DE69835591T2 - Induktoren für immuntoleranz - Google Patents

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Description

  • IMMUNTOLERANZINDUKTOR
  • TECHNISCHES GEBIET
  • Diese Erfindung betrifft die Verwendung eines Tolerogens für die Induktion einer Immuntoleranz.
  • STAND DER TECHNIK
  • Ein Immunsuppressionsmittel ist ein unverzichtbares Hilfsmittel für die Organtransplantation und neue Immunsuppressionsmittel werden eins nach dem anderen entwickelt. Gemäß der beabsichtigten Anwendung (Verwendung) können Immunsuppressionsmittel in zwei Kategorien klassifiziert werden. Die Arzneimittel der einen Kategorie sind diejenigen, die täglich genommen werden, solange das Transplantat in dem Körper des Empfängers verbleibt, für eine prophylaktische Unterdrückung von Transplantatabstoßungen und werden je nachdem Erhalt-Immunsuppressionsmittel, prophylaktische Immunsuppressionsmittel und basale Immunsuppressionsmittel genannt. Arzneimittel der anderen Kategorie sind diejenigen, die in massiven Dosen verwendet werden, wenn auch nur für begrenzte Zeitspannen, mit dem Ziel, eine intensive Immunsuppression auszulösen, die notwendig ist für die Heilung der Abstoßungsreaktion, die trotz einer verlängerten Immunsuppression auftreten kann, im wesentlichen einer zellulären Abstoßung und sind als therapeutische Arzneimittel für die Transplantatabstoßung bekannt.
  • Im Hinblick auf die prinzipielle pharmakologische Wirkung wie auch die Nebenwirkungen können diese Immunsuppressionsmittel jedoch kaum als harmlos für den menschlichen Körper angesehen werden und da langzeitige Erhaltungsdosen und/oder höhere Dosierungen nötig sind, sind toxische Wirkungen und/oder nachteilige Arzneimittelreaktionen, die nicht übersehen werden können, unvermeidlich. Weiterhin sind diese Immunsuppressionsmittel, wenn sie unabhängig verwendet werden, nicht stark genug, um eine ausreichende Immunsuppression zu erzeugen, noch sind sie dazu in der Lage, Transplantatabstoßungen nach Ausbruch bei hoher Heilungsrate zu heilen.
  • Währenddessen gibt es klinische Berichte, wenn auch sporadisch, über den Erfolg, mit dem Transplantate erhalten blieben, trotz fehlender Verabreichung eines Immunsuppressionsmittels und diese günstigen Ergebnisse wur den der Induktion einer immunologischen Toleranz zugeschrieben. Wenn eine solche Immuntoleranz tatsächlich etabliert werden könnte, würde die Verabreichung von Immunsuppressionsmitteln nicht mehr nötig sein. Daher wird die künstliche Induktion einer immunologischen Toleranz als vorrangige Aufgabe bei der heutigen Organtransplantation angesehen und Ergebnisse vieler relevanter Studien wurden berichtet.
  • Im Hinblick auf die Verfahrensweise für die künstliche Induktion einer immunologischen Toleranz kann auf den folgenden Bericht u.a. Bezug genommen werden.
    • Induction of Tolerance by Transfer of a Splenocyte or Myelocyte Tolerogen in Combination with Administration of an Antimitotic Drug [Fukuoka Acta Med., 81(1), 20-40 (1990); Microbiol. Immunol., 32(3), 283-292 (1988), etc.].
  • Als das antimitotische Arzneimittel werden 6-Mercaptopurin, Methotrexat, Cyclophosphamid (CP), 5-Fluoruracil, Azathioprin (AZP) und Procarbazin erwähnt und es wird gewarnt, das Cyclosporin A (CsA) und Steroide, die sich von diesen antimitotischen Mitteln im Hinblick auf die Wirkungsweise entfernt befinden, für die Induktion einer immunologischen Toleranz nicht geeignet sind.
  • Hayakawa et al. berichteten über ihren Versuch einen Donor-spezifischen immunkompromittierten Zustand mit FK506 zu induzieren [Keio Medicine, 72(3), 163-176 (1995)]. Ähnlich berichteten Muramatsu et al. über die Möglichkeit der Induktion einer immunologischen Toleranz mit 15-DSG [Abstract of Papers, gelesen auf dem 20th Congress of the Japan Society of Microsurgery, 89-90 (1994)].
  • Die vorliegenden Erfinder haben bereits früher berichtet, dass die Verabreichung von Knochenmarkszellen (insbesondere hämatopoietischen Stammzellen) in die Portalvene oder durch den ähnlichen intravenösen Weg bei Mäusen zu einem Einfangen von Donor-abstammenden Zellen in der Leber des Empfängers führt, zu einem Etablieren einer Chimerität und einer Induktion einer Immuntoleranz [Eur. J. Immunol., 24, 1558 (1994)].
  • In Eid et al. wird die Induktion einer Transplantationstoleranz durch Intraportalinjektion allogener Knochenmarkszellen beschrieben, wie auch mögliche Implikationen für eine intrauterine Knochenmarkstransplantation über Haupthistokompatibilitätsbarrieren [Transplant International, Juli 1988 1(2): 109-112]. Eine Bestrahlung wurde mit 400 rad WBI durchgeführt, was 4 Gy entspricht.
  • Die Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung einer Technologie, durch die die notwendige immunologische Toleranz für eine Organtrans plantation erfolgreich etabliert werden kann. Anders ausgedrückt, hat diese Erfindung die Aufgabe ein neues Verfahren zur Sicherstellung eines positiven Erhalts von Transplantaten bereitzustellen, ohne Verwendung von Immunsuppressionsmitteln für den Erhalt (durch langzeitige Verabreichung eines Immunsuppressionsmittels) und daher ohne die Risiken schwerwiegender Nebenwirkungen.
