WO2004098635A1 - Glutamat-rezeptor-antagonisten als neuroprotektiva - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to neuroprotectants for the therapy and prophylaxis of neurological damage, in particular damage which is indirectly or directly attributable to the overactivation of the methyl-D-asparate-type glutamate receptor (hereinafter NMDA-glutamate receptor) and takes it Priority of German patent applications 103 37 098.6, 103 20 336.2 and 103 52 333.2, to which reference is made in terms of content.
  • NMDA-glutamate receptor methyl-D-asparate-type glutamate receptor
  • neuroprotectants is understood to mean therapeutic agents or active substances which help protect nerve cells from cell damage and / or counteract neurodegenerative processes and impairments in neuronal performance.
  • glutamate receptor antagonists which protect the nerve cells against an increased activity of excitatory neurotransmitter receptors (excitotoxicity) or mitigate overactivation.
  • the most important group of receptor antagonists are the NMDA antagonists, which inhibit the NMDA type of the glutamate receptor.
  • NMDA antagonists such as 2-amino-5-phosphonopentanoate ((D) -AP5) and (+/-) - 4- (4-phenylbenzoyl) -piperazin-2,3-dicar boxylic acid (PBPD), which acts at the glutamate binding site
  • NMDA receptor channel blockers such as MK-801, memantine and ketamine, which block the ion channel of the receptor
  • the NMDA antagonists acting at the glycine binding site such as GV96771A, which inhibit the binding of the co-agonist glycine
  • polyamine site antagonists such as Ifenprodil, which inhibit the binding of receptor-stimulating polyamines.
  • BESTATIGUNGSKOPIE Three classes of glutamate receptors (AMPA, kainate and NMDA receptors), which each act as glutamate-dependent ion channels, pass on the postsynaptic signal of the most important excitatory neurotransmitter glutamate.
  • AMPA glutamate receptor
  • NMDA glutamate receptors in the form of different receptor subtypes are widespread throughout the brain and, as crucial excitatory neurotransmitter receptors, are essential for the functioning of the central nervous system (CNS).
  • NMDA glutamate receptor The molecular biology of the NMDA glutamate receptor has been studied in detail in recent years. It was shown that these receptors consist of an NR1 subunit in combination with one or more NR2 subunits and - more rarely - an NR3 subunit (Das, S. et al .: Increased NMDA current and spine density in mice lacking the NMDA receptor subunit NR3A. Nature 393 (1998), 377-381; Chatterton, JE et al .: Excitatory glycine receptors containing the NR3 family of NMDA receptor subunits. Nature 415 (2002), 793-798).
  • the NR2 subunit determine the pharmacology of the NMDA glutamate receptor.
  • NR1 and NR2A are ubiquitously expressed in the CNS, while NR2B, NR2C and NR2D occur less frequently or only in certain regions of the brain. This different composition of the receptor subtypes enables therapeutic approaches with selectively acting antagonists.
  • the complex activation of the NMDA glutamate receptor is responsible for presynaptically released glutamate as an excitatory neurotransmitter and glycine as a modulating neurotransmitter and co-agonist.
  • the activation of the receptor leads to an influx of calcium ions and is associated with an activation of complex cellular signals - especially in the case of prolonged stimulation.
  • antagonists of the glutamate receptor generally have a therapeutic and / or prophylactic potential for all CNS diseases or neuronal conditions in which neurons are threatened or damaged by this process.
  • These "conditions” include cerebral ischemia that occurs in the course of a stroke, as well as newly rodegenerative diseases such as Parkinson's and Huntington's disease, in which the main cause of the disease is not excess glutamate, but increased sensitivity to excitotoxic damage.
  • diseases such as epilepsy and neuropathic pain, which are based on an overactivity of signaling pathways, are possible areas of application for the antagonists of the glutamate receptor. Further applications extend, for example, to the treatment of pain conditions, in particular chronic pain, the treatment of addictions, the treatment of psychiatric disorders and the stimulation of learning and memory performance.
  • Antagonists can inhibit the receptor competitively or non-competitively. While the competitive antagonists of receptor activation e.g. counteracting by the natural agonists glutamate and glycine, the non-competitive antagonists inhibit the receptor regardless of the presence or concentration of the agonists - for example by blocking the ion channel.
  • Competitive inhibition (antagonization) of the NMDA-type glutamate receptor is possible, for example, with 2-amino-5-phosphonovalerate (APV) or 2-amino-5-phosphonoheptanoate (APH).
  • AAV 2-amino-5-phosphonovalerate
  • APH 2-amino-5-phosphonoheptanoate
  • non-competitive inhibition can be achieved by substances that bind to the phencyclidine side of the channels, such as phencyclidine, MK-801, dextrorphan or ketamine.
  • glutamate receptor antagonists in the dosage required for neuroprotection often have an unacceptably strong anesthetic to narcotic effect.
  • numerous NMDA antagonists such as phencyclidine and ketamine were originally developed for the purposes of anesthesia and anesthesia.
  • t-PA is usually administered, which is currently the only thrombolytic approved for stroke treatment.
  • t-PA plays an important role in excitotoxicity (Nicole O; Docagne F Ali C; Margaill I; Carmeliet P; MacKenzie ET; Vivien D and Buisson A, 2001: The proteolytic activity of tissue-plasminogen activator enhances NMDA receptor-mediated signaling; in: Nat Med 7, 59-64). Then depolarized cortical neurons release t-PA, which interacts with and cleaves the NR1 subunit of the glutamate receptor of the NMDA type. This is accompanied by an activation of the receptor activity. The administration of t-PA thus contributes to the cell-damaging excitotoxicity. This results in a neurotoxic effect of t-PA.
  • the object of the present invention to provide an alternative possibility for the treatment and prophylaxis of neurological damage.
  • This object is achieved through the use of substances as neuroprotectants that inhibit t-PA activity.
  • the term “inhibition” encompasses all effects which lead to a reduction or reduction in t-PA activity. This can be, for example, a competitive or non-competitive inhibition, an accelerated breakdown of the t-PA or else a reduction (suppression) of the t-PA expression.
  • the term inhibitor accordingly refers to all substances that cause a reduction in t-PA activity in the cell.
  • the t-PA activity is defined in particular as the activation of the glutamate receptor, preferably the glutamate receptor of the NMDA type.
  • the reduction in the activation of the glutamate receptor by the neuroprotective agent is preferably determined by determining the Ca ++ influx into the cells of the affected tissue while administering the neuroprotective agent.
  • An assay for the presentation of Ca ++ is known to the person skilled in the art and is given under Example 3 in Section II.
  • Inhibitors of t-PA are widely known. For example, it is known that the activity of the t-PA is regulated by the plasminogen activator inhibitor (PAI). Likewise, t-PA can be inhibited by the proteases Neuroserpin or protease Nexin I (PN-1). These inhibitors are serine protease inhibitors that inhibit t-PA in the physiological context. According to the invention, however, they are used as neuroprotective agents.
  • PAI plasminogen activator inhibitor
  • PN-1 proteases Neuroserpin or protease Nexin I
  • TGF- ⁇ transforming growth factor ⁇
  • the plasminogen activating factor DSPA (Desmoteplase) is used as a neuroprotective agent, in particular for the treatment of the (pathological) conditions due to the excitotoxicity.
  • DSPA with its isoforms is described in detail, inter alia, in the patents US 5,830,849 and US 6,008,019. The recombinant production of the DSPA is disclosed in US Pat. No. 5,731,186.
  • DSPA desmoteplase
  • FIG. 1 The primary structure of a particularly preferred isoform of desmoteplase is shown in FIG. 1 (DSPA ⁇ 1).
  • DSPA desmoteplase
  • FIG. 1 Other functionally identical DSPA isoforms can also be used according to the invention. These are also disclosed in the above-mentioned US patents. These plasminogen activating factors are hereinafter referred to as DSPA or Desmoteplase, without this being associated with a limitation to DSPA ⁇ 1.
