JP2001518934A

JP2001518934A - 移植部位としての骨髄

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Publication number: JP2001518934A
Application number: JP54594298A
Authority: JP
Inventors: ラスター，モーリス; ローゼンウォルド，リンゼイ
Original assignee: ラスター，モーリス; ローゼンウォルド，リンゼイ
Priority date: 1997-03-25
Filing date: 1998-03-25
Publication date: 2001-10-16
Also published as: EP0969775A4; CA2285178A1; AU744944B2; EP0969775A1; IL132078A0; US6463933B1; WO1998042270A1; AU6869298A

Abstract

(57)【要約】本発明は、哺乳動物の骨または骨髄に細胞を導入することによる細胞の培養方法に関する。本発明はまた、核酸、ベクター、タンパク質、医薬組成物などの生物学的に活性な物質を骨または骨髄に導入することによって前記物質を哺乳動物に送達する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称移植部位としての骨髄発明の背景発明の技術分野本発明は細胞を哺乳動物の骨もしくは骨髄に導入することによって培養する工程に関する。本発明はまた生物学的に活性な物質を骨もしくは骨髄に導入することによって哺乳動物に送達する方法にも関する。背景の考察骨髄(BM)は骨の皮質壁の間に存在する臓器である。幼児期および小児期においては全身の骨髄が造血に関与する。成人では造血は体軸骨格(頭蓋骨、胸骨/肋骨、椎体、腸骨稜)に限定される。 BMは循環系とのアクセスを提供し、さらに造血幹細胞および間質細胞を提供する。過去には、小児の救急蘇生法として静脈注射が容易に行い得ない場合には骨内注射が用いられた。このようなやり方は静脈とアクセスする器具類の改善に伴って廃れていった。その後、この骨内注射法は小児の外傷および火傷患者に再度用いられるようになった[(Evansら，Burns 21(7):552-3(1995);Hopkinsら，Jrnl of the Louisiana State Medical Society 142(3):31-2，1990)]。骨髄が免疫的に特別な部位であることは文献によって支持されている。Parami thiotisとCooperは、抗原を経験したＢリンパ球は、骨髄以外の場所から移動させた場合には免疫グロブリンを分泌するが、骨髄から移動させると自発的には免疫グロブリンを分泌しないことを示した。YokichiらはLPSに対する骨髄マクロファージの応答性は末梢マクロファージのそれよりも低いと発表した。この発表には骨髄マクロファージの応答性がLPS感作前においても低かったことも含まれている。Hirschらは結核に対するＴ細胞の応答におけるTGFβの免疫抑制効果について述べている。TGFβは骨に大量に含まれ、骨髄にも含まれている。これらの報告は、骨髄の微小環境が免疫抑制的であるとする理論と一致している。その他の研究では骨内注射の利用法として、実験サンプルを採取するため[(Or lowskiら，Annals of Emergency Medicine 18(12):1348-51(1989)]、および薬理学的活性化合物の注射のため[Cameronら，Jrnl of Emergency Medicine 7(2):12 3-7(1989);Neishら，Am J of Disease of Children 142(8):878-80(1988);Brick manら，Annals of Emergency Medicine 16(10):1141-4(1987)]の用法が示されている。そのような研究の一つでは、鎖骨内注射の流速を測定し、それは鎖骨下静脈の流速と統計学的に同程度であるが、腸骨稜では鎖骨下静脈の２倍の流速であることを見出した[Iwamaら，Jrnl of Medical Science 40(1):1-8(1994)]。体の中で免疫学的に特別な部位は、そのホストにとって異物となるものを導入するための場所として用いることができる。免疫学的に特別な性質はおそらく免疫抑制、免疫偏位(immune deviation)、または能動性免疫寛容の誘発のいずれかによって得られたものであろう。免疫学的に特別な部位の特徴としては血液組織関門の存在、TGFβなどのサイトカイン、ニューロペプチド、能動的に免疫寛容を誘発する抗原提示細胞の存在、ならびにその他の要因が挙げられる[(Streilin ，Science 270(5239)1158-9(1995)]。免疫学的に特別な部位は身体の特定のコンパートメントに発達し、そこでは外来異物とみなされる可能性のある組織が存在するので、免疫刺激がホストにとって有害となるかもしれない。これらの部位は次いで何らかの方法で免疫抑制および能動性免疫寛容を行う微小環境をつくり出すためにコンパートメント化される。免疫学的に特別な部位の１例としては妊娠子宮がある。胎盤と胎児とは母体にとって異物の組織であるが、これらの抗原は通常の条件下では拒絶されない。母体と胎児は胎盤と子宮の間にある洞様毛細血管を経由して結ばれている。妊娠期間中は母体の循環系に胎児の血液細胞が存在する。