JPS6388127A - 移植拒否反応抑制または自己免疫疾患治療用薬学的組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈発明の分野〉 本発明によれば、抗凝固剤としての効果を発揮する投与
量の約１％−約１０％量のヘパリン又はＮ−デスルフエ
ート、Ｎ−アセチル化ヘパリンを含む、同種移植片拒否
反応の阻止もしくは軽減、あるいは自己免役疾患の治療
もしくは軽減に使用される薬学的組成物が提供される。

目的とする効果を発揮する、ヘパリンの他の誘導体及び
ヘパリンの修正形態にあるものも使用することかできる
。しかしながら全てのヘパリンの誘導体が有効ではなく
、例えば完全デスルフエートヘパリンは所期の目的を全
く達成することができない。

〈発明の背景〉 免疫系は、外部からの侵入に対して個体を守るという重
要な役割力を来たしているか、また免疫系はそれに伴い
、自己自身の組織自体を攻撃する　′場合があシ、それ
によって自己免疫疾患が起こる。

免疫系の他の好ましくない作用としては、移植臓器に対
する拒否反応がある。免疫系の作用によシ自己免疫疾患
が起こるか否か、あるいは同種移植片拒否反応が生じる
か否かは、リンパ球、特に活性化ＴＵンパ球がターケ０
ット器官あるいは移植組織中に侵入出来るか否かに依っ
ている。ターケ９ットへの到達には血Ｗを経由しなけれ
ばならず、従って活性化Ｔリンパ球は血管壁へ侵入しま
た血管壁から出てくることが出来なければならない。従
って、自己免疫疾患あるいは同種移植片拒否反応でのＴ
リンパ球の役割りは、Ｔ’）ンパ球の移動性に影響を与
える手段によって阻止することが出来るものと考えられ
る。

〈発明の開示〉 これまでの研究で、インタクトヘパリン又は化学的に修
正された抗凝固活性を欠い次ヘパリンが、自己免疫疾患
又は同種移植片拒否に対して有効であることが示された
例はない。

Ｔリンパ球はヘパラナー＋！ｈ酵素を発現しそれが、内
皮細胞から分泌され血管と接する細胞外マトリックスの
グリコサミノグリカン部分を攻撃することが、本発明者
らによって最近発見された（Ｎａｐａ−ｒｓｔｅｋ、　
Ｙ、、　Ｃｏｈｅｎ、　１．Ｒ，、Ｆｕｋｓ、　Ｚ、及
び工。

Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ、活性化Ｔリンパ球によるマトリッ
クス分解性へパランスルフェートエンドグリコシダーゼ
の産生、　　Ｎａｔｕｒｅ３１０　：　２４１　（１９
８４））。

この酵素の存在は、自己免役系Ｔリンパ球がＪｆｆｌ官
壁に浸透して実験的自己免疫脳を鎖長と言われるモデル
疾患の中心部を攻撃する能力と密接に関連している。

更には、ヘパラナーゼ酵素はヘパリン、及びＮ−デスル
フェート、Ｎ−アセチル化ヘパリンなどの修正ヘパリン
によって抑制され、また児全デスルフエートヘパリンな
どの他の誘導体くよっては抑制されないことが発見され
た（表Ｉ参照）。

そこで本発明者らは、実験動物にヘパリン又は修正ヘパ
リンを投与して、これらが自己免疫疾患の治療あるいは
同種移植系拒否反応の阻止に使用できるか否かを調べｔ
ｏ 表　　Ｉ インタクトヘパリン　　　　　　　あシ完全デスルフェ
ートヘパリン　　　なしＮ−デスルフエート、Ｎ　　　
　　　あジアセチル化ヘパリン 〔ヘパラナーゼ活性は、活性化Ｔリンパ球と接触し窺細
胞外培地中に誘導され、かかる活性ｔ１文献記載の方法
１：　Ｎａｐａｒｓｔｅｋ、　ｙ、、　Ｃｏｈｅｈ、　
１．Ｒ，＋Ｆｕｋｓ、　Ｚ、及び１．　Ｖｌｏｄａｖｓ
ｋｙ、活性化Ｔリンパ球によるマトリック分解性へパラ
ンスルフェートエンドグリコシダーゼの産生、Ｎａｔｕ
ｒｅ　３１　Ｑ：２４１　（１９８４））Ｋ従ってヘパ
ランスルフェートを３５Ｂでラベル化しこのラベル化さ
れ之ヘパランスルフェートが存在する細胞外マトリック
と培地とをインキュベートすることによりテストし友。

