ES2270507T3

ES2270507T3 - Inductores de inmunotolerancia.

Info

Publication number: ES2270507T3
Application number: ES98905773T
Authority: ES
Inventors: Tienan Jin; Kikuya Sugiura; Haruo Morita; Susumu Ikehara; Shinji Sogo; Kazuya Yamanishi; Masakazu Adachi
Original assignee: JIMRO Co Ltd
Current assignee: JIMRO Co Ltd
Priority date: 1997-03-07
Filing date: 1998-03-04
Publication date: 2007-04-01
Anticipated expiration: 2018-03-04
Also published as: WO1998039016A1; ATE336257T1; EP0972519A1; EP0972519A4; DE69835591T2; EP0972519B1; PT972519E; DE69835591D1; US20030091541A1; DK0972519T3

Abstract

Esta invención se refiere a un nuevo inductor de tolerancia inmunitaria que es efectivo en la inducción de tolerancia inmunológica sin implicar ningún procedimiento invasivo importante, garantizando así el mantenimiento de un medicamento inmunosupresor. Este inductor de tolerancia inmunitaria o un inductor de sistema doble que comprende una primera composición farmacéutica para la administración portal que comprende una cantidad efectiva de un tolerógeno que contienen células madre hematopoiéticas , células progenitores hematopoiéticas, linfocitos maduros o una de sus mezclas como componente activo y una segunda composición farmacéutica para administración intravenosa que comprende una cantidad efectiva del tolerógeno antes citado como componente activo o un inductor de tolerancia inmunitaria de sistema único que comprende una cantidad efectiva de un tolerógeno que contiene células madre hematopoiéticas, células progenitores hematopoiéticas o una mezclas de estos como componente activo siendo administrado dicho inductor de tolerancia inmunitaria de sistema único en asociación con radiación.

Description

Inductores de inmunotolerancia.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la utilización de un tolerógeno con el fin de inducir inmunotolerancia.

Antecedentes de la invención

El inmunosupresor es un accesorio indispensable en el transplante de órganos y se desarrollan nuevos supresores uno tras otro. De acuerdo con la aplicación que se pretende (utilización), los inmunosupresores se pueden clasificar en dos categorías. Los fármacos de una de las categorías son los que se toman a diario mientras el injerto permanece en el cuerpo del recipiente con el fin de suprimir profilácticamente el rechazo del injerto y son en general denominados, inmunosupresores de mantenimiento, inmunosupresores profilácticos e inmunosupresores basales. Los fármacos de la otra categoría son los que se utilizan en dosis masivas, aunque durante períodos de tiempo limitados, con el objeto de producir una inmunosupresión intensiva necesaria para curar la respuesta de rechazo que puede tener lugar a pesar de la inmunosupresión continua, principalmente el rechazo celular y son conocidos como fármacos terapéuticos para el rechazo de los injertos.

Sin embargo, en términos de la acción farmacológica principal así como de los efectos secundarios, dichos inmunosupresores están lejos de poder ser considerados como inofensivos para el cuerpo humano y debido a que se necesitan dosis de mantenimiento a largo plazo y/o dosis elevadas, no se pueden pasar por alto los inevitables efectos adversos y/o reacciones tóxicas al fármaco. Además, dichos inmunosupresores, cuando se utilizan independientemente, no son lo suficientemente potentes como para producir la suficiente inmunosupresión, ni son capaces de curar el rechazo de los injertos con elevada proporción de curación una vez iniciado.

Entretanto, se producen publicaciones clínicas, aunque esporádicas, sobre el éxito en el mantenimiento de injertos incluso sin la administración de un inmunosupresor, y dichos resultados favorables se han atribuido a la inducción de una tolerancia inmunológica. Si dicha inmunotolerancia pudiese de hecho ser establecida, no sería necesaria la administración de un inmunosupresor. Por consiguiente, la inducción artificial de inmunotolerancia se considera como el objetivo principal para el transplante de órganos, hoy en día, y se han reportado los resultados de muchos estudios.

En la metodología para la inducción artificial de tolerancia inmunológica se puede hacer referencia, entre otras, a las siguientes publicaciones.

Induction of tolerance by transference of splenocyte or myelocyte tolerogen in combination with administration of an antimitotic drug, Fukuoka Acta Med., 81(1):20-40 (1990); Microbiol. Immunol., 32(3):283-292 (1988), etc.

Como fármacos antimitóticos se mencionan, 6-mercaptopurina, metotrexato, ciclofosfamida (CP), 5-fluorouracilo, azatioprina (AZP) y procarbazina y se advierte que la ciclosporina A, CsA) y los esteroides, que son distantes a los agentes antimitóticos en su modo de acción, no son adecuados con el fin de inducir tolerancia inmunológica.

Hayakawa et al., reportan su intento de inducir un estado de inmunocomprometido específico del donante con FK506 [Keio Medicine, 72(3):163-176 (1995)]. De modo semejante Muramatsu et al., reportaron la posibilidad de inducir tolerancia inmunológica con 15-DSG [resumen de los documentos leídos antes del 20th Congress of the Japan Society of Microsurgery, 89-90 (1994)].

