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Die
vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen
zur Förderung
der Heilung von Wunden oder fibrotischen Erkrankungen, insbesondere
zur Förderung
der Heilung von Wunden oder fibrotischen Erkrankungen mit reduzierter
Narbenbildung.
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Unter „Wunden
oder fibrotischen Erkrankungen" versteht
man jedweden Zustand, der zur Bildung von Narbengewebe führen kann.
Dies schließt
insbesondere die Heilung von Hautwunden, die Reparatur einer Sehnenschädigung,
die Heilung von Quetschverletzungen, die Heilung von Augenwunden,
einschließlich Hornhautwunden,
die Heilung von Verletzungen des Zentralnervensystems (ZNS), Zuständen, die
zur Bildung von Narbengewebe im ZNS führen, Bildung von Narbengewebe
aufgrund von Schlaganfällen
und Gewebsadhäsion,
wie zum Beispiel aufgrund einer Verletzung oder eines chirurgischen
Eingriffs (dies kann z. B. auf die Sehnenheilung und abdominellen
Strikturen und Adhäsionen
zutreffen) ein. Fibrotische Erkrankungen schließen zum Beispiel Lungenfibrose,
Glomerulonephritis, Leberzirrhose und proliferative Vitreoretinopathie
ein.
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Unter „reduzierter
Narbenbildung" versteht
man, im Vergleich zu einer unbehandelten Wunde oder fibrotischen
Erkrankung, einen reduzierten Grad der Narbenbildung.
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Es
liegt insbesondere ein Mangel an Zusammensetzungen zur Förderung
der Heilung von Wunden oder fibrotischen Erkrankungen mit reduzierter
Narbenbildung vor. Die Bildung von Narbengewebe kann, obwohl es
einer geheilten Wunde mechanische Festigkeit verleiht, unansehnlich
sein und kann die Gewebsfunktion beeinträchtigen.
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Dies
ist insbesondere der Fall bei Wunden, welche zur Narbengewebsbildung
im ZNS führen,
wobei das Narbengewebe die Wiederverbindung von durchtrennten oder
nachwachsenden Nervenenden inhibiert und folglich ihre Funktion
signifikant beeinträchtigt.
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Zusammensetzungen
zur Förderung
der Heilung von Wunden oder fibrotischen Erkrankungen können auch
zusammen mit Zusammensetzungen zur Anwendung bei der Behandlung
von chronischen Wunden, wie zum Beispiel venösen Ulcera, diabetischen Ulcera
und Druckgeschwüren
(Dekubitalulcera), insbesondere bei älteren und an den Rollstuhl
gebundenen Patienten, eingesetzt werden. Solche Zusammensetzungen
können bei
Patienten, bei denen die Wundheilung entweder sehr langsam abläuft oder
bei denen der Wundheilungsvorgang noch nicht begonnen hat, sehr
nützlich
sein. Solche Zusammensetzungen können
zum „Kick-Start" der Wundheilung
angewendet werden und können
dann in Kombination mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eingesetzt
werden. Folglich könnte
eine chronische Wunde nicht nur geheilt, sondern sie könnte sogar
mit reduzierter Narbenbildung geheilt werden.
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Die
Aktivierung von LTGF-β (Latent
Transforming Growth Factor β)
zu aktivem TGF-β stellt
einen kritischen Schritt im Heilungsvorgang dar. LTGF-β (der TGF-β an das LAP
(Latency Associated Peptide) gebunden umfasst, das wiederum an das
LTBP (LTGF-β-bindende
Protein) gebunden sein könnte)
bindet via M6P-enthaltende Kohlenhydrate im LAP an die Zelloberflächen-Rezeptoren
von M6P (Mannose-6-Phosphat) (Purchio, M.F. et al., 1988, J. Biol.
Chem., 263: 14211-14215; Dennis, P.A. und Rifkin, D.B., 1991, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 88: 580-584; Shah, M. et al., 1992, Lancet,
339: 213-214; Shah, M. et al., 1994, J. Cell Sci., 107: 1137-1157).