これらの細胞と胎児は、この異物組織のコンパートメント形成およびその組織と免疫学的に特別でないホストとの間のインターフェイスが弱体化していない限りは拒絶されない。そのコンパートメントが完全な形で残っている限りは、その微小環境はTGFβなどの局所性増殖因子、Fas-リガンドの存在、およびACAID(前眼房関連免疫偏在anterio cham ber associated immune deviation)を経由する免疫抑制の助けとなる。子宮から胎盤が分離されるときに起こるように、ひとたびそのコンパートメントが破られると免疫的に特別な状態は破られ、母体は胎児に対する免疫応答を開始するが、それはRh陽性の胎児を持つRh陰性の母体に起こる状況である。Rh陽性の胎児での第1回目の妊娠ではRh抗原に対する免疫応答は起こらない。出産後にコンパートメントが破られ、もしRhogam(抗Dヒト免疫グロブリン製剤)が投与されなければ、母体はRh抗原に対して永久的に応答することとなり、その結果として次のRh陽性胎児を攻撃することとなる可能性がある[(Tafuriら，Science 270: 630(1995)]。上述したとおり、免疫学的に特別な部位は独立した「微小環境」として存在しうる。抗原が存在している微小環境がその抗原に対するホストの応答を決定づける。免疫の表現型は、リンパ球が通過する、またはある期間とどまる環境の範囲によって変わってくる[Doherty，J．Immunol．155(3):1023-7(1995)]。今日までのところ、骨髄の使用は主として造血系の移植に用いるための骨髄由来細胞の使用に限定されている。しかし、1968年にFonkalsrudは骨髄腔を同種皮膚移植のための免疫学的に特別な部位として用いることの可能性を述べている(S urgery，Gynecology & Obstetrics，pp．71-75)。1969年にFonkalsrudは骨髄腔を移植に用いる可能性について再び述べており、この時は甲状腺の同種移植についてであった(Arch．Surg．Vol 98，pp．738-741)。しかし、現在までのところ、骨髄への肝細胞および膵島細胞などの他の細胞の移植、またはペプチド、薬剤、遺伝子の送達のための骨髄腔の使用、または幹細胞、神経、心筋もしくはその他の有用な組織などの移植のための細胞培養の場としての骨髄腔の使用を行ったという報告はない。Ricoldi(Pancreatic Islet Cell Transplantation，p.317-3 19(1992)，これは参照によりその全文を本明細書に組み入れる）は、免疫的に単離されていない(non-immunoisolated)ラットからマウスへの膵島の異種移植は生着率が低いが、膵島が骨髄中へ移植されたことはないことを示した。外科的なインターベンションのための骨髄の使用が上述のとおり行われていないことから見て、当技術分野はそのような方法に対するニーズがある。発明の概要従って、本発明の目的の一つは、哺乳動物の骨髄に細胞を移植することを含んでなる細胞培養法を提供することである。本発明の別の目的は、哺乳動物中への細胞の移植のための方法であって、その細胞を哺乳動物の骨髄へ送達することを含んでなる方法を提供することである。本発明のまた別の目的は、機能性遺伝子を哺乳動物に送達する方法であってその遺伝子を含有するベクターで形質転換した細胞を哺乳動物の骨髄に送達することを含んでなる方法を提供することである。本発明のまた別の目的は、生物学的活性のあるタンパク質またはペプチドを哺乳動物に送達する方法であって、そのタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子を発現するベクターで形質転換させた細胞を哺乳動物の骨髄中に送達することを含んでなる方法を提供することである。本発明のまた別の目的は、生物学的活性のあるタンパク質またはペプチドを哺乳動物に送達する方法であって、そのタンパク質またはペプチドをコードするDN Aを哺乳動物の骨髄中に送達することを含んでなる方法を提供することである。本発明のまた別の目的は、生物学的活性のあるタンパク質またはペプチドを哺乳動物に送達する方法であって、適当なキャリアー中のそのタンパク質またはペプチドを哺乳動物の骨髄中に送達することを含んでなる方法を提供することである。本発明のまた別の目的は、医薬品を哺乳動物に送達する方法であって、適当なキャリアー中のその医薬品を哺乳動物の骨髄中に送達することを含んでなる方法を提供することである。本発明のまた別の目的は、骨髄移植を行う方法を提供することである。本発明のまた別の目的は、ある抗原に対する免疫寛容を治療前に患者に誘発させるための方法を提供することである。上述の目的およびその他の目的について、本発明の利点および様相はこれ以降で明らかとなり、本発明の本質は下に記載の本発明の好ましい実施形態についての詳細説明および添付されている請求事項を参照することで、より明確に理解することができるであろう。図の簡単な説明本発明および本発明に伴う多数の利点のより完全な理解は、添付されている図と関連づけて下記の詳細説明を参照することにより容易に得られるであろうが、その図は：図1は本発明に従って骨髄に直接注射するために用いることができる各種の組成物と送達システムを図示するものである。図2は本発明に従って骨内人工透析デバイスがどのように用いられるか図示したものである。図3は本発明に従って行われる細胞/器官/デバイスの移植操作法を図示したものである。図3Aは移植の最初のステップである腐食(cauterization)を図示している。図3Bは皮質/骨髄ブロックの除去を示し、移植される材料が置かれるための開放空間がそこに残される。