  • both the native purified DSPA and recombinantly produced DSPA can be used.
  • Derivatives or fragments of the DSPA can also be used, provided they show the neuroprotective effects of the DSPA.
  • the term “DSPA” is therefore understood in the present case as a generic term for native or recombinant DSPA and their derivatives, analogs or fragments that have essentially the same function.
  • the term "derivatives, analogs or fragments" of the DSPA includes, in particular, all proteins or peptides which functionally have the characteristic properties of the native DSPA, especially the increased fibrin specificity compared to the native t-PA.
  • the increased fibrin specificity of the DSPA compared to the t-PA is known from WO 03/037363.
  • the DSPA derivatives and analogs preferably have at least 70 %, preferably at least 80-90% homology to the amino acid sequence of the DSPA according to FIG. 1.
  • DSPA has not only no neurotoxic but also a neuroprotective effect by counteracting the neurotoxic effect of t-PA. It was recognized that DSPA acts as an antagonist to t-PA. Furthermore, it could be shown that high concentrations of DSPA lead to a reduction in the neuronal damage induced by NMDA even if it alone - i.e. was applied without an external administration of t-PA.
  • DSPA as a neuroprotective agent
  • the suitability of the DSPA as a neuroprotective agent is particularly surprising given the neurotoxicity of the t-PA, which has been known since 1995. Since DSPA and t-PA show considerable functional and structural correspondence, it was therefore to be expected that DSPA would also be neurotoxic.
  • a particular advantage of the use of DSPA or its derivatives or fragments according to the invention is based on the fact that, due to the surprisingly found neuroprotective effect of DSPA, a therapeutic can be used which has both fibrinolytic and neuroprotective properties.
  • This advantage is particularly important for stroke treatment, since the tissue damage associated with the stroke includes are to be attributed to the neurotoxic side effects of the body's own and t-PA, which may be administered for therapeutic purposes.
  • the neuroprotective effect of the DSPA can at least counteract these damaging effects of the t-PA.
  • DSPA can therefore be administered as a neuroprotective agent in the treatment of stroke in combination with a thrombolytic agent, for example t-PA.
  • a thrombolytic agent for example t-PA.
  • the therapeutic advantage of the t-PA can be used for the patient and at the same time its neurotoxic side effects by DSPA as Neuroprotective neutralized, or at least weakened.
  • the substances which can be used according to the invention as neuroprotectants can be used for the treatment of a large number of pathological conditions (see above).
  • Applications include the treatment of neurodegenerative diseases such as Parkinson's, Alzheimer's, Huntington's and diabetes, the treatment of pain, the treatment of addictions, the treatment of neurological and psychiatric disorders such as epilepsy, motor disorders, depression, anxiety and memory disorders, a general improvement in cognitive Benefits as well as the treatment of amyotrophic lateral sclerosis.
  • Overactivation of the NMDA glutamate receptor plays an important role in the pathogenesis of these diseases and conditions.
  • the therapeutic effectiveness of the neuroprotectants which can be used according to the invention on the affective state of patients has already been shown in the first clinical studies. In this study, the patients treated with DSPA in their affective state (depression and anxiety) were recorded.
  • depression is comprehensively defined here, i.e. it encompasses all affective or mental disorders that cannot be regarded as an adequate reaction to external conditions, regardless of the physiological or psychological background of their origin.
  • depression particularly includes anxiety. Consequently, the term “anti-depressant” refers comprehensively to a therapeutic agent for the treatment of these disorders.
  • the clinical study was conducted to evaluate the clinical effects and safety of the DSPA ⁇ 1 in acute ichemic stroke (Desmoteplase in Acute Ichemic Stroke, hereinafter DIAS study). This is a placebo-controlled, randomized, double-blind phase II study in which DSPA was administered intravenously to patients within 3 to 9 hours after the onset of stroke symptoms.
  • the proportion of patients affected in the comparable desmoteplase-treated group was only 16.7%.
  • 56 patients took part who were treated with 62 ⁇ g / kg, 90 ⁇ g / kg, 125 ⁇ g / kg DSPA or placebo.
  • the results of the second part of the study confirmed the results of the first part with regard to both reperfusion and reduction in the frequency of depression.
  • a reduction in mood disorders is also possible with higher doses.
  • the dosage may differ.
  • the dosage is advantageously adjusted on the basis of the respective bioequivalence of the substance used.
  • This low dosage is particularly advantageous for post-stroke depression in which a single treatment by i.v. Bolus is administered. Then 90 ⁇ g / kg DSPA may be sufficient. In (sub) chronic applications, far lower doses may suffice. This applies above all to t-PA inhibitors used according to the invention, which lead to a suppression of endogenous t-PA production. In contrast, the doses listed above are preferred for inhibitors which cause competitive inhibition at the NMDA receptor. For less acute clinical pictures, s.c, oral or inhalation formulations are advantageous.
  • t-PA plays a positive role in learning behavior in healthy people (Pawlak 2002 and 2003). It is also known from studies on t-PA-deficient mouse mutants that t-PA in the tonsil body is a critical factor for stress-induced anxiety. represents (Pawlak et al. 2003) and is essential in the induction of fear (Pawlak 2003). Depression, on the other hand, appears to be related to the so-called neuronal plasticity with which the body can react to stress such as injuries. According to previous knowledge, this process is regulated, inter alia, by the activation of t-PA mediated glutamate receptor.
  • LTP long-term potentiation
  • LTD long-term depression
  • the LTD can be induced as "compensation" of a previous LTP or de novo by low-frequency electro-stimulation. Like the LTP, the mechanism is based on the activation of NMDA-type glutamate receptors. However, this leads to a moderate Ca ++ influx and thus to a reduced synaptic effectiveness. This causes depression.
  • t-PA binds to the NMDA-type glutamate receptor, cleaves it and thus activates it. This could be the one used by Pawlak et al. observed influence of neuronal plasticity by t-PA justified his. Depending on the amount of t-PA released, both the development of long-term potentiation and long-term depression could be explained.
  • DSPA as an antagonist blocks the activation of the NMDA glutamate receptor and can thus counteract long-term depression as a result.
  • Pregnant Swiss White mice Central Animal House of the Monash University were killed on day 14-16 of the pregnancy and the uterus taken from ter. The fetuses were removed under sterile conditions, the head was detached, the brain was dissected freely, and the cerebral neocortices were dissected under a section microscope (Industrial and Scientific Supply Co.) by microsection.
  • HBSS Hank's Balance saline solution
  • HBSS Hank's Balance saline solution
  • BSA bovine serum albumin
  • the tissue was cut into small pieces with the tip of a plastic pipette and centrifuged briefly at a strength of 1000 g to collect the fragments.
  • the pellet of the fragments was resuspended in warm (37 ° C.) HBSS (with 3 mg / ml BSA and 1.2 mM MgSO 4 ) containing trypsin (0.2 mg / ml) and deoxyribonuclease I (DNase I, 880 U / ml) and for 5 incubated min at 37 ° C in a shaker water bath.
  • the digestion of the fragments was stopped by adding an equal volume of HBSS (with 3 mg / ml BSA) containing trypsin inhibitor (83.2 ⁇ g / ml), DNase I (880 U / ml) and MgSO 4 (1.22 mM) and for 5 centrifuged at 1000 g for min.
  • the supernatant was drawn off and HBSS containing trypsin inhibitor (0.52 mg / ml), DNase I (880 U / ml) and MgSO 4 (2.7 mM) were added to the pellet.
  • the tissue was broken up by trituration (15 impacts with a 24 gauge caliber) and centrifuged at 1000 g for 5 min.
  • the supernatant was drawn off and the cells were dialyzed in Neurobasal TM medium (InVitrogen, USA; NBM) containing 2% B27 supplement (Invitrogen, USA), 100 U / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin, 0.5 mM L-glutamine and 10% fetal calf serum (dFCS), hereinafter referred to as full NBM, resuspended.
  • the cell density of the suspension and the culture yield were determined by repeated cell counting in hemocytometer chambers.
