JP2001172188A - 免疫寛容誘導剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】骨髄細胞移植及び臓器移植の際に発生する拒絶
反応を抑制する免疫寛容を容易に誘導でき、移植細胞及
び臓器を長期間維持できる新しい免疫寛容誘導剤を提
供。 【解決手段】放射線照射と共に免疫寛容の誘導に用いら
れる医薬であって、骨髄細胞を含む寛容原を有効成分と
し放射線照射後に骨髄内投与される骨髄内投与形態を有
する免疫寛容誘導剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、骨髄移植及び臓器
移植に際して発生する移植骨髄及び移植臓器に対する拒
絶反応を効率的に抑制して、それら骨髄及び臓器の長期
に亘る維持、生着を可能とする、免疫寛容誘導剤に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】免疫寛容の人為的な誘導（免疫寛容の成
立）は、臓器移植における最終目標として注目され、種
々の研究がなされ、研究成果が報告されている。かかる
人為的な免疫寛容の誘導方法としては、例えば以下の報
告が参照される。

【０００３】脾臓細胞や骨髄細胞の寛容原（toleroge
n）移入と抗有糸分裂剤（antimitoticdrug）との併用に
よる寛容誘導〔Fukuoka Acta Med., 81(1), 20-40 (199
0); Microbiol. Immunol., 32(3), 283-292 (1988)
等〕。ここで、抗有糸分裂剤としては、６−メルカプト
プリン（6-mercaptopurine）、メソトレキセート（meth
otrexate）、サイクロホスファマイド（cyclophosphami
de, CP）、５−フルオロウラシル（5-fluorouracil）、
アザチオプリン（azathioprine, AZP）、プロカルバジ
ン（procarbazine）等が挙げられ、シクロスポリンＡ
（ciclosporin A, CsA）やＦＫ５０６のような免疫抑制
剤やステロイド類は、之等抗有糸分裂剤とは作用機構が
顕著に相違する。

【０００４】早川らは、ＦＫ５０６を用いてドナー特異
的な免疫抑制状態を誘導する試みを報告している〔慶応
医学、72(3),163-176 (1995)〕。同様に、村松らは、１
５−ＤＳＧによる免疫寛容導入の可能性について報告し
ている〔第20回日本マイクロサージャリー学会抄録、89
-90頁 (1994)〕。

【０００５】本発明者らも先に、マウスに骨髄細胞（特
に造血幹細胞）を門脈内又は静脈内投与すると、該細胞
が肝臓に捕捉されてキメリズムが成立し、かくして免疫
学的寛容が誘導されることを報告している〔Eur. J. Im
munol., 24: 1558 (1994)〕。

【０００６】更に本発明者らは、骨髄細胞等の寛容原
（tolerogen）を有効成分とする薬剤を門脈内投与し次
いで静脈内投与することによって免疫寛容を達成でき、
これによれば移植臓器の長期に亘る生着、維持が行ない
得ることを見出し、この知見に基づく免疫寛容誘導剤に
係わる発明を先に完成した〔ＷＯ９８／３９０１６
号〕。

【０００７】一方、近年、自己免疫疾患が血液幹細胞疾
患（stem cell disorder）として認識されるに至り〔In
ternational Journal of Molecular Medicine, 1: 5-1
6, 1998〕、骨髄移植（ＢＭＴ）、殊に同種骨髄移植
（アロＢＭＴ）による各種自己免疫疾患の治療が注目を
あびてきている。このように近年のＢＭＴにあって中心
的役割を果たしているアロＢＭＴにおいて、殊に、骨髄
バンクの整備により非血縁者間ＢＭＴが増加してきてい
る現状において、その効果と共に、移植細胞の生着不全
／拒絶や移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）への対応が、問題
点あるいは課題として指摘されている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、より
侵襲の少ない処置で確実にキメリズムを導入し、免疫寛
容状態を長期間維持でき、もって拒絶反応の抑制を効率
的に行ない、移植臓器（骨髄細胞を含む）の長期に亘る
生着、維持を図り得る画期的な技術を提供することにあ
る。

【０００９】本発明の他の目的は、現在のＢＭＴに見ら
れる問題、殊に生着不全／拒絶の問題を解消する新しい
ＢＭＴの方法及びこれに利用できる免疫寛容誘導技術乃
至骨髄細胞移植技術を提供することにある。

【００１０】本発明者らは鋭意研究の結果、従来試みら
れた例のない骨髄細胞の骨髄内投与という新しい手法を
採用し、しかもこれを免疫寛容のための前処置としての
放射線照射と組合せて実施するときには、上記目的とす
る所望の免疫寛容誘導が行ない得るという新規事実を発
見し、ここに本発明を完成するに至った。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、免疫寛
容の誘導に放射線照射と共に用いられる医薬であって、
骨髄細胞を含む寛容原を有効成分とし、放射線照射後に
骨髄内投与される骨髄内投与形態を有することを特徴と
する免疫寛容誘導剤が提供される。

