DK175666B1

DK175666B1 - Behandling af autoimmune sygdomme ved oral administration af autoantigener

Info

Publication number: DK175666B1
Application number: DK198906516A
Authority: DK
Inventors: Howard L Weiner; David A Hafler
Original assignee: Autoimmune Inc
Priority date: 1987-06-24
Filing date: 1989-12-20
Publication date: 2005-01-10
Also published as: JP2512796B2; EP0666080A1; DE3854741T2; DE3854741T3; EP0359783A4; WO1988010120A1; JPH02503919A; ATE258065T1; EP0666080B1; DE3856566D1; DE3856566T2; CA1336954C; AU632991B2; DK651689D0; DE3854741D1; ATE130762T1; EP0359783B2; EP0359783A1; AU2079788A; EP0359783B1

Description

i · DK 175666 B1

Den foreliggende opfindelse angår området for behandling af autoimmune sygdomme og især T-cellemedierede eller T-celle-afhængige autoimmune sygdomme. Den foreliggende opfindelse anviser oral eller enteral administration af autoantigener eller 5 fragmenter eller analoger deraf til terapeutisk behandling af disse autoimmune sygdomme.

Autoimmune sygdomme forårsages af et abnormt immunrespons eller -reaktion, som involverer enten celler eller antistoffer, 110 som er rettet mod normalt væv. En række strategier er blevet udviklet til at undertrykke autoimmune sygdomme, navnlig lægemidler, som ikke-specifikt undertrykker det immune respons. En metode til at inducere immunologisk tolerans ved oral indgivelse af et antigen til forhindring af autoimmune responser 15 blev først påvist af Wells i 1911. H. Wells, J. Infect. Dis. 9:147 (1911). Den orale induktion af ikke-reakti vitet er også blevet påvist for flere T-celleafhængige antigener. J. Ngan et al., J. Immunol. 120:861 (1978), S. Gautam et al., J. Immunol. 135:2975 (1985), R. Titus et al., Int. Arch. Allergy Appl.

20 Immun. 65:323 (1981). I en publikation af nyere dato beskrives endvidere oral indgivelse af kollagen til undertrykkelse af koMageninduceret artritis i en musemodel. Nag 1er-Anderson et al., Proc. Nat 1 . Aead. Sci. (USA) 83:7443-7446 (1986).

25 Videnskabsmand har også undersøgt metoder til at undertrykke autoimmune sygdomme i forskellige dyremodeller. Eksperimentel allergisk encephalomyelitis (EAE) er en T-ce11 emed ieret autoimmun sygdom, som er rettet mod basisk myelinproteiη (MBP) og er blevet undersøgt som en model til multipel sclerose hos 30 flere pattedyrsarter. Se E. Alvord et al., Experimental Allergic Encephalomyelitis- A Useful Model for Multiple Sclerosis (Allan R. Liss, New York, 1984). Immunregulering af EAE vides at være i det mindste delvis afhængig af suppressor-T-ce11 er (Ts). Det har vist sig, at Ts er til stede i rotter, som er 35 kommet sig over EAE. J. Swierkosz et al., J. Immunol. 119:1501 (1977). Endvidere er det blevet vist, at suppressor-T-cel1 er står til regnskab for ikke-reaktivi teten over for EAE, hvilken

I DK 175666 B1 I

I

udvises af nogle musestammer. Z. Lando et al., Nature 287:551 I

I (1980). I

Der er blevet anvendt forskellige metoder til at inducere I

5 antigen-specifik undertrykkelse af EAE, herunder immunisering I

med MBP, som er emulgeret i Freund's ufuldstændige adjuvans, I

H som vist af Z. Lando et al., J. Immunol. 126:1526 (1981), og I

intravenøs injektion af MBP-konjugerede lymfeceller, som vist I

af S. Sri ram et al., Cell. Immunol. 75:378 (1983). I

Η ίο I

Tre skrifter af Alvord et al. er rapporteret i Annals of Neu- I

rology i bind 6 på henholdsvis side 461-468, 468-473 og I

474-482 (1979). I det første og andet af disse skrifter be- I

H skrives undertrykkelse af EAE i aber ved parenteral indgivelse I

15 af MBP kun ved indgivelse sammen med en ikke-specifik hjælpe- I

faktor, f.eks. et antibiotika eller et steroid. I det tredje I

skrift beskrives tilstedeværelsen i cerebrospinalvæsken hos I

patienter med multipel sklerose af flere proteaser, som ned- I

bryder MBP til antigent aktive peptidfragmenter. I

I 20 I

I skrifter af Traugott et al., J. Neurological Science I

56:65-73 (1982) og Raine et al.. Lab. Investigation 48:275-84 I

H (1983) beskrives, at behandling af en marsvinestamme, som li- I

der af kronisk tilbagevendende EAE, med parenteralt indgivet I

25 MBP alene eller i Freund's ufuldstændige adjuvans (IFA) eller I

i kombination med et lipidhapten af myelin, især galactocere- I

H brosid, undertrykte de kliniske symptomer på EAE. I

I Endvidere beskriver McKenna et al. i Cell. Immun. 81:391-402 I

30 (1983), at præinjektion i rotter med marsvine-MBP koblet til I

syngeniske (eng.: syngeneic) leukocytter fra milten eller til I

I syngeniske røde blodlegemer undertrykte den efterfølgende in- I

duktion af EAE under anvendelse af marsvine-MBP i Freund's I

I fuldstændige adjuvans. Graden af undertrykkelse var i positiv I

35 overensstemmelse med mængden af indgivet MBP. I

I I en rapport af Strejan et al., Cell. Immun. 84:171-184 (1984) I

I beskrives, at præinjektion i rotter med marsvine-MBP, som er I

DK 175666 B1 3 indkapslet i phosphatidylseriniiposomer, undertrykte de kliniske tegn og symptomer på EAE, der forekommer i rotter, som er blevet injicerede med marsvine-MBP i Freund's fuldstændige adjuvans.

5 1 et andet skrift af McKenna et al., Cell. Immun. 88:251-259 (1984) beskrives> at de undertrykkende effekter af injiceret marsvine-MBP-leukocytkomplekser, som er beskrevet i deres rapport fra 1983, blev ophævet, når dyr blev forbehandlet med cy-10 k1ophosphamid, et lægemiddel som inhiberer produktionen af suppressor-T-lymfocyt ter.