  • Nach intensiven Untersuchungen haben die Erfinder festgestellt, dass die Verwendung, wie hiernach beschrieben, das oben beschriebene Problem löst und haben die gegenwärtige Erfindung vervollständigt.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung stellt für die Induktion einer immunologischen Toleranz bei einem Patienten, der eine Organtransplantation durchläuft, die Verwendung einer effektiven Menge eines Tolerogens bereit, enthaltend hämatopoietische Stammzellen, hämatopoietische Vorläuferzellen, reife Lymphocyten oder eine Mischung daraus, wobei diese nicht von einem menschlichen Embryo abstammen, in Kombination mit einem pharmazeutischen Träger für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Pfortaderverabreichung zur Induktion einer immunologischen Toleranz bei einem Patienten, der eine Organtransplantation durchmacht, in Assoziation mit einer Gesamtkörperbestrahlung unter Verwendung einer sublethalen Bestrahlungsdosis von mindestens 6,5 Gy.
  • Dadurch stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Immuntoleranzinduktors zur Anwendung an einen Patienten, der eine Organtransplantation durchläuft, zusammen mit einer Bestrahlung zur Induktion der immunologischen Toleranz bei dem Patienten bereit, umfassend eine effektive Menge eines Tolerogens, enthaltend hämatopoietische Stammzellen, hämatopoietische Vorläuferzellen oder eine Mischung daraus in Kombination mit einem pharmazeutischen Träger, insbesondere einen Immuntoleranzinduktor, umfassend eine Knochenmarkszellfraktion als Tolerogen.
  • Durch Verwendung eines Immuntoleranzinduktors dieser Erfindung kann eine immunologische Toleranz, die der oben erwähnten Aufgabe entspricht, erfolgreich etabliert werden, so dass das transplantiere Organ in zufriedenstellendem Zustand erhalten werden kann.
  • Soweit diese Erhaltung aufrechterhalten bleibt, sind die pharmazeutische Art und Dosierungsform jeder Zusammensetzung nicht besonders begrenzt.
  • Beispielsweise können die pharmazeutischen Zusammensetzungen als Einzeldosisform oder optional in unabhängigen Dosierungsformen bereitgestellt werden. So gibt es, wie typischerweise durch die Beispiele für eine Verwendung, die hier noch angegeben werden, für den Immuntoleranzinduktor dieser Erfindung repräsentiert, keine besondere Begrenzung für die Art des pharmazeutischen Artefakts und die Dosierungsform unter der einzigen Maßgabe, dass die Aufgabe der Induktion der notwendigen immunologischen Toleranz gelöst wird.
  • Die Tolerogen-haltigen hämatopoietischen Stammzellen, hämatopoietischen Vorläuferzellen, reifen Lymphocyten oder Mischungen daraus, wobei es sich um den Wirkstoff in den pharmazeutischen Zusammensetzungen im allgemeinen handelt, können beispielsweise ein Tolerogen sein, abstammend von einem Transplantat-Donor (ein Tier desselben Stamms wie der Donor). Der oben erwähnte Wirkstoff kann eine Knochenmarkszellfraktion, Milzzellfraktion, periphere Blutzellfraktion oder eine Fraktion sein, umfassend eine Mischung derselben, die die Zellen enthält.
  • Die Abtrennung und Isolation solcher Tolerogene kann durch bekannte Verfahren durchgeführt werden. Beispielsweise können die Verfahren verwendet werden, die von Yamamoto et al. beschrieben werden [Blood, 88, 445-454 (1996) und das Verfahren, das in Protocols in Experimental Cellular Immunity [herausgegeben von Mishell B. B., Shiigi S. M., übersetzt von Katsuyuki Imai, Susumi Kawaguchi and Takayuki Harada, Rikogaku-Sha, S. 3-12, 1982] beschrieben wird.
  • Das bevorzugte Tolerogen von dem Transplantat-Donor (einem Menschen) beinhaltet Knochenmarkszellen und periphere Blutzellen. Das Verfahren zur Ernte dieser Zellen ist für den Fachmann auf dem Gebiet wohl bekannt. Beispielsweise kann das Verfahren zur Bearbeitung von Knochenmarkszellen dasselbe sein wie dasjenige, das bei der Knochenmarkstransplantation verwendet wird.
  • Das Tolerogen zur Verwendung in der pharmazeutischen Zusammensetzung ist vorzugsweise eine Knochenmarkszellfraktion, die an hämatopoietischen Vorläuferzellen reich ist, eine Milzelle oder eine periphere Blutzellfraktion, enthaltend reife Lymphocyten (ausschließlich aktivierte Lymphocyten) oder eine Mischung daraus. Andererseits ist das Tolerogen der pharmazeutischen Zusammensetzungen vorzugsweise die Knochenmarkszellfraktion. Als aktiver Bestandteil der pharmazeutischen Zusammensetzungen wird eine Knochenmarkszellfraktion wie oben erwähnt bevorzugt, jedoch wird die periphere Blutzellfraktion, enthaltend die hämatopoietischen Stammzellen, mobilisiert von dem Knochenmark durch Cytokine, wie G-CSF, ebenfalls bevorzugt, teilweise da sie sowohl reife Lymphocyten als auch hämatopoietische Vorläuferzellen enthält und teilweise da eine solche Zellfraktion einfach verfügbar ist.
  • Um die pharmazeutischen Zusammensetzungen bereitzustellen kann der aktive Bestandteil in eine konventionelle Dosierungsform formuliert werden, die für pharmazeutische Produkte bekannt ist, enthaltend zelluläre Fraktionen dieser Art. Die Dosierungsform kann gezielt aus einer Vielzahl von Dosierungsformen für den gegenwärtigen Zweck gewählt werden. Eine injizierbare Dosierungsform kann als Beispiel erwähnt werden. Der pharmazeutische Träger oder das Vehikel, die bei der Herstellung von solchen Dosierungsformen verwendet werden können, beinhalten einen breiten Bereich pharmazeutisch annehmbarer Substanzen. Das Herstellungsverfahren kann auch den etablierten pharmazeutischen Prozeduren folgen. Bei der Herstellung solcher Dosierungsformen können auch verschiedene Infusionen, die heutzutage in breiter Verwendung sind, verwendet werden.
  • Bei der Praxis dieser Erfindung können diese Dosierungsformen aus dem Stegreif hergestellt werden, falls gewünscht, wenn die Organtransplantation stattfindet unter Verwendung des von dem Transplantat-Donor erhaltenen Materials.
