DE69633392T2 - Verwendung von betalycan zur verminderung der narbenbildung - Google Patents

Description

• Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind pharmazeutische Zusammensetzungen zur Förderung der Heilung von Wunden oder fibrotischen Veränderungen, insbesondere zur Förderung der Heilung von Wunden oder fibrotischen Veränderungen mit reduzierter Narbenbildung.
• Unter „Wunden oder fibrotischen Veränderungen" versteht man jedweden Zustand, der zur Bildung von Narbengewebe führen kann. Dies schließt insbesondere Folgendes ein: das Heilen von Hautwunden, die Reparatur von Sehnenschädigungen, die Heilung von Quetschungsverletzungen, die Heilung von Augenwunden, einschließlich Hornhautwunden, die Heilung von Verletzungen des Zentralnervensystems (ZNS), Zustände, die zur Bildung von Narbengewebe im ZNS führen, von Schlaganfällen resultierende Narbengewebsbildung und Gewebeadhäsion, zum Beispiel aufgrund einer Verletzung oder eines chirurgischen Eingriffs (dies kann z. B. auf die Heilung von Sehnen und Strikturen und Adhäsionen im Abdominalbereich zutreffen). Beispiele fibrotischer Veränderungen schließen die pulmonale Fibrose, Glomerulonephritis, Leberzirrhose und proliferative Vitreoretinopathie ein.
• Unter „reduzierter Narbenbildung" versteht man ein reduziertes Ausmaß der Narbenbildung im Vergleich zu einer unbehandelten Wunde oder fibrotischen Veränderung.
• Es liegt insbesondere ein Mangel an Zusammensetzungen zur Förderung der Heilung von Wunden oder fibrotischen Veränderungen mit reduzierter Narbenbildung vor. Obwohl die Bildung von Narbengewebe für eine verheilte Wunde mechanische Stärke bereitstellt, kann sie unansehnlich sein und kann die Funktion des Gewebes beeinträchtigen.
• Dies ist insbesondere bei Wunden der Fall, die in Narbengewebsbildung im ZNS resultieren, wobei das Narbengewebe die Wiederverbindung von durchtrennten oder nachwachsenden Nervenenden inhibiert und sich auf diese Weise signifikant auf ihre Funktion auswirkt.
• Es liegt auch ein Mangel an Zusammensetzungen zur Behandlung und Förderung der Heilung chronischer Wunden, zum Beispiel venöser Ulzera, diabetischer Ulzera und Druckgeschwüren (Dekubitalulzera), besonders bei älteren Menschen und an den Rollstuhl gebundene Patienten vor. Solche Zusammensetzungen können bei Patienten äußerst nützlich sein, bei denen die Wundheilung entweder langsam verläuft oder bei denen der Wundheilungsprozess noch nicht begonnen hat. Diese Zusammensetzungen können zum „Kickstart" der Wundheilung verwendet werden und können dann in Kombination mit Zusammensetzungen zur Förderung der Heilung mit reduzierter Narbenbildung verwendet werden. Folglich kann eine chronische Wunde nicht nur geheilt, sondern sie kann auch mit reduzierter Narbenbildung geheilt werden.
• Bei Betaglycan (BG), das anderweitig als TGF-β (transformierender Wachstumsfaktor β) Typ III Rezeptor (RIII) bekannt ist, handelt es sich um ein weit verbreitetes Membran-Proteoglycan, umfassend ein Kernpotein von 100 kDa mit daran gebundenen Heparan- und Chondroitinsulfat-Seitenketten (siehe Lopez-Casillas et al., 1991, Cell, 67: 785–795). TGF-β bindet an das BG-Kernprotein, wobei für diese Interaktion die Glycosaminoglycan-Seitenketten (GAG-Seitenketten) nicht erforderlich sind, während FGF-2 über die Heparansulfat-Seitenketten an BG bindet (Cheifetz, S. et al., 1988, J. Biol. Chem., 263: 16984–16991).
• Das BG-Kernprotein umfasst:
• i) Eine extrazelluläre Domäne;
• ii) eine Transmembran-Domäne; und
• iii) eine intrazelluläre Domäne mit keiner erkennbaren Signalstruktur.
• Zellen sind zur Freigabe der extrazellulären Domäne über einen Spaltungsort in der Nähe der Transmembran-Domäne fähig, und dies scheint in vivo aufzutreten, wobei lösliches BG (solBG) im Serum gefunden wird (Andres, J. L. et al., 1989, J. Biol. Chem., 109: 3137–3145).
