質又はポリペプチドに通常は存在する少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５若しくは１００個又はそれ以上のＮ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸を、欠いていてもよい。

１つの実施形態では、１つ以上のＮ末端アミノ酸が欠失しているか又は存在しなくてもよい。いくつかの実施形態では、Ｎ末端アミノ酸は、欠失可能であるか、又は異種のシグナルペプチドのアミノ酸配列に（例えば酵母での発現などのために）置き換えられることが可能な、シグナルペプチドのアミノ酸である。例えば、短縮型のポリペプチド又はタンパク質は、ＴＭＰタンパク質中に通常存在する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個又はそれ以上のＮ末端アミノ酸を欠いていてもよい。

適切には、短縮型のポリペプチド又はタンパク質は、Ｎ末端又はＮ末端付近にアミノ酸配列Ｃ‐Ｘ‐Ｃを含む。この点に関して「Ｎ末端付近」とは、Ｎ末端、又はＮ末端から約１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸以内であることを意味している。

いかなる特定の理論によっても束縛されるのは望まないが、Ｎ末端又はＮ末端付近のＣ‐Ｘ‐Ｃモチーフが保持されてＭＭＰ活性部位クレフトへの挿入とその後の触媒活性の阻害が可能である限り、Ｃ末端アミノ酸が、特に野生型のＴＭＰ２から、単独で、又はいくつかのＮ末端アミノ酸と一緒に、欠失されうることが提唱されている。

配列番号１〜３１などの、図１及び２のタンパク質は組織メタロプロテアーゼ阻害物質と呼ばれうるが、そのようなタンパク質が必ずしもこの特定の生物学的活性を所有しているわけではないことは理解されるべきである。更に、該タンパク質のうちの任意のもの又は全てがこの生物学的活性を有していても、それは該タンパク質の抗炎症特性にとって必ずしも不可欠又は必要ということではない。

好ましくは、フラグメントは「生物学的に活性なフラグメント」である。いくつかの実施形態では、生物学的に活性なフラグメントは、単離タンパク質の抗炎症活性の１０％以上、好ましくは２５％以上、より好ましくは５０％以上、かつさらにより好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％以上を有している。そのような活性は、そのような活性を同定するのに一般に有用であると当業者が認識可能な、標準的な試験方法及びバイオアッセイを使用して評価されうる。

いくつかの実施形態では、単離タンパク質は、生物学的に活性なフラグメントを含めて複数の同一又は異なるフラグメントを含むことができる。
さらに、配列番号１〜３１などの、図１及び／又は２に記されたアミノ酸配列を含む単離タンパク質のうち任意のもののバリアントも企図される。

典型的には、タンパク質に関して、「バリアント」タンパク質は、異なるアミノ酸に置き換わっている１つ以上のアミノ酸を有する。いくつかのアミノ酸は、そのタンパク質の活性の性質を変化させることなく概ね類似の特性を備えた他のアミノ酸に変更可能であること（すなわち保存的置換）は、当分野において良く理解されている。

さらに、（〜の）１つ以上のアミノ酸残基は、単離タンパク質又はそのフラグメントの機能的活性及び／又は生物学的活性をほとんど変更することなく、改変若しくは欠失、又は付加配列の追加がなされうることも認められるであろう。そのような活性は、そのような活性を同定するのに一般に有用であると当業者が認識可能な、標準的な試験方法及びバイオアッセイを使用して評価されうる。

用語「バリアント」には、配列番号１〜３１に記されたアミノ酸配列を含む単離タンパク質のペプチドミメティック及びオーソログが含まれる。「ペプチドミメティック」によって意味されるのは、天然型の親ペプチドの生物学的作用を模倣するか又は該作用に拮抗することが可能な、非ペプチド性の構造要素を含有している分子である。ペプチドミメティックの例には、ペプチドの主鎖が１つ以上のベンゾジアゼピン分子に置換されているペプチド性化合物（例えば、ジェームズ（Ｊａｍｅｓ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９３年、第２６０巻、ｐ．１９３７−４２を参照）及び「レトロインベルソ型（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）」ペプチド（例えば米国特許第４，５２２，７５２号明細書を参照）が挙げられる。該用語はさらに、天然に存在するアミノ酸以外の構成部分であって、タンパク質の機能にあまり不利な妨げを為すことなく該タンパク質中の特定のアミノ酸の代用物として立体配座上かつ機能上の役割を果たす構成部分も指す。アミノ酸ミメティックの例にはＤ‐アミノ酸が挙げられる。１つ以上のＤ‐アミノ酸を用いて置換されたタンパク質は、良く知られたペプチド合成手法を使用して作製されうる。さらなる置換物には、官能基を備えたバリアント側鎖を有するアミノ酸類似体、例えば、ｂ‐シアノアラニン、カナバニン、ジェンコール酸、ノルロイシン、３‐ホスホセリン、ホモセリン、ジヒドロキシフェニルアラニン、５‐ヒドロキシトリプトファン、１‐メチルヒスチジン、及び３‐メチルヒスチジンなどが挙げられる。

（〜の）「オーソログ」によって意味されるのは、配列番号１〜３１などの、図１及び２のタンパク質の入手元又は誘導元である同一又は異なる生物体に由来する、構造上の関係を有するタンパク質である。

１つの実施形態では、タンパク質のバリアント又はオーソログは、配列番号１〜３１などの、図１及び２に記されたアミノ酸配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、８０％若しくは８５％、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を共有する。

好ましくは、配列同一性は、配列番号１〜３１に記されたアミノ酸配列からなる参照配列の少なくとも６０％にわたって、より好ましくは少なくとも７５％にわたって、より好ましくは少なくとも９０％にわたって、又はより好ましくは少なくとも９５％、９８％、又は実質的に全長にわたって、測定される。

配列同一性（％）を決定するためには、アミノ酸及び／又はヌクレオチドの配列の最適なアライメントが、アルゴリズム（インテリジェネティクス（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）によるＧｅｎｅｗｏｒｋｓプログラム；ウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェア・パッケージ・リリース（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ）７．０のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、米国ウィスコンシン州のジェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ））のコンピュータによる遂行によって、又は検査及び選択された様々な方法のうち任意のものによって生成された最良のアライメント（すなわち比較ウィンドウ上の最も高い相同性（％）をもたらすもの）によって、実行されうる。例えばアルツシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、１９９７年、第２５巻、ｐ．３３８９−４０２に開示されているようなＢＬＡＳＴファミリーのプログラムが照会されてもよい。

配列分析の詳細な議論については、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ）」、１９９５−１９９９年、米国ニューヨークのジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ））のユニット１９．３に見出すことが可能である。

本発明によって企図される特定のバリアントの非限定的な例は、グリコシル化部位であるアミノ酸が欠失しているか又は別のアミノ酸に置き換えられている、非グリコシル化バリアントである。配列番号３３を参照すると、アミノ酸配列

は太字のＮ結合型グリコシル化部位を含むが、該部位は非グリコシル化アミノ酸に、例えばグルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）残基に、突然変異していてもよい。同様の突然変異は、配列番号１〜３１のうち１つ以上に組み入れることが可能である。

バリアントタンパク質は当業者に既知の様々な標準的突然変異誘発手法によって生産可能である。突然変異は、単一の遺伝子、遺伝子のブロック又は染色体全体のヌクレオチド配列の改変と、その後の１つ以上の突然変異タンパク質の生産とを伴うことができる。単一の遺伝子における変化は、ＤＮＡ塩基配列内の単一のヌクレオチド塩基の除去、付加又は置換を伴う点突然変異の結果であってもよいし、多数のヌクレオチドの挿入又は欠失を伴う変化の結果であってもよい。

突然変異は化学的又は物理的な突然変異原への曝露に続いて生じる。そのような突然変異誘発要因には、電離放射線、紫外線並びに多種多様な化学的作用薬、例えばアルキル化薬及び多環式芳香族炭化水素などが含まれ、これらは全て、直接的又は間接的に（一般には何らかの代謝性の生体内変化に続いて）核酸と相互作用することができる。そのような環境要因によって誘発されたＤＮＡ損傷は、その損傷を受けたＤＮＡが複製又は修復されるときに塩基配列の改変を、よって突然変異をもたらす場合があり、この突然変異はその後タンパク質レベルで反映される可能性がある。突然変異は、特定の標的設定型の方法の使用を通じて部位指定されることも可能である。