I en rapport af Krasner et al. i Neurology 36:92-94 (1986) beskrives, at syntetisk C-copolymer I, som undersøges som en be-15 handling mod multipel sklerose, fordi den beskytter dyr imod EAE og ikke udviser immunologisk krydsreaktivitet med MBP.

Endvidere beskrives i en rapport fra Sovjetunionen af Belik et al., Vopr. Med. Khim. 24:372-377 (1978) (ifølge et engelsk 20 sammendrag) den parenterale indgivelse af "alkalisk myelinpro-teinfragment" og "syntetisk encephali togent peptid" til marsvin med EAE. Dyrene kom sig efter indgivelse af "alkalisk myelinproteinfragment" til disse dyr, som var sensibiliseret med bovint "alkalisk myelinprotei nfragment" eller med 25 "syntetisk encepha1 i togent peptid".

I både en rapport af Braley-Mullen et al., Cell. Immun. 51:408 (1980) og den ovenfor nævnte rapport af Nagler-Anderson et al. omtales undertrykkelse af symptomerne på to andre eksperimen-30 telle autoimmune sygdomme, som er induceret ved injektion i dyr med autoant i gen 1ymfocytkonjugater. Rapporten af Braley-Mullen et al. beskriver undertrykkelse af eksperimentel autoimmun thyroiditis i marsvin ved injektion i disse dyr med thy-roglobulinantigen i Freund’s ufuldstændige adjuvans. I rap-35 porten af Nagler-Anderson et al. beskrives undertrykkelse af T-type II kol1 agen-induceret artritis i mus ved intragastri sk administration af opløselige, men ikke denaturerede T type II-

I DK 175666 B1 I

I I

H kollagener forud for immunisering af dyret med T type Il-kollagen i adjuvans. I

H Formålet med den foreliggende opfindelse er at anvise en fremgangsmåde, der kan an- I

H vendes til behandling af en T-cellemedieret eller T-celleafhængig autoimmun sygdom I

H 5 hos et menneske. I

Det formål opnås ved, at et autoantigen, som er specifikt for en autoimmun sygdom, I

anvendes til fremstilling af et lægemiddel til oral eller enteral indgift. Et sådant I

I 10 lægemiddel er nyttigt til behandling af en T-cellemedieret eller T-celleafhængig I

autoimmun sygdom hos et menneske. Både de kliniske og histologiske effekter af så- I

H danne sygdomme undertrykkes på en dosisafhængig måde. Under- I

trykkeisen forekommer endvidere, hvad enten den orale eller I

enterale indgift sker før eller efter indtræden af den autoim- I

15 mune sygdom. Sygdom undertrykkes også ved oral eller enteral I

indgivelse af ikke-sygdomsinducerende og sygdomsinducerende I

H fragmenter af autoantigenet. Den orale eller enterale indgift I

af autoantigener repræsenterer derfor en effektiv, enkel me- I

I tode, hvorved en autoimmun sygdom på naturlig måde kan I

20 immunreguleres. I

På den ledsagende tegnings figurer viser I

I fig. 1 et diagram, hvoraf fremgår antigenspecificiteten af I

I 25 oralt induceret undertrykkelse af det proliferative respons i I

I Lewis-rotter. Dyrene fik 500 pg MBP eller BSA på dag -7, -5 og I

I -2, hvorefter de blev immuniseret med 100 pg MBP i CFA på dag I

0. Ni dage efter immunisering blev lymfeknuder fjernet, og I

I prol i ferat i vt respons på MBP, BSA og PPD (alle ved 50 pg/ml) I

I 30 blev bestemt som beskrevet i eksempel 3. Stimulationsindeks =

I eksperimentel cpm/kontrol cpm; I

I fig. 2 en graf, hvoraf fremgår oralt induceret undertryk- I kelse af adjuvans-artritis, som målt ved ledopsvulmning; I 35 fig. 3 en fremstilling i diagramform af protokollen for in- I ducering af tilbagevendende murin EAE;

DK 175666 B1 I

H

j fig. 4 et søjlediagram, hvoraf fremgår den oralt inducerede I

undertrykkelse af 1 ymfecel 1eproliferation i SOL-mus. Dyr fik H

400 pg MBP syv gange i løbet af en 2-ugers periode og blev im- I

muniseret med 400 pg MBP i CFA (0,6 mg/ml M. tuberculosis). I

5 Stimulationsindeks er MBP-induceret proliferation divideret I

med baggrund; I

fig. 5 en graf, hvoraf fremgår den antigenspecifikke under- I

trykkelse af knæhasedrænende lymfeknudecelle (PLNC)-responser I

10 ved hjælp af milt- og mesenteri a 1 -1ymfeknudeceIler (LNC), der

opnås fra rotter, som har modtaget basisk mye1 inprotein (MBP). Resultaterne udtrykkes som procentvis undertrykkelse af PLNC

I på MBP (cirkler) og på Mycobacterium tuberculosis (firkanter).

Lukkede cirkler eller lukkede firkanter repræsenterer respon-15 set på miltceller. Åbne cirkler eller åbne firkanter repræ- • senterer responset på mesenterial-1ymfeknudece1 ler; fig. 6 en graf, hvoraf fremgår den specifikke undertrykkelse af IgG-responser på MBP efter oral MBP-indgi ve 1 se. Rotter blev 20 åreladet med mellemrum, og sera blev undersøgt for anti-OVA-antistoffer (fig. 6A, åbne cirkler) eller anti-MBP-antistoffer (fig. 6B, åbne firkanter). Oisse sera blev sammenlignet med sera, der var opnået fra udfordrede dyr, hvortil der ikke var indgivet noget (lukkede symboler). Resultaterne udtrykkes som 25 ELISA O.D. 492 niveauer ± S.D.

Den foreliggende opfindelse vedrører behandling af T-celleme-dierede eller T-celleafhængige autoimmune sygdomme ved oral eller enteral indgivelse af autoantigener, som er specifikke 30 for sådanne autoimmune sygdomme, såvel som biologisk aktive fragmenter af autoantigenerne og analoger deraf. Betegnelsen "behandling" har til hensigt at omfatte undertrykkelsen eller lindringen af symptomer efter indtrædelse af sådanne autoimmune sygdomme.

