JPH10306027A - 免疫寛容誘導剤 - Google Patents
免疫寛容誘導剤Info
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- JPH10306027A JPH10306027A JP9155015A JP15501597A JPH10306027A JP H10306027 A JPH10306027 A JP H10306027A JP 9155015 A JP9155015 A JP 9155015A JP 15501597 A JP15501597 A JP 15501597A JP H10306027 A JPH10306027 A JP H10306027A
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- Japan
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- cells
- bone marrow
- mice
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Abstract
(57)【要約】
【課題】免疫抑制剤による維持を必要とせず移植臓器の
維持を可能とする新しい免疫寛容誘導剤を提供。 【解決手段】免疫寛容の誘導に用いられる医薬であっ
て、造血幹細胞、造血前駆細胞、成熟リンパ球又はそれ
ら混合物を含む寛容原を有効成分とする門脈内投与用の
第１医薬組成物及び上記寛容原を有効成分とする静脈内
投与用の第２医薬組成物からなることを特徴とする免疫
寛容誘導剤。
維持を可能とする新しい免疫寛容誘導剤を提供。 【解決手段】免疫寛容の誘導に用いられる医薬であっ
て、造血幹細胞、造血前駆細胞、成熟リンパ球又はそれ
ら混合物を含む寛容原を有効成分とする門脈内投与用の
第１医薬組成物及び上記寛容原を有効成分とする静脈内
投与用の第２医薬組成物からなることを特徴とする免疫
寛容誘導剤。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、臓器移植、より詳
しくは移植臓器の維持を可能とする免疫寛容を達成でき
る免疫寛容誘導剤に関する。
しくは移植臓器の維持を可能とする免疫寛容を達成でき
る免疫寛容誘導剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】臓器移植にとり、免疫抑制剤は不可欠の
存在となっており、目下、次々と新たな免疫抑制剤が開
発されている。かかる免疫抑制剤は、その使用目的（用
途）から、２つに分けられる。一つは、予防的に拒絶反
応を抑制する目的で、連日、移植臓器が体内にある限り
服用され続けるものであり、維持免疫抑制剤、予防的免
疫抑制剤、基礎的免疫抑制剤等と呼ばれる。他方は維持
免疫抑制をしているにも拘わらず発症する拒絶反応、主
として細胞性拒絶反応を治療する目的で、短期間ではあ
るが、大量且つ強力に免疫抑制を行うのに用いられるも
のであり、拒絶反応治療剤等と呼ばれる。
存在となっており、目下、次々と新たな免疫抑制剤が開
発されている。かかる免疫抑制剤は、その使用目的（用
途）から、２つに分けられる。一つは、予防的に拒絶反
応を抑制する目的で、連日、移植臓器が体内にある限り
服用され続けるものであり、維持免疫抑制剤、予防的免
疫抑制剤、基礎的免疫抑制剤等と呼ばれる。他方は維持
免疫抑制をしているにも拘わらず発症する拒絶反応、主
として細胞性拒絶反応を治療する目的で、短期間ではあ
るが、大量且つ強力に免疫抑制を行うのに用いられるも
のであり、拒絶反応治療剤等と呼ばれる。
【０００３】しかしながら、之等の免疫抑制剤は、その
主作用、副作用のいずれもが人体にとり無害とはいえ
ず、その長期投与による維持や大量投与等を必要とする
ため、いずれも無視できないかなりの毒性乃至副作用を
伴う。また、免疫抑制剤の単独投与では充分な免疫抑制
効果を奏し得ず、発症した拒絶反応を高率に治療するこ
とができるものではない。
主作用、副作用のいずれもが人体にとり無害とはいえ
ず、その長期投与による維持や大量投与等を必要とする
ため、いずれも無視できないかなりの毒性乃至副作用を
伴う。また、免疫抑制剤の単独投与では充分な免疫抑制
効果を奏し得ず、発症した拒絶反応を高率に治療するこ
とができるものではない。
【０００４】一方、臨床的に、免疫抑制剤の投与がなさ
れていなかったにも拘わらず、移植臓器が無事に維持さ
れる報告が散見されており、これは免疫寛容状態が誘導
されたためと考えられている。かかる免疫寛容の成立に
よれば、上記免疫抑制剤の投与は不要となり、従って、
人為的に免疫寛容を誘導することが臓器移植における最
終目標として注目され、これについて種々の研究成果が
報告されている。
れていなかったにも拘わらず、移植臓器が無事に維持さ
れる報告が散見されており、これは免疫寛容状態が誘導
されたためと考えられている。かかる免疫寛容の成立に
よれば、上記免疫抑制剤の投与は不要となり、従って、
人為的に免疫寛容を誘導することが臓器移植における最
終目標として注目され、これについて種々の研究成果が
報告されている。
【０００５】かかる人為的な免疫寛容誘導方法として
は、例えば、以下の報告が参照される。
は、例えば、以下の報告が参照される。
【０００６】脾臓細胞や骨髄細胞の寛容原（toleroge
n）移入と抗有糸分裂剤（antimitoticdrug）との併用に
よる寛容誘導〔Fukuoka acta Med., 81(1), 20-40 (199
0); Microbiol. Immunol., 32(3), 283-292 (1988)
等〕。ここで、抗有糸分裂剤としては、６−メルカプト
プリン（6-mercaptopurine）、メソトレキセート（meth
otrexate）、サイクロホスファマイド（cyclophosphami
de, CP）、５−フルオロウラシル（5-fluorouracil）、
アザチオプリン（azathioprine, AZP）及びプロカルバ