【００１２】特に、本発明によれば、以下の免疫寛容誘
導剤が提供される。 (1) 寛容原が、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防止す
るためのものであり且つＴ細胞の混入の少ない骨髄細胞
（例えばマウスを用いた試験において得られる如き採取
した骨髄細胞に、抗Ｔ細胞抗体処理を行なった後の細胞
や、カニクイザルを用いた試験において得られる如き灌
流法により得られる骨髄細胞に、抗Ｔ細胞抗体処理を行
なった後の細胞）である上記免疫寛容誘導剤。 (2) 骨髄内投与が大腿骨内投与によりなされる上記免
疫寛容誘導剤。 (3) 放射線照射が１日２回の分割による全身照射によ
り行なわれる上記免疫寛容誘導剤。 (4) 骨髄移植に用いられる上記免疫寛容誘導剤。 (5) 自己免疫疾患の治療に用いられる上記免疫寛容誘
導剤。 (6) 臓器移植の前処置に用いられる上記免疫寛容誘導
剤。

【００１３】また、本発明によれば、上記免疫寛容誘導
剤を利用した免疫寛容誘導方法乃至骨髄移植方法が提供
される。該方法は、より詳しくは、免疫寛容の誘導を所
望される患者に、放射線照射を行ない、次いで骨髄細胞
を含む寛容原の有効量を製剤担体と共に含む医薬組成物
を骨髄内投与することを特徴としている。

【００１４】本発明免疫寛容誘導剤は、上記のように骨
髄移植用剤として、従来の骨髄移植対象疾患は勿論のこ
と、他に代表的には自己免疫疾患の治療に用いることが
できる。特に、本発明免疫寛容誘導剤は、これを骨髄移
植に利用することによって、生着不全あるいは拒絶の発
生頻度を非常に低減させて、移植された骨髄細胞を良好
に維持でき、かくして、移植された骨髄細胞による本来
の効果、即ち、造血機能、免疫機能の正常化により、白
血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、重症再生不良性貧
血、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）及びその他の遺伝性疾
患等の治療効果を始めとして、自己免疫疾患の治療や遺
伝子導入による遺伝子治療への利用等の効果を十分に発
揮し得る。

【００１５】また、本発明免疫寛容誘導剤は、臓器移植
の前処置に用いることができ、その利用によって、所望
の免疫寛容を誘導して、移植臓器の長期に亘る良好な生
着、維持効果を奏し得る。

【００１６】

【発明の実施の形態】本発明免疫寛容誘導剤（以下、単
に「本発明医薬」ということがある）における有効成分
である、寛容原としての骨髄細胞としては、例えばドナ
ー由来のものを例示できる。かかる寛容原の分離及び単
離は、公知の方法に従うことができ、例えば山本等の文
献〔Blood, Vol 88, pp 445-454 (1996)〕や「細胞免疫
実験操作法」〔Mishell B. B., Shgi S. M. 編、今井勝
行、川口進、原田孝之供訳、理工学社、3-12頁、1982
年〕等に記述されている方法等が参照される。

【００１７】本発明における特に好ましい上記骨髄細胞
は、ＧＶＨＤが発症せずに生着率を高め得る点より、Ｔ
細胞の混入をできるだけ抑えたものであるのがよい。か
かるＴ細胞の混入の少ない（例えば１％程度）骨髄細胞
は、より詳しくは、後述する灌流法により入手される骨
髄細胞（通常５％程度以下のＴ細胞が混入する）から、
例えば以下の如くしてＴ細胞を処理して調製することが
できる。このＴ細胞除去は、例えば、通常の抗Ｔ細胞抗
体（例えば、抗ＣＤ３抗体や抗ＣＤ４抗体と抗ＣＤ８抗
体とを混合したもの等）を細胞集団に添加後、補体を加
えずに、抗Ｔ細胞抗体が結合した細胞（Ｔ細胞）をin v
ivoで殺すことにより実施できる。この方法によれば、
従来の抗体と補体を用いた処理方法とは異なって、Ｔ細
胞以外の細胞、特にストローマ細胞は除去されず、生着
率を向上させることができる。

【００１８】上記灌流法は、本発明者らが独自に確立し
た、免疫原としての骨髄細胞の採取法であり、Ｔ細胞の
混入を低減させたドナー（哺乳動物）由来の骨髄細胞の
採取に特に適している。該灌流法は、例えば、大腿骨の
一端に骨髄穿孔針を挿入し、該針を通して適当な灌流
液、例えばリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を骨髄腔
内に流し、これを大腿骨の他端に設けた穿孔より回収す
る方法である。