En autoimmun sygdom er en funktionsfejl i immunsystemet hos et dyr, herunder mennesker, hvori immunsystemet ikke er i stand

I DK 175666 B1 I

I 6 I

til at skelne mellem fremmede substanser inden i dyret og de I

H forskellige substanser, som dyret selv er sammensat af. Beteg- I

nelsen "dyr" dækker alle livsformer, som har et immunregu1 ato- I

risk system, og som derfor er følsomme over for autoimmune I

5 sygdomme. I

H Et "autoantigen" er en vilkårlig substans, som normalt findes I

i et dyr, og som i en abnorm situation ikke længere genkendes I

H som del af selve dyret af dette dyrs lymfocytter eller anti- I

10 stoffer, og som derfor angribes af det immunregulatoriske sy- I

stem, som om det var en fremmed substans. Betegnelsen "biolo- I

gisk aktivt fragment eller aktive fragmenter" af sådanne auto- I

antigener omfatter hvilke som helst delvise aminosyresekvenser I

deraf, som inducerer det samme biologiske respons, dvs. evnen I

15 til at undertrykke eller eliminere T-cellemedieret eller T- I

celleafhængigt autoimmunt respons, efter oral eller enteral I

I indførelse. Betegnelsen "analog eller analoger" af sådanne au- I

toantigener omfatter forbindelser, der er så nært strukturelt I

beslægtede, at de udviser den samme biologiske aktivitet, dvs. I

20 evnen til at eliminere eller undertrykke T-cellemedieret eller I

I T-celleafhængigt autoimmunt respons efter pral eller enteral I

indføring. Som sådan omfatter betegnelsen aminosyresekvenser, I

I som er forskellige fra autoantigenets aminosyresekvens med en I

I eller flere aminosyrer (idet der stadig bibeholdes i alt væ- I

I 25 sentligt ækvivalent biologisk aktivitet), såvel som kemiske I

forbindelser, som efterligner den biologiske aktivitet af au- I

I toantigenerne i deres evne til at undertrykke eller lindre I

I symptomerne på sygdommen. Sådanne forbindelser kan bestå af I

I væv fra et målorgan, dvs. angrebsstedet i en autoimmun sygdom. I

I 30 I

I Det primære formål med opfindelsen er at behandle en stor kategori af sygdomme, som I

I samlet kaldes T-cellemedierede eller T-celleafhængige autoimmune sygdomme, herun- I

I der, men ikke begrænset til, multipel sklerosem rheumatodi artritis, diabetes mellitus I

I 3 5 og autoimmun thyroiditis. I

DK 175666 B1 I

Eksperimentel allergisk encephalomyelitis {EAE) er en Τ' I

eé 11emedieret autoimmun sygdom, som er rettet mod basisk mye- I

linprotein (MBP), og som er blevet undersøgt som en model for I

multipel sklerose i flere pattedyrsarter. Immunregulering af I

5 EAE vides at være i det mindste delvis afhængig af suppressor- I

T-celler (Ts). Det er blevet vist, at Ts er til stede i rot- I

ter, som er kommet sig over EAE, og at Ts står til regnskab I

for ikke-reaktiviteten på sygdommen i nogen musestammer. I

10 Adjuvans artritis (AA) er en autoimmun dyremodel af rheumatoid I

artritis, som induceres ved injektion af Mycobacterium tuber- I

culosis i halebasis på Lewis-rotter. Mellem 10 og 15 dage ef- I

ter injektion udvikler dyr en alvorlig, fremadskridende ar- I

tritis.

15

Den foreliggende opfindelse er baseret på den opdagelse og bekræftelse på, at den orale eller enterale indgivelse af MBP er en effektiv metode til at undertrykke akut monofase-EAE, og at den orale eller enterale indgivelse af Mycobacteria tuber- 20 culosis er en effektiv måde til undertrykkelse af adjuvans ar- I tritis. Oralt eller enteralt induceret tolerans er dosisafhæn- gig, og både kliniske og histologiske symptomer på sygdommen bliver mindre alvorlige. Da et i rrelevant antigen, såsom bovint serumalbumin (BSA) oralt eller enteralt ikke har nogen 25 virkning på følsomheden for EAE, kan det siges, at oralt eller enteralt induceret tolerans over for EAE er specifik for MBP, det antigen, hvortil T-cellerne, som medierer sygdommen, er sensibiliserede.

30 Oral eller enteral administration af MBP til rotter inducerer endvidere undertrykkelse af immunresponser på MBP. F.eks. mindskes både lymfecelleproliferation og produktion af anti-MBP-antistoffer. Cellerne, som er ansvarlige for både undertrykkelse af sygdommen og undertrykkelse af antigenspecifikke 35 cellulære responser in vitro,er af T-ce11eoprinde1 se og er suppressor/cytotoksiske CD8+ T-lymfocytter.

H DK 175666 B1 I

I I

Som vist nedenfor er således anvendelse af EAE-dyremodellen I

for multipel sklerose og dyremodellen for AA, den enkle admini- I

strati onsmetode, oralt eller enteralt, af autoantigener, såsom I

MBP, som anvist ifølge opfindelsen, en effektiv behandling til I

5 at undertrykke både udviklingen af autoimmune sygdomme og I

visse immunresponser på autoantigenerne. I

H Med betegnelsen "indførelse" eller "administration" menes, at I

autoantigenet, dets biologisk aktive fragmenter eller biolo- H 10 gisk aktive analoger indføres i maven gennem munden ved fod- H ring eller intragastrikalt gennem et maverør, dvs. enteralt.

H Autoantigenet, fragmentet eller analogen indføres generelt, H oralt eller enteralt, i en mængde på fra 1 til 1000 mg pr. dag H 15 og kan indgives i enkel tdos isform eller i f1erdosisform. Auto- antigenet, fragmentet eller analogen indgives fortrinsvis i en mængde på fra 25 til 850 mg pr. dag. Som det forstås af fag- folk inden for området er den eksakte dosis en funktion af au- toantigenet, patientens alder, køn og fysiske tilstand såvel 20 som andre ledsagende behandlinger, der gives.

Når autoantigenet, fragmentet eller analogen indføres oralt, kan det blandes roed andre fødeformer og indtages i fast form, I halvfast form, suspensions- eller emulsionsform; det kan 25 blandes med farmaceutisk acceptable bærere, aromaforøgende I midler og lignende.

Når autoantigenet, fragmentet eller analogen administreres en- I teralt, kan det indføres i fast form, halvfast form, suspensi- 30 ons- eller emulsionsform og kan være kombineret med en hvilken I som helst vært for farmaceutisk acceptable bærere, herunder I vand, suspenderingsmidler, emulgeringsmidler.