  • Die Dosierung und das Timing der Verabreichung für jede pharmazeutische Zusammensetzung sind nicht besonders begrenzt, können jedoch gezielt von dem Fachmann auf dem Gebiet gewählt werden, mit der einzigen Maßgabe, dass die notwendige immunologische Toleranz erfolgreich etabliert werden kann.
  • Die empfohlene Dosis der pharmazeutischen Zusammensetzung ist die notwendige Minimaldosis (3 × 107 Zellen bei Mäusen) um sicherzustellen, dass die Reaktivität gegenüber dem Alloantigen des Donors in der gemischten Lymphocytenreaktion nach der Verabreichung minimal wird (maximale Inhibition der Reaktion) und sich ausniveliert.
  • Der gemischte Lymphocytenreaktionstest für Milzzellen, wie oben genannt, kann auf Routineart durchgeführt werden [Protocols in Experimental Cellular Immunity, 147-149, 1982]. Die Gesamtdosis für die Verabreichung bei Menschen kann die bei konventioneller Knochenmarkstransplantation verwendete Dosis sein. Z.B. kann die Dosis im Hinblick auf Knochenmarkszellen bei ungefähr 3 × 108 Zellen pro kg oder mehr liegen.
  • Diese Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Induktion einer immunologischen Toleranz unter Verwendung der oben beschriebenen spezifischen Verfahren bereit.
  • Das durch das Verfahren dieser Erfindung erreichte oben erwähnte Ergebnis steht in keiner Beziehung zu dem Timing der Transplantation eines Transplantatmaterials. So kann die Transplantationsprozedur erfolgreich durchgeführt werden, egal ob parallel zu dem Verfahren dieser Erfindung oder nach Etablieren einer immunologischen Toleranz durch das Verfahren dieser Erfindung.
  • Bei der Induktion einer immunologischen Toleranz gemäß dieser Erfindung können verschiedene andere medizinische Behandlungen und die Verabreichung von Arzneimitteln, die gleichzeitig bei Verfahren dieser Art durchgeführt werden, in Kombination mit dem Verfahren der Erfindung durchgeführt werden, solange die Wirkung der Erfindung nicht kompromittiert wird.
  • Z.B. kann die Verabreichung von Immunosuppressionsmitteln erwähnt werden. Das Verfahren, Dosierung und Timing der Verabreichung der Immunosuppressionsmittel kann gezielt von dem Fachmann auf dem Gebiet gewählt werden.
  • Das besonders bevorzugte Immunsuppressionsmittel beinhaltet Cyclosporin A und FK506, um nur einige wenige repräsentative Arzneimittel zu erwähnen, und die Dosierung und das Verabreichungsverfahren können diejenigen sein, die für die bekannten kommerziellen Produkte empfohlen werden. Das besonders bevorzugte Verabreichungsverfahren ist die Verabreichung eines Immunsuppressionsmittels kurz nach Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung, einmal oder zweimal, beispielsweise um den 2. Tag oder um den 5. Tag herum, folgend auf die portale Verabreichung.
  • Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung eine Immuntoleranz-induzierende Technologie bereit, die eine Chimerität mit einer minimalen Invasion bereitstellen kann sowie mit einem hohen Grad der Sicherheit, um einen langzeitigen Erhalt des Zustands einer immunologischen Toleranz sicherzustellen.
  • So stellt die vorliegende Erfindung einen Immuntoleranzinduktor zur Verwendung bereit, in Assoziation mit einer Bestrahlung für einen Patienten, der eine Organtransplantation durchläuft, um eine immunologische Toleranz bei dem Patienten zu induzieren, der eine effektive Menge eines Tolerogens umfasst, enthaltend hämatopoietische Stammzellen, hämatopoietische Vorläuferzellen oder eine Mischung daraus und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
  • Die Immuntoleranz, die dem hier vorher genannten Objekt entspricht, kann etabliert werden, solange man das Verfahren in Kombination mit einer Bestrahlung befolgt, mit dem Ergebnis, dass das transplantierte Organ in einem zufriedenstellenden Zustand erhalten bleiben kann.
  • Das Tolerogen, das hämatopoietische Stammzellen, hämatopoietische Vorläuferzellen oder eine Mischung daraus umfasst, das den aktiven Bestandteil der Medizin dieser Erfindung zur Verabreichung an den Patienten in Assoziation mit einer Bestrahlung bildet, kann beispielsweise eine Knochen markszellfraktion, eine periphere Blutzellfraktion oder eine Mischung daraus sein, die hämatopoietische Stammzellen und hämatopoietische Vorläuferzellen enthält.
  • Das von dem Transplantat-Donor (einem Menschen) abstammende Tolerogen beinhaltet eine Knochenmarkszellfraktion, eine Nabelschnurblutzellfraktion und eine periphere Blutzellfraktion, enthaltend hämatopoietische Stammzellen, mobilisiert durch ein Cytokin, wie z.B. G-CSF.
  • Die Technik zur Abtrennung und Isolation des Tolerogens zur Verwendung bei dem Immuntoleranzinduktor dieser Erfindung, der zusammen mit einer Bestrahlung angewandt werden soll, das Verfahren zur Herstellung des Induktors, die Dosierungsform, der pharmazeutische Träger zur Verwendung bei der Herstellung der Dosierungsform, der Verabreichungsweg und die Dosierung sind dieselben wie vorher erwähnt für die obige pharmazeutische Zusammensetzung.
  • Es ist jedoch essentiell, dass der obige Immuntoleranzinduktor dieser Erfindung in Assoziation mit einer Strahlung verwendet wird, d.h., dass in die Portalvene dem Patienten, dem diese Strahlung verabreicht wird, verabreicht wird.
  • Die Referenzdosis für die intravenöse Verabreichung ist ungefähr die Dosis (3 × 107 Zellen bei Mäusen), die für eine Rekonstruktion des Immunsystems des Wirts bei der Transplantation von üblichen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-inkompatiblen Knochenmark benötigt wird (nach Bestrahlung mit einer lethalen Dosis bei Mäusen).
  • Wenn die obige Dosis für Mäuse als Referenz genommen wird, kann die Dosis für die Medizin dieser Erfindung in geeigneter Weise gemäß den Konventionen der Knochenmarkstransplantation gewählt werden. Als spezifisches Beispiel kann eine Dosis von ungefähr 3 × 108 Zellen/kg oder mehr im Hinblick auf Knochenmarkszellen erwähnt werden.
