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Die
Erfindung betrifft Serin-Protease-Inhibitoren zur spezifischen Inhibition
von Gewebs-Kallikreinen.
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Ungefähr
60% der Weltbevölkerung leidet unter dermatologischen Störungen,
wobei 25% ärztliche Behandlung benötigen (Hadgraft,
J. (2002) Crossing the barrier. In: The Essential Stratum corneum,
R. Marks, J. L. Leveque und R. Voegeli, eds., 103–9).
Die klinische Diagnose von Hautstörungen ist eine schwierige
Aufgabe, da anomale Hautbilder von verschiedensten lokalen oder
systemischen Krankheiten verursacht werden können. Hautkrankheiten sind
zudem oft schwer zu behandeln, aufgrund der Barriere, die die äußerste
Hautschicht, das Stratum corneum, darstellt.
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Das
Stratum corneum wirkt als wichtigste schützende Grenzschicht
des Körpers gegen physische und chemische Schaden, Dehydratisierung
und mikrobielle Krankheitserreger. Während der normalen
Desquamation des Stratum corneum werden die oberflächlichsten
Korneozyten von der Hautoberfläche abgeworfen. Dieser Prozess
erfordert die Proteolyse der korneodesmosomalen Adhäsionsmoleküle,
die durch Serin-Proteasen erfolgt. Bislang wird Serin-Protease-Aktivität
im Stratum corneum menschlichen Gewebs-Kallikreine (KLKs, nach neuester
Nomenklaturregel „Kallikrein-related peptidases”)
zugeschrieben, eine Familie von 15 verschiedenen Trypsin- und Chymotrypsin-artigen
Serin-Proteasen. Bei den KLKs ist eine Rolle in der Desquamation des
Stratum corneum KLK5 und KLK7 zugeschrieben worden. Weitere Studien
haben ergeben, dass zusätzlich zu KLK 5 und 7 andere Kallikreine
mit Desquamation in Verbindung stehen: KLK 5, 6, 7, 8, 10, 11, 13
und 14 werden in der Epidermis exprimiert und sind an der Desquamation
der Haut und ihrer Barrierefunktion maßgeblich beteiligt
(Lundwall, A. und Brattsand, M. (2008) Kallikrein-related
peptidases. Cell. Mol. Life Sci. 65: 2019–38).
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Da
Desquamation ein Serin-Protease-abhängiger Prozess ist,
wird sie durch Serin-Protease-Inhibitoren (SPIs) reguliert. Die
Bedeutung des desquamationsregelndes Serin-Protease/SPI-Gleichgewichtes
ist bei der Gendermatose „Netherton Syndrom” (NS)
am deutlichsten. NS, eine autosomal rezessive ichthyosiforme Hautstörung,
durch Haarschaft-Defekte gekennzeichnet, charakterisiert durch atopische
Eigenschaften, übermäßige Desquamation
der Korneozyten, und schwerwiegende Funktionsstörungen
des Stratum corneum, wird durch frameshift- und nonsense-Mutationen
im Kazal-Typ Serin-Protease-Inhibitor 5 Gen (spink5) verursacht (Komatsu,
N., Takata, M., Otsuki, N., Ohka, R., Amano, O., Takehara, K. und
Saijoh, K. (2002) Elevated Stratum corneum hydrolytic activity in
Netherton syndrome suggests an inhibitory regulation of desquamation
by SPINK5-derived peptides. J. Invest. Dermatol. 118: 436–43; Chavanas,
S., Bodemer, C., Rochat, A., Hamel-Teillac, D., Ali, M., Irvine,
A. D., Bonafe, J. L., Wilkinson, J., Taieb, A., Barrandon, Y., et
al. (2000) Mutations in SPINK5, encoding a serine protease inhibitor,
cause Netherton syndrome. Nat. Genet. 25: 141–2; Sprecher, E.,
Chavanas, S., DiGiovanna, J. J., Amin, S., Nielsen, K., Prendiville,
J. S., Silverman, R., Esterly, N. B., Spraker, M. K., Guelig, E.,
et al. (2001) The spectrum of pathogenic mutations in SPINK5 in
19 families with Netherton syndrome: implications for mutation detection
and first case of prenatal diagnosis. J. Invest. Dermatol. 117: 179–87).
spink5 kodiert für ein SPI mit 15 Inhibitor-Domänen,
der lympho-epithelial Kazal-Typ Inhibitor (LEKTI) bezeichnet wird
(Mägert, H. J., Ständker, L., Kreutzmann,
P., Zucht, H. D., Reinecke, M., Sommerhoff, C. P., Fritz, H. und
Forssmann, W. G. (1999) LEKTI, a novel 15-domain type of human serine
proteinase inhibitor. J. Biol. Chem. 274: 21499–502).
Alle bekannte spink5 Mutationen verursachen vorzeitigen Stoppcodons
im LEKTI Transkript und führen zur Entstehung verkürzter
LEKTI Formen, denen einige Inhibitor-Domänen fehlen. Infolgedessen
verursachen reduzierte LEKTI Expression bzw. Aktivität
unkontrollierte, erhöhte Serin-Protease-Aktivität,
wie im Stratum corneum von NS-Patienten (Descargues, P.,
Deraison, C., Prost, C., Fraitag, S., Mazereeuw-Hautier, J., D'Alessio,
M., Ishida-Yamamoto, A., Bodemer, C., Zambruno, G., und Hovnanian,
A. (2006) Corneodesmosomal cadherins are preferential targets of
Stratum corneum trypsin- and chymotrypsin-like hyperactivity in
Netherton syndrome. J. Invest Dermatol. 126: 1622–32; Komatsu,
N., Takata, M., Otsuki, N., Ohka, R., Amano, O., Takehara, K. und
Saijoh, K. (2002) Elevated Stratum corneum hydrolytic activity in
Netherton syndrome suggests an inhibitory regulation of desquamation
by SPINK5-derived peptides. J. Invest. Dermatol. 118: 436–43; Hachem,
J. P., Houben, E., Crumrine, D., Man, M. Q., Schurer, N., Roelandt,
T., Choi, E. H., Uchida, Y., Brown, B. E., Feingold, K. R. und Elias,
P. M. (2006) Serine protease signaling of epidermal permeability
barrier homeostasis. J. Invest. Dermatol. 126: 2074–86)
und bei spink5-null Mäusen (Descargues, P., Deraison,
C., Bonnart, C., Kreft, M., Kishibe, M., Ishida-Yamamoto, A., Elias,
P., Barrandon, Y., Zambruno, G., Sonnenberg, A. und Hovnanian, A.