各種濃度のヘパリンあるいは修正ヘパリンを反応混合物
に添加し、文献記載の方法（Ｎａｐａｒｓｔｅｋ、　Ｙ
、、　Ｃｏｈｅｎ、　１．Ｒ，、Ｆｕｋｓ、　Ｚ。

及び１．　Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ、活性化！リンパ球によ
るマトリックス分解性へパランスルフェートエンドグリ
コシダーゼの産生、Ｎａｔｕｒｅ　３１０　：　２４１
（１９８４））に−従ってラベル化へパランスルフェー
トの分解効果を測定することによって、ヘパラン活性抑
制をテストした。完全デスルフエートヘパリン；Ｎ−デ
スルフエート、Ｎ−アセチル化ヘパリンは、文献記載の
方法［Ａｙｏｔｔｅ。

Ｌ、、　Ａ、Ｓ、　Ｐｅｒｌｉｎ、　ヘパリンのスルフ
ェート基Ｋ［し７ｊ　ＮＭＦｔスペクトル観察、カルシ
ウムｉ合性対生物活性、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒ
ｅｓ、　１４５　：２６７（１９８６））に従って、：
Ｎ４製した。〕〈発明の詳細な記述〉 １、Ｎ−デスルフエ−１’、Ｎ−アセチル化修正ヘパリ
ン、又は低投与量のインタクトヘパリンは、ラットに対
して抗凝固活性を示さない。表Ｈには、インタクトヘパ
リンをラット１四癌り１日２η（１０１１９／ｋｇ）の
投与量で投与することによって、。

ラットのプロトロンビンタイムが延長されることが示さ
れている。他方、インドタクトヘパリン０．０２　ｍｇ
　（０，１ｒｖ／ｋｙ　）　ｈるいはＮ−デスルフエー
ト、Ｎ−アセチル化ヘパリン２ｍｌ　１０７１＆／ｋｌ
ｉｌ）の投与量では、抗凝固活性は発揮されなかつ之。

従って、インタクトヘパリン１０〜／に９を投与しに際
に起こる患者の出血の危険性は、抗凝固活性を有しない
低投与量のインタクトヘパリンあるいは化学的修正ヘパ
リンを使用することによって回避することができる。

表　　■ Ｎｏｎｅ　　　　　０　１９　− ヘパリン　　　　　　　　２０　　２５　　　　あシヘ
パリン　　　　　　　０．２　　１７　　　　なし〔体
重２５０９ｍのＬｅｖｔｒｉｓラット（１０週令）に、
ヘパリンを上記の如き投与量で１日１回、２日間に亘っ
て皮下投与した。次いでＰａｔｈｒｏｍｔｉｎＫｉｔ−
ＯＴＸ５”　（Ｈｏｅｃｈｓｔ−Ｂｅｈｒｉｎｇ、　Ｍ
ａｒｂｕｒｇ、　ＦＲＧ）に記載された方法に従って、
プロトロンビンタイムをテストした。〕 ２、修正ヘパリンあるいは低投与量のヘパリンによシ、
皮膚同種移植片拒否が抑制された。Ｆ１マウス（ＢＡＬ
Ｂ／ｃｘ　Ｃ５７Ｂ　Ｌ／　６　）での８．７　Ｌ／Ｊ
皮膚片の生存が第１図に示されている。生理食塩水で処
理したコントロールマウスでの皮膚移植片の生存時間の
中央値は１４日間であ）、他方ヘパリンを毎日０．０５
１／ｋｌｉ＋投与したマウスの場合には中央値な２６日
間でちゃ、最大値は３２日間であった。第２図には、Ｎ
−デスルフェ−１、ｗ−アセチル化ヘパリンを毎日１０
ヤ／に９投与した場合には、異寅遺伝子的皮Ｓ移植片の
生存時間の中央値は、１０−２０日延長されることが示
されている。

これらの績来から、低投与量の準抗（５ｕｂ−ａｎｔｉ
−）凝固活性ヘパリンあるいは修正され之非抗凝固活性
ヘパリンにより、マウスでの異質遺伝子的皮膚移植片の
生存時間か有意流延長されることが判る。

３、修正ヘパリンあるいは低投与量ヘパリンによシ、実
験的自己免役脳を髄炎（ＥＡＥ）　ｆｒ、引き起こす抗
ＢＰＴ　ＩＪンパ球の能力か抑制される。

ＥＡＥは、ヒトでの多発性硬化症を伴う実験的自己免役
疾患である。この疾患は、中枢神経系ミニリンの塩基性
蛋白質（ＢＰ）で免疫化されたＴリンパ球によって引き
起こされる。自己免疫疾患を引き起こすＴリンパ球の能
力に対するヘパリンの効果を胸べるために、Ｔセルライ
ン（Ｃｏｈｅｎ、　１．Ｒ。

