DE10138550A1

DE10138550A1 - Verwendung von TIMP-1 als Immunsuppressivum

Info

Publication number: DE10138550A1
Application number: DE10138550A
Authority: DE
Inventors: Wolfgang E Berdel; Elisabeth Oelmann
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-08-06
Filing date: 2001-08-06
Publication date: 2003-02-20
Also published as: WO2003013592A1; US20040235724A1

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von DOLLAR A (a) TIMP-1; DOLLAR A (b) einem TIMP-1 Analogon; DOLLAR A (c) eines Fragmentes von (a) oder (b) mit immunsuppressiver Aktivität; oder DOLLAR A (d) einer Nukleinsäure, die für eines der in (a) bis (c) genannten Peptide kodiert; DOLLAR A zur Behandlung von Erkrankungen oder Störungen, die durch eine erhöhte immunologische Aktivität gekennzeichnet sind.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines bestimmten Inhibitors der Metalloproteinasen (des sogenannten "tissue inhibitor of metalloproteinases 1"; nachfolgend als TIMP-1 bezeichnet) zur Behandlung von Erkrankungen oder Störungen, die durch eine erhöhte immunologische Aktivität gekennzeichnet sind.
Die Anzahl der Organ und Gewebe- Transplantationen zwischen verschiedenen Individuen (Allotransplantationen) hat in den letzten Jahren stark zugenommen. Der Erfolg einer entsprechenden Transplantation wird derzeit im wesentlichen durch Art und Umfang der Abstoßungsreaktion durch das Immunsystem des Empfängers bestimmt. Die Transplantatabstoßung muß in jedem Fall der Allotransplantation durch Immunsuppression gehemmt werden.
Immunsuppressive Wirkstoffe, beispielsweise Kortikosteroide, Antimetabolite, Antilymphozytenserum, Anti-IL-2-Rezeptor-Antikörper oder Ciclosporin, werden im klinischen Alltag für die Inhibierung der Transplantatabstoßung sowie zur Behandlung einer Vielzahl weiterer Erkrankungen und Störungen eingesetzt. Beispielsweise werden Autoimmunerkrankungen und alle Immunreaktionen der akuten Phase mit Immunsuppressiva behandelt (vgl. Pschyrembel, Klinisches Wörterbuch).
Eine Reihe von biotechnologisch hergestellten immunsuppressiven Mitteln auf Peptidbasis, meist Antikörper, sind inzwischen zur Behandlung verschiedener Erkrankungen zugelassen worden (vgl. Remicade, Anti-TNF-Alpha-Antikörper der Essex Pharma; Orthoclone, Anti-CD3-Antikörper von Janssen-Cilag; Keliximab, Anti-CD4- Antikörper von SmithKline Beecham, etc.).
Die verfügbaren Mittel weisen jedoch in der Regel schwerwiegende Nebenwirkungen auf. Insbesondere die für die Behandlung der Transplantatabstoßung verwendeten Mittel führen zu einer generellen Unterdrückung aller immunologischen Reaktionen und daher zu einer Schwächung der Abwehr gegen Infektionskrankheiten und einer erhöhten Gefahr des Auftretens bösartiger Erkrankungen. Ein Teil der Mittel weist ferner toxische Nebenwirkungen auf.
Insbesondere die Verabreichung von "Fremdproteinen" an Menschen, also von Proteinen nicht-menschlichen Ursprungs (beispielsweise murine Antikörper), führt in vielen Fällen zu unerwünschten Nebenwirkungen, wie Anaphylaxie, Sensibilisierung, erhöhte Thromboseneigung durch Entstehung von Immunkomplexen und einem allgemeinen Zytokin-Release-Syndrom. Ferner bildet das Immunsystem der Menschen, die einer entsprechenden Behandlung ausgesetzt werden, Antikörper gegen diese Fremdproteine, wodurch eine Neutralisierung derselben erfolgt. Fremdproteine können daher nur über sehr kurze Zeit eingesetzt werden.
