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Es werden Arzneimittel geschaffen, die zur Verhinderung
oder Verminderung der Abstoßung von Fremdtransplantat, zur
Verhinderung oder Linderung von Autoimmunkrankheiten
angewandt werden, umfassend eine wirksame Dosis Heparin oder N-
desulfatiertes, N-acetyliertes Heparin oder N-acetyliertes
Heparin, wobei die Dosis in der Größe von 1 bis 10% einer
Dosis liegt, die eine merkliche koagulationshemmende Wirkung
ergibt.
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Es können ebenfalls andere Derivate und modifizierte
Formen von Heparin die gewünschte Wirkung ergeben. Nicht alle
dieser Derivate sind wirksam: zum Beispiel ist total
desulfatiertes Heparin für die beabsichtigten Zwecke völlig wertlos.
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Zusammen mit seiner lebenswichtigen Rolle des Schützens
des Individuums gegen fremde eindringende Erreger, kann das
Immunsystem das eigene Gewebe des Individuums angreifen,
wobei Autoimmunkrankheiten produziert werden. Eine andere
unerwünschte Wirkung des Immunsystems ist die Abstoßung
kritischer transplantierter Organe. Die Fähigkeit des
Immunsystems, Autoimmunkrankheiten zu produzieren oder
Fremdtransplantate abzustoßen, hängt von der Fähigkeit der Lymphozyten,
insbesondere aktivierter T-Lymphozyten, ab, in das Zielorgan
oder das transplantierte Gewebe einzudringen. Der Transport
zum Ziel geht über den Weg der Blutgefäße und die aktivierten
T-Lymphozyten müssen fähig sein, durch die Gefäßwände
einzudringen und auszutreten. Daher ist es vernünftig
anzunehmen, daß die Teilnahme von T-Lymphozyten an einer
Autoimmunschädigung oder Abstoßung von Fremdtransplantat durch
Maßnahmen die ihren Transport betreffen, verhindert werden
könnte.
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In keiner früheren Untersuchung zeigten intaktes
Heparin oder chemisch modifizierte Heparine ohne
koagulationshemmende Wirkung einen Nutzen bei Autoimmunkrankheiten oder der
Abstoßung von Fremdtransplantat.
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Subkoagulationshemmende Dosen von 5000 Einheiten
Heparin pro Tag zeigten keine Wirkung auf die
Fremdtransplantatfunktion oder Überlebenszeit von Fremdtransplantat bei
Menschen (Hervath und Mitarb., Aust. N.Z.J.Med., Vol. 5(6), S.
537-539, 1975).
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Vor kurzem wurde durch uns festgestellt, daß
T-Lymphozyten ein Heparanase-Enzym herstellen, das spezifisch die
Glycosaminoglycan-Einheit der extrazellulären Matrix, die von
endothelen Zellen, die die Blutgefäße auskleiden, abgesondert
wird (Naparstek, Y., Cohen, I.R., Fuks, Z. und I. Vlodavsky,
Activated T lymphocytes produce a matrix-degrading heparan
sulphate endoglycosidase, Nature 310:241 (1984)). Die
Gegenwart dieses Enzyms wurde mit der Fähigkeit von Autoimmun-T-
Lymphozyten, die Blutgefäßwände zu durchdringen und das
Gehirn in einer Modellkrankheit, experimentelle Autoimmun-
Enzephalomyelitis genannt, anzugreifen, in Verbindung
gebracht.
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Weiter wurde festgestellt, daß das Heparanase-Enzym
durch Heparin oder einige modifizierte Heparinmoleküle, wie
N-desulfatiertes, N-acetyliertes Heparin, aber nicht durch
andere, wie total desulfatiertes Heparin, gehemmt werden kann
(Tabelle 1).
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Wir haben daher untersucht, ob Heparin oder
modifizierte Heparine, an Versuchstiere verabreicht, verwendet
werden könnten, um Autoimmunkrankheiten zu behandeln oder
Abstoßung von Fremdtransplantat zu verhindern.
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1. N-desulfatiertes, N-acetyliertes modifiziertes Heparin
oder eine niedrige Dosis intaktes Heparin besitzt keine
koagulationshemmende Wirkung bei Ratten. Tabelle 2 zeigt, daß
intaktes Heparin bei einer Dosis von 2 mg pro Ratte täglich
(10 mg/kg) eine Erhöhung der Prothrombinzeit der
Empfängerratten bewirkte. Im Gegensatz bewirkte eine Dosis intaktes
Heparin von 0,02 mg (0,1 mg/kg) oder 2 mg N-desulfatiertes,
N-acetyliertes Heparin (10 mg/kg) keine koagulationshemmende
Wirkung. So könnten die potentiellen Gefahren der
Blutungsfolge nach der Verabreichung von 10 mg/kg intaktem Heparin
durch Verwendung von intaktem Heparin mit einer niedrigen
Dosis (0,1 mg/kg) oder eines chemisch modifizierten Heparins
ohne koagulationshemmende Wirkung vermieden werden.