  • the cells were inoculated into Nunc TM (Denmark) 24 or 96-sample plates at densities of 0.3 x 10 6 or 0.12 x 10 6 cells / sample chamber, which was defined as the in vitro duration of 0 days (0 div).
  • the plates had been previously coated with poly-D-lysine (50 ⁇ g / ml) to promote cell attachment. This Coating was removed after overnight incubation at 37 ° C. After 24 h (1 cell division), the full NBM was replaced by dFCS-free full NBM (2.5% B27 supplement). Half of the serum-free full NBM was replaced every 3-4 divisions.
  • the cells were kept in a humidified CO 2 incubator at 37 ° C.
  • NMDA (30 ⁇ M or 70 ⁇ M) cultured according to the above protocol was added and the cultures were incubated for a further 24 h.
  • the extent of cell death induced was measured by determining the released lactate dehydrogenase (LDH), with complete lysis with TX-100 serving as a comparison (Fig. 2).
  • LDH lactate dehydrogenase
  • the NMDA was added to the cultures in the presence of increasing concentrations of t-PA (5, 50, 250, 500 nM) or DSPA (5, 50, 500 nM) and the cell death was determined in an analogous manner.
  • NMDA 70 ⁇ M was added to a primary culture of cortical neurons at a constant t-PA concentration of 500 nM and increasing DSPA concentrations (5, 50, 500 nM) and the neuronal cell death after 24 h on the basis of the released LDH Quantity determined.
  • An increase in the DSPA concentration shows an inhibition of the t-PA-dependent stimulation of the induced neural cell death.
  • the intracellular calcium concentration was examined by an essay with Fluo- 3 / AM.
  • cortical neurons were cultivated for 9 days (see above) and loaded with 10 ⁇ M Fluo-3 / AM in HEPES-buffered saline.
  • This salt solution contained 135 mM NaCI, 5 mM KCI, 0.62 mMgSO 4 , 1.8 mM CaCI 2 , 10 mM HEPES and 6 mM glucose, pH 7.4 at 37 ° C. for one hour.
  • DMSO (1%) and 0.2% Pluronic F-127 were added to facilitate the dispersion of the paint.
  • the cells were washed with the above-mentioned HEPES buffer containing 1 mM furosemide to prevent the color from escaping from the buffer (which was used in each buffer thereafter).
  • the relative fluorescence units (RFU) of the cells were determined after washing to obtain a baseline and during the treatment period (5 minutes) at 485/530 nm (excitation / emission).
  • a Fluoroskan Ascent Fluorometer (Labsystems) was used for this.
  • NMDA treatment alone caused a significant increase in calcium concentration after one minute (P ⁇ 0.05). These calcium concentrations were increased by 30% if the cells were pretreated with t-PA (30 ⁇ g / ml; 500 nM; P ⁇ 0.05) for five minutes before NMDA administration.
  • Pawlak R. Nagal N., Urano T., Napiorkowska-Pawlak D., Ihara H.,

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Hemmstoffs der t-PA vermittelten Aktivierung des Glutamat-Rezeptors, vorzugsweise des NMDA-Typs, als Neuroprotektivum.

Description

GLUTAMAT-REZEPTOR-ANTAGONISTEN ALS NEUROPROTEKTIVA
Die Erfindung betrifft Neuroprotektiva für die Therapie und Prophylaxe neurologischer Schädigungen, insbesondere von Schädigungen, die auf die Überaktivierung des Glutamat-Rezeptors des methyl-D-asparat-Typs (nachfolgend NMDA-Glutamat-Rezeptor) mittelbar oder unmittelbar zurück- zuführen sind und nimmt die Priorität der deutschen Patentanmeldungen 103 37 098.6, 103 20 336.2 und 103 52 333.2 in Anspruch, auf die inhaltlich Bezug genommen wird.
Unter dem Begriff der "Neuroprotektiva" werden im Sinne der vorliegenden Erfindung Therapeutika oder Wirkstoffe verstanden, die dazu beitragen, Nervenzellen vor Zellschädigung zu schützen und/oder neurodegenerativen Prozessen sowie Beeinträchtigungen der neuronalen Leistung entgegenzuwirken.
Bei der Entwicklung von Neuroprotektiva sind wesentliche Anstrengungen insbesondere auf die Identifikation und/oder die Weiterentwicklung von Glutamat-Rezeptor-Antagonisten gerichtet, die die Nervenzellen gegen eine erhöhte Aktivität erregender Neurotransmitter-Rezeptoren (Exzitotoxizität) schützen oder die Überaktivierung mildern. Die wichtigste Gruppe der Rezeptor-Antagonisten sind die NMDA-Antagonisten, die den NMDA-Typ des Glutamatrezeptors hemmen. Dabei wird zwischen folgenden Agonisten unterschieden: kompetitive NMDA-Antagonisten wie 2-Amino-5-phospho- nopentanoat ((D)-AP5) und (+/-)-4-(4-Phenylbenzoyl)-piperazin-2,3-dicar- boxylsäure (PBPD), die an der Glutamat-Bindestelle wirken, NMDA Rezep- tor Kanal-Blockern wie MK-801 , Memantin und Ketamin, die den lonenkanal des Rezeptors blockieren, den an der Glycin-Bindestelle wirkenden NMDA- Antagonisten wie GV96771A, die die Bindung des Co-Agonisten Glycin hemmen und den Polyamine Site-Antagonisten wie Ifenprodil, die die Bindung Rezeptor-stimulierender Polyamine hemmen.
BESTATIGUNGSKOPIE Drei Klassen von Glutamat-Rezeptoren (AMPA-, Kainat- und NMDA-Rezep- toren), die jeweils als Glutamat-abhängige lonenkanäle fungieren, leiten das postsynaptische Signal des wichtigsten erregenden Neurotransmitters Glutamat weiter. NMDA-Glutamat-Rezeptoren sind in Form unterschiedli- eher Rezeptor-Subtypen im gesamten Gehirn verbreitet und als entscheidende erregende Neurotransmitter-Rezeptoren für die Funktion des zentralen Nervensystems (ZNS) essentiell.
In den letzten Jahren wurde die Molekularbiologie des NMDA-Glutamat- Rezeptors eingehend untersucht. Dabei zeigte sich, daß diese Rezeptoren aus einer NR1 -Untereinheit in Kombination mit einer oder mehreren NR2- Untereinheiten und - seltener - einer NR3-Untereinheit bestehen (Das, S. et al.: Increased NMDA current and spine density in mice lacking the NMDA receptor subunit NR3A. Nature 393 (1998), 377-381 ; Chatterton, J.E. et al.: Excitatory glycine receptors containing the NR3 family of NMDA receptor subunits. Nature 415 (2002), 793-798).
Insbesondere die NR2-Untereinheit, von der die vier Formen A-D existieren, aber auch alternative Splice-Varianten der Untereinheit NR1 , bestimmen die Pharmakologie des NMDA-Glutamat-Rezeptors. NR1 und NR2A werden im ZNS ubiquitär exprimiert, während NR2B, NR2C und NR2D seltener oder nur in bestimmten Regionen des Gehirns vorkommen. Diese unterschiedliche Zusammensetzung der Rezeptor-Subtypen ermöglicht therapeutische Ansätze mit selektiv wirkenden Antagonisten.
Für die komplexe Aktivierung des NMDA-Glutamat-Rezeptors sind präsynaptisch freigesetztes Glutamat als erregender Neurotransmitter und Glycin als modulierender Neurotransmitter und Co-Agonist verantwortlich. Die Aktivierung des Rezeptors führt zu einem Einstrom von Calcium-Ionen und ist - insbesondere bei länger andauernder Stimulierung - mit einer Aktivierung komplexer zellulärer Signale verbunden. Diese führen u.a. zu einer Phosphorylierung des CRE-Bindeproteins (CREB) sowie zu einer multiplen Genaktivierung und synaptischer Plastizität (Neuroplastizität), die eine wesentliche Grundlage für Gedächtnisleistungen und Lernprozesse darstellt.
