DE69830400T2

DE69830400T2 - Verbesserter heilungsprozess von neuralverletzungen anhand von cm101/gbs-toxin

Info

Publication number: DE69830400T2
Application number: DE69830400T
Authority: DE
Inventors: G. Carl HELLERQVIST; W. Artur WAMIL; D. Barbara WAMIL
Original assignee: Vanderbilt University
Current assignee: Vanderbilt University
Priority date: 1997-01-29
Filing date: 1998-01-29
Publication date: 2006-01-26
Anticipated expiration: 2018-01-30
Also published as: EP0981353B1; AU6258798A; EP0981353A1; ATE296636T1; WO1998032448A1; ES2244046T3; JP2001511136A; US6476001B1; DE69830400D1; US5981508A

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Herstellung eines Medikaments, das in einer Therapie zur Förderung des Heilprozesses von Nervenverletzungen im Zentralnervensystem oder im peripheren Nervensystem nützlich ist.
Hintergrund der Erfindung.
Nervenverletzungen, die durch physische Traumata, durch Ischämie oder durch Erkrankungen verursacht werden, können zu schwerwiegenden Gebrechen oder sogar zum Tod führen. Solche Gebrechen, die physischer und/oder mentaler Natur sein können, umfassen Beweglichkeitsverlust, beeinträchtigte sensorische Wahrnehmung, Verlust kognitiver Funktionen, Anfälle und emotionelle sowie Persönlichkeitsstörungen. Angesichts der Häufigkeit von Todesfällen und des Häufigkeitsgrades sowie des möglichen Ausmaßes von Gebrechen bei Überlebenden stellen Nervenverletzungen ein großes gesundheitliches Problem für Einzelpersonen und die ganze Gesellschaft dar. Demgemäß besteht Bedarf an Behandlungen, die die Wiederherstellung verletzter Nerven und neuronaler Wege verbessern. Zur Zeit gibt es keine effiziente Behandlung für Verletzungen des Zentralnervensystems (ZNS).
Physische Gehirntraumata, Rückenmarkskompression oder -durchtrennung, Ischämie oder chirurgische Eingriffe verursachen Hypoxie, die eine Reihe an molekularen Ereignissen auslöst, welche wiederum zu Nervenverletzungen führen (X.Z. Liu et al., Neuronal and glial apoptosis after traumatic spinal cord injury, J. Neurosci. 17, 5395–5406 (1997); Y. Olsson et al., Release of endogenous neurochemicals may increase vascular permeability, induce edema and influence cell changes in trauma to the spinal cord, Progress in Brain Res. 91, 197–203 (1992); M.J. Crowe et al., Apoptosis and delayed degeneration after spinal cord injury in rats and monkeys, Nature Med. 3, 73–76 (1997)). Trotz medizinischer Behandlung sterben zahlreiche Patienten in den ersten paar Tagen nach einer schwerwiegenden ZNS-Verletzung. Für jene Pati enten, die ihre Verletzungen überleben, hängt die Prognose von der Fähigkeit der verbleibenden Neuronen ab, neue Funktionen zu adaptieren, da mithilfe der aktuellen Techniken die Verbindungsfähigkeit von Neuronen nur selten wiederhergestellt wird. Da neuronale Adaptation nur langsam erfolgt und häufig unvollständig ist, wäre der mögliche Nutzen einer Behandlung, die Nervenheilung und den Neuaufbau neuronaler Verbindungen verbessert, ebenso gewaltig wie der Nutzen, der aus Behandlungen gezogen werden kann, die die Wahrscheinlichkeit reduzieren, dass ein Patient während der kritischen Phase unmittelbar nach Zuziehen der Verletzung stirbt.
Neuronen im peripheren Nervensystem können ihre Targets neu bilden und neu innervieren. Narbengewebe jedoch, das sich infolge der Verletzung bildet, kann das Wachstum von regenerierenden peripheren Nerven behindern und somit die Wiedergewinnung der neuronalen Funktion stören. Da der Heilprozess bei neuronalen Verletzungen durch Hemmen von Narbenbildung verbessert werden kann, besteht Bedarf an einer Behandlung zur Minimierung von Narbenbildung im peripheren Nervensystem.
Die Regeneration von Nerven im ZNS von Säugetieren ist stärker eingeschränkt. Im erwachsenen Säugetier-ZNS wurde bis vor kurzem neuronale Regeneration als nahezu unmöglich erachtet (L. Snell & M.E. Schwab, Sprouting and regeneration of lesioned cortical spinal tract fibres in the adult rat spinal cord, Eur. J. Neurosci. 5, 1156–1161 (1993); H. Cheng et al., Spinal cord repair in adult paraplegic rats: partial restoration of hind limb function, Science 273, 510–513 (1996); W. Young, Spinal cord regeneration, Science 273, 451 (1996); L. Olson, Regeneration in the adult central nervous system: Experimental repair strategies, Nature Med. 3(12), 1329–1335 (1997); Y. Li et al., Repair of adult rat cortical spinal tract by transplant of olfactory and ensheathing cells, Science 277, 2000–2002 (1997)). Da für ZNS-Neuronen von erwachsene Säugetieren gezeigt wurde, dass sie in der Lage sind, Synapsenverbindungen wachsen zu lassen und zu entwickeln, wenn sie in eine andere Umgebung platziert wurden, wurde hypothetisch angenommen, dass das ZNS Inhibitoren neuronaler Regeneration enthielt. Neuronales Wachstum im ZNS kann auch durch Gliose verzögert werden, ein Verfahren, in dem Glialnarben im heilenden ZNS durch Pro liferation von Astrozyten und Mikroglia und Infiltration von Makrophagen gebildet werden. Posttraumatische Epilepsie, die bis zu mehrere Jahre später nach einem Kopftrauma auftreten kann, wird auch mit Glial-Zerebromeningeal-Narben in Verbindung gebracht (J.O. McNamara, Cellular and molecular basis of epilepsy, J. Neurosci. 14, 3413–3416 (1994)). Da das Minimieren von Gliose einerseits neuronale Regeneration verbessern und andererseits die Wahrscheinlichkeit posttraumatischer Epilepsie senken kann, gibt es Bedarf an Behandlungen, die Gliose hemmen.
Dass Personen mit ZNS-Verletzungen, insbesondere mit Rückenmarksverletzungen, ihre Nervenfunktionen nicht wiedererlangen, ist teilweise auf sterische Beeinträchtigung durch Gliose und darauf folgende Narbenbildung zurückzuführen. Es besteht Bedarf an einer Behandlung zur Verbesserung des Heilprozesses von ZNS-Verletzungen durch Minimieren von Gliose und Narbenbildung. Der Bedarf ist besonders groß an einer Behandlung, die zusätzlich zur Verbesserung des Heilprozesses frischer Nervenverletzungen auch die Wiederherstellung neuronaler Funktion bei einer Person mit einer bereits existierenden Nervenverletzung unterstützen könnte.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ermöglicht ein Verfahren zur Behandlung von Nervenverletzungen durch Verabreichung eines GBS-Toxins, eines nicht-toxischen Polysaccharids, das aus β-hämolytrischen Streptokokkus-Bakterien der Gruppe B stammt.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das Unterstützen der Wiederherstellung neuronaler Verbindungen in einem Patienten mit Nervenverletzung. Die vorliegende Erfindung zeigt, dass das Verabreichen von GBS-Toxin den Transfer elektrischer Impulse über eine Stelle einer Nervenschädigung steigerte. GBS-Toxin-vermittelte Steigerung neuronaler Verbindungsfähigkeit ist funktionell gesehen signifikant: Tiere, die mit GBS-Txoin behandelt worden waren, fanden ihre Fähigkeit wieder, innerhalb von ein paar Tagen nach der Nervenverletzung zu gehen, während unbehandelte Tiere mit denselben Verletzungen gelähmt blieben.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist zumindest teilweises Hemmen von Narbenbildung bei Patienten mit Nervenverletzungen. Das Minimieren von Narbenbildung ermöglicht vollständigere Wiederherstellung der neuronalen Verbindungen. Darüber hinaus reduziert durch das Reduzieren von Gliose GBS-Toxin-Verabreichung an Patienten mit Schädeltrauma auch die Wahrscheinlichkeit posttraumatischer Epilepsie und anderer Komplikationen.