  • Die oben erwähnte Bestrahlung kann auf konventionelle Weise durchgeführt werden. Insbesondere wird der Patient (Empfänger), der eine Organtransplantation durchläuft, einer geeigneten Strahlungsdosis ausgesetzt von mindestens 6,5 Gy, jedoch einer sublethalen Dosis, vorzugsweise ungefähr 7,0 Gy pro Aussetzung auf einer Gesamtkörperbestrahlung (TBI)-Basis. Diese Bestrahlungsdosis ist auch als Bestrahlungsdosis gekennzeichnet, die eine Erholung der Knochenmarkszellen des Empfängers bereitstellt.
  • Die obige Bestrahlung kann vor der Verabreichung der Medizin dieser Erfindung durchgeführt werden und in der Regel wird die Medizin vorzugsweise innerhalb von 24 Stunden nach der Bestrahlung verabreicht.
  • Die Erfindung ist vorteilhaft darin, dass die erwartete Wirksamkeit durch eine einzelne Dosis einer Medikation erhalten werden kann, die für den Empfänger am wenigstens invasiv ist.
  • Durch Verabreichung der Medizin dieser Erfindung zusammen mit einer Bestrahlung kann die gewünschte immunologische Toleranz für einen zufriedenstellenden Erhalt des transplantierten Organs induziert werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Immuntoleranz-induzierendes Verfahren, das eine Bestrahlung involviert, bereit.
  • Das Phänomen, dass die gewünschte immunologische Toleranz durch dieses Verfahren, involvierend eine Bestrahlung, für einen erfolgreichen Erhalt des Transplantats induziert wird, steht ebenfalls nicht in Beziehung zu dem Timing der Operation für die Transplantation des Transplantats.
  • Bei der Durchführung des obigen Kombinationsbehandlungsverfahrens können ebenfalls die verschiedenen medizinischen Behandlungen und Medikationen, die üblicherweise bei Prozeduren dieser Art verabreicht werden, z.B. die Verabreichung von immunsuppressiven Arzneimitteln, wie Cyclosporin A, FK506, etc. gleichzeitig durchgeführt werden, wenn die Wirkung der Erfindung nicht vermindert oder ausgeschaltet wird.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist eine diagrammartige Repräsentation der Transplantationsrate von Hauttransplantaten in Testbeispiel 3 und
  • 2 ist eine diagrammartige Repräsentation der Transplantationsrate von Hauttransplantaten in Testbeispiel 4.
  • BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
  • Das folgende ist eine Beschreibung der Tests, die mit dem aktiven Bestandteil dieser Erfindung durchgeführt wurden, um diese Erfindung im weiteren Detail zu illustrieren.
  • TESTBEISPIEL 1 (nur zur Referenz)
  • Die Induktion der immunologischen Toleranz in diesen Testbeispielen wurde durch (1) die Injektion von allogenen Donor-Milzzellen oder Knochenmarkszellen in die Portalvene und (2) die intravenöse Injektion der allogenen Donor-Knochenmarkszellen bewirkt und das Etablieren der immunologischen Toleranz wurde unter Verwendung der erfolgreichen Transplantationsrate von Hauttransplantaten (die für den Donor allogen sind) bewertet, wobei es sich um das Organ als Indikator handelt, das einer Abstoßung besonders empfänglich gegenüber steht.
  • (1) PRÄPARATION DER MILZZELLSUSPENSION
  • Milzellen wurden von 8 Wochen alten weiblichen BALB/cCrSlc-Mäusen (Körpergewicht 19 bis 22 g, BALB/c; Japan SLC Inc.) geerntet und mit einem Paar von nicht-gezähnten Zangen auf einem 200 G rostfreiem Stahlsieb in RPMI1640-Lösung (Nikken Bio Med. Lab) zur Herstellung diskreter Milzzellen aufgelockert. Die Zellen wurden einmal mit RPMI1640-Lösung gewaschen und eine Hämolyse mit Tris-HCl-Ammoniumchloridpuffer (0,75 % NH4Cl, 0,017 M Tris-HCl, pH 7,5) unterworfen. Nach zwei weiteren Waschungen mit RPMI1640 wurden die Milzzellen in derselben Lösung wiederum suspendiert, um eine Milzzellsuspension bereitzustellen (Konzentration: 1,0 × 108/ml).
  • (2) PRÄPARATION EINER KNOCHENMARKSZELLSUSPENSION
  • Femur und Tibia wurden von 8 Wochen alten weiblichen BALB/c-Mäusen isoliert und eine 22-G-Nadel (Code Nr. NN-2225R, Terumo Co., Ltd.), befestigt an einer Spritze (2,5 ml, Code Nr. SS-02S, Terumo Co., Ltd.) wurde in jeden Knochen von der Kniegelenksseite her inseriert und die Knochenmarkszellen wurden in eine sterilisierte Schale gespült (90 × 16 mm, Iwaki Clinical Test Ware), wobei RPMI1640-Lösung verwendet wurde und in der RPMI1640-Lösung suspendiert. Die so geernteten Knochenmarkszellen wurden mit RPMI1640-Lösung einmal gewaschen und in derselbe Lösung resuspendiert, um die beabsichtigte Knochenmarkszellsuspension bereitzustellen (Konzentration: 1,0 × 108/ml).
  • (3) INJEKTION IN DIE PORTALVENE
  • Unter Pentobarbitalanästhesie (Pitman-Moor Inc.; 37,5 mg/kg Körpergewicht, i.p.) wurden 10 Wochen alte weibliche C57BL/6CrSlc-Mäuse (B6; Körpergewicht 20 bis 24 g, Japan SLC Inc.) mit einem Rasierer rasiert und desinfiziert. Dann wurde ein Mittellinieneinschnitt in den Abdominalbereich durchgeführt und das Mesenterium wurde exponiert. Eine 27 G-Nadel (Terumo Co., Ltd.), verbunden mit einer 1 ml-Tuberculinspritze, wurde durch das adipöse Gewebe des Mesenteriums inseriert und 3 × 107 BALB/c-Mausmilzzellen oder Knochenmarkszellen (0,3 ml Suspension), wie in (1) oben hergestellt, wurden in die Portalvene verabreicht.