Aufgrund der apoptotischen Wirkung auf Lymphozyten führt die Verabreichung von Steroiden bei den Betroffenen zu einer gefährlichen allgemeinen Immunschwäche. Es besteht daher ein Bedarf an neuen immunsuppressiven Wirkstoffen.
Eine Gruppe multifunktioneller Proteine wurde aufgrund der Fähigkeit Metalloproteinasen im Gewebe zu inhibieren als TIMP ("tissue inhibitors of metalloproteinases") bezeichnet (Corcoran, M. L. und Stedler, W. G., J. Biol. Chem. 270, S. 13453-13459, 1995). Als Metallo- oder Matrixmetalloproteinasen (MMP) werden Zink-abhängige Peptidasen, darunter Kollagenasen, Gelatinasen und Stromelysine bezeichnet. Diese Proteinasen sind unter anderem in der Lage, die Bestandteile der extrazellulären Matrix (ECM) abzubauen.
Sowohl bei der Gewebe-Entwicklung als auch bei pathologischen Störungen ist der Auf- und Abbau der ECM-Struktur von wesentlicher Bedeutung. Die MMP spielen daher eine wichtige Rolle bei der Umstrukturierung des Gewebes, beispielsweise bei der Morphogenese, der Angiogenese, der Reparatur des Gewebes und insbesondere beim Wachstum und der Wanderung von Tumoren (Docherty at al., Trends Biotechnol., 10: 200-207, 1992; Matrisian LM, BioEssays, 14: 455-463, 1992; Stetler-Stevenson et al., Annu. Rev. Cell. Biol., 9: 541-573, 1993; Stetler-Stevenson, W. G., J. Clin. Invest., 103: 1237-1241, 1999; DeClerck et al., Adv. Exp. Med. Biol., 425: 89-97, 1997; Jones, J. L. und Walker, R. A., J. Pathol., 183: 377-379, 1997; Westermarck, J. und Kähäri, V. M., FASEB J., 13: 781-792, 1999; Polette, M. und Birembaut, P., Int. J. Biochem. Cell. Biol., 30: 1195-1202, 1998).
Die meisten MMPs werden als Zymogen sekretiert und durch weitere Proteinasen aktiviert. Die Aktivität der MMP wird anschließend jedoch primär durch eine Familie spezifischer Inhibitoren (den TIMP) reguliert. Die Inhibierung erfolgt durch Ausbildung irreversibler, inaktiver Komplexe zwischen TIMP und MMP (Cawston et al., Biochem. J., 211: 313-318, 1983).
Bisher wurden vier TIMP-Typen identifiziert und kloniert, nämlich TIMP-1 (Docherty et al., Nature, 318: 66-69, 1985), TIMP-2 (Boone et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2800-2804, 1990), TIMP-3 (Apte et al., Genomics, 19: 86-90, 1994; Silbiger et al., Gene, 141: 293-297, 1994; Uria et al., Cancer Res., 54: 2091-2094, 1994; Wilde et al., DNA Cell. Biol., 13: 711-718, 1994) und TIMP-4 (Greene et al., J. Biol. Chem., 271: 30375-30380, 1996).
Die strukturellen Eigenschaften einiger TIMP, sowie deren Wirkungsweise bei der MMP-Inhibierung mittels Komplexbildung wurden im Detail untersucht (Tuuttila et al., J. Mol. Biol., 284: 1133-1140, 1998; Bode et al., Cell. Mol. Life Sci., 55: 639-652, 1999; Gomis-Rüth at al., Nature 389: 77-81, 1997). Eine ausgeglichene Balance zwischen MMP und TIMP ist physiologisch von großer Bedeutung. Dafür werden die TIMP-Mengen durch Steroide, Wachstumsfaktoren und Zytokine, wie beispielsweise IL-1, IL-6, IL-10, Leukämie-inhibitorischer Faktor, Neurotrophischer Faktor, Oncostatin M, TNF-alpha und epidermaler Wachstumsfaktor reguliert (Fabunmi et al., Biochem. J., 315: 335-342, 1996; Roeb et al., FEBS Letters, 349: 45-49, 1994; Nemoto et al., Arthritis Rheumatism, 39: 560-566, 1996; Lotz, M, und Guerne, P. A., J. Biol. Chem., 266: 2017-2020, 1991; Hosono et al., FEBS Letters, 381: 115-118, 1996; Lacraz et al., J. Clin. Invest., 96: 2304-2310, 1995; Shingu et al., Clin. Exp. Immunol., 94: 145-149, 1993).