Los presentes autores dieron a conocer con anterioridad que, en ratones, la administración de células de la médula ósea (en particular células madre hematopoyéticas) en la vena porta o mediante las vías intravenosas usuales produce la retención de las células derivadas del donante en el hígado del recipiente, estableciendo quimerismo y la inducción de inmunotolerancia [Eur. J. Immunol., 24:1558 (1994)].

En Eid et al., se describe la inducción de tolerancia a los transplantes mediante la inyección intraportal de células alogénicas de la médula ósea, así como también las posibles implicaciones para el transplante intrauterino de médula ósea a través de las barreras de histocompatibilidad principales [Transplant Internacional, 1(2):109-112, (julio 1988)]. Se irradió con 400 rad WBI lo que corresponde a 4 Gy.

El objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una metodología mediante la cual se puede establecer con éxito la tolerancia inmunológica necesaria para el transplante de órganos. Expresado de otro modo el objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un nuevo procedimiento con el fin de asegurar un mantenimiento positivo de los injertos sin la utilización de inmunosupresores para su mantenimiento (mediante la administración a largo plazo de un inmunosupresor) y, por consiguiente, sin el riesgo de efectos secundarios serios.

A continuación de un estudio intenso se descubrió que la utilización descrita a continuación en la presente memoria cumple con los objetivos anteriores y se han perfeccionado la presente invención instantánea.

Exposición de la presente invención

La presente invención proporciona la inducción de tolerancia inmunológica en un paciente que recibe el transplante de un órgano, la utilización de una cantidad efectiva de un tolerógeno que contiene células madre hematopoyéticas, células progenitoras hematopoyéticas, linfocitos maduros o una mezcla de los mismos, diferentes de las derivados de un embrión humano, en combinación con un vehículo farmacéutico para la preparación de una composición farmacéutica destinada a la administración portal con el fin de inducir tolerancia inmunológica en un paciente que sufre el transplante de un órgano, en asociación con irradiación de todo el cuerpo utilizando dosis subletales de irradiación de por lo menos 6,5 Gy.

Por consiguiente, la presente invención proporciona la utilización de un inductor de inmunotolerancia destinado a su aplicación en un paciente que sufre un transplante de órgano en asociación con irradiación para inducir tolerancia inmunológica en dicho paciente que comprende un cantidad efectiva de un tolerógeno que comprende células madre hematopoyéticas, células progenitoras hematopoyéticas o una mezcla de las mismas en combinación con un vehículo farmacéutico, más particularmente dicho inductor de la inmunotolerancia comprende una fracción celular de la médula ósea como dicho tolerógeno.

Mediante la utilización del inductor de inmunotolerancia de la presente invención, la inmunotolerancia que satisface los objetivos mencionados anteriormente se puede establecer con éxito de modo que el órgano transplantado se puede mantener en condiciones satisfactorias.

Siempre y cuando se mantenga dicha condición, el dispositivo farmacéutico y la forma de dosis de cada composición no quedan particularmente restringidos.

Por ejemplo, dicha composición farmacéutica se puede proporcionar en una única forma de dosis u opcionalmente en formas de dosis independientes. Por consiguiente, tal como se representa típicamente mediante los ejemplos de utilización que se proporcionan a continuación para el inductor de inmunotolerancia de la presente invención, no existe ninguna limitación en particular sobre el tipo de dispositivo farmacéutico y forma de dosis con la única provisión de que se logre el objetivo de lograr la tolerancia inmunológica necesaria.

El tolerógeno que contiene células madre hematopoyéticas, células progenitoras hematopoyéticas, linfocitos maduros o una mezcla de éstas, que constituyen el ingrediente activo en dicha composición farmacéutica en común pueden ser, por ejemplo, un tolerógeno derivado del donante del injerto (un animal de la misma raza que el donante). El ingrediente activo mencionado anteriormente puede ser una fracción celular de la médula ósea, una fracción celular del bazo, una fracción celular de la sangre periférica o una fracción que comprende una mezcla de éstas, que contiene dichas células.

La separación y el aislamiento de dicho tolerógeno se puede realizar mediante procedimientos conocidos en la materia. Por ejemplo, se puede utilizar el procedimiento descrito por Yamamoto et al., [Blood, 88:445-454 (1996) y los procedimientos descritos en Protocols in Experiemental Cellular Immunity [ed. por Mishell B.B., Shiigi S.M.; traducido por Katsuyuky Imai, Susumu Kawaguchi y Takayuki Harada, Rikogaku-Sha, pp.3-12, 1982].

El tolerógeno preferido del donante del injerto (un ser humano) incluye células de la médula ósea y de la sangre periférica. El procedimiento para la cosecha de dichas células es bien conocido en la materia. Por ejemplo, el procedimiento para manipular células de la médula ósea puede ser el mismo que el utilizado en el transplante de médula ósea.