  • (4) INTRAVENÖSE INJEKTION
  • Die in (1) oben hergestellte Knochenmarkszellsuspension wurde auf eine Konzentration von 1 ×108 Zellen/ml eingestellt und das 3 ×107 Zellenäquivalent der Suspension (0,3 ml) wurde in die Schwanzvene der Wirts-Maus am Tag 5 nach der Portalinjektion, wie in (3) oben beschrieben, verabreicht.
  • (5) HAUTTRANSPLANTATION
  • Die Hauttransplantation wurde am Tag 7 nach der Portalinjektion durchgeführt. Die Präparation von Hauttransplantatmaterialien und die Transplantation wurden wie folgt durchgeführt, unter Bezugnahme auf die in der Literatur beschriebenen Verfahren [Mayumi et al., Jpn. J. Surg., 18, 548-557 (1988)].
  • So wurden als Donor 8 Wochen alte BALB/c-Mäuse unter Ethylether (Nacalai Tesque Inc.)-Anästhesie geopfert. Unter Verwendung einer Depilationscreme (Feather Hair Remover, Feather Softy Razor Co., Ltd.) wurde das gesamte Fell entfernt und nach Desinfektion mit 70 % Alkohol wurde die gesamte Hautschicht abgeschält und gewonnen. Nachdem subkutanes Fettgewebe mit einem Zangenpaar und mit sanitären Baumbauwollflauschen, so weit wie möglich entfernt worden war (gebogene Spitze, sich verjüngend, ohne Zähne), wurde die Haut in eine Klappe geschnitten (1,2 × 1,5 cm2). Ein 1 mm langer Einschnitt wurde auf die Kranialseite der Klappe als Marker eingefügt und die Klappe wurde in einer kalten sterilen phosphatgepufferten Salzlösung (Dulbecco's PBS(–), Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) suspendiert.
  • Nachdem eine B6-Wirts-Maus mit Pentobarbital (37,5 mg/kg Körpergewicht, i.p.) anästhesiert worden war, wurde der rechte Dorsalbereich mit den Fingern von Haaren befreit und weiter mit der Depilationscreme (3,0 × 3,5 cm) und mit 70 % Alkohol desinfiziert, um ein Operationsfeld für die Hauttransplantation vorzubereiten.
  • Auf dem nackten Bereich wurde die oben hergestellte BALB/c-Hautklappe mit dem Marker caudad angeordnet platziert und mit 8 Stichen vernäht (im Zentrum von jeder Seite und an den 4 Ecken), wobei ein Nylonfaden mit einer 6,0-Nadel (Ethilon, Ethicon Inc.) verwendet wurde. Die Oberfläche des Hauttransplantats wurde mit einem Stück Gaze bedeckt, das eine Fradiomycinsulfatsalbe (2,0 × 2,5 cm, Sofratulle; Japan Roussel Co., Ltd.) trug und weiterhin mit einer adhäsiven elastischen Bandage (Elatex; Alcare Co., Ltd.) verdeckt.
  • Die Überprüfung für eine erfolgreiche Transplantation wurde in Woche 2 nach der Transplantation begonnen.
  • (6) ERGEBNISSE
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1
    Figure 00110001
  • (7) ERKLÄRUNG DER ERGEBNISSE UND DISKUSSION
  • Testgruppe 1: Von BALB/c-Mäusen abstammende Milzzellen wurden in die Portalvene von 10 MHC-inkompatiblen B6-Mäusen verabreicht. Am Tag 5 nach der Verabreichung wurden BALB/c-Mausknochenmarkszellen intravenös injiziert und am Tag 7 wurde eine Hauttransplantation durchgeführt. Im Ergebnis wurde eine erfolgreiche Transplantation des übertragenen Hautmaterials bei 10 von 10 Mäusen in Woche 36 nach der Transplantation bestätigt.
  • Testgruppe 2: Von BALB/c-Maus-abgeleitete Milzzellen wurden in die Portalvene von 5 gesunden B6-Mäusen verabreicht und am Tag 5 nach der Verabreichung wurden BALB/c-Maus-abgeleitete Milzzellen intravenös injiziert. Die Hauttransplantation wurde am Tag 7 durchgeführt. Im Ergebnis wurde eine erfolgreiche Transplantation bei einer von 5 Mäusen in Woche 18 nach der Transplantation bestätigt, jedoch wurde das Transplantat bei einer Maus in Woche 6 und bei 3 Mäusen in Woche 7 abgestoßen (versetzt).
  • Testgruppe 3: BALB/c-Mausknochenmarkzellen wurde in die Portalvene von 6 B6-Mäusen verabreicht und am Tag 5 wurde von BALB/c-Maus-abstammende Knochenmarkszellen intravenös verabreicht. Die Hauttransplantation wurde am Tag 7 durchgeführt. Im Ergebnis wurde eine erfolgreiche Transplantation von übertragener Haut bei 4 von 6 Mäusen in Woche 36 nach der Transplantation angetroffen.
  • Kontrollgruppe: BALB/c-Maus-abstammende Milzzellen wurden in die Portalvene von 9 B6-Mäusen verabreicht und eine Hauttransplantation wurde am Tag 7 durchgeführt. Im Ergebnis wurde das Transplantat bei 2 Mäusen in Woche 2 nach der Transplantation abgestoßen (versetzt) und bei den verbliebenen 2 Mäusen in Woche 3.
  • Kontrollgruppe 2: BALB/c-Maus-abgeleitete Knochenmarkzellen wurden in die Portalvene von 4 B6-Mäusen verabreicht und eine Hauttransplantation wurde am Tag 7 durchgeführt. Im Ergebnis wurde das Hauttransplantat bei 2 Mäusen in Woche 2 nach der Transplantation abgestoßen und bei den verbleibenden 2 Mäusen in Woche 3.
  • Es wird aus den obigen Ergebnissen deutlich, dass die portale Verabreichung der ersten pharmazeutischen Zusammensetzung und die darauffolgende intravenöse Verabreichung der zweiten pharmazeutischen Zusammensetzung eine erfolgreiche Transplantation des Hauttransplantats des Donors sicherstellt (Erhalt der Donor-Alloantigen-spezifischen Immuntoleranz).
