WO2003013592A1 - Verwendung von timp-1 als immunosuppressivum - Google Patents

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WO2003013592A1
WO2003013592A1 PCT/EP2002/008733 EP0208733W WO03013592A1 WO 2003013592 A1 WO2003013592 A1 WO 2003013592A1 EP 0208733 W EP0208733 W EP 0208733W WO 03013592 A1 WO03013592 A1 WO 03013592A1
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PCT/EP2002/008733
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Wolfgang E. Berdel
Elisabeth Oelmann
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Berdel Wolfgang E
Elisabeth Oelmann
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    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to the use of a specific inhibitor of metalloproteinases (the so-called "tissue inhibitor of metalloproteinases 1"; hereinafter referred to as TIMP-1) for the production of a pharmaceutical composition for the treatment of diseases or disorders which are characterized by increased immunological activity.
  • tissue inhibitor of metalloproteinases 1 tissue inhibitor of metalloproteinases 1
  • the available agents usually have serious side effects.
  • the agents used for the treatment of graft rejection lead to a general suppression of all immunological reactions and therefore to a weakening of the defense against infectious diseases and an increased risk of malignant diseases occurring.
  • Some of the agents also have toxic side effects.
  • TIMP tissue inhibitors of metalloproteinases
  • Zinc-dependent peptidases including collagenases, gelatinases and stromelysins, are referred to as metallo- or matrix metalloproteinases (MMP).
  • MMP matrix metalloproteinases
  • the build-up and breakdown of the ECM structure is essential for both tissue development and pathological disorders.
  • the MMP therefore play an important role in the restructuring of the tissue, for example in morphogenesis, angiogenesis, tissue repair and in particular in the growth and migration of tumors (Docherty at al., Trends Biotechnol., 10: 200- 207, 1992; Matrisian LM, BioEs- says, 14: 455-463, 1992; Stetler-Stevenson et al., Annu. Rev. Cell. Biol., 9: 541-573, 1993; Stetler-Stevenson, WG, J Clin. Invest. 103: 1237-1241, 1999; DeClerck et al., Adv. Exp. Med.
  • TIMP a family of specific inhibitors
  • the inhibition takes place through the formation of irreversible, inactive complexes between TIMP and MMP (Cawston et al., Biochem. J., 211: 313-318, 1983).
  • TIMP-1 Docherty et al., Nature, 318: 66-69, 1985
  • TIMP-2 Boone et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2800-2804, 1990
  • TIMP-3 Apte et al., Genomics, 19: 86-90, 1994; Silbiger et al., Gene , 141: 293-297, 1994; Uria et al., Cancer Res., 54: 2091-2094, 1994; Wilde et al., DNA Cell. Biol., 13: 711-718, 1994
  • TIMP-4 Greene et al., J. Biol. Chem., 271: 30375-30380, 1996.
  • TIMP TIMP-alpha
  • steroids growth factors and cytokines, such as IL-1, IL-6, IL-10, leukemia inhibitory factor, neurotrophic factor, oncostatin M, TNF-alpha and epidermal growth factor
  • cytokines such as IL-1, IL-6, IL-10, leukemia inhibitory factor, neurotrophic factor, oncostatin M, TNF-alpha and epidermal growth factor
  • each TIMP has other properties that differ from TIMP to TIMP.
  • TIMP-1 is primarily active in B cells and B cell lymphomas, while the expression of TIMP-2 is restricted to T cells.
  • TIMP-1 and -2 have a proteinase inhibitor domain at the NH 2 end and a growth factor domain at the COOH end. The proteinase inhibitors, however, act on different proteinases.
  • TIMP-2 inhibits MMP2, a proteinase that specifically cleaves the basement membrane of collagen IV (the collagen of the basement membrane of vessels). The MMP2 function is essential for lymphocytes as it enables them to exit the vascular wall.
  • TIMP-1 inhibits MMP-1, -3 and -9, proteinases that primarily cleave collagen III, but have no effect on vessel walls.
  • TIMP-1 and -2 have a total homology of about 40%, the greatest homology being in the area of the domain responsible for the proteinase inhibitor activity (Fernandez-Catalan et al., EMBO J., 17, 5238-48, 1998; Greene et al., J. Biol. Chem., 271, 30375-80, 1996; Hayakawa et al., J. Cell. Sei., 107, 2373-9, 1994).
  • TIMP-1 was known to induce B cell differentiation (Guedez et al., J. Clin. Invest., 102: 2002-2010, 1998; Guedez et al., Blood, 92: 1342-1349, 1998 ).
  • TIMP-2 can be used for the treatment of allergic inflammation, in particular inflammation of the skin or atopic dermatitis (JP 2000086533). It has also recently been reported that TIMP-2 has the ability to induce apoptosis in activated peripheral T cells. No apoptosis was induced in non-stimulated T cells. In this context, it was also found that this was a TIMP-2-specific effect. In these studies, TIMP-1 had no apoptotic effect on activated T cells (Lim et al., PNAS, Vol. 878 (1999), pp. 522-523).
  • TIMP-1 also has an immunosuppressive activity. has.
  • the present invention thus relates to the use of
  • TIMP-1 a protein with the in Fig. 2 of the publication Dockerty et al. (Nature, 318: 66-69, 1985) disclosed amino acid sequence referred to as TIMP-1.
  • the TIMP-1 analogs are naturally occurring variants of the TIMP-1 or those created using chemical or recombinant methods, but the differences in the amino acid sequence essentially have the same immunosuppressive activity.
  • Corresponding analogs have a degree of homology of at least 50%, preferably at least 70%, compared to the TIMP-1 amino acid sequence.
  • the TIMP-1 analogs have a degree of homology of at least 80%, in particular at least 95%, to the TIMP-1 amino acid sequence.
  • the degree of homology is determined by writing the two sequences one above the other, four gaps of a length of 100 amino acids being possible in order to achieve the greatest possible agreement between the sequences to be compared (cf. also Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, 124, 1972). The percentage of the amino acid residues of the shorter of the two amino acid chains is then determined, which faces identical amino acid residues on the other chain.
  • a large number of methods are known in the prior art by means of which proteins and peptides are modified, for example by derivatizing individual groups of the amino acids or by binding to macromolecules (for example PEG and PEG derivatives or other proteins for the production of fusion proteins). The derivatization is said to give the peptides advantageous properties (improved stability, etc.). Corresponding derivatives of the above-mentioned peptides are covered by the present invention and are also referred to as TIMP-1 analogs.
  • a TIMP-1 analog has the same immunosuppressive activity as TIMP-1 when it measures at least 65 the T cell-mediated cytotoxicity in a mixed lymphocyte culture using the chromium release detection method %, preferably at least 75%, in particular at least 85% inhibited (the inhibition being set as 100% by TIMP-1).
  • the mixed lymphocyte culture can be carried out as in the examples below (see Example 1) and by methods known in the art (see Kägi et al., Science, 265, 528-530, 1994; and Löwin et al. , Nature, 370, 650-652, 1994).
  • TIMP-1 or the analogs can of course also be used in the context of the present invention.
  • the fragment can be of any size provided that it has the same immunosuppressive activity as TIMP-1.
  • the fragment has a length of at least 3 amino acids, preferably a length of at least 5 amino acids, a length of 10 to 20 amino acids being particularly preferred.
  • TIMP-1 analogs and fragments mentioned here can be generated by the person skilled in the art, for example, by recombinant production after the introduction of substitutions or deletions in the known TIMP-1 nucleic acid sequence.
  • the analogs can be generated by chemical synthesis. In any case, it is a simple immunosuppressive activity of analogues to determine.
  • Corresponding TIMP-1 analogs and fragments are therefore readily available to the person skilled in the art.
  • the present invention relates to the use of a nucleic acid which codes for TIMP-1, a TIMP-1 analog or a fragment thereof for the production of a pharmaceutical composition for the treatment of diseases or disorders which are characterized by an increased immunological activity .
  • a nucleic acid which codes for TIMP-1, a TIMP-1 analog or a fragment thereof for the production of a pharmaceutical composition for the treatment of diseases or disorders which are characterized by an increased immunological activity .
  • vectors based on retroviruses were used (cf. Dao et al., Int. J. Mol. Med., 1, 257-264, 1998; and Pollok et al. , Curr. Op. Mol. Ther., 1, 595-604, 1999).
  • Vectors based on SV40 and HSV have also been used in the prior art for in vitro and in vivo gene transfer to certain eukaryotic cells (Strayer, DS, J. Cell. Physiol., 181, 375-384, 1999; and Stevenson et al., Semin. Hemol., 36, 38-42, 1999).
  • the present invention comprises the use of corresponding nucleic acid-based methods in the medical use of TIMP-1, its analogs and fragments.
  • the nucleic acids can be, for example, RNA or DNA, preferably a DNA is used.
  • the nucleic acid coding for TIMP-1, for the TIMP-1 analog or for one of the fragments with immunosuppressive activity is preferably operatively linked to a regulatory sequence which can effect the expression of the coding sequence.