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2. Modifiziertes oder niedrigdosiertes Heparin hemmt die
Abstoßung einer Hautfremdtransplantation. Fig. 1 zeigt die
Überlebensdauer von SJL/J Hauttransplantationen bei (BALB/cx
C57BL/6)F1 Mäusen. Die mittlere Überlebenszeit von
Hauttransplantationen bei Kontrollmäusen, die mit Kochsalzlösung
behandelt wurden, war 14 Tage, während die bei mit 0,05 mg
Heparin täglich behandelten Mäusen 26 Tage, mit einer
maximalen Überlebensdauer von 32 Tagen, war. Fig. 2 zeigt, daß
die Behandlung mit 10 mg/kg N-desulfatiertem, N-acetyliertem
Heparin täglich die mittlere Überlebensdauer von allogenen
Hauttransplantationen von 10 auf 20 Tagen erhöhte.
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Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß eine niedrige,
subkoagulationshemmende Dosis Heparin oder ein modifiziertes
nicht koagulationshemmendes Heparin die Überlebenszeit von
allogenen Hauttransplantationen bei Mäusen deutlich erhöhen
kann.
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3. Modifiziertes oder niedrig dosiertes Heparin hemmt die
Fähigkeit von anti-BP-T-Lymphozyten, eine experimentelle
Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE) zu produzieren.
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EAE ist eine experimentelle Autoimmunkrankheit mit
einigen Merkmalen, die an multiple Sklerose beim Menschen
erinnern. Die Krankheit wird durch T-Lymphozyten verursacht,
die auf das Basisprotein (BP) des zentralen Nervensystem
Myelins immunisiert sind. Um die Wirkung von Heparinen auf
die Fähigkeit von T-Lymphozyten, Autoimmunkrankheiten zu
verursachen, zu untersuchen, verwendeten wir T-Lymphozyten,
die gegen BP sensibilisiert waren, entweder als T-Zellinien
(Cohen, I.R., Experimental autoimmune encephalomyelitis:
Pathogenesis and prevention. In: Immunoregulatory Processes
in Multiple Sclerosis and Experimental Allergic
Encephalomyelitis. A.A. Vandenbark und J.C.M. Raus, Hrsg.,
Elsevier Biomedical Res. Amsterdam, 7:91-125 (1985)) oder als
Populationen von Lymphknotenzellen aus BP immunisierten
Ratten. Tabelle 3 zeigt, daß eine subkoagulationshemmende Dosis
intaktes Heparin (0,1 mg/kg/Tag) oder eine Dosis
modifiziertes Heparin (N-desulfatiertes, N-acetyliertes) ohne
koagulationshemmende Wirkung (10 mg/kg/Tag) fähig war, die
Schwere von EAE, die durch die anti-BP T-Lymphozyten
produziert wurde, deutlich zu hemmen. Fig. 3 zeigt die Hemmung
von produzierter EAE durch die Behandlung von Ratten mit
Heparin (0,02 mg/Ratte/Tag; 0,1 mg/kg) grafisch.
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4. Modifiziertes oder niedrig dosiertes Heparin hemmt
adjuvante Arthritis.
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Adjuvante Arthritis ist eine experimentelle Krankheit,
die in einigen Rattenstämmen, indem man sie auf Antigene von
Mycobacterium tuberculosis (Pearson, C.M. Development of
arthritis, periarthritis and periostitis in rats given
adjuvant. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 91:91 (1956))
immunisiert, künstlich erzeugbar ist. Von der Krankheit wird
angenommen, daß sie ein Modell rheumatischer Arthritis bei
Menschen ist (Pearson, C.M. Experimental models in rheumatoid
disease. Arthritis Rheum. 7:80 (1964)). Die Arthritis scheint
durch T-Lymphozyten verursacht zu sein, die ein Antigen von
M. tuberculosis erkennen, das kreuzreaktiv zum Knorpel ist
(Cohen, I.R., J. Holoshitz, W. Van Eden, A. Frenkel, T
lymphocytes illuminate pathogenesis and effect therapy of
experimental arthritis. Arthritis Rheum. 29:841 (1985)).