Neben der übereinstimmenden Ativität der Proteinase-Inhibierung weist jedes TIMP jedoch weitere Eigenschaften auf, die von TIMP zu TIMP verschieden sind. TIMP-1 ist primär in B-Zellen und H-Zell-Lymphomen aktiv, während die Expression von TIMP-2 auf T- Zellen beschränkt ist. TIMP-1 und -2 weisen am NH₂-Ende eine Proteinase-Inhibitor-Domäne und am COOH-Ende eine Wachstumsfaktor- Domäne auf. Die Proteinase-Inhibitoren wirken jedoch auf unterschiedliche Proteinasen. TIMP-2 inhibiert MMP2, eine Proteinase, die spezifisch die Basalmembran des Kollagen IV (das Kollagen der Basalmembran von Gefäßen) spaltet. Die MMP2-Funktion ist essentiell für Lymphozyten, da es diesen ermöglicht, aus der Gefäßwand auszutreten.
TIMP-1 inhibiert MMP-1, -3 und -9, Proteinasen, die primär Kollagen III spalten, aber keinen Einfluß auf Gefäßwände haben.
TIMP-1 und -2 weisen eine Gesamthomologie von etwa 40% auf, wobei die größte Homologie im Bereich der für die Proteinase- Inhibitor-Aktivität verantwortlichen Domäne vorliegt (Fernandez- Catalan et al., EMBO J., 17, 5238-48, 1998; Greene et al., J. Biol. Chem., 271, 30375-80, 1996; Hayakawa et al., J. Cell. Sci., 107, 2373-9, 1994).
Sowohl die Überexpression von TIMP-1 in Non-Hodgkin-Lymphomen (NHL) als auch deren Übereinstimmung mit der klinischen Aggressivität der Erkrankung wurde im Stand der Technik beschrieben (Kossakowska et al., Blood, 77: 2475-2481, 1991). Ferner war bekannt, dass die Bewegung der Lymphozyten durch das Gleichgewicht zwischen den von diesen Zellen erzeugten MMP und TIMP bestimmt wird (Johnatty et al., J. Immunol., 158: 2327-2333, 1997; und Borland et al., J. Biol. Chem., 274: 2810-1815, 1999). Schließlich wußte man, dass TIMP-1 die Differenzierung der B-Zellen induziert (Guedez et al., J. Clin. Invest., 102: 2002-2010, 1998; Guedez et al., Blood, 92: 1342-1349, 1998).
Im Stand der Technik finden sich Tierversuche, die zeigen, dass TIMP-2 für die Behandlung allergischer Entzündungen, insbesondere Entzündungen der Haut oder der atopischen Dermatitis verwendet werden kann (JP 2000086533). Kürzlich wurde auch berichtet, dass TIMP-2 die Fähigkeit besitzt, Apoptose in aktivierten peripheren T-Zellen zu induzieren. In nicht-stimulierten T-Zellen wurde keine Apoptose induziert. In diesem Zusammenhang wurde ferner festgestellt, dass es sich dabei um eine TIMP-2 spezifische Wirkung handelte. TIMP-I wies in diesen Untersuchungen keine apoptotische Wirkung auf aktivierte T-Zellen auf (Lim et al., PNAS, Vol. 878 (1999), S. 522-523).
Demgegenüber offenbart die vorliegende Erfindung überraschenderweise, dass auch TIMP-1 eine immunsuppressive Aktivität aufweist. Die vorliegende Erfindung betrifft somit die Verwendung von