  • the regulatory sequence is like this designed that the coding sequences are expressed exclusively in selected target cells.
  • Pathologic conditions or disorders that are characterized by an increased immunological activity are easily identified by the specialist.
  • a characteristic of a corresponding illness or disorder is, for example, the lysis of the body's own organs or cells by lymphocytes.
  • Diseases characterized by increased immunological activity can be, for example, autoimmune diseases.
  • conditions or disorders which are characterized by an increased immunological activity can be characterized by an excessive release of mediator substances. Examples of such conditions are allergic diseases in which mediators such as cytokines, etc. are released by lymphocytes, causing the disease (hay fever, asthma, etc.).
  • TIMP-1 does not induce T cell apoptosis, but rather activates for inhibitory T cells (for example CD4, Th2 cells, which the Express transcription factor Gata-3) and / or have an inhibitory effect on activating T cells (for example CD4, Thl cells and activated, TZFP-positive lymphocytes).
  • inhibitory T cells for example CD4, Th2 cells, which the Express transcription factor Gata-3
  • TZFP-positive lymphocytes for example CD4, Thl cells and activated, TZFP-positive lymphocytes.
  • TIMP-1 appears to reduce or block the degranulation of activated cells and thus the release of toxic substances.
  • EDN eosinophile derived neurotoxin
  • eosinophilic granulocytes from patients with allergic rhinitis
  • TIMP-2 the results of the present application show a protective effect on the cell populations examined.
  • TIMP can have a protective effect on the target cell population (inhibition of the Apoptosis) by inhibiting toxic substances such as perforin.
  • Active substances that have an immunosuppressive effect without inducing apoptosis in T cells are of particular pharmacological interest since they offer the possibility of achieving immunosuppression without inducing a general and persistent immune deficiency.
  • the use according to the invention of the TIMP-1, the TIMP-1 analogue, their fragments or the corresponding nucleic acid thus includes, among other things, the use for the treatment of immune diseases which are activated by Thl cells, abnormally activated Th2 cells, activated CD8 or CD4 Cells, activated eosinophilic granulocytes, mast cells and / or abnormally secreting cells (such as epithelial cells of the nose and the bronchial system).
  • immune diseases which are activated by Thl cells, abnormally activated Th2 cells, activated CD8 or CD4 Cells, activated eosinophilic granulocytes, mast cells and / or abnormally secreting cells (such as epithelial cells of the nose and the bronchial system).
  • the TIMP-1, the TIMP-1 analogue, their fragments or a corresponding nucleic acid can in particular be used to produce a pharmaceutical composition for the treatment of multiple sclerosis, Crohn's disease, acute and chronic graft versus host diseases, acute graft rejection, type I diabetes mel- litus, rheumatoid arthritis, Lyme arthritis, reactive Yersinia-induced arthritis, post-streptococcal valve and myocardial diseases, hepatitis C-induced chronic hepatitis, Hashimoto's thyroiditis, Grave's ophthalmopathy, primary sclerosing cholangylitis, helicobobia , cerebral malaria, contact dermatitis, aplastic anemia, immunological abortions, bronchial asthma, allergic skin conditions, sunburn or hay fever.
  • TIMP-1 has been found to be overexpressed in lymph nodes from patients with Hodgkin's disease.
  • the protein according to the invention should therefore preferably not be administered to patients with B-cell lymphomas.
  • TIMP-1, the TIMP-1 analogue, their fragments or a corresponding nucleic acid can be applied in any of the known pharmaceutical forms.
  • Application in the form of an injection solution, infusion solution, nasal drops, nasal spray, drops, mouthwash, inhalation agent, tablet, plaster or cream is preferred.
  • the present invention also relates to methods for producing a medicament for the treatment of diseases or disorders which are characterized by an increased immunological activity.
  • This can be, in particular, a solution for infusion, a solution for injection, a tablet, a plaster or a cream.
  • TIMP-1, a TIMP-1 analogue, its fragments or a nucleic acid coding therefor are mixed with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • TIMP-1 the TIMP-1 analog, its fragment or a corresponding nucleic acid
  • TIMP-1 can be used for the in vitro treatment of graft tissue or organs before the transplantation.
  • a rinsing solution for transplants is created that contains the active ingredient mentioned.
  • T cell purging can be achieved by this procedure.
  • Fig. 1 results of the allogeneically activated, mixed lymphocyte culture, the inhibition of lysis by TIMP being shown as a percentage of specific chromium release.
  • Fig. 2 Results of the FACS analysis of the influence of rhTIMP-1 on the apoptosis of activated lymphocytes.
  • Fig. 3 DNA synthesis rate of mixed allogeneically stimulated lymphocyte cultures in the presence and absence of rhTIMP-1.
  • Fig. 4 DNA synthesis rate of mixed allogenously stimulated lymphocyte cultures in the presence and absence of rhTIMP-1.
  • Fig. 5 DNA synthesis rate of mixed allogeneically stimulated lymphocyte cultures in the presence and absence of rhTIMP-1 after separation of the lymphocytes in subpopulations.
  • Fig. 7 Inhibition of the cytotoxic effect of perforin on a human T cell line (Jurkat) by rhTIMP-1.
  • Fig. 8 Inhibition of perforin-induced intracellular Ca influx by rhTIMP-1.
  • the mixed lymphocyte cultures were prepared according to methods known in the art (Kägi et al., Science, 265: 528-530, 1994; and Löwin et al. , Nature, 370: 650-652, 1994).
  • blood was obtained from various non-histocompatible, healthy donors (stimulator and responder) and Ficoll was added.
  • the interphase cells were isolated and washed twice.
  • Mononuclear cells functioning as stimulators were irradiated with 30 Gy.
  • the stimulation was carried out in a test with CD14-enriched (MACS, CD14 microspheres, Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Germany) and irradiated cells.
  • CD14-enriched CD14 microspheres, Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Germany
  • 8 x 10 irradiated stimulator and 2 x 10 7 living responder cells were mixed with one another over 5 days in 15 ml RPMI 1640 medium with 2 mM glutamine and 10% FCS in 50 ml Falcon tubes with constant shaking (once a day) incubated (pH 7.2, 37 ° C, 5% C0 2 , high humidity).
  • E cells in the specified E: T amount in the presence of rhTIMP-1 or rhTIMP-2 or a vehicle filled as a control.
  • the microtiter plates were incubated for 4 hours (pH 7.2, 37 ° C, 5% CO 2 , high humidity) and centrifuged at 200 G for 5 minutes. Aliquots of the supernatants were then examined for radioactivity.
  • the maximum chromium release was measured after lysis of the marked stimulator cells (corresponds to the target cells, "target cells” or T) using Triton X 100 treatment of the wells. The spontaneous release of chromium was measured on target cells which had only been left in medium.
  • an experiment was set up in which autologous (HLA-A2 positive) PHA-stimulated lymphocytes with a melanoma-associated nonapeptide (IMDQVPFSV, a gplOO peptide that was changed in position 2 to improve affinity compared to the native peptide for HLA-A * 0201 binding sites; see Parkhurst, MR, J. Immunol., 157: 2539-2548, 1996) as a stimulator / target cell.
  • IMDQVPFSV a melanoma-associated nonapeptide
  • FIG. 1 shows, by way of example, results which were obtained when the chromium release detection was carried out after mixed lymphocyte culture. As this figure clearly shows, both rhTIMP-1 and rhTIMP-2 only inhibit the T-mediated cytotoxicity against different target cells
  • mixed, mononuclear cells were isolated and stimulated analogously to the protocol for mixed lymphocyte cultures. 5 Days after the start of the experiment, 1 ⁇ 10 5 cells per test condition (staining with lymphocyte subpopulation-specific antibodies against CD3, CD4 or CD8) were stained with Annexin-V and propium iodide according to standard methods (FACS Calibur, Becton Dickinson) in order to distinguish between apoptotic and dead cells to be able to distinguish. The cell suspension was left in the dark at 4 ° C for one hour and analyzed using a FACS analyzer (FACS Calibur, Becton Dickinson). The further evaluation was carried out using CellQuest and Paint-A-Gate 3.0 software on a Macintosh PC.
  • TIMP-1 did not lead to a significant decrease in thymidine uptake. An increase in proliferation tended to be shown, although this was not statistically significant. However, these results show that no induced cell death can be observed in the relevant cell population (cf. FIGS. 3 and 4).
  • This example describes the analysis of the influence of TIMP-1 on the quantitative RNA synthesis rate of the transcription factors Gata-3 and TZFP ("testis zinc finger protein” or "repressor of Gata-3") in mixed allogeneic lymphocyte cultures.
  • CD4-Th2 cells play either a minor - or even an inhibitory role in this process. Recognizing features for fundamentally activated T lymphocytes is the transcription factor TZFP, which binds and inactivates Gata-3 as a repressor protein. Gata-3, on the other hand, is found almost exclusively in CD4-Th2 cells in differentiated cells and should therefore rather fall off during an allogeneically stimulated condition.