【００１９】上記灌流法につき、例えばヒトへの応用を
考慮してサルを供試動物として更に詳述すれば、該方法
は以下の如くして実施できる。即ち、麻酔下に、骨髄穿
孔針を大腿骨外顆近位部（上腕骨の場合は上腕骨大結節
遠位部）に軸に対して直角に挿入し、進展チューブの一
端を該針につなぎ、他端を培養フラスコ中に入れる。該
フラスコ内にはヘパリンを含むＰＢＳを入れておく。も
う一つの骨髄穿孔針を同大腿骨大転子遠位部（上腕骨の
場合は上腕骨外顆近位部）に軸に対して直角に挿入し、
ＰＢＳを入れたシリンジに繋ぐ。該シリンジよりＰＢＳ
をゆっくりと骨髄腔に押し出して骨髄を洗出し、骨髄液
を含む媒体を上記フラスコ中に回収する。かくして、Ｔ
細胞の混入を低減された所望の骨髄細胞を得ることがで
きる。

【００２０】上記灌流方法によれば、通常の骨髄細胞の
採取方法であるアスピレーション法に比して、得られる
骨髄細胞上の表面抗原ＣＤ４及びＣＤ８量が約１／５以
下に減少しており、このことからＴ細胞の混入が非常に
少ないことが明らかである。

【００２１】本発明医薬は、その有効成分が骨髄内投与
されるものであるため、骨髄内投与に適した形態に調製
されることが重要である。かかる骨髄内投与形態の代表
的なものとしては、例えば注射剤、輸液剤等の液剤形態
を例示できる。この注射剤を含む所望形態の調製は、通
常のこの種の細胞成分からなる各種医薬製剤におけるそ
れらと同様のものとすることができる。その際用いられ
る担体も、この分野で従来よりよく知られている、薬学
的に許容される各種の担体（希釈剤等）でよく、その例
としては、代表的にはＰＢＳやＲＰＭＩ１６４０等を例
示することができる。また、上記骨髄内投与形態の調製
に際しては、現在汎用されている各種の輸液用製剤に利
用されている各種の技術も利用可能である。尚、本発明
医薬は、移植に際して移植臓器ドナーより用時調製する
こともできる。

【００２２】本発明医薬の投与量は、骨髄移植乃至臓器
移植に有効な量、即ち移植細胞乃至移植臓器の生着不全
や拒絶及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が惹起されない
量であるかぎり特に制限はない。好ましい上記投与量と
しては、例えばマウスの場合骨髄細胞として少なくとも
１×１０⁷個程度、好ましくは３×１０⁷個程度を目安と
して、適宜増減することができる。ヒトにおける投与量
は上記マウスのそれを参考にして、通常の骨髄移植にお
ける投与量を参考にして適宜決定できる。例えば１×１
０⁸個／ｋｇ程度もしくはそれ以上とするのがよい。
尚、造血機能の回復が遅延する場合は、随時、凍結保存
しておいたドナー骨髄細胞の追加静脈内投与を行なうの
が好ましい。

【００２３】本発明医薬は、骨髄内経路により投与さ
れ、これにより、所望の免疫寛容の誘導による移植細胞
乃至臓器の長期に亘る生着、維持をはかり得る。かかる
骨髄内投与は、例えば脛骨（又は大腿骨）骨髄内に刺入
した針を利用して注射により実施することができる。そ
の詳細は、後記実施例に示すとおりである。特にこの方
法はレシピエントへの侵襲の少ないものとして特徴付け
られる。

【００２４】本発明医薬を利用して免疫寛容を誘導する
方法、即ち、本発明医薬の骨髄内投与による骨髄細胞移
植方法及び各種臓器移植に先立つ移植臓器の拒絶反応抑
制のための免疫寛容誘導方法は、骨髄細胞乃至臓器の移
植に有効な放射線照射（移植前処置）と、上述した骨髄
内経路による本発明医薬の投与との両要件を必須として
包含することを最大の特徴とする。之等の要件以外は、
いずれも通常の骨髄細胞移植における場合のそれらに準
ずることができる。

【００２５】本発明医薬の投与に先立つ放射線照射は、
レシピエントに所定量の放射線を照射することにより行
なわれ、これは常法に従うことができる。より具体的に
は、全身照射（ＴＢＩ）により行なうことができる。