(2005) Spink5-deficient mice mimic Netherton syndrome through degradation
of desmoglein 1 by epidermal protease hyperactivity. Nat. Genet.
37: 56–65) beobachtet werden kann, und führen
zu übermäßiger Desquamation und zum Abbau
des Stratum corneum.
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LEKTI
Mangel verursacht eine anormale Proteolyse der Korneodesmosomen
wegen der Hyperaktivität von KLK5 und KLK7. Dies führt
zu beschleunigter Abschilferung des Stratum corneum und folglich
zum Verlust der Barrierenfunktion der Haut (Yang, T., Liang,
D., Koch, P. J., Hohl, D., Kheradmand, F. und Overbeek, P. A. (2004)
Epidermal detachment, desmosomal dissociation, and destabilization
of corneodesmosin in Spink5-/- mice. Genes Dev. 18: 2354–8.; Descargues,
P., Deraison, C., Bonnart, C., Kreft, M., Kishibe, M., Ishida-Yamamoto,
A., Elias, P., Barrandon, Y., Zambruno, G., Sonnenberg, A. und Hovnanian,
A. (2005) Spink5-deficient mice mimic Netherton syndrome through
degradation of desmoglein 1 by epidermal protease hyperactivity.
Nat. Genet. 37: 56–65; Hewett, D. R.,
Simons, A. L., Mangan, N. E., Jolin, H. E., Green, S. M., Fallon,
P. G. und McKenzie, A. N. (2005) Lethal, neonatal ichthyosis with
increased proteolytic processing of filaggrin in a mouse model of
Netherton syndrome. Hum. Mol. Genet. 14: 335–46).
LEKTI kann daher als Schlüsselregulator der epidermalen
Protease-Aktivität betrachtet werden. Zudem deutet das
Vorkommen von LEKTI-Domänen in der Blutzirkulation darauf
hin (Mägert, H. J., Ständker, L., Kreutzmann,
P., Zucht, H. D., Reinecke, M., Sommerhoff, C. P., Fritz, H. und
Forssmann, W. G. (1999) LEKTI, a novel 15-domain type of human serine
proteinase inhibitor. J. Biol. Chem. 274: 21499–502; Mägert,
H. J., Kreutzmann, P., Ständker, L., Walden, M., Drogemüller,
K. und Forssmann, WG. (2002) LEKTI: a multidomain serine proteinase
inhibitor with pathophysiological relevance. Int. J. Biochem. Cell
Biol. 34: 573–6), dass LEKTI nicht nur direkt
an der Haut biologische Effekte aufweisen könnte. Der Umfang
der atopischen Manifestationen beim NS spricht dafür, dass LEKTI
als Protease-Inhibitor am Entzündungsprozess mitbeteiligt
ist (Deraison, C., Bonnart, C., Lopez, F., Besson, C., Robinson,
R., Jayakumar, A., Wagberg, F., Brattsand, M., Hachem, J. P., Leonardsson,
G. und Hovnanian, A. (2007) LEKTI fragments specifically inhibit
KLK5, KLK7, and KLK14 and control desquamation through a pH-dependent
interaction. Mol. Biol. Cell 18: 3607–19).
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LEKTI
gehört zur Familie der Kazal-Typ Serin-Protease-Inhibitoren,
deren zahlreiche Mitglieder im Allgemeinen 3–7 Tandem-Kazal-Domänen
aufweisen. Interessanterweise besteht LEKTI aus einem Signalpeptid und
15 potentiellen Serin-Protease-Inhibitor-Domänen (D1–D15)
getrennt durch 14 spacer-Segmente. Zwei dieser Domänen
(D2 und D15) ähneln typischer Kazal-Typ Serin-Protease-Inhibitoren,
mit einem charakteristischen Motiv aus sechs Cysteinresten. Die übrigen
13 Domänen weisen eine hohe Homologie mit dieser Inhibitor-Familie,
aber ihnen fehlt eine der drei konservierten Disulfidbrücken.
Einige Autoren haben die inhibitorische Aktivität verschiedener
LEKTI-Formen untersucht. Es wurde gezeigt, dass das gesamte rekombinante LEKTI-Protein
Trypsin, Subtilisin A, Plasmin, Kathepsin G und Neutrophilelastase,
aber nicht Chymotrypsin (Mitsudo, K., Jayakumar, A., Henderson,
Y., Frederick, M. J., Kang, Y., Wang, M., El-Naggar, A. K. und Clayman,
G. L. (2003) Inhibition of serine proteinases plasmin, trypsin,
subtilisin A, cathepsin G, and elastase by LEKTI: a kinetic analysis.
Biochemistry 42: 3874–81) oder KLKs (Deraison,
C., Bonnart, C., Lopez, F., Besson, C., Robinson, R., Jayakumar,
A., Wagberg, F., Brattsand, M., Hachem, J. P., Leonardsson, G. und
Hovnanian, A. (2007) LEKTI fragments specifically inhibit KLK5,
KLK7, and KLK14 and control desquamation through a pH-dependent
interaction. Mol. Biol. Cell 18: 3607–19) inhibieren
kann. Eine andere LEKTI-Form, das Domänen 6–9
(rLEKTI6–9) enthält, inhibiert hingegen Trypsin,
Subtilisin A, Chymotrypsin, KLK5 und KLK7, aber nicht Plasmin, Kathepsin
G oder Elastase (Jayakumar, A., Kang, Y., Mitsudo, K., Henderson,
Y., Frederick, M. J., Wang, M., El-Naggar, A. K., Marx, U. C., Briggs,
K. und Clayman, G. L. (2004) Expression of LEKTI domains 6–9'
in the baculovirus expression system: recombinant LEKTI domains
6–9' inhibit trypsin and subtilisin A. Protein Expr. Purif.
35: 93–101; Schechter, N. M., Choi, E.
J., Wang, Z. M., Hanakawa, Y., Stanley, J. R., Kang, Y., Clayman,
G. L. und Jayakumar, A. (2005) Inhibition of human kallikreins 5
and 7 by the serine protease inhibitor lympho-epithelial Kazal-type
inhibitor (LEKTI). Biol. Chem. 386: 1173–84).