  • Wenn weiterhin ein Immunsuppressionsmittel zwischen der portalen Verabreichung (Tag 0) und der intravenösen Verabreichung (Tag 5) von Knochenmarkszellen in der obigen Testgruppe 3 verabreicht wurde, wurde eine Verbesserung in der erfolgreichen Transplantationsrate der übertragenen Hauttransplantaten erhalten. Die folgenden Testbeispiele werfen ein klareres Licht auf die obigen Feststellungen werfen.
  • TESTBEISPIEL 2 (nur Referenz)
  • (1) HERSTELLUNG VON KNOCHENMARKSZELLEN UND VERABREICHUNG IN DIE PORTALVENE UND AUF DEM INTRAVENÖSEN WEG
  • Es wurden Knochenmarkszellen hergestellt und auf dieselbe Weise wie in den obigen Testbeispielen 1-(2), (3) und (4) verabreicht.
  • (2) VERABREICHUNG EINES IMMUNSUPPRESSIONSMITTELS
  • Als Immunsuppressionsmittel wurde entweder Cyclosporin A (CsA; Sandimmum, 250 mg/5 ml Lösung, Novartis Pharma K.K.) 10 mg/kg Körpergewicht oder FK506 (10 mg/ml Lösung, Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.) 1 mg/kg Körpergewicht intraperitoneal am Tag 2 und Tag 5 nach der Portalverabreichung verabreicht.
  • (3) HAUTTRANSPLANTATION
  • Die Hauttransplantation wurde auf dieselbe Weise wie in Testbeispiel 1-(5) durchgeführt.
  • (4) ERGEBNISSE
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten dargestellt. TABELLE 2
    Figure 00130001
  • (5) ERKLÄRUNG DER ERGEBNISSE UND DISKUSSION
  • Die Testgruppe 3 und Kontrollgruppe 2 wurden in dem Abschnitt von Testbeispiel 1 bereits vollständig beschrieben.
  • Testgruppe 4: BALB/c-Maus-abstammende Knochenmarkszellen wurden in die Portalvene von 5 B6-Mäusen verabreicht. Am Tag 2 und Tag 5 wurde CsA verabreicht. Zusätzlich wurden BALB/c-Maus-abstammende Knochenmarkszellen intravenös am Tag 5 verabreicht und die Hauttransplantation wurde am Tag 7 durchgeführt. Im Ergebnis wurde das Hauttransplantat bei einer Maus in Woche 6 nach der Transplantation abgestoßen, jedoch wurde eine erfolgreiche Transplantation bei 4 von 5 Mäusen in Woche 32 nach der Transplantation erhalten.
  • Testgruppe 5: BALB/c-Maus-abstammende Knochenmarkszellen wurden in die Portalvene von 6 B6-Mäusen verabreicht. Am Tag 2 und 5 wurde FK506 verabreicht. Zusätzlich wurden BALB/c-Maus-abstammende Knochenmarkszellen intravenös am Tag 5 verabreicht und eine Hauttransplantation wurde am Tag 7 durchgeführt. Im Ergebnis wurde das Hauttransplantat bei 1 Maus in Woche 6 nach der Transplantation abgestoßen, jedoch wurde eine erfolgreiche Transplantation bei 5 von 6 Mäusen in Woche 30 nach der Transplantation erhalten.
  • Der folgende Schluss kann aus den obigen Feststellungen gezogen werden. Obwohl allgemein anerkannt wird, dass Immunsuppressionsmittel, wie CsA und FK506 zur Verwendung in Kombination mit einem Tolerogen für die Induktion der Immuntoleranz nicht geeignet sind, führt die Verwendung eines Immunsuppressionsmittels in Kombination mit der portalen Verabreichung der ersten pharmazeutischen Zusammensetzung und der intravenösen Verabreichung der zweiten pharmazeutischen Zusammensetzung zu einer verbesserten Transplantationsrate und ist daher effektiv bei der Induktion einer immunologischen Toleranz.
  • TESTBEISPIEL 3 (nur Referenz)
  • (1) HERSTELLUNG VON KNOCHENMARKSZELLEN UND PORTAL UND INTRAVENÖSE INJEKTION DER ZELLEN
  • Die in den Beispielen 1-(2), (3) und (4) beschriebenen Verfahren wurden wiederholt.
  • (2) VERABREICHUNG EINES IMMUNSUPPRESSIONSMITTELS
  • CsA wurde mit 10 mg/kg Körpergewicht intraperitoneal an Tag 2 und 5 nach der Portalinjektion verabreicht.
  • (3) HAUTTRANSPLANTATION
  • Außer dass die Hauttransplantation am selben Tag wie die portale Verabreichung durchgeführt wurde, wurde das Verfahren von Testbeispiel 1-(5) wiederholt (n = 6). Eine Kontrollgruppe, die Hautklappen erhielt, abstammend von C3H-Mäusen wurde ebenfalls bereitgestellt (n = 4).
  • (4) ERGEBNISSE
  • Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt.
  • In 1 stellt die Ordinate die Transplantationsrate (%) von Hautklappen dar und die Abszisse stellt die Zeit (in Wochen) nach der Transplantation dar. Gruppe 1 ist eine Testgruppe und Gruppe 2 ist eine Kontrollgruppe.
  • Die Ergebnisse dieses Testbeispiels zeigen an, dass das Immuntoleranz-induzierende Verfahren, umfassend die Verabreichung der ersten pharmazeutischen Zusammensetzung in die Portalvene und die Organtransplantation gleichzeitig durchgeführt werden können. Daher können auch beim Menschen die Portalverabreichung der ersten pharmazeutischen Zusammensetzung (Knochenmark- und andere Zellen) von dem Donor und die Organtransplantation gleichzeitig durchgeführt werden. Diese Technik wird als epochal betrachtet, da die Graft-vs.-host-Reaktion (GvH-Reaktion) verhindert werden kann, sogar ohne Entfernung von T-Zellen aus der Markszellfraktion und da die Immuntoleranz ausreichend erhalten bleiben kann, wobei nur zwei Dosierungen eines Immunsuppressionsmittels verwendet werden.