El tolerógeno que se debe utilizar en la composición farmacéutica es preferentemente una fracción celular de la médula ósea rica en células progenitoras hematopoyéticas, una fracción celular del bazo o de la sangre periférica que contiene linfocitos maduros (excluyendo los linfocitos activados) o una mezcla de las mismas. Por otra parte, el tolerógeno para la composición farmacéutica es preferentemente dicha fracción celular de la médula ósea. Como componente activo de dichas composiciones farmacéuticas, es preferible una fracción celular de la médula ósea tal como se mencionó anteriormente pero la fracción celular de la sangre periférica que contiene las células madre hematopoyéticas movilizadas de la médula ósea mediante citoquinas tales como G-CSF también es preferida, en parte porque contiene tanto linfocitos maduros como células progenitoras hematopoyéticas y en parte porque dicha fracción celular es fácilmente asequible.

Con el fin de proporcionar dichas composiciones farmacéuticas, el componente activo se puede formular en una forma de dosis convencional conocida para productos farmacéuticos que contienen fracciones celulares de tal tipo. La forma de dosis se puede seleccionar juiciosamente de entre una multiplicidad de formas de dosis para el presente propósito. Se puede mencionar como ejemplo una forma de dosis inyectable. Los vehículos farmacéuticos que se pueden utilizar en la preparación de tales formas de dosis incluyen una amplia gama de substancias farmacéuticamente aceptables. El procedimiento de preparación también puede seguir los procedimientos farmacéuticos establecidos. En la preparación de tales formas de dosis, se pueden utilizar las múltiples infusiones que se utilizan ampliamente en la actualidad.

En la práctica de la presente invención, dichas formas de dosis se pueden preparar extemporáneamente, si se desea, en el caso de un transplante de órgano, utilizando el material obtenido del donante del injerto. La dosis y el programa de administración de cada composición farmacéutica no se encuentran particularmente restringidos pero se pueden seleccionar juiciosamente por los expertos en la materia solamente con la condición de que se pueda establecer con éxito la necesaria tolerancia inmunológica.

La dosis recomendada de la composición es la mínima dosis (3 x 10^{7} células en ratones) necesaria para asegurar que dicha reactividad contra el aloantígeno del donante en la reacción de linfocitos mezclados, después de la administración, es mínima (máxima inhibición de la reacción) y se aplana.

El ensayo de linfocitos mezclados para las células de bazo, mencionado anteriormente, se puede realizar de modo rutinario [Protocols in Experimental Cellular Immunity, 147-149, 1982]. La dosis total para la administración en seres humanos puede ser la dosis utilizada en los transplantes de médula convencionales. Por ejemplo, la dosis en términos de células de médula ósea puede ser de aproximadamente 3 x 10^{8} células/kg o más.

La presente invención, por consiguiente, proporciona un procedimiento destinado a inducir tolerancia inmunológica utilizando los procesos específicos descritos anteriormente.

El resultado mencionado anteriormente logrado mediante el procedimiento de la presente invención no está relacionado con el programa temporal del transplante de un material de injerto. Por consiguiente, el procedimiento de transplante se puede realizar con éxito, ya sea en paralelo con el procedimiento de la presente invención o después del establecimiento de la tolerancia inmunológica por el proceso de la presente invención.

Cuando se induce tolerancia inmunológica según la presente invención, se pueden practicar otros tratamientos médicos y administraciones de fármacos, que se practican concomitantemente en los procedimientos de este tipo y se pueden practicar en combinación con los procesos de la presente invención a menos que con ello se comprometa el efecto de la invención.

Como ejemplo, se puede mencionar la administración de dichos inmunosupresores. El procedimiento, la dosis y el tiempo de la administración de los inmunosupresores pueden ser seleccionados con criterio por los expertos en la materia.

El inmunosupresor preferido incluye particularmente ciclosporina A y FK506, mencionando solamente algunos fármacos representativos y la dosis y el procedimiento de administración pueden ser los recomendados para el producto comercial conocido. El modo de administración particularmente preferido es administrar el inmunosupresor poco después de la administración de la composición farmacéutica, una o dos veces, por ejemplo, aproximadamente al segundo día o aproximadamente a los días 2º y 5º siguientes a la administración portal.

Además, la presente invención proporciona una tecnología inductora de la inmunotolerancia capaz de introducir quimerismo con un mínimo de invasión y con un elevado grado de certeza en asegurar un mantenimiento del estado de tolerancia a largo plazo.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un inductor de inmunotolerancia de aplicación, en asociación con irradiación, a un paciente que sufre un transplante de órgano, que comprende una cantidad efectiva de un tolerógeno que contiene células madre hematopoyéticas, células progenitoras hematopoyéticas o una mezcla de las mismas y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La inmunotolerancia que logra los objetivos mencionados hasta ahora se puede establecer siempre que se siga el proceso en combinación con irradiación, con el resultado de que el órgano transplantado se puede mantener en condiciones satisfactorias.

El tolerógeno que contiene células madre progenitoras, células progenitoras hematopoyéticas o una mezcla de las mismas que constituye el componente del medicamento de la presente invención que se debe administrar al paciente en asociación con irradiación, pueden ser, por ejemplo, una fracción celular de la médula ósea, una fracción de la sangre periférica o una mezcla de las mismas, que contiene células madre hematopoyéticas y células progenitoras hematopoyéticas.

El tolerógeno derivado del donante del injerto (un ser humano) incluye una fracción celular de la médula ósea, una fracción celular de la sangre umbilical y una fracción celular de la sangre periférica que contiene células madre hematopoyéticas movilizadas mediante una citoquina tal como G-CSF.