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Tabelle 4 zeigt, daß subkoagulationshemmende Dosen
Heparin deutlich adjuvante Arthritis hemmten. Eine Heparindosis
von 0,001 mg täglich hatte eine deutliche Wirkung auf
Arthritis. Dosen von 0,005 und 0,01 mg waren wirksamer, während
eine Dosis von 0,02 mg bei der Hemmung von Arthritis maximal
wirksam war. Jedoch zeigte eine höhere Dosis von 0,04 mg
keine Hemmungswirkung. So waren die
Dosis-Reaktions-Charakteristiken der Behandlung sehr scharf; eine Verdopplung der am
meisten wirksamen Dosis führte zu einem totalen Verlust der
Wirksamkeit. Die Schärfe der Dosis-Reaktions-Kurve
verursacht, daß die heilsame Wirkung von Heparin auf Autoimmunität
und Transplantationsabstoßung leicht verfehlt wird, und ist
möglicherweise dafür verantwortlich, daß die anderen Erfinder
unsere Beobachtung übersehen haben. Modifizierte Heparine,
wie N-desulfatiertes, N-acetyliertes Heparin zeigten
ebenfalls eine scharfe Dosis-Reaktions-Kurve mit einer maximalen
Wirkung bei 0,02 mg pro Ratte (0,1 mg/kg). Eine höhere Dosis
(0,04 mg) war unwirksam (Fig. 4).
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Fig. 5 veranschaulicht, daß modifiziertes Heparin (N-
desulfatiertes, N-acetyliertes) in einer Dosierung von 0,1
mg/kg/Tag, verabreicht vom 21. bis 51. Tag, eine frühe
Remission von gesicherter adjuvanter Arthritis produzierte. So
war die Behandlung, sogar bei bereits klinisch schwerer
Arthritis wirksam. Eine histologische Untersuchung der Gelenke
zeigte ernste Zeichen der Entzündung bei den Ratten der
Kontrollgruppe und gesunde Gelenke bei den behandelten Ratten.
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Tabelle 5 tabellarisiert die Quellen von im Handel
erhältlichen Heparinen, die auf ihre Fähigkeit, eine
Langzeithemmung (am Tag 60) von adjuvanter Arthritis zu bewirken
nachfolgend einer täglichen subcutanen Behandlung während 5
Tagen, beginnend am 8. Tag nach der Induzierung von
Arthritis, untersucht wurden. 3 von 4 Heparinquellen waren sehr
wirksam, während eine Quelle (Organon) nur teilweise wirksam
war. So kann eine Reihe von Quellen verwendet werden, um eine
wirksame Substanz zu erhalten.
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Fig. 6 veranschaulicht die verschiedenen modifizierten
Heparine, die auf ihre Fähigkeit, eine Langzeithemmung bei
adjuvanter Arthritis am 60. Tag wie vorstehend beschrieben
herzustellen, untersucht wurden. Total desulfatierte und N-
desulfatierte Heparine waren bei der Behandlung von Arthritis
nicht wirksam. Jedoch waren N-desulfatierte, N-acetylierte
und o-desulfatierte, N-acetylierte Heparine genauso wirksam
wie ursprüngliches Heparin. Wie in Tabelle 2 gezeigt, besaßen
die modifizierten Heparine eine kleine koagulationshemmende
Wirkung. So kann die Hemmung von unerwünschten
immunologischen Reaktionen mit verschiedenen Heparinzubereitungen
ohne die Gefahr der koagulationshemmenden Wirkung erreicht
werden.
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5. Modifiziertes Heparin hemmt von aktivierten T-Lymphozyten
den Eintritt in und Austritt aus Blutgefäßen.
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Um die Wirkung von modifiziertem Heparin auf den
T-Lymphozyten-Transport zu untersuchen, markierten wir die
Lymphozyten mit &sup5;¹Cr und maßen das Aufnehmen der markierten
Lymphozyten aus einer subcutanen Stelle und ihr Bestehen im
Blut. Wir stellten fest, daß die markierten Lymphozyten an
der Injektionsstelle, im Schwanz von Ratten oder Mäusen, 5-6
Tage bei den behandelten Tieren (N-desulfatiertes,
N-acetyliertes Heparin; 0,05 mg/kg) bestehen blieben. Dagegen
wanderten die markierten Lymphozyten bei den Kontrolltieren von
der Injektionsstelle innerhalb von 1-2 Tagen ab.
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Weiter führte eine Behandlung mit modifiziertem Heparin
zu einem 4-5tägigen Bestehen der markierten Lymphozyten im
Blut, dagegen entfernten die unbehandelten Ratten oder Mäuse
die markierten Lymphozyten in einem Tag aus dem Blut. So
hemmte eine Behandlung mit modifiziertem Heparin die
Fähigkeit von T-Lymphozyten, in Blutgefäße einzutreten und, einmal
in den Blutgefäßen, verhinderte es, daß die T-Lymphozyten
wieder austreten. Das kann der Hemmung der Heparanaseenzym-
Aktivität zugeschrieben werden, die benötigt wird, um die
extrazelluläre Matrix der Gefäßwand zu durchdringen. Aus diesem
Grund waren die T-Lymphozyten weniger dazu fähig,
Autoimmunkrankheiten oder Transplantationsabstoßung zu verursachen.