実験的自己免疫脳を鎖長：病因及び予防、多発性硬化症
及び実験的アレルヤー性脳を髄炎の免疫真如工程、Ａ−
Ａ−Ｖａｎｄｅｒｂａｒｋ及びＪ、Ｃ，Ｍ、　Ｒａｖｓ
、　ｅｄｓ。

Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓ、　
Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、　７　：　９１−１２５（１９８
５））あるいはＢＰ免疫化マウスのリンパ節細胞集団と
して、ＢＰによって免疫感作されたＴリンパ球を使用し
之。表璽には、準抗凝固活性を示す投与量のインタクト
ヘパリン（０，１■／に９／日）あるいは抗凝固活性を
示さない修正ヘパリン（Ｎ−デスルフェート、Ｎ−アセ
チル化ヘパリン）の投与（１０１ｉ９　／　ｋｇ　／日
）により、抗ＢＰＴリンパ球によシ引き起こされたＥＡ
Ｅの症状が著しく抑えられることが示されている。第６
図には、ヘパリン処理（０，０２ｍｙ／ラット／日；０
・１叩／に！９）ｔ、たラットでのＥＡＥ抑制がグラフ
により示されている。

（Ｌｅｗｉｓラットに、抗ＢＰＴリンパ球のセルライン
（１０６セル）あるいは抗ＢＢ感作すンハ節細胞（１０
フセル）を静脈内投与することによシ接禎して、ＥＡＥ
　’ｉ発症せしめ７（（Ｃｏｈｅｎ、１．Ｒ，。

実験的自己免疫脳を鎖長：病因と予防、多発性硬化症及
び実験的アレルギー性脳を鎖長の免投＝Ｓ工程、Ａ、Ａ
、　Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋ及びＪ、Ｃ，Ｍ、　Ｒａｕｓ
。

ａｄｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　
Ｒｅｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ。

７：９ｌ−１２５（１９８５））。接種１日前から１０
日間、毎日ラットに生理食塩水あるいはヘパリンを与え
ｍ０ラツトについて麻痺の発達状況を観察し、尾が弱ま
る場合を１、後肢の麻痺を２、後肢及び前肢の麻痺の場
合を６、死にかけの状態を４とした。〕 ４、修正ヘパリンあるいは低投与九Ｆのヘパリンによυ
アジュバント関節炎が抑制される。

アジュバント関節炎は、ある系のラットにＭｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原を免疫
することによって訪導することの出来る実験的峡患であ
るＣ　Ｐｅａｒｓｏｎ、　Ｃ，）Ｊ、、関節炎、関節周
囲炎、骨；漢炎のラットでの発達、Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ
、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ。

Ｍｅｄ−９１二９１　（１９５６））。この疾患は、ヒ
トのりウマチ性関節炎のモデルと考えられる〔Ｐｅａｒ
ｓｏｎ、　Ｃ，Ｍ、、リウマチ扶忌０実験的モデル、Ａ
ｒｔｈｒｉｔｉｓ　　Ｒｂｅｕｍ、　　７　　：　　８
　０　　（１９６４）　　〕　ａ　　　リウマチは、軟
骨組域と交差反応するＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ
抗原を認識するＴリンパ球によって引き起こされるもの
と考えられる（　Ｃｏｈｅｎ、　工、Ｒ，，Ｊ、Ｈｏ１
ｏｓｈｉｔｚ。

Ｗ、　Ｖａｎ　Ｅｄｅｎ、　Ａ、　Ｆｒｅｎｋｅｌ、、
　Ｔリンパ球の作用による実験的リウマチの病因及び治
療効果の解明、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｖｍ、　２
９　：　８１　（１９８５）　〕。

表■には、準抗凝固活性を示す投与量のヘパリンによシ
、アジュバント関節炎が著しく抑制されることが示され
ている。１日０．００１　ｍｇのヘパリン投与の場合に
は、リウマチに副次的に有効である。投与量（Ｊ、００
５■及びＬ］、０１　ｒｎ９でより有効となシ、投与力
ｔ　０．０２■でリウマチ抑制効果は最大になる。しか
しながら、０．０４１７１９の高投与量では抑制効果を
示さない。従って治療の用量応答特性は極めてシャープ
でめシ、最も有効な投与量の２倍では、全く活性が失な
われる。用量応答曲想が憶めてシャープであるために、
自己免疫疾、息あるいは移殖片拒否に対するヘパリンの
有効な効果は見逃がされ易い。Ｎ−デスルフエート、Ｎ
−７セチル化ヘパリンなどの修正ヘパリンも、ラット１
匹当シ０．０？夕の投与量（０，１〜／ｋｇ）の時に最
大値を示すシャープな用量応答カーブを示す。よシ尚い
投与ＩＬ（０，０４Ｔｎ９）では効果がない（第４図参
照）。