I Eksperimentelt.

I 35

Dyr·. Lewis-hunrotter med en vægt på 150 til 220 g blev opnået fra Charles River Laboratory, Wilmington, MA. og anvendt i I alle forsøg.

DK 175666 B1 I

Immunisering af dyr·. Rotter blev immuniseret i begge baghæf- I

teskiver med 50 ug marsvine-MBP, som var emulgeret i Freund's I

fuldstændige adjuvans (CFA). I nogle forsøg blev 50 pg ovalbu- I

min (OVA) (Sigma) sat til de emulgerede antigener og tilsva- I

5 rende injiceret. EAE blev karakteriseret ved lammelse af lem- I

mer og bedømt som følger: 0) ingen sygdom; 1) mindsket akti- I

vitet, slap hale; 2) mild lammelse, ustabil gang; 3) moderat I

paraparese, lemmer spredt fra hinanden; og 4) tetraplegi. I

10 Induktion af oral tolerans: Rotter fik MBP eller bovinserumal- I

bumin (BSA) fem gange med tre dages intervaller, 1 mg i 1 ml I

PBS under anvendelse af en nål med et standardmål på 23 dækket I

med et plastrør. I

15 Proliferationsbedømmelse: Ni dage efter immunisering blev rot- I

terne aflivet, og deres knæhaselymfeknuder blev fjernet. En I

enkelt cellesuspension blev fremstillet ved at presse lymfe- I

knuderne gennem en sigte af rustfrit stål. Et totalt antal på I

105 lymfeknudeceller (LNC) blev dyrket med det angivne antal I

20 af enten bestrålede (2000 Rads) eller intakte LNC hidrørende fra fodrede rotter i fire eksemplarer i rundbundet 96-brønd- I plade (Costar). MBP og Mycobacterium tuberculosis (Mt), 50 pg/ral, blev sat til kulturen i et volumen på 20 μΐ. Kulturerne blev inkuberet i 80 timer og blev pulseret med 1 pCi [3 H ] 25 TdR/brønd i de sidste 16 timer af dyrkning. Kulturerne blev derefter høstet på et automatisk cel lehøstningsapparat og aflæst på et standard væskescinti1lationstælleapparat.

Procent undertrykkelse af primet LNC (PLNC)-proliferati on blev 30 beregnet ved hjælp af den følgende formel: CPM (bestrålede LNC fra behandlet * undertrykkelse . 100 * 1 - D?.t_te. - .+ - CPM (ubestrålede LNC fra ubehandlet rotte + PLNC antigen)

3 S

Proliferationsmedier: RPMI (Gibco) blev anvendt i alle forsøgene. Mediet blev sterilfiltreret efter tilsætning af 2

I DK 175666 B1 I

I · I

x 10“5M 2-roercaptoethanol, 1% nat riumpyruvat, 1% penicillin og I

streptomycin, 1% ikke-essentielle aminosyrer og 1% autologt I

serum. I

5 Oprensning af forskellige celledelmængder: Til udtynding eller I

udtømning af C03-, CD4- og C08-populationer fra miltceller an- I

vendtes negativ udvælgelse. Petriskåle blev dækket natten over I

H ved 4°C med 10 ml 1/1000 gede-ant i muse-IgG + IgM-anti stoffer I

H {Tago) i PBS/BSA. Pladerne blev derefter vasket og dækket med I

H 10 3% fetal bovinserum i PBS i 30 min. ved 20°C og atter vakset. I

H Lewis-LNC blev plettet med museantiratmonoklonale antistoffer I

{Serotec/ Bioproducts) for C03 {MRC, 0X/38), C04 {W 3/25) el- I

ler CD8 (OX/8), som var fortyndet 1/100 i PBS. Cellerne blev I

plettet i 30 min. på is og derefter vasket og podet på de fo- I

15 rudbelagte petriskåle, 15 millioner celler/5 ml PBS/plade ved I

H 4°C. Supernatanten, som indeholdt ikke-fastklæbende celler, I

H blev opsuget forsigtigt 60 min. senere og centrifugeret to I

gange før celleundersøgelse og -tælling. Denne protokol giver I

cellepopulationer på ca. 85-95% renhed som undersøgt i fluor- I

20 escensaktiveret cellesorterapparat ved undersøgelse af membra- I

nimmunf1uorescens. I

Adopt ivoverfør i ngsundersøgelser: Donorrotter blev behandlet med enten MBP eller BSA, 1 mg x 5 gange, med 3-4 dages inter- 25 valler og aflivet 4 dage efter den sidste behandling, Mesente- rial-LNC og miltceller blev høstet og injiceret intraperitone- alt enten øjeblikkeligt eller efter aktivering med concavalin- I A (Con-A), 1,5 pg/ml, i pro 1 iferationsmedi er i 48 timer. An- tallet af injicerede celler til adopt i voverfør ingsundersøge1 - I 30 ser var som følger: 120 x 10® for hele LNC-popul at i on, enten I aktiverede eller ikke aktiverede; 60 x 10® for CD3-udtyndede eller -udtømte LNC; 80 x 10® for CD4-udtyndet eller -udtømt I population; og 95 x 10® for CD8-udtyndede eller -udtømte LNC.

I Modtagende Lewis-rotter blev immuniseret med BP/CFA 4 timer I 35 seneretil i nduktion af EAE, I Serumn iveauer af antistoffer: Enzymkoblet immunoabsorbentana- I lyse i fast fase (ELISA) blev anvendt til bestemmelse af anti- DK 175666 Bl 11 stoftitere over for MBP og OVA. Mi krot i terp lader blev inkuberet med 0,1 ml pr. brønd af 10 pg antigen/ml i dobbe11dest i 1-leret vand. Plader blev inkuberet i 18 timer ved 25eC. Efter 3 vaske med PBS/Tween-20 (Bio-Rad), pH 7,5 blev plader inkube-5 ret med 3% BSA/PBS i 2 timer ved 37eC og vasket to gange, og 100 μΐ fortyndet serum blev tilsat i 4 omgange. Pladerne blev inkuberet i 2 timer ved 37eC. Efter 3 skylninger med PBS/ Tween-20 blev pladerne inkuberet med 100 μΐ/brønd peroxidase-konjugeret gede-antirotte-lgG-antistof {Tago, USA), som var 10 fortyndet 1:1000 i 1% BSA/PBS, i 1 time ved 25°C. Farvereaktion blev opnået ved udsættelse for D-phenylendiamin (0,4 mg/ml phosphat)-c itratpuffer, pH 5,0) indeholdende 30% H2O2· Reaktionen blev stoppet ved tilsætning af 0,4N H2SO4, og OD ved 492 nm blev aflæst på et ELISA-aflæsningsapparat.