【００２６】放射線照射量は、骨髄移植の場合は、レシ
ピエントの骨髄細胞が回復してこない放射線量（letha
l）としてとらえられ、これは常法に従う医学的許容量
範囲とされる。一般には約５〜６Ｇｙ、好ましくは約
５．５Ｇｙの２回照射が適当なものとして例示できる。
臓器移植の場合の放射線照射量は、例えば全身照射（Ｔ
ＢＩ）による１回照射で６．５Ｇｙ以上で且つ致死量に
満たない量（sublethal）、好ましくは約７Ｇｙ前後の
放射線照射量とすることができる。

【００２７】かかる放射線照射量（sublethal dose）
は、レシピエントの骨髄細胞が回復する放射線量として
も特徴付けられる。特に灌流法を利用して得られる本発
明医薬（ドナー由来骨髄細胞）の骨髄内投与によれば、
上記sublethalの放射線照射によっても生着不全を生じ
ない特徴が認められる。これはドナーの造血幹細胞がド
ナーのストローマ細胞と一緒に骨髄内に投与されるた
め、ドナーのストローマ細胞がドナーの造血幹細胞の増
殖を助長することによると考えられる。このことは、本
発明者らが先に報告した造血幹細胞の増殖には主要組織
適合抗原複合体（ＭＨＣ）（ヒトではＨＬＡ）の一致し
たストローマ細胞のサポートが必要である旨の知見（Bl
ood, 89: 49-54, 1997）からも支持される。

【００２８】上記放射線照射は、本発明免疫寛容誘導剤
の投与に先だって行なわれ、その後、通常約２４時間以
内に本発明薬剤の骨髄内投与を実施するのが好ましい。
かくして、レシピエントへの侵襲の少ない処置によって
本発明所望の免疫寛容誘導効果が奏され、移植骨髄又は
移植臓器の良好な維持が可能となる。

【００２９】尚、本発明にかかる処置によって、所望の
免疫寛容が誘導され、移植臓器の良好な維持が可能とな
る現象は、移植術施行の時期とは関係しない。従って、
当該臓器移植術は、本発明処置と平行して或いは本発明
処置による免疫寛容が達成された後のいずれにも良好に
行なうことができる。

【００３０】また、本発明にかかる免疫寛容の誘導に際
しては、本発明の効果が害されない限りにおいて、通常
この種の処置に際して利用される各種の医療処置や他の
医薬製剤の併用をすることができる。その例としては、
例えばシクロスポリンＡ、ＦＫ５０６等の各種の免疫抑
制剤等を例示できる。それらの用量、用法等は既知（市
販品）のそれらに従うことができる。

【００３１】

【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため、本
発明医薬を用いた試験例を挙げると共に、参考例として
本発明医薬（骨髄内投与用）の調製例及び該医薬の調製
のための骨髄細胞の採取例を挙げる。

【００３２】

【試験例１】骨髄移植 （１）マウス骨髄細胞浮遊液の調製 ドナーマウスより大腿骨及び脛骨を取り外し、それぞ
れ、膝関節側よりシリンジ（2.5ml, Code No. SS-02S,
Terumo Co., Ltd.）につけた２２ゲージ針（CodeNo. NN
-2225RSS-02S, Terumo Co., Ltd.）を刺入し、シリンジ
中のＲＰＭＩ１６４０溶液にて骨髄細胞を滅菌シャーレ
（90×15mm, Iwaki Clinical Test Wares）へ押し流し
た後、ＲＰＭＩ１６４０溶液中に懸濁させ、得られる骨
髄細胞をＲＰＭＩ１６４０溶液にて１回洗浄後、同溶液
中に浮遊させて所望の骨髄細胞浮遊液（1×10⁸/ml濃
度）を調製した。