a) TIMP-1;
b) einem TIMP-1 Analogon;
c) eines Fragmentes von (a) oder (b) mit derselben immunsuppressiven Aktivität wie TIMP-1; oder
d) einer Nukleinsäure, die für eines der in (a) bis (c) genannten Peptide kodiert;

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird ein Protein mit der in Fig. 2 der Veröffentlichung Docherty et al. (Nature, 318: 66-69, 1985) offenbarten Aminosäuresequenz als TIMP-1 bezeichnet. Demgegenüber handelt es sich bei den TIMP-1 Analoga um natürlich vorkommende oder mittels chemischer oder rekombinanter Verfahren erstellte Varianten des TIMP-1, die Unterschiede in der Aminosäuresequenz aber im wesentlichen dieselbe immunsuppressive Aktivität aufweisen. Entsprechende Analoga haben im Vergleich zu der TIMP-1 Aminosäuresequenz einen Homologiegrad von mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 70% auf. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die TIMP-1 Analoga einen Homologiegrad von mindestens 80%, insbesondere mindestens 95% zu der TIMP-1 Aminosäuresequenz auf. Die Bestimmung des Homologiegrades erfolgt, indem man die beiden Sequenzen übereinander schreibt, wobei vier Lücken auf einer Länge von 100 Aminosäuren möglich sind, um größtmögliche Übereinstimmung der zu vergleichenden Sequenzen zu erzielen (vgl. auch Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, 124, 1972). Anschließend wird der Prozentsatz der Aminosäurereste der kürzeren der beiden Aminosäureketten ermittelt, der identischen Aminosäureresten auf der anderen Kette gegenübersteht.
Im Stand der Technik sind eine Vielzahl an Verfahren bekannt, mittels derer Proteine und Peptide, beispielsweise durch Derivatisierung einzelner Gruppen der Aminosäuren oder durch Bindung an Makromoleküle (z. B. PEG und PEG-Derivate oder andere Proteine zur Herstellung von Fusionsproteinen) modifiziert werden. Durch die Derivatisierung sollen die Peptide vorteilhafte Eigenschaften (verbesserte Stabilität, etc.) erhalten. Entsprechende Derivate der oben genannten Peptide sind von der vorliegenden Erfindung erfaßt und werden ebenfalls als TIMP-1 Analoga bezeichnet.
Ein TIMP-1 Analogon weist für die Zwecke der vorliegenden Erfindung dieselbe immunsuppressive Aktivität wie TIMP-1 auf, wenn es die T-Zell-vermittelte Zytotoxizität in einer gemischten Lymphozyten-Kultur gemessen mittels des Chrom-Freisetzungs-Nachweisverfahrens zu mindestens 65%, vorzugsweise zu mindestens 75%, insbesondere zu mindestens 85% inhibiert (wobei die Inhibierung durch TIMP-1 als 100% gesetzt wird). Die gemischte Lymphozyten-Kultur kann wie in den nachfolgenden Beispielen (vgl. Beispiel 1) und nach im Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden (vgl. Kägi et al., Science, 265, 528-530, 1994; und Lowin et al., Nature, 370, 650-652, 1994).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können natürlich auch Fragmente des TIMP-1 oder der Analoga verwendet werden. Das Fragment kann eine beliebige Größe aufweisen, sofern es dieselbe immunsuppressive Aktivität wie TIMP-1 hat. Das Fragment weist eine Länge von mindestens 3 Aminosäuren, vorzugsweise eine Länge von mindestens 5 Aminosäuren auf, wobei eine Länge von 10 bis 20 Aminosäuren besonders bevorzugt ist.