１つ以上の突然変異を含む単離タンパク質の生産に役立つ突然変異誘発手法には、限定するものではないが、ランダム突然変異誘発（例えば、既知のＤＮＡフラグメントの挿入を介した遺伝子の不活性化に基づく挿入突然変異誘発、化学的突然変異誘発、放射線突然変異誘発、エラープローンＰＣＲ（キャドウェル（Ｃａｄｗｅｌｌ）及びジョイス（Ｊｏｙｃｅ）、ＰＣＲ・メソッズ・アンド・アプリケーションズ（ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．）、１９９２年、第２巻、ｐ．２８−３３））、及び部位特異的突然変異誘発（例えば、所望の突然変異のＤＮＡ塩基配列をコードする特異的オリゴヌクレオチドプライマー配列を使用）が挙げられる。部位特異的突然変異誘発のさらなる方法は、米国特許第５，２２０，００７号；同第５，２８４，７６０号：同第５，３５４，６７０号；同第５，３６６，８７８号；同第５，３８９，５１４号；同第５，６３５，３７７号：及び同第５，７８９，１６６号明細書に開示されている。

さらに提供されるのは、単離タンパク質、生物学的に活性なフラグメント及びバリアントの「誘導体」である。そのような誘導体には、化学修飾されたタンパク質（例えばアミノ酸側鎖の修飾）、化学的に架橋されたタンパク質、アビジン、ビオチン及びその他の結合性部分、エピトープタグ及び／又は融合パートナー（例えばＦＬＡＧ、ヘマグルチニン、ｍｙｃタグ、ＧＳＴ又はＭＢＰ、ヘキサヒスチジン融合パートナー）の付加物、標識（例えば放射性標識、蛍光標識）並びに酵素（例えばＨＲＰ、アルカリホスファターゼ）を含むように修飾されたタンパク質が挙げられるがこれらに限定はされない。

単離タンパク質（フラグメント、バリアント及び誘導体を含む）は、当業者に既知の任意の適切な手法によって調製可能である。
１つの実施形態では、単離タンパク質（フラグメント、バリアント及び誘導体を含む）は化学合成によって生産される。化学合成技法は当分野において良く知られているが、当業者は適切な方法論の実例について、コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら編「カレント・プロトコールズ・イン・プロテイン・サイエンス（ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ）」、１９９５−２００１年、米国ニューヨークのジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ） の第１８章を参照してもよい。

別の実施形態では、単離タンパク質（フラグメント、バリアント及び誘導体を含む）は組換えタンパク質として調製される。
したがって本発明の別の態様は、単離タンパク質又はそのフラグメントをコードする単離核酸に関する。

本明細書中で使用されるように、「核酸」は、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを含めた一本鎖若しくは二本鎖のＤＮＡ、又はｍＲＮＡを含めたＲＮＡであってよい。適切には、核酸の発現については（例えば組換え型タンパク質の発現については）、遺伝子構築物は１つ以上の他のヌクレオチド配列に作動可能に連結又は接続された単離核酸を含むことができる。そのようなヌクレオチド配列には、調節ヌクレオチド配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列、スプライス部位、翻訳開始又は終結配列、抗生物質耐性遺伝子及び選択マーカー遺伝子が含まれうるがこれらに限定はされない。プロモーターは、典型的には、発現に使用される宿主細胞、例えば酵母、細菌、昆虫、植物又は哺乳動物の宿主細胞などに応じて選択される。融合パートナー又はエピトープタグ配列、例えばヘキサヒスチジン、ＭＢＰ、ＧＳＴ、ヘマグルチニン、ＦＬＡＧ及びｃ‐ｍｙｃ配列のうち少なくともいずれかなども付加されうる。遺伝子構築物は、該遺伝子構築物を含むように遺伝子組換え又は操作がなされた宿主細胞において、適切に、操作、増殖、及び／又は発現が行われる。そのような宿主細胞には、酵母、細菌、昆虫、植物又は哺乳動物の宿主細胞が挙げられるが、これらに限定はされない。

組換えタンパク質の生産については当分野で良く知られているが、当業者は例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「モレキュラー・クローニング．ラボラトリー・マニュアル（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ））、特に第１６部及び第１７部；オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ）」、１９９５−１９９９年、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）、特に第１０章及び第１６章；並びにコリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら編「カレント・プロトコールズ・イン・プロテイン・サイエンス（ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ）」、１９９５−１９９９年、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、特に第１、５及び６章、に記載されているような標準的プロトコールを参照してもよい。

炎症の軽減、緩和及び／又は予防のための（かつ／又は炎症に関連した疾患、障害及び／又は状態の治療若しくは予防のための）当業者に知られているような１つ以上の追加の作用薬の様々な組み合わせが、治療上有効な量の、配列番号１〜３１によるアミノ酸配列を含む単離タンパク質（又はその生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント）のうちの１つ以上に加えて、投与を必要とする対象者に投与されてもよい。すなわち、炎症の治療及び／又は予防のために伝統的に使用される１つ以上の追加の作用薬が、配列番号１〜３１によるアミノ酸配列を含む治療上有効な量の単離タンパク質（又はその生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント）に加えて対象者に投与されうる。

例えば、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、アミノサリチラート、コルチコステロイド、免疫抑制薬、サイトカイン／サイトカインレセプター阻害薬（例えばＴＮＦα阻害薬、ＩＬ‐５阻害薬、ＩＬ‐１３阻害薬、ＩＬ‐１７阻害薬、及びＩＬ‐６Ｒ阻害薬）特に抗サイトカイン／サイトカインレセプター抗体、抗生物質、並びにこれらの組み合わせが、炎症の軽減、緩和及び／又は予防を行うためのある実施形態において、配列番号１〜３１によるアミノ酸配列を含む１つ以上の単離タンパク質（又はその生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント）とともに投与されることが可能である。

ある実施形態では、１つ以上の追加の作用薬は、例えば配列番号１〜３１によるアミノ酸配列を含むもの等の、図１及び２に記された１つ以上の単離タンパク質（又はその生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント）に対して節約的効果（ｃｏｎｓｅｒｖｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ）を提供する。さらなる実施形態では、配列番号１〜３１によるアミノ酸配列を含む１つ以上の単離タンパク質（又はその生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント）は、１つ以上の追加の作用薬に対して節約的効果を提供する。さらに一層の実施形態では、１つ以上の追加の作用薬は、配列番号１〜３１によるアミノ酸配列を含む１つ以上の単離タンパク質（又はその生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント）の作用に対し補完的な効果を提供し、好ましくは炎症に関連した１つ以上の症状の頻度又は重症度を排除又は低減する（かつ／又は前記症状を予防する）。

当業者には良く知られているように、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＡ）とも呼ばれる非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、鎮痛作用、解熱作用及び抗炎症作用を備えた薬物であり、サリチラート（例えばアスピリン）並びにプロピオン酸誘導体（例えばイブプロフェン及びナプロキセン）が挙げられる。

アミノサリチラートは炎症性腸疾患（特に潰瘍性大腸炎）の治療における使用について当分野で良く知られており、例えば、バルサラジド、メサラジン、オルサラジン、及びスルファサラジンが挙げられる。

当業者には良く知られているように、コルチコステロイドは、副腎により産生されるホルモンであるコルチゾールに非常によく似た薬物である。典型的なコルチコステロイドには、限定するものではないが、コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、及びメチルプレドニゾロンが挙げられる。

免疫抑制薬は、ある種の疾患又は状態に関連した炎症の治療における使用について当分野で良く知られており、例えば、薬物シクロスポリン、アザチオプリン及びミコフェノラートが挙げられる。

当業者には良く知られているように、サイトカイン／サイトカインレセプター阻害薬（例えばＴＮＦα阻害薬、ＩＬ‐５阻害薬、ＩＬ‐１３阻害薬、ＩＬ‐１７阻害薬、及びＩＬ‐６Ｒ阻害薬）には、限定するものではないが、小分子阻害剤及び抗体が挙げられる。

いくつかの実施形態では、配列番号１〜３１によるアミノ酸配列を含む１つ以上の単離タンパク質（又はその生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント）と、１つ以上の追加の作用薬との組み合わせは、炎症の治療及び／又は予防において相乗効果を生む。従って、本発明はさらに、作用薬の治療有効性を、そのような作用薬が使用される何らかの状態（例えば炎症並びに任意の関連する疾患、障害及び／又は状態）の治療の際に増強する方法も含んでいる。