【００３３】上記で得たＲＰＭＩ１６４０溶液中に浮遊
させたマウス骨髄細胞（2×10⁷/ml濃度）に、モノクロ
ーナル抗Thy-1.2抗体（American Type Culture Collect
ion,Rockville, MD）を細胞浮遊液量の１／１０倍量加
え、４℃、３０分間静置した後、抗体を洗浄することな
く、そのまま引き続く免疫寛容誘導実験に供した。この
抗体を含んだ液の投与は、レシピエントの残存したＴ細
胞の除去にも役立つ。 （２）放射線照射 レシピエントマウスの放射線照射は、¹³⁷Ｃｓを線源と
したガンマセル４０エグザクター（Nordion Internatio
nal Inc.社製）を用いた１回の全身照射もしくは２回に
分割した全身照射により行った。尚、分割照射の場合、
１回目と２回目の照射間隔は４時間とした。これらの放
射線照射は、骨髄の注射投与の前日に実施した。 （３）骨髄内注射 ペントバルビタール麻酔後、レシピエントマウスを仰臥
位にし、鼠径部から膝関節まで剃毛し消毒した。膝蓋部
の上縁より5 mm上方の大腿部前面に5 mmの横切開を加
え、膝関節を90-120度屈曲し、脛骨近位を前方に引き出
し、２６ゲージ針（Terumo Co., Ltd.）を膝蓋腱のやや
内側から挿入し、脛骨関節面に骨孔を作成した。更に脛
骨骨髄内へと5 mm程度針を進め、前記（１）で調製した
ドナーマウスの骨髄細胞（3×10⁷個、浮遊液0.3 ml）を
入れた１ｍｍシリンジ（Terumo Co., Ltd.）を上記２６
ゲージ針に装着し、上記骨孔から骨髄内に骨髄細胞を注
入した。尚、皮膚は５−０ナイロン（Johnson and John
son Company）で縫合し、創部を消毒した。 （４）門脈内注射 レシピエントマウスをペントバルビタール（Pitman-Moo
r Inc.; 37.5mg/kg体重i.p.）麻酔下にて剃毛、消毒
し、腹部正中切開を行った後、腸間膜を露出させ、１ｍ
ｌ−ツベルクリン用シリンジにつけた２７ゲージ針（Te
rumo Co., Ltd.）を腸間膜脂肪組織を経て刺入し、前記
（１）で調製したドナーマウスの骨髄細胞の3×10⁷個
（浮遊液 0.3 ml）を門脈内に注射投与した。 （５）静脈内注射 前記で得たドナーマウスの骨髄細胞を、1×10⁸/ｍｌ濃
度に調整し、その3×10 ⁷個（0.3 ml)をレシピエントマ
ウスの尾静脈より注射投与した。 （６）骨髄移植及び結果 ＭＲＬ／ＭＰ−ｌｐｒ／ｌｐｒ（ＭＲＬ／ｌｐｒ）マウ
スは、異常Ｔ細胞の集積とともにリンパ節腫脹を自然発
症し、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）や慢性関節リ
ューマチ（ＲＡ）等、自己免疫疾患の動物モデルとして
知られている。このＭＲＬ／ｌｐｒマウス（Japan SLC
Inc.）をレシピエントとし、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂ
６、Japan SLC Inc.）をドナーとして、上記（２）及び
（３）に従って、骨髄移植を実施し、レシピエントマウ
スの生存とドナー由来細胞の生着につき確認した。また
自己免疫疾患の治療効果を併せて確認した。

【００３４】比較のため、上記（３）に従う骨髄内注入
に代えて、上記（４）及び／又は（５）に従う門脈内投
与及び／又は静脈内注射を行なう以外は同様とする比較
試験を実施した。

【００３５】尚、試験群は次のとおりである。 グループＩ（本発明群）：放射線の２回分割照射（５．
５Ｇｙ×２）の１日後に、骨髄細胞の骨髄内投与を行な
った群（ｎ＝１０）。 グループII（比較群１）：放射線の２回分割照射（５．
５Ｇｙ×２）の１日後に骨髄細胞を門脈内投与し、更に
その５日後に同骨髄細胞を静脈内注射した群（ｎ＝１
３）。 グループIII（比較群２）：放射線の２回分割照射
（５．５Ｇｙ×２）の１日後に骨髄細胞を門脈内投与し
た群（ｎ＝１０）。 グループIV（比較群３）：放射線の２回分割照射（５．
５Ｇｙ×２）の１日後に骨髄細胞を静脈内注射した群
（ｎ＝４）。 （７）結果 結果を図１に示す。図１において、縦軸はレシピエント
マウスの生存率（％）を、横軸は移植術終了後の経過日
数を示す。

【００３６】発症した自己免疫疾患の治療を目的とし
て、蛋白尿２．５以上でリンパ節腫脹の認められるＭＲ
Ｌ／ｌｐｒマウスに骨髄移植療法を行なった結果、図１
に示すとおり、放射線の５．５Ｇｙ×２回分割照射及び
全骨髄細胞の経静脈投与（グループIV：比較群３）の場
合は、全てのレシピエントＭＲＬ／ｌｐｒマウスが１８
０日以内に死亡し、また、放射線の５．５Ｇｙ×２回分
割照射及び全骨髄細胞の門脈内投与（グループIII：比
較群２）の場合も、移植術後３５０日での生存率は７０
％であった。

【００３７】これに対して、本発明方法に従う、放射線
の５．５Ｇｙ×２回分割照射及び全骨髄細胞の骨髄内投
与（グループＩ：本発明群）の場合は、放射線の５．５
Ｇｙ×２回分割照射並びに骨髄細胞の門脈内投与＋静脈
注射（グループII：比較群１）の場合と同様に、ドナー
由来細胞の生着及び長期間の生存が確認され、また、自
己免疫疾患の治癒も確認された。