ジン（procarbazine）等が挙げられ、シクロスポリンＡ
（ciclosporin A, CsA）やステロイド類は、之等抗有糸
分裂剤とは作用機構が顕著に相違することから、免疫寛
容の誘導には適さないものとされている。
n）移入と抗有糸分裂剤（antimitoticdrug）との併用に
よる寛容誘導〔Fukuoka acta Med., 81(1), 20-40 (199
0); Microbiol. Immunol., 32(3), 283-292 (1988)
等〕。ここで、抗有糸分裂剤としては、６−メルカプト
プリン（6-mercaptopurine）、メソトレキセート（meth
otrexate）、サイクロホスファマイド（cyclophosphami
de, CP）、５−フルオロウラシル（5-fluorouracil）、
アザチオプリン（azathioprine, AZP）及びプロカルバ
ジン（procarbazine）等が挙げられ、シクロスポリンＡ
（ciclosporin A, CsA）やステロイド類は、之等抗有糸
分裂剤とは作用機構が顕著に相違することから、免疫寛
容の誘導には適さないものとされている。
【０００７】早川らは、ＦＫ５０６を用いてドナー特異
的な免疫抑制状態を誘導する試みを報告している〔慶応
医学、72(3), 163-176 (1995)〕。同様に、村松らは、
１５−ＤＳＧによる免疫寛容導入の可能性について報告
している〔第20回日本マイクロサージャリー学会抄録、
89-90頁 (1994)〕。
的な免疫抑制状態を誘導する試みを報告している〔慶応
医学、72(3), 163-176 (1995)〕。同様に、村松らは、
１５−ＤＳＧによる免疫寛容導入の可能性について報告
している〔第20回日本マイクロサージャリー学会抄録、
89-90頁 (1994)〕。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、臓器
移植において所望の免疫寛容を達成させる（成立させ
る）技術を提供することにある。即ち、現在の免疫抑制
剤による維持（免疫抑制剤の長期投与）を必要とせず、
従ってこれに伴われる重大な副作用等を確実に回避で
き、且つ移植臓器の維持を可能とする新しい技術を提供
することにある。
移植において所望の免疫寛容を達成させる（成立させ
る）技術を提供することにある。即ち、現在の免疫抑制
剤による維持（免疫抑制剤の長期投与）を必要とせず、
従ってこれに伴われる重大な副作用等を確実に回避で
き、且つ移植臓器の維持を可能とする新しい技術を提供
することにある。
【０００９】本発明者らは鋭意研究の結果、下記構成の
医薬品が上記目的に合致することを見出し、ここに本発
明を完成するに至った。
医薬品が上記目的に合致することを見出し、ここに本発
明を完成するに至った。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、免疫寛
容の誘導に用いられる医薬であって、造血幹細胞、造血
前駆細胞、成熟リンパ球又はそれら混合物を含む寛容原
を有効成分とする門脈内投与用の第１医薬組成物及び上
記寛容原を有効成分とする静脈内投与用の第２医薬組成
物からなることを特徴とする免疫寛容誘導剤、特に骨髄
細胞を寛容原とする上記の免疫寛容誘導剤が提供され
る。
容の誘導に用いられる医薬であって、造血幹細胞、造血
前駆細胞、成熟リンパ球又はそれら混合物を含む寛容原
を有効成分とする門脈内投与用の第１医薬組成物及び上
記寛容原を有効成分とする静脈内投与用の第２医薬組成
物からなることを特徴とする免疫寛容誘導剤、特に骨髄
細胞を寛容原とする上記の免疫寛容誘導剤が提供され
る。
【００１１】本発明誘導剤の利用によれば、前述した目
的に合致する所望の免疫寛容を達成でき、臓器移植にお
ける移植臓器の良好な維持が可能となる。
的に合致する所望の免疫寛容を達成でき、臓器移植にお
ける移植臓器の良好な維持が可能となる。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明免疫寛容誘導剤は、上記の
通り、門脈内投与用の第１の医薬組成物と静脈内投与用
の第２の医薬組成物との両者を必須とし、その限りにお
いて、それら組成物の医薬形態や使用に供する形態等に
は特に制限はない。
通り、門脈内投与用の第１の医薬組成物と静脈内投与用
の第２の医薬組成物との両者を必須とし、その限りにお
いて、それら組成物の医薬形態や使用に供する形態等に
は特に制限はない。
【００１３】例えば上記第１及び第２の医薬組成物は、
一つの医薬形態中に含ませることができ、或いは所望に
より、それらを別途の医薬形態として分けておくことも
できる。即ち、後述する本発明医薬の使用例に代表され
るように、所望の免疫寛容を達成するという本発明の効
果が奏される限りにおいて、その医薬形態や使用に供す
る形態等には特に制限はない。
一つの医薬形態中に含ませることができ、或いは所望に
より、それらを別途の医薬形態として分けておくことも
できる。即ち、後述する本発明医薬の使用例に代表され
るように、所望の免疫寛容を達成するという本発明の効
果が奏される限りにおいて、その医薬形態や使用に供す
る形態等には特に制限はない。
【００１４】本発明に係わる第１及び第２の医薬製剤に
おいて共通する有効成分である、造血幹細胞、造血前駆
細胞、成熟リンパ球又はそれら混合物を含む寛容原とし
ては、例えば移植臓器ドナー（マウスでは、ドナーと同
系）由来のものを挙げることができ、これは、それら細
胞を含む骨髄細胞、脾臓細胞、末梢血細胞又はそれらの
混合物であることができる。
おいて共通する有効成分である、造血幹細胞、造血前駆
細胞、成熟リンパ球又はそれら混合物を含む寛容原とし
ては、例えば移植臓器ドナー（マウスでは、ドナーと同
系）由来のものを挙げることができ、これは、それら細
胞を含む骨髄細胞、脾臓細胞、末梢血細胞又はそれらの
混合物であることができる。
【００１５】之等寛容原の分離及び単離は、公知の方法
に従うことができる。例えばマウスにおけるかかる方法
は「細胞免疫実験操作法」〔Mishell B. B., Shgi S.