１つの実施形態では、配列番号１〜３１によるアミノ酸配列を含むもの等の、図１及び／又は２の１つ以上の単離タンパク質（又はその生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント）は、１つ以上の追加の作用薬の投与に先立って投与される。別の実施形態では、配列番号１〜３１によるアミノ酸配列を含むもの等の、図１及び／又は２の１つ以上の単離タンパク質（又はその生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント）は、１つ以上の追加の作用薬の投与の後で投与される。なお別の実施形態では、配列番号１〜３１によるアミノ酸配列を含むもの等の、図１及び２の１つ以上の単離タンパク質（又はその生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント）は、１つ以上の追加の作用薬の投与と同時に投与される。さらに別の実施形態では、配列番号１〜３１によるアミノ酸配列を含むもの等の、図１及び／又は２の１つ以上の単離タンパク質（又はその生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント）の投与並びに１つ以上の追加の作用薬の投与（逐次又は同時）は、配列番号１〜３１によるアミノ酸配列を含むもの等の、図１及び／又は２の１つ以上の単離タンパク質（又はその生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント）又は１つ以上の追加の作用薬のいずれか一方を他方の不在下で投与することによる炎症の軽減又は緩和よりも大きな、炎症の軽減又は緩和をもたらす。

配列番号１〜３１によるアミノ酸配列を含むもの等の、図１及び／又は２の１つ以上の単離タンパク質（又はその生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント）並びに１つ以上の追加の作用薬は、当業者によく知られているように、治療用組成物と併せて使用するのに利用可能な任意の従来の方法／経路によって投与可能である。そのような方法には、限定するものではないが、米国特許第６，０９０，７９０号明細書に記載されているような特異的組織部位への極微針注射による投与、米国特許第６，０５４，１２２号明細書に記載されているような炎症の部位に施用される局所用クリーム剤、ローション剤若しくは密封ドレッシング材、又は国際公開第９９／４７０７０号に記載されているような、配列番号１〜３１によるアミノ酸配列を含むもの等の、図１及び／又は２の１つ以上の単離タンパク質（又はその生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント）を放出する移植材料が含まれる。

この点に関しては、配列番号１〜３１によるアミノ酸配列を含むもの等の、図１及び／又は２の１つ以上の単離タンパク質（又はその生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント）と、任意選択で１つ以上の追加の作用薬とを含む組成物は、該組成物を適切に含浸、コーティング又はその他の方法で含む、生体材料、生体高分子、ハイドロキシアパタイト若しくはその誘導体のような無機質材料、外科用移植材料、人工器官、創傷ドレッシング材、圧迫包帯、包帯などと関連付けられて、又はこれらの構成成分として、投与されうる。

適切には、組成物は適当な薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む。
好ましくは、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤は、哺乳動物への、より好ましくはヒトへの投与に適している。

「薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤」によって意味されるのは、全身投与で安全に使用されうる固体又は液体の増量剤、希釈剤又はカプセル封入物質である。特定の投与経路に応じて、当分野で良く知られた様々な担体が使用されうる。これらの担体は、糖質、デンプン、セルロース及びその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、多価アルコール、アルギン酸、リン酸緩衝液、乳化剤、等張生理食塩水並びに塩であって例えば塩酸塩、臭化物及び硫酸塩を含む鉱酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩及びマロン酸塩のような有機酸、並びに発熱性物質除去水、を含む群から選択されうる。

薬学的に許容される担体、希釈剤及び賦形剤について述べている有用な参照文献は、「レミングトンの薬剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」（１９９１年、米国ニュージャージー州のマック・パブリシング・カンパニー（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．））である。

任意の安全な投与経路が、配列番号１〜３１によるアミノ酸配列を含むもの等の、図１及び／又は２の１つ以上の単離タンパク質（又はその生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント）と、任意選択で１つ以上の追加の作用薬とを含む組成物を対象者に提供するために使用されうる。例えば、経口、直腸内、腸管外（非経口）、舌下、口腔内、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、鼻内、眼内、腹腔内、脳室内、経皮などが使用されうる。

剤形には、錠剤、分散液、懸濁液、注射剤、溶液、シロップ剤、トローチ、カプセル剤、坐剤、エアロゾル、経皮用貼付剤などが挙げられる。これらの剤形はさらに、注射用若しくは移植用の制御放出デバイスであってこの目的のために特別に設計されたデバイス、又はこの様式において追加として作用するように改変された他の形態の移植材料も含みうる。配列番号１〜３１によるアミノ酸配列を含むもの等の、図１及び／又は２の１つ以上の単離タンパク質（又はその生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント）、並びに任意選択で１つ以上の追加の作用薬の制御放出は、前記のものを、例えば、アクリル樹脂、ろう、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸及びポリグリコール酸などの疎水性ポリマー、並びにヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなある種のセルロース誘導体でコーティングすることにより達成されうる。加えて、制御放出は、その他のポリマーマトリクス、リポソーム及び／又はミクロスフェアを使用することにより影響される場合もある。

上記組成物は、投薬調合物に適合した方式で、かつ薬学的に有効／治療上有効であるような量で、投与されうる。対象者に投与される用量は、本発明に関しては、適正な時間にわたって対象者において有益な応答（例えば炎症の軽減）を達成するのに十分であるべきである。配列番号１〜３１によるアミノ酸配列を含むもの等の、図１及び／又は２の１つ以上の単離タンパク質（又はその生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント）の投与されるべき量は、治療を受ける対象者の年齢、性別、体重及び一般的健康状態、当分野の通常の技術を有する治療者の判断に応じて変化するであろう要因を含め、治療を受ける対象者によって変化しうる。

本明細書に記載されるような組成物はさらに、ウイルスベクター（例えば、ワクシニア、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス及びレンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス及びサイトメガロウイルスに由来するベクター、のような発現ベクターを含みうる。この関連で、米国特許第５，９２９，０４０号及び同第５，９６２，４２７号明細書に記された方法などによる遺伝子療法も適用可能である。

本発明が容易に理解され、かつ実用的に具体化されうるように、以降の非限定的な実施例が提供される。
実施例
材料及び方法
［配列データ、並びにＴＩＭＰの同定及び生物情報工学的解析］
公的な配列データベース（すなわち全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）；ＥＮＳＥＭＢＬゲノムブラウザ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）；ワームベース（ＷｏｒｍＢａｓｅ）（ｗｗｗ．ｗｏｒｍｂａｓｅ．ｏｒｇ）；ジーンＤＢ（ＧｅｎｅＤＢ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｄｂ．ｏｒｇ／；ｗｗｗ．ｇａｓｓｅｒｌａｂ．ｏｒｇ）［３２〜３４、３９、４０、４２〜４５］から得て本明細書中で解析した配列データには、既知のＴＩＭＰアミノ酸配列であってヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）由来のもの（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿０１０３９２．１、ＮＰ＿００３２４６．１、Ｐ３５６２５．１及びＱ９９７２７．１）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）由来のもの（登録番号Ｐ１２０３２．２、Ｐ２５７８５．２、Ｐ３９８７６．１及びＱ９ＪＨＢ３．１）、イエイヌ（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）由来のもの（ＡＦ１１２１１５．１）、セキショクヤケイ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）由来のもの（ＡＡＢ６９１６８．１）、アナウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）由来のもの（ＡＡＢ３５９２０．１）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）由来のもの（ＡＡＬ３９３５６．１）、イヌ鉤虫（Ａ．ｃａｎｉｎｕｍ）由来のもの（ＡＦ３７２６５１．１及びＥＵ５２３６９８．１）、十二指腸鉤虫（Ａ．ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）（ＡＢＰ８８１３１．１）並びにカエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）由来のもの（ＮＰ＿５０５１１３．１）に加えて、予測ペプチドであって（ｉ）マンソン住血吸虫（Ｓ．ｍａｎｓｏｎｉ）、日本住血吸虫（Ｓ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、ビルハルツ住血吸虫（Ｓ．ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ）（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｄｂ．ｏｒｇ）、豚回虫（Ａ．ｓｕｕｍ）（ｗｗｗ．ｗｏｒｍｂａｓｅ．ｏｒｇ）、旋毛虫（Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／３１６９７９８３３）、マレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ）及びバンクロフト糸状虫（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）（ヒトに寄生するフィラリア線虫）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／；［４６］）、アメリカ鉤虫（Ｎ．ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）（ヒト鉤虫；［３６］）の全ゲノム又はドラフトゲノム配列、並びに（ｉｉ）豚鞭虫（Ｔ．ｓｕｉｓ）、豚腸結節虫（Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ ｄｅｎｔａｔｕｍ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇａｓｓｅｒｌａｂ．ｏｒｇ）、シジョウハイチュウ（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ ｆｉｌａｒｉａ）（ヒツジ肺吸虫；［４７］）並びに肝吸虫（Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、タイ肝吸虫（Ｏ．ｖｉｖｅｒｒｉｎｉ）（ヒトの肝吸虫）、肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ）及び巨大肝蛭（Ｆ．ｇｉｇａｎｔｉｃａ）（それぞれウシ及びシカの肝吸虫）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇａｓｓｅｒｌａｂ．ｏｒｇ）のトランスクリプトーム、から推論されるものが含まれた。