  • RNA per batch was transcribed to cDNA using a primer (random hexamers) and the use of Superscript II reverse transcriptase.
  • the cDNA was diluted 1: 200 ⁇ l with ddH 2 0.
  • the 5 ⁇ -3 nuclease activity of the Taq polymerase cleaves the sample and thus leads to the release of the fluorescent dyes (FAM, VIC), which can be measured by the laser detector of the PCR cycler. After exceeding a threshold value, the fluorescence achieved is proportional to the amount of the PCR product generated.
  • Each examined 96-well microtiter plate contained 12 standard samples (dilution series of resting lymphocytes).
  • the relative gene expression of each sample was calculated using the standard curve for each condition.
  • the constantly expressed genes such as GAPDH and 18S-RNA served as additional controls for the calculation as well as for comparing the quality of the cDNA.
  • nucleotides were used as PCR primers and as probes for the transcripts to be examined (corresponding primers and probes for GAPDH and 18S-RNA are commercially available):
  • Primer 5 -3 direction 5 ⁇ ata-gca-ccc-cca-cca-ctg-g-3
  • Th2-specific transcription factor Gata-3 is significantly increased by rhTIMP-1, which suggests an increased presence of Th2 cells, which cannot be detected under normal stimulation conditions.
  • Perforin is a glycoprotein that is secreted from activated cytotoxic cells (CTLs, NK cells) and leads to cell death (necrosis) in target cells by forming pores in the membrane.
  • CTLs activated cytotoxic cells
  • NK cells cytotoxic cells
  • a first consequence of this pore formation is the inflow of ions, e.g. calcium, from outside to inside into the target cells.
  • FACS analysis This principle is used to measure propidium iodide (PI) stained cells and to analyze them using FACS, since PI can only be absorbed into dead cells or cells with a membrane that is no longer intact.
  • the Jurkat T-cell line was incubated in a concentration of 1 ⁇ 10 ⁇ cells / ml with 20 ng / ml perforin for 4 hours at 37 ° C. and then stained with PI using standard methods (FACS Calibur, Becton Dickinson). As a control, the same volume of 1 ⁇ PBS was used instead of perforin.
  • TIMP-1 condition The batches designated as "TIMP-1 condition" were preincubated with 500ng / ml rhTIMP-1 for 1 h at 37 ° C. and then pipetted into the perforin or perforin and rhTIMP-1 in the stated concentrations were added together at the start of the 4 h incubation pipetted into the cells.
  • Trypan blue staining Trypan blue is a dye that cannot penetrate intact cell membranes and only stains blue cells that are either dead or have holes in the membrane. The cells were incubated according to the above-mentioned conditions (control, perforin, TIMP-1, perforin + TIMP-1) for 30 minutes at 37 ° C. and then stained with this dye. For this, 50 ⁇ l of cell suspension (1 ⁇ 10 cells / ml) were mixed with 450 ⁇ l of Trypan blue and evaluated under the microscope.
  • rhTIMP-1 is capable of the perforation-induced pore formation in the membrane of the Jurkat cell line and the subsequent necrosis. inhibit induction.
  • rhTIMP-1 was able to inhibit 10-56% of the necrosis induced by perforin and the apoptosis induced by perforin + granzyme B in all approaches.
  • glycoprotein perforin induces hole formation in membranes of human cells, which leads to the influx of calcium from outside (from the buffer) into the cells.
  • This calcium influx can be represented by staining the cells with the dye Fura-2, which accumulates intracellularly and when Ca flows into the cells, the Ca binds and at that moment increases its fluorescence properties.
  • the different fluorescence between bound and unbound calcium is measured in a fluorescence spectrometer.
  • Eosinophilic granulocytes from allergic patients are also an example of an activated cell of the immune system with a corresponding hyperfunction.
  • the induction of this secretion by eotaxin and IL-5 is described in detail in the literature (Fusjisawa, T. et al. J. Allergy Clin Immunol 2000).
  • rhTIMP-1 To check the function of rhTIMP-1 on these cells, we first isolated granulocytes according to standard Milteniy protocols from heparinized blood from patients with allergic rhinitis using Ficoll purification and further enriched the eosinophilic granulocytes from this population using CD16 depletion.
  • eosinophilic granulocytes were then either stained with Fura-2 and subjected to calcium fluorescence measurement under the influence of eotaxin or incubated in a 96-well microtiter plate with the cytokine / chemokine indicated below (eotaxin 1 x 10 mol / 1; IL-5 2.5 ng / ml; eotaxin and IL-5 +/- rhTIMP-l).
  • the supernatants from these cultures were frozen and then examined for the presence of the EDN protein using an ELISA.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von (a) TIMP-1; (b) einem TIMP-1 Analogon; (c) eines Fragmentes von (a) oder (b) mit immunsuppressiver Aktivität; oder (d) einer Nukleinsäure, die für eines der in (a) bis (c) genannten Peptide kodiert; zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Erkrankungen oder Störungen, die durch eine erhöhte immunologische Aktivität gekennzeichnet sind.

Description

VERWENDUNG VON TIMP-1 ALS IMMUNOSUPPRESSIVUM
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines bestimmten Inhibitors der Metalloproteinasen (des sogenannten "tissue inhibitor of metalloproteinases 1"; nachfolgend als TIMP-1 bezeichnet) zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Erkrankungen oder Störungen, die durch eine erhöhte immunologische Aktivität gekennzeichnet sind.
Die Anzahl der Organ und Gewebe- Transplantationen zwischen verschiedenen Individuen (Allotransplantationen) hat in den letzten Jahren stark zugenommen. Der Erfolg einer entsprechenden Transplantation wird derzeit im wesentlichen durch Art und Umfang der Abstoßungsreaktion durch das Immunsystem des Empfängers bestimmt. Die Transplantatabstoßung muß in jedem Fall der Allo- transplantation durch Immunsuppression gehemmt werden. Immunsuppressive Wirkstoffe, beispielsweise Kortikosteroide, Antimetabolite, Antilymphozytenserum, Anti-IL-2-Rezeptor-Antikörper oder Ciclosporin, werden im klinischen Alltag für die Inhibierung der Transplantatabstoßung sowie zur Behandlung einer Vielzahl weiterer Erkrankungen und Störungen eingesetzt. Beispielsweise werden Autoimmunerkrankungen und alle Immunreaktionen der akuten Phase mit Immunsuppressiva behandelt (vgl. Pschy- rembel, Klinisches Wörterbuch) .
Eine Reihe von biotechnologisch hergestellten immunsuppressiven Mitteln auf Peptidbasis, meist Antikörper, sind inzwischen zur Behandlung verschiedener Erkrankungen zugelassen worden (vgl. Remicade, Anti-TNF-Alpha-Antikörper der Essex Pharma; Orthoclo- ne, Anti-CD3-Antikörper von Janssen-Cilag; Keliximab, Anti-CD4- Antikörper von SmithKline Beecham, etc.).
Die verfügbaren Mittel weisen jedoch in der Regel schwerwiegende Nebenwirkungen auf . Insbesondere die für die Behandlung der Transplantatabstoßung verwendeten Mittel führen zu einer generellen Unterdrückung aller immunologischen Reaktionen und daher zu einer Schwächung der Abwehr gegen Infektionskrankheiten und einer erhöhten Gefahr des Auftretens bösartiger Erkrankungen. Ein Teil der Mittel weist ferner toxische Nebenwirkungen auf .
Insbesondere die Verabreichung von "Fremdproteinen" an Menschen, also von Proteinen nicht-menschlichen Ursprungs (beispielsweise urine Antikörper) , führt in vielen Fällen zu unerwünschten Nebenwirkungen, wie Anaphylaxie, Sensibilisierung, erhöhte Thromboseneigung durch Entstehung von Immunkomplexen und einem allgemeinen Zytokin-Release-Syndrom. Ferner bildet das Immunsystem der Menschen, die einer entsprechenden Behandlung ausgesetzt werden, Antikörper gegen diese Fremdproteine, wodurch eine Neutralisierung derselben erfolgt . Fremdproteine können daher nur über sehr kurze Zeit eingesetzt werden.
Aufgrund der apoptotischen Wirkung auf Lyphozyten führt die Verabreichung von Steroiden bei den Betroffenen zu einer gefähr- liehen allgemeinen Immunschwäche. Es besteht daher ein Bedarf an neuen immunsuppressiven Wirkstoffen.
Eine Grupe multifunktioneller Proteine wurde aufgrund der Fä- higkeit Metalloproteinasen im Gewebe zu inhibieren als TIMP ("tissue inhibitors of metalloproteinases") bezeichnet (Corco- ran, M.L. und Stedler, W.G., J. Biol . Chem. 270, S. 13453-13459, 1995) . Als Metallo- oder Matrixmetalloproteinasen (MMP) werden Zink-abhängige Peptidasen, darunter Kollagenasen, Gelatinasen und Stromelysine bezeichnet. Diese Proteinasen sind unter anderem in der Lage, die Bestandteile der extrazellulären Matrix (ECM) abzubauen.