• TGF-β bindet an verschiedene Membranproteine (siehe Massague, J. et al., 1994, Trends in Cell Biol., 4: 172–178, zur Übersicht), von denen zwei, TGF-β Typ I und II Rezeptoren (RI und RII) einen Signalrezeptorkomplex bilden. RI scheint das Vorliegen von RII zur Bindung des Liganden zu benötigen, und RII scheint das Vorliegen von RI zum Signalisieren, aber nicht zur Ligandenbindung zu benötigen (siehe Wrana, J. L. et al., 1992, Cell, 71: 1003–1014). Die Isoformspezifität des TGF-β-Rezeptors kann durch die drei verschiedenen Rezeptortypen verliehen werden, da RI und RII TGF-β₁ und TGF-β₃ mit einer viel größeren Affinität als TGF-β₂ binden, wobei dieser Unterschied in Zellen mit einem Mangel an BG am ausgeprägtesten ist. Die Expression von BG korreliert mit der erhöhten Bindung aller TGF-β an RII, und diese Korrelation ist besonders evident im Fall von TGF-β₂, einer Isoform, die bei Abwesenheit von BG eine geringe Affinität zu RI und RII aufweist (siehe Lopez-Casillas, F. et al., 1993, Cell, 73: 1435–1444). Eine wichtige Funktion des Membran-verankerten BG stellt die Präsentation von TGF-β an RII dar, wobei ein ternärer Komplex gebildet wird, wodurch die Rezeptorbindungsaffinität zu und Zellansprechbarkeit auf TGF-β zunimmt.
• Umgekehrt spielt die lösliche Form von BG eine sehr unterschiedliche Rolle zu der des Membran-verankerten BGs. Lösliches BG bindet an TGF-β und verhindert, dass die TGF-β-Moleküle an die Zelloberflächen-Rezeptoren binden, wobei sie folglich als ein TGF-β-Antagonist wirken (siehe Lopez-Casillas, F. et al., 1994, J. Cell Biol., 124: 557–568).
• Folglich kann das BG in seinen verschiedenen Formen als ein Doppelmodulator des TGF-β-Zugangs zu Signalrezeptoren wirken.
• Vorherige Arbeiten zu den Wirkungen fibrotischer und nicht fibrotischer Wachstumsfaktoren bei der Wundheilung (Shah, M. et al., 1994, J. Cell Sci., 107: 1137–1157; Shah, M. et al., 1995, J. Cell Sci., 108: 985–1002; WO 92/17206 und Verweise darin) haben gezeigt, dass um eine wirksame Heilung mit reduzierter Narbenbildung zu fördern, sowohl TGF-β₁ als auch TGF-β₂ in einem ähnlichen Ausmaß inhibiert werden müssen, wobei Experimente gezeigt haben, dass eine einfache Inhibition von TGF-β₂ allein zu keiner signifikanten Verbesserung der Narbenbildung führt. Dieser Erfinder hat nun gefunden, dass das Anlagern von löslichem BG an einen Ort (unter „Ort" versteht man einen Wundort oder einen Ort einer fibrotischen Veränderung), insbesondere an einen Wundort, überraschend Heilung mit reduzierter Narbenbildung bewirkt.
• Die resultierende Wirksamkeit ist besonders überraschend, da sie durch die Verwendung von löslichem BG – das primär spezifisch für TGF-β₂ ist – allein, anstelle der Verwendung von BG in Kombination mit einer für TGF-β₁ spezifischen neutralisierenden Zusammensetzung erreicht wurde, wobei eine derartige Verwendung gemäß dem Stand der Technik scheinbar notwendig ist. Die Experimente (nachstehend) zeigen auch, dass bei bestimmten Konzentrationen von solBG der TGF-β₃-Spiegel in Wunden überraschend erhöht ist. Niedrigere Konzentrationen von solBG scheinen keine Wirkung auf den TGF-β₃-Spiegel zu haben, wohingegen höhere Konzentrationen eine negative Wirkung auf den TGF-β₃-Spiegel aufweisen. Dies ist besonders signifikant, da TGF-β₃ im Gegensatz zu TGF-β₁ und TGF-β₂ die Heilung von Wunden und fibrotischen Veränderungen mit reduzierter Narbenbildung fördert (WO 93/19769), und dies kann bei der Erklärung der Wirkung von solBG gegen Narbenbildung helfen.
• Erfindungsgemäß wird die Verwendung von löslichem Betaglycan in einer pharmakologisch wirksamen Menge bereitgestellt, die zur Inhibition des transformierenden Wachstumsfaktors β₂ (TGF-β₂) bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Förderung der Heilung von Wunden mit reduzierter Narbenbildung oder zur Förderung der Heilung von fibrotischen Veränderungen mit reduzierter Narbenbildung ausreichend ist.