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Die Ergebnisse zeigen, daß ein Inhibitor der
Heparanase, wie Heparin oder N-desulfatiertes, N-acetyliertes
Heparin, verwendet werden kann um eine Autoimmunität oder
Abstoßung von Fremdtransplantat zu verhindern. Die wirksame
Dosis Heparin, in der Größe von 0,1 mg/kg, ist etwa 1% oder
weniger als die, die verwendet wird um eine
koagulationshemmende Wirkung (10 mg/kg) herzustellen und daher kann eine
Verhinderung von unerwünschten Immunreaktionen von der
Koagulationshemmung getrennt werden. N-desulfatierte,
N-acetylierte oder O-desulfatierte, N-acetylierte Heparine sind an
sich ohne koagluationshemmende Wirkung und können mit einer
höheren Dosis in der Größe von 10 mg/kg verwendet werden,
obwohl niedrigere Dosen (0,1 mg/kg) dieser Substanzen wirksamer
sind, um unerwünschte Immunreaktionen zu verhindern. Diese
Dosis ist kritisch, da, wie in Tabelle 4 aufgeführt, 0,02
mg/Ratte (0,1 mg/kg) für die Hemmung einer Krankheit optimal
sein kann, während eine höhere Dosis, 0,04 mg/Ratte (0,2
mg/kg) unwirksam sein kann. Die gleiche
Wirkungsempfindlichkeit der Dosis wurde ebenfalls mit modifizierten Heparinen,
wie N-desulfatierten, N-acetylierten, beobachtet.
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Diese Behandlung ist neu und vermeidet die allgemein
toxischen Wirkungen der gegenwärtig verwendeten
immunhemmenden Mittel. Wir schlagen vor, die Verwendung jedes Heparins
oder modifizierten Heparins, die die T-Lymphozyten
Heparanase-Aktivität hemmt, zur Herstellung eines Arzneimittels zur
Behandlung von Autoimmunkrankheiten bei Menschen des
Nervensystems, der Gelenke, Muskeln, Nieren, Leber, Haut, des
Verdauungstraktes, der Blutbausteine, endokriner Organe oder
Geschlechtsorgane oder zur Verhinderung der Abstoßung von
Fremdtransplantaten, zu patentieren. Diese Erfindung betrifft
die Verwendung von Heparin, N-desulfatiertem Heparin oder N-
acetyliertem Heparin zur Herstellung von Arzneimitteln, die
gegen Autoimmunkrankeiten wirksam sind, zur Linderung dieser
Krankheiten und zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten bei
Säugern, einschließlich Menschen, und zur Verhinderung oder
Verzögerung der Abstoßung von Fremdtransplantat, wobei die
Arzneimittel als Wirkstoff 1 bis 10% einer Dosierung von
Heparin, N-desulfatiertem Heparin oder N-acetyliertem Heparin
enthalten, die erforderlich ist, um eine koagulationshemmende
Wirkung zu erzielen.
Hemmung von Hautreaktionen des DTH-Typs
a. Versuchssystem
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Mäuse wurden auf 4-Ethoxymethylen-2-phenyloxazolon (OX)
durch Bepinseln ihrer Haut zweimal in 5 Tagesintervallen mit
etwa 0,1 ml einer 3%igen OX-Lösung in 4:1 Aceton:Olivenöl
(Volumen) als Träger sensibilisiert. Ihre immunisierten
drainierten Lymphknotenzellen (I-LKZ) wurden dann intravenös in
Empfängermäuse transferiert (5·10&sup7;). Die Fähigkeit der I-
LKZ, die Stelle des Antigens zu erreichen und eine
DTH-Reaktion
zu produzieren, wurde durch Reizen der Empfängermaus
eine Stunde nach dem I-LKZ-Transfer mit 0,02 ml einer 0,5
%igen OX-Lösung, die an das Ohr gepinselt wurde, untersucht.
Die DTH wurde durch Messen der Dicke der Ohren 24 Stunden
später mit einer Mikrometerschraube bestimmt.