図3Cは骨髄への移植の最終ステップを図示しており、そこでは移植される材料がその開放空間に挿入され、皮質が置換される。図4は同系SD-SDラット膵島移植を行った場合のブドウ糖レベルの時間的推移を示している。図5は同種膵島移植を行った場合のブドウ糖レベルの時間的推移を示している。図6は移植量を変えて同系膵島移植を行った場合のブドウ糖レベルの時間的推移を示している。詳細な説明本発明は、骨髄が外来細胞、遺伝子、タンパク質および医薬の送達に適した部位であるということを認識するものである。まず、骨髄は天然の動脈−静脈移植片であるので、最小限の操作で循環系に簡単にアクセスすることができる。さらに骨髄は、免疫特権(privileged)部位であるのでそのような送達システムに特に適しており、よって骨髄への送達により移植された材料に対する宿主免疫応答が排除される。骨髄が天然動脈−静脈移植片であるということに関連して、骨には循環の「二元系」、すなわち流出栄養分−骨髄および流入骨膜ハーバース系が存在する。この二元系によりホメオスタシスの必要性が生じる。栄養動脈は主に赤血球生成の役割を果たすが、骨膜−皮質循環はホメオスタシスの骨形成側面とより密接に関連している(Trueta，Studies of the Development and Decay of the Human Fra me，William Heinemann Medical Books，Ltd，London(1968))。循環基礎に身体の残りの部分(remainder)由来の骨髄の区画化(comartmentalization)を付与するのがこの二元循環である。骨髄は、小児の外傷および熱傷における循環アクセスとして用いられる。さらに、骨髄を用いることにより実験試料を取り出すことができ、骨髄は中心静脈の流量よりも大きい流量を有する。骨髄は区画化されて免疫抑制および能動的免疫寛容に対して伝導力のある微小環境を作り出す。サイトカイン、能動的に寛容を誘導する抗原提示細胞およびその他の因子の存在は、一部、この微小環境の創出の役割を果たす。したがって、骨髄の免疫特権は骨髄からの骨膜／皮質循環の分離に依存する。この分離の完全性が侵害されると免疫特権が失われることになり得る。しかしながら、外科手術により区画(compartment)の完全性を保存しながら「無菌的に」骨髄に到達することができるので、骨髄は細胞移植のための部位として用いることができる。バイオハイブリッド膵臓または肝臓において実施された以前の実験は、循環系へのアクセスを確保するために血管処置を必要とする。さらに、以前の微小被包実験(Ricordi，Pancreatic Islet Cell Transplantation，pp.177-237，R.G.Lan des Col.，Austin，Texas(1992))により、腹膜に移植されたカプセルは結果として繊維芽細胞の過剰増殖により窒息死するということが示された。骨髄の血液循環の性質のために、骨髄へのそのようなカプセルの移植はこの問題を同様にうまく解決するものである。骨髄は天然動脈−静脈（A-V）移植片として機能するので、細胞またはバイオハイブリッド系の骨髄への移植により循環系への簡単なアクセスが得られる。骨髄の微小環境はその他の免疫特権部位に関連した特徴を必ずしも全て伴うわけではないが多くの特徴を伴う。免疫特権部位の特徴の一つは、Trueta（上記のとおり）によって記載されている骨の二元循環の結果として骨中に存在するバリア系の存在である。骨髄が免疫特権部位であるという証拠としては、骨髄におけるそのような免疫特権と関連している分子の存在が挙げられる。特に、骨マトリックスは大量のTGF-βを含む（Seydinら，J．Biol．Chem．261:5693-5695(1986) ）。さらに、サブスタンスP、VIPおよびCGRPのような神経ペプチドは全て骨に存在する（Kreicsbergsら，Regulatory Peptides 51(3):179-188(1994)）。さらに、CD34+細胞は、適性に刺激された場合、Fas-Lを発現し得る。骨髄における免疫細胞の非活性化は、Fasリガンドの直接的な結果であり得る。さらに、骨髄に大量に存在する造血幹細胞は、特異的環境下で構成的にFasリガンドを発現し得る。骨髄が免疫特権部位であるというサポートのその他の証拠としては樹状細胞を椎体骨髄から抽出する寛容研究が挙げられる（Starzlら，Transplantation 59(6 ):871-4(1995)）。これらの細胞は促進細胞と呼ばれ、BMTキメラ現象の確立の手段になる。また、自己反応性B細胞は骨髄内で非活性化されることも示されている（Goodnowら，Cell 73(2):325-35(1993)）。骨または骨内に見出される細胞は特異的アロ反応性(alloreactivity)における阻害作用を誘導し得る（Friedlande rら，The Orthopedic Clinics of North America 18(2):227-33(1987)）。したがって、骨髄は細胞移植の理想的な部位である。骨および骨軟骨同種移植片の使用、ならびにその免疫学的側面は、HorowitzおよびFriedlanderら(1987)に記載されており、これは参照により本明細書に含まれるものである。下文で用いる場合、「移植されるべき材料」という用語は、細胞、組織およびその他の組成物ならびに外来的に導入される遺伝子、タンパク質または医薬組成物用の担体を含むものであり、この組成物および担体は、宿主に対する治療を与えるためのものである。本発明は、循環系へのアクセスを必要とする種々の細胞、デバイス、遺伝子材料および医薬の移植を有効なものにする。