Ein dritter Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines Toxins von β-hämolytischem Streptokokkus der Gruppe B (GBS) zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zur Steigerung der Überlebenswahrscheinlichkeit eines Patienten nach einer ZNS-Verletzung.
Ein vierter Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines Toxins von β-hämolytischem Streptokokkus der Gruppe B (GBS) zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zum Minimieren der Bildung neuer Narben aufgrund der chirurgischen Exzision von bereits bestehendem Narbengewebe, das auf eine bereits existierende Nervenverletzung zurückzuführen ist. Die Behandlung kann die Transplantation neuronaler Vorläuferzellen in unmittelbarer Nähe der Exzisionsstelle einbinden. Das Medikament kann eine Verbindung einbinden, die neurale Regeneration fördert, z.B. IGF-1, bFGF, TGFβS, BDNF, NT-3 oder CNTF.
Ein Herstellungsartikel, der GBS-Toxin umfasst, und insbesondere CM101, zusammen mit Anleitungen zur Behandlung und ein Verfahren zur Herstellung des Artikels sind ebenfalls offenbart.
GBS-Toxin kann verwendet werden, um die Qualität des Heilungsprozesses sowohl im ZNS als auch im peripheren Nervensystem zu verbessern.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Resultate von elektrophysiologischen Versuchen an isolierten ZNS mit Rückenmarks-Quetschverletzungen. 1A ist eine graphische Darstellung des in diesen Versuchen verwendeten Zwei-Mikroelektroden-Systems: Die links der Quetschstelle angebrachte Mikroelektrode gab einen einzelnen elektrischen Impuls ab (Pfeil), und die rechte Mikroelektrode zeichnete die durch den Impuls induzierten Veränderung im Membranpotential auf. Die Versuche wurden einen Tag (B & C) und fünf Tage (D & E) nach der Verletzung an nicht behandelten, traumatisierten ZNS (B & D) und an traumatisierten ZNS, die mit 0,3 μg/ml CM101 (C & E) behandelt worden waren, durchgeführt. Die rechts angeführten Kalibrierungen gelten für alle Versuche.
2 zeigt die Wiedergewinnung der Funktion der Hinterextremität bei monoplegischen (A) oder paraplegischen (B) Mäusen von Kontrollgruppen (leeres Quadrat), 30-μg/kg-CM101-Gruppen (volles Dreieck) und 60-μg/kg-CM101-Gruppen (voller Kreis). Die mittleren Ergebnisse der freien Bewegung von Mäusen aus jeder Gruppe sind auf der Y-Achse dargestellt, und die X-Achse gibt den Tag an, an dem die Messungen vorgenommen wurden, wobei Tag 0 der Tag des chirurgischen Eingriffs war. Bei monoplegischen Tieren (A) wurden die Ergebnisse von der gelähmten Gliedmaße genommen. Bei paraplegischen Mäusen (B) wurden die Ergebnisse für die einzelnen Tiere durch Berechnung des Mittelwertes der Ergebnisse für jede der beiden Hinterextremitäten ermittelt.
3 zeigt die Wirkungen von 3 zweiten Impulsen von 10 μM GABA (horizontale Linien unter der Anzeige) auf das Membranpotential von kultivierten Kontroll-Maus-Rückenmarkneuronen (A, D, G), traumatisierten Neuronen, die mit 0,3 μg/ml CM101 behandelt wurden (B, E, H), und nicht behandelten traumatisierten Neuronen (C, F, I). GABA-Impulse wurden 6 Stunden lang (A, B, C), zwei Tage lang (D, E, F) und fünf Tage lang (G, H, I) nach der Verletzung angelegt. Die rechts angegebenen Kalibrierungen gelten überall.
BESCHREIBUNG SPEZIFISCHER AUSFÜHRUNGSFORMEN
CM101, ein GBS-Toxin, ist ein Polysaccaridmolekül, das aus einem β-hämolytischen Streptokokkus der Gruppe B (GBS) isoliert wurde. Spezifisch produziert pathogener β-hämolytischer Streptokokkus der Gruppe B ein Polysaccharid-Exotoxin. Dieses Exotoxin ist das vermutliche Agens für frühen Krankheitsbeginn bei neugeborgenen Menschen. Es wird angenommen, dass Rezeptoren für CM101 primär an den Lungen von Neugeborenen vorhanden sind, was sie auf Neugeborenensepsis empfindlich macht, wobei jedoch diese Rezeptoren in etwa vier bis sieben Tagen nach der Geburt verloren gehen. Somit betrifft die vorliegende Erfindung im Allgemeinen die Behandlung von Patienten, die zumindest 7 Tage alt sind.
Es wurde gezeigt, dass isoliertes und gereinigtes CM101 toxische Wirkungen auf Schaf-Versuchsmodelle hatte, die GBS-Säuglingslungenerkrankung nachahmen (C.G. Hellerqvist et al., Studies on group B β-hemolytic streptococcus I. Isolation and partial characterization of an extra-cellular toxin, Pediatr. Res. 12, 892–898 (1981)). Im Schafmodell von neonataler Neugeborenensepsis verursacht GBS-Toxin Lungenhypertension, gesteigerte Lungengefäßdurchlässigkeit, Granulozytopenie und Lungensequestration von Granulozyten.
CM101 hat ein Molekulargewicht von etwa 300.000 Da und umfasst N-Acetylgalactosamin, N-Acetylglucosamin, Glucose-, Galactose- und Mannosereste. Es wird auch von Carbonsäureresten angenommen, dass sie einen integralen Bestandteil des Moleküls bilden. Sich wiederholende, aktive Epitope spielen höchstwahrscheinlich durch Vernetzungsrezeptoren am Target-Endothel eine wichtige Rolle in der pathophysiologischen Reaktion auf CM101 (C.G. Hellerqvist et al., Early Results of a Phase I Trial of CM101 in Cancer Patients, Proceedings of the American Association of Cancer Research Annual Meeting (1995)).
Ein Verfahren zur Reinigung eines GBS-Toxins wird im US-Patent Nr. 5.010.062 bereitgestellt. Vorzugsweise wird das CM101 jedoch gemäß dem Verfahren, das in der Internationalen Anmeldung Nr. PCT/US97/17535 beschrieben wird, gereinigt.
Eine Quelle für GBS-Ausgangsmaterial zur Verwendung im Verfahren der vorliegenden Erfindung kann durch Kultivieren von Stämmen von β-hämolytischen Streptokokken-Bakterien der Gruppe B erhalten werden, die kurz davor neugeborene Säuglinge infiziert haben oder die in der Lage sind, sie zu infizieren. Isolate solcher Stämme können aus dem Blut oder der Rückenmarksflüssigkeit der infizierten Säuglinge erhalten werden.