表　　■ ０　　　＞２０　１０ ０．０４　　　＞２０　１０ ０．０２　　８　２ ０．０１　　１５　５ ０．００５　　１６　４ （ラットをＭ、　ｔｏｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　（１ｍｇ
　）を含むオイルで免疫してアジュバント関節炎を誘導
した［　Ｐｅａｒｓｏｎ、　Ｃ，Ｍ、、関節炎、関節周
囲炎、骨膜炎のラットでの発達、Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ、
　Ｅｃｐ。

Ｂｉｏｌ、　Ｍｏａ、９１：９１（１９５６））。９日
後に、各種の投与量のヘパリンを１日１回、５日間皮下
投与し、関節炎の発達の程度をスケール０−１６でスコ
ア付けし７ｒ−（Ｈｏ１ｏｓｈｉｔｚ、　Ｙ、ｅＹ、　
Ｎａｐａｒｓｔｅｋ、　Ａ、　Ｂｅｎ−Ｎｕｎ、　１．
Ｒ，Ｃｏｈｅｎ、、リンパ球の仲介あるいは自己免役関
節炎に対する接種、５ｃｉｅｎｃｅ　２１９　：　５６
　（１９８３）　］　。

第５図には、修正ヘパリン（Ｎ−デスルフエート、Ｎ−
アセチル化ヘパリン）を０．１号／ｋｇ／日の投与量で
２１日目から５１日目まで投与することによシ、アジュ
バント関節炎が軽減されることが示されている。しかし
て、関節炎がすでに臨床的に重くなっている場合でも修
正ヘパリンは有効であることが判る。関節の組織所見で
は、コントロールラットの場合には重度の炎症が見られ
、処置ラットの関節は正常でめつ友。

表ＶＫは、開業的に入手し得る各種ヘパリンについて、
関節炎肪専後８日目から毎日５日間皮下投与することに
よる、関節炎の長期間（６０日〕抑′ＭＪ能力に関して
のテスト結果か示されている。

４橿のヘパリンのうち３つは非常に有効であったが１つ
は一部のみに有効であつ７Ｃ（Ｏｒｇａｎｏｎ社）。

しかして各種のヘパリンを用いて、活性成分とす′　る
ことができる。

表　　Ｖ Ｔｈｒｏｍｂｏｌｉｇｕｉｎｅ　Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅ
ｋｎｉｋａ（Ｂｏｘｔｅｌ、Ｈｏ１ｌａｎｄ）　　２．
５　　　一部あり未処理　　　　　　−５ （Ｌｅｗｉｓラットにアジュバント関節炎を誘導して、
表１ｖに示したと同様にして各種のヘパリンで処理した
。６０日目の関節炎の平均スコアーを求めて、ヘパリン
処理による効果を調べ之。〕表■には、各種の修正ヘパ
リンについて、上記した如き６０日目でのアジュバント
関節炎の長期間卯制に関してテストしに７姑来が示され
ている。

完全デスルフエートヘパリン、Ｎ−デスルフェートヘパ
リンは、関節炎処理には有効でない。しかしながら、Ｎ
−デスルフエート、Ｎ−アセチル化ヘパリン及び０−デ
スルフエート、Ｎ−７セチル化ヘパリンは、ヘパリンと
同様に有効である。表ＩＩＩＫ示されているように、１
ω正ヘパリンは、抗凝固活性？はとんど示さない。かく
して、望ましくない免疫学的反北、は、抗凝固活性を示
す危険性のない各種ヘノぐリン調製物によって抑１ｔｒ
ｌＪすることができる。

表　　ｖｌ バンド関節炎抑制テスト Ｎｏｎｅ　　　　　　　　　　　６　　　　　−インタ
クトヘパリン　　　　　　　０　　　　　　　ありＮ−
デスルフエート、　　　　　　　０　　　　　　　あシ
Ｎ−アセチル化ヘパリン ０−デスルフエート、　　　　　　　０　　　　　　　
りりＮ−アセチル化ヘパリン 完全デスルフエート　　　　　５　　　　　なしヘノぐ
リン ＣＬｅｗｉｓラットにアジュバント関節炎を篩尋せしめ
て、表１ｖ及びＶに示したと同様にして修正ヘパリンで
処理した。修正ヘパリンは、文献に記載笛れた方法（Ａ
ｙｏｔｔｅ、　Ｌ、、　Ａ、Ｓ、　Ｐｅｒｌｉ；１゜ヘ
パリンのスルフェート基に関してのＮＭＲスペクトル観
察、カルシウム結合性対生物学的γ占性、Ｃａｒｂｏｈ
ｙｄｒａｔｅｓ　Ｒｅｓ、　　１　４５　　：　　２６
７　（１９６８））に従って調製した。