【００３８】以上のことから次の通り考察される。即
ち、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは個体レベルで放射線感受性
が高く、更に自己免疫疾患発症後は腎機能低下に伴う尿
毒症性腸炎が発症するため、放射線感受性が更に強くな
るが、細胞レベルにおいては、放射線抵抗性の異常な造
血幹細胞を有しており、このため従来の骨髄移植方法を
用いてはＭＲＬ／ｌｐｒマウスの自己免疫疾患の治療は
極めて困難であった。本発明によれば、低線量の放射線
照射とその後の骨髄内単一回骨髄細胞投与（付加的静脈
内投与が不要である）により、ドナー骨髄細胞の生着が
促進され、かくしてＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおいてもそ
の自己免疫疾患の満足できる治療法が確立できた。

【００３９】また、本発明群（グループＩ）における結
果を、比較群１（グループII）におけるそれと対比すれ
ば、以下の通り結論付けられる。 (1)門脈内投与は開腹を必要とするか又は腹腔鏡下もし
くは超音波診断装置下に骨髄細胞を注入する操作を必要
とする。上記開腹は必然的に侵襲を伴う。後者の２つの
方法は開腹は必要としないが、前者も含めて、門脈内注
入の際、出血等の危険があることを考慮すると、いずれ
も侵襲を伴うものである。これに対して、骨髄内投与は
直視下に行なわれるものであり、上記門脈内投与に比し
て、より簡便且つ安全な方法といえる。また、門脈内投
与は上記いずれの場合にも全身麻酔が必要となるのに対
して、骨髄内投与は、例えば大腿骨内に投与する場合、
腰椎麻酔もしくは局所麻酔のみで充分であり、麻酔によ
る負担を顕著に軽減できる。 (2)門脈内投与＋静脈内投与の場合は、同一のドナーの
骨髄細胞を、例えば５日間の間隔をあけて、２回投与す
るものであり、そのために、同一ドナーから２回骨髄細
胞を採取するか、もしくは１回目の骨髄細胞採取の際、
一部を確立された既存の方法により凍結保存し、２回目
の静脈内投与に際して解凍して使用する必要がある。か
かる同一ドナーより２回の骨髄採取はドナーに対する侵
襲を考慮すると適当ではなく、また骨髄細胞の凍結−解
凍操作によれば、細胞の生存率の減少や造血能力の低下
は避けられない。骨髄内投与は、上記の如き欠点のない
点からも優位である。

【００４０】

【試験例２】皮膚移植本例では、免疫寛容の誘導を、前
記試験例１の（３）と同様にして、異系ドナーの骨髄細
胞の骨髄内投与により行い、免疫寛容の成立を、拒絶反
応を最も受けやすい皮膚（ドナーと同系）の移植による
生着の程度を観察し、その指標として評価した。 （１）骨髄細胞浮遊液の調製 試験例１の（１）と同様にして、ＲＰＭＩ１６４０溶液
に骨髄細胞を浮遊させた骨髄細胞浮遊液（1×10⁸/ml濃
度）を調製した。 （２）放射線照射 レシピエントマウスの放射線照射は、¹³⁷Ｃｓを線源と
したガンマセル４０エグザクター（Nordion Internatio
nal Inc.）を用いた１回の全身照射により行った。 （３）骨髄細胞の投与経路 骨髄内投与、門脈内投与及び静脈内投与は、それぞれ試
験例１の（３）、（４）及び（５）と同様にして実施し
た。 （４）皮膚移植 皮膚移植片の調製及び移植方法は、文献記載の方法〔Ma
yumi et al., Jpn. J.Surg., 18, 548-557 (1988)〕を
参照して、以下の通り行った。

【００４１】即ち、８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（１９−
２０ｇ、日本ＳＬＣ）をドナーとして、エチルエーテル
（Nacalai Tesque Inc.）麻酔下で屠殺し、除毛剤（Fea
therHair Remover, Feather Safty Razor Co., Ltd.）
にて全身の体毛を除去し、７０％アルコール溶液にて除
菌した後、皮膚全層を剥離採取した。ピンセット（先曲
がり先細無鈎）及び滅菌綿棒を用いて可及的に皮下脂肪
組織を剥離した後、皮膚片（1.2×1.5cm四方）に細切
し、頭側の一辺にマーカーとして１ｍｍの切開を加え、
冷却した無菌のリン酸緩衝食塩水（Dulbecco's PBS(-),
Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.）中に浮遊させた。