Ohne Einschränkung auf eine bestimmte Theorie wird angenommen, dass GBS-Toxin, und insbesondere CM101, eine wichtige Rolle bei der Behandlung von Nervenverletzungen spielt, da es die Regeneration von Nervenverbindungen durch Hemmen von Gliazellvermehrung verbessert. Es ist bekannt, dass das ZNS betreffende Traumata Hypoxie verursachen (Liu et al., 1997) und dass sie die Freisetzung von Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF) auslösen. VEGF stimuliert Endothelzellen, sich zu dedifferenzieren und zu beginnen, neue Blutgefäße zu bilden. Die neu gebildeten Blutgefäße erleichtern Gliazellvermehrung, was Narben entstehen lässt, die die Neubildung neuronaler Kontakte physisch hemmen. CM101-Behandlung unterbindet die Vermehrung von Gliazellen und vermindert somit Gliose (die Bildung von Narben im heilenden ZNS). CM101-vermittelte Hemmung von Gliazellvermehrung ist indirekt und tritt durch Binden von CM101 an dedifferenzierte gefäßbildende Endothelzellen, wodurch diese zum Target für Komplement-vermittelten Zerstörung werden, und durch Herabregulierung von VEGF-Transkription auf (B.D. Wamil et al., CM101 inhibits VEGF induced tumor neovascularization as determined by MRI and RT-PCR, AACR Proceedings 38, 237 (1997)). Da Glialnarben Nervenneuverbindung von geschädigten Axonen sterisch stören, fördert die Behandlung mit CM101 die Wiederherstellung von Nervenverbindungen und ermöglicht somit die Wiedergewinnung vitaler Organfunktionen sowie motorischer und sensorischer Funktionen.
Die vorliegende Erfindung ist zur Behandlung von Verletzungen des Zentralnervensystems und des peripheren Nervensystems nützlich. Sie verbessert den Neuaufbau neuronaler Verbindungen nach Verletzungen durch Hemmen von Narbenbildung und durch Fördern der neuronalen Regeneration. Zusätzlich zur Behandlung von Trauma-, Operations- und Ischämiepatienten in den Minuten oder Stunden vor oder nach der Entstehung bzw. Zufügung der Verletzung findet CM101 Verwendung bei Patienten mit bereits bestehenden Nervenverletzungen und Verletzungen, die bereits länger als zwei Wochen vorhanden sind. Diesen Patienten wird CM101 verabreicht, um die Bildung neuer Narben nach mikrochirurgischen Exzisionen des bestehenden Narbengewebes zu unterbinden. Diese Patienten können Infusionen von Nervenwachstumsfaktor wie beispielsweise IGF-1, bFGF oder TGFβS (J. Houle et al., Axonal regeneration by chronically injured supraspinal neurons can be enhanced by exposure to insulin-like growth factor, basic fibroblast growth factor or transforming growth factor beta, Restorative Neurol. Neurosci. 10(4), 205–215 (1996)) oder BDNF, NT-3 (R. Grill et al., Cellular delivery of neurotrophin-3 promotes corticospinal axonal growth and partial functional recovery after spinal cord injury, J. Neurosci. 17, 5560–5572 (1997)), CNTF (J-H. Ye & J. Houle, Treatment of the chronically injured spinal cord with neurotrophic factors can promote axonal regeneration from superspinal neurons, Exp. Neurol. 143(1), 70–81 (1997); Grill et al., 1997) verabreicht oder Transplantate neuronaler Vorläuferzellen eingeführt werden (C. Lundberg et al., Conditionally immortalized neural progenitor cell lines integrate and differentiate after grafting to the adult rat striatum: A combined autoradiographic and electron microscopic study, Brain Res. 737(1–2), 295–300 (1996)), um neuronale Regeneration an der Exzisionsstelle zu steigern. Bei Patienten mit Schädeltrauma senkt CM101-Behandlung die Wahrscheinlichkeit posttraumatischer Epilepsie, die mit zerebromeningealer Narbenbildung assoziiert ist.
Da CM101 Nervenheilung fördert und die Wiederherstellung von neuronaler Neuverbindung verbessert, liefert es ein Verfahren zur Behandlung von Personen mit Erkrankungen, die durch Nervendegeneration oder Beeinträchtigung neuronaler Verbindungen charakterisiert sind. Diese Erkrankungen umfassen Alzheimer-Krankheit, Pick-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Striatum-Syndrom, Shy-Drager-Syndrom, Hal lervorden-Spatz-Syndrom, progressive supranukleäre Lähmung, olivopontozerebellare Atrophie, Friedreich-Ataxie, Ataxie-Teleangiektasie, amyotrophe Lateralsklerose, primäre Lateralsklerose, progressive Muskelatrophie, progressive Bulbärparalyse, Pseudobulbärparalyse, Werdnig-Hoffman-Krankheit, Kugelberg-Welander-Syndrom, multiple Sklerose und perivenöse Enzephalomyelitis. Der Vorteil von CM101-vermittelter geförderter Nervenheilung für Patienten, die an Krankheiten wie diesen leiden, ist beachtlich.
Eines der Verfahren, die verwendet werden, um die Wirkung von CM101 auf Nervenheilung zu bestimmen, ist ein In-vitro-Test von GABA-vermittelter Veränderung des Nervenmembranpotentials. Dieser Test basiert auf der Beobachtung, dass, obwohl gesunde Neuronen hyperpolarisieren, wenn sie GABA ausgesetzt werden, Neuronen, die eine nicht verheilte Verletzung aufweisen, depolarisieren, wenn GABA aufgetragen wird. Da die Amplitude der Depolarisierung das Ausmaß der Nervenschädigung widerspiegelt, stellt die Reaktion auf GABA über eine bestimmte Zeitspanne hinweg ein Maß für die Kinetik von neuronalem Aussprossen und Nervenheilung dar. Dieser Test zeigt, dass CM101 neuronale Regeneration fördert. Der GABA-Test ist auch nützlich zum Testen anderer Verbindungen auf ihre Fähigkeit, den Heilprozess neuronaler Verletzungen positiv oder negativ zu beeinflussen.
GBS-Toxin wie hierin verwendet ist als jede Fraktion oder Komponente definiert, die aus natürlichen oder lysierten GBS-Bakterien isoliert wurde oder aus Mediumsüberständen von lysierten und/oder autoklavierten GBS-Bakterien stammt und die eine biologische Aktivität aufweist, die durch Einsetzen von Atmungsbeschwerden im Schaftest (C.G. Hellerqvist et al., Studies on group B β-hemolytic streptococcus I. Isolation and partial characterization of an extra-cellular toxin, Pediatr. Res. 12, 892–898 (1981)) oder durch Aktivierung vom Komplement und Bindung an neue Blutgefäße zum Ausdruck kommt, wie durch einen Peroxidase-Antiperoxidase- (PAP-) Test eines Tumorgewebemusters gezeigt werden kann (C.G. Hellerqvist et al., Anti-tumor effects of GBS toxin: a polysaccaride exotoxin from group B β-hemolytic streptococcus, J. Canc. Res. Clin. Oncol. 120, 63–70 (1993); und C.G. Hellerqvist et al., Early Results of a Phase I Trial of CM101 in Cancer Patients, Proceedings of the Amercian Association of Cancer Research Annual Meeting (1995)). GBS-Toxin bezeichnet auch jedes synthetische Polysaccharid mit derselben Struktur oder Funktion wie jedes beliebige von GBS stammende Molekül mit der zuvor erwähnten Aktivität.
Im Wesentlichen reines GBS-Toxin bezeichnet ein Präparat, in dem GBS-Toxin zu mehr als 40 % rein (z.B. in einer Konzentration von zumindest etwa 40 Gew.-% vorhanden), vorzugsweise zu zumindest etwa 60 % rein, noch bevorzugter zu zumindest etwa 90 % rein, und am meisten bevorzugt zu zumindest etwa 95 % rein, ist. Dosierungen von GBS-Toxin mit geringer Reinheit sollten demgemäß geändert werden. Die Reinheit von GBS-Toxin wird ausführlicher in der Internationalen Anmeldung Nr. PCT/US97/17535 erläutert.