Diese Bindung ermöglicht
die Aktivierung von LTGF-β,
ein Verfahren, an dem auch Transglutaminase und Plasminogen/Plasmin
beteiligt sind.
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Aufgrund
der Bindung von LTGF-β an
den M6P-Rezeptor kann M6P selbst durch Wettbewerb mit den M6P-enthaltenden
Kohlenhydraten im LAP um die Rezeptor-Bindungsstelle von M6P eine
signifikante Rolle im Heilungsvorgang spielen. Durch Erhöhung der
Quantität
von M6P an einer Stelle (wobei man in diesem Zusammenhang unter „Stelle" die Stelle einer
Verletzung oder einer fibrotischen Erkrankung versteht), kann die Bindung
von LTGF-β an
den M6P-Rezeptor inhibiert (oder zumindest reduziert) werden, und
sich auf die Spiegel von fibrotischem und nicht fibrotischem TGF-β auswirken.
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Obgleich
M6P außerordentlich
nützlich
ist, wird es schnell metabolisiert, und deshalb haben sich frühere Versuche,
die Spiegel von M6P an der Wundstelle zu erhöhen, auf die Bereitstellung
einer ständigen
Versorgung der Wundstelle mit M6P durch die Verwendung von langsamen/hinhaltenden/biokompatiblen
nicht inflammatorischen Abgabesystemen konzentriert. Diese langsamen/hinhaltenden
Abgabesysteme sind sowohl kostspielig als auch unzweckmäßig und
sind außerordentlich
schwer herzustellen, da es schwierig ist, eine langsame Freisetzung
aus einem nicht inflammatorischen/biokompatiblen Vehikel zu erreichen.
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Es
wurde erfindungsgemäß gefunden,
dass zur Förderung
der Heilung von Wunden oder fibrotischen Erkrankungen mit reduzierter
Narbenbildung – übenaschenderweise – Analoga
von M6P verwendet werden können,
wobei die Analoga ähnliche,
aber dennoch distinkte Strukturen aufweisen und wie M6P wirken und/oder
den Abbau von M6P inhibieren.
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Es
wird erfindungsgemäß ein Phosphonat
von Mannose-6-phosphat (M6P) zur Anwendung bei der Förderung
der Heilung von Wunden oder fibrotischen Erkrankungen mit reduzierter
Narbenbildung bereitgestellt.
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Das
Phosphonat kann ein Salz eines Phosphonats von M6P sein. Das Phosphonat
kann zum Beispiel jedwedes eine der Moleküle von 1(b)-(f)
oder ein Salz davon sein. Es wurde übenaschenderweise gefunden,
dass Phosphonate von M6P zum Binden an die M6P-Isomerase-Bindungsstelle fähig sind.
Dadurch wird ihnen ermöglicht,
die Bindung von M6P an die Bindungsstelle und den Abbau von M6P
(d. h. den M6P-Metabolismus) kompetitiv zu inhibieren, wobei folglich
die Halbwertzeit von M6P verlängert
wird. Noch übenaschender
ist, dass diese Phosphonate von M6P, trotz ihrer molekularen Ähnlichkeit
mit M6P und trotz ihrer Fähigkeit, an
die M6P-Isomerase-Bindungsstelle zu binden, über signifikant längere Halbwertzeiten
als M6P verfügen
(d. h. sie werden bei einer signifikant langsameren Rate als M6P
abgebaut).
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Das
Phosphonat kann eine signifikant längere Halbwertzeit als M6P
aufweisen. Das Phosponat kann eine Halbwertzeit aufweisen, die bei
mindestens ca. 10-mal der von M6P liegt. Es kann zum Beispiel eine
Halbwertzeit aufweisen, die mindestens ca. 100- oder 1000-mal länger als
die von M6P ist. Es kann durch M6P-Isomerase bei einer signifikant
langsameren Rate als M6P metabolisiert werden. Das Phosphonat kann
die Rezeptor-Bindungsstelle der M6P-Isomerase binden. Es kann an
die Zelloberflächen-Rezeptor-Bindungsstelle von
M6P binden.