Zudem wurde gezeigt, dass die Domäne D6 Trypsin, KLK5 und
KLK7 inhibiert, wohingegen D15 gegenüber dieser zwei Kallikreine
keine Wirkung aufweist.
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Beim
Kazal-Typ Serin-Protease-Inhibitor Familienmitglied LEKTI2 (von
spink9 kodiert) wurde gezeigt, dass es spezifisch die Aktivität
von KLK5 inhibiert, nicht aber von KLK7, 8, und 14 oder humanem
Thrombin, bovinem Trypsin und bovinem Chymotrypsin (Stefansson,
K. (2008) Kallikrein-related peptidases in human epidermis: studies
on activity, regulation, and function. Doctoral thesis, Umeå University,
Faculty of Medicine, Public Health and Clinical Medicine, Dermatology
and Venerology, http://www.divaportal.org/umu/abstract.xsql?dbid=1644).
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Serin-Protease-Inhibitoren
oder dessen Fragmente, die LEKTI-Domänen enthalten, sind
Gegenstand mehrerer Patenten bzw. Patentanmeldungen. So betrifft
die Anmeldung
PCT/EP 98/08424 Serin-Protease-Inhibitoren,
die eine Domäne mit vier Cysteinen aufweisen, wobei sich
zwischen dem ersten und einem zweiten Cystein eine Sequenz von 0
bis 20 Aminosäuren befindet oder die Serin-Proteinase-Inhibitoren
eine Domäne mit sechs Cysteinen aufweisen und sich zwischen
dem ersten und zweiten Cystein eine Sequenz von 7 bis 20 Aminosäuren
befindet. Die
WO03/070953
A1 beschreibt LEKTI Fragmente und ihre Verwendung zur Inhibierung
von Infektionen oder Virusvermehrung. Die
WO02/066513 A2 und die
EP 1 040 190 B1 betreffen
auch biologisch aktive LEKTI Fragmente und ihre Verwendung als Diagnostik
und Arzneimittel zur Behandlung verschiedener Indikationen.
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Aufgrund
der bedeutenden physiologischen Rolle, die die geschilderten proteolytischen
Prozesse spielen, besitzen bestimmte Protease-Inhibitoren ein hohes
therapeutisches Potential. Daher besteht ein ständiger
Bedarf an neuen spezifisch-wirkenden Serin-Protease-Inhibitoren,
die präventiv oder kurativ eingesetzt werden können.
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Der
vorliegende Erfindung liegt damit die Aufgaben zugrunde, weitere
Serin-Proteinase-Inhibitoren bereitzustellen, die als gut zugängliches
Arzneimittel mit biologischer und therapeutischer Aktivität
eines natürlichen Stoffes verwendet werden können
sowie einen Weg zu ihrer Produktion aufzuzeigen.
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Erfindungsgemäß wird
diese Aufgabe durch den Serin-Proteinase-Inhibitor mit den Merkmalen
von Anspruch 1 gelöst. Die Unteransprüche geben
vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung wieder.
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Die
Erfindung wird anhand der Zeichnungen näher erläutert.
Es zeigen:
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1 eine Übersicht über
das LEKTI-3-kodierende spink6 Gen und das LEKTI-3 Protein, nämlich
a) eine schematische Darstellung der Exon-Intron-Struktur des spink6
Gens; b) die Nukleotid- und Aminosäurensequenz des humanen
spink6 Gens; und c) die schematische Strukturdarstellung der Kazal-Domäne
des humanen LEKTI-3 Proteins anhand eines Sequenzvergleiches von
LEKTI-3 Proteinen von verschiedenen Spezies;
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2 das
Expressionsprofil von LEKTI-3 in verschiedenen menschlichen Geweben;
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3 die
Isolierung von LEKTI-3 aus menschlicher Haut a) in einer C2C18-RP-HPLC
Analyse und B9 in einer ESI-MS Analyse;
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4 die
Identifizierung von LEKTI-3 in menschlicher Haut;
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5 KLK3-,
KLK5- und KLK7-Aktivität unter Einfluss von hrLEKTI-3;
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6 KLK8-,
KLK12, und KLK13-Aktivität unter Einfluss von hrLEKTI-3;
und
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7 KLK14-Aktivität
unter Einfluss von hrLEKTI-3.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung und Verwendung des
in der Haut vorkommenden Proteins Serin-Proteinase-Inhibitor LEKTI-3.
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In
der menschlichen Chromosomregion 5q32 gibt es verschiedene Spink-Gene,
die einen Cluster mit den bereits charakterisierten Spink5, Spink7
und Spink9 bilden, u. a. Spink6 (Gen-Bank accession No. NM_205841).
Spink6 kodiert für das Protein LEKTI-3. Um das menschliche
Spink6 zu charakterisieren, haben die Erfinder die LEKTI-3-cDNA
aus kultivierten Keratinozyten isoliert. Das gesamte durch spink6-kodierte
Protein LEKTI-3 hat die Aminosäuresequenz (SEQ ID: NO 1):
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Aus
menschlicher Haut wurde zudem ein LEKTI-3 Fragment isoliert, mit
der Aminosäuresequenz (SEQ ID: NO 2):
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Das
oben beschriebene LEKTI-3 Fragment SEQ ID: NO 2) wurde in E. coli
exprimiert und anschließend aufgereinigt. Das rekombinante
LEKTI-3-Fragment inhibiert dosisabhängig und in selektiver
Weise die Aktivität von KLK 5, 7, 12, 13 und 14, aber nicht
die von KLK3 und KLK8.
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Weitere
Einzelheiten der Erfindung sind der folgenden Beschreibung zu entnehmen,
in der die Erfindung anhand der Figuren näher erläutert
ist.
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1 zeigt
eine Übersicht über das LEKTI-3-kodierende spink6
Gen und das LEKTI-3 Protein. Die Struktur des Spink6-Gens wird in 1a) veranschaulicht. Spink6 umfasst 4 Exons und
3 Introns. Die nicht-kodierenden Regionen sind in 1a) grau
dargestellt. Die cDNA-Sequenzdaten sind unter der GenBank beim ”National
Center for Biotechnology Information” (NCBI) unter Zugangsnummer
AY358716 verfügbar. Der offene Leserahmen (schwarz in 1a)) umfasst 243 Nukleotide, die für
ein 80 Aminosäurereste langes Peptid (SEQ ID: NO 1, GenBank
AAQ89078) kodieren, das humane LEKTI-3 Protein.