５、髄正ヘパリンによシ、活性化Ｔリンパ球が通管へ侵
入しめるいは血管から出ることが抑制される。

７９７８球の移動に与える修正ヘパリンの幼果をテスト
するため、リンパ球を５　”Ｃｒでラベル化して、皮下
部位からのラベル化ＴＵンパ球の取シ　′込み及び血液
中でのラベル化Ｔ＋７ンパ球の残存量をｍａｊ定し７こ
。５−６日間、ラット又はマウスの尾に修正ヘパリンを
注射した（酊−デスルフェート、Ｎ−７セチル化ヘパリ
ン；　０．０５　〃ｙ／ｋｇ）　８位には、ラベル化リ
ンパ球が残存しておシ、他方コントロールラット又はマ
ウスでは、１日−２日以内でコントロール注射部位から
ラベル化リンパ球が移動してい友。

史には、修正ヘパリン処置により、ラベル化リンパ球は
血液中に４−５日間残存し１おり、他方、未処置ラット
ま７こはマウスでは、１日で血液からラベル化リンパ球
は除かれｔいた。しかして、修正ヘパリン処置によＪ、
’Ｉｌンパ琢が皿背中に侵入する能力が抑制され、−度
血・Ｕ中に人つ次場合には皿ｔから出ることが阻止され
る。このこと【より、血管壁の細胞外マトリックスに浸
透するのに必要とされるヘパラナーゼ酵素活性が抑制さ
れるものと考えられる。このために、７９７８球によシ
自己免疫疾患あるいは移植拒否反応と引き起こす能力が
抑制される。

これらの結果から、ヘパリンあるいはＮ−デスルフエー
ト、Ｎ−アセチル化ヘパリンなどのヘパラナーゼ抑制因
子を用いて自己免役あるいは同極移植片拒否反応を閉止
できることが判る。ヘパリンの有効投与針は０．１啼／
ｋｇでありこれは、抗凝固活性を示すに心労な投与量（
１０ｎ・９／ｍ）の約１チあるいはそれ以下に相当する
。１・１つて、望ましくない免疫反応の阻止活性と抗凝
固粘性とを分離することが可能である。Ｎ−デスルフエ
ート、Ｎ−７セチル化ヘパリン及びＯ−デスルフエート
、Ｎ−アセチル化ヘバリンビ、内因的に抗凝固活性を有
さす、低投与ｆｆｒ　（０，１Ｉｎ９／ｍ　）であって
もこれらは望ましくない免疫反応を阻止することはでき
るが、１０ｒＩＩ９／〜の高投与量で使用することもで
きる。表１ｖに示されるように、０．０２η／ラツ）　
（０，１１Ｍ／／ｋｇ）の投与量が疾患治療に最適であ
り、一方０．０４〜／ラット（０，２啼／に９）の高投
与量では有効でないため、投与量は臨界的である。

Ｎ−デスルフエート、Ｎ−アセチル化ヘパリンについて
もＩ？５］様に、投与量に対する感度が観察された（第
４図）。

この処置は、新規でかつ現在使用されている免疫抑制剤
の一般的な毒性を避けることができる。

Ｔリンパ球ヘバラナーゼ活性を抑制するヘパリン、修正
ヘパリンは、ヒトの中枢神経系、関節、筋肉、腎、肝、
皮膚、消化器官、血液エレメント、内分泌系器官、正殖
器官などの免疫疾患の治療、あるいは同種移植系拒否反
応の阻止に使用することができる。

ＤＴＨ皮屑反応の抑制 改、アッセイシステム ６％４−エトキシメチレン−２−フニニルオキサゾール
（ＯＸ）　’に含む４：１アセトン：オリーブオイル（
容積比）の媒体０．１−を、５日問おきに２回、マウス
の皮膚に塗布して、マウス′ｆＩ：ＯＸで感作せしめた
。感作リンパ節排出細胞（Ｉ−ＬＮＧ）を、次いでマウ
スに静脈投与して他のマウスに移した（　５　Ｘ　１０
７）。Ｉ−ＬＡＪＣが抗原部位に到達しＤＴＨ反応を生
起せしめる能力を、Ｉ−ＬＮＣを投与１時間後マウスの
耳に０．５％ＯＸ　０．０２−を塗布してチャレンジす
ることによシアツセイした。２４時間後、耳の厚さをマ
イクロメーターで測定することによってＤＴＨ反応を確
認した。

投与されたＩ−ＬＮＣが耳に到達する能力を、投与前の
Ｉ−Ｌ〜Ｃを放射活性５　”Ｃｒでラベル化しく１０７
セル／Ｍを０．１　ｍＣｉ”Ｃｒクロム酸ナトリウムで
インキュベートし次いで洗浄した）　ＤＴＨ反応時間後
に耳に到達したｃｐｍ　ｋｌを測定することによってテ
ストした。