Eine Übersicht über die allgemeine Pharmakologie des NMDA-Rezeptors und der NMDA-Antagonisten gibt die Veröffentlichung von Kemp, J.A. und McKeman, R.M.: NMDA Receptor Pathways as Drug Targets, Nature Neuroscience, Nov. 2002, Vol. 5 Suppl., 1039-1042, deren Offenbarung vollumfänglich in Bezug genommen wird.
Eine Überaktivierung des Rezeptors und der damit verbundene erhöhte Ca2+-Einstrom führt hingegen zu einer massiven Störung des Ca2+-abhängi- gen zellulären Stoffwechsels - einschließlich des Energiestoffwechsels. Für den nachfolgend eintretenden Zelltod wird insbesondere die Aktivierung Ca2+-abhängiger kataboler Enzyme verantwortlich gemacht (Lee, Jin-Mo et al., "The changing landscape of ischemic brain injury mechanisms"; Dennis W. Zhol "Glutamat neurotoxicity and deseases of the nervous System"). Dieser Prozess ist als Exzitotoxizität bekannt.
Da die Exzitotoxizität auf der Überaktivierung des Glutamat-Rezeptors beruht, besitzen Antagonisten des Glutamat-Rezeptors im allgemeinen ein therapeutisches und/oder prophylaktisches Potential für alle ZNS-Erkrankungen oder neuronalen Zustände, bei denen Neuronen durch diesen Prozess bedroht oder geschädigt werden. Zu diesen "Zuständen" gehören ebenso die im Zuge eines Schlaganfalls auftretende cerebrale Ischämie wie auch neu rodegenerative Erkrankungen wie Parkinson und Chorea Huntington, bei denen nicht überschüssiges Glutamat, sondern eine erhöhte Sensibilität gegenüber exzitotoxischer Schädigung die wesentliche Krankheitsursache darstellt. Schließlich stellen auch Erkrankungen wie Epilepsie und neuropathische Schmerzen, die auf einer Überaktivität erregender Signal- wege beruhen, mögliche Anwendungsbereiche der Antagonisten des Glutamat-Rezeptors dar. Weitere Anwendungen erstrecken sich beispielsweise auf die Behandlung von Schmerzzuständen, insbesondere chronischer Schmerzen, die Behandlung von Suchterkrankungen, die Behandlung psychiatrischer Erkrankungen und die Stimulierung der Lern- und Gedächtnisleistung.
Antagonisten können den Rezeptor kompetitiv oder nicht-kompetitiv hemmen. Während die kompetitiven Antagonisten einer Rezeptoraktivierung z.B. durch die natürlichen Agonisten Glutamat und Glycin entgegenwirken, hemmen die nicht-kompetitiven Antagonisten den Rezeptor unabhängig von der Gegenwart oder Konzentration der Agonisten - etwa durch das Blockieren des lonenkanals. Eine kompetitive Hemmung (Antagonisierung) des Glutamat-Rezeptors des NMDA-Typs ist beispielsweise mit 2-Amino-5- Phosphonovalerat (APV) oder 2-Amino-5-Phosphonoheptanoate (APH) möglich. Eine nicht-kompetitive Hemmung kann dagegen durch Substanzen erreicht werden, die an die Phencyclidin-Seite der Kanäle binden, wie Phen- cyclidin, MK-801 , Dextrorphan oder Ketamin.
Bislang haben klinische Studien zur Verwendung von NMDA-Antagonisten als Neuroprotektiva insbesondere bei Schlaganfall und traumatischen Him- Verletzungen jedoch noch nicht den gewünschten Erfolg erbracht (Kemp, J.A.; Kew, J.N.C.; Gill, R.: Handbook of Experimental Pharmakology Vol. 141 (eds. Jonas, P. & Monyer, H.) 495-527 (Springer, Berlin, 1999); Lees, K.R. et al.: Glycine antagonist (gavestinel) in neuroprotection (GAIN International) in patients with acute STROKE: a randomised controlled trial. GAIN International Investigators. Lancet 355 (2000), 1949-1954; Sacco, R.L. et al. Glycine antagonist in neuroprotection for patients with acute stroke: GAIN Americas: a randomized controlled trial. JAMA 285 (2001 ), 1719-1728).
Die bisher wenig erfolgreichen Versuche zur Neuroprotektion bei Schlaganfall lassen sich unter anderem vermutlich darauf zurückführen, daß die bekannten Neuroprotektiva notwendigerweise mit Thrombolytika kombiniert werden müssen, um zum Ort der Gewebeschädigung vorzudringen und dort ihre Wirkung zu entfalten. Des weiteren können die bekannten NMDA- Glutamat-Rezeptor Antagonisten aufgrund ihrer beträchtlichen Nebenwirkungen in der Regel nicht ausreichend hoch dosiert verabreicht werden, um die wunschgemäße Wirkung zu erzielen. In hohen Dosierungen verursachen sie nämlich u.a. Halluzinationen sowie eine deutliche Erhöhung des Blutrucks. Letzteres ist naturgemäß gerade bei Schlaganfall-Patienten besonders kritisch.
Des weiteren haben die bekannten Glutamat-Rezeptor-Antagonisten in der für die Neuroprotektion erforderlichen Dosierung häufig eine nicht akzeptable stark betäubende bis narkotische Wirkung. So wurden zahlreiche NMDA-Antagonisten wie Phencyclidin und Ketamin ursprünglich zu Zwecken der Anästhesie und Narkose entwickelt.
Es wurde daher versucht, diese Nebenwirkungen mit Rezeptor-selektiven NMDA-Antagonisten zu vermeiden. Dabei zeigten sich für den NR2B selektiven Antagonisten Ifenprodil im Tiermodell für Schlaganfall vorteilhafte Wirkungen bei deutlich verminderten Nebenwirkungen (Gotti, B. et al. Ifenprodil and SL 82.0715 as cerebral anti-ischemic agents. Evidence for efficacy in modeis of focal cerebral ischemia. J. Pharmacoil. Exp. Ther. 247 (1988), 1211-1221 ). Eine Zahl weiterer Antagonisten der NR2B-Untereinheit - so z.B. CP-101606, Ro 25-6981 und Ro 63-1908 - ist seither beschrieben worden (Kemp, J.A.; Kew, J.N.C.; Gill, R.: Handbook of Experimental Pharma- kology Vol 141 (eds. Jonas, P. & Monyer, H.) 495-527 (Springer, Berlin, 1999); Gill R. et al.: Pharmacological characterization of RO63-1908 (1-[2- (4-hydroxy-phenoxy)-ethyl]-4-(4-methyl-benzyl)-piperidin-4-01 ), a novel sinotype-selective N-methyl-D-asparatate antagonist. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302 (2002), 940-948). Auch diese zeigten im Tiermodell durchaus eine neuroprotektive Wirkung bei geringen Nebenwirkungen. Diese positiven Ergebnisse ließen sich in klinischen Studien zur traumatischen Himverlet- zung jedoch nicht bestätigen. Vielmehr versagte CP-101606 wiederholt (Pressemitteilung von Pfizer, Oktober 2001 ).
Bei der Suche nach einem geeigneten Neuroprotektivum zur Minderung der Zellschädigung bei Schlaganfall besteht zudem das besondere Problem, daß die Neuroprotektiva mit einem Fibrinolytikum/Thrombolytikum kombiniert werden müssen, um die Barriere des Thrombus zu überwinden und in den Bereich des geschädigten Gewebes vorzudringen (siehe oben). Als Thrombolytikum wird in der Regel t-PA verabreicht, bei dem es sich um das derzeit einzig für die Schlaganfallbehandlung zugelassene Thrombolytikum handelt.