ＢＬＡＳＴｐ［４８］及びＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ［４９］アルゴリズムを、真核生物由来の既知のＴＩＭＰタンパク質［５０］との配列相同性（ｅ値カットオフ：１０〜５）に基づいてゲノム及びトランスクリプトームのデータセット各々の中のＴＩＭＰタンパク質を同定するために使用した。加えて、ソフトウェアｐＳｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｓｃ．ｅｄｕ／ｇｅｎｅｒａｌ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｐｐｇｒｏｕｐｓ／ｐｓｃａｎ．ｈｔｍｌ）を、ＴＩＭＰについて正規表現に基づく特徴的パターンを同定するために使用した（Ｐｒｏｓｉｔｅ：ＰＳ００２８８）。シグナルペプチドも、ニューラルネットワーク及び隠れマルコフモデルの両方を使用するＳｉｇｎａｌＰ ３．０プログラムを用いて予測した［５１］。推定上のＥＳ ＴＩＭＰタンパク質を、シグナルペプチドの存在並びにＳｅｃｒｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｓｐｄ．ｃｂｉ．ｐｋｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ ；［５２］）及びＳｉｇｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｌｉｎｅ．ｂｉｃ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｇ／ｓｐｄｂ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ ；［５３］）にリストされた１つ以上の既知のＥＳタンパク質に対する配列相同性に基づいて同定した。

［二次構造予測及び相同性モデリング］
ＰＳＩＰＲＥＤソフトウェア［５５］を使用して予測した二次構造要素によって導かれたＳＢＡＬ［５４］を用いて、ＴＩＭＰタンパク質の構造に基づいた配列アライメントをコンピュータ計算及び手動編集した。個々の構造に基づいたアミノ酸配列のアライメントを、プログラムＭｒＢａｙｅｓ（ｖ．３．１．２）［５６］を使用したベイズ推定（ＢＩ）により解析し、またプログラムＭＥＧＡ（ｖ．５）［５７］を使用した最大尤度解析（Ｍａｘｉｍｕｍ Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ａｎａｌｙｓｉｓ）及び座位間の速度（ｒａｔｅｓ ａｍｏｎｇ ｓｉｔｅｓ）を均一としたジョーンズ‐テイラー‐ソーントン（Ｊｏｎｅｓ−Ｔａｙｌｏｒ−Ｔｈｏｒｎｔｏｎ）置換モデル（ＪＴＴ＋Ｇ＋Ｉ）により検証した。ＢＩ解析はそれぞれ、１００番目ごとの系統樹を保存しながら、１，０００，０００世代について行い（ｎｇｅｎ＝１，０００，０００）、使用したのは次のパラメータすなわちｒａｔｅｓ＝ｇａｍｍａ、ａａｍｏｄｅｌｐｒ＝ｍｉｘｅｄであり、かつその他のパラメータはデフォルト設定のままであった。系統樹及び枝の長さはパラメータ「ｓｕｍｔ ｂｕｒｎｉｎ＝１０００」を使用して測定され；無根の合意樹が、合意の事後確率を使用して決定されている「ｃｏｎｔｙｐｅ＝ｈａｌｆｃｏｍｐａｔ」の分岐サポート（ｎｏｄａｌ ｓｕｐｐｏｒｔ）を備えて構築され、ソフトウェアＦｉｇＴｒｅｅ（ｈｔｔｐ：／／ｔｒｅｅ．ｂｉｏ．ｅｄ．ａｃ．ｕｋ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｆｉｇｔｒｅｅ／）を使用して表示された。選択されたＴＩＭＰについて、既知の三次元構造とのホモログをタンパク質折り畳み構造認識ソフトウェアｐＧｅｎＴＨＲＥＡＤＥＲ［５８］を使用して同定し、ＭＯＤＥＬＬＥＲ［５９］を使用した比較モデリングのための鋳型として選択した。２０個の独立したモデルを生成し、最も低いエネルギーを備えたモデルを選択し、その幾何構造をＰＲＯＣＨＥＣＫ［６０］を使用して解析し、次いでＰｙＭＯＬ［６１］で視覚的に調べた。

［ＴＩＭＰをコードする遺伝子の転写のレベルの評価］
豚回虫（Ａ．ｓｕｕｍ）の感染型Ｌ３（ｉＬ３；卵子由来）、移行Ｌ３（肝臓及び肺由来）、第４期幼虫（Ｌ４、小腸由来）並びに成虫の雌雄それぞれに由来する筋肉組織及び生殖組織［３４］、アメリカ鉤虫（Ｎ．ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）のｉＬ３及び成虫（雄雌混合）［３６］、並びに、ビルハルツ住血吸虫（Ｓ．ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ）の卵及び雌雄成虫［４０］からの均一化されていないｃＤＮＡライブラリ各々に由来する生の配列リードを、プログラムＳＯＡＰ２［６２］を使用して個々の推定ＴＩＭＰタンパク質をコードする最長のコンティグにマッピングした。簡潔に述べると、生の配列リードを非冗長的なトランスクリプトームデータにアラインして、それぞれの生の配列リードが独自にマッピングされるようにした（すなわち独自の転写物とした）。２つ以上の転写物にマッピングされたリード（「マルチリード」と称される）を、無作為に独自の転写物に割り当て、一度しか記録されないようにした。転写物存在量を相対的に評価するために、各配列にマッピングされた生のリードの数を長さについて正規化した（すなわちｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｒｅａｄｓ、ＲＰＫＭ）［３４、４０、６３］。

結果及び考察
［寄生蠕虫のＴＩＭＰタンパク質］
既知の真核生物のＴＩＭＰに対する高い相同性（ｅ値カットオフ：１０〜５）を備えた合計１５個のタンパク質配列が、寄生蠕虫について利用可能な配列データの相補物から予測され（表１）、よって、寄生生物におけるこのタンパク質ファミリーの将来的な構造及び機能の調査のための確たる情報源に相当するものとなった。本明細書で解析されたＦＡＳＴＡ形式の配列データは、補足ファイル１において入手可能である。ここに含まれたデータセットのうち、アメリカ鉤虫及び豚回虫について利用可能なタンパク質コード遺伝子の相補物は、最多数の予測ＴＩＭＰタンパク質をコードしていた（それぞれｎ＝８及び３；表１参照）。３個のアメリカ鉤虫のＴＩＭＰ（すなわちＮＥＣＡＭＥ＿１３１６８、ＮＥＣＡＭＥ＿０７１９１及びＮＥＣＡＭＥ＿０８４５８；表１参照）並びにすべての豚回虫のＴＩＭＰ（ＧＳ＿２１７３２、ＧＳ＿０４７９６及びＧＳ＿０８１９９；表１参照）がＮ末端シグナルペプチドを含有すると予測され、それぞれイヌ鉤虫のＡｃ‐ＴＭＰ‐１及びＡｃ‐ＴＭＰ‐２並びにセイロン鉤虫由来のネトリンドメインを含有するホモログ（＝排泄・分泌タンパク質２（ｅｘｃｒｅｔｏｒｙ−ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）、ＡｃｅＥＳ‐２）についての以前の観察と一致していた［２５〜２７、６４］。Ａｃ‐ＴＭＰ‐１、Ａｃ‐ＴＭＰ‐２とＡｃｅＥＳ‐２との間の配列の類似にもかかわらず、後者はヒトＭＭＰ阻害活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで示さず、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるこのタンパク質の異なる機能を示唆していた［６４］。しかしながら、注目すべきなのは、チャン（Ｚｈａｎ）らが述べたＡｃ‐ＴＭＰ‐２の部分的なＭＭＰ阻害活性［２６］は、哺乳動物ＭＭＰをそのＴＩＭＰ相当物によって阻害するのに必要な１：１の阻害物質：酵素モル比を十分越えた、膨大な過剰モル濃度の組換えＴＭＰ‐２に基づいたものであるということである［２３］。