ｂ、低投与量ヘパリンによｐ、ＤＴＨ部位への移動が抑
制される。

第６図には、ヘパリンを毎日５μｇ投与することによＪ
　、Ｉ−ＬＮＣが耳に到達するのが阻止され（ｃｐｍの
減少）、ＤＴＨ反応の生起か抑制される（耳の禮れ力Ｓ
減少する）ことが示ちれている。烏投与量（１日２０μ
ｇ）のヘパリンでは、Ｉ−ＬＮＣの耳への移動を阻止す
ることか出来ず、またＤＴＨ反応性を抑制するしともで
きない。

Ｃ１低投与ｈ：：のヘパリンによシ、Ｉ−ＬＮＣでのヘ
パラナーゼ発現が阻害される。

上記し之結氷から、低投与量（５μｇ）のヘパリン処置
により、ＤＴＨｉ仲介するＩ−ＬＮＣが血管へ侵入して
抗原部ぜへ集まる能力が抑制されることが判る。これら
の効果は、内生のヘパラナーゼ抑制と関連しているか否
かを調べるため、高投与量（２５μｇ）及び低投与量（
５μｇ）のヘパリンでマウスを処置し、次いでＯＸで感
作せしめて、Ｉ−ＬＮＣのヘパラナーゼ活性をｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏで調べた。

第７図には、低投与量（５μｇ）のヘパリンで処置した
マウスのＩ−ＬＮＣ＃、ｃ％ヘバラナーゼ活注がないこ
とが示されている。他方、高投与量（２５μｇ）のヘパ
リン処置マウスのＩ−ＬＮＣｒ［′、未処置コントロー
ルマウスと同様のヘパラナーゼ活性？有していた。かく
して、ヘパリン５μｇのｉｎ　ｖｉｖ。

処置により、感作リンパ球での酵素活性が実質的に減少
せしめられる。

ｄ、低投与量ヘパリンによっては、１ｎｓｉｔｕＤＴＨ
反応は阻害さｔ’Ｌない。

ヘパラナーゼ抑制とヘバラナーゼ依存移動が、低投与量
ヘパリンによるＤＴＨ抑制の主たるメカニズムであると
すれば、感作Ｔリンパ球が血管へ移動する必要性を回避
することによってＤＴＨ抑制が回避されるものと考える
ことができる。そこで、抑制活性を有する投与量（５μ
ｇ）のヘパリンでマウスを処置し、次いで耳にドナーＩ
−ＬＮＣ’Ｔｈ、静脈内ではなく直接注射した。表１１
１には、感作リンパ球をｉｎ　５ｉｔｖで投与すること
によって、ヘパリン５μｇ投与によるＤＴＨの抑制効果
が回泣辷れることが示されている。かくして、ＤＴＨ仲
介Ｔリンパ球が、循環経路を経由して抗原部位へ到達す
る必要がある時にのみ、低投与量のヘパリンによってＤ
ＴＨが抑制されるものと考えられる。

表　　■１ 〔５日前にＯＸ″ｒｉ格作したＥＡＬＢ／Ｃ’マウスか
らＩ　−ＬＮＣを侍た。Ｉ−ＬＮＣ’を遠心して、ＲＰ
ＭＩ培地に再懸濁せしめ（３Ｘ　１０’セル／２０μ４
υ、まだ何も処置していない未処置マウスの耳の背部表
面に皮肉投与した。皮肉投与直後に、耳をＯＸでチャレ
ンジした。２４時間後に、ＤＴＨによる耳の腫れの程度
を測定し友。〕 ｅ、結論 １、　低投与量のヘパリンによって移槓拒否が抑制され
、実験動Ｃ吻での自己免疫疾患が抑制されると同様に、
ＤＴＨ反応も抑制される。

２、　これらの効果は、Ｔリンパ球ヘパ乏ナーゼの減少
及び抗原部位へのＴリンパ球の７移動に密接に関連して
いる。

２、　ヒトでの低投与＆　＜でよるＤＴＨ反応の抑制ａ
、健健常人ボランティー −名の医学生について、ツベルクリン、破傷風トキソイ
ド、耳下腺炎抗原あるいはジフテリアトキソイドに対す
る皮膚ＤＴＨ反応を４８時間後にテストし、次いでヘパ
リン３００−５００単位を１日１回皮下投与した。ヘパ
リン処置を継続して２週間後に、再びＤＴＨ反応を測定
したところ、６名のそれぞれに陽性反応の著しい減少が
親察された。