その生物が骨および骨髄を含むという条件付で、任意の宿主生物を用いることができる。骨の解剖学的構造および循環は、Trueta，Studies of the Developme nt and Decay of the Human Frame，William Heinemann Medical Books，Ltd.， London，(1968)に記載されており、これは参照により本明細書に含まれるものである。したがって、生物は脊椎動物である必要があり、好ましくは哺乳動物である。宿主は、任意の妊娠年齢(gestational age)を含む、任意の年齢のものであり得る。任意の型の細胞または組織を骨（すなわち骨内）または骨髄に本発明の方法を用いて移植することができる。細胞材料は、自己移植片または同種移植片であり得る。好ましい態様においては、細胞材料は肝細胞または膵島細胞である。膵島細胞の移植は、Posseltら，Ann．Surg．214:363-373(1991)に記載されており、これは参照により本明細書に含まれるものである。別の好ましい態様においては、本発明の方法を用いることにより骨髄移植片が得られる。したがって、この場合、細胞材料はドナー患者の骨髄から得られる。細胞材料は、宿主または血縁関係のあるドナー、特に宿主の親、兄弟または子から得るのが好ましい。細胞材料が同種移植片である場合、ドナーを移植材料の拒絶を低減する医薬組成物、サイトカインまたはリンホカインで前治療し得る。さらに、宿主を、骨髄における移植細胞のインキュベーション期間(incubation period)中に治療し得る。さらに、結果を改善するために患者を移植前に抗原で予備免疫寛容し得る。患者は、同様に、10注射によりアレルゲンに対して免疫寛容され得る。10空間への直接BM注射によりGvHDおよびHvGDが低減され得る。したがって、本発明の方法は、細胞治療に有用である。細胞を骨髄中に直接送達して細胞数または活性が低下している領域を再構成または補給し得る。骨髄への移植に好ましい細胞には被包または非被包細胞が含まれ得る。そのような細胞としては、例えば、肝細胞または膵島細胞が挙げられる。特に好ましい移植部位は腸骨稜(IC)である。移植される細胞は、さらに下記に示したとおり、正常細胞または遺伝子操作された細胞であり得る。組織状態または懸濁液の状態にある細胞を提供することに加えて、細胞は含浸ゲルの状態で、または中空糸細胞移植片として移植し得る。本発明の細胞移植の別の局面は、骨髄移植（BMT）植付けを助けることである。最近、幹細胞の数を増大させることによりBMT植付けを助けることができるという証拠が示された（Reisnerら，Nature Medicine 1(12):1268-1273(1995)）。 10空間にBM細胞を直接注射することにより、幹細胞植付けの数の関数的な増大が生じ得る。BM植付けを助ける骨髄中に存在する因子には、BMの三次元マトリックスおよび間質細胞による増殖サイトカインの産生が含まれる。細胞および組織に適した培養環境を提供することに加えて、骨髄は外来遺伝子、タンパク質および医薬組成物の投与に理想的な場所を提供する。骨髄は免疫特権部位であるので、投与される材料、特にタンパク質（抗体など）および医薬組成物に対する免疫応答は最小になる。同様に、本発明の方法は、骨髄においてデバイスを移植するのに用いられ得る。骨髄への移植に特に好ましいデバイスとしては薬剤放出デバイス、または透析デバイスが挙げられる。そのような透析デバイスは、骨髄に移植されると、骨内（IO）透析（そしてその後に管組織を介した膀胱への排出）を行い得る。本発明の特に好ましい使用は遺伝子治療に対する使用である。遺伝子材料は形質転換細胞または裸のDNAの状態で骨髄に導入され得る。裸のDNAの注入は、遺伝子導入の効果的な方法であることが示されている（Montgomeryら，Current Opin ion in Biotechnology 5(5):505-510(1994)）。幹細胞は、BM中にその最大の濃度で存在するので、直接的なIO注入によりこれらの標的細胞（骨髄幹細胞または間質細胞）への直接的なアクセスが可能になる。本発明の好ましい方法は、低投与量化学療法または放射線療法が付与される方法であり、遺伝子は複製期に導入される。この方法により、標的細胞への遺伝子材料の組み込みが増大する。骨髄において特に好ましい標的細胞は間質細胞である。BM間質細胞は循環系への直接的アクセスを有する分泌場所であり、したがって遺伝子治療に関して魅力的な標的である（Clarkら，Jrnl of Immunology，155(3):1023-7(1995)）。上記のように、本発明の方法を用いることにより宿主に治療物質を投与し得る。骨髄はこの意味で特に好ましい部位である。というのは、骨髄は外来的に投与された核酸によって形質転換され、分裂および分化して外来的に投与された核酸をさらに含む多数の娘細胞を産生し得る幹細胞を含むからである。遺伝子ベクターは直接的幹細胞形質導入または間質細胞形質導入のためにBMに注入し得る。例えば、レトロウイルスベクター、リポソーム、アデノウイルスベクター、DNA含浸ゲルなどが挙げられる。したがって、移植されるべき材料には原核細胞および真核細胞の両方が含まれ得るものであり、それらは目的の核酸を含むベクターで形質転換される。細胞に供給されるベクターは、好ましくは発現ベクターであり、宿主において治療作用を有するタンパク質を発現する。ベクターは、ベクターが含まれる細胞の型における発現に適したプロモーターを含むように選択される。