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Durch
RACE („Rapid Amplification of cDNA Ends”) wurden
zwei cDNA-Klone aus Keratinozyten charakterisiert. Die 5'-Experimente
ergaben zwei Extensionsprodukte mit unterschiedlichen Transkriptionsstarstellen
(transcription start site, TSS in 1b)).
Die 3'-Experimente ergaben ein einziges Extensionsprodukt mit einem
Polyadenylierungssignal (AATAAA, doppelt unterstrichen in 1b)) 214 Nukleotide 5' vom Poly(A). Die cDNAs
(947 bp für den längeren Transkript; 883 bp für
den kürzeren) enthalten den gleichen offenen Leserahmen
(243 bp; 1b)). Das resultierende 80
Aminosäurereste-lange LEKTI-3 Protein enthält
eine leader-Sequenz mit einem Signalpeptid (Reste 1–24,
nicht unterstrichen bei der Proteinsequenz in 1b)).
Der Sequenzvergleich der Kazal-Domänen, die bei Säugetieren
und Vögeln von Spink6 kodiert werden, zeigt, dass diese
Sequenzen sehr konserviert sind (1c).
Die markierten putativen Disulfidbrücken bei der Konsensus-Sequenz
entsprechen den Disulfidbrücken, die sich bei einer Kazal-Inhibitor-Domäne
ausbilden.
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Das
Expressionsprofil von LEKTI-3 in verschiedenen menschlichen Geweben
wird in 2 veranschaulicht. Die mRNA
Expression von Spink6 wurde mittels real-time RT-PCR untersucht.
Dabei wurde Spink6 mRNA in allen untersuchten Geweben und Zellen
nachgewiesen, einschließlich Atemwege (Lunge und Trachea),
Magen-Darm-Trakt (Speicheldrüsen, Magen, Dünndarm,
Kolon und Leber), Fortpflanzungsapparat und Harnwege (Niere, Blase,
Prostata, Hoden, Milchdrüse, Knochenmark und Plazenta),
endokrines System (Schild- und Adrenaldrüse), Gehirn und
Lymphgewebe (Mandeln, Gehirn, Milz, Thymus, Herz), Vorhaut-Hauproben,
primäre Keratinozyten aus Zellkultur und HaCat Zellen.
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Um
natürlich prozessiertes LEKTI-3 Protein in menschlicher
Haut zu identifizieren, wurde das affinitätsgereinigte
polyklonale Spink6-Antikörper (Beispiel 4) zur affinitätschromatographischen
Isolierung von LEKTI-3 Formen aus menschlichen Hautextrakten verwendet.
Die Fraktion des einzigen dabei erhaltenen Peaks (nicht gezeigt)
wurde anschließend durch C2C18-RP-HPLC aufgereinigt (
3a): die durchgehende Linie zeigt die
Absorption bei 215 nM, die darunterliegende – siehe Anfang
des Chromatogrammes – bei 254 nM und die unterste bei 280
nM). ESI-MS Analysen (
3b)) zeigten
eine einzige proteinhaltige HPLC Fraktion mit dem Molekulargewicht
(5933,75 Da) des vorausgesagten Spink6-Fragmentes (Reste 25 bis
80). Die Identität dieser Fraktion wurde außerdem
durch MS/MS Analysen bestätigt. Dieses natürlich
prozessierte Spink6-Fragment hat folgende Sequenz (SEQ ID: NO 2)
und unterscheidet sich von der bereits bekannten cDNA Sequenz (SEQ
ID: NO 1) in einem Aminosäurerest (unterstrichen):
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Immunohistochemische
Analysen haben gezeigt, dass LEKTI-3 in der menschlichen Haut in
der Epidermis exprimiert wird (4), mit
einem erhöhten Expressionsniveau von basalen bis terminal
differenzierten Keratinozyten. LEKTI-3 Immunoreaktivität
wurde zudem in Haarfollikel, Schweiß- und Talgdrüsen
nachgewiesen (nicht gezeigt).
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Zur
Charakterisierung der inhibitorischen Aktivität von LEKTI-3
wurde die prozentuale Inhibition von rekombinantem LEKTI-3 SEQ ID:
NO 2 für verschiedene Serin-Proteasen bestimmt (Tabelle
1; Beispiel 7). Inhibition durch LEKTI-3 wurde dabei nur für
die getesteten KLK-Familienmitglieder festgestellt, aber nicht für andere
untersuchte Serin-Proteasen, einschließlich Trypsin, Chymotrypsin
und Thrombin.
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Daraufhin
wurde vermutet, dass es sich bei LEKTI-3 um einen KLK-selektiven
Inhibitor handelt. Für die Inhibition von KLK3, 5, 7, 8,
12, 13, 14 wurden anschließend Konzentrations-abhängige
Versuche durchgeführt. 5 zeigt
die dosisabhängige Inhibition von KLKs durch rekombinantes
LEKTI-3. Mit in vitro Assays (5; Beispiel
7) konnten die Erfinder zeigen, dass LEKTI-3 dosisabhängig
und in selektiver Weise die Aktivität von KLK5, 7, 12,
13 und 14 inhibiert. Es ließ sich eine Ki von 0,6 nM für
KLK5 und von 0,1 nM für KLK14 ermitteln. KLK 3 und 8 wurden
nicht von LEKTI-3 inhibiert.
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Die
vorliegende Erfindung stellt des Weiteren ein Herstellungsverfahren
für die erfindungsgemäßen Peptide bereit.
Neben der gentechnischen Herstellung der Peptide ist auch die aufbauende
Totalsynthese an üblichen Festphasen im Sinne der Merrifield-Synthese
oder einer Flüssigphasensynthese möglich. Die
Synthesestrategie und der Aufbau der Peptide und von ihnen abgeleiteten
Derivaten mit den entsprechend geschützten Aminosäuren
sind dem Fachmann bekannt. Gegenstand der Erfindung ist daher neben
der Verwendung der beschriebenen Peptide auch die Verwendung deren
biologisch aktive Fragmente. Biologisch aktiv bedeutet, dass die
Fragmente gemäß dem in den Beispielen angegebenen
Messverfahren einen maximal 10-fach so hohen Ki-Wert aufweisen wie
die zugrunde liegenden kompletten Peptide. Bevorzugt handelt es sich
um Derivate, bei dem N- oder C-Terminal eine oder mehrere Aminosäuren
fehlen. Es können jedoch auch Aminosäuren aus
der Sequenz deletiert sein. Solche Fragmente weisen bevorzugt nicht
mehr als 10% deletierte Aminosäuren auf.