ヘパリン処置を止めて２週間後にｎ、ＤＴＨ反応は、最
初の反応状νくにもどっていることが四路された。

再びヘパリン投与？繰り返したところ、ＤＴＨ反応性は
著しく減少し、処１次を止めたところ、最初の反応性が
回復した。

ｂ、多発性硬化症患者 多発性硬化症に対する低投与量ヘパリンの臨床テストを
行なうため、１日に３００−１０００単位のヘパリンを
１２名の思考に投与した。健常人の場合と同ｓｐｃ、１
２名すべての患者においてＤ’ｌ”Ｈ反応性か減少した
。

Ｃ０低投与量ヘパリンによるリウマチ性関節炎の改善 自己免疫疾患では自己抗原に対するＤＴＨ反応が起こる
ので、リウマチ性関節炎患者に低投与量（約３００−５
００単位７日）でヘパリンを投与した。関節炎重症患者
３名に１ケ月間ヘパリン処宜を行なったところ、６基金
部が改善された。６名の患者は、よくなったと感じ、医
師も認めるように廃疾及関節炎かは善された。

第１図 ヘパリン（０，Ｊ　５牧／ユ）処置により、皮膚間１移
植片拒否反応が阻止される。ノ・イブリット系マウスＦ
　１　（ＢＡＬＢ／ＣＸＣ５７Ｂ　Ｌ／６　）に、異種
遺伝子的８ＪＬ／Ｊマウスの皮膚を移植した。マウスに
（１群２０匹）、毎日、生理食塩水（四角状：口）ある
いはヘパリン（Ｌｅ、−ｒ社、０．０５　Ｉｆｌｌｋｇ
　；羨形状二◇）を皮下投与し、皮膚移植片の生存を鯛
べた。コントロール群の生存中央値は１０日であシ、他
方、ヘパリン処置グループの中央値は２４日であった。

第２図 Ｎ−デスルフエート、Ｎ−７セチル化ヘパリン（１０■
／に９）処置によシ、皮膚同種移植片拒否反応が阻止さ
れる。第１図の場合と同様にして、マウスに移植し、毎
日、生理食塩水（四角状：口）アルいｉＮ−デスルフエ
ート、Ｎ−アセチル化ヘパリン（ｉｏＩｎｙ、／ｋｇ；
菱形状；◇）と投与した。

フントロール群の皮膚同抛移植片の生存中央値は１０日
であシ、処置群の中央イ直ｒ１２０日であった。

第６図 ヘパリン（０，１■／に９）処置により、自己免疫Ｔリ
ンバエメにより誘導される肱Ｅが抑制される。

Ｔリンパ球接棟１日痔１ｊから、ヘパリン０．０２　ｍ
ｔｙを毎日皮下投与し７ｊ　（０，１ｍｇ／に９　；四
角状コロ）。

函ドルラットには、生理食塩水を投与し之（菱形状：◇
〕。工臨床スコアーを評価し、尾の弱体化−２５、後肢
の麻痺−５０、四肢の麻痺−７５、死にかけた状態−１
００とした。

第４図 各種投与量の（ｈ正ヘパリン（Ｎ−デスルフエート、Ｎ
−アセチル化ヘパリン）を用いｍアジュバント関節炎処
置ケ示している。表■に記載され次と同様にしてマウス
を免疫化し、アジュバント関節炎を誘導せしめ定０９白
筒から、１日１回、Ｎ−デスルフエート、Ｎ−アセチル
化ヘパリンを０Ｔｎ９＜◇）、０．００１　Ｉｎ９（−
）、０．０２１ｖ（Ｘ）、０．０４ヤ（ロ）の投与かで
皮下投与しｋ。０．０２η夕投与量で関節炎が有意に抑
制された。

第５図 Ｎ−デスルフエート、Ｎ−アセチル化ヘパリン（０，１
〜／ｋｇ）処置により、アジュバント関節炎（ＡＡ）が
改善される。２０匹のｌｃｗｉｓラットにｕｗｒｒｙｒ
）ト１ｍｔ＋＋ｔｓｒ１角す、、＋＋−−−、−ｑ−−
＝−Ａ−二５４１山１イΔΔＡ−誘導せしめ友。臨床関
節炎について、ｏ（関節炎なし）−１００（著しく腫れ
、四肢が柔かくな）赤くなる）のスコアーで評価した。

２１日白筒すべてのラットは関節炎になった。１０匹の
ラットについては生理食塩水（菱形状：◇）を、他の１
０匹についてはＮ−デスルフェート、Ｎ−７セチル化ヘ
パリン（、０，１１Ｒ９／ｋｇ）を５１日白筒で皮下投
与した。