さらに、ＴＩＭＰは、ＭＭＰ活性部位クレフトへの挿入とその後の触媒活性の阻害を可能にするためにＮ末端のＣ‐Ｘ‐Ｃモチーフを必要とするように思われ；組換えＡｃ‐ＴＭＰ‐２はプラスミドベクター由来の長いＮ末端伸展部を含有するように遺伝子操作されており、よってさらなる研究をせずに鉤虫のＴＩＭＰに対してＭＭＰ阻害活性をはっきりと帰するのは時期尚早である。セイロン鉤虫においては、ＡｃｅＥＳ‐２の分泌は実験用ハムスター宿主の感染後すぐに始まり、吸血活動の開始に対応して着実に増加する［６５］。更に、組換えＡｃｅＥＳ‐２の単回経口投薬は、セイロン鉤虫を用いたハムスターの攻撃感染後の貧血の軽減をもたらし［６６］、このことは、この分子が鉤虫症の病理発生において役割を果たす可能性があるという推測に結びついた［６６］。哺乳動物宿主への侵入及び／又は最終付着部位での宿主ＭＭＰの阻害に関連した分子プロセスにおける鉤虫ＴＩＭＰの役割についても、Ａｃ‐ＴＭＰ‐２がイヌ鉤虫成体の抽出物及びＥＳ生成物のみからしか（この寄生生物のＬ３及び成体のいずれからも対応するｍＲＮＡが検出されているにもかかわらず）単離できないという事実［２６］に基づいて、仮説が立てられた。

アメリカ鉤虫における推定ＴＩＭＰをコードする８個の遺伝子のうち、ＮＥＣＡＭＥ＿１３１６８及びＮＥＣＡＭＥ＿０７１９１の転写はｉＬ３において顕著にアップレギュレートされており（表１参照；［３６］）、よってヒト宿主の感染過程におけるこれらのタンパク質の役割を裏付けている。反対に、ＮＥＣＡＭＥ＿０８４５７及びＮＥＣＡＭＥ＿０８４５８は成体のアメリカ鉤虫において高い転写レベルを示し（表１参照；［３６］）、このことは恐らく、この寄生生物の様々な発生段階におけるこのタンパク質ファミリー構成員の機能の多様化を反映している。今後、アメリカ鉤虫の、性別及び異なる組織の両方におけるＴＩＭＰをコードする遺伝子の示差的転写に関する研究は、この成体の線形動物（線虫）の基本的な分子的生態においてこれらの分子が果たす役割を解明する助けとなりうる。豚回虫では、ＧＳ＿０４７９６の転写はこの線虫の成体雌の生殖組織において顕著にアップレギュレートされた一方、Ｇ５＿２１７３２は雄の筋肉においてアップレギュレートされた（表１参照；［３４］参照）。

ＧＳ＿０４７９６及びＧＳ＿２１７３２によってコードされた推定ＴＩＭＰタンパク質は、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のＣＲＩ‐２（ＷＢＧｅｎｅ０００１９４７８；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｏｒｍｂａｓｅ．ｏｒｇ）と約４０％の類似性を共有するが、ＣＲＩ‐２の発現は、体壁筋肉組織及び成体線虫の陰門、肛門及び咽頭の筋肉に局在していた（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｏｒｍｂａｓｅ．ｏｒｇ 参照）。Ｃ．エレガンスでは、ｃｒｉ‐２はリポ多糖類（ＬＰＳ）に対する生得的免疫応答の調節に関連した分子的事象のカスケードにおいて機能することが知られている［６７］。従来の研究では、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＬＰＳで刺激されたマウスのマクロファージ細胞株におけるＣ．エレガンスｃｒｉ‐２のハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）オーソログを小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により阻害すると、インターロイキン６（ＩＬ‐６）の産生が減少した［６７］。このサイトカインはｉｎ ｖｉｖｏにおいて広く様々な生物学的活性に関連しており、該生物学的活性には病原体による感染に応答した急性期反応の生成が含まれる［６８］。

扁虫では、ビルハルツ住血吸虫の遺伝子Ａ＿０１７２７は、コンピュータ計算上の方法を使用して同定することができた唯一の吸虫ＴＩＭＰタンパク質をコードしていた。様々な発生段階におけるビルハルツ住血吸虫Ａ＿０１７２７の転写調節の解析から、この分子がこの寄生吸虫の成虫雄でアップレギュレートされることが明らかとなった（表１；［４０］参照）。マウスＴＩＭＰ‐１をコードする転写物は精巣形態形成の間に雄の生殖腺においてアップレギュレートされる一方、対応するタンパク質の発現は胎児の精巣索に限定された［７０］。加えて、ＴＩＭＰ‐２をコードするヒト及びマウスの遺伝子は、ディファレンシャル・ディスプレイ・クローン８（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ ｃｌｏｎｅ ８、ＤＤＣ８）遺伝子を含むことが知られ、該遺伝子の転写は精子形成の際に増強される［７１］。これらの観察は、ヒト胎児のセルトリ細胞におけるＴＩＭＰ‐１の発現増大［７２、７３］及びラットにおけるＴＩＭＰ‐２の精巣での発現［７４］という以前の結果と共に、これらの分子が精巣の器官形成及び発生の間に［７０］、並びに精上皮を通る生殖細胞の移動において［７１］、特異的な役割を果たしうるという仮説に結びついた。したがって、成虫の雄の吸虫の再生能に関連した生物学的プロセスにおけるビルハルツ住血吸虫Ａ＿０１７２７の役割を推測したくなるが、この仮説は厳格な試験を必要とする。今後、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）及び遺伝子導入のうち少なくともいずれか一方によるアメリカ鉤虫、豚回虫及びビルハルツ住血吸虫の遺伝子操作［７５−７８］は、これらの生物体の生殖生物学における、また同様にその他の基礎的な分子プロセス、例えば宿主への侵入及び宿主の生得的免疫応答の変調に関連した分子プロセスにおける、蠕虫の推定ＴＩＭＰの機能を解明する助けとなりうる。

ビルハルツ住血吸虫のＡ＿０１７２７との同一性を備えたゲノム配列データは、マンソン住血吸虫（Ｓｍｐ＿０８７６９０；ｅ値は３ｅ−１１０）及び日本住血吸虫（Ｓｊｐ＿００５３０５０．１；ｅ値は６．３ｅ−６４）の両方で検出された。しかしながら、ビルハルツ住血吸虫のＡ＿０１７２７から予測されたアミノ酸配列と、マンソン住血吸虫及び日本住血吸虫由来の対応するホモログとの間の配列重複は、ＮＴＲのＮ末端モジュールに限定されており（図２参照）、このことは、後者の２つの生物種のゲノム配列におけるＴＩＭＰをコードする遺伝子の存在についてのいかなる推論をも極めて憶測的とするであろう。マンソン住血吸虫及び日本住血吸虫のゲノムの目下のアセンブリにおいてＴＩＭＰをコードする遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の断片化が生じてしまった可能性はあるが、その全ゲノム配列を現在利用可能な他の生物種（例えばマレー糸状虫及び旋毛虫）に真核生物ＴＩＭＰのホモログが欠如しているということは、蠕虫におけるこのタンパク質ファミリー構成員の間の、配列及び長さの両方における相当な変動を反映しているのかもしれない［２３］。実際、ＰＳｃａｎソフトウェアを使用した真核生物ＴＩＭＰのＮ末端ＮＴＲモジュールの特有な特徴の検索から、ここで解析されたすべての寄生蠕虫にネトリンタンパク質ファミリーの構成員が存在することが明らかとなった（ｎ＝２６；範囲１〜５；表１参照）。この所見は、蠕虫のゲノムが脊椎動物のＴＩＭＰのＮ末端ドメインに相同な単一ドメインのＴＩＭＰタンパク質をコードする一方で対応するＣ末端領域を欠いているという現在の知見と一致している［７９］。真核生物では、ＴＩＭＰのＮ末端ＮＴＲドメインはＴＩＭＰのメタロプロテアーゼ阻害活性に関与していることが知られており［２４、８０、８１］、一方Ｃ末端ドメインは、メタロプロテアーゼについての［８０、８２、８３］、又は細胞表面及び／又は細胞外マトリックスへのＴＩＭＰの結合のための［２４、８１、８４］、結合部位を提供する。対応するＣ末端から分離された時、ＴＩＭＰのＮ末端ドメインはそのメタロプロテアーゼ阻害活性を保持している［２４、８１〜８４］。この知見に基づいて、単一ドメインの蠕虫ＴＩＭＰは、その脊椎動物の同等物に類似のメタロプロテアーゼ阻害活性を発揮すると仮定されうる一方、いくつかの成熟した蠕虫分子の２位に存在するアミノ酸残基（例えばリジン、アルギニン及びグルタミン；図２参照）は脊椎動物のＴＩＭＰについては非典型的であり、これらのタンパク質がメタロプロテアーゼ活性の阻害とは無関係な機能を遂行するかもしれないことを示唆している（［２３、８５］を参照）。Ｎ末端ＮＴＲモジュールと同様にＴＩＭＰタンパク質のアミノ酸配列の比較構造解析も、蠕虫タンパク質のこのファミリーの機能の詳細な調査を支援するためには不可欠である。