15

In vi tro-må 1 ing af antistofprodukt i on : Popliteal- og milt-LNC

blev opnået fra fodrede, ikke forud testede og udfordrede rotter og podet i en koncentration på 10^ celler pr. ml petriskål enten alene eller bestrålet (2000 Rads) sammen med andre PLNC, 20 som angivet. Kulturerne blev holdt i proliferationsmedier med eller uden antigen (20 pg/ml) i 3 dage i en inkubator, hvorefter de blev høstet. De fortyndede supernatanter blev anvendt til at undersøge in vitro fremstilling og udskillelse af igG-antistof og blev målt for antistofproduktion under anvendelse 25 af en ELISA-prøve som tidligere beskrevet.

Identifikation af forskelige områder af det basiske myelinpro-teinmolekyle, som er ansvarlig for undertrykkelse af EAE: Overlappende fragmenter af 1-37-området i marsvinemyelinbase-30 protein blev syntetiseret under anvendelse af fastfase-peptidtéknik. R. Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA

82:5131-5135 (1985). Disse fragmenter blev derefter admini streret oralt i ekvimolære koncentrationer til 15 mg helt basisk myelinprotein. De blev administreret på dag -7, -5 og -2 35 forud for immunisering. Dyrene blev derefter udfordret med basisk protein i Freund's adjuvans ifølge etablerede procedurer og bedømt.

I DK 175666 B1 I

I 12 I

Påvisning af, at oral adini ni strationsvej af et proteinantigen I

bestemmer, til hvilket fragment der er et immunrespons: I

Dyrene fik helt basisk myelinprotein, enten immuniseret i hæf- I

5 teskive med Freund's adjuvans eller administreret oralt. Syv I

H til 10 dage derefter blev milt- og lymfeknudeceller fjernet og I

H genstimuleret in vitro med forskellige fragmenter af det ba- I

H siske myelinproteinmolekyle. I

10 Eksempler I

Eksempel 1 I

Virkningen af tilføring af MBP og peptiske fragmenter deraf på I

15 følsomheden for og alvorligheden af akut monofase-EAE blev I

undersøgt i Lewis-rotten. Resultater viser, at denne naturlige I

vej til toleransinduktion undertrykker både udviklingen af I

sygdommen og immunresponser på MBP. I

20 Til oralt at inducere undertrykkelse af EAE blev Lewis-rotter I

tilført MBP, som var oprenset fra marsvinehjerne (G. Diebier I

I et al.. Prep. Biochem. 2:139 (1972)) under anvendelse af en I

sprøjte, som var forsynet med en 20G kuglepunktsnål. Kontrol- I

dyr fik lige store mængder bovinsertima 1 bumin (BSA) eller salt- I

25 vand alene. EAE blev fremkaldt ved immunisering med 50 pg MBP, I

H som var emulgeret i Freund's fuldstændige adjuvans (CFA), som I

indeholdt 200 pg Mycobacterium tuberculosis, ved injektion i I

I baghæfteskiverne. Sygdom blev karakteriseret ved lammelse af I

I de bageste lemmer og inkontinens sædvanligvis mellem dag 12 og I

I 30 15 efter immunisering, og i alle tilfælde var rotterne kommet ' I

I sig ved dag 16. Ved den første række forsøg undersøgtes ef- I

fekten af en række tilføringer og dosis af MBP på sygdomsud- I

tryk. Rotter blev tilført forskellige mængder af MBP enten på I

I en gang 7 dage før (dag -7) immuniseringsdag (dag 0) eller tre I

35 gange på dag -14, -7 og 0. Resultaterne (tabel I) viser, at I

tilføring af MBP til rotter undertrykker EAE, og at oralt in- I

I duceret undertrykkelse er dosisafhængig. Mangfoldige 500 pg- I

13 DK 175666 B1 tilføringer resulterede i fuldstændig undertrykkelse af sygdom og var mere effektivt end en enkelt tilføring ved denne dosis.

I tilknytning til klinisk manifestation af EAE blev histologisk tegn på sygdom i rotter undersøgt. Seksten dage efter im-5 munisering blev rotter aflivet, og hjerner blev fjernet og fikseret i formalinopløsning. Fikservæske var en opløsning af 100 ml 70% ethanol, 10 ml 37% formalin og 5 ml iseddike. Præparatglas af paraffin-indesluttet væv blev fremstillet fra hver rotte og farvet med hematoxylin og eosin. Perivaskulære 10 inflammatoriske foci blev kvantitativt bestemt på kodede præparatglas ved hjælp af etablerede procedurer (R. Sobel, et al., J. Immunol. 132:2393 (1984)). Som vist i tabel I, bevirkede tilføring til rotter af 500 pg MBP på dag -14, -7 og 0 et I markant fald i antallet af inflammatoriske læsioner i hjernen.

15 Et moderat fald blev fundet i dyr, som var blevet tilført 100 pg, og ingen signifikant reduktion af inflammation blev fundet hos rotter, som havde fået 25 pg MBP.

20 Eksempel 2

Ved en anden række forsøg undersøgtes effekten af tilføring af MBP forud for eller efter immunisering med MBP til bestemmelse af, hvorvidt effektiviteten af oralt induceret undertrykkelse 25 sker ved forudgående udsættelse for antigen. Til disse forsøg blev dyr tilført 500 pg MBP tre gange enten før eller efter aktiv fremkaldelse af sygdom (immunisering med MBP). Resultaterne (tabel II) viser, at klinisk udtryk for sygdom undertrykkes, hvad enten dyrene fik MBP før eller efter sensibili-30 sering, idet effekten er mere fuldstændig, når antigenet blev tilført forud for immunisering. Histologisk undersøgelse afslørede imidlertid en dramatisk reduktion af perivaskulære i n-filtrater i rotter, som var tilført MBP enten før eller efter sensibilisering over for MBP. Mere end 60% undertrykkelse af 35 sygdom forekom også, når rotter fik behandling tre gange roed start på dag +5 eller +7 efter immunisering (data ikke vist).