Die hier angesprochenen TIMP-1 Analoga und Fragmente können vom Fachmann beispielsweise durch rekombinante Herstellung nach Einführung von Substitutionen oder Deletionen in der bekannten TIMP-1 Nukleinsäure-Sequenz erzeugt werden. Alternativ dazu können die Analoga durch chemische Synthese erzeugt werden. In jedem Fall ist es ein einfaches die immunsuppressive Aktivität der Analoga zu bestimmen. Entsprechende TIMP-1 Analoga und Fragmente sind für den Fachmann somit ohne weiteres verfügbar.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Nukleinsäure, die für TIMP-1, ein TIMP-1 Analogon oder ein Fragment davon kodiert, zur Behandlung von Erkrankungen oder Störungen, die durch eine erhöhte immunologische Aktivität gekennzeichnet sind. Im Stand der Technik sind verschiedene Verfahren bekannt, mittels derer Nukleinsäuren unmittelbar oder in Kombination mit einem Träger zur in vitro und in vivo Transformation von Zellen und damit zur Behandlung von Erkrankungen verwendet werden.
Zum gezielten Gentransfer in eukaryotische Zellen des hämatopoetischen Systems wurden beispielsweise Vektoren verwendet, die auf Retroviren basieren (vgl. Dao et al., Int. J. Mol. Med., 1, 257-264, 1998; und Pollok et al., Curr. Op. Mol. Ther., 1, 595-604, 1999). Auch auf SV40 und HSV basierende Vektoren sind im Stand der Technik bereits in vitro und in vivo für den Gentransfer in bestimmte eukaryotische Zellen genutzt worden (Strayer, D. S., J. Cell. Physiol., 181, 375-384, 1999; und Stevenson et al., Semin. Hemol., 36, 38-42, 1999).
Die vorliegende Erfindung umfaßt den Einsatz entsprechender auf Nukleinsäuren basierender Verfahren bei der medizinischen Verwendung von TIMP-1, dessen Analoga und Fragmente. Bei den Nukleinsäuren kann es sich beispielsweise um RNS oder DNS handeln, vorzugsweise wird eine DNS verwendet.
In dieser Ausführungsform ist die für TIMP-1, für das TIMP-1 Analogon oder für eines der Fragmente mit immunsuppressiver Aktivität kodierende Nukleinsäure vorzugsweise operativ mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft, welche die Expression der kodierenden Sequenz bewirken kann. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die regulatorische Sequenz so ausgestaltet, dass eine Expression der kodierenden Sequenzen ausschließlich in ausgewählten Zielzellen erfolgt.
Krankhafte Zustände oder Störungen, die durch eine erhöhte immunologische Aktivität gekennzeichnet sind, sind vom Facharzt ohne weiteres zu identifizieren. Ein Merkmal einer entsprechenden Erkrankung oder Störung ist beispielsweise die Lyse von Körpereigenen Organen oder Zellen durch Lymphozyten. Bei Erkrankungen, die durch eine erhöhte immunologische Aktivität gekennzeichnet sind, kann es sich beispielweise um Autoimmunerkrankungen handeln. Alternativ oder zusätzlich dazu können Zustände oder Störungen, die durch eine erhöhte immunologische Aktivität gekennzeichnet sind, durch eine überhöhte Freisetzung von Mediator- Substanzen gekennzeichnet sein. Beispiele für entsprechende Zustände sind allergische Erkrankungen, bei denen unter anderem durch Lymphozyten Mediatoren, wie Zytokine, etc., feigesetzt werden, wodurch die Erkrankung (Heuschnupfen, Asthma, etc.) verursacht wird.