［真核生物のＴＩＭＰの構造解析］
構造上は、４つのヒトＴＩＭＰは十分に特徴解析されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ参照）。これらのタンパク質は、２個のドメイン、すなわちＮＴＲ折り畳み構造を導入するＮ末端ドメイン（Ｎ‐ＴＩＭＰ）及びＣ末端ドメイン（Ｃ‐ＴＩＭＰ）で構成されている。完全長のＴＩＭＰ‐１、ＴＩＭＰ‐２、さらにはＮＴＩＭＰ‐１、Ｎ‐ＴＩＭＰ‐２及びＮ‐ＴＩＭＰ‐３の三次構造は、一部はその標的ＭＭＰとの複合体において、決定済みである（概観については表２を参照）。Ｎ‐ＴＩＭＰ及びＣ‐ＴＩＭＰはいずれも３個のドメイン内ジスルフィド架橋によって内部的に安定化され、かつそれらの構造要素は絡み合っておらず、この２つの構成部分が確かに個別の折り畳み単位（すなわちドメイン）であることを示唆している。この概念は、Ｎ‐ＴＩＭＰがｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＭＭＰ阻害活性を示す折り畳まれた実体として入手可能であるという観察によってさらに裏付けられる［７９、８６〜８８］。

完全長ＴＩＭＰの形状はくさび様に見え、かつＮ末の最末端は、プロテアーゼの活性部位クレフトとの相互作用によるＭＭＰの阻害作用に関与している。いくつかの実例では、さらなる相互作用が、Ｃ‐ＴＩＭＰとプロテアーゼの触媒部位から離れた辺縁部との間で観察されている。しかしながら、ＴＩＭＰ‐２／ＭＭＰ‐２複合体の場合、Ｃ‐ＴＩＭＰ‐２及びＭＭＰ‐２のヘモペキシンドメインの相互作用が阻害物質の親和性を顕著に増強している［８９、９０］。ＴＩＭＰによるその標的プロテアーゼとの主な相互作用は、Ｎ末端の端部の連続ペプチド（ヒトのＴＩＭＰ‐１ではＣｙｓ１‐Ｐｒｏ５）によって、かつ２つの隣接したβ鎖を接続するループ（ヒトのＴＩＭＰ‐１ではＭｅｔ６６‐Ｃｙｓ７０）において、形成される。この２つの領域は、ジスルフィド結合（ヒトのＴＩＭＰ‐１ではＣｙｓ１‐Ｃｙｓ７０）によって共有結合で連結され、２個のαヘリックスが隣接したグリークキートポロジー（ＯＢ折り畳み構造）を備えた５本鎖のαバレルの折り畳み構造を導入するタンパク質のネトリンモジュール（Ｎ‐ＴＩＭＰ）に位置している。

Ｎ‐ＴＩＭＰのＮ末端は標的プロテアーゼの活性部位の中に入り込み、Ｃｙｓ‐１（ヒトのＴＩＭＰ‐１）のα‐アミノ及びカルボニル基が、本来ならば金属に結合される水分子を追い出すことによりプロテアーゼの活性部位亜鉛イオンに配位する［２３］。残基２（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）はプロテアーゼの特異性（Ｓ１）ポケットの中へと突出する。残基３〜５は、プライミングされたサブサイトの中のプロテアーゼ残基と相互作用し、これは通常、切断可能な結合のＣ末端基質残基を包含する。同様に、ＴＩＭＰ‐１の残基６６〜７０は、プロテアーゼのプライミングされていないサブサイトであって、本来ならばＮ末端から切断可能結合までの残基と相互作用するサブサイトを塞ぐ。構造に基づいたアミノ酸配列アライメント（図２）から明白なように、寄生蠕虫由来のＴＩＭＰは、無脊椎動物のＴＩＭＰの以前の解析結果［２３］と一致して、その哺乳動物のホモログよりも配列変異が大きいことを特徴とする。しかしながら、構造機能関係に関しては、ネトリン折り畳み構造の上に接ぎ足された最も重要な特徴は、Ｃｙｓ‐１近隣の立体配座であるように見える。脊椎動物のＴＩＭＰでは、２は、プロテアーゼの特異性ポケットの中に突出するセリン又はトレオニンのいずれかである。重要な注目点は、Ａｃ‐ＴＭＰ‐１もＡｃ‐ＴＭＰ‐２も、ＭＭＰ阻害活性を有するとは（１：１の阻害物質：酵素モル比で）説得力をもって示されていないことである。さらに、平坦なＮ末端を備えて産生されるＡｃｅＥＳ‐２は、１５：１及び１１５：１のモル比でＭＭＰ活性についてスクリーニングされ、阻害活性を示さなかった（［６４］参照）。図２のアミノ酸配列アライメントは、この領域における、ＴＩＭＰの一般的なモチーフであるＣ‐Ｘ‐Ｃを強調している。該アライメントは、阻害活性を備えることが報告された蠕虫ＴＩＭＰであるＡｃ‐ＴＭＰ‐２について、セリン及びトレオニンに加えてリジンも阻害に関して２位における許容残基であることを示している。顕著には、十二指腸鉤虫由来のＡｃｅＥＳ‐２及びＡｄ‐ＴＩＭＰ‐１は、２番目のシステイン残基のほかに阻害のためにプロテアーゼのＳ１’ポケットの中に突出することのできる２位の適切な残基（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｌｙｓ）も欠いている（図２参照）。

これに基づけば、Ａｄ‐ＴＩＭＰ‐１はいかなるＭＭＰ阻害活性も持たないと予測されることになろう。よって、２位の保存を示す蠕虫ＴＩＭＰはヒトＭＭＰに対する阻害活性を示す可能性が高い。Ａ＿０１７２７によってコードされるビルハルツ住血吸虫タンパク質は、２つのＮ末端システイン残基の間に２個の残基（Ａｒｇ‐Ｓｅｒ）を有し、このことが、実験的構造なしに機能的効果を予測することを困難にしている。完全なアミノ酸配列データを利用可能な蠕虫ＴＩＭＰは、Ａｄ‐ＴＩＭＰ‐１を除き、２個のＮ末端システイン残基及びそれらの共有結合パートナー、並びにＯＢ折り畳み構造の維持に適した残基のような、ＮＴＲモジュールの重要な構造要素の保存を示している。変異が最も大きいエリアは、表面が露出した３つのループエリア、すなわち残基２８〜４１、５６〜５９、及び６６〜７０である（Ｈｓ‐ＴＩＭＰ‐２の番号表記；図２を参照）。顕著には、脊椎動物及び蠕虫のＴＩＭＰにおける塩基性残基（Ｈｓ‐ＴＩＭＰ‐１のＡｒｇ２０）の高度保存があり、これはプロテアーゼ相互作用部位よりも遠位側の表面の露出した残基である（図３）。我々の知る限りでは、この残基についての生理学的に重要な機能は未だ記述されていない。その場所（タンパク質の表面）はタンパク質‐タンパク質相互作用又はタンパク質‐マトリックス相互作用を示唆しているが、この位置の塩基性残基が細胞外マトリックスとの結合に関与することは報告されていない［９１］。ビルハルツ住血吸虫のＡ＿０１７２７は他の真核生物のＴＩＭＰとのアミノ酸配列同一性が最も低いが（図２参照）、構造に基づいた配列アライメントは、それに応じて予測された３Ｄ構造と共に、これがＴＩＭＰタンパク質ファミリーの機能的構成員であるかもしれないことを示している。この結論は、ネトリン様折り畳み構造の分子内ジスルフィド結合に必要なすべての保存システイン残基が存在すること、同様にＭＭＰの触媒部位の中に突出すると予想されるセリン残基（Ｓｅｒ３）が保存されていることに基づいている。