• Das lösliche Betaglycan kann zum Beispiel rekombinantes lösliches Betaglycan umfassen.
• Unter „Fragment" oder „teilweise modifizierter Form" versteht man ein Molekül, das zur Bindung an TGF-β₂ fähig ist, wobei es die Rolle von solBG wie vorstehend beschrieben übernimmt. Eine teilweise Modifikation kann zum Beispiel durch Substitution, Deletion oder Addition von Aminosäureresten herbeigeführt werden. Eine Substitution kann zum Beispiel eine konservierte Substitution darstellen. Folglich kann eine teilweise modifizierte Form von solBG ein Homologon von solBG darstellen. Sie kann zum Beispiel eine Homologie von mindestens 40% mit solBG aufweisen. Sie kann zum Beispiel eine Homologie von mindestens 50, 60, 70, 80, 90 oder 95% mit solBG aufweisen.
• Das solBG kann zum Beispiel mindestens das TGF-β-Bindungsfragment von solBG umfassen.
• Das solBG kann die beschleunigte Heilung von Wunden oder fibrotischen Veränderungen fördern. Unter „beschleunigter Heilung" versteht man eine schnellere Wundheilung als die, die mit einer unbehandelten Kontrollwunde erreicht wird.
• Das solBG kann bei einer Konzentration zwischen ca. 0,01 und 1 μM, zum Beispiel bei ca. 0,1 μM vorliegen. Experimente (nachstehend) haben gezeigt, dass die Wirksamkeit von solBG bei der Förderung der Heilung von Wunden dosisabhängig ist. Experimente (nachstehend) beziehen sich nur auf Ratten, und optimale Konzentrationen von solBG zur Förderung der Heilung von Wunden oder fibrotischen Veränderungen mit reduzierter Narbenbildung in Ratten und anderen Tieren können ohne weiteres durch Experimentierung ermittelt werden.
• Das solBG kann eine größere Bindungsaffinität zu TGF-β₂ als zu TGF-β₁ und TGF-β₃ aufweisen. Es kann TGF-β₁, TGF-β₂ und TGF-β₃ in einem Verhältnis von ca. 2 : 7 : 2 binden.
• Das solBG kann die Menge von TGF-β₂, die an Zelloberflächen-Rezeptoren bindet, reduzieren.
• Das solBG kann die Aktivierung von Zelloberflächen-Rezeptoren durch TGF-β₂ reduzieren.
• Das solBG kann zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsmittel verwendet werden.
• Das solBG kann zusammen mit einer Zusammensetzung zur Förderung der Heilung von Wunden oder fibrotischen Veränderungen mit reduzierter Narbenbildung verwendet werden.
• Das solBG kann zusammen mit einer Zusammensetzung zur Förderung des Heilens chronischer Wunden verwendet werden.
• Das solBG kann an einen Ort der Verwundung oder Fibrose verabreicht werden.
• Das solBG kann in Aliquoten von ca. 140 μl verabreicht werden.
• Das solBG kann entweder unmittelbar vor oder unmittelbar nach der Verwundung oder dem Beginn verabreicht werden. Unter „Beginn" versteht man den Beginn einer fibrotischen Veränderung. Das solBG kann innerhalb von ca. 120 Stunden der Verwundung/des Beginns, zum Beispiel ca. 48 oder 24 Stunden nach der Verwundung/des Beginns verabreicht werden.
• Das solBG kann mindestens zweimal verabreicht werden. Es kann zum Beispiel dreimal verabreicht werden. Es kann zum Beispiel unmittelbar vor der Verwundung oder dem Beginn, ca. 24 Stunden nach der Verwundung oder dem Beginn und ca. 48 Stunden nach der Verwundung oder dem Beginn verabreicht werden.
• Die Erfindung wird weiter aus der folgenden Beschreibung ersichtlich werden, welche, lediglich als Beispiel, eine Form von solBG zur Förderung der Heilung von Wunden oder fibrotischen Veränderungen mit reduzierter Narbenbildung und Verfahren für dieselbe zeigt.