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Das
Phosphonat kann an die Rezeptor-Bindungsstelle der M6P-Isomerase
binden. Es kann an die Zelloberflächen-Rezeptor-Bindungsstelle
von M6P binden.
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Das
Phosphonat kann eine größere Bindungsaffinität zu einem
M6P-Rezeptor als M6P aufweisen. Das Phosponat kann eine größere Affinität zur Rezeptor-Bindungsstelle
der M6P-Isomerase als M6P aufweisen. Das Phosphonat kann eine Bindungsaffinität zum M6P-Rezeptor
aufweisen, die ca. 2- oder 3-mal größer als die von M6P ist.
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Das
Phosphonat kann das Phosphonat-Analogon von M6P der 1(b) oder
ein Salz davon mit einer Halbwertzeit von ca. 1000-mal der von M6P
sein.
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Das
Phosphonat kann das Phosphonat-Analogon von M6P von 1(b) oder
ein Salz davon mit einer Halbwertzeit von ca. 1000-mal der von M6P
und einer Bindungsaffinität
zur Rezeptor-Bindungsstelle der M6P-Isomerase von ca. 3-mal der
von M6P darstellen.
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Das
Phosphonat kann die Halbwertzeit von M6P in einer Umgebung verlängern, die
M6P-Isomerase enthält. Das
Phosphonat kann zur Verlängerung
der Halbwertzeit von M6P in einer M6P-Isomerase enthaltenden Umgebung verwendet
werden.
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Das
Phosphonat kann in der Umgebung des menschlichen oder tierischen
Körpers
verwendet werden.
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Das
Phosphonat kann zur Förderung
der Heilung von Wunden oder fibrotischen Erkrankungen mit reduzierter
Narbenbildung verwendet werden.
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Das
Phosphonat kann einen Inhibitor des M6P-Abbaus darstellen. Es kann
ein Inhibitor des M6P-Metabolismus
sein. Es kann einen Inhibitor der M6P-Isomerase darstellen.
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Das
Phosphonat kann zusammen mit einer Zusammensetzung zur Förderung
der Heilung von Wunden oder fibrotischen Erkrankungen mit reduzierter
Narbenbildung verwendet werden. Eine derartige Zusammensetzung kann
M6P umfassen. Ein erfindungsgemäßes Phosphonat
kann beispielsweise ein Phosphonat-Analogon von M6P zusammen mit
M6P selbst umfassen.
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Das
Phosphonat kann zusammen mit einer Zusammensetzung zur Förderung
der Heilung von chronischen Wunden verwendet werden.
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Das
Phosphonat kann zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen
Träger,
Verdünnungs- oder Hilfsmittel
verwendet werden.
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Dies
bedeutet, dass eine Einzeldosis eines Phosphonats eine lang anhaltende
Wirkung auf eine Wundstelle ausüben
kann, wobei es signifikante klinische und therapeutische Vorteile
bereitstellt. Dies bedeutet wiederum, dass anstelle der augenblicklichen
ständigen
Versorgung einer Wundstelle mit M6P eine Einzeldosis oder Mehrfachdosen
eines Phosphonats von M6P an eine Stelle verabreicht werden kann/können.
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Durch
Reduktion der Dosierung von M6P an eine Wundstelle, kann die osmotische
Wirkung auf das umgebende Gewebe an dieser Stelle im Vergleich zur
osmotischen Wirkung einer ständigen
Versorgung mit M6P signifikant reduziert werden.
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Das
Phosphonat kann zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen
Träger,
Verdünnungs- oder Hilfsmittel
verwendet werden.
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Auf
diese Weise kann das Phosphonat dem M6P funktionell entsprechen
und kann dennoch eine signifikant längere Halbwertzeit und/oder
größere Rezeptor-Bindungsaffinität als M6P
aufweisen. Das Phosphonat kann nicht nur als M6P wirken, sondern
es kann auch auf die Verlängerung
der Halbwertzeit und Erhöhung der
Wirksamkeit von jedwedem zugesetztem oder endogenem M6P durch Inhibition
des Metabolismus von M6P durch beispielsweise M6P-Isomerase wirken.