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Die Fähigkeit der transferierten I-LKZ, die Ohren zu
erreichen, wurde durch Markieren der I-LKZ vor dem Transfer
mit radioaktivem &sup5;¹CR (10&sup7; Zellen/ml inkubiert mit 0,1 mCi
&sup5;¹Cr Natriumchromat und gewaschen) und Messen der Menge Zpm,
die die Ohren zur Zeit der DTH erreichen, untersucht.
b. Niedrigdosiertes Heparin hemmt Wanderung an die Stelle der
DTH
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Fig. 1 zeigt, daß eine Dosis von 5 ug Heparin täglich,
verhindert, daß sowohl die I-LKZ das Ohr erreichen (Abnahme
der Zpm), als auch, daß eine DTH Reaktion produziert wird
(Abnahme der Ohrschwellung). Eine höhere Heparindosierung (20
ug täglich) hemmte weder die Wanderung der I-LKZ zu den Ohren
noch die DTH Reagibilität.
c. Niedrigdosiertes Heparin beseitigt die Herstellung von
Heparanase in I-LKZ
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Die vorstehenden Ergebnisse zeigten, daß eine
Behandlung mit niedrigdosiertem Heparin (5 ug) die Fähigkeit von I-
LKZ, die eine DTH verursachen, in die Blutgefäße einzudringen
und sich an der Stelle der Antigenablagerung anzusammeln,
unterdrückte. Um zu erfahren, ob diese Wirkungen mit der
Hemmung endogener Heparanase in Verbindung zu bringen sind,
behandelten wir Mäuse mit hohen (25 ug) oder niedrigen (5 ug)
Heparindosierungen, sensibilisierten sie auf OX und
untersuchten ihre I-LKZ auf die Heparanaseaktivität in vitro.
Fig. 2 zeigt, daß die I-LKZ von Mäusen, die mit
niedrigdosiertem Heparin (5 ug) behandelt wurden, keine
Heparanaseaktivität besaßen. Im Gegensatz besaßen die mit hohen
Heparindosierungen (25 ug) behandelten Mäuse eine
Heparanaseaktivität, die ähnlich der der unbehandelten Kontrollmäuse
war. So bewirkte eine Behandlung mit 5 ug Heparin in vivo
eine wesentliche Abnahme der Enzymaktivität in
sensibilisierten Lymphozyten.
d. Niedrigdosiertes Heparin beseitigt keine in situ DTH
Reaktion
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Falls die Hemmung von Heparanase und des
Heparanase-abhängigen Transports der Hauptmechanismus ist, durch den
niedrigdosiertes Heparin eine DTH unterdrückt, müßte man fähig
sein, die Hemmung von DTH durch Umgehung des Bedarf des
vaskulären Transports der sensibilisierten T-Lymphozyten, zu
umgehen. Demgemäß behandelten wir Empfängermäuse mit einer
Inhibitordosis (5 ug) Heparin und injizierten dann die Donor I-
LKZ direkt in die Ohren, nicht intravenös. Tabelle 1 zeigt,
daß Einbringen der sensibilisierten Lymphozyten in situ die
Inhibitorwirkung von 5 ug Heparin auf die DTH umging. So
schien eine Behandlung mit niedrigdosiertem Heparin eine DTH
nur zu hemmen, falls die DTH verursachenden Lymphozyten über
den Weg der Blutbahn zu der Stelle des Antigens gelangen
mußten.
e. Schlußfolgerungen:
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1. Eine Niedrigdosis Heparin hemmt eine DTH Reaktion, wie bei
der Abstoßung von Transplantationen und Autoimmunkrankheiten
bei Versuchstieren.
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2. Diese Wirkungen werden mit einer Abnahme der
T-Lymphozyten-Heparanase und der T-Lymphozyten-Wanderung an die
Stelle des Antigens in Verbindung gebracht.
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2. Niedrigdosiertes Heparin hemmt DTH-Reaktionen beim
Menschen
a. Gesunde Freiwillige
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6 junge erwachsene Medizinstudenten wurden in 48 Std.
auf ihre spontanen Haut-DTH-Reaktionen auf Tuberculin,
Tetanusimpfstoff, Mumpsantigen oder Diphtherieimpfstoff
untersucht und dann mit einer einzelnen täglichen subcutanen
Injektion von 300-500 Einheiten Heparin behandelt. Zwei Wochen
später, während die Heparinbehandlung fortgesetzt wurde,
wurden ihre DTH-Reaktionen wieder gemessen und es wurde
festgestellt, daß die positiven Reaktionen bei allen 6 deutlich
vermindert waren. Die Heparinbehandlungen wurden unterbrochen
und 2 Wochen später wurde beobachtet, daß die DTH-Reaktionen
ihren ursprünglichen Reaktivitätszustand erreichten.
Wiederholte Verabreichung von Heparin bewirkte wieder eine
deutliche Abnahme der DTH-Reaktivität und Stoppen der Behandlung
führte zu einer Wiedererlangung der ursprünglichen
Reaktivität.
b. Patienten, die an multipler Sklerose leiden
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Bei der Vorbereitung eines Klinikversuchs von
niedrigdosiertem Heparin bei multipler Sklerose wurden 12 Patienten
mit täglichen Dosierungen von 300-1000 Einheiten Heparin
behandelt und, ähnlich zu den gesunden Freiwilligen, zeigten
alle 12 eine Abnahme der DTH-Reaktivität.
c. Eine Niedrigdosierung Heparin bewirkt eine Besserung bei
rheumatischer Arthritis.