【００４２】Ｂ６マウス（１０−１３週齢、２０−２３
ｇ、日本ＳＬＣ）をレシピエントとして、ペントバルビ
タール（37.5mg/kg体重i.p.）で麻酔した後、右背側部
を手指による抜毛及び前記除毛剤により除毛（3.0×3.5
cm四方）し、７０％アルコール溶液にて除菌して移植の
ための術野を作製した。

【００４３】剥離面に上記調製したドナーの皮膚片をマ
ーカーを尾部に向けて設置し、６-０針付きナイロン縫
合糸（Ethilon; Ethicon Inc.）にて８針（４辺の中央
と４角）を縫合した。皮膚移植面を硫酸フラジオマイシ
ン軟膏付きガーゼ（2.0×2.5cm四方, Sofratulle; Japa
n Roussel Co., Ltd.）で覆い、更に粘着性伸縮包帯（E
latex; Alcare Co., Lrd.）で巻いた。 （５）免疫寛容誘導 レシピエントへの放射線照射１日後に、ドナー骨髄細胞
を各投与経路によりそれぞれ投与し、之等骨髄細胞の投
与と同日に皮膚移植を行ない、移植皮膚の生着の有無
を、移植術後観察した。

【００４４】上記投与経路の相違により、以下の各試験
群に分けた。 本発明群：放射線６．５Ｇｙ照射１日後に骨髄細胞を骨
髄内投与した群（ｎ＝５） 比較群１：放射線７．０Ｇｙ照射１日後に骨髄細胞を門
脈内投与した群（ｎ＝１６） 比較群２：放射線７．０Ｇｙ照射１日後に骨髄細胞を静
脈内投与した群（ｎ＝１８） 比較群３：放射線６．５Ｇｙ照射１日後に骨髄細胞を門
脈内投与した群（ｎ＝１９） 比較群４：放射線６．５Ｇｙ照射１日後に骨髄細胞を静
脈内投与した群（ｎ＝２２） 比較群５：放射線６．０Ｇｙ照射１日後に骨髄細胞を門
脈内投与した群（ｎ＝１０） 比較群６：放射線６．０Ｇｙ照射１日後に骨髄細胞を静
脈内投与した群（ｎ＝１０） （６）結果 結果を図２に示す。図２において、縦軸は、皮膚生着率
（％）を、横軸は、移植術後の経過週数を示す。

【００４５】図２より、次のことが判る。即ち、６．０
Ｇｙの放射線照射後に骨髄細胞を門脈内又は静脈内投与
した群（比較群５及び６）では、ともに皮膚移植片は移
植後３週以内に全てのレシピエントマウスで拒絶され
た。６．５Ｇｙの放射線照射後に同骨髄細胞の門脈内又
は静脈内投与を行なったレシピエントマウスでも、移植
後５０週の時点で、静脈内投与群（比較群４）で２２匹
中１１匹で皮膚移植片が拒絶され、門脈内投与群（比較
群３）で１９匹中４匹のレシピエントマウスで皮膚移植
片が拒絶された。之等の各投与経路での骨髄細胞の単一
回投与と放射線照射との併用では、臓器移植における免
疫寛容誘導は尚不十分であり、充分な免疫寛容の誘導の
ためには、少なくとも７．０Ｇｙの放射線照射の併用が
必要である（比較群：１及び２参照）ことが判った。

【００４６】これに対して、本発明群では、６．５Ｇｙ
放射線照射後に骨髄細胞を骨髄内に単一回投与すること
によって、上記７．０Ｇｙ放射線照射後に骨髄細胞を門
脈内又は静脈内投与した群（比較群１及び２）と同様に
充分な免疫寛容を誘導して、ドナーの皮膚移植片の生着
率を１００％とすることができることが明らかである。 （７）考察 本発明によって、臓器移植のモデルケースである皮膚移
植において、放射線照射量を低減させて、レシピエント
に対する放射線の侵襲を軽減して、充分な免疫寛容を達
成できることが可能となった。消化管、皮膚、生殖器官
等に対する放射線による悪影響を考慮すると、上記放射
線照射量の低減は、レシピエントにとって非常に有利で
あり、このことは本発明の優れた利点の一つである。

【００４７】

【参考例１】骨髄内投与剤の調製 骨髄細胞を生理食塩水に懸濁して、１×１０⁸細胞／ｍ
ｌの細胞浮遊液を調製する。骨髄投与用として、ヒトの
場合、通常３×１０⁸細胞／ｋｇ以上の骨髄細胞（少量
のＴ細胞が混入していても可）投与量で投与されるのが
好ましく、少なくとも当該投与量を含有する単回投与用
形態である注射剤を調製する。