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Das
Phosphonat kann an eine Stelle der Verletzung oder Fibrose verabreicht
werden.
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Das
Phosphonat kann entweder unmittelbar vor oder unmittelbar nach der
Verletzung/dem Ausbruch verwendet werden. Es kann innerhalb von
ca. 120 Stunden nach der Verletzung/dem Ausbruch angewendet werden,
obwohl bevorzugt sein könnte,
es innerhalb einer kürzeren
Zeit, wie zum Beispiel 120, 96, 72, 48, 24 oder 12 Stunden nach
der Verletzung/dem Ausbruch, zu applizieren. Unter „Ausbruch" versteht man den
Ausbruch einer fibrotischen Erkrankung.
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Die
Wirksamkeit der Behandlung bei der Förderung der Heilung mit reduzierter
Narbenbildung kann durch Erhöhung
der M6P-Spiegel an einer Stelle unmittelbar nach der Verletzung
signifikant gesteigert werden, wenn TGF-β1, das
mit LAP komplex gebunden ist, aus degranulierenden Plättchen freigesetzt
wird. Der TGF-β1, der mit LAP komplex gebunden ist, liegt
in der Gewebsflüssigkeit
entweder frei, gebunden an den Fibringerinnsel/Plättchen-Komplex
vor oder wird durch Endozytose in die umgebenden Zellen, z. B. Fibroblasten,
Monozyten und Makrophagen durch den M6P-Rezeptor aufgenommen. Diese
Degranulation und Freisetzung von fibrotischem TGF-β1 bei
anfänglicher
Verletzung weist mehrere sich auf die nachfolgende Heilung auswirkende
Effekte auf. Insbesondere zieht TGF-β1 Monozyten
und Makrophagen an die Stelle an, die wiederum mehr TGF-β1 freisetzt.
Durch Inhibition dieser anfänglichen
Aktivierung von TGF-β1, der überwiegend als
TGF-β1 vorliegt, kann das Verhältnis von fibrotischen: nicht
fibrotischen Wachstumsfaktoren an einer Stelle zugunsten nicht fibrotischer
Wachstumsfaktoren verändert
und die Heilung mit reduzierter Narbenbildung verstärkt bewirkt
werden.
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Experimentelle
Arbeiten, die im Rahmen der Behandlung von Wunden mit nicht phosphorylierter
Mannose und Glukose durchgeführt
wurden, führten
im Vergleich zu den Kontrollen zu verzögerter Heilung. Galaktose-6-phosphat
und Glycerol-3-phosphat haben weder auf die Wundheilung noch die
Narbenbildung eine Wirkung.
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Die
Erfindung wird weiter durch das folgende Beispiel verdeutlicht,
das lediglich beispielhaft eine Form eines bei einer signifikant
niedrigeren Rate metabolisierten Analogons von M6P und eine größere M6P-Rezeptor-Bindungsaffinität als M6P
aufweist und zur Inhibition des M6P-Metabolismus verwendet werden
kann.
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Von
den Figuren –
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zeigt 1 M6P
ebenso wie verschiedene Phosphonate von M6P. Die Figuren sind als
(a) bis (F) gekennzeichnet, die von links nach rechts und von oben
nach unten verlaufen;
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zeigt 2 Verfahren
zur Synthese derselben; und
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zeigt 3(a) nicht isosterisches Mannosephosphonat;
(b) Fruktose-1-phosphat; und (e) Maltose-1-phosphat.
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EXPERIMENTELLER
TEIL
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Die
Eigenschaften von isosterischem Mannosephosphonat ( 1(b))
und nicht isosterischem Mannosephosphonat (3a),
Fruktose-1-phosphat (3b) und Maltose-1-phosphat
(3c) bei der Wundheilung und Entgegenwirkung
der Narbenbildung wurden wie nachstehend beschrieben getestet.