［系統発生学的解析］
真核生物ＴＩＭＰの系統発生学的解析により、本発明者らは蠕虫のＴＩＭＰとその脊椎動物の同等物との関係を研究することが可能となった（図４）。この解析は、脊椎動物由来のホモログによって形成されたクレードを除外して、自由生活性及び寄生性の蠕虫（分岐サポート：０．９０）を含む無脊椎動物由来のＴＩＭＰを含む１つの主要なクレードを同定した（図４参照）。無脊椎動物のクレード内において、線虫由来のＴＩＭＰを表すサブクレードがキイロショウジョウバエ由来のＴＩＭＰタンパク質を除外してクラスタ化され（分岐サポート；０．７６；図４参照）、寄生線虫についてのＴＩＭＰの単系統群が存在することを裏付けた。系統発生学的解析にビルハルツ住血吸虫のＡ＿０１７２７を含めた後、脊椎動物のホモログに対する線虫ＴＩＭＰクレードの単系統が維持された。鉤虫由来のＴＩＭＰと他の自由生活性及び寄生性の線虫由来のものとの間には明瞭な分離は観察されず、よって、線虫のＴＩＭＰはその脊椎動物ホモログの機能特性とは異なる特異的な機能特性を特徴とするかもしれないという仮説が裏付けられた。線虫のＴＩＭＰが、脊椎動物の祖先からＣ末端ドメインを喪失した後に生じたのか、又は別個の遺伝子ラインから生じたのかは（［２３］参照）、未だ検討されていない。

配列番号１〜３１として指定され、かつ図１及び／又は図２に示されたＴＩＭＰタンパク質アミノ酸配列は、炎症状態の予防又は治療に適した抗炎症特性を有しうる。国際公開第２０１３／１３４８２２号として公開されたＰＣＴ／ＡＵ２０１３／０００２４７に記載されている以前の研究では、ＡｃＴＩＭＰ‐１（配列番号３２）及びＡｃＴＩＭＰ‐２（配列番号３３）は抗炎症活性を有することが示された。初期の研究では、組換えＡｃ‐ＴＭＰ‐１（配列番号３２）及びＡｃ‐ＴＭＰ‐２（配列番号３３）は２つの別個のＴＮＢＳ大腸炎の実験において体重減少からの優れた保護を示した。Ａｃ‐ＴＭＰ‐２を臨床的かつ巨視的なスコア及び結腸長さについてさらに評価し、これに関しては腸の病理学的状態の著しい軽減を示した。更に、処置されたマウスは、好酸球増加、肺の血管周囲及び気管支周囲の細胞浸潤について、著しい軽減を示した。ナイーブ群と比較して、ＰＢＳで処置しＢＳＡで攻撃したマウスは、インターロイキン（ＩＬ）‐５及びＩＬ‐１３のようなＴｈ２サイトカイン、並びにＩＬ‐６のような炎症のマーカーのレベルの増加を示した。Ａｃ‐ＴＭＰ‐１処置により、肺において（それぞれ）ＩＬ‐５は１〜５分の１、及びＩＬ‐１３は２分の１となった。炎症性サイトカインＩＬ‐６も、Ａｃ‐ＴＭＰ‐１で処置したマウスにおいて２分の１〜３分の１に減少した。炎症誘発性サイトカインであるＴＮＦα又はＩＦＮγは喘息による炎症に直接関連していないが、処置されたマウスでレベルが（それぞれ）３倍及び５倍に増大した。しかしながら、レベルはＡｃ‐ＴＭＰ‐１処置によって影響を受けないままであり、Ａｃ‐ＴＭＰ‐１が十分に忍容されること、及び炎症応答を誘発しないことを示唆していた。ＩＬ‐１２及びＭＣＰ‐１のレベルはＡｃ‐ＴＭＰ‐１処置によって影響を受けないままであり、ＢＳＡ誘発性の炎症の予防はＴｈ１応答の誘導を必要とせず、かつ単球走化性に影響しないことを意味していた。驚くべきことに、Ａｃ‐ＴＭＰ‐１処置は、肺においてＩＬ‐１７Ａレベルを２分の１〜３分の１に減少させたが、ＩＬ‐１７Ａは高レベルでは重症の喘息による炎症及び気道過敏性に関連していることが報告されている。総合すれば、これらの結果から、Ａｃ‐ＴＭＰ‐１がＢＳＡ誘発性の好酸球及びリンパ球の気道浸潤、加えてＴｈ２及びＴｈ１７の応答、並びにＩＬ‐６のような炎症誘発性サイトカインをも著しく軽減することが例証された。

喘息について調査するさらなる実験では、Ａｃ‐ＴＭＰ‐１（配列番号３２）又はＡｃ‐ＴＭＰ‐２（配列番号３３）で処置したマウスは、模擬注射群と比較して気道における好酸球増加の有意な軽減を示し、腹膜内の好酸球の浸潤はなく、Ａｃ‐ＴＭＰ‐１及びＡｃ‐ＴＭＰ‐２がアレルギー応答又は炎症応答の部位のみにおいて好酸球の誘導を防ぐことが示された。

ＯＶＡで攻撃したマウス由来の肺細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＯＶＡ刺激でＩＬ‐５、ＩＬ‐１０及びＩＬ‐１３分泌のレベルの増大を示した。他方、上清のＭＣＰ‐１及びＩＬ‐１７Ａのレベルは、ＯＶＡで刺激した時にＰＢＳの模擬投与及びＯＶＡ攻撃したマウスいずれの肺細胞においても同様に上昇した。気管支肺胞洗浄物の所見と一致して、Ｔｈ２サイトカインのＩＬ‐５、ＩＬ‐１０及びＩＬ‐１３、並びに炎症誘発性サイトカインのＭＣＰ‐１及びＩＬ‐１７Ａのレベルは、Ａｃ‐ＴＭＰ‐１で処置したマウス由来のＯＶＡ刺激した肺細胞では低減した。同様に、肺のサイトカイン含量はＡｃ‐ＴＭＰ‐２で処置したマウスにおいて顕著に減少し、Ａｃ‐ＴＭＰ‐２がＴｈ２並びにＩＬ‐６及びＩＬ‐１７Ａのような炎症誘発性サイトカインを効果的に抑制することが示唆された。

最初のＯＶＡ攻撃の際にのみ（＋／−）、又はＯＶＡ攻撃の両セットの際に（＋／＋）投与されたＡｃ‐ＴＭＰ‐２が慢性喘息のマウスモデルにおいて気道の炎症を減少させるかどうかを評価するために、ナイーブなマウス、ＰＢＳ模擬注射で処置されたマウス、又はＡｃ‐ＴＭＰ‐２で処置されたマウス（＋／−及び＋／＋）の気管支肺胞洗浄物を収集してＦＡＣＳにより解析した。Ａｃ‐ＴＭＰ‐２が最初の攻撃の際に投与されたか（＋／−）又は両方の攻撃の際に投与されたか（＋／＋）にかかわらず、処置されたマウスは、ＯＶＡ誘導型慢性喘息のこのモデルにおいて、ＰＢＳ模擬注射で処置されたマウスと比較して全細胞及び好酸球のいずれの気道浸潤においても顕著な低減を実証した。

鼻腔内注射により局所投与されたＡｃ‐ＴＭＰ‐２が、予防的（Ｔｐ、ＯＶＡ攻撃前）又は治療的（Ｔｃ、ＯＶＡ攻撃後）に与えられたときに気道の炎症を減弱化できるかどうかを判定するために、ナイーブなマウス、ＰＢＳ模擬注射で処置されＯＶＡで攻撃されたマウス、又はＡｃ‐ＴＭＰ‐２で処置（Ｔｃ及びＴｐ）されＯＶＡで攻撃されたマウスの気管支肺胞洗浄物を収集してＦＡＣＳによって解析し、ＦＡＣＳから全細胞数及び分化細胞数を導き出した。マウスが予防的又は治療的いずれの様式で処置されたかにかかわらず、鼻腔内Ａｃ‐ＴＭＰ‐２は全細胞及び好酸球の気道細胞浸潤を顕著に減弱化した。重要なことに、これらのデータにより、Ａｃ‐ＴＭＰ‐２が、喘息のこのネズミ科動物モデルにおける気道の炎症を予防するために、局所的に、かつ単に腸管外というだけではなく投与可能であることが明らかとなった。