Durch die Untersuchungen von Nicole et al. ist jedoch bekannt, daß t-PA eine wichtige Rolle bei der Exzitotoxizität zukommt (Nicole O; Docagne F Ali C; Margaill I; Carmeliet P; MacKenzie ET; Vivien D und Buisson A, 2001 : The proteolytic activity of tissue-plasminogen activator enhances NMDA receptor-mediated signaling; in: Nat Med 7, 59-64). Danach schütten depolarisierte kortikale Neuronen t-PA aus, das mit der NR1 Untereinheit des Glutamat Rezeptors des NMDA Typs interagiert und diese spaltet. Damit geht eine Aktivierung der Rezeptoraktivität einher. Die Verabreichung von t-PA trägt somit zu der zeilschädigenden Exzitotoxizität bei. Daraus folgt eine neurotoxische Wirkung des t-PA. Die Entwicklung eines Neuroprotektivums für die Prophylaxe und Behandlung von Zellschäden beim Schlaganfall steht somit vor der besonderen Herausforderung, nicht nur die durch den Schlaganfall bedingten Zellschäden zu mildern, sondern auch möglichst diejenigen Schäden zu berücksichtigen, die durch die Gabe des Therapeutikums zur Wiedereröffnung der Gefäße verursacht oder verstärkt werden.
Es ist somit die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine alternative Möglichkeit zur Behandlung und Prophylaxe neurologischer Schäden bereitzustellen. Diese Aufgabe wird gelöst durch die Verwendung von Substanzen als Neuroprotektiva, die die t-PA Aktivität hemmen. Der Begriff "Hemmung" umfaßt in diesem Zusammenhang alle Effekte, die zu einer Verringerung bzw. Reduktion der t-PA Aktivität führen. Dabei kann es sich beispielsweise um eine kompetitive oder nicht-kompetitive Hemmung, einen beschleunigten Abbau des t-PA oder aber auch um eine Reduktion (Suppression) der t-PA Expression handeln. Der Begriff Hemmstoff bezieht sich entsprechend auf alle Substanzen, die eine Reduktion der t-PA Aktivität in der Zelle verursa- chen.
Die t-PA Aktivität wird insbesondere als die Aktivierung des Glutamat- Rezeptors, vorzugsweise des Glutamat-Rezeptors des NMDA-Typs definiert. Die Verminderung der Aktivierung des Glutamat-Rezeptors durch das Neuroprotektivum wird vorzugsweise durch die Bestimmung des Ca++Εinstroms in die Zellen des betroffenen Gewebes ermittelt unter Gabe des Neuroprotektivums. Ein Assay zur Darstellung des Ca++ ist dem Fachmann bekannt und unter Beispiel 3 in Ziffer II angegeben.
Hemmstoffe des t-PA sind umfangreich bekannt. So ist beispielsweise bekannt, daß die Aktivität des t-PA durch den Plasminogen Aktivator Inhibitor (PAI) reguliert wird. Ebenso kann t-PA durch die Proteasen Neuroserpin oder Protease Nexin I (PN-1) inhibiert werden. Bei diesen Inhibitoren handelt es sich jeweils um Serin-Protease-Inhibitoren, die im physiologischen Kontext t-PA hemmen. Erfindungsgemäß werden sie jedoch als Neuroprotektiva eingesetzt.
Es ist erfindungsgemäß auch möglich, die t-PA Aktivität mittelbar über die Erhöhung der Transkriptionsrate der physiologischen Hemmstoffe zu redu- zieren. So kann beispielsweise TGF-ß (transforming growth factor ß) verabreicht werden, von dem bekannt ist, daß er die Transkription von PAI -1 stimuliert. ln einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Plasminogen Aktivierende Faktor DSPA (Desmoteplase) als Neuroprotektivum eingesetzt, insbesondere zur Behandlung von den auf die Exzitotoxizi- tat zurückgehenden (pathologischen) Zuständen. DSPA mit seinen Isoformen ist unter anderem in den Patentschriften US 5,830,849 sowie US 6,008,019 ausführlich beschrieben. Die rekombinante Herstellung des DSPA ist in der US Patenschrift 5,731 ,186 offenbart. Diese Druckschriften werden zu Zwecken der Offenbarung der Struktur, der Funktion und der Bereitstellung des DSPA vollumfänglich in Bezug genommen.
Die Primärstruktur einer besonders bevorzugt verwendeten Isoform der Desmoteplase ist in der Fig. 1 dargestellt (DSPA α1 ). Allerdings können erfindungsgemäß auch andere funktionsgleiche DSPA-Isoformen eingesetzt werden. Diese sind ebenfalls in den oben genannten US Patenten offenbart. Diese Plasminogen Aktivierenden Faktoren werden nachfolgend einheitlich als DSPA oder Desmoteplase bezeichnet, ohne daß damit eine Begrenzung auf DSPA α1 verbunden wäre.
Erfindungsgemäß kann sowohl das native gereinigte DSPA als auch rekom- binant hergestelltes DSPA eingesetzt werden. Ebenso können Derivate oder Fragmente des DSPA einsetzt werden, sofern sie die neuroprotektiven Wirkungen des DSPA zeigen. Der Begriff "DSPA" wird vorliegend daher als Oberbegriff für natives oder rekombinantes DSPA sowie deren im wesentli- chen funktionsgleichen Derivate, Analoga oder Fragmente verstanden.
Unter den Begriffen "Derivate, Analoga oder Fragmente" des DSPA werden insbesondere alle Proteine oder Peptide subsumiert, die funktioneil die charakteristischen Eigenschaften des nativen DSPA vor allem die gegenüber dem nativen t-PA erhöhte Fibrinspeziftät aufweisen. Die gegenüber dem t- PA erhöhte Fibrinspezifität des DSPA ist aus der WO 03/037363 bekannt. Vorzugsweise weisen die DSPA-Derivate und Analoga eine mindestens 70 %-ige, vorzugsweise eine mindestens 80-90 % Homologie zu der Aminosäuresequenz des DSPA gemäß Fig. 1 auf.
Die überraschende erfindungsgemäße neuroprotektive Wirkung des DSPA wurde in Tierversuchen und in in ϊro-Versuchen identifiziert, in denen gezeigt werden konnte, daß DSPA nicht nur keine neurotoxische, sondern auch eine neuroprotektive Wirkung hat, indem es der neurotoxischen Wirkung von t-PA entgegenwirkt. Es wurde darin erkannt, daß DSPA als Antagonist zum t-PA wirkt. Des weiteren konnte gezeigt werden, daß hohe Kon- zentrationen von DSPA auch dann zu einer Verminderung der durch NMDA induzierten neuronalen Schädigungen führen, wenn es allein - d.h. ohne eine externe Gabe von t-PA - appliziert wurde.
Zur experimentellen Untersuchung der neuroptotektiven Wirkung des DSPA wurden Kulturen isolierter cortikaler Neuronen aus Mäuse-Foeten mit NMDA behandelt, um damit den neuronalen Zelltod zu induzieren. Zusätzlich zu NMDA enthielten die Kulturmedien unterschiedliche Mengen t-PA und/oder DSPA. Diese in w'fro-Versuche zeigen, daß t-PA eine Potentierung des durch NMDA ausgelösten Zelltodes bewirkt, während DSPA diesen Effekt nicht verursacht (Fig 2). Wurde DSPA dagegen gemeinsam mit t-PA appliziert, verminderte sich der NMDA-induzierte Zelltod im Vergleich zu t-PA allein signifikant (Fig. 3). Dabei wurde zudem deutlich, daß DSPA konzentrationsabhängig die durch t-PA verstärkte neurale Zellschädigung deutlich reduzieren kann.