ベクターはプラスミドベクターまたはウイルスベクターであり得るものであり、好ましくは宿主に感染しないウイルスベクターであり得る。しかしながら、ベクターはアンチセンス作用を付与し得るmRNAも供給し得るものであり、またはその他の核酸に結合して遺伝子調節機能を付与することができる核酸またはタンパク質を供給し得る。本発明の方法によって任意のタンパク質を投与し得る。特に、本発明の方法によって投与され得る治療タンパク質としては、アンジオジェニン(angiogenin)、上皮増殖因子、エリトロポエチン、繊維芽細胞増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヘパリン結合性EGF様増殖因子、肝細胞増殖因子、インスリン、インスリン様増殖因子、インターロイキン、インターフェロン、白血病阻害因子、マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、単球走化性タンパク質、単球走化性及び活性化因子、マクロファージ炎症タンパク質、神経成長因子、オンコスタチン、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、幹細胞因子、トランスフォーミング増殖因子、腫瘍壊死因子、血管内皮細胞増殖因子などが挙げられる。一方、移植されるべき材料は、「裸の」核酸、タンパク質、および医薬、すなわち、適当な媒体または医薬上許容される担体中に核酸、タンパク質および医薬を含み得るものである。移植されるべき材料は、適当な担体中に核酸およびタンパク質を含み得るものであり、これは材料の持続放出を付与するものである。そのような持続放出性製剤は当技術分野で周知であり、カプセルおよび錠剤、リポソーム、カートリッジならびにゲルが挙げられ得る。骨に移植片を付与する方法は、米国特許第5,503,558号、5,489,306号および5,461,034号に記載されており、これらは全て参照により本明細書に含まれるものである。適当な担体としては、無菌のパイロジェンを含まない水が挙げられ得る。活性成分としてポリペプチドまたは医薬を含む治療組成物の調製は当技術分野では十分に理解されている。典型的には、そのような組成物は液体溶液または懸濁液であるが、移植前に溶液または懸濁液にするのに適した固形製剤も調製され得る。活性治療成分は、医薬上許容され、活性成分と適合性のある賦形剤と混合されることが多い。適当な賦形剤は、例えば、水、生理的食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せである。さらに、所望により、組成物は、活性成分の有効性を高める加湿剤または乳化剤、pH緩衝剤のような補助物質を少量含むことができる。ポリペプチド、核酸または医薬組成物は、中和された医薬上許容される塩の状態で治療組成物に配合され得る。医薬上許容される塩としては、例えば塩酸またはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸とともに形成される酸付加塩（ポリペプチドまたは抗体分子の遊離アミノ基をとともに形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基から形成される塩も例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、または水酸化鉄などの無機塩基、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導され得る組成物は治療上有効な量が投与される。投与されるべき量は治療されるべき被検体および所望される治療の程度に依存する。投与に必要な活性成分の正確な量は、開業医の判断に依存し、各個人に特有のものである。担体は、さらに、主要な治療薬剤であると考えられるもの以外の医薬を含み得る。特に、抗体および／またはその他の免疫抑制物質が担体に含まれ得る。移植されるべき材料のインキュベーションの部位は宿主の身体における任意の骨髄であり得る。好ましい位置は腸骨稜である。移植の部位は、アクセスの容易性に関して選択されるのが好ましい。宿主は、移植されるべき材料に対する免疫応答の機会をさらに減少させ、複製期における取込を上昇させるために、任意に化学療法または放射線療法を用いて前治療され得る。そのような免疫抑制薬剤および放射線養生法は当技術分野では周知である。移植されるべき材料の送達方法には、骨または骨髄に材料を導入することができるあらゆる方法が含まれ得る。好ましくは、この方法は注入によるものであり、これは比較的非侵襲性の操作である。注入は骨または骨髄に直接行われ得るか、カテーテルによって行われ得る。移植されるべき材料の投与の部位は、宿主の任意の骨または骨髄であり得る。好ましくは、その部位は造血骨内（IO）部位、好ましくは腸骨稜である。一方、その部位としては、好ましくは頭骨、胸骨、肋骨および椎骨が挙げられ得る。移植されるべき材料のインキュベーション期間は、所期の目的により変動する。換言すると、移植されるべき材料が細胞増殖または拡大のための手段である場合、移植期間は数日または数週間から宿主の生命が続く期間までであり得る。また、移植されるべき材料は、所望のレベルの細胞増殖および拡大が生じるまで培養され得る。この「所望のレベル」は、外科手術などの侵襲操作、または産生されるサイトカインまたはリンホカインのレベルなどの移植細胞または組織の何らかの産物もしくは副産物のレベルを測定する低侵襲性操作により監視され得る。治療目的で投与される移植材料、すなわち核酸、タンパク質および医薬組成物のインキュベーション期間は、指定された治療持続期間のみであり得るか、ドナーの寿命の間であり得る。