Das CM101 oder ein anderes GBS-Toxin wird vorzugsweise mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger kombiniert und einem Patienten systemisch verabreicht. Der Träger ist vorzugsweise einer, der leicht mit CM101 vermischt werden kann, um eine Zusammensetzung zu bilden, die intravenös (IV) verabreicht werden kann. Somit ist der Träger vorzugsweise Salzlösung, die andere pharmazeutisch annehmbare Exzipienten eingebunden haben kann, um ihre Eignung zur intravenösen Verabreichung sicherzustellen. Die resultierende Zusammensetzung ist steril und weist annehmbare osmotische Eigenschaften auf. Im Allgemeinen wird eine geeignete IV-Formulierung gemäß herkömmlichen Verfahren hergestellt, die Fachleuten bekannt sind. Beispielsweise stellt Kapitel 85 mit dem Titel "Intravenous Admixtures" von Salvatore J. Turco in der 18. Ausgabe von Remington's Pharamceutical Sciences, Mach Publishing Co. (1990), herkömmliche Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutisch annehmbaren IV-Zusammensetzung bereit, die in Bezug auf diese Erfindung nützlich ist. Andere Dosierungsformen zur Verabreichung von CM101 können auch verwendet werden. Sie können zur intraarteriellen oder intrathekalen Verabreichung bestimmt sein. Als eine Alternative zur systemischen Verabreichung kann CM101 auch lokal an einer Stelle verabreicht werden. Die Verabreichung von CM101 an den Patienten kann vor, während und/oder nach der Zufügung der Nervenverletzung erfolgen. Vorzugsweise wird CM101 innerhalb eines geeigneten Zeitfensters nach der Verletzung verabreicht. Die Verabreichung von CM101 bald nach Auftreten der Verletzung ist am meisten bevorzugt. Beispielsweise wird Verabreichung innerhalb eines Tages, oder vorzugsweise innerhalb von sechs Stunden, als ideal erachtet. Verabreichung von CM101 bald nach einer ZNS-Verletzung ist erforderlich, um die Wahrscheinlichkeit (im Bezug auf Patienten mit ähnlichen Verletzungen, die kein CM101 erhalten) zu steigern, dass der Patient die ersten paar Tage nach der Verletzung überlebt. Während die Länge dieser "kritischen Phase nach der Verletzung" je nach Art und Ausmaß der Verletzung variiert, sind Überleben für 72, 98 und 120 Stunden nach der Verletzung bereits bedeutende Fortschritte.
Die Menge von CM101, die einem Patienten verabreicht wird, ist eine Menge, die ausreichend ist, um den Wiederaufbau von Nervenverbindungen zu unterstützen und Narbenbildung zu minimieren. Eine bevorzugte Dosierung liegt im Bereich von 1 bis 100 μg/kg Körpergewicht. Eine bevorzugtere Dosierung liegt jedoch im Bereich von 1 μg/kg bis 50 μg/kg Körpergewicht, und eine am meisten bevorzugte Dosierung liegt im Bereich von 1 μg/kg bis 25 μg/kg. Es wird jedoch bekannt sein, dass die spezifische Dosierungsmenge für jeden einzelnen Patienten von zahlreichen Faktoren abhängt, einschließlich Alter, allgemeinem Gesundheitszustand, Geschlecht, Ernährung und Ausmaß der Nervenverletzung. Die Menge kann so ausgewählt werden, dass sie ausreichend ist, um Gliose, zumindest teilweise, zu hemmen. Dies kann das Risiko von posttraumatischer Epilepsie minimieren. Jede Dosierung wird vorzugsweise in Form einer Infusion innerhalb eines Zeitraums von bis zu 120 Minuten verabreicht, wobei 5 bis 60 Minuten die bevorzugte Zeitspanne und 5 bis 30 Minuten die am meisten bevorzugte Zeitspanne darstellen. Einmal wöchentliche Behandlungen sind bevorzugt und sind wahrscheinlich alles, was erforderlich ist, um nachweisbare Resultate zu erzielen.
Man spricht von Nervenverletzung, wenn ein Teil eines Neurons oder eines Nervs, ein Faserbündel oder -fortsatz durchstochen, gezerrt, durchtrennt, zerdrückt, gequetscht oder anders in seinen Fähigkeiten, elektrochemische Signale auszusenden oder zu empfangen, behindert wird. Die Wiederherstellung neuronaler Verbindungen bindet die Neubildung von normalen synaptischen Strukturen oder die Wiederauf nahme normaler synaptischer Funktion ein. Dies kann durch neurologische Untersuchung, neurologische Diagnoseverfahren wie beispielsweise Elektroenzephalographie, Bildgebung durch Magnetresonanz und CT-Scan oder durch elektrophysiologische Aufzeichnungen oder Sichtbarmachung von Synapsen bewertet werden.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Herstellungsartikel wie beispielsweise ein Set und ein Verfahren zur Herstellung dieses Artikels. Der Artikel bindet eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein GBS-Toxin, insbesondere CM101, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst, ein. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann in einen geeigneten Behälter platziert werden, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist. Auch sind Anweisungen zur Behandlung von Patienten gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung eingebunden.
Die Erfindung wird nun auf Grundlage der folgenden, nicht einschränkenden Beispiele, die nur zum Zwecke der Veranschaulichung dargeboten sind, noch verständlicher dargestellt.
BEISPIELE
Beispiel 1. CM101 fördert die Wiederherstellung neuronaler Verbindungen in traumatisierten, isolierten Zentralnervensystemen
Die Wirkungen von CM101 auf die Wiederherstellung neuronaler Verbindungen und das Wiedererlangen neuronaler Funktion wurden an isolierten und traumatisierten Zentralnervensystemen untersucht.
Isolierte ZNS-Kulturen wurden gemäß modifizierten veröffentlichten Verfahren (Nicholls et al. (1990); Stewart et al. (1991)) präpariert. Das Gehirn und Rückenmark mit daran angebundenen Dorsal- und Ventralwurzeln wurden aus embryonalen Mäusen E5 (Gestationstag 5) seziert, und eine Läsion wurde am Rückenmark durch sanftes Quetschen mit einer Operationspinzette induziert. Die traumatisierten ZNS-Präparate wurden bei Raumtemperatur (23–25°C) 5–7 Tage lang kultiviert (Stewart et al. (1991); Mollgard et al. (1994)). Das Kulturmedium war Eagle's Minimal Essential medium (MEM), das 0,2 % fötales Kalbserum (GIBCO), 30 ng/ml NGF 7S (Sigma), 10 μg/ml Insulin und 0,1 mg/ml Gentamicin-Sulfat enthielt. Nach Äquilibrierung mit Inkubatoratmosphäre, die 5 % CO₂ enthielt, betrug der pH des Kulturmediums 7,4. Das Medium wurde dreimal pro Woche erneuert. In einer Gruppe isolierter traumatisierter ZNS (n = 6) wurden 0,3 μg/ml CM101 zum Kulturmedium zugesetzt. Die unbehandelte Gruppe isolierter traumatisierter ZNS (n = 6) erhielt kein CM101. Einer Kontrollgruppe isolierter ZNS (n = 4) wurde keine Quetschverletzung zugeführt, wurde abgesehen davon jedoch gleich kultiviert wie die unbehandelte Gruppe.
Nach einem Tag und fünf Tagen in Kultur wurden elektrophysiologische Experimente durchgeführt, um auf synaptische Verbindungen an der Quetschstelle im Rückenmark zu testen. Bei jenen isolierten traumatisierten ZNS, die CM101 während der Kulturphase erhalten hatten, waren während der elektrophysiologischen Experimente 0,3 μg/ml CM101 im Superfusat vorhanden. Bei den Experimenten, die bei 37°C durchgeführt wurden, wurde ein duales intrazelluläres Mikroelektroden-Aufzeichnungsverfahren eingesetzt (Wamil et al. (1994); Sotela & Alvarado-Mallart (1991)). An jeder Seite der Rückenmarksläsion wurde eine Mikroelektrode in das Gewebe eingeführt (1A). Ein Experiment bestand darin, dass eine Mikroelektrode einen einzelnen elektrischen Impuls abgab (1B–E, Pfeil nach oben) und die andere Mikroelektrode jegliche resultierende Depolarisation aufzeichnete oder Aktionspotentiale and der anderen Seite der Verletzung abgab.