M. 編、今井勝行、川口進、原田孝之供訳、理工学社、3
-12頁、1982年〕に記述されている。即ち、マウスをエ
ーテル麻酔下で屠殺し、７０％エタノールを用いて体表
面を消毒した後、右側腹を切開し、脾臓を無菌的に採取
し、これをＲＰＭＩ１６４０溶液（Nikken Bio Med. La
b.）中において２００ゲージのステンレススチールメッ
シュ上で無鈎ピンセットにてほぐし、単離脾臓細胞浮遊
液とする。単離脾臓細胞をＲＰＭＩ１６４０溶液にて１
回洗浄した後、トリス塩酸アンモニウム溶液（0.75% NH
4Cl, 0.017M Tris-HCl, pH 7.5）にて溶血し、ＲＰＭＩ
１６４０溶液にて更に２回洗浄した後、同溶液中に調製
する。また、骨髄細胞の採取、調製は、例えばマウスを
エーテル麻酔下で屠殺し、７０％エタノールを用いて体
表面を消毒した後、両脚の皮膚を剥ぎ、筋肉をつけたま
ま体幹より分離し、鋏でおおよその筋肉を切り取った
後、滅菌ガーゼで関節包及び筋肉を完全に取り除き、大
腿骨及び脛骨のそれぞれに、膝関節側よりシリンジ（2.
5ml, Code No. SS-02S,Terumo Co., Ltd）につけた２２
ゲージ針（Code No. NN-2225R, Terumo Co., Ltd）を刺
入し、シリンジ中のＲＰＭＩ１６４０溶液にて骨髄細胞
を滅菌シャーレ（90×15mm, Iwaki Clinical Test War
e）へ押し流し、ＲＰＭＩ１６４０溶液中に調製するこ
とにより実施できる。
に従うことができる。例えばマウスにおけるかかる方法
は「細胞免疫実験操作法」〔Mishell B. B., Shgi S.
M. 編、今井勝行、川口進、原田孝之供訳、理工学社、3
-12頁、1982年〕に記述されている。即ち、マウスをエ
ーテル麻酔下で屠殺し、７０％エタノールを用いて体表
面を消毒した後、右側腹を切開し、脾臓を無菌的に採取
し、これをＲＰＭＩ１６４０溶液（Nikken Bio Med. La
b.）中において２００ゲージのステンレススチールメッ
シュ上で無鈎ピンセットにてほぐし、単離脾臓細胞浮遊
液とする。単離脾臓細胞をＲＰＭＩ１６４０溶液にて１
回洗浄した後、トリス塩酸アンモニウム溶液（0.75% NH
4Cl, 0.017M Tris-HCl, pH 7.5）にて溶血し、ＲＰＭＩ
１６４０溶液にて更に２回洗浄した後、同溶液中に調製
する。また、骨髄細胞の採取、調製は、例えばマウスを
エーテル麻酔下で屠殺し、７０％エタノールを用いて体
表面を消毒した後、両脚の皮膚を剥ぎ、筋肉をつけたま
ま体幹より分離し、鋏でおおよその筋肉を切り取った
後、滅菌ガーゼで関節包及び筋肉を完全に取り除き、大
腿骨及び脛骨のそれぞれに、膝関節側よりシリンジ（2.
5ml, Code No. SS-02S,Terumo Co., Ltd）につけた２２
ゲージ針（Code No. NN-2225R, Terumo Co., Ltd）を刺
入し、シリンジ中のＲＰＭＩ１６４０溶液にて骨髄細胞
を滅菌シャーレ（90×15mm, Iwaki Clinical Test War
e）へ押し流し、ＲＰＭＩ１６４０溶液中に調製するこ
とにより実施できる。
【００１６】移植臓器ドナー（ヒト）からの寛容原とし
ては、骨髄細胞及び末梢血細胞の利用を好適に例示で
き、それら細胞の取得は当業者に周知である。例えば、
骨髄細胞の利用に際しては、骨髄移植における場合に準
ずることができる。
ては、骨髄細胞及び末梢血細胞の利用を好適に例示で
き、それら細胞の取得は当業者に周知である。例えば、
骨髄細胞の利用に際しては、骨髄移植における場合に準
ずることができる。
【００１７】上記第１医薬製剤としては、造血前駆細胞
を多く含む骨髄細胞、成熟リンパ球（活性化リンパ球を
除く）を含む脾臓細胞、同末梢血細胞又はそれらの混合
物からなる寛容原の利用が好ましく、一方、第２医薬製
剤としては、上記骨髄細胞からなる寛容原の利用が望ま
しい。尚、上記第１及び第２医薬製剤の両者における有
効成分として、骨髄細胞の利用が好ましいが、例えばＧ
−ＣＳＦ等のサイトカインで骨髄より動員される造血幹
細胞を含む末梢血細胞は、成熟リンパ球及び造血前駆細
胞の両者要素を含むことより、また細胞の入手が容易で
ある点より、同様に好ましい有効成分として例示でき
る。
を多く含む骨髄細胞、成熟リンパ球（活性化リンパ球を
除く）を含む脾臓細胞、同末梢血細胞又はそれらの混合
物からなる寛容原の利用が好ましく、一方、第２医薬製
剤としては、上記骨髄細胞からなる寛容原の利用が望ま
しい。尚、上記第１及び第２医薬製剤の両者における有
効成分として、骨髄細胞の利用が好ましいが、例えばＧ
−ＣＳＦ等のサイトカインで骨髄より動員される造血幹
細胞を含む末梢血細胞は、成熟リンパ球及び造血前駆細
胞の両者要素を含むことより、また細胞の入手が容易で
ある点より、同様に好ましい有効成分として例示でき
る。
【００１８】第１及び第２の医薬製剤において、かかる
有効成分は、通常この種の細胞成分からなる各種医薬製
剤と同様にして、一般的な医薬製剤形態に調製すること
ができる。かかる医薬製剤としては、各種の形態が所望
により選択でき、その代表的なものとしては注射剤を例
示することができる。之等の医薬製剤形態への調製に際
し使用される薬学的に許容される各種の担体としても、
この分野で従来よりよく知られているものを広く利用す
ることができ、その調製も常法に従うことができる。之
等の製剤の調製に際しては、現在汎用されている各種の
輸液用製剤の利用も可能である。
有効成分は、通常この種の細胞成分からなる各種医薬製
剤と同様にして、一般的な医薬製剤形態に調製すること
ができる。かかる医薬製剤としては、各種の形態が所望
により選択でき、その代表的なものとしては注射剤を例
示することができる。之等の医薬製剤形態への調製に際
し使用される薬学的に許容される各種の担体としても、
この分野で従来よりよく知られているものを広く利用す
ることができ、その調製も常法に従うことができる。之
等の製剤の調製に際しては、現在汎用されている各種の
輸液用製剤の利用も可能である。
【００１９】尚、本発明において上記医薬製剤は、移植