Sowohl bei der Gewebe-Entwicklung als auch bei pathologischen Störungen ist der Auf- und Abbau der ECM-Struktur von wesentlicher Bedeutung. Die MMP spielen daher eine wichtige Rolle bei der Umstrukturierung des Gewebes, beispielsweise bei der Morpho- genese, der Angiogenese, der Reparatur des Gewebes und insbesondere beim Wachstum und der Wanderung von Tumoren (Docherty at al., Trends Biotechnol., 10: 200-207, 1992; Matrisian LM, BioEs- says, 14: 455-463, 1992; Stetler-Stevenson et al . , Annu. Rev. Cell. Biol., 9: 541-573, 1993; Stetler-Stevenson, W.G., J. Clin. Invest., 103: 1237-1241, 1999; DeClerck et al . , Adv. Exp. Med. Biol., 425: 89-97, 1997; Jones, J.L. und Walker, R.A. , J. Pathol., 183: 377-379, 1997; Westermarck, J. und Kähäri, V.M., FASEB J., 13: 781-792, 1999; Polette, M. und Birembaut, P., Int. J. Biochem. Cell. Biol., 30: 1195-1202, 1998).
Die meisten MMPs werden als Zymogen sekretiert und durch weitere Proteinasen aktiviert. Die Aktivität der MMP wird anschließend jedoch primär durch eine Familie spezifischer Inhibitoren (den TIMP) reguliert. Die Inhibierung erfolgt durch Ausbildung irreversibler, inaktiver Komplexe zwischen TIMP und MMP (Cawston et al., Biochem. J. , 211: 313-318, 1983).
Bisher wurden vier TIMP-Typen identifiziert und kloniert, nämlich TIMP-1 (Docherty et al., Nature, 318: 66-69, 1985), TIMP-2 (Boone et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87: 2800-2804, 1990), TIMP-3 (Apte et al . , Genomics, 19: 86-90, 1994; Silbiger et al . , Gene, 141: 293-297, 1994; Uria et al . , Cancer Res . , 54: 2091- 2094, 1994; Wilde et al . , DNA Cell. Biol., 13: 711-718, 1994) und TIMP-4 (Greene et al . , J. Biol. Chem. , 271: 30375-30380, 1996) .
Die strukturellen Eigenschaften einiger TIMP, sowie deren Wirkungsweise bei der MMP-Inhibierung mittels Komplexbildung wurden im Detail untersucht (Tuuttila et al . , J. Mol. Biol., 284: 1133- 1140, 1998; Bode et al . , Cell. Mol. Life Sei., 55: 639-652, 1999; Gomis-Rüth at al . , Nature 389: 77-81, 1997). Eine ausgeglichene Balance zwischen MMP und TIMP ist physiologisch von großer Bedeutung. Dafür werden die TIMP-Mengen durch Steroide, Wachstumsfaktoren und Zytokine, wie beispielsweise IL-1, IL-6, IL-10, Leukämie-inhibitorischer Faktor, Neurotrophischer Faktor, Oncostatin M, TNF-alpha und epidermaler Wachstumsfaktor reguliert (Fabunmi et al., Biochem. J. , 315: 335-342, 1996; Roeb et al., FEBS Letters, 349: 45-49, 1994; Nemoto et al . , Arthritis Rheumatism, 39: 560-566, 1996; Lotz, M. und Guerne, P.A., J. Biol. Chem., 266: 2017-2020, 1991; Hosono et al . , FEBS Letters, 381: 115-118, 1996; Lacraz et al . , J. Clin. Invest., 96: 2304- 2310, 1995; Shingu et al . , Clin. Exp. Immunol . , 94: 145-149, 1993) .
Neben der übereinstimmenden Ativität der Proteinase-Inhibierung weist jedes TIMP jedoch weitere Eigenschaften auf, die von TIMP zu TIMP verschieden sind. TIMP-1 ist primär in B-Zellen und B-Zeil-Lymphomen aktiv, während die Expression von TIMP-2 auf T- Zellen beschränkt ist. TIMP-1 und -2 weisen am NH2-Ende eine Proteinase-Inhibitor-Domäne und am COOH-Ende eine Wachstumsfaktor- Domäne auf. Die Proteinase-Inhibitoren wirken jedoch auf unterschiedliche Proteinasen. TIMP-2 inhibiert MMP2, eine Proteinase, die spezifisch die Basalmembran des Kollagen IV (das Kollagen der Basalmembran von Gefäßen) spaltet. Die MMP2-Funktion ist essentiell für Lymphozyten, da es diesen ermöglicht, aus der Gefäßwand auszutreten. TIMP-1 inhibiert MMP-1, -3 und -9, Proteinasen, die primär Kollagen III spalten, aber keinen Einfluß auf Gefäßwände haben.
TIMP-1 und -2 weisen eine Gesamthomologie von etwa 40% auf, wobei die größte Homologie im Bereich der für die Proteinase- Inhibitor-Aktivität verantwortlichen Domäne vorliegt (Fernandez- Catalan et al., EMBO J. , 17, 5238-48, 1998; Greene et al . , J. Biol. Chem., 271, 30375-80, 1996; Hayakawa et al . , J. Cell. Sei. , 107, 2373-9, 1994) .
Sowohl die Überexpression von TIMP-1 in Non-Hodgkin-Lymphomen (NHL) als auch deren Übereinstimmung mit der klinischen Aggressivität der Erkrankung wurde im Stand der Technik beschrieben (Kossakowska et al., Blood, 77: 2475-2481, 1991). Ferner war be- kannt, dass die Bewegung der Lymphozyten durch das Gleichgewicht zwischen den von diesen Zellen erzeugten MMP und TIMP bestimmt wird (Johnatty et al., J. Immunol . , 158: 2327-2333, 1997; und Borland et al . , J. Biol. Chem., 274: 2810-1815, 1999). Schließlich wußte man, dass TIMP-1 die Differenzierung der B-Zellen induziert (Guedez et al . , J. Clin. Invest., 102: 2002-2010, 1998; Guedez et al . , Blood, 92: 1342-1349, 1998).
Im Stand der Technik finden sich Tierversuche, die zeigen, dass TIMP-2 für die Behandlung allergischer Entzündungen, insbesonde- re Entzündungen der Haut oder der atopischen Dermatitis verwendet werden kann (JP 2000086533) . Kürzlich wurde auch berichtet, dass TIMP-2 die Fähigkeit besitzt, Apoptose in aktivierten peri- pheren T-Zellen zu induzieren. In nicht-stimulierten T-Zellen wurde keine Apoptose induziert. In diesem Zusammenhang wurde ferner festgestellt, dass es sich dabei um eine TIMP-2 spezifische Wirkung handelte. TIMP-1 wies in diesen Untersuchungen keine apoptotische Wirkung auf aktivierte T-Zellen auf (Lim et al., PNAS, Vol. 878 (1999), S. 522-523).
Demgegenüber offenbart die vorliegende Erfindung überraschenderweise, dass auch TIMP-1 eine immunsuppressive Aktivität auf- weist. Die vorliegende Erfindung betrifft somit die Verwendung von
(a) TIMP-1;
(b) einem TIMP-1 Analogon;
(c) eines Fragmentes von (a) oder (b) mit derselben immun- suppressiven Aktivität wie TIMP-1; oder
(d) einer Nukleinsäure, die für eines der in (a) bis (c) genannten Peptide kodiert;
zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Erkrankungen oder Störungen, die durch eine erhöhte immunologische Aktivität gekennzeichnet sind.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird ein Protein mit der in Fig. 2 der Veröffentlichung Docherty et al. (Nature, 318: 66-69, 1985) offenbarten Aminosäuresequenz als TIMP-1 bezeichnet. Demgegenüber handelt es sich bei den TIMP-1 Analoga um natürlich vorkommende oder mittels chemischer oder rekombinanter Verfahren erstellte Varianten des TIMP-1, die Unterschiede in der Aminosäuresequenz aber im wesentlichen dieselbe immunsuppressive Aktivität aufweisen. Entsprechende Analoga haben im Vergleich zu der TIMP-1 Aminosäuresequenz einen Homologiegrad von mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 70% auf. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die TIMP-1 Analoga einen Homologiegrad von mindestens 80 %, insbesondere mindestens 95% zu der TIMP-1 Aminosäuresequenz auf. Die Bestimmung des Homologiegrades erfolgt, indem man die beiden Sequenzen übereinander schreibt, wobei vier Lücken auf einer Länge von 100 Aminosäuren möglich sind, um größtmögliche Übereinstimmung der zu vergleichenden Sequenzen zu erzielen (vgl. auch Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, 124, 1972) . Anschließend wird der Prozentsatz der Aminosäurereste der kürzeren der beiden Aminosäureketten ermittelt, der identischen Aminosäureresten auf der anderen Kette gegenübersteht . Im Stand der Technik sind eine Vielzahl an Verfahren bekannt, mittels derer Proteine und Peptide, beispielsweise durch Deriva- tisierung einzelner Gruppen der Aminosäuren oder durch Bindung an Makromoleküle (z.B. PEG und PEG-Derivate oder andere Proteine zur Herstellung von Fusionsproteinen) modifiziert werden. Durch die Derivatisierung sollen die Peptide vorteilhafte Eigenschaften (verbesserte Stabilität, etc.) erhalten. Entsprechende Derivate der oben genannten Peptide sind von der vorliegenden Erfindung erfaßt und werden ebenfalls als TIMP-1 Analoga bezeichnet.