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Da DTH-Reaktionen auf Selbstantigene bei
Autoimmunkrankheiten beteiligt sind, haben wir begonnen,
Niedrigdosierungen Heparin (etwa 300-500 Einheiten täglich) bei Patienten
mit rheumatischer Arthritis zu untersuchen. Drei Patienten
mit schwerer Arthritis wurden 1 Monat lang behandelt und bei
allen 3 trat eine Besserung ein; sie fühlten sich subjektiv
besser und sie zeigten eine Abnahme in ihren klinischen
Gebrechen und der Arthritis, wie durch ihre Ärzte bestimmt
wurde.
LEGENDE ZU DEN FIGUREN
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Fig. 1: Behandlung mit Heparin (0,05 mg/kg) verhindert die
Abstoßung von Hautfremdtransplantationen. Mäusen des
Hybridenstamms (BALB/c·C57BL/6) F1 wurde Haut von allogenen
SJL/J-Mäusen transplantiert. Die Mäuse (20 pro Gruppe) wurden
täglich mit subcutanen Injektionen von Kochsalzlösung
(Quadrate) oder Heparin ("Leo", 0,05 mg/kg; Rauten) behandelt und
die Überlebensdauer der Hauttransplantation bewertet. Die
mittlere Überlebensdauer war für die Kontrollgruppe 10 Tage,
während sie für die mit Heparin behandelte Gruppe 24 Tage
war.
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Fig. 2: Behandlung mit N-desulfatiertem, N-acetyliertem
Heparin (10 mg/kg) verhindert die Abstoßung von
Hautfremdtransplantationen. Mäuse wurden, wie in der Legende zu Fig. 1
beschrieben,
transplantiert, und sie wurden täglich mit
Kochsalzlösung (Quadrate) oder N-desulfatiertem, N-acetyliertem
Heparin (10 mg/kg; Rauten) behandelt. Die mittlere
Überlebensdauer der Hauttransplantation bei den Kontrollgruppen
war 10 Tage, während sie für die behandelte Gruppe 20 Tage
war.
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Fig. 3: Behandlung mit Heparin (0,1 mg/kg) hemmt durch
autoimmune T-Lymphozyten produzierte EAE. Beginnend 1 Tag vor
der Beimpfung mit den T-Lymphozyten, wurde den Ratten täglich
0,02 mg Heparin subcutan injiziert (0,1 mg/kg; Quadrate). Den
Kontrollratten wurde Kochsalzlösung injiziert (Rauten). Die
klinische Bewertung der EAE wurde wie folgt beurteilt:
Schwanzschwäche -25; Lähmung der hinteren Gliedmaßen -50;
Lähmung aller 4 Gliedmaßen -75; im Sterben liegend -100.
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Fig. 4: Behandlung adjuvanter Arthritis unter Verwendung von
modifiziertem Heparin (N-desulfatiertes, N-acetyliertes) in
verschiedenen Dosen. Ratten wurden immunisiert wie in der
Legende zu Tabelle 4 beschrieben, um eine adjuvante Arthritis
hervorzurufen. Ab dem 9. Tag wurden die Ratten einmal täglich
mit N-desulfatiertem, N-acetyliertem Heparin in Dosen von 0
mg ( ), 0,001 mg (-), 0,02 mg (x) oder 0,04 mg ( ) subcutan
geimpft. Die Dosis von 0,02 mg bewirkte eine deutliche
Hemmung der Arthritis.
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Fig. 5: Behandlung mit N-desulfatiertem, N-acetyliertem
Heparin (0,1 mg/kg) bewirkt eine Remission bestehender
adjuvanter Arthritis (AA). Zwanzig Lewis-Ratten wurden mit
Mycobacteria tuberculosis geimpft, um eine AA wie beschrieben (3,11)
hervorzurufen. Klinische Arthritis wurde mit einer Skala von
0 (keine Arthritis) bis 100 (deutliche Schwellung,
Empfindlichkeit und Rötung aller 4 Pfoten) bewertet. Am 21. Tag,
wenn alle Ratten unter deutlicher Arthritis litten, wurden 10
subcutan mit Kochsalzlösung geimpft (Quadrate), und 10 wurden
mit N-desulfatiertem, N-acetyliertem Heparin (0,1 mg/kg) bis
zum 51. Tag behandelt.