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Zusätzlich wurde
das M6P-Phosphonat-Analogon von 1(b) vorbereitet
und zur Analyse seiner Bindungsaffinität zum M6P-Rezeptor und auch
zur Analyse seiner Halbwertzeit ein Rezeptor-Bindungsassay mit M6P-Isomerase durchgeführt. Zur
Erfassung von Daten wurden Standardverfahren verwendet.
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METHODE
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Erwachsene
männliche
Sprague-Dawley-Ratten (200-250 g) wurden unter Verwendung gleicher
Teile Halothan, Lachgas und Sauerstoff anästhesiert. Es wurden vier lineare,
1 cm lange Inzisionen in voller Dicke bis zur Tiefe des Panniculus
carnosus in die dorsale Haut, 1 cm von der Mittellinie und 5 und
8 cm von der Schädelbasis
entfernt vorgenommen. Die Wunden wurden zur Sekundärheilung
nicht genäht.
Experimentelle Behandlungen wurden durch intradermale Injektion
(50 μl jeden
Wundrand hinunter) an die Wundränder
verabreicht. Die Tiere wurden zu ausgewählten Zeitpunkten durch eine Überdosis
Chloroform getötet.
Die Wunden wurden aus dem umgebenden Gewebe exzidiert und zweigeteilt.
Eine Hälfte
der Wunden wurde zum Gefrierschnitt und zur Immunzytochemie in OCT
schnell gefroren, und eine Hälfte
wurde in Formaldehyd zur Einbettung in Wachs und zur Histologie
fixiert. Wachsschnitte wurden zur Ermöglichung der Beurteilung der
Narbenqualität
routinemäßig mit
Hämatoxylin
und Eosin, Picrosirius-Rot-
und Lille-Masson-Trichrom-Färbung
zur Darstellung von Dicke, Dichte und Orientierung der Kollagenfasern
gefärbt.
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Fruktose-1-phosphat
(F1P) und Maltose-1-phosphat (Malt1P) wurden von der Sigma Chemical
Company erworben. Für
jeden Zucker wurde ein Dosisbereich (10 mM, 20 mM und 40 mM) mit
PBS (phosphatgepufferter Kochsalzlösung) als Kontrolle untersucht.
Die Behandlungen wurden zur Zeit der Verletzung und an jedem Tag
während
der folgenden sieben Tage verabreicht. Für jede Verbindung wurden zwei
Tiere pro Dosis an jeweils jedem der drei Zeitpunkte (7, 40 und
80 Tage nach der Verletzung) untersucht. Insgesamt n = 12.
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Isosterisches
Mannosephosphonat wurde synthetisiert und von Dr. Sally Freeman,
Department of Pharmacy, University of Manchester, zur Verfügung gestellt.
Ein Dosisbereich (20 mM, 10 mM und 10 mM + 10 mM M6P) wurde mit
PBS als negative Kontrolle und 10 mM M6P und 20 mM M6P als positive
Kontrollen untersucht. Die Behandlungen wurden zur Zeit der Verletzung
und an jeweils jedem der folgenden zwei Tage verabreicht. An jedem
der zwei Zeitpunkte (7 und 80 Tage nach der Verletzung) wurde ein
Tier pro Dosis untersucht. Insgesamt n = 4.
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Nicht
isosterisches Mannosephosphonat wurde synthetisiert und von Dr.
Sally Freeman, Department of Pharmacy, University of Manchester,
zur Verfügung
gestellt. Eine einzelne Konzentration (20 mM) dieser Verbindung
wurde, mit PBS als Kontrolle, untersucht. Der Verabreichungszeitpunkt
variierte im Vergleich zu den vorherigen Experimenten. Die Tiere
wurden in drei Gruppen aufgeteilt und am Tag 0 allein, an den Tagen 0,
2 und 4, oder an den Tagen 0 bis 7 inklusive behandelt. Zwei Tiere
pro Behandlungsregime wurden an jedem der drei Zeitpunkte (3, 7
und 80 Tage) untersucht. Insgesamt n = 18.