に際して移植臓器ドナーより用時調製することもでき
る。
に際して移植臓器ドナーより用時調製することもでき
る。
【００２０】本発明における第１及び第２の医薬製剤に
おいて、第１医薬製剤は門脈内投与を必須とし、第２医
薬製剤は静脈内投与を必須とする。代表的な投与の態様
を例示すれば、まず第１医薬製剤を門脈内投与し、その
後第２医薬製剤を静脈内投与する。この第２の静脈内投
与は、第１の門脈内投与後、脾細胞のリンパ球混合反応
において宿主細胞のドナーのアロ抗原に対する反応性が
最小となった（例えばマウスでは約４日目）後、再び上
がりかけた時期（マウスでは５日目）に行われるのがよ
い。
おいて、第１医薬製剤は門脈内投与を必須とし、第２医
薬製剤は静脈内投与を必須とする。代表的な投与の態様
を例示すれば、まず第１医薬製剤を門脈内投与し、その
後第２医薬製剤を静脈内投与する。この第２の静脈内投
与は、第１の門脈内投与後、脾細胞のリンパ球混合反応
において宿主細胞のドナーのアロ抗原に対する反応性が
最小となった（例えばマウスでは約４日目）後、再び上
がりかけた時期（マウスでは５日目）に行われるのがよ
い。
【００２１】第１医薬製剤の門脈内投与量は、門脈内投
与後のリンパ球混合反応でドナーのアロ抗原に対する反
応性が最小（反応抑制が最大）となる時期において、反
応抑制度がプラトーに達するための最小用量（マウスで
は３×１０7個）を目安とするのが適当であり、また、
第２医薬製剤の静脈内投与量は、通常の主要組織適合遺
伝子複合体（ＭＨＣ）不適合の骨髄移植（マウスでは致
死量の放射線照射後）において、宿主の免疫系を再構築
するのに充分な量（マウスでは３×１０7個）を目安と
することができる。
与後のリンパ球混合反応でドナーのアロ抗原に対する反
応性が最小（反応抑制が最大）となる時期において、反
応抑制度がプラトーに達するための最小用量（マウスで
は３×１０7個）を目安とするのが適当であり、また、
第２医薬製剤の静脈内投与量は、通常の主要組織適合遺
伝子複合体（ＭＨＣ）不適合の骨髄移植（マウスでは致
死量の放射線照射後）において、宿主の免疫系を再構築
するのに充分な量（マウスでは３×１０7個）を目安と
することができる。
【００２２】尚、上記において、脾細胞のリンパ球混合
反応試験は、常法に従い実施することができ〔前記「細
胞免疫実験操作法」、147-149頁、1982年〕、また、ヒ
トにおける門脈内及び静脈内投与量は、通常の骨髄移植
におけるそれに準ずることができる。例えば、骨髄細胞
として、３×１０8個／ｋｇ程度或はそれ以上の投与量
を例示することができる。
反応試験は、常法に従い実施することができ〔前記「細
胞免疫実験操作法」、147-149頁、1982年〕、また、ヒ
トにおける門脈内及び静脈内投与量は、通常の骨髄移植
におけるそれに準ずることができる。例えば、骨髄細胞
として、３×１０8個／ｋｇ程度或はそれ以上の投与量
を例示することができる。
【００２３】かくして、本発明の第１医薬製剤の門脈か
らの投与に続く本発明の第２医薬製剤の静脈からの投与
からなる処置によって、所望の免疫寛容が誘導され、移
植臓器の良好な維持が可能となる。
らの投与に続く本発明の第２医薬製剤の静脈からの投与
からなる処置によって、所望の免疫寛容が誘導され、移
植臓器の良好な維持が可能となる。
【００２４】本発明の処置によれば、所望の免疫寛容が
誘導され移植臓器の良好な維持が可能となるが、これ
は、移植臓器の移植術施行の時期に関係なく奏効を示
す。従って、当該移植術は、本発明処置と平行して或は
本発明処置による免疫寛容が達成された後のいずれにも
良好に行うことができる。
誘導され移植臓器の良好な維持が可能となるが、これ
は、移植臓器の移植術施行の時期に関係なく奏効を示
す。従って、当該移植術は、本発明処置と平行して或は
本発明処置による免疫寛容が達成された後のいずれにも
良好に行うことができる。
【００２５】尚、本発明に係わる免疫寛容の誘導に際し
ては、本発明の効果が害されない限りにおいて、通常こ
の種の処置に際して利用されることの知られている各種
の医療処置や他の医薬製剤の投与等を併用することもで
きる。その例としては、前述した免疫寛容の誘導に使用
されている各種の免疫抑制剤の併用、特には、第１医薬
製剤の門脈内投与後の短期的な、例えば門脈内投与後２
日目程度と５日目程度の１乃至２回の免疫抑制剤の併用
を例示することができる。ここで、用い得る免疫抑制剤
としては、代表的には、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６
等を例示でき、その併用量、用法等は既知の市販品のそ
れらに従うことができる。
ては、本発明の効果が害されない限りにおいて、通常こ
の種の処置に際して利用されることの知られている各種
の医療処置や他の医薬製剤の投与等を併用することもで
きる。その例としては、前述した免疫寛容の誘導に使用
されている各種の免疫抑制剤の併用、特には、第１医薬
製剤の門脈内投与後の短期的な、例えば門脈内投与後２
日目程度と５日目程度の１乃至２回の免疫抑制剤の併用
を例示することができる。ここで、用い得る免疫抑制剤
としては、代表的には、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６
等を例示でき、その併用量、用法等は既知の市販品のそ
れらに従うことができる。
【００２６】
【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため、本
発明有効成分につき行われた試験例を挙げる。
発明有効成分につき行われた試験例を挙げる。
【００２７】
【試験例１】以下の試験例における免疫寛容誘導は、
(1)異系ドナーの脾細胞又は骨髄細胞の門脈内注射及び
(2)異系ドナーの骨髄細胞の静脈内注射によって行い、
免疫寛容成立は、拒絶反応を最も受けやすい臓器である
皮膚（ドナーと同系）の移植による生着の程度を観察し
てその指標とした。
(1)異系ドナーの脾細胞又は骨髄細胞の門脈内注射及び
(2)異系ドナーの骨髄細胞の静脈内注射によって行い、
免疫寛容成立は、拒絶反応を最も受けやすい臓器である