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Gegenstand
der Erfindung ist weiterhin die Verwendung solcher Peptide, bei
denen einzelne Aminosäuren ausgetauscht sind. Bevorzugt
handelt es sich dabei um konservative Austausche, d. h. Aminosäuren mit ähnlichen
Eigenschaften werden ersetzt, beispielweise Alanin gegen Serin,
Leucin gegen Isoleucin, etc. Auch hier wird bevorzugt, dass nicht
mehr als 10% der Aminosäuren in den Peptiden ersetzt werden.
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Darüber
hinaus können auch einzelne Aminosäuren durch
nicht-natürliche Aminosäuren ersetzt sein, d.
h. durch Aminosäuren, die weitere funktionelle Gruppen
tragen, beispielsweise Hydroxyproline, Methylthreonine, Homocysteine,
etc. Auch in diesem Fall sind bevorzugt nicht mehr als 10% der Aminosäuren
entsprechend modifiziert. Weiterhin können die Peptide
Derivatisierungen tragen, beispielsweise glycosiliert, amidiert, acetyliert,
sulfatiert oder phosphoryliert sein.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren die Verwendung der erfindungsgemäßen
Peptide als Arzneimittel für verschiedene therapeutische
Indikationen. Dazu können die Peptide als hochreine Stoffe
oder – wenn für die Verwendung ausreichend – innerhalb
eines teilweise aufgereinigten Peptidgemisches oder als Gemisch
mehrerer erfindungsgemäßer Peptide verwendet werden.
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Da
LEKTI-3 natürlicherweise im Bereich der Epidermis gefunden
wird und eine spezifische Wirkung als Inhibitor von KLK5, 7, 12,
13 und 14 aufweist, eignen sich die erfindungsgemäßen
Peptide besonders gut zur Behandlung von Hauterkrankungen mit geschädigter
epidermaler Barriere wie Neurodermatitis, dishydrosiformes Hand-Fußekzem,
nummuläres Ekzem und Netherton Syndrom.
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Für
die erfindungsgemäßen Peptide sind auch kosmetische
Anwendungen möglich, wenn ein raues, rissiges Hautbild
behandelt werden soll.
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Die
Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben.
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Beispiel 1: Klonierung der LEKTI-3 cDNA
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Mit
Hilfe gängiger molekularbiologischer Methoden gelang die
Klonierung der cDNA aus kultivierten menschlichen Keratinozyten.
Die Gesamt-RNA wurde mit TRIzol (Invitrogen, Hamburg, Germany) aus
kultivierten Keratinozyten menschlicher Vorhäute gewonnen.
Um eine Kontamination mit genomischer DNA auszuschließen
wurden nach Behandlung mit RNase freier DNaseI (Roche Diagnostics,
Mannheim, Germany) 3 μg der DNA-freien Gesamt-RNA zur Synthese
der First-strand cDNA für die RACE („Rapid Amplification
of cDNA Ends”) mit dem SMART RACE cDNA Amplifikations Kit
(BD Bioscience Clontech, Heidelberg, Germany) nach Angaben des Herstellers
verwendet.
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Um
das 5'-Ende der spink6 cDNA zu gewinnen, wurde 5'-RACE mit einem
genspezifischen Antisenseprimer (5'-AGG CAC ATT TAT TGC CAT ATG
TCT GGC CAT C-3') und einem Universalprimergemisch (10 × UPM)
nach dem Clontech SMART RACE cDNA Ampilfizierungsprotokoll durchgeführt.
Die 5'-RACE PCR wurde folgendermaßen durchgeführt:
1 min, 95°C; 5 Zyklen 95°C, 20 s, 3 min, 72°C;
5 Zyklen 95°C, 20 s, 3 min, 70°C; 25 Zyklen 95°C,
20 s, 3 min, 68°C; abschließend 10 min Extension
bei 72°C.
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Um
das 3'-Ende der spink6 cDNA zu erhalten, wurde der erste PCR Zyklus
mit einem genspezifischen Senseprimer (5'-GTG AGT TCC AGG ACC CCA
AGG TCT ACT G-3') und 10 × UPM durchgeführt. Anschließend
wurden 0,5 μl des PCR-Produktes als Template für
die nested-PCR verwendet mit nested genspezifischen Primern (5'-nest:
5'-GCC ACA GTG TGG GTT AGA TTC CCG AGT G-3'; 3'-nest: 5'-CCA CAC
TGT GGC TCT GAT GGC CAG A-3'). Die Reaktion fand unter folgenden
Bedingungen statt: 1 min, 95°C; 30 Zyklen 95°C,
20 s, 3 min 70°C; abschließend 10 min Extension
bei 70°C. Das amplifizierte Fragment wurde Gel-gereinigt,
in den Vektor pGEM-T (Promega, Mannheim, Germany) subkloniert und
anschließend sequenziert.
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Beispiel 2: Bestimmung der Expression
von LEKTI-3 durch Real-time RT-PCR
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Gesamt-RNA
aus kultivierten Keratinozyten menschlicher Vorhäute, aus
HaCaT-Zellen und aus Haut wurde mit TRIzol (Invitrogen, Hamburg,
Germany) gewonnen. Andere Gesamt-RNAs aus verschiedenen Geweben
wurden von BD Bioscience Clontech (Heidelberg, Germany) bezogen.
Die reverse Transkription erfolgte aus 2 μg Gesamt-RNA
mit einem oligo(dT)18 Primer und der Superscript II RNaseH-Reversen
Transcriptase (Invitrogen). Das verwendete Paar Gen-spezifischer
PCR-Primer (forward Primer: 5'-ACC TCA GCT GGA CAA AGC AG-3'; reverse
Primer: 5'-TGG CAA GTC ACC AAG AAA CA-3') ermöglicht die
Amplifizierung eines 322 bp LEKTI-3-Fragmentes, das alle drei Exon-Intron-Grenzen
umfasst. Die Real-time RT-PCR Experimente wurden mit dem SYBR® Premix Ex TaqTM Kit
(Takara Bio, Heidelberg, Germany) in einem Fluoreszenz-Thermocycler
nach den Angaben des Herstellers (LightCycler, Roche Molecular Biochemicals,
Hamburg, Germany) durchgeführt. Die Amplifikationsprodukte
wurden durch 2,0% Agarose-Gelelectrophorese analysiert und, wenn
nötig, noch aufgereinigt und sequenziert, um ihre Identität
zu bestätigen. Durch Quantifizierung bei jeder cDNA in
einer gesonderten PCR-Reaktion wurde das ”housekeeping”-Gen
GAPDH (Glyceraldehyd Phosphodehydrogenase) als interne Kontrolle
verwendet.