—------ - - -----^

I DK 175666 B1 I

I I

H Der blev endvidere udført forsøg, hvori rotter fik 100 ug MBP I

på forskellige tidspunkter før og efter immunisering med MBP. I

H Som vist i tabel III ses sygdomsundertrykkelse med enkelte

tilføringer før og efter immunisering. I

I 5 I

Eksempel 3 I

Virkningerne af oral administration af MBP på cellulære og hu-

10 morale immunresponser på MBP blev også undersøgt. Prolifera- I

tive responser på MBP blev undersøgt efter tilføring til rot- I

ter af forskellige doser af MBP og efter tilføring på forskel- I

lige tidspunkter med hensyn til immunisering. Ti dage efter I

immunisering blev rotter aflivet, og enkeltcellesuspensioner I

15 af drænerende (popliteale) lymfeknuder blev fremstillet. Cel- I

ler blev dyrket i mikrobrønde i fire dage, de sidste 24 timer I

med ^H-thymidin tilsat. Et volumen på 0,2 ml indeholdende 4 x I

1θ5 i RPMI 1640 indeholdende 2% glutamin, 1% penicillin/ I

streptomycin, 5 x 10“5 M 2-mercapto-ethanol, og 5% fetal kal- I

20 veserum blev sat til hver mikrobrønd, og MBP blev tilsat ved I

50 pg/ml. Brønde blev pulseret med 1 pCi tritieret thymidin, I

høstet på fiberglasfiltre under anvendelse af et mu 11ihøsteap-

parat og talt under anvendelse af standard væskescinti1 lati- H

onsteknikker. I

Resultater (tabel I og II) viser, at tilføring af MBP bevirker I

et udtalt (75-92%) fald i proliferative responser på MBP. Un- I

dertrykkelse af proliferation forekom i modsætning til under- H

trykkelse af sygdom ved alle afprøvede doser og tilførings- H

30 kure, herunder tilføring efter immunisering. Oralt induceret H

undertrykkelse af det poliferative respons på MBP er antigen- H

specifikt, som vist i fig. 1. Specielt undertrykker tilføring H

af MBP ikke det proliferative respons på oprenset proteinderi- H

vat (PPD), som er et antigen hidrørende fra M. tuberculosis, H

35 og som inducerer et proliferativt respons som en konsekvens af H

immunisering med CFA. Tilføring af et irrelevant antigen, BSA, H

påvirker ikke det proliferative respons på PPD og undertrykker H

klin svagt det proliferative respons på MBP. H

Eksempel 4 15 DK 175666 B1

Effekten af tilføring af MBP på dannelsen af antistof over for MBP blev også undersøgt. Rotter, som. var blevet tilført MBP, 5 blev immuniseret, og blod blev fjernet ved hjertepunktur 16

dage efter immunisering. Niveauer af anti-MBP-anti s tof i serum blev målt ved hjælp af ELISA. Et volumen på 0,1 ml af MBP opløsning (0,05 mg/ml i PBS) blev tilsat pr. mikrobrønd og inkuberet i 3 timer ved 37°C. Brønde blev vasket med PBS inde-10 holdende 0,05% Tween (PBST) og blokeret natten over ved 4eC

med 5% BSA i PBS med en pH-værdi på 9,0. Efter vask af brøndene med PBST blev fortyndede rottesera tilsat og inkuberet i 3 timer ved stuetemperatur, og efter vask med PBST blev sekundært antistof (peroxidasekonjugeret gede-anti-rotte) tilsat i 15 i time ved stuetemperatur. Substrat blev tilsat, og reaktionen blev stoppet med 0,1M NaFl. Plader blev aflæst ved 450nm på et "Titertek-multi scan"-apparat. AbS45o blev også bestemt for serum fra rotter, som kun var immuniseret med CFA, og trukket fra alle værdier som baggrund.

20 I modsætning til proliferative responser, som forekom ved praktisk talt alle afprøvede doser og ti 1før ingskure , blev undertrykkelse af anti s tofprodukt i on kun observeret, når dyr blev tilført den højest afprøvede dosis (500 pg) på dag -14, 25 -7 og 0 (66% undertrykkelse, tabel I). Bemærkes skal manglen på undertrykkelse i rotter, som blev tilført 500 pg MBP på dag -7, -5 og -2 (tabel II), hvilket antyder, at den temporale sekvens, hvori en identisk dosis af MBP tilføres, er vigtig ved undertrykkelse af antistof responser.

30 35

I DK 175666 B1 I

I 16 I

Tabel I I

Effekt af ti 1 før inosdosis på oralt induceret I

undertrykkelse af EAE i Lewis-rotter I

5 Immunrespons I

på MBP I

Induktion af EAE (procent inhibering) I

aKli ni sk ^Histologisk ^Proli fe- dAnt i stof I

sygdom bedømme 1 se ration _ I

H Immuniserede kon- I

10 tro 1 dyr 19/22 9,2t5,8 I

H Ti 1før ingsdag -7 I

25 pg 3/5 NO 75,6±2 NO I

100 pg 2/5e* NO 88,9 NO I

I 500 μς 3/10*** ND 88,9±2 NO I

15 I

Ti 1før ingsdage I

-14, -7, 0 I

I 25 M9 3/5 7,2±5,2 82,1 -48±72 I

I j 100 M9 2/5* 3,2i1,9 80,8±5 14±49 I

H 20 I

‘ 500 M9 0/10*** 0,2±0,4 87,2±1 66±39 I

I (a) Rotter blev tilført forskellige doser af MBP på de indike- I

H rede dage og immuniseret med 50 μg MBP i CFA (200 μς Μ. I

tuberculosis) på dag 0. Antallet af syge rotter i forhold I

25 til det totale antal immuniserede rotter er vist. Immuni- I

I serede kontroldyr blev tilført BSA eller saltopløsning. I

I (b) Rotter blev aflivet på dag 16 efter immunisering, og I

I hjerner blev fjernet og fikseret. Det gennemsnitlige antal I

30 af perivaskulære inflammatoriske foci pr. dyr +/- stan- I

I dardafvigelse er vist. ND = ikke bestemt. I

M

I 35 I

17 DK 175666 B1 (c) Proliferativt respons på MBP blev målt for drænerende lymfeknudeceller, ti dage efter rotter var immuniseret. Et volumen på 0,2 ml indeholdende 4 x 10® celler i RPMI 1640 indeholdende 2¾ glutamin, 1¾ penici11in/streptomycin, 5 x 5 10~5 M2-mercaptoethanol og 5¾ fetal kalveserum blev sat ! til hver mikrobrønd, og MBP blev tilsat ved 50 pg/ml .