皮膚（ドナーと同系）の移植による生着の程度を観察し
てその指標とした。
【００２８】（１）脾細胞浮遊液の調製 ８週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃＣｒＳｌｃマウス（体重19-22
ｇ, BALB/c; Japan SLCInc.）より脾細胞を採取し、Ｒ
ＰＭＩ１６４０溶液（Nikken Bio Med. Lab.）中におい
て２００ゲージのステンレススチールメッシュ上で無鈎
ピンセットにてほぐし、単離脾臓細胞を得た。これをＲ
ＰＭＩ１６４０溶液にて１回洗浄後、トリス塩酸アンモ
ニウム溶液（0.75% NH4Cl, 0.017M Tris-HCl, pH 7.5）
にて溶血し、ＲＰＭＩ１６４０溶液にて更に２回洗浄し
た後、同液中に脾細胞を浮遊させて脾細胞浮遊液（1.5
×108/ml濃度）を調製した。
ｇ, BALB/c; Japan SLCInc.）より脾細胞を採取し、Ｒ
ＰＭＩ１６４０溶液（Nikken Bio Med. Lab.）中におい
て２００ゲージのステンレススチールメッシュ上で無鈎
ピンセットにてほぐし、単離脾臓細胞を得た。これをＲ
ＰＭＩ１６４０溶液にて１回洗浄後、トリス塩酸アンモ
ニウム溶液（0.75% NH4Cl, 0.017M Tris-HCl, pH 7.5）
にて溶血し、ＲＰＭＩ１６４０溶液にて更に２回洗浄し
た後、同液中に脾細胞を浮遊させて脾細胞浮遊液（1.5
×108/ml濃度）を調製した。
【００２９】（２）骨髄細胞浮遊液の調製 ８週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスより大腿骨及び脛骨を取
り外し、それぞれ、膝関節側よりシリンジ（2.5ml, Cod
e No. SS-02S, Terumo Co., Ltd.）につけた２２ゲージ
針（Code No. NN-2225R, Terumo Co., Ltd.）を刺入
し、シリンジ中のＲＰＭＩ１６４０溶液にて骨髄細胞を
滅菌シャーレ（90×15mm, Iwaki ClinicalTest Ware）
へ押し流した後、ＲＰＭＩ１６４０溶液中に懸濁させ、
得られる骨髄細胞をＲＰＭＩ１６４０溶液にて１回洗浄
後、同溶液中に浮遊させて所望の骨髄細胞浮遊液（1.5
×108/ml濃度）を調製した。
り外し、それぞれ、膝関節側よりシリンジ（2.5ml, Cod
e No. SS-02S, Terumo Co., Ltd.）につけた２２ゲージ
針（Code No. NN-2225R, Terumo Co., Ltd.）を刺入
し、シリンジ中のＲＰＭＩ１６４０溶液にて骨髄細胞を
滅菌シャーレ（90×15mm, Iwaki ClinicalTest Ware）
へ押し流した後、ＲＰＭＩ１６４０溶液中に懸濁させ、
得られる骨髄細胞をＲＰＭＩ１６４０溶液にて１回洗浄
後、同溶液中に浮遊させて所望の骨髄細胞浮遊液（1.5
×108/ml濃度）を調製した。
【００３０】（３）門脈内注射 １０週齢雌性Ｃ５７ＢＬ／６ＣｒＳｌｃマウス（体重20
-24ｇ, B6; Japan SLCInc.）をペントバルビタール（Pi
tman-Moor Inc.; 37.5mg/kg体重i.p.）麻酔下にて剃
毛、消毒し、腹部正中切開を行った後、腸間膜を露出さ
せ、１ｍｌ−ツベルクリン用シリンジにつけた２７ゲー
ジ針（Terumo Co., Ltd.）を腸間膜脂肪組織を経て刺入
させ、前記（１）で調製したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細
胞又は骨髄細胞の３×１０7個（浮遊液 0.2ml）を門脈
内に注射投与した。
-24ｇ, B6; Japan SLCInc.）をペントバルビタール（Pi
tman-Moor Inc.; 37.5mg/kg体重i.p.）麻酔下にて剃
毛、消毒し、腹部正中切開を行った後、腸間膜を露出さ
せ、１ｍｌ−ツベルクリン用シリンジにつけた２７ゲー
ジ針（Terumo Co., Ltd.）を腸間膜脂肪組織を経て刺入
させ、前記（１）で調製したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細
胞又は骨髄細胞の３×１０7個（浮遊液 0.2ml）を門脈
内に注射投与した。
【００３１】（４）静脈内注射 前記（１）で得た骨髄細胞浮遊液を１×１０8/ｍｌ濃度
に調整し、その３×１０7個（0.3ml)を、上記（３）の
門脈内注射後５日目に、宿主マウスの尾静脈より注射投
与した。
に調整し、その３×１０7個（0.3ml)を、上記（３）の
門脈内注射後５日目に、宿主マウスの尾静脈より注射投
与した。
【００３２】（５）皮膚移植 門脈内注射後７日目に皮膚移植を行った。皮膚移植片の
調整及び移植方法は、文献記載の方法〔Mayumi et al.,
Jpn. J. Surg., 18, 548-557 (1988)〕を参照して、以
下の通り行った。
調整及び移植方法は、文献記載の方法〔Mayumi et al.,
Jpn. J. Surg., 18, 548-557 (1988)〕を参照して、以
下の通り行った。
【００３３】即ち、８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスをドナー
として、エチルエーテル（NacalaiTesque Inc.）麻酔下
で屠殺した。除毛剤（Feather Hair Remover, Feather
Safty Razor Co., Ltd.）にて全身の体毛を除去し、７
０％アルコール溶液にて除菌した後、皮膚全層を剥離採
取した。ピンセット（先曲がり先細無鈎）及び滅菌綿棒
を用いて可及的に皮下脂肪組織を剥離した後、皮膚片
（1.2×1.5cm四方）に細切し、頭側の一辺にマーカーと
して１ｍｍの切開を加え、冷却した無菌のリン酸緩衝食
塩水（Dulbecco's PBS(-), Nissui Pharmaceutical C
o., Ltd.）中に浮遊させた。
として、エチルエーテル（NacalaiTesque Inc.）麻酔下
で屠殺した。除毛剤（Feather Hair Remover, Feather