El procedimiento para separar y aislar dicho tolerógeno con el fin de utilizarlo en la inmunotolerancia de la presente invención que se debe aplicar en asociación con dicha irradiación, el procedimiento para la preparación del inductor, la forma de dosis, el vehículo farmacéutico que se debe utilizar en la preparación de la forma de dosis, la vía de administración y la dosis son los mismos mencionados anteriormente para la composición farmacéutica
anterior.

Es esencial, sin embargo, que el inductor de inmunotolerancia anterior de la presente invención se utilice en asociación con irradiación, es decir que se administre en la vena porta del paciente al que se proporciona dicha irradiación.

La dosis de referencia para la administración intravenosa es aproximadamente la dosis necesaria para reconstruir el sistema inmune del huésped (3 x 10^{7} células en ratones) en el transplante de médula ósea incompatible con el complejo de histocompatibilidad principal (MHC) ordinario (después de irradiar ratones con una dosis letal).

Tomando la dosis anterior para ratones como referencia, la dosis del medicamento de la presente invención se puede seleccionar con criterio según las convenciones para el transplante de médula ósea. Como ejemplo específico, se puede mencionar una dosis de 3 x 10^{8} células/kg o más, en términos de células de la médula ósea.

La irradiación mencionada anteriormente se puede realizar de modo convencional. Más particularmente, el paciente (recipiente) que sufre el transplante de órgano se expone a una dosis de radiación adecuada, de por lo menos 6,5 Gy pero, sin embargo, una dosis subletal, preferentemente de aproximadamente 7,0 Gy por exposición, sobre la base de la irradiación de cuerpo entero (TBI). Dicha dosis de radiación se caracteriza asimismo como una dosis de radiación que tiene en cuenta la recuperación de las células de la médula ósea del paciente.

La irradiación anterior se puede realizar antes de la administración del medicamento de la presente invención y es generalmente preferido administrar el medicamento durante las 24 horas después de la irradiación.

La presente invención es ventajosa en que la eficacia esperada se puede lograr mediante una sola dosis del medicamento, lo que es menos invasivo para el recipiente.

Mediante la administración del medicamento de la presente invención junto con irradiación, se puede inducir la tolerancia inmunológica deseada para el mantenimiento satisfactorio del órgano transplantado.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un procedimiento para inducir inmunotolerancia que implica irradiación.

El fenómeno por el cual se induce la inmunotolerancia deseada mediante este procedimiento que implica irradiación para el mantenimiento del injerto con éxito no está relacionado con el momento de la operación para el transplante de órgano.

En la práctica del procedimiento de tratamiento combinado anterior, los múltiples tratamientos médicos y fármacos que se administran generalmente en procedimientos de esta naturaleza, por ejemplo, la administración de ciclosporina A, FK506, etc. se pueden realizar de manera correspondiente a menos que disminuyan o supriman el efecto de la invención.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una representación esquemática de la proporción de injerto en los transplantes de piel del Ejemplo de Ensayo 3, y

la Figura 2 es una representación esquemática de la proporción de injertos en los transplantes de piel del Ejemplo de Ensayo 4.

Mejor modo de poner en práctica la invención

A continuación se describen los ensayos realizados con el componente activo de la presente invención con el fin de ilustrar con mayor detalle la presente invención.

Ejemplo de ensayo 1

(Únicamente referencia)

La inducción de tolerancia inmunológica en los Ejemplos de Ensayo se realizó mediante (1) la inyección de células alogénicas de bazo o de la médula ósea de un donante en la vena porta y (2) la inyección intravenosa de células alogénicas de médula ósea del donante y midiendo el establecimiento de tolerancia inmunológica utilizando como indicador la proporción de injertos en los trasplantes de piel (alogénicos para el donante) que es el órgano más susceptible de rechazo.

(1) Preparación de una suspensión de células de bazo

Se cosecharon las células de bazo de un ratón hembra de 8 semanas BALB/cCRSlc (de entre 19 y 22 g, BALB/c; Japan SLC Inc.) y se disgregaron con un par de pinzas sin dientes en un cedazo de acero inoxidable de 200 G en disolución RPMI1640 (Nikken Bio Med. Lab.) con el fin de preparar células de bazo discretas. Las células se lavaron 1 vez con disolución RPMI1640 y se sometieron a hemólisis con tampón Tris-HCl-cloruro amónico (0,75% NH_{4}Cl, 0,017 M Tris-HCl, pH 7,5). Después de dos lavados más con RPMI1640, las células de bazo se resuspendieron en la misma disolución para producir una suspensión de células de bazo (concentración: 1,0 x 10^{8}/ml).

(2) Preparación de una suspensión de células de médula ósea

Los fémures y tibias se aislaron de ratones hembra BALB/c de 8 semanas de edad y se insertó una aguja 22-G (nº de código NN-2225R, Terumo Co., Ltd.) conectada a una jeringa (2,5 ml, nº de código SS-02S, Terumo Co., Ltd.) en cada hueso desde la articulación de la rodilla y se empujaron a presión en una placa estéril (90 x 16 mm, Iwaki Clinical Test Ware) utilizando disolución de RPMI1640 y se suspendieron en RPMI1640. Las células de médula ósea cosechadas de tal modo se lavaron con disolución RPMI1640 una vez y se suspendieron en la misma disolución para producir la suspensión de células de médula ósea objetivo (concentración: 1,0 x 10^{8}/ml).