Ein TIMP-1 Analogon weist für die Zwecke der vorliegenden Erfindung dieselbe immunsuppressive Aktivität wie TIMP-1 auf, wenn es die T-Zell-vermittelte Zytotoxizität in einer gemischten Ly phozyten-Kultur gemessen mittels des Chrom-Freisetzungs-Nach- weisverfahrens zu mindestens 65%, vorzugsweise zu mindestens 75%, insbesondere zu mindestens 85% inhibiert (wobei die Inhibierung durch TIMP-1 als 100% gesetzt wird) . Die gemischte Lymphozyten-Kultur kann wie in den nachfolgenden Beispielen (vgl. Beispiel 1) und nach im Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden (vgl. Kägi et al . , Science, 265, 528-530, 1994; und Löwin et al . , Nature, 370, 650-652, 1994).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können natürlich auch Fragmente des TIMP-1 oder der Analoga verwendet werden. Das Fragment kann eine beliebige Größe aufweisen, sofern es dieselbe immunsuppressive Aktivität wie TIMP-1 hat. Das Fragment weist eine Länge von mindestens 3 Aminosäuren, vorzugsweise eine Länge von mindestens 5 Aminosäuren auf, wobei eine Länge von 10 bis 20 Aminosäuren besonders bevorzugt ist.
Die hier angesprochenen TIMP-1 Analoga und Fragmente können vom Fachmann beispielsweise durch rekombinante Herstellung nach Einführung von Substitutionen oder Deletionen in der bekannten TIMP-1 Nukleinsäure-Sequenz erzeugt werden. Alternativ dazu können die Analoga durch chemische Synthese erzeugt werden. In jedem Fall ist es ein einfaches die immunsuppressive Aktivität der Analoga zu bestimmen. Entsprechende TIMP-1 Analoga und Fragmente sind für den Fachmann somit ohne weiteres verfügbar.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Nukleinsäure, die für TIMP-1, ein TIMP-1 Analogon oder ein Fragment davon kodiert, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Erkrankungen oder Störungen, die durch eine erhöhte immunologische Aktivität gekennzeichnet sind. Im Stand der Technik sind ver- schiedene Verfahren bekannt, mittels derer Nukleinsäuren unmittelbar oder in Kombination mit einem Träger zur in vitro und in vivo Transformation von Zellen und damit zur Behandlung von Erkrankungen verwendet werden.
Zum gezielten Gentransfer in eukaryotische Zellen des hämatopoe- tischen Systems wurden beispielsweise Vektoren verwendet, die auf Retroviren basieren (vgl. Dao et al., Int. J. Mol. Med. , 1, 257-264, 1998; und Pollok et al . , Curr. Op. Mol. Ther. , 1, 595- 604, 1999) . Auch auf SV40 und HSV basierende Vektoren sind im Stand der Technik bereits in vitro und in vivo für den Gentransfer in bestimmte eukaryotische Zellen genutzt worden (Strayer, D.S., J. Cell. Physiol., 181, 375-384, 1999; und Stevenson et al., Semin. Hemol . , 36, 38-42, 1999).
Die vorliegende Erfindung umfaßt den Einsatz entsprechender auf Nukleinsäuren basierender Verfahren bei der medizinischen Verwendung von TIMP-1, dessen Analoga und Fragmente. Bei den Nukleinsäuren kann es sich beispielsweise um RNS oder DNS handeln, vorzugsweise wird eine DNS verwendet .
In dieser Ausführungsform ist die für TIMP-1, für das TIMP-1 Analogon oder für eines der Fragmente mit immunsuppressiver Aktivität kodierende Nukleinsäure vorzugsweise operativ mit einer regulatorisehen Sequenz verknüpft, welche die Expression der kodierenden Sequenz bewirken kann. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die regulatorische Sequenz so ausgestaltet, dass eine Expression der kodierenden Sequenzen ausschließlich in ausgewählten Zielzellen erfolgt.
Krankhafte Zustände oder Störungen, die durch eine erhöhte immu- nologische Aktivität gekennzeichnet sind, sind vom Facharzt ohne weiteres zu identifizieren. Ein Merkmal einer enstprechenden Erkrankung oder Störung ist beispielsweise die Lyse von Körpereigenen Organen oder Zellen durch Lymphozyten. Bei Erkrankungen, die durch eine erhöhte immunologische Aktivität gekennzeichnet sind, kann es sich beispielweise um Autoimmunerkrankungen handeln. Alternativ oder zusätzlich dazu können Zustände oder Störungen, die durch eine erhöhte immunologische Aktivität gekennzeichnet sind, durch eine überhöhte Freisetzung von Mediator- Substanzen gekennzeichnet sein. Beispiele für entsprechende Zustände sind allergische Erkrankungen, bei denen unter anderem durch Lymphozyten Mediatoren, wie Zytokine, etc., feigesetzt werden, wodurch die Erkrankung (Heuschnupfen, Asthma, etc.) verursacht wird.
Die vorläufige Analyse der immunsuppressiven Wirkung des TIMP-1 weist darauf hin, dass TIMP-1 im Gegensatz zu TIMP-2 keine T- Zell-Apoptose induziert, sondern aktivierend auf inhibitorische T-Zellen (beispielsweise CD4-, Th2-Zellen, welche den Transkriptionsfaktor Gata-3 exprimieren) und/oder hemmend auf aktivieren- de T-Zellen (beispielsweise CD4-, Thl-Zellen und aktivierte, TZFP-positive Lymphozyten) wirken könnte.
Ferner scheint TIMP-1 die Degranulation aktivierter Zellen und damit die Ausschüttung toxischer Substanzen zu vermindern oder zu blockieren. Dies konnte erfindungsgemäß am Beispiel der Sekretion von EDN ("eosinophile derived neurotoxin") aktivierter, eosinophiler Granulozyten (aus Patienten mit allergischer Rhini- tis) gezeigt werden. Im Gegensatz zur Apoptose-Induktion durch TIMP-2 zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Anmeldung einen protektiven Effekt auf die untersuchten Zellpopulationen. Neben der Hemmung von aktivierten Zellen (Effektoren) kann TIMP eine schützende Wirkung auf die Zielzellpopulation (Inhibition der Apoptose) durch Inhibierung toxischer Substanzen, wie z.B. Per- forin, ausüben.
Wirkstoffe, die immunsupprimierend wirken, ohne Apoptose in T- Zellen zu induzieren sind pharmakologisch von besonderem Interesse, da sie die Möglichkeit bieten, eine Immunsuppression zu erzielen, ohne eine allgemeine und anhaltende Immunschwäche zu induzieren.
Die erfindungsgemäße Verwendung des TIMP-1, des TIMP-1 Analo- gons, deren Fragmente oder der entsprechenden Nukleinsäure umfaßt somit unter anderem die Verwendung zur Behandlung von Immunerkrankungen, die durch Thl-Zellen, abnorm aktivierte Th2- Zellen, aktivierte CD8- oder CD4-Zellen, aktivierte eosinophile Granulozyten, Mastzellen und/oder abnorm sezernierende Zellen (wie z.B. Epithelzellen der Nase und des Bronchialsystems) vermittelt werden.
Das TIMP-1, das TIMP-1 Analogon, deren Fragmente oder eine ent- sprechende Nukleinsäure kann insbesondere zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Multiple Sklerose, Morbus Crohn, akuter und chronischer Graft versus Host Erkrankungen, akuter Transplantatabstoßung, Typ-I Diabetes mel- litus, rheumatoide Arthritis, Lyme-Arthritis, reaktive Yersi- nien-induzierte Arthritis, Post-Streptokokken-Herzklappen- und Myokarderkrankungen, Hepatitis C-induzierte chronische Hepatitis, Hashimoto-Thyreoiditis, Grave's Ophthalmopathie, primäre sklerosierende Cholangitis, Helicobacter pylori induzierte Gastritis, zerebrale Malaria, Kontaktdermatitis, aplastische An- ämie, immunologisch bedingte Aborte, Asthma bronchiale, allergische Zustände der Haut, Sonnenbrand oder Heuschnupfen verwendet werden.