Die vorläufige Analyse der immunsuppressiven Wirkung des TIMP-1 weist darauf hin, dass TIMP-1 im Gegensatz zu TIMP-2 keine T- Zell-Apoptose induziert, sondern aktivierend auf inhibitorische T-Zellen (beispielsweise CD4-, Th2-Zellen) und/oder hemmend auf aktivierende T-Zellen (beispielsweise CD4-, Th1-Zellen) wirken könnte. Wirkstoffe, die immunsupprimierend wirken, ohne Apoptose in T-Zellen zu induzieren sind pharmakologisch von besonderem Interesse, da sie die Möglichkeit bieten, eine Immunsuppression zu erzielen, ohne eine allgemeine und anhaltende Immunschwäche zu induzieren.
Das TIMP-1, das TIMP-1 Analogon, deren Fragmente oder eine entsprechende Nukleinsäure kann insbesondere zur Behandlung von Multiple Sklerose, Morbus Crohn, akuter und chronischer Graft versus Host Erkrankungen, akuter Transplantatabstoßung, Typ-I Diabetes mellitus, rheumatoide Arthritis, Lyme-Arthritis, reaktive Yersinien-induzierte Arthritis, Post-Streptokokken-Herzklappen- und Myokarderkrankungen, Hepatitis C-induzierte chronische Hepatitis, Hashimoto-Thyreoiditis, Grave's Ophthalmopathie, primäre sklerosierende Cholangitis, Helicobacter pylori induzierte Gastritis, zerebrale Malaria, Kontaktdermatitis, aplastische Anämie, immunologisch bedingte Aborte, Asthma bronchiale, allergische Zustände der Haut, Sonnenbrand oder Heuschnupfen verwendet werden.
Es wurde festgestellt, dass TIMP-1 in Lymphknoten von Patienten mit Hodgkin's Disease überexpremiert wird. Das erfindungsgemäße Protein sollte daher nicht an Patienten mit B-Zell-Lymphomen verabreicht werden.
Erfindungsgemäß kann TIMP-1, das TIMP-1 Analogon, deren Fragmente oder eine entsprechende Nukleinsäure in irgend einer der bekannten Arzneiformen appliziert werden. Die Applikation in Form einer Infusionslösung, einer Tablette, von Nasentropfen, einer Mundspülung, eines Inhalationsmittels, eines Pflasters oder einer Creme ist bevorzugt. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, insbesondere einer Infusionslösung, einer Tablette, eines Pflaster oder einer Creme, bei denen man TIMP-1, ein TIMP-1 Analogon, deren Fragmente oder eine dafür kodierende Nukleinsäure mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger vermischt.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform kann TIMP-1, das TIMP-1 Analogon, deren Fragment oder eine entsprechende Nukleinsäure zur in vitro Behandlung von Transplantat-Gewebe oder -Organen vor der Transplantation eingesetzt werden. Dafür wird eine Spüllösung für Transplantate erstellt, die den genannten Wirkstoff umfaßt. Durch dieses Vorgehen kann ein sogenanntes T-Zell-Purging erzielt werden.
Bei der Auswertung aller statistischer Analysen der nachfolgenden Beispiele wurde der Mann-Whitney-Test verwendet, wobei ein P-Wert von weniger als 0,05 als signifikanter Unterschied gewertet wurde.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 Ergebnisse der allogen aktivierten, gemischten Lymphozytenkultur, wobei die Hemmung der Lyse durch TIMP als prozentuale Menge spezifischer Chrom-Freisetzung dargestellt wird.
Fig. 2 Ergebnisse der FACS-Analyse des Einflusses von rhTIMP-1 auf die Apoptose aktivierter Lymphozyten.
Fig. 3 DNS-Syntheserate gemischter allogen stimulierter Lymphozytenkulturen in Gegenwart und Abwesenheit von rhTIMP-1.
Fig. 4 DNS-Syntheserate gemischter allogen stimulierter Lymphozytenkulturen in Gegenwart und Abwesenheit von rhTIMP-1.
Fig. 5 DNS-Syntheserate gemischter allogen stimulierter Lymphozytenkulturen in Gegenwart und Abwesenheit von rhTIMP-1 nach Auftrennung der Lymphozyten in Subpopulationen.