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(3) Inyección en la vena porta

Bajo anestesia con pentobarbital (Pitman-Moor Inc.; 37,5 mg/kg peso corporal, i.p.), se afeitaron utilizando una cuchilla y se desinfectaron ratones hembra C57BL/6CrSlc de 10 semanas de edad (B6; peso corporal entre 20 y 24 g, Japan SLC Inc.). A continuación, se realizó una incisión en la línea media de la región abdominal y se expuso el mesenterio. Se insertó una aguja de 27 G (Terumo Co., Ltd.) conectada a una jeringa de tuberculina de 1 ml a través del tejido adiposo del mesenterio y se administraron por la vena porta 3 x 10^{7} células de bazo o de médula ósea de ratón BALB/c (suspensión de 0,3 ml) preparadas en (1) anterior.

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(4) Inyección intravenosa

La suspensión de células de médula ósea preparada en (1) se ajustó a una concentración de 1 x 10^{8} células/ml y la suspensión equivalente a 3 x 10^{7} células (0,3 ml) se administró por la vena de la cola del ratón huésped en el día 5 después de la inyección portal descrita en (3) anteriormente.

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(5) Injertos de piel

Los injertos de piel se realizaron el día 7 después de la inyección portal. La preparación de los materiales para los injertos de piel y el transplante de los mismos se realizó como se expone a continuación, según referencia al procedimiento descrito en la literatura [Mayumi et al., Jpn. J. Surg., 18:548-557 (1988)].

Se sacrificaron como donantes ratones BALB/c de 8 semanas de edad bajo anestesia con éter etílico (Nacalai Tesque Inc.). Utilizando crema depilatoria (Feather Hair Remover, Feather Softy Razor Co., Ltd.), se eliminó toda la cubierta de pelo y una vez desinfectado con alcohol al 70%, se peló y recogió todo el grosor de la capa de piel. Una vez extraída la mayor parte posible del tejido adiposo subcutáneo utilizando un par de pinzas (de punta doblada, sin dientes, con punta) y bolas de algodón sanitario, se cortó la piel en hojas (1,2 x 1,5 cm^{2}). Se practicó una incisión de 1 mm de longitud en el lado craneal de la hoja como marca y se suspendió en disolución salina fría, estéril, tamponada con fosfato (PBS(-) de Dulbecco, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd).

Después de anestesiar un ratón B6 huésped con pentobarbital (37,5 mg/kg peso corporal, i.p.); se arrancaron los pelos de la región dorsal derecha con los dedos y a continuación se depiló con la crema depilatoria mencionada (3,0 x 3,5 cm) y se desinfectó con alcohol del 70% para preparar el campo operatorio para el injerto de
piel.

En la zona desnuda, se dispuso la hoja de BALB/c preparada con la marca en posición caudal y se suturó mediante 8 puntos (en la zona central de cada lado y en las 4 esquinas) utilizando sutura de nilón y una aguja 6-0 (Ethilon; Ethicon Inc.). La superficie del injerto de piel se recubrió con un parche de gasa con un ungüento de sulfato de fradiomicina (2,0 x 2,5 cm, Sofratulle; Japan Roussel Co., Ltd.) y se ocluyó todavía más con una venda elástica adhesiva (Elatex; Alcare Co., Ltd.).

La comprobación de injerto se inició en la semana 2 después del transplante.

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(6) Resultados

Los resultados se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1

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1

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(7) Explicación de los resultados y discusión

Grupo de Ensayo 1: Se administraron células de bazo derivadas de ratón BALB/c en la vena porta de 10 ratones B6 MHC-incompatibles. El día 5 después de la administración, se inyectaron intravenosamente células de médula ósea de ratón BALB/c y el día 7, se realizaron los trasplantes de piel. Como resultado, el injerto del material de piel transferido se confirmó en 10 de 10 ratones en la semana 36 después del transplante.

Grupo de ensayo 2: Se administraron células de bazo derivadas de ratones BALB/c en la vena porta de 5 ratones B6 y el día 5 después de la administración, se inyectaron intravenosamente células de bazo derivadas de ratones BALB/c. Los trasplantes de piel se realizaron el día 7. Como resultado, se confirmó el injerto en 1 de 5 ratones en la semana 18 después del transplante pero el trasplante fue rechazado (se soltó) en un ratón en la semana 6 y en 3 ratones en la semana 7.

Grupo de Ensayo 3: Se administraron células de médula ósea derivadas de ratones BALB/c por la vena porta de 6 ratones B6 y el día 5, se administraron intravenosamente células de médula ósea de ratón BALB/c. El día 7 se realizaron los trasplantes de piel. Como resultado, se encontró injerto de la piel transferida en 4 de 6 ratones en la semana 36 después del transplante.