Es wurde festgestellt, dass TIMP-1 in Lymphknoten von Patienten mit Hodgkin's Disease überexpremiert wird. Das erfindungsgemäße Protein sollte daher vorzugsweise nicht an Patienten mit B-Zell- Lymphomen verabreicht werden. Erfindungsgemäß kann TIMP-1, das TIMP-1 Analogon, deren Fragmente oder eine entsprechende Nukleinsäure in irgend einer der bekannten Arzneiformen appliziert werden. Die Applikation in Form einer Injektionslösung, Infusionslösung, Nasentropfen, Nasen- spray, Tropfen, Mundspülung, Inhalationsmittel, Tablette, Pflaster oder Creme ist bevorzugt. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen oder Störungen, die durch eine erhöhte immunologische Aktivität gekennzeichnet sind. Dabei kann es sich insbesondere um eine Infusionslösung, Injektionslösung, eine Tablette, ein Pflaster oder ein Creme handeln. Für die Herstellung vermischt man TIMP-1, ein TIMP-1 Analogon, deren Fragmente oder eine dafür kodierende Nukleinsäure mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform kann TIMP-1, das TIMP-1 Analogon, deren Fragment oder eine entsprechende Nukleinsäure zur in vitro Behandlung von Transplantat-Gewebe oder -Organen vor der Transplantation eingesetzt werden. Dafür wird eine Spül- lösung für Transplantate erstellt, die den genannten Wirkstoff umfaßt. Durch dieses Vorgehen kann ein sogenanntes T-Zell-Pur- ging erzielt werden.
Bei der Auswertung aller statistischer Analysen der nachfolgen- den Beispiele wurde entweder der Mann-Whitney-Test (Beispiele 1 bis 3), wobei ein P-Wert von weniger als 0,05 als signifikanter Unterschied gewertet wurde, oder eine einfache Ermittlung der Standardabweichungen (Beispiele 4 bis 9) verwendet.
Kurze Beschreibung der Figuren
Fig. 1 Ergebnisse der allogen aktivierten, gemischten Lymphozy- tenkultur, wobei die Hemmung der Lyse durch TIMP als prozentuale Menge spezifischer Chrom-FreiSetzung dargestellt wird. Fig. 2 Ergebnisse der FACS-Analyse des Einflusses von rhTIMP-1 auf die Apoptose aktivierter Lymphozyten.
Fig. 3 DNS-Syntheserate gemischter allogen stimulierter Lympho- zytenkulturen in Gegenwart und Abwesenheit von rhTIMP-1.
Fig. 4 DNS-Syntheserate gemischter allogen stimulierter Lympho- zytenkulturen in Gegenwart und Abwesenheit von rhTIMP-1.
Fig. 5 DNS-Syntheserate gemischter allogen stimulierter Lympho- zytenkulturen in Gegenwart und Abwesenheit von rhTIMP-1 nach Auftrennung der Lymphozyten in Subpopulationen.
Fig.6 Induktion der RNA-Expression des Th2-Zell spezifischen Transkritionsfaktors Gata-3 und Reduktion des für T-Zell- Aktivierung spezifischen Transkriptionsfaktors TZFP durch rhTIMP-1 in allogenen Lymphozytenkulturen.
Fig.7 Inhibition der zytotoxischen Wirkung des Perforins auf eine menschliche T-Zell Linie (Jurkat) durch rhTIMP-1.
Fig.8 Inhibition des durch Perforin induzierten intrazellulären Ca-Einstroms durch rhTIMP-1.
Fig.9 Inhibition des durch Eotaxin in eosinophilen Granulozyten vermittelten intrazellulären Ca-Einstroms mit nachfolgender Inhibition der Sekretion des toxischen Moleküls EDN ( "eosinophile derived neurotoxin") .
Beispiel 1
Einfluss von TIMP-1 auf gemischte und autologe Lymphozytenkulturen
Die gemischten Lymphozytenkulturen wurden nach im Stand der Technik bekannten Verfahren (Kägi et al . , Science, 265: 528-530, 1994; und Löwin et al . , Nature, 370: 650-652, 1994) durchgeführt .
Zusammengefasst wurde dafür Blut von verschiedenen nicht-histo- kompatiblen, gesunden Spendern (Stimulator und Responder) gewonnen und mit Ficoll versetzt. Die Zellen der Interphase wurden isoliert und 2fach gewaschen. Als Stimulator fungierende, mono- nukleäre Zellen wurden mit 30 Gy bestrahlt. Die Stimulierung wurde in einem Versuch mit CD14-angereicherten (MACS, CD14-Mi- krokügelchen, Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Deutschland) und bestrahlten Zellen durchgeführt. Dafür wurden 8 x 10 bestrahlte Stimulator und 2 x 107 lebende Responder-Zellen miteinander über 5 Tage in 15 ml RPMI 1640 Medium mit 2 mM Glutamin und 10 % FCS in 50 ml Falcon-Röhrchen unter gleichmäßigem Schüt- teln (1 Mal täglich) inkubiert (pH 7,2, 37 °C, 5 % C02, hohe Feuchtigkeit) . Am 5. Tag wurden frische, nicht-bestrahlte Stimulator-Zellen, in einer Konzentration von 2 x 10 Zellen pro 100 μl für 90-120 min mit 100 μCi an Natrium [51Cr] -Chromat inkubiert (100 μl Volumen, spezifische Aktivität 472.220241 mCi/mg, NEN; pH 7,2, 37 °C, 5 % C02 und hohe Feuchtigkeit) . Die markierten Zellen wurden 3 Mal in 1640 RPMI-Medium mit 10 % FCS gewaschen. Anschließend wurden Mikrotiterplatten mit 150 μl markierten Stimulator/Target (E) Zellen und Responder/Effektor
(E) Zellen in der angegebenen E:T-Menge in Gegenwart von rhTIMP-1 oder rhTIMP-2 oder einem Vehikel als Kontrolle befüllt. Die Mikrotiterplatten wurden für 4 Stunden inkubiert (pH 7,2, 37 °C, 5 % C02, hohe Feuchtigkeit) und für 5 Minuten bei 200 G zentrifugiert . Aliquote Teilmengen der Überstände wurden anschließend auf Radioaktivität hin untersucht. Die maximale Chrom-Freisetzung wurde nach Lyse der markierten Stimulatorzel- len (entspricht den Zielzellen, "target cells" oder T) mittels Triton X 100 Behandlung der Vertiefungen gemessen. Die spontane Chrom-Freisetzung wurde an Zielzellen gemessen, die nur in Medium belassen worden waren. Die Ergebnisse (Fig. 1) zeigen die prozentuale Menge spezifischer Chrom-FreiSetzung als Durchschnitt von Dreifachmessungen (experimentelle Chrom-FreiSetzung (cpm) minus spontane Chrom-Freisetzung (cpm) x 100 dividiert durch die maximale Chrom-Freisetzung (cpm) minus spontane Freisetzung) .
Alternativ dazu wurde ein Versuch angesetzt, in dem autologe (HLA-A2-positive) PHA-stimulierte Lymphozyten mit einem Melanom- assoziiertem Nonapeptid (IMDQVPFSV, ein gplOO Peptid, das in Position 2 verändert wurde, um im Vergleich zu dem nativen Peptid verbesserte Affinität für HLA-A*0201-Bindungsstellen zu erhalten; vgl. Parkhurst, M.R., J. Immunol . , 157: 2539-2548, 1996) als Stimulator/Ziel-Zelle inkubiert. Nach 3 facher Stimulierung durch Nonapeptid-präsentierende Zellen (autolog zu den Effektor-Lymphozyten) wurde mit Lymphozyten als Responder/Ef- fektor-Zellen inkubiert, wobei im übrigen die für die gemischte Lymphozyten-Kultur angegebenen Parameter eingestzt wurden.
Figur 1 zeigt beispielhaft Ergebnisse, die bei der Durchführung des Chrom-Freisetzungsnachweises nach gemischter Lymphozytenkul- tur erhalten wurden. Wie diese Abbildung eindeutig darstellt, inhibiert sowohl rhTIMP-1 als auch rhTIMP-2 die T-vermittelte Zytotoxizität gegen verschiedene Zielzellen nach lediglich
3 Stunden in der Kultur und 4 Stunden Assay Dauer. Diese Wirkung war bei höheren E:T-Verhältnissen am stärksten ausgeprägt, und erreichte Werte zwischen 84% und 89% Inhibition der Kontrollen
(ohne Zytokin) .
Beispiel 2
Einfluss von rhTIMP-1 auf die Apoptose aktivierter Lymphozyten
Um mögliche Ursachen für die verminderte Lysefähigkeit der allogen stimulierten Lymphozyten zu untersuchen, wurde die Vitalität dieser Zellen anhand ihrer Proliferationskapazität, sowie ihres Apoptoseverhaltens überprüft .
Dafür wurden gemischte, mononukleäre Zellen analog des Protokolls für gemischte Lymphozytenkulturen isoliert und stimuliert. 5 Tage nach Versuchsbeginn wurden 1 x 105 Zellen pro Versuchsbedingung (Färbung mit Lymphozyten-Subpopulations-spezifischen Antikörpern gegen CD3, CD4 oder CD8) mit Annexin-V und Propiumiodid nach Standardverfahren (FACS Calibur, Becton Dickinson) gefärbt, um zwischen apoptotischen und toten Zellen unterscheiden zu können. Die Zellsuspension wurde bei 4°C für eine Stunde im Dunklen belassen und unter Verwendung eines FACS-Analyzers (FACS Calibur, Becton Dickinson) analysiert. Die weitere Auswertung erfolgte mittels CellQuest und Paint-A-Gate 3,0 Software auf einem Macintosh PC.