Beispiel 1

Einfluss von TIMP-1 auf gemischte und autologe Lymphozytenkulturen

Die gemischten Lymphozytenkulturen wurden nach im Stand der Technik bekannten Verfahren (Kägi et al., Science, 265: 528-530, 1994; und Lowin et al., Nature, 370: 650-652, 1994) durchgeführt.
Zusammengefasst wurde dafür Blut von verschiedenen nicht-histokompatiblen, gesunden Spendern (Stimulator und Responder) gewonnen und mit Ficoll versetzt. Die Zellen der Interphase wurden isoliert und 2fach gewaschen. Als Stimulator fungierende, mononukleäre Zellen wurden mit 30 Gy bestrahlt. Die Stimulierung wurde in einem Versuch mit CD14-angereicherten (MACS, CD14-Mikrokügelchen, Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Deutschland) und bestrahlten Zellen durchgeführt. Dafür wurden 8 × 10⁶ bestrahlte Stimulator und 2 × 10⁷ lebende Responder-Zellen miteinander über 5 Tage in 15 ml RPMI 1640 Medium mit 2 mM Glutamin und 10% FCS in 50 ml Falcon-Röhrchen unter gleichmäßigem Schütteln (1 Mal täglich) inkubiert (pH 7,2, 37°C, 5% CO₂, hohe Feuchtigkeit). Am 5. Tag wurden frische, nicht-bestrahlte Stimulator-Zellen, in einer Konzentration von 2 × 106 Zellen pro 100 µl für 90-120 min mit 100 µCi an Natrium [⁵¹Cr]-Chromat inkubiert (100 µl Volumen, spezifische Aktivität 472.220241 mCi/mg, NEN; pH 7,2, 37°C, 5% CO₂ und hohe Feuchtigkeit). Die markierten Zellen wurden 3 Mal in 1640 RPMI-Medium mit 10% FCS gewaschen. Anschließend wurden Mikrotiterplatten mit 150 µl markierten Stimulator/Target (E) Zellen und Responder/Effektor (E) Zellen in der angegebenen E:T-Menge in Gegenwart von rhTIMP-1 oder rhTIMP-2 oder einem Vehikel als Kontrolle befüllt. Die Mikrotiterplatten wurden für 4 Stunden inkubiert (pH 7,2, 37°C, 5% CO₂, hohe Feuchtigkeit) und für 5 Minuten bei 200 G zentrifugiert. Aliquote Teilmengen der Überstände wurden anschließend auf Radioaktivität hin untersucht. Die maximale Chrom-Freisetzung wurde nach Lyse der markierten Stimulatorzellen (entspricht den Zielzellen, "target cells" oder T) mittels Triton X 100 Behandlung der Vertiefungen gemessen. Die spontane Chrom-Freisetzung wurde an Zielzellen gemessen, die nur in Medium belassen worden waren. Die Ergebnisse (Fig. 1) zeigen die prozentuale Menge spezifischer Chrom-Freisetzung als Durchschnitt von Dreifachmessungen (experimentelle Chrom-Freisetzung (cpm) minus spontane Chrom-Freisetzung (cpm) × 100 dividiert durch die maximale Chrom-Freisetzung (cpm) minus spontane Freisetzung).
Alternativ dazu wurde ein Versuch angesetzt, in dem autologe (HLA-A2-positive) PHA-stimulierte Lymphozyten mit einem Melanom- assoziiertem Nonapeptid (IMDQVPFSV, ein gp100 Peptid, das in Position 2 verändert wurde, um im Vergleich zu dem nativen Peptid verbesserte Affinität für HLA-A*0201-Bindungsstellen zu erhalten; vgl. Parkhurst, M. R., J. Immunol., 157: 2539-2548, 1996) als Stimulator/Ziel-Zelle inkubiert. Nach 3 facher Stimulierung durch Nonapeptid-präsentierende Zellen (autolog zu den Effektor-Lymphozyten) wurde mit Lymphozyten als Responder/Effektor-Zellen inkubiert, wobei im übrigen die für die gemischte Lymphozyten-Kultur angegebenen Parameter eingestzt wurden.
Fig. 1 zeigt beispielhaft Ergebnisse, die bei der Durchführung des Chrom-Freisetzungsnachweises nach gemischter Lymphozytenkultur erhalten wurden. Wie diese Abblidung eindeutig darstellt, inhibiert sowohl rhTIMP-1 als auch rhTIMP-2 die T-vermittelte Zytotoxizität gegen verschiedene Zielzellen nach lediglich 3 Stunden in der Kultur und 4 Stunden Assay Dauer. Diese Wirkung war bei höheren E:T-Verhältnissen am stärksten ausgeprägt, und erreichte Werte zwischen 84% und 89% Inhibition der Kontrollen (ohne Zytokin).

Beispiel 2

Einfluss von rhTIMP-1 auf die Apoptose aktivierter Lymphozyten

Um mögliche Ursachen für die verminderte Lysefähigkeit der allogen stimulierten Lymphozyten zu untersuchen, wurde die Vitalität dieser Zellen anhand ihrer Proliferationskapazität, sowie ihres Apoptoseverhaltens überprüft.
Dafür wurden gemischte mononukleäre Zellen analog des Protokolls für gemischte Lymphozytenkulturen isoliert und stimuliert. 5 Tage nach Versuchsbeginn wurden 1 × 10⁵ Zellen pro Versuchsbedingung (Färbung mit Lymphozyten-Subpopulations-spezifischen Antikörpern gegen CD3, CD4 oder CD8) mit Annexin-V und Propiumiodid nach Standardverfahren (FACS Calibur, Becton Dickinson) gefärbt, um zwischen apoptotischen und toten Zellen unterscheiden zu können. Die Zellsuspension wurde bei 4°C für eine Stunde im Dunklen belassen und unter Verwendung eines FACS-Analyzers (FACS Calibur, Becton Dickinson) analysiert. Die weitere Auswertung erfolgte mittels CellQuest und Paint-A-Gate 3,0 Software auf einem Macintosh PC.
Die Ergebnisse sind in Fig. 2 zusammengefasst und zeigen, dass rhTIMP-1 keinen Apoptose-fördernden Effekt auf aktivierte Lymphozyten, noch nicht einmal auf eine Subpopulation der Lymphozyten ausübt.