An den Tagen 1, 2, 3, 4, 5, 10 und 16 wurde isoliertes ZNS-Gewebe zur histologischen Untersuchung auf neuverbundene Axone in benachbarten Segmenten der Rückenmarks entfernt.
Ergebnisse
In nicht behandelten isolierten ZNS nach einem Tag in Kultur produzierte die Impulsstimulierung (500 ms, 2–8 nA) eine kurze Depolarisationsreaktion und wenige, wenn überhaupt, Aktionspotentiale (1B). Die Latenz dieser Reaktion betrug 4–20 s. Im Vergleich dazu hatten Kontroll-ZNS-Kulturen eine Latenzdauer von 0,5–3 ms (nicht dargestellt). Wurden die traumatisierten isolierten ZNS, die mit CM101 behandelt worden waren, mit einem Impuls von 500 ms und 2–8 nA stimuliert, so führte dies zu einer kurzen Depolarisationsantwort und selten oder nie zu Aktionspotentialen (1C). Die Latenz dieser Reaktion betrug 10–20 s. Diese Ergebnisse zeigen, dass sowohl unbehandelte als auch CM101-behandelte ZNS manche Nervenverbindungen über die Quetschstelle hinweg wiederhergestellt hatten. Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den behandelten und unbehandelten ZNS nach einem Tag CM101-Behandlung beobachtet.
Fünf Tage nach der Verletzung ergab ähnliche Stimulation von unbehandelten, traumatisierten isolierten ZNS größere Depolarisationsamplituden, längere Reaktionsdauern und intensivere Abgabe von Aktionspotentialen ohne postsynaptische Potentiale als zuvor beobachtet wurden (vergleiche 1D mit 1B). Die Latenz der Abgabe betrug 2–4 s. Exzitatorische postsynaptische Potentiale (EPSP) überwogen gegenüber inhibitorischen postsynaptischen Potentialen (IPSP). In den ZNS, die fünf Tage lang nach der Verletzung CM101 ausgesetzt worden waren, führte die Impulsstimulation zu intensiver zweigerichteter Aktivität (Depolarisation und Hyperpolarisation) in Form von exzitatorischen APs und inhibitorischer Hyperpolarisation (1E). Diese Steigerung von exzitatorischer und inhibitorischer Aktivität in Bezug auf unbehandelte traumatisierte ZNS zeigt, dass CM101-Behandlung neuronale Neuverbindung und Wiedergewinnung der Funktion der Rückenmarksbahnen fördert.
Beispiel 2. CM101 verbessert die Wiedergewinnung neuronaler Funktion bei Mäusen mit Druckverletzungen am Rückenmark
Untersucht wurden die Wirkungen von CM101 auf die Genesung nach akuter physischer Verletzung des Säugetier-Zentralnervensystems. Ein Mausmodell von Rückenmarks-Druck/Quetschverletzung wurde zur langfristigen Beobachtung von Verhaltensveränderungen, die aus akutem Trauma und Behandlung mit CM101 resultieren, entwickelt.
Vier Wochen alte CD-1-Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip einer Kontrollgruppe (n = 6) oder einer CM101-behandelten Gruppe (n = 6) zugewiesen. Alle Mäuse erhielten einen Hautschnitt und eine bilaterale Läsion des Rückenmarks auf der Höhe von TH11–TH12. Innerhalb von 5 Minuten des Traumas erhielten alle Tiere eine Injektion von 100 μl in die dorsale Schwanzvene. Die CM101-behandelten Tiere erhielten Injektionen von 20, 60 oder 120 μg/kg (n = 2 pro Konzentration), und die Kontrolltiere erhielten Dulbecco's phosphatgepufferte Salzlösung. Die Tiere wurden sieben Tage lang beobachtet. Wenn die Mäuse nach dem siebenten Tag starben oder getötet wurden, wurden Fragmente des Rückenmarks mit Quetschverletzung zur histopathologischen Untersuchung entnommen, um den herkömmlichen Zeitpunkt von Gliose und die Qualität der Nervenverbindungen zu bestimmen.
Ergebnisse
Innerhalb der ersten 48 Stunden waren alle Tiere sediert und zeigten beinahe keine Bewegungsaktivität. Während der ersten vier Tage nach der Verletzung schleppten alle Mäuse ihre Hinterextremitäten hinter sich her, wobei keine Unterschiede zwischen den Kontrolltieren und den CM101-behandelten Mäusen beobachtet werden konnte. Von den fünf Mäusen, die bis zum Tag 5 überlebten, waren alle drei behandelten Mäuse (zwei, die 20 μg/kg, und eine, die 60 μg/kg erhalten hatten) in der Lage, unter mäßigem Hinken beider Hinterläufe zu gehen, während die Hinterläufe der Kontrollmäuse gelähmt waren. Eine behandelte Maus (60 μg/kg CM101) und eine Kontrollmaus überlebten sieben Tage nach dem Trauma. Die Kontrollmaus wies beidseitige Lähmung der Hinterläufe am siebenten Tag auf. Im Vergleich dazu war die CM101-behandelte Maus am siebenten Tag in der Lage, zu gehen, das Körpergewicht während des Setzens eines Schrittes auszubalancieren und eine Rampe mit 60° Neigung hinaufzuklettern. Der am stärksten merkliche Defekt bei der CM101-behandelten Maus am Tag 7 war ein leichtes Nachziehen der Zehe am linken Fuß. Diese Resultate weisen darauf hin, dass CM101 die Wiedergewinnung der Funktion des Rückenmarks nach einer Druck- oder Quetschverletzung der unteren Brustwirbelsäule verbessert.
Beispiel 3. CM101 ermöglicht es erwachsenen Mäusen, die durch Druckverletzungen des Rückenmarks gelähmt sind, die Fähigkeit zu gehen wiederzuerlangen, und steigert ihre posttraumatische Überlebensrate
Die Wirkungen von CM101-Behandlung auf die Genesung nach einer Rückenmarks-Druckverletzung wurden überprüft und in einer Versuchsreihe, die jener aus Beispiel 2 ähnlich war, erweitert.
Jede der 40 erwachsenen Mäuse, die mit Ketamin und Xylazin (80:20, 50–100 mg/kg durch intraperitoneale Injektion) anästhesierten wurden, erhielt einen 5–10 mm langen Schnitt in die geschorene, desinfizierte Haut über der Wirbelsäule, und die dorsalen Muskel wurden zurückgezogen, wodurch die Dornfortsätze der Wirbel TH8–TH13 freigelegt wurden. Die posterioren Fortsätze von TH10 und TH11 wurden durch Mikroscheren getrennt, und die intakte Dura mater wurde somit freigelegt. Das Rückenmarkssegment zwischen TH10 und TH11 wurde schrittweise durch dünne Pinzettenspitzen (1 mm breit) komprimiert. Die Kompression und die daraus resultierende Quetschverletzung waren bei 15 Mäusen auf eine Seite des Rückenmarks beschränkt ("Monoplegie"). Die übrigen 25 Mäuse erhielten bilaterale Druckverletzungen ("Paraplegie"), die das ganze Rückenmarkssegment zwischen TH10 und TH11 umfassten. Bei allen Mäusen reduzierte die Kompression den Segmentdurchmesser von 2 mm auf 0,1–0,2 mm. Das Verfahren wurde durch Schließen der inneren Schichten mittels chirurgischer Nähte und das Versiegeln der Haut mit sterilem Gewebekleber abgeschlossen. Jedes operierte Tier konnte sich unter uneingeschränktem Zugang zu Nahrung und Wasser von der Operation erholen. In der postoperativen Phase wurde darauf geachtet, Wirbelgelenke und Weichteile so wenig wie möglich zu schädigen.