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Beispiel 3: Expression eines rekombinanten
LEKTI-3-Fragmentes
-
Die
rekombinante Expression der spink6 cDNA wurde in E. coli durchgeführt.
Dazu wurde die spink6 cDNA in die prokaryotischen Expressionsvektoren
pET-32a (Novagen, North Ryde, Australia) und pET-SUMO (Invitrogen),
wie beschrieben (Wu and Meyer-Hoffert et al., J Invest Derm
in press) subkloniert. Das SUMO-His-tagged Fusionsprotein
wurde mit SUMO Protease nach Angaben des Herstellers (Lifesensors
Inc., Pennsylvania, USA) verdaut und über eine Jupiter-5μg-C4-300A
HPLC Säule (Phenomenex, Aschaffenburg, Germany) aufgereinigt.
Die Reinheit und die Sequenz des Peptides wurden mittels ESI-QTOF-Massenspektrometrie überprüft
(Micromass, Manchester, U. K.).
-
Beispiel 4: Herstellung von Antikörper
gegen LEKTI-3
-
Die
polyklonalen Antisera gegen die Aminosäuresequenz des humanen
LEKTI-3-Fragmentes (SEQ ID: NO 2) wurden in der Ziege hergestellt.
Die Gesamtmenge 1,0 mg des Fusionsproteins (pET-32a-LEKTI-3) wurde
mit der Glutarataldeyd Methode (Briand, J. P., Müller,
S. und Van Regenmortel, M. H. (1985). Synthetic peptides as antigens:
Pitfalls of conjugation methods. J. Immunol. Methods. 78: 59–69)
zu Maleimid-aktiviertem keyhole limpet Hemocyanin (KLH) (Protein
KLH 1:1 w/w) konjugiert und anschließend für den
Gebrauch als Immungen mit 500 μg pET-32a-LEKTI-3 gemischt.
-
Die
Immunisierung der Ziege wurde viermal durchgeführt an den
Tagen 0, 14, 28 und 35. Das Blut der Ziege wurde 2 Wochen nach dem
letzten „booster” entnommen. Das Serum wurde bis
zum Gebrauch bei –70°C aufbewahrt. Die Antisera
wurden durch die Absorption an hiT rap NHS-aktivierte HP 1 ml Säulen
(American Biosciences, Freiburg, Germany) mit kovalent-gebundenem
rLEKTI-3 Affinitäts-gereinigt. Die Spezifität wurde
mit gereinigtem rLEKTI-3 und Stratum corneum Extrakten mittels Western
Blot getestet.
-
Beispiel 5: Isolierung von natürlichem
LEKTI-3 aus menschlichen Hautproben
-
Gesamtprotein
wurde aus Hornmaterial von verschiedenen Probanden (80–120
g Stratum corneum aus Fersengewebe) wie beschrieben isoliert Meyer-Hoffert
et al., 2009 (PLoS ONE. 2009; 4(2): e4372.) und Affinitäts-gereinigt.
Dafür wurden anti-humanen LEKTI-3-Antikörper (Beispiel
4) zu HiTrap NHS-aktivierten HP 1 ml Säulen (Amersham Biosciences)
kovalent gebunden. Die Affinitäts-gereinigten Fraktionen
wurden ferner durch C2C18 RP-HPLC aufgetrennt. Jede Fraktion wurde
anschließend durch ESI-Massenspektrometrie im positiven
Ionisierungsmodus mit einem Quadrupol orthogonal beschleunigenden
Flugzeit-Massenspektrometer (QTOF-II hybrid mass spectrometer; Micromass,
Manchester, United Kingdom) analysiert. MS/MS wurde zudem angewendet,
um die Identität der Fraktionen zu analysieren.
-
Beispiel 6: Bestimmung der Expression
von LEKTI-3 in der Haut
-
Die
Expression von LEKTI-3 in der Haut wurde mit Hilfe von immunhistochemischer
Färbung von Paraffin-Schnitten untersucht. Die Fixierung
der Gewebeproben wurde in 4% Paraformaldehyd durchgeführt.
Es wurden Paraffin Bereiche (5 μm) der Gewebeproben deparaffiniert
und rehydriert, bevor eine hitzeinduzierte Antigen Rückgewinnung
in 0,01 M Citratpuffer (pH 6,0) durchgeführt wurde. Diese
Paraffin Bereiche wurden anschließend vor der Färbung
mit normalem Hasenserum (1:75, Dako Cytomation, Glostrup, Denmark)
blockiert. Die immunohistochemische Färbung wurde mit Affinitäts-gereinigten
polyklonalen Ziegen-LEKTI-3 Antikörper (1:200 Verdünnung)
für 1 Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die Bereiche wurden mit biotiniliertem Anti-Ziege IgG (1:100, Dako
Cytomation) inkubiert, anschließend mit dem Vector Universal
ABC Alkaline Phophatase Substrate Kit (Vector, Burlingame, CA, USA)
inkubiert und mit Vector NovaRED Substrate (Vector) entwickelt.
Schließlich wurde eine Gegenfärbung mit Hematoxylin
durchgeführt. Die Spezifität wurde durch Blockieren
des primären Antikörpers mit dem rekombinanten
LEKTI-3-Peptid getestet, und die Negativ-Kontrollen erfolgten durch
Färbung der Bereiche mit präimmunen Ziegen-Sera.
-
Beispiel 7: Bestimmung der biologischen
Aktivität von LEKTI-3
-
Zur
Charakterisierung der Protease-inhibitorischen Aktivität
von LEKTI-3 wurde die prozentuale Inhibition für verschiedene
Serin-Proteasen bestimmt (Tabelle 1). Alle Protease-Assays erfolgten
durch Bestimmung der Freisetzung von chromogenischem Substrat durch
die Proteasen. Die Aktivität aller Proteasen (Tabelle 1)
wurde im vom Hersteller empfohlenen Puffer bestimmt. Die spezifischen
Protease-, Substrat- und Inhibitorkonzentrationen sind in Tabelle
1 angegeben. Die Veränderung der Absorbanz bei 405 nm wurde über 16
Stunden verfolgt und mit Enzym-freien Kontrollreaktionen verglichen.