• EXPERIMENTELL
• Tiere wurden auf die Wirkungen von löslichem BG (solBG) bei der Wundheilung durch Verwundung der Tiere und ihre Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von solBG und Analysieren der Wunden (siehe ,Materialien und Verfahren') getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass lösliches BG, insbesondere bei einer Konzentration zwischen ca. 0,01 μM und 1 μM, ganz besonders bei einer Konzentration von ca. 0,1 μM, ein großes Potenzial als ein Mittel gegen Narbenbildung aufzuweisen scheint. Die an den Tagen 7, 40 und 80 nach der Verwundung (pV) analysierten Wunden zeigen sowohl eine signifikant verbesserte Narbenbildung (d. h. weniger Narbenbildung) und eine erhöhte (d. h. beschleunigte) Wundheilung im Vergleich zu Kontrollwunden.
• MATERIALIEN UND VERFAHREN
• Rekombinantes solBG (siehe Lopez-Casillas et al., 1991, Cell, 67: 785–795; Lopez-Casillas, F. et al., 1993, Cell, 73: 1435–1444; und Lopez-Casillas, F. et al., 1994, J. Cell. Biol., 124: 557–568), das von F. Lopez-Casillas zur Verfügung gestellt wurde, wurde in MEM (Minimum Essential Medium)(serumfrei) aufgelöst. 250 ng solBG entsprechen 50 μg neutralisierendem Antikörper (NAK) gegen TGF-β. Es wurden angemessene solBG-Dosen aus den bekannten wirksamen Konzentrationen von NAK gegen TGF-β berechnet (siehe Shah, M. et al., 1994, J. Cell Sci., 107: 1137–1157; Shah, M. et al., 1995, J. Cell Sci., 108: 985–1002; und Lopez-Casillas, F. et al., 1994, J. Cell Biol., 124: 557–568). Erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten (200–250 g) wurden mit Halothan-, Stickoxydul- und Sauerstoffinhalation anästhesiert. Es wurden vier Inzisionen, 1 cm lang und bis zur Tiefe des und durch den Panniculus carnosus an der dorsalen Haut, gleichweit von der Mittellinie entfernt und benachbart zu den Gliedmaßen vorgenommen. Die Wunden wurden nicht genäht, um sie zur Herbeiführung maximaler Narbenbildung mittels sekundärer Wundheilung (per secundam intentionem) heilen zu lassen. An jedem Tier wurde eine Kontrollwunde unbehandelt gelassen, und eine wurde durch Injektion mit MEM allein, als eine Vehikelkontrolle, infiltriert. Die beiden übrigen Wunden wurden mit solBG bei Konzentrationen von 0,001 μM, 0,01 μM, 0,1 μM, 1 μM und 2 μM knapp vor der Verwundung und an den Tagen 1 und 2 nach der Verwundung injiziert. SolBG wurde durch intradermale Injektion in 100 μl MEM entlang der Länge eines jeden Wundrandes appliziert. Vier Tiere pro solBG-Dosis pro Zeitpunkt wurden für jeweils 0,001 μM und 2 μM verwendet und zwei Tiere pro Dosis pro Zeitpunkt für jeweils 0,001 μM, 0,1 μM und 1 μM (n = 48 insgesamt). Die Tiere wurden an jedem der Zeitpunkte 3, 5, 7 und 80 Tage pV geerntet. Die Tiere wurden durch eine Chloroform-Überdosis getötet, und die Wunden wurden durch Exzision aus dem umgebenden Gewebe geerntet. Jede Wunde wurde in zwei Teile zerschnitten, eine Hälfte der Wunde wurde in OCT für Kryoschnitte und die Immuncytochemie schnell gefroren, und die andere Hälfte wurde zum Einbetten in Wachs und zur Histologie in Formaldehyd fixiert.
• ERGEBNISSE
• Histologie
• Es wurden fünf Tage nach der Verwundung wenige histologische Unterschiede zwischen mit den niedrigeren Dosen von solBG (0,001–0,1 μM) behandelten Wunden und Kontroll- oder Vehikelkontrollwunden festgestellt. Die mit 1 und 2 μM solBG behandelten Wunden schienen jedoch viel enger als die Kontrollen zu sein, aber ein stärker inflammatorisches Zellinfiltrat und mehr neue Blutgefäße an der Basis der Wunde aufzuweisen. Ähnliche Beobachtungen wurden in Wunden bemerkt, die 7 Tage nach der Verwundung geerntet wurden.