  • TESTBEISPIEL 4 (erfinderisch)
  • Die Induktion der Immuntoleranz wurde durch portale oder intravenöse Injektion allogener Donor-Knochenmarkszellen durchgeführt und das Etablieren der immunologischen Toleranz wurde unter Verwendung der Transplantationsrate der Hauttransplantate (allogen für den Donor) bewertet, die gegenüber einer Abstoßung besonders empfindlich sind, als Indikator.
  • (1) HERSTELLUNG EINER KNOCHENMARKSZELLSUSPENSION
  • Von der Donor-Maus wurden Femur und Tibia entfernt und eine 22 G-Nadel (Code Nr. NH-2225R, Temuro Co., Ltd.), verbunden mit einer Spritze (2,5 ml, Code Nr. SS-02S, Temuro Co., Ltd.) wurde in jeden Knochen von der Kniegelenksseite her inseriert. Die Knochenmarkszellen wurden in eine sterilisierte Schale (90 × 15 mm, Iwaki Clinical Test Ware) unter Verwendung einer RPMI1640-Lösung aus der Spritze gespült und in RPMI1640-Lösung suspendiert. Die geernteten Knochenmarkszellen wurden mit RPMI1640-Lösung einmal gewaschen und in derselben Lösung resuspendiert, um die beabsichtigte Knochenmarkszellsuspension (Konzentration: 1 × 108 Zellen/ml) herzustellen.
  • (2) BESTRAHLUNG
  • Die Bestrahlung der Empfängermäuse wurde durch das TBI-Verfahren unter Verwendung eines Gamma-Zell-40-Exactors (Nordion International Inc.) und 137Cs als Strahlenquelle durchgeführt.
  • (3) PORTALE VERABREICHUNG
  • Die Empfängermaus wurde mit einem Rasierer unter einer Pentobarbitalanästhesie rasiert (Pitman-Moor Inc.; 37,5 mg/kg Körpergewicht, i.p.) und nach der Desinfektion wurde ein Mittellinieneinschnitt in das Abdomen durchgeführt und das Mesenterium exponiert. Eine 27 G-Nadel (Terumo Co., Ltd.), verbunden mit einer 1 ml-Tuberculinspritze, wurde durch das adipöse Gewebe des Mesenteriums inseriert und 3 × 107-Knochenmarkszellen von der Donor-Maus (0,3 ml der oben hergestellten Suspension) wurden in die Portalvene verabreicht.
  • (4) INTRAVENÖSE VERABREICHUNG
  • Die oben hergestellte Knochenmarkszellsuspension von der Donor-Maus wurde auf 1 × 108 Zellen/ml eingestellt und das 3 × 107-Äquivalent hiervon (0,3 ml) wurde von der Schwanzvene der Empfängermaus her verabreicht.
  • (5) HAUTTRANSPLANTATION
  • Die Herstellung und Transplantation von Hauttransplantaten wurde wie folgt durchgeführt, unter Bezugnahme auf die in der Literatur beschriebenen Verfahren [Mayumi et al., Jpn. J. Surg., 18, 548-557 (1988)].
  • So wurde die Donor-Maus unter Ethylether (Nacalai Tesque Inc.)-Anästhesie geopfert und das gesamte Fell wurde mit einer depilatorischen Creme entfernt (Feather Hair Remover, Feather Softy Razor Co., Ltd.) Nach Desinfektion mit einer 70%igen Alkohollösung wurde die gesamte Dicke der Hautschicht abgelöst und gewonnen. Unter Verwendung eines Paars von Zangen (mit gebogener Spitze, sich verjüngend, ohne Zähne) und sanitären Baumbauwollbällchen wurde das subkutane Fettgewebe so weit wie möglich entfernt und die Haut wurde in Klappen geschnitten (1,2 × 1,5 cm2). Ein 1 mm- Einschnitt wurde auf der kranialen Seite der Klappe als Marker durchgefügt und die Hautklappe ließ man in einer kalten sterilisierten phosphatgepufferten Salzlösung (Dulbecco's PBS(–), Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) schwimmen.
  • Nachdem die Empfängermaus mit Pentobarbital (37,5 mg/kg Körpergewicht, i.p.) anästhesiert worden war, wurde der rechte dorsale Bereich mit den Fingern von Haaren befreit und weiter mit der depilatorischen Creme (3,0 × 3,5 cm) enthaart. Der nackte Bereich wurde mit einer 70%igen Alkohollösung desinfiziert, um ein Operationsfeld für die Hauttransplantation herzustellen.
  • Auf dem nackten Bereich wurde die Donor-Hautklappe, die oben hergestellte wurde, mit einem caudad angeordneten Marker platziert und mit 8 Stichen vernäht (im Zentrum jeder Seite und an den 4 Ecken), wobei ein Nylonfaden mit einer 6,0-Nadel (Ethilon, Ethicon Inc.) verwendet wurde. Die Oberfläche des Hauttransplantats wurde mit einem Gaze-Pflaster bedeckt, das eine Fradiomycinsulfatsalbe trug (2,0 × 2,5 cm, Sofratulle; Japan Roussel Co., Ltd.) und weiter mit einer adhäsiven elastischen Bandage abgedeckt (Elatex; Alcare Co., Ltd.).
  • (6) INDUKTION DER IMMUNOLOGISCHEN TOLERANZ
  • Unter Verwendung von (BALB/cxBDA2) F1-Mäusen (H-2Kd) (Alter 7~8 Wochen, 19~20 g, Japan SLC) als Donor-Mäuse und B6-Mäusen (H-2Kd) (Alter 10~13 Wochen, 20~23 g, Japan SLC) als Empfänger wurde jedes Empfängertier bestrahlt und nach 1 Tag wurden die Donor-Knochenmarkszellen entweder in die Portalvene oder intravenös verabreicht. Die Hauttransplantation wurde am selben Tag wie die portale oder intravenöse Verabreichung der Knochenmarkszellen durchgeführt und die Überprüfung der Transplantation von Hautklappen wurde, beginnend in Woche 3 nach der Transplantation, durchgeführt.
  • (7) ERGEBNISSE
  • Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt.