Die mittels chirurgischem Eingriff verletzten Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip den Kontroll- und Behandlungsgruppen zugeteilt. Kontrolltiere (monoplegisch, n = 5; paraplegisch, n = 9) erhielten Dulbecco's phosphatgepufferte Salzlösung ("PBS"), während die behandelten Tiere entweder 30 μg/kg CM101 (monoplegisch, n = 4; paraplegisch, n = 8) oder 60 μg/kg CM101 (monoplegisch, n = 5; paraplegisch, n = 8), ver dünnt in PBS, erhielten. Alle Mäuse erhielten 100-μl-Injektionen in die dorsale Schwanzvene eine Stunde nach der Operation und an den Tagen 2, 4, 6, 8 und 10 nach der Operation.
Überleben, funktionelle Defizite und Genesung von der Lähmung wurden täglich im Laufe der ersten 21 Tage nach der Operation und anschließend wöchentlich bis zu 110 Tagen bewertet. Eine modifizierte Form des Open-field-Gehbewertungssystems, entwickelt von Cheng et al. (Spinal cord repair in adult paraplegic rats: partial restoration of hind limb function, Science 273, 510–513. (1996)), wurde verwendet, um die gesamte Bewegungsfähigkeit jeder Maus während einer 3- bis 5-minütigen Testphase zu messen. Ein Tier nach dem anderen konnte sich in einem Kunststoffbehälter (8'' × 11'' × 3'') frei bewegen. Die Bewegungsaktivität wurde auf Videoband aufgezeichnet, und die Tiere wurden von zwei unabhängigen, nicht informierten Beobachtern unter Verwendung einer modifizierten Tarlov-Skala (Cheng et al., 1996) bewertet. Diese Skala reicht von 0 (atonische oder spastische Lähmung) bis 5 (normales Gehen) und spiegelt exakt das Standardmuster zur Wiedergewinnung von lokomotorischen Funktionen wider:
0 – spastische und atonische Lähmung;
1 – keine spontane Bewegung, jedoch Wiedererlangung von sensorischen Reaktionen auf Stimuli;
2 – spontane, unkoordinierte Bewegung von Muskelgruppen;
3 – Bewegung von 2 oder 3 der Hauptgelenke in den Hinterläufen und aktives Stützen und entweder unkoordinierter Gang oder kurzzeitig koordinierter Gang (hinkendes Gehen);
4 – koordiniertes Gehen mit geringen Defiziten in den Hinterläufen und im Gang (einschließlich Gehen auf Knöcheln oder der mittleren Oberfläche des Fußes, mäßiges Nachziehen von Zehen oder Gehen auf breiter Basis; und
5 – vollständige Genesung normaler Gehfunktion.
Am Tag 6 wurden zwei Mäuse aus jeder paraplegischen Gruppe zur histologischen Analyse getötet. Sagittalschnitte des Rückenmarks wurden mit Hämatoxylin und Eo sin gefärbt, und der Grad von Hämorrhagie, Fibrose und Gliose in jedem Tier wurde bewertet und mittels Photomikrographie dokumentiert.
21 Tage nach der Verletzung wurde Magnetresonanz-Darstellung ("MRI") am Rückenmark der lebenden Kontrollmäuse und behandelten Mäuse durchgeführt, um den Bereich der Rückenmarkschädigung und den Heilungsprozess zu dokumentieren. Das Rückenmark wurde in 300-μm-Scheiben unter Verwendung einer mausgroßen Spule mit 1 Zoll Durchmesser bei 200 MHz, 4,6 Tesla Magnetfeld, sichtbar gemacht.
Ergebnisse
A. Überleben
Die Anzahl an überlebenden Tieren von Tag 0 (Tag der Operation) bis Tag 110 ist in Tabelle 1 dargestellt. Jede Spalte in Tabelle 1 stellt den angegebenen Tag nach der Operation dar, und jede Zeile steht für die Versuchsgruppe (M: Monoplegie; P: Paraplegie). Am Tag 1 waren 8 der 14 Kontrolltiere gestorben, und alle 26 behandelten Mäuse waren noch am Leben. Innerhalb der nächsten vier Tage starben 2 weitere Kontrollmäuse und 2 der 26 behandelten Tiere. Überleben an Tag 6 erreichte im Mittel 92,3 % in den Behandlungsgruppen gegenüber 28,6 % in den Kontrollgruppen. Später noch am selben Tag wurden zwei Mäuse aus jeder Paraplegie-Gruppe für histologische Tests getötet (in Tabelle 1 mit Sternchen gekennzeichnet). An Tag 28 starb ein weiteres Kontrolltier. Die 20 verbleibenden behandelten Mäuse und die einzige überlebende Kontrollmaus waren an Tag 35 noch immer am Leben. An Tag 110 gab es keine überlebenden Mäuse mehr aus der Gruppe der ursprünglich 14 Kontrollmäuse (von denen zwei an Tag 6 getötet worden waren), doch 17 der 26 behandelten Mäuse waren noch am Leben (wobei vier der 26 behandelten Mäuse an Tag 6 getötet worden waren). Somit liefern die Daten einen starken Beweis dafür, dass intravenöse Verabreichung von CM101 signifikanten Schutz vor früher Sterblichkeit in Verbindung mit traumatischer Rückenmarksverletzung gewährt. Insbesondere ist die Wahrscheinlichkeit, dass eine behandelte Maus fünf Tage oder länger nach der Ver letzung überlebt, sehr viel höher als die Überlebenswahrscheinlichkeit für eine Kon trollmaus.
Tabelle 1: Tierüberleben nach Rückenmarksverletzung
B. Wiedergewinnung der Funktion auf Ebene des Gesamtorganismus
Wiedererlangung der Gehfähigkeit bei monoplegischen und paraplegischen Tieren ist in Diagrammform in den 2A bzw. 2B abgebildet. Am Tag der Operation zogen die Mäuse in allen Untersuchungsgruppen ihren Hinterlauf/ihre Hinterläufe hinter sich her. (2A und 2B, Pfeil). Am Tag 2 zeigten 7 von 10 behandelten monoplegischen Mäusen und 10 von 16 behandelten paraplegischen Mäusen teilweise Wiederherstellung ihrer Gehfähigkeit, wie durch Open-field-Gehergebnisse mit einer Bewertung von zumindest 3 belegt wurde. Wurden die Ergebnisse von monoplegischen und paraplegischen behandelten Mäusen mit den entsprechenden Kontrollgruppen verglichen, so waren die Unterschiede signifikant (p<0,001 in Kruskal-Wallis-Test) bei den paraplegischen Tieren von Tag 3 an (unter Ausnahme von Tag 6) und bei den monoplegischen Tieren von Tag 6 an. Vollständige Wiedererlangung normaler Gehfunk tion wurde bei 10 von 10 behandelten (30 μg/kg CM101, n = 4; 60 μg/kg CM101, n = 6), monoplegischen Mäusen bis zum Tag 14, vier Tage nach der letzten CM101-Behandlung, beobachtet. Unter den paraplegischen Mäusen zeigten 7 von 8 Mäusen, die 30 μg/kg CM101, und 7 von 8 Mäusen, die 60 μg/kg CM101 erhielten, bis zum Tag 12 verbesserte Gehfähigkeit, die Bewertungen zwischen 3 und 5 verdienten. Mehrere behandelte Tiere wurden nach 110 Tagen noch am Leben gehalten; sie erzielten Bewertungen von 5 (normales Gehen) und gewannen sogar wieder Kontrolle über ihre Schwänze wieder.
Diese Daten zeigen, dass CM101 eine bemerkenswert rasche Regeneration des Rückenmarks bei Tieren mit akuter Rückenmarksverletzung hervorbringt, wofür die Wiederherstellung motorischer Funktionen innerhalb der Behandlungstage als Beweis steht.