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Fig. 6
Links:
Niedrigdosiertes Heparin hemmt eine angenommene transferierte
DTH.
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I-LKZ wurden aus OX sensibilisierten Mäusen (Gruppen A-C) und
natürliche LKZ aus unsensibilisierten Mäusen (Gruppe D)
erhalten. Die LKZ wurden intravenös in natürliche Empfänger,
die mit Heparin (5 ug oder 20 ug) behandelt (Gruppen B-C)
oder unbehandelt (Gruppen A, D) waren. Das Heparin wurde 18
Std. und 1 Std. vor dem Zelltransfer und 20 Std. nach dem
Zelltransfer injiziert. Eine DTH Ohrschwellung wurde durch OX
zur Zeit des Zelltransfers hervorgerufen und 24 Std. später
gemessen.
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Rechts:
Heparin hemmt die Zellwanderung an die Stelle des DTH Reizes.
Das Experiment wurde wie in Fig. 1 (links) beschrieben
durchgeführt, außer daß die I-LKZ vor dem Zelltransfer in die
natürlichen Empfängermäuse mit &sup5;¹Cr radioaktiv markiert
wurden. Die Ansammlung der I-LKZ in den durch OX gereizten Ohren
wird durch das &sup5;¹Cr angezeigt (Zpm/Ohr).
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Fig. 7: Heparin hemmt Heparanase in vivo.
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Mäuse wurden mit OX an den Tagen 0 und 5 immunisiert. Einige
der Mäuse wurden mit Heparin (5 ug oder 25 ug pro Injektion)
18 Std. vor und 2, 10 und 20 Std. nach der Immunisierung mit
OX am 5. Tag behandelt. Am 6. Tag wurden die I-LKZ entfernt
und auf Heparanaseaktivitität durch 48 Std. lange Inkubation
mit markiertem ECM untersucht. Heparansulfat-Abbauprodukte
für I-LKZ in den folgenden Gruppen von Mäusen sind
aufgeführt: Kein Heparin - 0; 25 Kg Heparin - X; 5 Kg Heparin - 0.
Die LKZ der nicht auf OX immunisierten Kontrollmäuse zeigten
keine Heparanaseaktivität (nicht gezeigt).
TABELLE 1 Hemmung der Heparanaseaktivität
Test Inhibitor Hemmung des Abbaus von Heparansulfat durch Heparanase intaktes Heparin vollständig desulfatiertes Heparin N-desulfatiertes, N-acetyliertes Heparin ja nein
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Eine Heparanaseaktivität wurde im extracellulären
Medium durch Baden der aktivierten T-Lymphozyten hervorgerufen
und durch Inkubieren des Mediums mit extracellulärer Matrix,
deren Heparansulfat mit ³&sup5;S wie beschrieben (Naparstek, Y.,
Cohen, I.R., Fuks, Z. und I. Vlodavsky, Activated T
lymphocytes produce a matrix-degrading heparan sulphate
endoglycosidase. Nature 310:241 (1984)) markiert wurde
untersucht. Eine Hemmung der Heparanaseaktivität wurde durch
Zugabe verschiedener Konzentrationen Heparin oder modifizierter
Heparine zum Reaktionsgemisch und wie beschrieben (Naparstek,
Y., Cohen, I.R., Fuks, Z. und I. Vlodavsky, Activated T
lymphocytes produce a matrix-degrading heparan sulphate
endoglycosidase. Nature 310:241 (1984)) Messung der Wirkung auf
den Abbau des markierten Heparin-Sulfats untersucht.
Vollständig desulfatiertes Heparin und N-desulfatiertes,
N-acetyliertes Heparin wurde wie beschrieben hergestellt (Ayotte,
L., A.S. Perlin, NMR spectroscopic observations related to
the function of sulfate groups in heparin. Calcium binding
vs. biological activity, Carbohydrate Res. 145:267 (1986)).
TABELLE 2 Wirkung auf die Prothrombinzeit von Heparinen
Injizierte Substanz Dosis Prothrombin Zeit Koagulationshemmung Keine Heparin N-desulfatiertes, N-acetyliertes ja nein
-
10 Wochen alten Lewis-Ratten mit einem Gewicht von 250
g wurde zwei Tage lang die angezeigte Heparindosierung einmal
täglich subcutan injiziert. Die Prothrombinzeit wurde dann
wie im "Prothrombin Set - OTX8" (Hoechst-Behring, Marburg,
BRD) beschrieben untersucht.