ナイーブなマウス、ＰＢＳ模擬注射で処置されＯＶＡで攻撃されたマウス、又はＡｃ‐ＴＭＰ‐２で処置（Ｔｃ及びＴｐ）されＯＶＡで攻撃されたマウスの肺由来の全タンパク質抽出物を調製し、サイトメトリックビーズアレイ（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ 、ＣＢＡ）によりＴｈ２サイトカインのＩＬ‐５及びＩＬ‐１３について解析した。ナイーブ群と比較して、ＰＢＳで処置されＯＶＡで攻撃されたマウスはＩＬ‐５及びＩＬ‐１３いずれについても著しく高いレベルを実証した。本発明者らは、予防的にであれ治療的にであれＡｃ‐ＴＭＰ‐２を用いる処置はＩＬ‐５及びＩＬ‐１３のレベルを顕著に低減することを見出した。総合すると、これらの所見から、Ａｃ‐ＴＭＰ‐２は鼻腔内投与された時にＯＶＡ誘発性の好酸球性気道浸潤及び関連するＴｈ２炎症応答を顕著に低減することが例証された。

ナイーブなマウスへのＡｃ‐ＴＭＰ‐２の投与は、小腸の粘膜固有層内へのＴｒｅｇの動員を顕著に誘発した。反対に、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）由来のＴｒｅｇの度数の著しい減少が、Ａｃ‐ＴＭＰ‐２処置で観察された。これらのデータは、ＭＬＮから腸の粘膜へのＴｒｅｇの移動パターンを示唆している。これを裏付けるように、粘膜固有層Ｔｒｅｇの６０パーセントはケモカインレセプターＣＣＲ９を発現しており、Ｔｒｅｇが腸に関連する流入領域リンパ節（すなわちＭＬＮ）においてインプリントされたことが示された。この観察は、ＭＬＮで生成されたＴｒｅｇが遍在する抗原に対する寛容性を維持するために粘膜に蓄積することを示唆するデータと合致する。

Ａｃ‐ＴＭＰ‐２処置は、ＯＶＡで攻撃した野生型マウスにおいて気道の炎症を顕著に軽減した。反対に、Ａｃ‐ＴＭＰ‐２で処置されＯＶＡで攻撃されたＤＥＲＥＧマウスは、ＯＶＡで攻撃された未処置のＤＥＲＥＧマウスに匹敵しうるレベルの気管支肺胞浸潤を実証した。これらの所見と一致して、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ‐５、ＩＬ‐１０及びＩＬ‐１３、並びに炎症誘発性のＩＬ‐６のレベルは、Ａｃ‐ＴＭＰ‐２で処置されると、ＯＶＡで攻撃された野生型マウスでは顕著に低減し、ＯＶＡで攻撃されたＤＥＲＥＧマウスでは低減しなかった。総合すると、これらの結果から、喘息のこのマウスモデルにおけるＡｃ‐ＴＭＰ‐２の抗炎症作用においてＴｒｅｇが不可欠な役割を果たすことが示唆された。

前述の実験的方法、モデル及び手法のうちの少なくともいくつかが、配列番号１〜３１に記されたもの等の、図１及び／又は２に記された１つ以上のタンパク質の抗炎症活性を実験的に確認するために利用されることになろう。最初に、ＮＥＣＡＭＥ＿０７１９１、ＮＥＣＡＭＥ＿１３１６８及び十二指腸鉤虫のＴＩＭＰ‐１が実験的ＴＮＢＳ大腸炎モデルにおいて試験されることになる。

したがって、期待されるのは、実験的検証により、配列番号１〜３１などの、図１及び／又は２に記された１つ以上のアミノ酸配列を含むタンパク質が、抗炎症活性を有し、かつその結果として疾患又は状態、例えば限定するものではないが喘息、喘息、気腫、慢性気管支炎、及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アジソン病、強直性脊椎炎、セリアック病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多巣性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、クローン病、脱髄性ニューロパチー、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン‐バレー症候群、橋本脳症、橋本甲状腺炎、低ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、インスリン依存型糖尿病（１型）、若年性関節炎、川崎症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋梗塞後症候群、原発性胆汁性肝硬変症、乾癬、特発性肺線維症、ライター症候群、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、潰瘍性大腸炎、血管炎、白斑、及びヴェーゲナー肉芽腫症、の治療又は予防に有用となりうることが確認されるであろうということである。

本明細書全体にわたって意図されてきたのは、本発明をいかなる１つの実施形態にも特定の特徴の集まりにも限定することなく、本発明の好ましい実施形態について述べることであった。したがって、本開示に照らせば、本発明の範囲から逸脱することなく、例示された特定の実施形態に様々な改変及び変更をなすことが可能であることは、当業者によって認識されよう。

本明細書中で参照した全てのコンピュータプログラム、アルゴリズム、特許文献及び科学文献は参照により本願に組込まれる。

参考文献

Claims (22)

1. 対象者の炎症を軽減又は緩和する方法であって、治療上有効な量の、配列番号１〜３１に記されたアミノ酸配列をそれぞれ含む１つ以上の単離タンパク質、又はその生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント又はこれらの組み合わせを対象者に投与することにより、対象者の炎症を軽減又は緩和するステップを含む方法。
2. 前記炎症は、対象者における疾患、障害及び状態のうちの少なくともいずれかに関連しているか又は続発するものである、請求項１に記載の方法。
3. 前記疾患、障害及び状態のうちの少なくともいずれかは基準療法に抵抗性である、請求項２に記載の方法。
4. 前記基準療法は、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、アミノサリチラート、コルチコステロイド、免疫抑制薬、サイトカイン／サイトカインレセプター阻害薬、抗生物質、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの基準作用薬の投与を含む、請求項３に記載の方法。
5. 少なくとも当初は、配列番号１〜３１に記されたアミノ酸配列をそれぞれ含む前記１つ以上の単離タンパク質、又はその生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント又はこれらの組み合わせは、基準療法とともに補助的に投与される、請求項３又は請求項４に記載の方法。
6. 少なくとも当初は、配列番号１〜３１に記されたアミノ酸配列をそれぞれ含む１つ以上の単離タンパク質、又はその生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント又はこれらの組み合わせは、総用量よりも少なく投与される少なくとも１つの基準作用薬とともに補助的に投与される、請求項３又は請求項４に記載の方法。
7. 対象者の炎症を予防するための方法であって、治療上有効な量の、配列番号１〜３１に記されたアミノ酸配列をそれぞれ含む１つ以上の単離タンパク質、又はその生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント又はこれらの組み合わせを対象者に投与することにより、対象者の炎症を予防するステップを含む方法。
8. 前記炎症は、対象者における疾患、障害及び状態のうちの少なくともいずれかに関連しているか又は続発するものである、請求項７に記載の方法。
9. 前記疾患、障害及び状態のうちの少なくともいずれかは、免疫学的な疾患、障害及び状態のうちの少なくともいずれかである、請求項２〜６及び請求項８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記免疫学的な疾患、障害及び状態のうちの少なくともいずれかは、アジソン病、強直性脊椎炎、セリアック病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多巣性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、クローン病、脱髄性ニューロパチー、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン‐バレー症候群、橋本脳症、橋本甲状腺炎、低ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、インスリン依存型糖尿病（１型）、若年性関節炎、川崎症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋梗塞後症候群、原発性胆汁性肝硬変症、乾癬、特発性肺線維症、ライター症候群、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、潰瘍性大腸炎、血管炎、白斑、及びウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
11. 前記疾患は消化管の疾患である、請求項２〜６及び請求項８のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記疾患は慢性胃炎又は炎症性腸疾患である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記炎症性腸疾患はクローン病又は潰瘍性大腸炎である、請求項１２に記載の方法。
14. 前記疾患は呼吸器系の疾患である、請求項２〜６及び請求項８のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記疾患は喘息、気腫、慢性気管支炎、及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
16. 少なくとも１つの追加の作用薬を対象者に投与するステップをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記少なくとも１つの追加の作用薬は、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、アミノサリチラート、コルチコステロイド、免疫抑制薬、サイトカイン／サイトカインレセプター阻害薬、抗生物質、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記対象者は哺乳動物である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記哺乳動物はヒトである、請求項１８に記載の方法。
20. 治療上有効な量の、配列番号１〜３１に記されたアミノ酸配列をそれぞれ含む１つ以上の単離タンパク質、又はその生物学的に活性なフラグメント若しくはバリアント又はこれらの組み合わせを、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と共に含む医薬組成物。
21. 少なくとも１つの追加の作用薬をさらに含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
22. 前記少なくとも１つの追加の作用薬は、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、アミノサリチラート、コルチコステロイド、免疫抑制薬、サイトカイン／サイトカインレセプター阻害薬、抗生物質、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２１に記載の医薬組成物。