【００４８】

【参考例２】灌流法による骨髄細胞浮遊液の調製 正常カニクイザル（cynomolgus monkey,体重：２．５〜
３．５ｋｇ、腸内寄生虫なし、細菌性赤痢、結核、Ｂウ
イルス、Ａ型肝炎及びＢ型肝炎ウイルス陰性）を供試動
物として用いた。全ての外科的手術及び術後処置はガイ
ドライン（guidlines of the National Institutes of
Health for care and use of primates）に従った。

【００４９】「ケタラール」（Sankyo Co., Ltd.）５ｍ
ｇ筋注麻酔下に、上記供試動物の大腿骨外顆近位部（上
腕骨の場合は上腕骨大結節遠位部）に、骨髄穿孔針（Ka
tsunuma's bone marrow puncture needle (φ1.8mm) Ky
oto, Japan）を、軸に対して直角に挿入し、進展チュー
ブ（extention tube, 50cm, 3.8ml, Code No. SF-ET382
5, Terumo Co., Ltd.）の一端を該針につなぎ、他端を
培養フラスコ（250ml,Becton Dickinson）中に入れた。
該フラスコ内にはヘパリン（10U/ml, Novo Heparin 100
0, Hoechst Marion Roussel Co., Ltd.）を含むリン酸
塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）２０mlを入れておいた。

【００５０】もう一つの骨髄穿孔針を、同供試動物の大
腿骨大転子遠位部（上腕骨の場合は上腕骨外顆近位部）
に軸に対して直角に挿入し、ＰＢＳ３０ｍｌを入れたシ
リンジ（30ml, Code No. SS-30ES, Terumo Co., Ltd.）
に繋いだ。該シリンジよりＰＢＳをゆっくりと骨髄腔に
押し出して骨髄細胞を洗出し、骨髄液を含む媒体を上記
培養フラスコ中に回収した。上記操作を２度繰り返し
た。当該方法により得られた骨髄細胞浮遊液をMono-Pol
y Resolving Medium (Dainippon PharmaceuticalCo., L
td.)の上に重層し、１５℃、３０分間、２０００回転に
て遠心操作を行ない、沈殿した赤血球を除去した。かく
して、Ｔ細胞の混入を低減された所望の骨髄細胞液
（２．３±１．５×１０⁸細胞／ｍｌ、２．６±１．６
×１０⁸細胞／大腿骨）を得た。

【００５１】即ち、得られた骨髄細胞の細胞表面抗原
を、ヒトＣＤ４，ＣＤ８，ＣＤ２０，ＣＤ１１ｂ又はＣ
Ｄ５６（Exalpha）及びＩｇＭ（Biosouce）に対する抗
体(mAbs、予めカニクイザル細胞上に発現される分子と
の交差反応性の程度を調べたもの)を結合させたＦＩＴ
Ｃ又はＰＥを用いて、フローサイトメトリー分析（EPIC
S-XL, Coulter Co.）により測定した。

【００５２】その結果、従来行なわれているアスピレー
ション法により得られる骨髄細胞では、２０％以上のＴ
細胞（ＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺）の混入が見られるのが普通
であるのに対して、上記方法（灌流法）により得られた
骨髄細胞では、Ｔ細胞の混入は５％を下回るものであっ
た（ＣＤ４；２．０±２．２％，ＣＤ８；３．９±３．
３％）。尚、他の表面マーカー（骨髄細胞に通常発現さ
れるもの）をもつ細胞の頻度は、本灌流法も従来のアス
ピレーション法もほぼ同様であった。

【００５３】このことから、本灌流法によれば、ＣＤ４
⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞の頻度で表わされる末梢血の混入が
顕著に低いことが明らかである。

【００５４】上記と同様にして、ヒト大腿骨より所望の
骨髄細胞浮遊液を調製することができる。このものは、
通常１×１０⁸細胞／ｋｇ程度もしくはそれ以上の投与
量で骨髄内投与されるのが好ましく、少なくとも当該投
与量を含有する骨髄内投与用形態としての注射剤形態に
調製される。

【図面の簡単な説明】

【図１】試験例１におけるレシピエントの生存率の結果
を示す図面である。

【図２】試験例２における皮膚移植生着率の結果を示す
図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/06 Ａ６１Ｐ 37/06 Ｆターム(参考） 4C087 AA01 AA02 BB44 CA03 MA66 NA14 ZA51 ZA55 ZB08 ZB26 ZB27

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 免疫寛容の誘導に放射線照射と共に用い
   られる医薬であって、骨髄細胞を含む寛容原を有効成分
   とし、放射線照射後に骨髄内投与される骨髄内投与形態
   を有することを特徴とする免疫寛容誘導剤。