Des weiteren wurden Untersuchungen zur Bestimmung des Ca++-Einstroms bei einer vorherigen Gabe von DSPA bzw. t-PA durchgeführt, da die Verminderung des durch die Aktivierung des Glutamat-Rezeptors verursachten Ca++-Einstroms bekanntermaßen als Indikator für die Neuroprotektivität der jeweiligen Testsubstanz gilt. Auch in diesen Versuchen bestätigte sich die Neuroprotektivität des DSPA, da DSPA den Ca++-Einstrom in die Zelle nicht erhöhte und der schädigenden Wirkung des t-PA entgegenwirkte (Fig. 4). Der Mechanismus der neuroprotektiven Wirkung des DSPA ist noch nicht abschließend verstanden. Er könnte aber möglicherweise darauf beruhen, daß DSPA zwar wie t-PA an den Glutamat-Rezeptor bindet, diesen aber nicht spaltet und somit nicht aktiviert. DSPA würde so selber nicht zur Exzitotoxizität beitragen und möglicherweise die Aktivierung des Rezeptors durch t-PA blockieren.
Die Eignung des DSPA als Neuroprotektivum ist insbesondere vor dem Hintergrund der seit 1995 bekannten Neurotoxizität des t-PA überraschend. Da DSPA und t-PA eine erhebliche funktioneile und strukturelle Übereinstimmung aufweisen, war daher nämlich zu erwarten, dass auch DSPA neu- rotoxisch ist.
Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen Verwendung des DSPA oder dessen Derivate oder Fragmente basiert darauf, daß aufgrund der überraschenderweise gefundenen neuroprotektiven Wirkung von DSPA ein The- rapeutikum eingesetzt werden kann, daß sowohl fibrinolytische als auch neuroprotektive Eigenschaften aufweist.
Dieser Vorteil wirkt sich insbesondere bei der Schlaganfallbehandlung aus, da die mit dem Schlaganfall verbundenen Gewebeschädigungen u.a. auf die neurotoxischen Nebenwirkungen des körpereigenen sowie des ggf. zu therapeutischen Zwecken verabreichten t-PA zurückzuführen sind. Durch die neuroprotektive Wirkung des DSPA kann diesen schädigenden Effekten des t-PA mindestens entgegengewirkt werden.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung kann DSPA daher als Neuroprotektivum bei der Behandlung des Schlaganfalls in Kom- bination mit einem Thrombolytikum, beispielsweise t-PA, verabreicht werden. So kann der therapeutische Vorteil des t-PA für den Patienten genutzt und gleichzeitig dessen neurotoxische Nebenwirkungen durch DSPA als Neuroprotektivum neutralisiert, oder aber mindestens abgeschwächt werden.
Die erfindungsgemäß als Neuroprotektiva einsetzbaren Substanzen können für die Behandlung einer Vielzahl pathologischer Zustände verwendet werden (siehe oben). Zu den Anwendungsmöglichkeiten gehören die Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen wie Parkinson, Alzheimer, Chorea Huntington und Diabetes, die Behandlung von Schmerzzuständen, die Behandlung von Suchterkrankungen, die Behandlung neurologischer und psychiatrischer Erkrankungen wie Epilepsie, motorische Störungen, Depressionen, Angstzustände und Gedächtnisstörungen, eine allgemeine Verbesserung kognitiver Leistungen sowie die Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose. Bei der Pathogenese dieser Erkrankungen bzw. Zustände spielt die Überaktivierung des NMDA-Glutamat-Rezeptors jeweils eine bedeu- tende Rolle.
Die therapeutische Effektivität der erfindungsgemäß einsetzbaren Neuroprotektiva auf den affektiven Zustand von Patienten konnte bereits in ersten klinischen Untersuchungen gezeigt werden. In dieser Studie wurden die mit DSPA behandelten Patienten in ihrem affektiven Zustand (Depressionen und Angstzustände) erfaßt.
Der Terminus "Depression" wird vorliegend umfassend definiert, d.h. er erfaßt alle affektiven oder mentalen Störungen, die nicht als adäquate Reak- tion auf äußere Bedingungen angesehen werden können, unabhängig von den physiologischen oder psychologischen Hintergründen ihrer Entstehung. Der Begriff "Depression" umfaßt insbesondere auch Angstzustände. Folglich bezieht sich der Begriff "Anti-Depressivum" umfassend auf ein Thera- peutikum zur Behandlung dieser Störungen.
Die klinische Studie wurde zur Evaluierung der klinischen Wirkung und Sicherheit des DSPA α1 in akutem ichemischen Schlaganfall durchgeführt (Desmoteplase in Acute Ichemic Stroke, nachfolgend DIAS-Studie). Dabei handelt es sich um eine placebokontrollierte, randomisierte Doppelblindstudie der Phase II, bei der DSPA den Patienten innerhalb eines 3- bis 9-stün- digen Zeitraums nach dem Einsetzen der Schlaganfallsymptome intravenös appliziert wurde.
Im ersten Teil der Studie nahmen 46 Patienten teil, die danach ausgewählt wurden, ob ihre vom Schlaganfall betroffenen Gehirnbereiche irreversibel geschädigt oder aber die teilgeschädigten bzw. gefährdeten Gehirnbereiche noch zu retten waren. Lediglich diejenigen Patienten wurden in die Studie aufgenommen, bei denen vorgeschädigte Gehirnbereiche durch Reperfu- sion mittels eines Thrombolytikums potentiell gerettet werden können. Die Auswahl der Patienten erfolgte über MRI (Magnetic Resonance Imaging).
Von den 46 untersuchten Patienten wurden 16 Patienten mit Placebo behandelt. Die übrigen 30 erhielten ein Desmoteplase-Präparat, wobei 17 Patienten mit 25 mg des Wirkstoffs und 13 Patienten mit 37,5 bzw. 50 mg behandelt wurden.
Mehr als 56 % der placebobehandelten Patienten klagten über Depressionen. Diese Depressionen wurden zwar von dem jeweiligen behandelnden Arzt als Depression klar diagnostiziert, eine eindeutige Zuordnung zu einer spezifischen Erscheinungsform der Depressionen konnte jedoch aufgrund fehlender weiterführender Informationen nicht vorgenommen werden. Die- ses depressive Syndrom wurde daher von den behandelnden Ärzten jeweils als "Depression NOS", nämlich als "not otherwise specified" kategorisiert.
Während demnach mehr als die Hälfte der placebobehandelten Patienten diese unspezifizierten Depressionen zeigte, lag der Anteil der davon betrof- fenen Patienten in der vergleichbaren Desmoteplase-behandelten Gruppe bei insgesamt nur 16,7 %. Im zweiten Teil der Studie nahmen 56 Patienten teil, die u.a. mit 62 μg/kg, 90 μg/kg, 125 μg/kg DSPA oder mit Placebo behandelt wurden. Die Ergebnisse des zweiten Teils der Studie bestätigten die Ergebnisse des ersten Teils sowohl hinsichtlich der Reperfusion als auch hinsichtlich der Senkung der Depressionshäufigkeit.
Ausgehend von diesen Ergebnissen ist für DSPA α1 eine Dosierung von größer 60 und kleiner 160 μg/kg, insbesondere von 90 bis 125 μg/kg zur Behandlung effektiver Störungen bevorzugt. Eine Reduktion der affektiven Störungen ist jedoch auch bei höheren Dosierungen möglich.
Bei der Verwendung anderer DSPA-Isoformen oder aber von DSPA-Deri- vaten, Analoga oder Fragmenten kann die Dosierung davon abweichen. Die Dosierung wird in diesen Fällen vorteilhafterweise ausgehend von der jewei- ligen Bioäquivalenz der verwendeten Substanz angepaßt.
Diese niedrige Dosierung ist insbesondere bei einer Depression nach Schlaganfall (Post-Stroke Depression) vorteilhaft, bei der eine Einmalbehandlung mittels i.v. Bolus Verabreichung erfolgt. Dann können bereits 90 μg/kg DSPA ausreichend sein. Bei (sub)chronischen Anwendungen können weitaus niedrigere Dosierungen genügen. Dies gilt vor allem für erfindungsgemäß eingesetzte t-PA Hemmstoffe, die zu einer Supprimierung der endogenen t-PA Produktion führen. Bei Hemmstoffen, die eine kompetitive Hemmung am NMDA Rezeptor verursachen, sind dagegen die oben aufgeführ- ten Dosierungen bevorzugt. Für weniger akute Krankheitsbilder sind s.c, orale oder inhalative Formulierungen vorteilhaft.