Beispiel 3

Einfluss von TIMP-1 auf die DNS-Syntheserate in gemischten Lymphozytenkulturen

In 8 Versuchen wurde die DNS-Syntheserate der gemischten Lymphozytenkulturen durch 3H-Thymidinaufnahme der Zellen gemessen.
Die Gegenwart von TIMP-1 führte dabei nicht zu einem signifikanten Abfall der Thymidinaufnahme. Es zeigte sich tendenziell eher eine Steigerung der Proliferation, die jedoch nicht statistisch signifikant war. Diese Ergebnisse zeigen jedoch, dass in der maßgeblichen Zellpopulation kein induzierter Zelltod zu beobachten ist (vgl. Fig. 3 und 4).
Schließlich wurde die 3H-Thymidinaufnahme von Lymphozyten aus gemischter Lymphozytenkultur bestimmt, wobei die Lymphozyten zuvor durch FACS-Auftrennung in Subpopulationen aufgeteilt wurden. Auch diese Auswertung (Fig. 5) zeigt eindeutig, dass TIMP-1 nicht apoptotisch auf Lymphozyten wirkt.

Claims

1. Verwendung von

a) TIMP-1;

b) einem TIMP-1 Analogon;

c) eines Fragmentes von (a) oder (b) mit immunsuppressiver Aktivität; oder

d) einer Nukleinsäure, die für eines der in (a) bis (c) genannten Peptide kodiert;

zur Behandlung von Erkrankungen oder Störungen, die durch eine erhöhte immunologische Aktivität gekennzeichnet sind.

2. Verwendung nach Anspruch 1, bei der das TIMP-1 Analogon eine natürliche oder rekombinante allelische Variante des TIMP-1 ist und einer Homologie von mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 70% zu der TIMP-1 Aminosäuresequenz aufweist.

3. Verwendung nach Anspruch 2, bei der das TIMP-1 Analogon eine Homologie von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 95% zu der TIMP-1 Aminosäuresequenz aufweist.

4. Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei der das Fragment eine Länge von mindestens 3, vorzugsweise mindestens 5 oder 10 Aminosäuren aufweist.

5. Verwendung gemäß Anspruch 1, bei der die für TIMP-1, für das TIMP-1 Analogon oder für eines der Fragmente mit immunsuppressiver Aktivität kodierende Nukleinsäure operativ mit einer Sequenz verknüpft ist, die eine Expression der Sequenz bewirken kann.

6. Verwendung gemäß Anspruch 5, bei der die Nukleinsäure Teil eines Expressionskonstruktes ist, das zur Transformation von Zielzellen in dem Patienten geeignet ist.

7. Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei der das TIMP-1, das Analogon, deren Fragmente oder eine entsprechende Nukleinsäure zur Behandlung von Th1-vermittelten Immunerkrankungen oder von Immunerkrankungen, die durch abnorm aktivierte Th2-Zellen oder aktivierte CD8-Zellen vermittelt werden, eingesetzt wird.

8. Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei der das TIMP-1, das Analogon, das Fragment oder die Nukleinsäure zur Behandlung von Multiple Sklerose, Morbus Crohn, akuter und chronischer Graft versus Host Erkrankungen, akuter Transplantatabstoßung, Typ-I Diabetes mellitus, rheumatoide Arthritis, Lyme-Arthritis, reaktive Yersinien-induzierte Arthritis, Fost-Streptokokken-Herzklappen- und Myokarderkrankungen, Hepatitis C-induzierte chronische Hepatitis, Hashimoto-Thyreoiditis, Grave's Ophthalmopathie, primäre sklerosierende Cholangitis, Helicobacter pylori induzierte Gastritis, zerebrale Malaria, Kontaktdermatitis, aplastische Anämie, immunologisch bedingte Aborte, Asthma bronchiale, Sonnenbrand, Heuschnupfen und allergische Erkrankungen eingesetzt wird.

9. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei TIMP-1, das Analogon, deren Fragmente oder eine entsprechende Nukleinsäure als Infusionslösung, Nasentropfen, Mundspülung, Inhalationsmittels, Tablette, Pflaster oder Creme vorliegt.

10. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, bei der TIMP-1, das Analogon, deren Fragmente oder eine entsprechende Nukleinsäure zur in vitro Behandlung von Transplantat- Gewebe vor der Transplantation eingesetzt wird.

11. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, bei dem man TIMP-1, ein TIMP-1 Analogon, deren Fragmente oder eine dafür kodierende Nukleinsäure mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger vermischt oder verbunden.

12. Spüllösung für Transplantate, umfassend TIMP-1, ein TIMP-1 Analogon, ein Fragment davon oder eine dafür kodierende Nukleinsäure und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.