KLK-Inhibition wurde nach Präinkubation des Enzyms mit
dem Inhibitor für 15 min bei 21°C bestimmt.
-
KLK14
(R & D, Systems),
ursprünglich als inaktive Proform, wurde nach den Angaben
des Herstellers aktiviert. Die Konzentration des aktiven KLK14 war
3,19 μM (89 μg/ml). KLK5 (R & D), bereits als aktive Form, wurde
in der Konzentration 3,7 μM (0,149 mg/ml) verwendet.
-
Um
den Ki-Wert zu bestimmen, wurden die aktiven Formen beider Enzyme
in der Konzentration 4 nM mit steigenden rLEKTI-3 Mengen in 100 μl
TNT Puffer (50 mM Tris; 0,15 mM NaCl; 0,05% Tween-20) präinkubiert.
Die Konzentration des Inhibitors wurde anhand von Sequenz-basierten
molaren Extinktionskoeffizienten und Messungen der Absorbanz bei
280 nm berechnet. Die Inkubation mit dem Inhibitor erfolgte für
15 Minuten bei 21°C, gefolgt von der Beigabe des Substrates
(Trypsin Substrat Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNa (Sigma)). Zu jeder Probe
wurden 100 μl T-GPR-pNa-Lösung hinzugefügt,
und die Kinetik-Messungen (Absorbanz bei 405 nm) wurde anschließend
sofort in einem Mikroplatten-Leser (Sunrise) durchgeführt.
Die Endkonzentration jedes Enzyms in einem Gesamtvolumen von 200 μl
betrug 2 nM, die Substratkonzentration 1 mM und die LEKTI-3-Konzentration
bis zu 2000 nM. Die Absorbanz wurde im Falle von KLK14 für
eine Stunde und für KLK5 übernacht gemessen. Die
Ergebnisse wurden anhand der Methode von Baici analysiert (
Baici,
A. (1981) The Specific Velocity Plot: A Graphical Method for Determining
Inhibition Parameters for Both Linear and Hyperbolic Enzyme Inhibitors.
Eur. J. Biochem. 119: 9–14). Tabelle 1: LEKTI-3 Inhibition verschiedener
Serin-Proteasen.
| Proteinase
(Endkonzentration) | LEKTI-3 (nM) | Inhibition (%) | Substrat
(0,33 mM) |
| Bovines
Trypsin (2 nM) | 400 | 0 | N-(p-Tosyl)-Arg-Gly-Val
5-Nitroanilid |
| Cathepsin
G (1 nM) | 666 | 0 | N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe
p-Nitroanilid |
| Chymase
(2 nM) | 666 | 0 | N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe
p-Nitroanilid |
| Humanes
Chymotrypsin (2 nM) | 400 | 0 | 3-Carbomethoxypropionyl-Arg-Pro-Tyr p-Nitroanilin |
| Humanes
Kallikrein 14 (2 nM) | 400 | 99,9 | N(p-Tosyl)-Arg-Gly-Val
5-Nitroanilid |
| Humanes
Kallikrein 5 (5,3 nM) | 400 | 99,9 | N(p-Tosyl)-Arg-Gly-Val
5-Nitroanilid |
| Humanes
Kallikrein 7 (15,8 nM) | 400 | 88,3 | 3-Carbomethoxypropionyl-Arg-Pro-Tyr p-Nitroanilin |
| Humanes
Leukozyt Elastase (2 nM) | 400 | 0 | N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val
p-Nitroanilid |
| Humanes
Plasmin (2 nM) | 400 | 0 | N-(p-Tosyl)-Gly-Pro-Lys
4-Nitroanilid |
| Humanes
Thrombin (1 nM) | 400 | 0 | N-(p-Tosyl)-Gly-Pro-Arg
p-Nitroanilid |
| Matriptase
(0,5 nM) | 400 | 0 | H-D-Ile-Pro-Arg
p-Nitroanilin |
-
Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
-
- - EP 98/08424 [0008]
- - WO 03/070953 A1 [0008]
- - WO 02/066513 A2 [0008]
- - EP 1040190 B1 [0008]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Hadgraft,
J. (2002) Crossing the barrier. In: The Essential Stratum corneum,
R. Marks, J. L. Leveque und R. Voegeli, eds., 103–9 [0002]
- - Lundwall, A. und Brattsand, M. (2008) Kallikrein-related peptidases.
Cell. Mol. Life Sci. 65: 2019–38 [0003]
- - Komatsu, N., Takata, M., Otsuki, N., Ohka, R., Amano, O.,
Takehara, K. und Saijoh, K. (2002) Elevated Stratum corneum hydrolytic
activity in Netherton syndrome suggests an inhibitory regulation
of desquamation by SPINK5-derived peptides. J. Invest. Dermatol.
118: 436–43 [0004]
- - Chavanas, S., Bodemer, C., Rochat, A., Hamel-Teillac, D.,
Ali, M., Irvine, A. D., Bonafe, J. L., Wilkinson, J., Taieb, A.,
Barrandon, Y., et al. (2000) Mutations in SPINK5, encoding a serine
protease inhibitor, cause Netherton syndrome. Nat. Genet. 25: 141–2 [0004]
- - Sprecher, E., Chavanas, S., DiGiovanna, J. J., Amin, S., Nielsen,
K., Prendiville, J. S., Silverman, R., Esterly, N. B., Spraker,
M. K., Guelig, E., et al. (2001) The spectrum of pathogenic mutations
in SPINK5 in 19 families with Netherton syndrome: implications for
mutation detection and first case of prenatal diagnosis. J. Invest.