Die Ergebnisse sind in Fig. 2 zusammengefasst und zeigen, dass rhTIMP-1 keinen Apoptose-fördernden Effekt auf aktivierte Lymphozyten, noch nicht einmal auf eine Subpopulation der Lymphozy- ten ausübt .
Beispiel 3
Einfluss von TIMP-1 auf die DNS-Syntheserate in gemischten Lymphozytenkulturen
In 8 Versuchen wurde die DNS-Syntheserate der gemischten Lymphozytenkulturen durch 3H-Thymidinaufnähme der Zellen gemessen.
Die Gegenwart von TIMP-1 führte dabei nicht zu einem signifikanten Abfall der Thymidinaufnähme. Es zeigte sich tendenziell eher eine Steigerung der Proliferation, die jedoch nicht statistisch signifikant war. Diese Ergebnisse zeigen jedoch, dass in der maßgeblichen Zellpopulation kein induzierter Zelltod zu beobachten ist (vgl. Fig. 3 und 4) .
Schließlich wurde die 3H-Thymidinaufnähme von Lymphozyten aus gemischter Lymphozytenkultur bestimmt, wobei die Lymphozyten zuvor durch FACS-Auftrennung in Subpopulationen aufgeteilt wurden. Auch diese Auswertung (Fig. 5) zeigt eindeutig, dass TIMP-1 nicht apoptotisch auf Lymphozyten wirkt. Beispiel 4
Einfluss von TIMP-1 auf die RNA-Synthese der Transkriptionsfaktoren Gata-3 und TZFP
Dieses Beispiel beschreibt die Analyse des Einflusses von TIMP-1 auf die quantitative RNA-Syntheserate der Transkriptionsfaktoren Gata-3 und TZFP ("testis zinc finger protein" oder "repressor of Gata-3") in gemischten allogenen Lymphozytenkulturen.
Bei der allogen stimulierten Lymphozytenkultur ist ein koordiniertes Zusammenspiel zwischen CD4-Thl, sowie CD8 Zellen wesentlich. CD4-Th2 Zellen spielen in diesem Geschehen entweder eine untergeordnete - oder sogar eine inhibierende Rolle. Erkennungs- merkmale für grundsätzlich aktivierte T-Lymphozyten ist der Transkriptionsfaktor TZFP, der als Repressorprotein Gata-3 bindet und inaktiviert. Gata-3 dagegen findet sich bei differenzierten Zellen nahezu ausschließlich in CD4-Th2 Zellen und sollte somit während einer allogen stimulierten Bedingung eher ab- fallen.
Die zu untersuchenden Lymphozyten wurden wie in Beispiel 1 beschrieben, aus dem Blut gesunder Normalpersonen gewonnen und über 5 Tage kultiviert. Zu Begin des Versuches> Stunde 0, sowie an Tag 5 wurden die Zellen unterschiedlichen Bedingungen ausgesetzt (E= Effektor alleine; E+Tl 6h= Effektor inkubiert an Tag 5 für 6h mit rhTIMP-1 [500ng/ml] ; E+Tl 5T= Effektor mit rhTIMP-1 [500ng/ml] von Stunde 0 bis Tag 5) . Zu den genannten Zeitpunkten wurden die Zellen pelletiert und RNA nach Standardprotokollen (RNAzol) isoliert. Anschließend wurde lμg RNA pro Ansatz mittels Primer (random hexamers) und Einsatz von Superscript II Reverser Transkriptase zu cDNA transkribiert. Die cDNA wurde l:200μl mit ddH20 verdünnt .
Von dieser cDNA wurden 5μl in eine PCR eingesetzt. Die Quantifizierung der mRNA erfolgte durch die Real-time Fluoreszence De- tektions-Methode. Die PCR erfolgte im ABI prism 7700 Sequence Detector (PE Biosystems, Foster City,CA). Eingesetzt wurden Primer und Proben, spezifisch für GAPDH oder 18S, als Kontrolle, sowie Gata-3 und TZFP, die am 5 'Ende mit VIC (GAPDH, 18S) , oder FAM (alle anderen Proben) und am 3 "Ende mit TAMRA, das als Quen- eher dient, markiert waren.
Die 5 λ -3 Nuklease-Aktivität der Taq-Polymerase spaltet die Probe ab und führt so zur Freisetzung der fluoreszierenden Farbstoffe (FAM, VIC) , die durch den Laser-Detektor des PCR-Cyclers gemes- sen werden können. Nach Überschreitung eines Schwellenwertes, ist die erreichte Fluoreszenz proportional zur Menge des erzeugten PCR-Produktes. Jede untersuchte Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen enthielt 12 Standard-Proben (Verdünnungsreihen von ruhenden Lymphozyten) .
Die relative Genexpression jeder Probe wurde an Hand der Standardkurve für jede Bedingung errechnet. Die ständig exprimierten Gene, wie GAPDH und 18S-RNA dienten als zusätzliche Kontrollen für die Berechnung, wie auch zum Vergleich der Qualität der cDNA.
Die folgenden Nukleotide wurden als PCR-Primer und als Sonde für die zu untersuchenden Transkripte verwendet (entsprechende Primer und Sonden für GAPDH und 18S-RNA sind kommerziell erhält- lieh) :
Gata-3 :
Primer 5 -3 λRichtung: 5 "gga-cga-gaa-aga-gtg-cct-caa-3
Primer 3 -5 xRichtung: 5 λ tgg-gac-gac-tcc-agc-ttc-a-3 λ Sonde: 5 λagg-tgc-ccc-tgc-ccg-aca-gc-3 x
TZFP:
Primer 5 -3 Richtung: 5 λata-gca-ccc-cca-cca-ctg-g-3
Primer 3 ' -5 Richtung: 5 Λggc-att-tag-gga-cag-tgg-ga-3 λ Sonde: 5 cag-gag-gtc-tgg-cgg-gaa-cag-agg-3 ' Die Ergebnisse sind in Fig.6 dargestellt und zeigen, dass die Inkubation von allogen stimulierten Lymphozyten mit rhTIMP-1 zu einer deutlichen Reduktion der Expression des Transkriptions- faktors TZFP führt. Unter normalen Stimulationsbedingungen steigt dieser Transkriptionsfaktors deutlich an.
Die Genexpression des Th2-spezifischen Transkriptionsfaktors Gata-3 dagegen wird durch rhTIMP-1 deutlich gesteigert, was auf eine vermehrtes Vorhandensein von Th2 Zellen schließen läßt, die unter normalen Stimulationsbedingungen nicht nachzuweisen sind.
Diese Untersuchungen legen somit den Schluß nahe, dass es sich bei der Beeinflussung dieser zwei Transkriptionsfaktoren durch rhTIMP-1 um Wirkungen auf unterschiedliche Lymphozyten-Subpopu- lationen handelt, welche durch die immunsuppressiven Wirkung des TIMP-1 hervorgerufen werden.
Beispiel 5
Einfluss des TIMP-1 auf die Perforin-induzierte Apoptose/Nekrose menschlicher T-Zellen
In diesem Beispiel wurde der Einfluss des TIMP-1 auf die Perforin-induzierte Apoptose/Nekrose der menschlichen Jurkat-T-Zell- linie untersucht.
Perforin ist ein Glykoprotein, das aus aktivierten zytotoxischen Zellen (CTLs, NK-Zellen) sezerniert wird und in Zielzellen durch Formation von Poren in die Membran zu deren Zelltod (Nekrose) führt. Eine erste Folge dieser Porenbildung stellt der Einstrom von Ionen, z.B Kalzium, von außen nach innen in die Zielzellen dar.
FACS-Analyse : Auf diesem Prinzip beruht die Messung Propidiumio- did (PI) gefärbter Zellen und deren Analyse mittels FACS, da PI ausschließlich in tote Zellen oder Zellen mit nicht mehr intakter Membran aufgenommen werden kann.
Zu diesem Zweck wurde die T-Zelllinie Jurkat in einer Konzentration von 1 x 10ε Zellen/ml mit 20 ng/ml Perforin für 4 Stunden bei 37°C inkubiert und anschließend mit PI nach Standardverfahren (FACS Calibur, Becton Dickinson) gefärbt. Zur Kontrolle wurde anstelle von Perforin das gleiche Volumen 1 x PBS verwendet.
Die als "TIMP-1-Bedingung" bezeichneten Ansätze wurden mit 500ng/ml rhTIMP-1 für lh bei 37°C vorinkubiert und dann zu dem Perforin pipettiert oder Perforin und rhTIMP-1 in den angegebenen Konzentrationen wurden gemeinsam zu Beginn der 4h Inkubation zu den Zellen pipettiert.
Entsprechende Versuche wurden durch Zugabe von Granzyme B 100 ng/ml zu den jeweiligen Bedingungen zur gezielten Apoptoseinduk- tion durchgeführt und durch Standardfärbung mit Annexin-V, bzw. Yopro-I zusammen mit Propidiumiodid analysiert.