• Das Ausmaß der Narbenbildung wurde 80 Tage nach der Verwundung untersucht. Die Behandlung mit 0,001 μM oder 0,01 μM solBG resultierte in keiner konsistenten Verbesserung der Narbenbildung im Vergleich zu den Kontrollen. Die Kollagenfasern in der Wunde waren dünn, dicht gepackt und, im Allgemeinen parallel zur Epidermis, in einer typischen Narbenformation hoch ausgerichtet. Wenn jedoch eine Dosis von 0,1 μM solBG auf die Wunden appliziert wurde, war die sich anschließende Narbenbildung signifikant verbessert. Die Kollagenfasern in den behandelten Wunden waren viel dicker, mit weiteren Zwischenräumen angeordnet und in einer willkürlicheren Weise als die Kontrollnarben ausgerichtet, und waren der „korbgeflechtartigen" Ausrichtung von Kollagenfasern ähnlicher, die in der normalen Dermis gesehen wurde. Eine Dosis von 1 μM solBG resultierte in keiner konsistenten Verbesserung der Narbenbildung, obwohl einige der behandelten Wunden gebessert wurden, wohingegen eine Dosis von 2 μM entweder in keiner Besserung oder einer Narbe resultierte, die genauso schlimm war, wie die, die in Kontrollwunden gefunden wurde.
• Immuncytochemie
• Es wurden 3 Tage nach der Verwundung geerntete Wunden untersucht. Drei Tage nach der Verwundung lagen keine konsistenten Unterschiede des Fibronectingehaltes in den Wunden zwischen Kontrollwunden und denen vor, die mit den verschiedenen solBG-Konzentrationen behandelt wurden. Das Färben auf TGF-β₁ wies ähnliche Mengen dieses Cytokins auf, das in den Monocyten/Makrophagen, in behandelten und Kontrollwunden am meisten evident war, außer wenn eine Konzentration von 1 oder 2 μM solBG appliziert wurde. In diesen Wunden schienen die TGF-β₁-Spiegel im Vergleich zu den Kontrollen erhöht zu sein. Die Färbung auf TGF-β₃, der wiederum hauptsächlich in den Monocyten/Makrophagen lokalisiert war, wies interessanterweise ein anderes Muster auf. Die Applikation von 0,001 μM solBG wies keine offensichtliche Wirkung auf die TGF-β₃-Spiegel auf, bei Dosen von 0,01 μM und insbesondere von 0,1 μM resultierte die Behandlung, welche die beste Verbesserung der Narbenbildung zeigte, jedoch in verstärkter Färbung auf TGF-β₃ in der Wunde. Im Vergleich zu den Kontrollen resultierten Dosen von 1 μM und 2 μM solBG im Gegensatz dazu in niedrigeren TGF-β₃-Spiegeln in der Wunde. Die initialen Studien zu den Spiegeln der TGF-β-Rezeptoren in der Wunde deuten auf eine erhöhte Expression des Typ I Rezeptors am Wundrand und in der benachbarten Dermis bei mit 1 und 2 μM solBG behandelten Wunden hin.

Claims (11)

1. Verwendung von löslichem Betaglycan in einer pharmakologisch wirksamen Menge, die zur Inhibition des transformierenden Wachstumsfaktors β₂ (TGF-β₂) ausreicht, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Förderung der Heilung von Wunden mit reduzierter Narbenbildung oder zur Förderung des Heilens fibrotischer Veränderungen mit reduzierter Narbenbildung.
2. Verwendung nach Anspruch 1, worin das lösliche Betaglycan rekombinantes lösliches Betaglycan darstellt.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Arzneimittel lösliches Betaglycan in einer Konzentration von zwischen ca. 0,1 und 1 μM enthält.
4. Verwendung nach Anspruch 3, worin das Arzneimittel lösliches Betaglycan in einer Konzentration von ca. 0,1 μM enthält.
5. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das lösliche Betaglycan eine größere Bindungsaffinität zu TGF-β₂ als zu TGF-β₁ und TGF-β₃ aufweist.
6. Verwendung nach Anspruch 5, worin das lösliche Betaglycan TGF-β₁, TGF-β₂ und TGF-β₃ in einem Verhältnis von ca. 2 : 7 : 2 bindet.
7. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin lösliches Betaglycan die Menge an TGF-β₂ reduziert, die an Zelloberflächen-Rezeptoren bindet.
8. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin lösliches Betaglycan die Aktivierung durch TGF-β₂ von Zelloberflächen-Rezeptoren reduziert.
9. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin lösliches Betaglycan in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsmittel verwendet wird.
10. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin lösliches Betaglycan in Verbindung mit einer Zusammensetzung zur Förderung des Heilens von Wunden oder fibrotischen Veränderungen mit reduzierter Narbenbildung verwendet wird.
11. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin lösliches Betaglycan in Verbindung mit einer Zusammensetzung zur Förderung des Heilens chronischer Wunden verwendet wird.