C. Heilung und Glialnarbenbildung auf zellulärer Ebene
MRI-Bewertung des Bereichs der Rückenmarksschädigung an Tag 21 zeigte ausgeprägte Unterschiede bezüglich des Heilungsprozesses zwischen Kontroll- und behandelten Tieren. An der Kompressionsstelle in jedem der Kontrolltiere war ein offensichtlicher großer Schädigungsbereich vorhanden, der auch umgebendes Gewebe und Rückenmark umfasste. Im Vergleich dazu wiesen die behandelten Mäuse nur sehr stark eingegrenzte Läsionsbereiche auf. Dies zeigt, dass die Behandlung mit CM101 den Bereich der Kompressions-induzierten Schädigung und der Narbenbildung signifikant einschränkte.
Rückenmarks-Glioseniveaus und insgesamte Wiedergewinnung von Gewebestruktur wurden durch histopathologische Untersuchung von Gewebe aus behandelten und unbehandelten Tieren bestimmt. Die Ergebnisse bestätigten die Ergebnisse der MRI-Analyse: CM101-behandelte Mäuse wiesen im Vergleich mit Kontrollmäusen signifikant reduzierte Bereiche von Hämorrhagie, Gliose und Fibrose auf.
Beispiel 4. Behandlung mit CM101 erleichtert neuronale Regeneration in traumatisierten Rückenmarksneuronen in Kultur
Die Wirkung von CM101 auf die Heilung von Nervenverletzungen wurde in kultivierten Rückenmarks- und Cortexneuronen durch Bewerten von Veränderungen im neuronalen Membranpotential nach Anbringen eines Impulses von γ-Aminobuttersäure (GABA) getestet.
GABA, einer. der zentralen inhibitorischen Neurotransmitter im ZNS, verursacht Membranpotential-Hyperpolarisation durch Öffnen von Chloridkanälen über GABA_A-Rezeptoren und Reduzieren intrazellulärer Calciumkonzentrationen über GABA_B-Rezeptoren. Werden Neuronen jedoch durch direkte physische Schädigung des Zellkörpers oder der Fortsätze verletzt, so reagieren sie auf einen kurzen Impuls von GABA durch Depolarisation ihrer Membranpotentiale. Das Ausmaß der neuronalen Schädigung spiegelt sich in der Amplitude der GABA-vermittelten Depolarisation wider. Da die neuronale Reaktion auf GABA ein Maß für den Verletzungsgrad ist, kann die GABA-Reaktion verwendet werden, um den Genesungszustand verletzter Neuronen zu bewerten. Zusätzlich zur Dokumentation des normalen zeitlichen Ablaufs der Genesung verletzter Neuronen wurde der Test verwendet, um zu bestimmen, ob CM101 die Regeneration verletzter Neuronen beeinflusst.
Rückenmarkzellkulturen wurden gemäß den veröffentlichten Verfahren (Wamil et al., Use-, concentration-, and voltage-dependent limitation by MK-801 of action potential firing frequency in mouse central neurons in cell culture, J. Pharmacol. Exp. Ther. 260, 376–383 (1992)) hergestellt. Kurz zusammengefasst wurde embryonales Maus-Rückenmark (Gestationstag 13–14) zerkleinert und durch Verreiben auf einzelne Zellen und kleine Klümpchen verteilt. Die Neuronen wurden auf Collagen-beschichtete Schalen ausplattiert und in vitro bei 35°C 4–16 Wochen vor dem Versuch in diesem Zustand gehalten. Während der ersten Woche des Kultivierens bestand das Kulturmedium aus: 80 Vol.-% Eagle's MEM, ergänzt mit 5,5 mM Glucose und 24 mM Natriumbicarbonat; 10 % fötalem Kalbserum; und 10 % wärmeinaktiviertem Pferdeserum mit 10 ng/ml 7S Nervenwachstumsfaktor und 1 ml/l Mito Serum Extender (alle Er gänzungen von Collaborative Research, Bedford, MA). Nach Äquilibrierung mit Inkubatoratmosphäre, die 10 % CO₂ enthielt, betrug der pH des Kulturmediums 7,4. Das Kulturmedium wurde dreimal pro Woche erneuert. Nach einer Woche wurde das Wachstum nicht-neuronaler Zellen durch kurze Behandlung mit 5-Fluor-2'-desoxyuridin unterdrückt. Hiernach wurde kein Pferdeserum mehr in das Kulturmedium eingebunden.
Die hierbei verwendeten Verfahren wurden im Detail bereits an anderer Stelle veröffentlicht (Wamil et al., Use-, concentration-, and voltage-dependent limitation by MK-801 of action potential firing frequency in mouse central neurons in cell culture, J. Pharmacol. Exp. Ther. 260, 376–383 (1992)); Wamil et al., Phenytoin Blocks N-Methyl-D-Aspartate Responses of Mouse Central Neurons, J. Pharmacol. Exp. Ther. 267, 218 (1993)). Vor Versuchsdurchführung wurde das Kulturmedium durch modifizierte Dulbecco's phosphatgepufferte Salzlösung (mDPBS) ersetzt, die erhöhte Mg²⁺-Konzentrationen erhielt, um spontane synaptische Aktivität zu unterdrücken (Zusammensetzung in millimolar: NaCl, 143,3; KCl, 4,2; CaCl₂, 0,9; MgCl₂, 1,0–7,0; und Glucose 5,6 in 9,5 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 7,4). Die Kulturschale wurde in ein Mikroinkubationssystem (PDMI-2, Medical Systems Corp., Greenvale, NY) mit einer Temperatur, die durch eine bipolare Temperatursteuerung (TC-202, Medical Systems Corp., Greenvale, NY) bei 37°C gehalten wurde, auf der Haltevorrichtung eines Umkehrphasen-Kontrastmikroskops (Nikon Diaphot 300) platziert. Die Zellen wurden kontinuierlich mit mDPBS durchströmt.
Während der Experimente wurden einzelne Neuronen mit Mikroelektroden so durchbohrt, dass intrazelluläre Aufzeichnungen von transmembranem Potential durchgeführt werden konnten. Ein Brückenkreislauf im Verstärker (Axoclamp 2B, Axon Instruments) ermöglichte gleichzeitige Injektion von Strom und Aufzeichnung des Potentials.
Bevor die Wirkung von GABA auf das Membranpotential untersucht wurde, wurde die Qualität der Kulturen durch Anlegen (über die Aufzeichnungselektrode) einer Reihe von depolarisierenden Stromimpulsen von 400 ms Dauer und variabler Ampli tude, um übermäßige Aktionspotentiale (AP) in Neuronen mit stabilen ruhenden Potentialen (E_m), die noch stärker negativ als oder gleich –55 mV waren, zu wecken, ge- testet. Anhaltende wiederholte Abgabe von Aktionspotentialen und die E_m-Messung waren Kriterien für die Neuronenlebensfähigkeit. Neuronen, die während des Durchbohrens beschädigt wurden, hatten geringes Ruhepotential, unterschreitende Aktionspotentiale, deren Amplitude bei hyperpolarisierendem Stromfluss nicht anstieg, und entweder eingeschränkte Abgabe während der Depolarisationsschritte oder äußerst schnelle spontane Abgabe vor dem Verlust des Membranpotentials und dem Zelltod. Solche Durchbohrungen wurden entfernt, und ein neues Neuron wurde für die Untersuchung ausgewählt.
Neuronen wurden durch direkte physische Kompression von Fortsätzen oder Zellkörpern durch eine wärmepolierte Glasmikropipette verletzt. 5–10 Minuten nach Zufügung der Verletzung und dann während dieses und weiterer elektrophysiologischer Versuche wurde eine Gruppe verletzter Neuronen CM101 (0,1 bis 6 μg/ml, Carbo-Med, Inc., Brentwood, TN) im Superfusat ausgesetzt. Während der Kulturphasen, die den Versuchen folgten, erhielten diese behandelten Neuronen Kulturmedium, das mit 0,3 μg/ml CM101 ergänzt war. Die andere Gruppe verletzter Neuronen wurde CM101 nicht ausgesetzt.