Safty Razor Co., Ltd.）にて全身の体毛を除去し、７
０％アルコール溶液にて除菌した後、皮膚全層を剥離採
取した。ピンセット（先曲がり先細無鈎）及び滅菌綿棒
を用いて可及的に皮下脂肪組織を剥離した後、皮膚片
（1.2×1.5cm四方）に細切し、頭側の一辺にマーカーと
して１ｍｍの切開を加え、冷却した無菌のリン酸緩衝食
塩水（Dulbecco's PBS(-), Nissui Pharmaceutical C
o., Ltd.）中に浮遊させた。
【００３４】Ｂ６宿主マウスをペントバルビタール（3
7.5mg/kg体重i.p.）で麻酔した後、右背側部を手指によ
る抜毛及び前記除毛剤により除毛（3.0×3.5cm四方）
し、７０％アルコール溶液にて除菌して移植のための術
野を作製した。
7.5mg/kg体重i.p.）で麻酔した後、右背側部を手指によ
る抜毛及び前記除毛剤により除毛（3.0×3.5cm四方）
し、７０％アルコール溶液にて除菌して移植のための術
野を作製した。
【００３５】剥離面に上記調製したＢＡＬＢ／ｃの皮膚
片をマーカーを尾部に向けて設置し、６-０針付きナイ
ロン縫合糸（Ethilon; Ethicon Inc.）にて８針（４辺
の中央と４角）を縫合した。皮膚移植面を硫酸フラジオ
マイシン軟膏付きガーゼ（2.0×2.5cm四方, Sofratull
e; Japan Roussel Co., Ltd.）で覆い、更に粘着性伸縮
包帯（Elatex; Alcare Co., Lrd.）で巻いた。
片をマーカーを尾部に向けて設置し、６-０針付きナイ
ロン縫合糸（Ethilon; Ethicon Inc.）にて８針（４辺
の中央と４角）を縫合した。皮膚移植面を硫酸フラジオ
マイシン軟膏付きガーゼ（2.0×2.5cm四方, Sofratull
e; Japan Roussel Co., Ltd.）で覆い、更に粘着性伸縮
包帯（Elatex; Alcare Co., Lrd.）で巻いた。
【００３６】皮膚移植生着の有無は、移植後２週間目よ
りの観察を行った。
りの観察を行った。
【００３７】（６）結果 結果を下記表１に示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】（７）結果の説明と考察 試験群１：ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞を１０匹のＭＨ
Ｃが不適合であるＢ６マウスの門脈内に注射後、５日目
にＢＡＬＢ／ｃマウスの骨髄細胞を静脈内注射し、７日
目に皮膚移植を行った結果、移植後３６週目の時点で１
０匹中１０匹のマウスで皮膚移植片が生着した。
Ｃが不適合であるＢ６マウスの門脈内に注射後、５日目
にＢＡＬＢ／ｃマウスの骨髄細胞を静脈内注射し、７日
目に皮膚移植を行った結果、移植後３６週目の時点で１
０匹中１０匹のマウスで皮膚移植片が生着した。
【００４０】試験群２：ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞を
５匹のＢ６マウスの門脈内に注射後、５日目にＢＡＬＢ
／ｃマウスの脾細胞を静脈内注射し、７日目に皮膚移植
を行った結果、移植後１８週目の時点で５匹中１匹のマ
ウスで移植片が生着したが、６週目で１匹、７週目で３
匹のマウスで皮膚移植片が拒絶された（脱落した）。
５匹のＢ６マウスの門脈内に注射後、５日目にＢＡＬＢ
／ｃマウスの脾細胞を静脈内注射し、７日目に皮膚移植
を行った結果、移植後１８週目の時点で５匹中１匹のマ
ウスで移植片が生着したが、６週目で１匹、７週目で３
匹のマウスで皮膚移植片が拒絶された（脱落した）。
【００４１】試験群３：ＢＡＬＢ／ｃマウスの骨髄細胞
を６匹のＢ６マウスの門脈内に注射後、５日目にＢＡＬ
Ｂ／ｃマウスの骨髄細胞を静脈内注射し、７日目に皮膚
移植を行った結果、移植後３６週目の時点で６匹中４匹
のマウスで皮膚移植片が生着した。
を６匹のＢ６マウスの門脈内に注射後、５日目にＢＡＬ
Ｂ／ｃマウスの骨髄細胞を静脈内注射し、７日目に皮膚
移植を行った結果、移植後３６週目の時点で６匹中４匹
のマウスで皮膚移植片が生着した。
【００４２】対照群１：ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞を
４匹のＢ６マウスの門脈内に注射後、７日目に皮膚移植
を行った結果、移植後２週目で２匹のマウスで、また３
週目で残りの２匹のマウスで、皮膚移植片が拒絶された
（脱落した）。
４匹のＢ６マウスの門脈内に注射後、７日目に皮膚移植
を行った結果、移植後２週目で２匹のマウスで、また３
週目で残りの２匹のマウスで、皮膚移植片が拒絶された
（脱落した）。
【００４３】対照群２：ＢＡＬＢ／ｃマウスの骨髄細胞
を４匹のＢ６マウスの門脈内に注射後、７日目に皮膚移
植を行った結果、移植後２週目で２匹のマウスで、また
３週目で残りの２匹のマウスで皮膚移植片が拒絶され
た。
を４匹のＢ６マウスの門脈内に注射後、７日目に皮膚移
植を行った結果、移植後２週目で２匹のマウスで、また
３週目で残りの２匹のマウスで皮膚移植片が拒絶され
た。
【００４４】以上の結果から、第１医薬製剤の門脈内投
与後における第２医薬製剤の静脈内投与によれば、長期
に亘るドナー皮膚移植片の生着（ドナーのアロ抗原に特
異的な免疫寛容の維持）が行い得ることが判る。
与後における第２医薬製剤の静脈内投与によれば、長期
に亘るドナー皮膚移植片の生着（ドナーのアロ抗原に特
異的な免疫寛容の維持）が行い得ることが判る。
【００４５】尚、上記試験群３において、骨髄細胞の門
脈内投与（０日目）と静脈内投与（５日目）との間に、
免疫抑制剤を投与すれば、皮膚移植片の生着率の向上が
認められた。以下、このことを明らかにする試験例を挙
げる。
脈内投与（０日目）と静脈内投与（５日目）との間に、
免疫抑制剤を投与すれば、皮膚移植片の生着率の向上が
認められた。以下、このことを明らかにする試験例を挙
げる。
【００４６】
【試験例２】 （１）骨髄細胞の調製並びに門脈内及び静脈内注射 上記試験例１の（２）、（３）及び（４）と同様にし
た。
た。