Grupo Control 1: Se administraron células de bazo derivadas de ratón BALB/c por la vena porta de 4 ratones B6 y se realizaron los trasplantes de piel el día 7. Como resultado, los injertos se rechazaron (se soltaron) en dos ratones a la semana 2 después del transplante y en los 2 ratones restantes en la semana 3.

Grupo Control 2: Se administraron células de médula ósea derivadas de ratón BALB/c por la vena porta de 4 ratones B6 y se realizaron los transplantes de piel el día 7. Como resultado, los trasplantes de piel se rechazaron en 2 ratones en la semana 2 después del transplante y en los 2 ratones restantes en la semana 3.

Resulta evidente a partir de los resultados anteriores que la administración portal de la primera composición farmacéutica y la siguiente administración intravenosa de la segunda composición farmacéutica aseguran el éxito del injerto del trasplante de piel (mantenimiento de la inmunotolerancia aloantígeno específica al donante).

Además, cuando se administró un inmunosupresor entre la administración portal (día 0) y la administración intravenosa (día 5) de células de médula ósea en los 3 grupos de ensayo anteriores, se obtuvo una mejora en la proporción de injertos de los trasplantes de piel transferidos. Los siguientes ejemplos de ensayo pondrán más claramente de manifiesto los descubrimientos anteriores.

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Ejemplo de ensayo 2

(Únicamente referencia)

(1) Preparación de células de médula ósea y administración en la vena porta y por vía intravenosa

Las células de medula ósea se prepararon y administraron del mismo modo que en el anterior Ejemplo de Ensayo 1-(2), (3) y (4).

(2) Administración de un inmunosupresor

Como inmunosupresor, se administró intraperitonealmente ciclosporina A (CsA; Sandimmum, 250 mg/5 ml disolución, Novartis Pharma K.K.) 10 mg/kg peso corporal o FK506 (10 mg/ml disolución, Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.) 1 mg/kg peso corporal en los días 2 y 5 después de la administración portal.

(3) Injertos de piel

Los trasplantes de piel se realizaron del mismo modo que en el Ejemplo de Ensayo 1-(5).

(4) Resultados

Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 2.

TABLA 2

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2

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(5) Explicación de los resultados y discusión

El Grupo de Ensayo 3 y el Grupo Control 2 se han descrito completamente en la sección de Ejemplo de Ensayo 1.

Grupo de Ensayo 4: Se administraron células de médula ósea derivadas de ratón BALB/c en la vena porta de 5 ratones B6. En los días 2 y 5, se administró CsA. Además, se administraron células de médula ósea derivadas de ratón BALB/c intravenosamente el día 5 y se realizaron los trasplantes el día 7. Como resultado, se rechazó el injerto en 1 ratón en la semana 6 después del transplante pero se produjo injerto en 4 de 5 ratones a la semana 32 después del transplante.

Grupo de Ensayo 5: Se administraron células de médula ósea derivadas de ratón BALB/c en la vena porta de 6 ratones B6. El día 2 y el día 5, se administró FK506. Además, se administraron células de médula ósea derivadas de ratón BALB/c intravenosamente el día 5 y se realizaron los transplantes de piel el día 7. Como resultado, el injerto de piel se rechazó en 1 ratón en la semana 6 después del transplante pero se obtuvo injerto en 5 de 6 ratones en la semana 30 después del transplante.

Se puede extraer la conclusión siguiente a partir de los resultados anteriores. Aunque generalmente se reconocía que los inmunosupresores tales como el CsA y el FK506 no son adecuados para la utilización en combinación con un tolerógeno para la inducción de inmunotolerancia, la utilización de un inmunosupresor en combinación con la administración portal de la primera composición farmacéutica y la administración intravenosa de la segunda composición farmacéutica resulta en una proporción de injertos mejorada y es, por consiguiente, efectivo en la inducción de tolerancia inmunológica.

Ejemplo de ensayo 3

(Únicamente referencia)

(1) Preparación de células de médula ósea e inyección portal e intravenosa de las células

Se repitieron los procedimientos descritos en los Ejemplos 1-(2), (3) y (4).

(2) Administración de un inmunosupresor

Se administró intraperitonealmente CsA, 10 mg/kg de peso corporal en los días 2 y 5 después de la inyección portal.

(3) Transplantes de piel

Excepto que se realizaron los transplantes de piel el mismo día que la administración portal, se repitió el proceso del Ejemplo de Ensayo 1-(5) (n = 6). Se proporcionó asimismo un grupo control que recibió hojas de piel derivadas de ratones C3H (n = 4).

(4) Resultados

Los resultados se muestran en la Figura 1.

En la Figura 1, la ordenada representa la proporción (%) de injertos de las hojas de piel y la abscisa representa el tiempo (en semanas) después del transplante. El Grupo 1 es un grupo de ensayo y el Grupo 2 es un grupo control.

Los resultados de este Ejemplo de Ensayo indican que el procedimiento de inducción de inmunotolerancia que comprende la administración de la primera composición farmacéutica en la vena porta y el transplante de órgano se pueden realizar simultáneamente. Por consiguiente, en los seres humanos, también, la administración portal de la primera composición farmacéutica (células de medula ósea y otras) del donante y el transplante de órgano se pueden realizar simultáneamente. Este procedimiento se considera que es importante, ya que se puede evitar la reacción del injerto contra el huésped (reacción GvH) incluso sin la eliminación de las células T de la fracción celular de la médula ósea y la inmunotolerancia se puede mantener suficientemente utilizando únicamente dos dosis de un inmunosupresor.