Die Bedeutung des t-PA für den affektiven Zustand und das Lernverhalten des Menschen ist bekannt. So spielt t-PA beim gesunden Menschen eine positive Rolle beim Lernverhalten (Pawlak 2002 und 2003). Ebenso ist aus Untersuchungen an t-PA-defizienten Mäusemutanten bekannt, daß t-PA im Mandelkörper einen kritischen Faktor für streßinduzierte Angstzustände dar- stellt (Pawlak et al. 2003) und bei der Induktion von Angst wesentlich ist (Pawlak 2003). Die Entstehung einer Depression scheint dagegen im Zusammenhang mit der sog. neuronalen Plastizität zu stehen, mit der der Körper auf Streß wie beispielsweise Verletzungen reagieren kann. Dieser Prozeß wird nach dem bisherigen Erkenntnissen u.a. durch die t-PA vermittelte Glutamatrezeptor Aktivierung reguliert.
Zusammenschauend ergibt sich aus den bekannten Untersuchungen, daß das durch Streß oder Verletzungen freigesetzte körpereigene t-PA ein Signal für die postsynaptische Zelle darstellt und als "Trigger" für plastische neuronale Veränderungen wirkt.
Bei dem der Neuroplastizität zugrundeliegenden Mechanismus handelt es sich vermutlich um die sogenannte long term potentiation (LTP) sowie die long term depression (LTD). Die LTP wird durch eine hochfrequente Anregung der Neuronen und die dadurch ausgelöste erhöhte Depolarisation induziert. Diese Langzeitpotenzierung beruht auf der glutamatabhängigen Aktivierung von NMDA-Glutamat-Rezeptoren, die zu einer erhöhten Ca++- Freisetzung führt. Die erhöhte Calcium-Konzentration bewirkt eine erhöhte Effektivität der Synapse und erlaubt damit eine Anpassung an die jeweiligen Umstände.
Die LTD kann als "Kompensation" einer vorangegangenen LTP oder auch de novo durch niedrig-frequente Elektro-Stimulation induziert werden. So wie die LTP basiert der Mechanismus auf der Aktivierung von Glutamat- Rezeptoren des NMDA-Typs. Diese führt jedoch zu einem moderaten Ca++- Influx und damit zu einer nur reduzierten synaptischen Effektivität. Diese verursacht Depressionen.
Nun ist bekannt, daß t-PA an den Glutamat-Rezeptor des NMDA-Typs bindet, diesen spaltet und somit aktiviert. Hierin könnte die bei Pawlak et al. beobachtete Beeinflussung der neuronalen Plastizität durch t-PA begründet sein. In Abhängigkeit von der Menge des ausgeschütteten t-PA wäre sowohl die Entstehung einer Langzeitpotenzierung als auch einer Langzeitdepression erklärbar.
Aus den dargestellten Untersuchungen zu der erfindungsgemäßen neuroprotektiven Wirkung des DSPA läßt sich somit ableiten, daß DSPA als Antagonist die Aktivierung des NMDA-Glutamat-Rezeptors blockiert und damit im Ergebnis einer Langzeitdepression entgegenwirken kann.
Die unterschiedliche Wirkung von DSPA und t-PA auf die synaptische Aktivität - und damit auf LTP und/oder LTD - wird auch durch Calcium-Mobilisa- tionsexperimente an neuronalen Zellen deutlich (siehe oben). Diese in vitro-V 'ersuche zeigen, daß die Behandlung neuronaler Zellen mit t-PA zu einer NMDA-abhängigen Calcium-Freisetzung führt, während dieselbe Behandlung mit DSPA keinen Einfluß auf die intrazelluläre Calcium-Kon- zentration hatte (s. Fig. 4). Der durch t-PA verursachte Konzentrationsanstieg betrug 30 % gegenüber der Kontrollgruppe.
Ausführungsbeispiele
I. Klinische Studie (DIAS)
Die Ergebnisse der DIAS Studie bezüglich der DSPA-Wirkungen auf effektive Störungen (Depression und Angstzustände) sind in Fig. 5 zusammen- gefaßt.
II. in wϊro-Untersuchungen an murinen corticalen Neuronen
Kultur primärer cortikaler Säuqer-Neuronen:
Schwangere Swiss White-Mäuse (Zentrales Tierhaus der Monash Univer- sity) wurden am Tag 14-16 der Schwangerschaft getötet und die Gebärmut- ter entnommen. Die Foeten wurden unter sterilen Bedingungen entnommen, der Kopf abgetrennt, das Gehirn frei präpariert und die cerebralen Neocorti- zes unter einem Sektionsmikroskop (Industrial and Scientific Supply Co.) durch Mikrosektion präpariert. Die Sektion wurde über Eis in Hank's Balance Salzlösung (HBSS; 137 mM NaCI, 5.37 mM KCI, 4.10 mM NaHCO3, 44 mM KH2P04, 0.13 mM NaHPO4, 10 mM HEPES, 1 mM Pyruvat, 13 mM D(+)Glucose und 0.001 g/L Phenolrot) enthaltend 3 mg/ml bovines Serumalbumin (BSA) und 1.2 mM MgSO4 (pH 7.4) durchgeführt. Meningen und Blutgefäße wurden sorgfältig entfernt. Das Gewebe wurde mit der Spitze einer Plastikpipette in kleine Stücke zerkleinert und kurz bei einer Stärke von 1000 g zentrifugiert, um die Fragmente zu sammeln. Das Pellet der Fragmente wurde in warmem (37°C) HBSS (mit 3 mg/ml BSA und 1.2 mM MgS04) enthaltend Trypsin (0.2 mg/ml) und Desoxyribonuclease I (DNase I, 880 U/ml) resuspendiert und für 5 min bei 37°C im Schüttler-Wasserbad inkubiert. Der Verdau der Fragmente wurde durch die Zugabe eines gleich großen Volumens HBSS (mit 3 mg/ml BSA) enthaltend Trypsin Inhibitor (83.2 μg/ml), DNase I (880 U/ml) und MgSO4 (1.22 mM) gestoppt und für 5 min bei 1000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgezogen und HBSS enthaltend Trypsininhibitor (0.52 mg/ml), DNase I (880 U/ml) und MgS04 (2.7 mM) wurde zum Pellet dazugegeben. Das Gewebe wurde durch Trituration aufgebrochen (15 Stöße mit einer Kaliber 24 Nadel) und 5 min bei 1000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgezogen und die Zellen in Neurobasal™ Medium (InVitrogen, USA; NBM) enthaltend 2% B27 Supplement (Invitrogen, USA), 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin, 0.5 mM L-Glutamin und 10% dialysiertes foetales Kälberserum (dFCS), im folgenden als Voll-NBM bezeichnet, resuspendiert. Die Zelldichte der Suspension und Kulturausbeute wurde durch wiederholte Zellzählung in Hämocytometer-Kammern ermittelt. Die Zellen wurden jeweils in Nunc™ (Denmark) 24- oder 96-Proben Platten bei Dichten von 0.3 x 106 oder 0.12 x 106 Zellen/Probenkammer angeimpft, was als in vitro Dauer von 0 Tagen (0 div) definiert wurde. Die Platten waren zuvor mit poly-D-Lysin (50 μg/ml) beschichtet worden, um die Zellanhaftung zu fördern. Diese Beschichtung wurde nach einer Übernacht-Inkubation bei 37°C entfernt. Nach 24 h (1 Zellteilung) wurde das Voll-NBM durch dFCS-freies Voll-NBM (2.5% B27 Supplement) ersetzt. Alle 3-4 Teilungen wurde die Hälfte des Serum-freien Voll-NBM ersetzt. Die Zellen wurden in einem befeuchteten CO2-lnkubator bei 37°C gehalten und mittels invertierter Phasenkontrast- Mikroskopie (Olympus, IMT-2) untersucht. Um die Morphologie der Zellkulturen im Laufe der Zellschädigung zu dokumentieren, wurden Photographien (Kodacolor Gold 100 ISO Film) aufgenommen. Alle Arbeitsschritte wurden - wenn nicht anders vermerkt - bei Raumtemperatur durchgeführt.