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Zusätzlich zu
den Tierstudien wurde ein Assay des ELISA-Typs unter Verwendung
von gereinigtem M6P/IGF II-Rezeptor (Insulinähnlichem Wachstumsfaktor II-Rezeptor)
zur Bestimmung entwickelt, ob diese Analoga von M6P an den M6P/IGF
II-Rezeptor binden.
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ERGEBNISSE
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FRUKTOSE-1-PHOSPHAT UND
MALTOSE-1-PHOSPHAT
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Am
Tag 7 nach der Verletzung zeigte die histologische Analyse, dass
im Vergleich zu den PBS-Kontrollen
weder F1P noch Malt1P irgendeine Wirkung auf die Wundheilung ausübt. Auch
die immunzytochemische Analyse zeigte, dass behandelte Wunden den
Kontrollen ähnlich
waren. Färbungen
auf Fibronektin waren zwischen den Behandlungen und Kontrollen wie
auch dem Monozyten/Makrophagen-Profil konsistent. 40 Tage nach der
Verletzung war die histologische Analyse ohne eindeutigen Trend
inkonsistent. 80 Tage nach der Verletzung schien Malt1P die Hautarchitektur
sehr geringfügig
zu verbessern, während
F1P die Narbenbildung, besonders bei der höchsten untersuchten Dosis (40
mM), signifikanter zu reduzieren schien.
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ISOSTERISCHES
MANNOSE-PHOSPHONAT
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Am
Tag 7 nach der Verletzung ging aus der histologischen Analyse hervor,
dass sich keine der behandelten Wunden von den PBS-Kontrollen zu
unterscheiden schienen. Am Tag 80 nach der Verletzung schien das
isosterische Analogon die Hautarchitektur im Vergleich zu den Kontrollen
zu verbessern und zeigte hinsichtlich der Narbenbildung eine ähnliche
Verbesserung wie die M6P-Behandlungen.
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NICHT ISOSTERISCHES
MANNOSE-PHOSPHONAT
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Die
anfängliche
histologische Analyse von Wunden, die vom Tag 0 bis 7 nach der Verletzung
mit dem nicht isosterischen Analogon (20 mM) behandelt wurden, zeigen
eine gegen die Narbenbildung gerichtete Wirkung, insbesondere mit
der Behandlung mit 20 mM an den Tagen 0 bis 7 nach der Verletzung.
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Die
bisher erhobenen Ergebnisse zeigen, dass trotz der Ähnlichkeit
der getesteten Mannose-6-phosphat-Analoga
(F1P, Malt1P und der isosterischen und nicht isosterischen Mannosephosphonat-Analoga) die größere Wirksamkeit
der Mannosephosphonat-Analoga auf die Erfüllung ihrer zusätzlichen
Rolle oder auf spezielle Eigenschaften in Bezug auf ihre Interaktionen
mit anderen Molekülen
zurückzuführen sein
könnte.
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REZEPTOR-BINDUNGSASSAY
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Anfängliche
Ergebnisse des Rezeptor-Bindungsassays zeigten, dass F1P den M6P/IGF
II-Rezeptor mit ähnlicher
Affinität
als M6P bindet, wohingegen Malt1P nicht an diesen Rezeptor bindet.
Die Ergebnisse zeigten auch, dass das Analogon von 1(b) eine
Bindungsaffinität
zur M6P-Rezeptor-Bindungsstelle von ca. 3-mal der von M6P aufweist. Überraschenderweise
zeigten die Ergebnisse auch, dass das Analogon, trotz dieser signifikant
gesteigerten Bindungsaffinität
und trotz seiner strukturellen Ähnlichkeit
mit M6P, eine Halbwertzeit von ca. 1000-mal der von M6P aufwies.
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Dies
deutet darauf hin, dass andere Phosphonat-Analoga von M6P ähnliche
Eigenschaften und folglich ein großes Potenzial als Inhibitoren
der Narbenbildung aufweisen könnten.