Ejemplo de ensayo 4

(Innovador)

Se realizó la inducción de inmunotolerancia mediante la inyección portal o intravenosa de células de médula ósea de un donante alogénico y se evaluó el establecimiento de tolerancia inmunológica utilizando la proporción de injerto de los transplantes de piel (alogénicos al donante) que son los más susceptibles de rechazo, como indicador.

(1) Preparación de la suspensión de células de médula ósea

Se extrajeron los fémures y las tibias de los ratones donantes y se insertó en cada hueso, desde la articulación de la rodilla, una aguja de 22 G (nº de código: NN-2225R, Terumo Co., Ltd.) conectada a una jeringa (2,5 ml, nº código: SS-02S, Terumo Co. Ltd.). Se empujaron las células de la médula ósea en una placa estéril (90 x 15 cm, Iwaki Clinical Test Ware) utilizando disolución RPMI1640 de la jeringa y se suspendieron en la disolución RMPI1640. Las células de médula ósea cosechadas se lavaron en una disolución RPMI1640 una vez y se resuspendieron en la misma disolución para proporcionar la suspensión objetivo de células de médula ósea (concentración: 1 x 10^{8} células/ml).

(2) Irradiación

La irradiación de los ratones recipientes se realizó mediante el procedimiento TBI utilizando un Gamma Cell 40 Exacter (Nordion Internacional Inc.) y ^{137}Cs como la fuente del haz.

(3) Administración portal

Se afeitó el pelo del ratón recipiente con una hoja bajo anestesia con pentobarbital (Pitman-Moor Inc.; 37,5 mg/kg peso corporal, i.p.) y una vez desinfectado, se realizó una incisión en la línea media del abdomen y se expuso el mesenterio. Se insertó una aguja de 27 G (Terumo Co., Ltd.) conectada a una jeringa de tuberculina de 1 ml, a través del tejido adiposo del mesenterio y se administraron en la vena porta 3 x 10^{7} células de médula ósea (0,3 ml de la suspensión preparada anteriormente) del ratón donante.

(4) Administración intravenosa

La suspensión de células de médula ósea preparada anteriormente del ratón donante se ajustó a 1 x 10^{8} células/ml y el equivalente a 3 x 10^{7} de la misma (0,3 ml) se administró a través de la vena de la cola del ratón recipiente.

(5) Transplantes de piel

La preparación y el transplante de los injertos de piel se realizó como se expone a continuación, según los procedimientos descritos en la literatura [Mayumi et al., Jpn. J. Surg., 18:548-557 (1988)].

El ratón donante se sacrificó bajo anestesia con éter etílico (Nacalai Tesque Inc.) y se eliminó toda la cubierta de pelo con una crema depilatoria (Feather Hair Remover, Feather Safety Razor Co. Ltd.). Después de la desinfección con disolución de 70% alcohol, se peló todo el grosor de la piel y se recuperó. Utilizando un par de pinzas (de punta doblada, afiladas, sin dientes) y bolas de algodón sanitario, se extrajo lo más posible del tejido graso subcutáneo y se cortó la piel en hojas (rectangulares de 1,2 x 1,5 cm). Se realizó una incisión de 1 mm en el lado craneal de la hoja como marca y se dejó la hoja de piel flotando en disolución salina estéril, fría, tamponada con fosfato (PBS(-) de Dulbeco, Nissui Pharmaceutical Co. Ltd.).

Una vez anestesiado el ratón recipiente con pentobarbital (37,5 mg/kg de peso corporal, i.p.) se arrancaron los pelos de la zona dorsal (3,0 x 3,5 cm) con los dedos y se continuó la depilación con dicha crema depilatoria. La zona desnuda se desinfectó con disolución alcohólica del 70% para preparar el campo de operación para el transplante de piel.

En la zona desnuda, la hoja de piel del donante preparada anteriormente se dispuso con la marca en posición caudal y se suturó con 8 puntadas (en el centro de cada lado y en las 4 esquinas) utilizando una sutura de nilón y una aguja 6-0 (Ethilon; Ethicon Inc.). La superficie del transplante se cubrió con un parche de gasa provisto de ungüento de fradiomicina (2,0 x 2,5 cm, Sofratulle, Japan Roussel Co., Ltd.) y se ocluyó todavía más con un vendaje adhesivo elástico (Elatex; Alcare Co., Ltd.).

(6) Inducción de tolerancia inmunológica

Utilizando como donantes ratones F1 (BALB/c x DBA2) (H-2k^{d}) (edad entre 7 y 8 semanas, entre 19 y 20 g, Japan SLC) y como recipientes ratones B6 (H-2K^{b}) (edad entre 10 y 13 semanas, entre 20 y 23 g, Japan SLC), cada animal recipiente se irradió y después de 1 día, se le administraron, en la vena porta o en intravenosamente, las células de la médula ósea del donante. Los transplantes de piel se realizaron en el mismo día que la administración portal o intravenosa de células de médula ósea y la comprobación del injerto de las hojas de piel se realizó empezando en la semana 3 después de los trasplantes.