【００４７】（２）免疫抑制剤の投与 免疫抑制剤としてシクロスポリンＡ（Ciclosporin A, C
s A: Sandimmun, 250mg/5ml溶液, Sandoz）１０ｍｇ／
ｋｇ体重もしくはＦＫ５０６（10mg/1ml溶液, Fujisawa
Pharmaceutical Co., Ltd.）１ｍｇ／ｋｇ体重を、門
脈内注射後２日目と５日目に腹腔内注射した。
s A: Sandimmun, 250mg/5ml溶液, Sandoz）１０ｍｇ／
ｋｇ体重もしくはＦＫ５０６（10mg/1ml溶液, Fujisawa
Pharmaceutical Co., Ltd.）１ｍｇ／ｋｇ体重を、門
脈内注射後２日目と５日目に腹腔内注射した。
【００４８】（３）皮膚移植 試験例１の（５）と同様とした。
【００４９】（４）結果 結果を下記表２に示す。
【００５０】
【表２】
【００５１】（５）結果の説明と考察 試験群３及び対照群２については、試験例１に詳述した
通りである。
通りである。
【００５２】試験群４：ＢＡＬＢ／ｃマウスの骨髄細胞
を５匹のＢ６マウスの門脈内に注射後、２日目と５日目
にＣｓＡを投与し、更に５日目にＢＡＬＢ／ｃマウスの
骨髄細胞を静脈内注射し、７日目に皮膚移植を行った結
果、移植後６週目で１匹のマウスで皮膚移植片が拒絶さ
れたが、移植後３２週目の時点で５匹中４匹のマウスで
皮膚移植片が生着した。
を５匹のＢ６マウスの門脈内に注射後、２日目と５日目
にＣｓＡを投与し、更に５日目にＢＡＬＢ／ｃマウスの
骨髄細胞を静脈内注射し、７日目に皮膚移植を行った結
果、移植後６週目で１匹のマウスで皮膚移植片が拒絶さ
れたが、移植後３２週目の時点で５匹中４匹のマウスで
皮膚移植片が生着した。
【００５３】試験群５：ＢＡＬＢ／ｃマウスの骨髄細胞
を６匹のＢ６マウスの門脈内に注射後、２日目と５日目
にＦＫ５０６を投与し、更に５日目にＢＡＬＢ／ｃマウ
スの骨髄細胞を静脈内注射し、７日目に皮膚移植を行っ
た結果、移植後６週目で１匹のマウスで皮膚移植片が拒
絶されたが、移植後３０週目の時点で６匹中５匹のマウ
スで皮膚移植片が生着した。
を６匹のＢ６マウスの門脈内に注射後、２日目と５日目
にＦＫ５０６を投与し、更に５日目にＢＡＬＢ／ｃマウ
スの骨髄細胞を静脈内注射し、７日目に皮膚移植を行っ
た結果、移植後６週目で１匹のマウスで皮膚移植片が拒
絶されたが、移植後３０週目の時点で６匹中５匹のマウ
スで皮膚移植片が生着した。
【００５４】之等のことから、次のことが判る。即ち、
従来、ＣｓＡやＦＫ５０６等の免疫抑制剤は、寛容原と
併用して免疫寛容を誘導させるには適さないものとされ
てきたが、本発明に従う免疫誘導剤としての第１医薬製
剤の門脈内投与と第２医薬製剤の静脈内投与との組合せ
にこれを併用するときには、皮膚生着率の向上が認めら
れ、免疫寛容にも有効であることが判明した。
従来、ＣｓＡやＦＫ５０６等の免疫抑制剤は、寛容原と
併用して免疫寛容を誘導させるには適さないものとされ
てきたが、本発明に従う免疫誘導剤としての第１医薬製
剤の門脈内投与と第２医薬製剤の静脈内投与との組合せ
にこれを併用するときには、皮膚生着率の向上が認めら
れ、免疫寛容にも有効であることが判明した。
【００５５】以上のように本発明によれば、臨床的応用
が充分に期待できる新しい免疫寛容誘導技術を提供でき
る。
が充分に期待できる新しい免疫寛容誘導技術を提供でき
る。
【００５６】
【試験例３】 （１）骨髄細胞の調製並びに門脈内及び静脈内注射 上記試験例１の（２）、（３）及び（４）と同様にし
た。
た。
【００５７】（２）免疫抑制剤の投与 ＣｓＡの１０ｍｇ／ｋｇ体重を門脈内注射後、２日目と
５日目に腹腔内注射した。
５日目に腹腔内注射した。
【００５８】（３）皮膚移植 門脈内注射と同日に皮膚移植を実施した以外は、上記試
験例１の（５）と同様に行った（ｎ＝６）。尚、対照と
してＣ３Ｈマウス皮膚片を使用した群をおいた（ｎ＝
４）。
験例１の（５）と同様に行った（ｎ＝６）。尚、対照と
してＣ３Ｈマウス皮膚片を使用した群をおいた（ｎ＝
４）。
【００５９】（４）結果 結果を図１に示す。
【００６０】同図において、縦軸は皮膚移植生着率
（％）を、横軸は皮膚移植からの経過時間（週）を、グ
ループ１は試験群を、グループ２は対照群をそれぞれ示
す。
（％）を、横軸は皮膚移植からの経過時間（週）を、グ
ループ１は試験群を、グループ２は対照群をそれぞれ示
す。
【００６１】この試験例の結果により、第１医薬製剤の
門脈内投与による免疫寛容誘導の操作と臓器移植とを同
時に行うことが可能であることが判明した。それ故、ヒ
トの場合、脳死ドナーからの第１医薬製剤（骨髄細胞
等）の門脈内投与と臓器移植が同時に実施可能となる。
この方法は、骨髄中のＴ細胞を除去しなくても移植片対
宿主反応（ＧｖＨＲ）も発症せず、免疫抑制剤も２回の
投与で長期間の免疫寛容が可能となり、画期的な方法と
考える。
門脈内投与による免疫寛容誘導の操作と臓器移植とを同
時に行うことが可能であることが判明した。それ故、ヒ
トの場合、脳死ドナーからの第１医薬製剤（骨髄細胞
等）の門脈内投与と臓器移植が同時に実施可能となる。
この方法は、骨髄中のＴ細胞を除去しなくても移植片対
宿主反応（ＧｖＨＲ）も発症せず、免疫抑制剤も２回の
投与で長期間の免疫寛容が可能となり、画期的な方法と
考える。
【００６２】
【製剤例１】骨髄細胞又は脾細胞を生理食塩水に懸濁し
て、１×１０8細胞／ｍｌの門脈投与用製剤を調製す
る。一方、骨髄細胞１×１０8細胞／ｍｌ生理食塩水の
静脈投与用製剤を同様に調製する。
て、１×１０8細胞／ｍｌの門脈投与用製剤を調製す
る。一方、骨髄細胞１×１０8細胞／ｍｌ生理食塩水の
静脈投与用製剤を同様に調製する。
【００６３】上記門脈投与用製剤は、ヒトの場合、通常
３×１０8細胞／ｋｇ以上の骨髄細胞（Ｔ細胞が混入し
ていても可）投与量で投与されるのが好ましい。
３×１０8細胞／ｋｇ以上の骨髄細胞（Ｔ細胞が混入し
ていても可）投与量で投与されるのが好ましい。
【図１】試験例３における皮膚移植生着の結果を示す図
面である。
面である。
フロントページの続き (72)発明者 山西 一也 徳島県徳島市大原町東千代ヶ丸19−139 (72)発明者 足立 正一 群馬県高崎市石原町3493−９