第６図 左側のグラフは、他からトランスファーされたＤＴＨが
低投与量ヘパリンによって抑制されることを示している
。

０ＸＩｆ＆作マウスからＩ−ＬＮＣ（Ａ　−Ｃクループ
）を、非感作マウスから未処置ＬＮＣ（Ｄグループ）を
得た。ＬＮＣｉ被検ラットに静脈内投与した。この被検
ラットでＢ−Ｃグループは、ＬＮＣ投与前１８時間前、
１時間前及び投与２０時１ｉ、ｉ１後にヘパリン（５μ
ｇまたは２０μｇ）で処置した。Ａ、　　Ｄグルー′ｆ
はヘパリン処置しなかつ之。ＬＮＣ投与時にＯＸにより
、ＤＴ）（の耳の浦れが誘導され、２４時間後に耳の腫
れを１ｔＩｌｊ定し友。

右側のグラフは、ＤＴＨチャレンジ部位への細胞の移動
かへバリンによって抑制されることを示している。

未処置マウスにＬＮＣを投与する前に、Ｉ−ＬＮＣを５
１０ｒで放射標識化する以外は、上記と同様にして実験
２行なった。ＯＸでチャレンジされた耳へのニーＬＮＣ
の集積を５１Ｃｒ　（ｃｐｒＨ／耳）で示した。

第７図 ヘパリンによるｉｎ　ｖｔｖｏでのヘパラナーゼ抑制が
示されている。

０８目及び５日目にマウスをＯＸで免疫化し友。

あるマウスについては、５日目にＯＫで免疫化する１８
時間前、２時間後、１０時間後及び２０時間後に、ヘパ
ラン活性した（５ｔｔｇあるいは２，５μｇ注射）。６
日目にＩ−ＬＮＧを採取し、ラベル化ＥＣＭで４８時間
インキュベートすることによりヘパラナーゼ活性を調べ
た。以下のグループから得７ｊニーＬＮＣについてのへ
パランスルフェート分解生成物が示されている。十二ヘ
パリン未処理、−Ｘ−：２５μｇヘパリン処ｔｆＬ−ｏ
−：５μｇヘパリン処置。ＯＸで免疫化しないコントロ
ールマウスのＩＪＣは、ヘパラン活性を示さなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヘパリン処置により皮膚同種移植片拒否反応
が阻止されることを示すグラフである。 １２１１Ｕ、Ｎ−デスルフエート、Ｎ−アセチル化ヘパ
リン処置洗よシ皮膚同種移植片拒否反応が阻止されるこ
とを示すグラフである。 第６図は、ヘパリン処置によ、！ｌ）　ＥＡＥが抑：Ｈ
されることを示すグラフである。 第４図は、各種投与量のＮ−デスルフエート、Ｎ−７セ
チル化ヘパリンを用いｔアジュバント１１節炎の治療に
ついてグラフで示したものである。 第５図ｉ１、Ｎ−デスルフエート、Ｎ−アセチル化ヘパ
リンによシアシュバント関節炎が改善されることを示す
グラフである。 第６図は、ヘパリンによりＤＴＨ反応性が抑制されるこ
とを示すグラフである。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗凝固剤としての効果を達成する投与量の１−１
   ０％の量のヘパリン、Ｎ−デスルフェートヘパリン、Ｎ
   −アセチル化ヘパリン又はヘパリンの他の有効な誘導体
   を含む、同種移植片拒否反応の遅延もしくは阻上、又は
   自己免疫疾患の軽減もしくは治療用薬学的組成物。
2. （２）１日当り０．０１−０．２ｍｇ／ｋｇ体重の投与
   量のヘパリンを含む特許請求の範囲第１項記載の薬学的
   組成物。
3. （３）０．０５ｍｇ／ｋｇ／日の投与量のＮ−デスルフ
   ェートヘパリン又はＮ−アセチル化ヘパリンを含む特許
   請求の範囲第１項記載の薬学的組成物。
4. （４）約０．０２ｍｇ／ｋｇ／日の投与量のヘパリンを
   含む、抗関節炎に有効な薬学的組成物。
5. （５）準抗（ｓｕｂ−ａｎｔｉ−）凝固剤としての投与
   量のヘパリン又はその有効な誘導体を含む、本明細書及
   び実施例に記載されたものと実質的に同様の、自己免疫
   疾患に対して有効であり、自己免疫疾患の軽減もしくは
   治療用、あるいは同種移植片拒否反応阻止のための薬学
   的組成物。
6. （６）準抗凝固剤として有効な量のヘパリン又はその有
   効な誘導体を投与することからなる、ヒトを含む哺乳動
   物の自己免疫疾患症状を阻止もしくは軽減し、あるいは
   同種移植片拒否反応を遅延もしくは阻止する方法。