TABELLE 3 Hemmung experimenteller Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE)
durch Behandlung mit einer subkoagulationshemmenden Dosis
intakten Heparins oder mit modifiziertem Heparin
(N-desulfatiertes, N-acetyliertes)
Mittel Dosis Verursachung der EAE % Auftreten Tag des Einsetzens Dauer (Tage) Klinische Bewertung Kein T-Zellinie Modifiziertes Heparin Präparierter Lymphknoten
-
EAE wurde durch intravenös es Impfen der Lewis-Ratten
mit einer T-Zellinie von anti-BP T-Lymphozyten (10&sup6; Zellen)
mit anti-BP präparierten Lymphknotenzellen (10&sup7; Zellen)
hergestellt (Cohen, I.R., Experimental autoimmune
encephalomyelitis: Pathogenesis and prevention. In: Immunoregulatory
Processes in Multiple Sclerosis and Experimental Allergic
Encephalomyelitis. A.A. Vandenbark und J.C.M. Raus, Hrsg.,
Elsevier Biomedical Res. Amsterdam, 7:91-125 (1985)). Einen
Tag vor der Impfung und einmal täglich 10 Tage lang erhielten
die Ratten entweder Kochsalzlösung oder Heparine. Die Ratten
wurden auf die Entwicklung einer Lähmung eingestuft nach 1
für Schwanzschwäche; 2 für Lähmung der hinteren Gliedmaßen; 3
für Lähmung der hinteren und vorderen Gliedmaßen; und 4 für
am Sterben liegend, untersucht.
TABELLE 4 Behandlung adjuvanter Arthritis durch
sub-koagulationshemmende Heparindosierungen
Heparin Dosis Adjuvante Arthritis Dauer (Tage) Maximale klinische Bewertung
-
Ratten wurden mit M. tuberculosis (1 mg) in Öl
immunisiert, um eine adjuvante Arthritis hervorzurufen (Pearson,
C.M., Development of arthritis, periarthritis and periostitis
in rats given adjuvant, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 91:91
(1956)). Ab dem 9. Tag wurden die Ratten einmal täglich 5
Tage lang mit verschiedenen Heparindosierungen subcutan
geimpft und die Entwicklung der Arthritis mit einer Skala von
0-16 wie beschrieben bewertet (Holoshitz, Y., Y. Naparstek,
A. Ben-Nun, I.R. Cohen, Lines of lymphocytes mediate or
vaccinate against autoimmune arthritis. Science 219:56
(1983)).
TABELLE 5 Quellen des für die Hemmung adjuvanter Arthritis untersuchten
Heparins
Heparin Firma Bewertung der Arthritis Hemmung der Arthritis Leo Arzneimittel Ballerp, Dänemark ja (Rinderlunge) Sigma Chemical Co. St. Louis, MI, USA BDH Chemicals Poole, England Thromboliquin Organon Teknika, Boxtel, Holland teilweise Unbehandelt
-
Adjuvante Arthritis wurde in Lewis-Ratten hervorgerufen
und die Ratten wurden mit den angegebenen Heparinquellen, wie
in der Legende zur Tabelle 4 beschrieben, behandelt. Die
mittlere Arthritisbewertung, bestimmt am 60. Tag, wurde
verwendet,
um die Wirksamkeit der Heparinbehandlung zu
untersuchen.
TABELLE 6 Modifizierte Heparine, die für die Hemmung adjuvanter
Arthritis untersucht wurden
Heparin Bewertung der Arthritis Hemmung der Arthritis Kein intaktes ja N-desulfatiertes, N-acetyliertes O-desulfatiertes, vollständig desulfatiertes nein N-desulfatiertes
-
Adjuvante Arthritis wurde in Lewis-Ratten hervorgerufen
und die Ratten wurden mit modifizierten Heparinen, wie in den
Legenden zu den Tabellen 4 und 5 beschrieben, behandelt. Die
Heparine wurden wie beschrieben modifiziert (Ayotte, L., A.S.
Perlin, NMR spectroscopic observations related to the
function of sulfate groups in heparin. Calcium binding vs.
biological activity, Carbohydrate Res. 145:267 (1986)).
TABELLE 7 Diese Tabelle veranschaulicht, daß Heparin den
Transfer von DTH nicht blockiert, falls die I-LKZ direkt an
der Stelle des Antigenreizes injiziert werden
Empfänger der auf OX sensibilisierten I-LKZ Heparin Behandlung OX Reiz Ohrschwellung Nein Ja
-
Die I-LKZ wurden aus BALB/c Mäusen, die 5 Tage vorher
auf OX sensibilisiert wurden, erhalten. Die I-LKZ wurden
zentrifugiert, in einem RPMI Medium resuspendiert und
intradermal in die dorsale Oberfläche der natürlichen Empfängermäuse
injiziert (3·10&sup6; Zellen/20 u/l). Die Ohren wurden mit OX
unmittelbar nach dem Zelltransfer gereizt. Die Schwere der
Ohrschwellung wurde 24 Std. später bestimmt.