Claims (2)
- 【請求項１】 免疫寛容の誘導に用いられる医薬であっ
て、造血幹細胞、造血前駆細胞、成熟リンパ球又はそれ
ら混合物を含む寛容原を有効成分とする門脈内投与用の
第１医薬組成物及び上記寛容原を有効成分とする静脈内
投与用の第２医薬組成物からなることを特徴とする免疫
寛容誘導剤。 - 【請求項２】 骨髄細胞を寛容原とする請求項１記載の
免疫寛容誘導剤。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9155015A JPH10306027A (ja) | 1997-03-07 | 1997-06-12 | 免疫寛容誘導剤 |
| ES98905773T ES2270507T3 (es) | 1997-03-07 | 1998-03-04 | Inductores de inmunotolerancia. |
| PT98905773T PT972519E (pt) | 1997-03-07 | 1998-03-04 | Indutores de imunotolerância |
| DK98905773T DK0972519T3 (da) | 1997-03-07 | 1998-03-04 | Immuntolerance-inducere |
| DE69835591T DE69835591T2 (de) | 1997-03-07 | 1998-03-04 | Induktoren für immuntoleranz |
| US09/380,579 US20030091541A1 (en) | 1997-03-07 | 1998-03-04 | Method of inducing immunotolerance in an organ transplantation recipient |
| PCT/JP1998/000909 WO1998039016A1 (fr) | 1997-03-07 | 1998-03-04 | Inducteurs de tolerance immunitaire |
| AT98905773T ATE336257T1 (de) | 1997-03-07 | 1998-03-04 | Induktoren für immuntoleranz |
| EP98905773A EP0972519B1 (en) | 1997-03-07 | 1998-03-04 | Immune tolerance inducers |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5293097 | 1997-03-07 | ||
| JP9-52930 | 1997-03-07 | ||
| JP9155015A JPH10306027A (ja) | 1997-03-07 | 1997-06-12 | 免疫寛容誘導剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10306027A true JPH10306027A (ja) | 1998-11-17 |
Family
ID=26393598
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9155015A Withdrawn JPH10306027A (ja) | 1997-03-07 | 1997-06-12 | 免疫寛容誘導剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10306027A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7556801B2 (en) | 2000-11-03 | 2009-07-07 | Kourion Therapeutics Gmbh | Human cord blood derived unrestricted somatic stem cells (USSC) |
| EP3081226A1 (en) | 2015-04-14 | 2016-10-19 | Kyoto University | Agent for forming an immune-tolerant site and agent for attracting immunosuppressive cells |
-
1997
- 1997-06-12 JP JP9155015A patent/JPH10306027A/ja not_active Withdrawn
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7556801B2 (en) | 2000-11-03 | 2009-07-07 | Kourion Therapeutics Gmbh | Human cord blood derived unrestricted somatic stem cells (USSC) |
| US7560280B2 (en) | 2000-11-03 | 2009-07-14 | Kourion Therapeutics Gmbh | Human cord blood derived unrestricted somatic stem cells (USSC) |
| EP3081226A1 (en) | 2015-04-14 | 2016-10-19 | Kyoto University | Agent for forming an immune-tolerant site and agent for attracting immunosuppressive cells |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040512 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20071205 |
|
| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20080128 |