  • In 2 stellt die Ordinate die Transplantationsrate (%) und die Abszisse die Zeit (Wochen) nach der Transplantation dar. Die Legende von Gruppe I repräsentiert die Daten, generiert in einer Gruppe (n = 3), die eine Bestrahlungsdosis von 6,5 Gy erhielt in Assoziation mit einer portalen Verabreichung von Knochenmarkszellen [Gruppe I: 6,5 Gy + pv (n:3)]; die Legende von Gruppe 2 repräsentiert eine Gruppe, die eine Bestrahlungsdosis von 7,0 Gy in Assoziation mit einer portalen Verabreichung (n = 9) oder einer intravenösen Verabreichung (n= 5) von Knochenmarkszellen erhielt [Gruppe II: 7 Gy + pv (n = 9) oder iv (n = 5)]; die Legende von Gruppe III repräsentiert eine Gruppe, die eine Bestrahlungsdosis von 6,5 Gy in Assoziation mit intravenö ser Verabreichung von Knochenmarkszellen (n = 7) [Gruppe III: 6,5 Gy + iv (n = 7)] erhielt; und die Legende von Gruppe IV repräsentiert eine Gruppe, die eine Bestrahlungsdosis von 6,0 Gy in Assoziation mit portaler Verabreichung (n = 5) oder intravenöser Verabreichung (n = 3) von Knochenmarkszellen erhielt [Gruppe IV: 6,0 Gy + pv (n = 5) oder iv (n = 3)].
  • (8) ERKLÄRUNG DER ERGEBNISSE
  • Bei B6-Mäusen wurde eine Gesamtkörperbestrahlung mit einer Dosis von 7,0 Gy, 6,5 Gy oder 6,0 Gy durchgeführt und nach ungefähr 24 Stunden wurde die portale (pv) oder intravenöse (iv) Injektion von Knochenmarkszellen, abstammend von einer (BALB/cxDBA/2) F1-Maus (CDF1) durchgeführt. Dann wurde innerhalb desselben Tags eine Hauttransplantation durchgeführt. Wie in 2 dargestellt, zeigten die Empfängermäuse, denen eine Bestrahlungsdosis von 7 Gy verabreicht wurde, sowohl in der portalen als auch intravenösen Verabreichungsgruppe eine Transplantationsrate von 100 % für von dem Donor (CDF1) abstammendes Hauttransplantat in Woche 23 (am 167. Tag) nach der Transplantation (9 von 9 Mäusen in der pv-Gruppe und 5 von 5 Mäusen in der iv-Gruppe). Diese steht deutlich im Kontrast zu den Empfängermäusen, die einer Bestrahlungsdosis von 6,0 Gy ausgesetzt wurden, worin die Hauttransplantation immer innerhalb von 3 Wochen nach der Transplantation abgestoßen wurde (bei 5 von 5 Mäusen in der pv-Gruppe und 3 von 3 Mäusen in der iv-Gruppe). Bei den Empfängermäusen, denen eine Bestrahlungsdosis von 6,5 Gy verabreicht wurde, wurde das Hauttransplantat bei einer von 7 Mäusen bei der intravenösen Verabreichungsgruppe in Woche 3 nach der Transplantation abgestoßen, jedoch wurde eine erfolgreiche Transplantation bei 3 der 3 Empfängermäuse bei der portalen Verabreichungsgruppe in Woche 13 nach der Transplantation erhalten.
  • (9) DISKUSSION
  • Die Transplantationsrate war bei der 6,5 Gy plus portale Verabreichungsgruppe etwas höher. Es scheint, dass da die Donor-hämatopoietischen Stammzellen in der Leber des Empfängers mit höherer Effizienz in dieser Gruppe eingefangen werden, die Abstoßung durch radioresistente immunkompetente Zellen bei den Empfängermäusen besonders effektiv vermieden wird.
  • PHARMAZEUTISCHES BEISPIEL 1
  • Knochenmarkszellen oder Milzzellen werden in physiologischer Salzlösung suspendiert, um eine 1 × 108/ml Zusammensetzung für die Verabreichung in die Portalvene herzustellen. Andererseits wird auf ähnliche Weise eine Zusammensetzung, enthaltend 1 × 108 Knochenmarkszellen/ml Salzlösung für die intravenöse Verabreichung hergestellt.
  • Bei Menschen wird die obige Zusammensetzung für die portale Verabreichung vorzugsweise in einer Dosis von allgemein 3 × 108 Knochenmarkszellen oder mehr (T-Zellen können vorliegen) pro kg Körpergewicht verabreicht.
  • PHARMAZEUTISCHES BEISPIEL 2
  • Knochenmarkszellen werden in physiologischer Salzlösung suspendiert, um eine 1 × 108/ml Suspension bereitzustellen. Für eine Verabreichung in die Portalvene eines Patienten wird die Suspension vorzugsweise in einer Dosis von allgemein 3 × 108 Knochenmarkszellen oder mehr (ein kleiner Anteil, d.h., ungefähr 2 % T-Zellen können vorliegen) pro kg Körpergewicht verabreicht. So wird eine Injektion bereitgestellt, die mindestens die obige Einheitsdosis enthält. Diese injizierbare Zusammensetzung ist von Wert als Immuntoleranzinduktor, um in Assoziation mit einer Strahlung verwendet zu werden.
  • GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT
  • Bei dem Immuntoleranzinduktor dieser Erfindung kann eine immunologische Toleranz bei einem Patienten induziert werden, der eine Organtransplantation durchmacht und ein positiver Erhalt des transplantierten Organs kann daher sichergestellt werden.

Claims (2)

  1. Verwendung einer effektiven Menge von einem Tolerogen, enthaltend hämatopoietische Stammzellen, hämatopoietische Vorläuferzellen, reife Lymphozyten oder einer Mischung daraus, wobei diese nicht von einem menschlichen Embryo abstammen, in Kombination mit einem pharmazeutischen Träger für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Pfortaderverabreichung zur Induktion einer immunologischen Toleranz bei einem Patienten, der eine Organtransplantation durchmacht, in Assoziation mit einer Gesamtkörperbestrahlung unter Verwendung einer sublethalen Bestrahlungsdosis von mindestens 6,5 Gy.
  2. Verwendung gemäss Anspruch 1, wobei das Tolerogen Knochenmarkszellen enthält.
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