Brønde blev pulseret med 1 pCi tritieret thymidin, høstet på fiberglasfiltre under anvendelse af et mu 1 tihøsteappa-rat og talt under anvendelse af standard væskescinti1la-10 tionsteknikker. Den procentvise inhibering af prolifera- tivt respons på MBP i forhold til den immuniserede kontrolgruppe er vist. Det gennemsnitlige stimulationsindeks hos de immuniserede kontroldyr (MBP-stimuleret CPM/bag-grund CPM) var 6,0 (29.888 CPM/4960 CPM).

16 (d) Rotter blev aflivet på dag 16, og blodet blev trukket ved i hjertepunktur. Sera blev fortyndet 1/15.625 i PBS og anti- ^ MBP-antistofniveauer blev bestemt ved hjælp af ELISA. Et volumen på 0,1 ml MBP opløsning (0,05 mg/ml i PBS) blev 20 tilsat pr. mikrobrønd og inkuberet i 3 timer ved 37°C.

Brønde blev vasket med PBS indeholdende 0,05% Tween (PBST) og blokeret natten over ved 4"C med 5% BSA i PBS, pH 9,0.

Efter vask af brøndene med PBST, blev fortyndet rottesera tilsat, og der inkuberedes i 3 timer ved stuetemperatur, 25 og efter vask med PBST blev sekundært antistof (peroxidase- konjugeret gede-antirotte) tilsat i 1 time ved stuetemperatur. Substrat blev tilsat, og reaktionen blev stoppet med 0,1 M NaFl . Plderne blev aflæst ved 450 nm på en Titertek-roultiscan. AbS45o blev også bestemt fra serum fra 30 rotter, som kun var immuniseret med CFA, og blev trukket fra alle værdier som baggrund. Det procentvise fald i antistofniveau, som målt ved absorbans af peroxidasesubstrat ved 450 nm i forhold til immuniserede kontroldyr (gennemsnitlig absorption ved A450 af immuniserede kontroldyr med 35 baggrund trukket fra var 0,148), er vist.

(e) Grupper blev sammenlignet ved "chi-square"-analyse med en frihedsgrad på frihed: *p< 0,05, **p < 0,1, *** p < 0,001.

DK 175666 B1 I

H

I 18 I

Tabel II I

Effekt af tilførinq af MBP til rotter før I

oa efter immunisering på udvikling af EAE I

_ Immunrespons I

på MBP I

Induktion af EAE (procent inhiberinq} I

aKli ni sk bHi stol og i sk cProlife- ^Antistof I

sygdom bedømmelse rat ion _ I

Immuniserede kon- I

troldyr 23/26 21,6±5,1 10

Oage for tilfø- I

ring af 500 ug MBP

' -7,-5,-2,+2,+5,+7 0,5e*** 0,2i0,4 MD 34

I -7,-5,-2 0/17*** 0 92,6 15 ’ I

I 15 +2, + 5,+7 4/10** 1,4 5 ± 2,3 91,5±3 15 I

I (a) Rotter blev tilført 500 ug MBP på de anførte dage og immu- I

I niseret med 50 ug MBP i CFA på dag 0. Immuniserede kon- I

H troldyr blev tilført BSA eller saltopløsning. I

1 I

20 (b) Se tabel I.

(c) Se tabel I. Gennemsnitlig stimulationsindeks af immunise- I

I rede kontroldyr var 9,4 (82.247 CPM/8.718 CPM). I

I 25 (d) Se tabel I. Gennemsnitlig absorption ved A450 af immunise- I

I rede kontroldyr med baggrund trukket fra var 0,403. I

I (e) Se tabel I. I

30 I

35 I

Tabel III

a 19 DK 175666 B1

Oralt induceret undertrykke Ise af EAE i Lewis-rotter

Tilførinqsskema Antal rotter svoe/total 5 Ingen 11/16 -14, -7, 0, +7 0/13 -14 1/5 -7 0/5 0 1/5 ♦ 7 1/5

Rotter blev tilført 100 ug MPB på de anførte dage (i forhold til immuniser ingsdag = 0) og blev immuniseret med 50 ug MBP med CFA (0,5 mg/ml M. tuberculosis).

Eksempel 5 15

Yderligere forsøg blev udført til bestemmelse af vedholdenheden af oralt induceret beskyttelse imod EAE. Efter tilføring på dag -7, -5 og -2 med 500 U9 MBP blev rotter immuniseret ved forskellige tidslængder efter den sidste tilføring. EAE 20 blev fuldstændigt undertrykt i rotter i op til fire uger efter tilføring, og ved otte uger var 50¾ af rotterne, som havde fået MBP, igen følsomme over for sygdom. Resultaterne er vist i tabel IV, som angiver, at tolerans over for sygdommen bevares 1 mindst fire uger efter den sidste tilføring, idet følsomhed 2g for sygdoms induktion bliver synlig ved otte uger efter tilføring. 1 35

I DK 175666 B1 I

I I

I Tabel IV I

I Vedholdenhed af oralt induceret tolerans af Lewis-rotter I

I Antal rotter syge/total I

I 5 I

I Kontroldyr 9/14 I

I Tilført -I

H Immuniseret dag 0 0/4

I - +7 0/4 I

+14 0/4 I

+28 0/3 +56 4/8

I Rotter blev tilført 500 pg MBP på dag -7, -5 og -2 og immu- I

I niseret på de anførte dage med 50 pg MBP i CFA. Kontrol rotter I

(tilført BSA) blev ligeledes immuniseret. I

I I

Eksempel 6 H

Det er kendt, at den encepha1 i togene region af marsvine-MBP i I

rotter er en specifik decapeptidsekvens, som er beliggende ved I

2o rester 75-84, og som selv kan inducere EAE, hvorimod andre I regioner af molekylet er ikke-encephali togene (G. Hashim, Mye-

lin: Chemistry and Biology, Alan R. Liss, N.Y. (1980)). Det er I

endvidere blevet rapporteret for andre antigener, at adskilte I

suppressordeterminanter findes på steder, som er forskellige I

I fra immunogene determinanter (R. Yowell et al., Nature 279:70 |

I (1979)). Det blev derfor undersøgt, hvorvidt både encephali- I

I togene og ikke-encephalitogene fragmenter af MBP kunne forhin- I

I dre EAE via oral administration. Fragmenter af marsvine-MBP I

I blevdannetved begrænset peps i nfordøjelse og separeret ved I

I 30 søjlekromatografi (J. Whitaker et al., J. Biol. Chem. I

250:9105: (1975)). De tre forskellige fragmenter blev tilført I

I til rotter, hvorefter dyrene blev immuniseret med helt MBP. I

I Det viste sig, at både de sygdoms inducerende (fragmenter I

44-89) og ikke-encephali togene (fragmenter 1-37 og 90-170)