Intrazelluläre Aufzeichnungen von transmembranem Potential wurden 6 Stunden, 2 Tage und 5 Tage nach der Verletzung und zu vergleichbaren Zeitpunkten an unverletzten Kontrollneuronen durchgeführt. Während der Aufzeichnung wurden 10 μM GABA (Research Biochemicals International, Natick, MA) durch 3 s Druckanlegung aus einer stumpfen Mikropipette, die aus einer Spannungsklemmenelektrode gemacht war, aufgebracht. Wirkstoffaufbringung wurde durch kontinuierliche Perfusion mit wirkstofffreiem Puffer, der in der zur Richtung der GABA-Auftragung entgegengesetzten Richtung einströmte, rasch beendet.
Ergebnisse
Wie erwartet führte das Aufbringen von 10 μM GABA auf intakte Neuronen nach 12–16 Wochen in Kultur zu einer Hyperpolarisation von 8,6 ± 0,7 SE mV für 10,0 ± 1,2 s (3A, D, G; Ruhemembranpotential, E_m = –67,5 ± 2,7, n = 10).
Unbehandelte Neuronen, die durch direkte physische Schädigung des Zellkörpers oder der Fortsätze verletzt wurden, werden durch eine 3-s-Druckanbringung von 10 μM GABA depolarisiert. Sechs Stunden nach der Quetschverletzung eines Fortsatzes depolarisierte GABA die neuronalen Membranen von traumatisierten Neuronen reversibel um 30 bis 55 mV (3C). Sogar 2 und 5 Tage nach Zufügung der Verletzung verursachte frisches Aufbringen von 10 μM GABA Depolarisation (3F bzw. I). Eine minimale Depolarisation von 20 mV wurde an Tag 5 des Versuchs verzeichnet (3I). Somit depolarisieren traumatisierte Neuronen in den Tagen nach einer Verletzung als Reaktion auf GABA-Aufbringung weiter, wobei jedoch Amplitude und Dauer der Depolarisation im Laufe der Zeit abnehmen.
Wurde GABA 6 Stunden nach der Verletzung aufgetragen, so reagierten CM101-behandelte Neuronen durch Depolarisation (3B). Diese Depolarisation war in Bezug auf Amplitude und Dauer jener ähnlich, die unbehandelte verletzte Neuronen bei Aussetzung gegenüber GABA aufwiesen (vergleiche die 3B und 3C). Nachdem Neuronen mit 0,3 μg/ml CM101 zwei Tage lang nach der Verletzung behandelt worden waren, verursachte GABA-Aufbringung Membrandepolarisation (3E). Amplitude und Dauer der Depolarisation waren jedoch im Vergleich zur Depolarisation von unbehandelten Neuronen zwei Tage nach der Verletzung signifikant herabgesetzt (vergleiche die 3E und 3F). Nach fünf Tagen kontinuierlicher CM101-Aussetzung nach Zufügung der Verletzung reagierten die traumatisierten Neuronen auf GABA mit einer geringfügigen Depolarisation (2 bis 5 mV) und einer geringfügigen Hyperpolarisation (1 bis 3 mV) (3H). Diese Reaktion ist jener Reaktion von nicht verletzten Neuronen auf GABA ähnlicher als jener Reaktion auf GABA von unbehandelten Neuronen fünf Tage nach der Verletzung (vergleiche 3H mit den 3G und 3I).
Diese Daten zeigen, dass die Wiederherstellung einer physiologisch normalen, hyperpolarisierenden Reaktion auf GABA durch CM101 verbessert wird. Somit werden Nervenverletzungen rascher ausgeheilt, wenn CM101 verabreicht wird. Dies weist darauf hin, dass CM101 neuronale Regeneration fördert.
Diese Untersuchungen liefern In-vivo-, Ex-vivo- und In-vitro-Beweise für gesteigerte neuronale Regeneration und Wiedererlangung physiologischer Funktionen durch verletzte Neuronen, die mit CM101 behandelt werden. CM101-Behandlung steigert die Wahrscheinlichkeit, dass Opfer von Verletzungen des Zentralnervensystems ihre Verletzungen überleben und neuronale Funktionen wiedererlangen, drastisch.
Alle in dieser Beschreibung erwähnten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen sind hierin durch Verweis in dem Maße aufgenommen, wie sie es wären, wenn für jede Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch und einzeln angegeben worden wäre, dass sie durch Verweis aufgenommen sind.
Nach ausführlicher Beschreibung der Erfindung wird es für Fachleute augenscheinlich sein, dass zahlreiche Änderungen und Modifikationen an dieser Erfindung vorgenommen werden können.

Claims

Verwendung eines Toxins von β-hämolytischem Streptokokkus der Gruppe B (GBS) bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Unterstützung der Wiederherstellung von Nervenverbindungen bei einem Patienten mit einer Nervenverletzung.
Verwendung eines Toxins von β-hämolytischem Streptokokkus der Gruppe B (GBS) beider Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Verhinderung von Narbenbildung bei einem Patienten mit einer Nervenverletzung.
Verwendung eines Toxins von β-hämolytischem Streptokokkus der Gruppe B (GBS) bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Erhöhung der Überlebenswahrscheinlichkeit eines Patienten nach einer Nervenverletzung im Zentralnervensystem des Patienten.
Verwendung eines Toxins von β-hämolytischem Streptokokkus der Gruppe B (GBS) bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Minimierung der Narbenbildung aufgrund der Exzision von Narbengewebe einer Nervenverletzung.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das GBS-Toxin im Wesentlichen rein ist.
Verwendung nach Anspruch 5, worin das GBS-Toxin eine Reinheit von zumindest etwa 90 % aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1, 2 oder 4, worin die Nervenverletzung im Zentralnervensystem liegt.
Verwendung nach Anspruch 3 oder 7, worin die Nervenverletzung im Rückenmark liegt.
Verwendung nach Anspruch 3 oder 7, worin die Nervenverletzung im Gehirn liegt.
Verwendung nach Anspruch 9, worin die Nervenverletzung im Cortex liegt.
Verwendung nach Anspruch 1, 2 oder 4, worin die Nervenverletzung im peripheren Nervensystem liegt.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Nervenverletzung durch ein Trauma hervorgerufen wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, worin die Nervenverletzung durch eine Operation hervorgerufen wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, worin die Nervenverletzung durch Ischämie hervorgerufen wird.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin dem Patienten GBS-Toxin intravenös verabreicht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin dem Patienten GBS-Toxin intraarteriell verabreicht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin dem Patienten GBS-Toxin intrathekal verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin dem Patienten innerhalb eines Tages nach Auftreten einer Verletzung GBS-Toxin verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 18, worin dem Patienten innerhalb von sechs Stunden nach Auftreten einer Verletzung GBS-Toxin verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin GBS-Toxin vor Auftreten einer Verletzung verabreicht wird.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Patient zumindest 7 Tage alt ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin dem Patienten GBS-Toxin in einer Dosis von 1 μg/kg bis 100 μg/kg Körpergewicht verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 2, worin GBS-Toxin in einer Menge verabreicht wird, die ausreicht, um Gliose zumindest teilweise zu hemmen.
Verwendung nach Anspruch 2, worin GBS-Toxin in einer Menge verabreicht wird, die ausreicht, um Gliose zumindest teilweise zu hemmen und so die Wahrscheinlichkeit von posttraumatischer Epilepsie bei Patienten zu minimieren.
Verwendung nach Anspruch 4, worin das Medikament weiters eine Verbindung umfasst, die Nervenregeneration fördert.
Verwendung nach Anspruch 25, worin die Verbindung, die Nervenregeneration fördert, aus IGF-1, bFGF, TGFβs, BDNF, NT-3 und CNTF ausgewählt wird.