In beiden Fällen erfolgte die weitere Auswertung mittels Cell- Quest und Paint-A-Gate 3,0 Software auf einem Macintosh PC.
Trypan-Blau-Färbung: Trypan-Blau ist ein Farbstoff, der intakte Zellmembranen nicht penetrieren kann und insofern nur Zellen blau färbt, die entweder tot sind, oder Löcher in der Membran aufweisen. Die Zellen wurden entsprechend den oben genannten Bedingungen (Kontrolle, Perforin, TIMP-1, Perforin + TIMP-1) für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend mit diesem Farbstoff angefärbt. Dafür wurden 50 μl Zellsuspension (1 x 10 Zellen/ml) mit 450 μl Trypan-Blau vermischt und unter dem Mikroskop ausgewertet .
Die Ergebnisse sind in Fig.7 dargestellt und zeigen, daß rhTIMP- 1 in der Lage ist, die durch Perforin induzierte Porenbildung in der Membran der Jurkat-Zellinie und die nachfolgender Nekrose- induktion zu inhibieren. In insgesamt 20 Analysen konnte rhTIMP- 1 in allen Ansätzen, die durch Perforin induzierte Nekrose, sowie die durch Perforin + Granzyme B induzierte Apoptose zu 10- 56% zu inhibieren. Diese Ergebnisse wurden auch durch den Try- pan-Blau-Assay bestätigt.
Beispiel 6
Einfluss von .TIMP-1 auf den Kalzium Einstrom in eine menschlichen T-Zelllinie (Jurkat)
In diesem Beispiel wurde der Einfluss von TIMP-1 auf den durch zytotoxisch-lytische Wirkung des menschlichem Perforins induzierten Kalzium Einstrom. in menschlichen T-Zellen (Jurkat) untersucht .
Wie in Beispiel 5 beschrieben, induziert das Glykoprotein Perfo- rin Löcherbildung in Membranen menschlicher Zellen, was zum Einstrom von Kalzium von außen (aus dem Puffer) in die Zellen führt .
Diesen Kalziumeinstrom kann man mittels Anfärbung der Zellen mit dem Farbstoff Fura-2 darstellen, der sich intrazellulär anreichert und bei Einstrom von Ca in die Zellen, das Ca bindet und in diesem Moment seine Fluoreszenz-Eigenschaften steigert. Gemessen wird dabei die unterschiedliche Fluoreszenz zwischen gebundenem und ungebundenem Kalzium in einem Fluroeszenz-Spek- trometer.
Die Ergebnisse sind in Fig.8 dargestellt und zeigen, dass rhTIMP-1 den durch Perforin ausgelösten Ca-Einstrom in die Zellen inhibieren konnte . Beispiel 7
Einfluss von TIMP-1 auf den durch Eotaxin induzierten Kalzium-Einstrom in eosinophile Granulozyten
In diesem Beispiel wurde der Einfluss von TIMP-1 auf den durch Eotaxin induzierten Kalzium-Einstrom in eosinophilen Granulozyten untersucht. Ferner wurden die nachfolgender Veränderungen der Sekretion des toxischen Proteins der eosinophilen Granulozy- ten , EDN, untersucht.
Eosinophile Granulozyten allergischer Patienten sind ebenfalls ein Beispiel einer aktivierten Zelle des Immunsystems mit ent- sprechender Überfunktion. In der Literatur genau beschrieben, ist die Induktion dieser Sekretion durch Eotaxin und IL-5 (Fus- jisawa,T. et al.J.Allergy Clin Immunol 2000).
Zur Überprüfung der Funktion von rhTIMP-1 auf diese Zellen haben wir zunächst Granulozyten nach Standardprotokollen der Firma Milteniy aus heparinisiertem Blut von Patienten mit allergischer Rhinitis mittels Ficoll-Aufreinigung isoliert und die eosinophilen Granulozyten aus dieser Population mittels CD16-Depletion weiter angereichert .
Ein Teil der zu 90% reinen Population von eosinophilen Granulozyten wurde dann entweder mit Fura-2 gefärbt und der Kalzium- Fluoreszenz-Messung unter Einfluß von Eotaxin unterzogen oder in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen mit dem nachfolgend angegebenen Zytokin/Chemokin inkubiert (Eotaxin 1 x 10 mol/1; IL-5 2,5 ng/ml; Eotaxin und IL-5 +/-rhTIMP-l) . Nach verschiedenen Zeitpunkten wurden die Überstände dieser Kulturen eingefroren und anschließend unter Verwendung eines ELISAs auf das Vorhandensein des EDN-Proteins hin untersucht.
Die Ergebnisse sind in Fig.9 dargestellt, wobei Mittelwerte aus drei unterschiedlichen Zeitpunkten gezeigt werden. Die Vorinkubation der Zellen mit rhTIMP-1 für lh bei 37°C führte zu einer teilweisen Inhibition des durch Eotaxin ausgelösten Ca-Einstroms in die Zellen. Nachfolgend konnte durch rh.TIMP-1 in der gleichen Zellpopulation die Sekretion von EDN auf das ursprüngliche Kon- trollniveau inhibiert werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von
(a) TIMP-1;
(b) einem TIMP-1 Analogon;
(c) eines Fragmentes von (a) oder (b) mit immunsuppressiver Aktivität; oder
(d) einer Nukleinsäure, die für eines der in (a) bis (c) genannten Peptide kodiert;
zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Erkrankungen oder Störungen, die durch eine erhöhte immunologische Aktivität gekennzeichnet sind.
2. Verwendung nach Anspruch 1, bei der das TIMP-1 Analogon eine natürliche oder rekombinante allelische Variante des TIMP-1 ist und einer Homologie von mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 70% zu der TIMP-1 Aminosäuresequenz aufweist.
3. Verwendung nach Anspruch 2, bei der das TIMP-1 Analogon eine Homologie von mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 95% zu der TIMP-1 Aminosäuresequenz aufweist.
4. Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei der das Fragment eine Länge von mindestens 3 , vorzugsweise mindestens 5 oder 10 Aminosäuren aufweist.
5. Verwendung gemäß Anspruch 1, bei der die für TIMP-1, für das TIMP-1 Analogon oder für eines der Fragmente mit immunsuppressiver Aktivität kodierende Nukleinsäure operativ mit einer Sequenz verknüpft ist, die eine Expression der Sequenz bewirken kann.
6. Verwendung gemäß Anspruch 5, bei der die Nukleinsäure Teil eines Expressionskonstruktes ist, das zur Transformation von Zielzellen in dem Patienten geeignet ist.
7. Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei der das TIMP-1, das Analogon, deren Fragmente oder eine entsprechende Nukleinsäure zur Behandlung von Immunerkrankungen, die durch Thl-Zellen, abnorm aktivierte Th2-Zellen, aktivierte CD8- oder CD4-Zellen, aktivierte eosinophile Granulozyten, Mastzellen und/oder abnorm sezernierende Zellen (wie z.B. Epithelzellen der Nase und des Bronchialsystems) vermittelt werden, eingesetzt wird.
8. Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei der das TIMP-1, das Analogon, das Fragment oder die Nukleinsäure zur Behandlung von Multiple Sklerose, Morbus Crohn, akuter und chronischer Graft versus Host Erkrankungen, akuter Transplantatabstoßung, Typ-I Diabetes mellitus, rheumatoide Arthritis, Lyme-Arthritis, reaktive Yersinien-induzierte Arthritis, Post-Streptokokken-Herzklappen- und Myokarderkran- kungen, Hepatitis C-induzierte chronische Hepatitis, Hashi- moto-Thyreoiditis, Grave's Ophthalmopathie, primäre sklero- sierende Cholangitis, Helicobacter pylori induzierte Gastritis, zerebrale Malaria, Kontaktdermatitis, aplastische Anämie, immunologisch bedingte Aborte, Asthma bronchiale, Sonnenbrand, Heuschnupfen und allergische Erkrankungen eingesetzt wird.
9. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei TIMP-1, das Analogon, deren Fragmente oder eine entsprechende Nukleinsäure als Injektionslösung, Infusionslösung, Nasentropfen oder -sprays, Tropfen, Mundspülung, Inhalationsmittel, Tablette, Pflaster oder Creme vorliegt.
10. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, bei der TIMP-1, das Analogon, deren Fragmente oder eine entsprechende Nukleinsäure zur in vitro Behandlung von Transplantat- Gewebe vor der Transplantation eingesetzt wird.
11. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen oder Störungen, die durch eine erhöhte immunologische Aktivität gekennzeichnet sind, bei dem man TIMP-1, ein TIMP-1 Analogon, deren Fragmente oder eine dafür kodierende Nukleinsäure mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger vermischt oder verbunden.
12. Spüllösung für Transplantate, umfassend TIMP-1, ein TIMP-1 Analogon, ein Fragment davon oder eine dafür kodierende Nukleinsäure und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
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