Dermatol. 117: 179–87 [0004]
- - Mägert, H. J., Ständker, L., Kreutzmann,
P., Zucht, H. D., Reinecke, M., Sommerhoff, C. P., Fritz, H. und Forssmann,
W. G. (1999) LEKTI, a novel 15-domain type of human serine proteinase
inhibitor. J. Biol. Chem. 274: 21499–502 [0004]
- - Descargues, P., Deraison, C., Prost, C., Fraitag, S., Mazereeuw-Hautier,
J., D'Alessio, M., Ishida-Yamamoto, A., Bodemer, C., Zambruno, G.,
und Hovnanian, A. (2006) Corneodesmosomal cadherins are preferential
targets of Stratum corneum trypsin- and chymotrypsin-like hyperactivity
in Netherton syndrome. J. Invest Dermatol. 126: 1622–32 [0004]
- - Komatsu, N., Takata, M., Otsuki, N., Ohka, R., Amano, O.,
Takehara, K. und Saijoh, K. (2002) Elevated Stratum corneum hydrolytic
activity in Netherton syndrome suggests an inhibitory regulation
of desquamation by SPINK5-derived peptides. J. Invest. Dermatol.
118: 436–43 [0004]
- - Hachem, J. P., Houben, E., Crumrine, D., Man, M. Q., Schurer,
N., Roelandt, T., Choi, E. H., Uchida, Y., Brown, B. E., Feingold,
K. R. und Elias, P. M. (2006) Serine protease signaling of epidermal
permeability barrier homeostasis. J. Invest. Dermatol. 126: 2074–86 [0004]
- - Descargues, P., Deraison, C., Bonnart, C., Kreft, M., Kishibe,
M., Ishida-Yamamoto, A., Elias, P., Barrandon, Y., Zambruno, G.,
Sonnenberg, A. und Hovnanian, A. (2005) Spink5-deficient mice mimic
Netherton syndrome through degradation of desmoglein 1 by epidermal
protease hyperactivity. Nat. Genet. 37: 56–65 [0004]
- - Yang, T., Liang, D., Koch, P. J., Hohl, D., Kheradmand, F.
und Overbeek, P. A. (2004) Epidermal detachment, desmosomal dissociation,
and destabilization of corneodesmosin in Spink5-/- mice. Genes Dev.
18: 2354–8 [0005]
- - Descargues, P., Deraison, C., Bonnart, C., Kreft, M., Kishibe,
M., Ishida-Yamamoto, A., Elias, P., Barrandon, Y., Zambruno, G.,
Sonnenberg, A. und Hovnanian, A. (2005) Spink5-deficient mice mimic
Netherton syndrome through degradation of desmoglein 1 by epidermal
protease hyperactivity. Nat. Genet. 37: 56–65 [0005]
- - Hewett, D. R., Simons, A. L., Mangan, N. E., Jolin, H. E.,
Green, S. M., Fallon, P. G. und McKenzie, A. N. (2005) Lethal, neonatal
ichthyosis with increased proteolytic processing of filaggrin in
a mouse model of Netherton syndrome. Hum. Mol. Genet. 14: 335–46 [0005]
- - Mägert, H. J., Ständker, L., Kreutzmann,
P., Zucht, H. D., Reinecke, M., Sommerhoff, C. P., Fritz, H. und Forssmann,
W. G. (1999) LEKTI, a novel 15-domain type of human serine proteinase
inhibitor. J. Biol. Chem. 274: 21499–502 [0005]
- - Mägert, H. J., Kreutzmann, P., Ständker,
L., Walden, M., Drogemüller, K. und Forssmann, WG. (2002) LEKTI:
a multidomain serine proteinase inhibitor with pathophysiological
relevance. Int. J. Biochem. Cell Biol. 34: 573–6 [0005]
- - Deraison, C., Bonnart, C., Lopez, F., Besson, C., Robinson,
R., Jayakumar, A., Wagberg, F., Brattsand, M., Hachem, J. P., Leonardsson,
G. und Hovnanian, A. (2007) LEKTI fragments specifically inhibit
KLK5, KLK7, and KLK14 and control desquamation through a pH-dependent
interaction. Mol. Biol. Cell 18: 3607–19 [0005]
- - Mitsudo, K., Jayakumar, A., Henderson, Y., Frederick, M. J.,
Kang, Y., Wang, M., El-Naggar, A. K. und Clayman, G. L. (2003) Inhibition
of serine proteinases plasmin, trypsin, subtilisin A, cathepsin
G, and elastase by LEKTI: a kinetic analysis. Biochemistry 42: 3874–81 [0006]
- - Deraison, C., Bonnart, C., Lopez, F., Besson, C., Robinson,
R., Jayakumar, A., Wagberg, F., Brattsand, M., Hachem, J. P., Leonardsson,
G. und Hovnanian, A. (2007) LEKTI fragments specifically inhibit
KLK5, KLK7, and KLK14 and control desquamation through a pH-dependent
interaction. Mol. Biol. Cell 18: 3607–19 [0006]
- - Jayakumar, A., Kang, Y., Mitsudo, K., Henderson, Y., Frederick,
M. J., Wang, M., El-Naggar, A. K., Marx, U. C., Briggs, K. und Clayman,
G. L. (2004) Expression of LEKTI domains 6–9' in the baculovirus
expression system: recombinant LEKTI domains 6–9' inhibit
trypsin and subtilisin A. Protein Expr. Purif. 35: 93–101 [0006]
- - Schechter, N. M., Choi, E. J., Wang, Z. M., Hanakawa, Y.,
Stanley, J. R., Kang, Y., Clayman, G. L. und Jayakumar, A. (2005)
Inhibition of human kallikreins 5 and 7 by the serine protease inhibitor
lympho-epithelial Kazal-type inhibitor (LEKTI). Biol. Chem. 386:
1173–84 [0006]
- - Stefansson, K. (2008) Kallikrein-related peptidases in human
epidermis: studies on activity, regulation, and function. Doctoral
thesis, Umeå University, Faculty of Medicine, Public Health
and Clinical Medicine, Dermatology and Venerology [0007]
- - http://www.divaportal.org/umu/abstract.xsql?dbid=1644 [0007]
- - Wu and Meyer-Hoffert et al., J Invest Derm in press [0043]
- - Briand, J. P., Müller, S. und Van Regenmortel, M.
H. (1985). Synthetic peptides as antigens: Pitfalls of conjugation
methods. J. Immunol. Methods. 78: 59–69 [0044]
- - Meyer-Hoffert et al., 2009 (PLoS ONE. 2009; 4(2): e4372.) [0046]
- - Baici, A. (1981) The Specific Velocity Plot: A Graphical Method
for Determining Inhibition Parameters for Both Linear and Hyperbolic
Enzyme Inhibitors. Eur. J. Biochem. 119: 9–14 [0050]