この場合、治療養生法には、血液または尿試験などの標準診断技術、固相酵素免疫検定法（ELISA）またはウエスタンブロットなどの免疫アッセイ、またはポリメラーゼ連鎖反応、サザンもしくはノーザンブロットによる核酸の検出による核酸、タンパク質または医薬のレベルの監視が含まれ得る。宿主は、遺伝子異常を有する患者であり得るものであり、この方法は宿主への正常遺伝子の送達をもたらすか、または正常よりもかなり高レベルでの遺伝子の送達をもたらし得るものである。そのような送達は、French Andersonの米国特許第5,399,346号およびFelgnerらの米国特許第5,589,466号（PCT国際公開WO90/1 1092に対応）（これらは参照により本明細書に含まれるものである）に記載されているような「遺伝子治療」を含み得るものである。宿主は、AIDSのような感染症を有する患者でもあり得るものであり、またはパーキンソン病、ハンチントン病またはアルツハイマー病のような神経退行性疾患に苦しんでいる患者でもあり得る。AIDSの場合、移植材料は、インターフェロンなどのウイルス複製または遺伝子発現をダウンレギュレートする治療タンパク質を含み得るか、または例えばプロテアーゼインヒビターなどの複製またはウイルスタンパク質機能を阻害する医薬であり得る。神経退行性疾患の場合、移植材料は、ドーパミン、アセチルコリンなどの患者宿主において減少している神経伝達物質または神経伝達物質前駆体を含み得る。宿主は、膵島細胞移植が必要な糖尿病患者であり得る。同様に、宿主は、肝臓移植片または肝臓移植へのブリッジが必要であり得る肝不全または劇症肝炎の患者であり得る。本発明は、また、骨髄炎および骨腫瘍の治療においても使用され得る。本発明を一般的に記載したが、さらなる理解が一定の特定の実施例を参照することによって得られ得る。この実施例は、説明の目的のためだけに記載されているものであり、特に示さない限り限定するものではない。実施例実施例１骨および骨髄の分析ヒト骨を外科手術により入手する。骨断片を生理食塩水で洗い、ホルマリンで固定する。この組織塊を薄片に切りわけ、スライドの上に載せる。骨または骨髄上のFasリガンドの存在の肉眼的評価のために、タグ付き抗CD95リガンド抗体をスライドに結合させる。実施例２手術前処置抗CD4抗体をレシピエントに投与して、もとの抗体応答を中和する。あるいは、またはそれに加えて、TNFを投与して造血幹細胞上にCD95を動員する。当業者であれば、上記の説明に従って、有効投与量および適切な製薬上の担体を決定することができる。前述の処置に加えて、またはその代わりに、癌の治療分野の当業者に知られている線量または用量の放射線もしくは化学療法を用いてレシピエントを処置する。実施例３外科手術骨膜および先端皮質(apical cortex)を焼灼術／レーザーにより分ける。格子状の骨髄を確認する。骨髄の一部を取り出し、その結果生じた空間に肝臓または他の細胞性材料の移植片を植え込む。次に、移植部位に皮質をかぶせ、手術部位を縫い合わせる。手術中／手術後処置で免疫抑制を行っても行わなくともよい。実施例４造血骨髄への注入免疫抑制したまたはしない哺乳動物の造血骨髄に、実施例３の方法または針による直接注入により、細胞性材料（自己移植片または同種移植片）を注入する。実施例５骨髄へのバイオハイブリッド構造体の注入上記したようなバイオハイブリッド構造体を、実施例３の方法または針による直接注入により、移植部位としての骨髄に挿入する。実施例６骨髄空間に導入するための細胞の調製ラットを40mg/kgのペントタール（生理食塩水溶液）で腹腔内麻酔した。手術すべき足をベタジンまたはアルコールで消毒した。穏やかに組織を後方移動させて、膝のすぐ下を切開して脛骨を露出させた。乾燥手術領域を確保するように注意した。近位脛骨から３〜４mm遠位に、歯科用ドリルで小さな穴を作り、骨髄空間にアクセスした。その後脛骨の骨髄空間にカニューレを約１〜1.5cm挿入した。このカニューレから細胞を注入した。注入に続いて、挿入部位を骨ろう(bonew ax)で閉じた。肝細胞の収穫門脈にPBSを通して洗浄した後で肝臓を摘出した。肝臓が白かったときは、コラゲナーゼ25mg/10mlを注入し、その後組織を機械的に裂いて37℃で20分インキュベートした。次に、細胞を600rpmで３分洗い、F-12培地を用いて懸濁させた。膵島細胞の収穫胆管にカニューレを挿入し、4.2mg/15ml/ラットの濃度のコラゲナーゼＰを膵臓に逆方向で注入した。膵臓を広げてプラスチックのチューブに入れ、37℃の浴中で40分間インキュベートした。10mlの冷却ハンクス液＋１g/lグルコースを添加し、この混合物をボルテックス混合して遠心分離した。上清を取り除き、細胞を２回洗浄した。次いで、細胞をメッシュフィルターにかけて洗浄した。ペレットに10mlのヒストパク(Histopaque)を加え、ペレットを再懸濁し、10mlのハンクス基本塩溶液を加えた。細胞を1500rpmで15分間遠心分離した。細胞のバンドを取り出し、５mlのハンクス液を加え、その後細胞を再遠心分離した。500rpmの遠心分離にかけて細胞をRPMI-FCSで２回洗浄した。細胞を２本のチューブに分割し、洗浄し、再懸濁してプレートした。この調製の１日後、膵島細胞を検査し、形態的に生存可能な膵島細胞を相対的サイズに基づいて拾い上げた。糖尿病のストレプトゾシン誘発ストレプトゾシンは60mg/kgの濃度で、２mlのNaClおよび数滴の酢酸で希釈して調製した。静脈内または腹腔内に注射した。注射の２日後、高血糖症について動物を検査した。