1. Effekt von t-PA und DSPA auf den durch NMDA induzierten neuronalen Zelltod
Zur Überprüfung einer Erhöhung NMDA-induzierten Zelltods durch t-PA und DSPA wurde den gemäß dem obigen Protokoll kultivierten cortikalen Neuronen NMDA (30 μM oder 70 μM) zugegeben und die Kulturen für weitere 24 h inkubiert. Das Ausmaß des induzierten Zelltods wurde durch die Bestimmung der freigesetzten Laktat-Dehydrogenase (LDH) gemessen, wobei eine vollständige Lyse mit TX-100 als Vergleich dient (Fig. 2). Im folgenden wurde das NMDA bei Anwesenheit jeweils steigender Konzentrationen an t- PA (5, 50, 250, 500 nM) oder DSPA (5, 50, 500 nM) den Kulturen zugegeben und der Zelltod in analoger Weise bestimmt.
Die Zugabe von 30 μM oder 70 μM NMDA führt zu signifikantem Zelltod (siehe Fig. 2) bei beiden NMDA-Konzentrationen. Bei Anwesenheit steigender Konzentrationen an t-PA ist eine erhöhte Rate des induzierten Zelltods zu beobachten, jedoch nur bei der jeweils höchsten t-PA-Konzentration von 500 nM (siehe Fig. 2). Demgegenüber ist bei DSPA keine Verstärkung des NMDA-induzierten Zelltods, insbesondere bei hoher DSPA-Konzentration sogar eine Reduzierung des durch NMDA induzierten Zelltods zu beobach- ten. In Abwesenheit von NMDA wird weder durch t-PA noch durch DSPA neuronaler Zelltod induziert (siehe Fig. 2).
2. Verminderung des t-PA induzierten Zelltodes durch DSPA
In weiteren in w'fro-Experimenten wurde festgestellt, ob die Zugabe von DSPA der durch t-PA ausgelösten Verstärkung des NMDA-induzierten Zelltods entgegen wirken kann. Dazu wurden jeweils 70 μM NMDA zu Primärkulturen cortikaler Neuronen in Gegenwart einer konstanten t-PA-Konzentra- tion von 500 nM und steigender DSPA-Konzentrationen von 5, 50 und 500 nM gegeben (Fig. 3). Das Ausmaß der in den Kulturen auftretenden Zellschädigung wird wiederum nach 24 h Inkubation anhand der freigesetzten Menge an Laktat-Dehydrogenase (LDH) bestimmt.
Es wurde jeweils NMDA (70 μM) bei einer konstanten t-PA-Konzentration von 500 nM und steigenden DSPA-Konzentrationen (5, 50, 500 nM) zu einer Primärkultur kortikaler Neuronen gegeben und der neuronale Zelltod nach 24 h anhand der freigesetzten LDH-Menge bestimmt. Dabei zeigt sich bei steigender DSPA-Konzentration eine Inhibition der t-PA-abhängigen Stimu- lierung des induzierten neuralen Zelltodes.
3. Ca++-Mobilisationsexperiment
Die intrazelluläre Calcium-Konzentration wurde durch einen Essay mit Fluo- 3/AM untersucht. Dazu wurden cortikale Neuronen für 9 Tage kultiviert (siehe oben) und mit 10 μM Fluo-3/AM in HEPES-gepufferter Salzlösung beladen. Diese Salzlösung enthielt 135 mM NaCI, 5 mM KCI, 0,62 mMgSO4, 1 ,8 mM CaCI2, 10 mM HEPES und 6 mM Glucose, pH 7,4 bei 37° C für eine Stunde. DMSO (1 %) und 0,2 % Pluronic F-127 wurden hinzugefügt, um die Dispersion der Farbe zu erleichtern. Die Zellen wurden mit dem oben angeführten HEPES-Puffer gewaschen, der 1 mM Furosemid enthielt, um das Austreten der Farbe aus dem Puffer (die in jedem Puffer danach eingesetzt wurde) zu verhindern. Die relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) der Zellen wurden nach dem Waschen ermit- telt, um damit eine Basislinie zu erhalten, und während der Behandlungsdauer (5 Minuten) bei 485/530 nm (Anregung/Emission). Dazu wurde ein Fluoroskan Ascent Fluorometer (Labsystems) verwendet.
Wie in Fig. 4 gezeigt, verursachte die NMDA-Behandlung allein einen signifi- kanten Anstieg der Caicium-Konzentration nach einer Minute (P< 0,05). Diese Calcium-Konzentrationen wurden noch erhöht um 30 %, wenn die Zellen vor der NMDA-Gabe für fünf Minuten mit t-PA (30 μg/ml; 500 nM; P< 0,05) vorbehandelt wurden.
Diese Ergebnisse entsprechen dem Bericht von Nicole et al. 2001 , in denen die vorherige Gabe von t-PA die Calcium-Freisetzung durch NMDA noch erhöhte. Die Behandlung mit t-PA allein verursachte keine Änderung der Konzentration an freien Calcium-Ionen. Eine fünfminütige Vorbehandlung der neuronalen Zellen mit DSPA vor der Gabe von NMDA veränderte dagegen die Caicium-Konzentration nicht über ein Maß hinaus, das mit NMDA-Gabe allein erreicht wurde. DSPA allein hatte daher keine Wirkung auf die intrazelluläre Caicium-Konzentration.
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Claims

Patentansprüche:
1. Verwendung eines Hemmstoffs der t-PA vermittelten Aktivierung des Glutamat-Rezeptors, vorzugsweise des NMDA-Typs, als Neuroprotektivum.
2. Verwendung eines Hemmstoffs nach Anspruch 1 zur Behandlung oder Prophylaxe von auf der Exzitotoxizität des Glutamatrezeptors basierender neuronaler Schädigungen oder Zustände.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 zur Behandlung von Depressionen oder Angstzuständen.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, gekennzeichnet durch den Einsatz bei der Schlaganfallbehandlung.
5. Verwendung nach einer der Ansprüche 1 oder 2, gekennzeichnet durch die Behandlung oder Prophylaxe eines der folgenden Zustände:
Parkinson, Alzheimer, Chorea Huntington, Diabetes, Schmerzzustände, Epilepsie oder Gedächtnisstörungen.
6. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, gekennzeichnet durch den Einsatz einer die t-PA Aktivität hemmenden Protease.
7. Verwendung nach Anspruch 6, gekennzeichnet durch einen Serin Protease-Inhibitor, vorzugsweise Neuroserpin, Plasminogen Aktivator Inhibitor (PAI) oder Protease Nexin I (PN-1 ).
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet durch die Verwendung von DSPA oder funktioneil und/oder strukturell daraus ableitbarer Derivate, Analoga oder Fragmente.
9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß DSPA mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 1 oder DSPA-Derivate, Analoga oder Fragmente mit einer mindestens 70%-igen, vorzugsweise eine 80 bis 90 %-igen Homologie dazu verwendet werden.
10. Verwendung nach Anspruch 8 oder 9, gekennzeichnet durch eine Dosierung von größer 62, 5 und kleiner 160 μg/kg DSPA gemäß Fig. 1 , vorzugsweise von 90 bis 125 μg/kg DSPA, besonders bevorzugt 90 μg/kg DSPA oder einer je nach der Bioäquivalenz des verwendeten Derivats, Analogons oder Fragments dazu angepaßten Dosierung.
11. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß DSPA oder Derivate, Analoga oder Fragmente davon als Neuroprotektivum bei der Schlaganfallbehandlung in Kombination mit einem Thrombolytikum eingesetzt wird.
12. Verwendung nach Anspruch 11 , gekennzeichnet durch t-PA als Thrombolytikum.
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