(7) Rultados

Los resultados se muestran en la Figura 2.

En la Figura 2, lo ordenada representa la proporción (%) de injerto y la abcisa representa el tiempo (en semanas) después del transplante. Leyenda: Grupo I, representa los datos generados en un grupo (n = 3) que recibió una dosis de radiación de 6,5 Gy en asociación con la administración portal de células de médula ósea [Grupo I: 6,5 Gy+pv (n = 3)]; la leyenda: Grupo II, representa un grupo que recibió una dosis de radiación de 7,0 Gy en asociación con la administración portal (n = 9) o con la administración intravenosa (n = 5) de células de médula ósea [Grupo II: 7 Gy+pv (n = 9) o iv (n = 5)]; la leyenda: Grupo III, representa un grupo que recibió una dosis de radiación de 6,5 Gy en asociación con la administración intravenosa de células de médula ósea (n = 7) [Grupo III: 6,5 Gy+iv (n =7)]; y la leyenda: Grupo IV, representa un grupo que recibió una dosis de radiación de 6,0 Gy en asociación con administración portal (n = 5) o intravenosa (n = 3) de células de médula ósea [Grupo IV: 6,0 Gy+pv (n = 5) o iv (n = 3)].

(8) Explicación de los resultados

En los ratones B6, se realizó la irradiación de cuerpo entero con una dosis de 7,0 Gy, 6,5 Gy o 6,0 Gy y después de aproximadamente 24 horas, se realizó la administración portal (pv) o intravenosa (iv) de células de médula ósea derivadas de un ratón F1 (BALB/c x DBA/2) (CDF1). A continuación, en el mismo día, se realizó el transplante de piel. Tal como se observa en la Figura 2, los ratones recipientes a los que se irradió con dosis de 7 Gy en tanto el grupo de administración portal como en el de administración intravenosa mostraron una proporción de injerto del 100% para los trasplantes de piel del donante (CDF1) en la semana 23 (el día 167) después del transplante (9 de 9 ratones en el grupo pv y 5 de 5 ratones en el grupo iv). Esto contrasta con los ratones recipientes expuestos a dosis de radiación de 6,0 Gy en los que el trasplante de piel fue invariablemente rechazado en las 3 semanas después del transplante (5 de 5 ratones en el grupo pv y 3 de 3 ratones en el grupo iv). En los ratones recipientes a los que se les suministró una dosis de radiación de 6,5 Gy, el trasplante de piel se rechazó en uno de 7 ratones del grupo de administración intravenosa en la semana 3 después del transplante pero se obtuvo un trasplante con éxito en 3 de los 3 ratones recipientes en el grupo de administración portal en la semana 13 después del trasplante.

(9) Discusión

La proporción de injertos fue ligeramente superior en el grupo de 6,5 Gy más administración portal. Parecería que debido a que las células hematopoyéticas del donante se quedan atrapadas en el hígado del recipiente con más eficacia en este grupo, se evita con mayor facilidad el rechazo por las células radiorresistentes inmunocompetentes en el ratón recipiente.

Ejemplo farmacéutico 1

Las células de médula ósea o de bazo se suspenden en disolución salina fisiológica para preparar una composición 1 x 10^{8}/ml para la administración en la vena porta. Por otra parte, se prepara de modo semejante una composición que contiene 1 x 10^{8} células de médula ósea/ml de disolución salina para la administración intravenosa.

En los seres humanos, la composición anterior destinada a la administración en la vena porta se administra preferentemente a una dosis de generalmente 3 x 10^{8} células de médula ósea o más (puede haber células T) por kg de peso corporal.

Ejemplo farmacéutico 2

Se suspenden células de médula ósea en disolución salina fisiológica para proporcionar una suspensión de 1 x 10^{8}/ml. Con el fin de suministrarlas en la vena porta de un paciente, por ejemplo, la suspensión se administra preferentemente en una dosis generalmente de 3 x 10^{8} células de médula ósea o más (puede haber una pequeña proporción, es decir, aproximadamente 2%, de células T) por kg de peso corporal. Por consiguiente, se proporciona una inyección que contiene por lo menos la dosis unitaria anterior. Esta composición inyectable es valiosa como un inductor de inmunotolerancia que se debe utilizar en asociación con irradiación.

Aplicabilidad industrial

Con el inductor de inmunotolerancia de la presente invención, se puede inducir una inmunotolerancia en un paciente que sufre un trasplante de órgano y se puede así asegurar un mantenimiento satisfactorio del órgano trasplantado.

Claims

1. Utilización de una cantidad efectiva de un tolerógeno que contiene células madre hematopoyéticas, células progenitoras hematopoyéticas, linfocitos maduros o una mezcla de éstes, diferentes de las derivadas de un embrión humano, en combinación con un vehículo farmacéutico para la preparación de una composición farmacéutica destinada a la administración portal con el fin de inducir tolerancia inmunológica en un paciente que sufre un transplante de órgano, en asociación con irradiación de cuerpo entero utilizando una dosis subletal de radiación de por lo menos 6,5 Gy.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que el tolerógeno contiene células de médula ósea.