実施例７実験１この実験の目的は、骨髄空間に肝細胞を注入することであった。ラット１同系肝細胞の注入ラット２ HeLa（ヒト癌）細胞の注入両ラットを上述した骨髄移植プロトコールにより準備した。ラット１には1.5 〜3x10⁵個の肝細胞を含む50〜100μlを注入した。ラット２には3x10⁵個のHeLa細胞を注入した。ラット１を手術後すぐに犠牲にした。ラット２は手術の３日後に犠牲にした。実験用脛骨をホルマリンで固定し、カットし、染色した。ラット１では、肝細胞が形態的に確認され、骨髄空間全体に散在していた。ラット２では、抗ケラチノサイト染色により、骨髄空間にヒトHeLa細胞の存在することが示された。異種細胞の周辺に炎症は見られなかった。ラット１とラット２の双方について得られた結果は、細胞が骨髄空間に侵入できたことを実証している。手術の３日後に免疫適格動物の骨髄にヒト細胞が炎症の徴候なしに存在していたことは、本方法の有効性を示すものである。実験２この実験の目的は同系移植を得ることであった。Sprague Dawley(SD)肝細胞を SD骨髄空間に導入した。ラットを手術の３日後に犠牲にし、組織学的検査のために骨を調製した。肝細胞は骨髄全体に形態的に確認された。多数の肝細胞が非常に明白なクラスターとして存在しており、種々の切片では増殖がはっきりと見えた。この実験の結果は、肝細胞が骨髄内に適切に配置されたことを示している。骨髄環境は生存と増殖さえも誘導するようである。炎症や拒絶反応の明らかな徴候は認められなかった。実験３この実験の目的は、同系／同種異系／異種移植を提供すること、および同系移植について軟骨からの侵入と皮質からの侵入を比較することであった。Ａ群のラットには、右足のSD骨髄空間にSD肝細胞を注入した。軟骨からの侵入と皮質からの侵入を比較した。左足でも、SD骨髄空間にSD肝細胞を注入した。Ｂ群のラットについては、左右の足のSD骨髄空間にマウスBA/C肝細胞を注入した。Ｃ群のラットにはSD骨髄空間にヒト生検肝細胞を注入した。それぞれの足への注射液は２〜３x10個の細胞を含んでいた。Ａ群は０、３、７および14日目に犠牲にした。Ｂ群とＣ群は３日目に犠牲にした。犠牲に続いて、骨を固定し、カットし、染色した。全ての群に対して肝細胞特異的マーカーによる対比染色を行った。Ａ群について、軟骨からの注入は、皮質注入からの侵入と比べて、技術的により難しい手術であった。一方、皮質注入による出血および損傷は比較的少なかった。皮質移植に対して軟骨実験では、より局所的な炎症が侵入部位に生じた。侵入の方法に関係なく、全ての切片に肝細胞が形態的に確認され、また14日目に抗アルブミン、パン-ケラチンABおよびk167を用いて肝細胞特異的対比染色を行うことによっても確認された。Ｂ群については、マウス肝細胞がヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色でラット骨髄に形態的に確認された。k167、k19およびパン-ケラチンによる肝細胞特異的対比染色は全切片において陽性であった。炎症、過細胞性、感染または他の免疫応答の明らかな徴候は見られなかった。Ｃ群のグループに関しては、ラット骨髄にヒト肝細胞がH&E染色で形態的に確認された。k167、k19およびパン-ケラチンによる肝細胞特異的対比染色は全切片において陽性であった。炎症、過細胞性、感染または他の免疫応答の明らかな徴候は見られなかった。かくして、Ａ群から得られた結果は、実験的に好適な侵入モードは皮質からで、軟骨からではないことを示す。軟骨からの侵入は明らかにより外傷性で、出血が多かった。従って、これはヒトでは好ましい実施形態ではないかもしれない。さらに、14日目に生きている同系細胞が存在していたことは、肝細胞移植部位としての骨髄の実施可能性を示すものである。細胞は、移動や他の明らかな有害作用を引き起こすことなく、存在しかつ生き延びることが可能である。Ｂ群から得られた結果は、免疫抑制を行っていない免疫適格動物における同種異系移植を表す。移植の３日後に正規染色と対比染色により確認された肝細胞の存在は本方法の有効性を実証している。炎症性応答が起こるのであれば、移植後３日目までに、かかる応答が現れると予想される。なぜならば、これらの細胞は絶えず血液と接触しているからである。Ｃ群からの結果は、免疫抑制を行っていない免疫適格動物における異種移植を表す。移植の３日後に正規染色と対比染色により確認された肝細胞の存在は本方法の有効性を実証している。この場合も、もしも炎症性応答が起こるのであれば、この時までにそれを検出できると予想される。なぜならば、これらの異種細胞は絶えず血液と接触しているからである。Ｂ群とＣ群の実験を繰り返し行って、結果を確認した。実施例８糖尿病ラットへの膵島移値移植した細胞が骨髄環境で機能し、免疫抑制なしでも生き延びることができることを示すために、ストレプトゾシン誘発糖尿病ラットへのβ細胞の移植の効果を分析することにより、細胞の機能を解析した。実験１同系SD膵島細胞をSD骨髄空間に移植し、移植後さまざまな時点でグルコース測定を行った。ラット１： 445個−対照ラット２： Hi −大きな膵島を移植ラット３： 228個−小さな膵島を移植結果を図４に示す。同系モデルでは、小さな膵島の移植が成功した。形態学的検査で大きな膵島はうまく機能していないと思われた。しかし、この実験から、骨髄に移植した細胞は少なくとも30日間機能し、生き延びることがわかる。このことは、骨髄空間が循環系に分泌される必要があるタンパク質の生産部位として使用でき、それゆえに遺伝子と細胞の両方の実施可能な移植部位であることを立証している。実験２この実験では、Wistarラットの骨髄空間へのLewisラット膵島の同種異系移植およびWistarラットの骨髄空間へのSD膵島の同種異系移植を行った。５匹のラットにストレプトゾシン注射で糖尿病を誘発し、４匹に次のような移植を行った。ラット１培地−対照ラット２ 90個のLewis膵島（ドナー１）ラット３先行実験からの90個のSD膵島（２週間培養）ラット４ 140個のLewis膵島（ドナー２）ラット５ 140個のLewis膵島（ドナー２）結果を図５に示してある。ラット＃２においては、移植後30日間にわたり正常血糖血をもたらし、膵島移植の機能的効果が存在したようである。ラット４でも機能的効果が現れたように思えたが、実験開始後12日目に死亡した。ラット１、３および５は経時的効果を示さなかったようである。これらの結果は本発明の方法の有効性を示すものである。なぜならば、このような免疫適格宿主における同種異系移植は、もしも拒絶が起こっていたならば５〜７日目までに完全に拒絶されていたにちがいないからである。７日後に確認できる効果が存在していたという事実は非常に重要であり、特に宿主の免疫抑制または準備のない状態ではそうである。他方の動物で効果が見られなかったことは、おそらく機能的効果に必要とされる細胞数の標準化を行わなかったことによるのだろう。というのは、タイトレーション実験を行った実験４の同系移植でも同様の成功率が観察されたからである。実験４機能を示す移植に必要な同系膵島細胞の数を決定するために、次のタイトレーション実験を行った。ラット１ 55個の膵島ラット２ 30個の膵島ラット３対照１ラット４ 27個の膵島ラット５対照２ラット６ 400個の膵島ラット７ 118個の膵島ラット８ 120個の膵島ラット９ 300個の膵島結果を図６に示す。この実験の結果は、最適量が約100個の膵島であることを示唆している。理論によって拘束されるつもりはないが、より多数の膵島が機能的でないように思える事実は、ラット脛骨の骨髄空間の体積が小さいために起こりうる局所的なダウンレギュレーションによるのだろう。本明細書中に挙げた全ての文献は参照によりそれらの全体をここに含めるものとする。本発明について一般的に説明してきたが、単なる例示であって、特に断らないかぎり限定するものではない特定の実施例を参照することにより、本発明のさらなる理解が得られるだろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ローゼンウォルド，リンゼイアメリカ合衆国 10024 ニューヨーク州, ニューヨーク，ウェストエンドアベニュー 441

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳動物の骨髄に細胞を送達することを含んでなる哺乳動物への細胞の移植方法。２．機能性遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞を哺乳動物の骨髄に送達することを含んでなる哺乳動物への機能性遺伝子の送達方法。３．生物学的に活性なタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子を発現するベクターで形質転換された細胞を哺乳動物の骨髄に送達することを含んでなる、哺乳動物への生物学的に活性なタンパク質またはペプチドの送達方法。４．生物学的に活性なタンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡを哺乳動物の骨髄に送達することを含んでなる、哺乳動物への生物学的に活性なタンパク質またはペプチドの送達方法。５．適当な担体中の生物学的に活性なタンパク質またはペプチドを哺乳動物の骨髄に送達することを含んでなる、哺乳動物への生物学的に活性なタンパク質またはペプチドの送達方法。６．適当な担体中の医薬を哺乳動物の骨髄に送達することを含んでなる、哺乳動物への医薬の送達方法。７．哺乳動物の骨髄にデバイスまたは組成物を植え込む方法であって、（a）骨髄に隣接した骨の部分を焼灼し、（b）骨の前記部分と隣接骨髄を取り出して植え込み用の開放空間をあとに残し、（c）前記開放空間にデバイスまたは組成物を植え込み、そして（d）ステップ(b)で取り出した骨を元へ戻す、ことを含んでなる方法。８．哺乳動物が送達に先立って免疫抑制される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。９．哺乳動物が植え込みに先立って免疫抑制される、請求項７に記載の方法。 10．骨が腸骨稜(iliac crest)である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。 11．デバイスが置換可能な軟骨である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。 12．組成物がＤＮＡ、タンパク質、細胞または組織である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。 13．組成物がＤＮＡ、タンパク質、細胞または組織を含浸させたゲルである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。 14．移植される組成物がドナー患者由来の骨髄である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。 15．哺乳動物が前記タンパク質に対して免疫寛容である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。