peptider undertrykte EAE ved til føring til rotter, idet de I

I ikke-encephali togene fragmenter var mere effektive til under- I

I trykkelse af sygdommen end det encepha1 i togene fragment (tabel I

21 DK 175666 B1 V). Et decapeptid (S79) blev syntetiseret, som er forskelligt fra den encepha1 i togene sekvens (rester 75-84) med en enkelt aminosyresubstitution, og er rapporteret at inducere undertrykkelse ved injektion i rotter med CFA (E. Kardys et al., J.

5 Immunol. 127 :862.( 1981 )). Når S79 (A1a-G1n-Gly-His-Arg-Pro-

Gln-Asp-Glu-Gly) blev tilført til dyr, viste det sig også at undertrykke EAE (tabel V). Bovin-MBP, som er forskelligt fra marsvine-HBP på flere steder, herunder den encepha1 i togene sekvens, og som ikke er encepha1 i togent i rotter ved encepha-10 litogene doser for marsvine-MBP (J. Holoshitz et al., J. Im munol. 131:2810 (1983)), undertrykte også sygdom ved tilforing til dyr forud for immunisering.

Tabel V 15

Effekt af tilførinq af encephali togene og ikke-encepha1 i togene fragmenter på udviklingen af EAE i Lewis-rotter

Klinisk forekomst af EAE

Immuniserede kontroldyr 19/25 20 MBP-fragment 1-37 (109 pg) 0/9a*** MBP-fragment 44-89 (135 pg) 3/11** MBP-fragment 90-170 (235 pg) 0/4**

Peptid S79 (30 pg) 1/8***

Bovin-MBP (500 pg) 0/10***

Lewis-rotter blev tilført de angivne mængder af MBP-fragmenter 25 eller -peptider (ækvimolær til 500 pg helt marsvine-MBP) på dag -7, -5 og -2 og immuniseret på dag 0 med 50 pg marsvine-MBP med CFA. Antallet af syge rotter i forhold til det totale antal immuniserede rotter er vist. (a) Grupper blev sammenlignet med immuniserede kontroldyr ved "chi-square"-analyse: ** 30 p < 0,01, *** p < 0,001.

Eksempel 7

Undertrykkelse af adjuvans-induceret arthritis 35 ved tilførino af Mycobacteria

Adjuvans arthritis blev induceret i Lewis-hunrotter ved immunisering med 0,1 ml af 10 mg/ml Freund's fuldstændige adjuvans

DK 175666 B1 I

i halens basis. Dyr blev tilført 2,0 mg Mycobacteria tubercu- H

losis i phosphatpufret saltopløsning på dag -7, -5 og -2 forud H

for immunisering på dag 0 og efter immunisering på dag +7 og H

+14. Arthritis blev kvantitativt bestemt ved måling af ledop- H

5 svulmning i tre uger efter immunisering (tabel VI og fig. 2). H

Tabel VI

Ledopsvulmning (mm) på dag 21 H

Kontrol 7,61 ± 1,4 H

Dage for tilførinq af Mycobacteria H

15 -7, -5, -2 5,61 il,1* I

-7, -5, -2, +7 , +14 6,07 ±0,9* I

Ledopsvulmning = tykkelse af led på den målte dag H

*p < 0,01 sammenlignet med kontroldyr (repræsentativt forsøg H

20 med 4 dyr/gruppe). H

Eksempel 8 H

En adoptiv overfør inqsmode1 af EAE i SJL-mus H

En brugbar, reproducerbar model til adoptiv recidiverende EAE H

blev etableret i SOL-mus. Protokollen for denne model blev H

taget fra Mokhtarian et al.. Nature, 309:356 (1984). Denne I

protokol er afbildet grafisk i fig. 3. Kort fortalt immunise- I

30 res donordyr med en emuis i on i ndeholdende 400 pg MBP og 30 pg I

M. tuberculosis i CFA. Ti dage efter fjernes drænerende lymfe- H

knuder og dyrkes med 50 pg/ml MBP i fire dage og vaskes grun- H

digt, og 4-6 x 107 levedygtige celler injiceres intravenøst i I

modtagende hundyr. Dyr bedømmes for klinisk EAE under anven- I

35 delse af standardskalaer og bedømmes patologisk under anven- H

delse af H & E-histolog i sk standardanalyse (A. Brown et H

al., Lab Invest. 45:278 (1981), F. Lublin et al., J. Immunol. H

23 DK 175666 B1 126:819 (1981) og C. Bernard et al., Eur. J. Immunol. 16:655 (1976)). Dyr overvåges i mindst 100 dage efter overføring, således at antallet af tilbagefald kan bestemmes.

5 Eksempel 9

Oralt induceret undertrykkelse af proliferative responser i SLJ-mus 10 Tilføring af 400 pg MBP hver anden dag i to uger (et total på syv separate tilføringer) forud for immunisering med 400 pg MBP i CFA (0,6 mg/ml M. tuberculosis) undertrykker proliferation af lymfeknudeceller i respons på MBP-immunisering. Resultaterne er vist i fig. 4. Denne figur afbilder kontrolresu1ta-15 terne i forhold til tiIføringsresultaterne som en funktion af den MBP-inducerede proliferation delt med baggrund (stimulationsindeks) .

Opfindelsen er ikke begrænset til sådanne metoder og udførel-20 sesformer ifølge nærværende tekst og udførelsesformer, som er blevet beskrevet ovenfor. Den omfatter hvilke som helst modifikationer, som resulterer i undertrykkelse af autoimmune sygdomme, som anvist ved den foreliggende opfindelse. Disse ækvivalenter er indbefattet inden for beskyttelsesområdet, som de-25 fineres af kravene.

Eksempel 10

Adoptiv overføring af beskyttende modstandsdygtighed 30 mod EAE-udvikling fra MBP-tilførte donorrotter til ikke forud testede synoeniske modtagende rotter

Donorrotter blev tilført enten MBP eller BSA, 1 mg x 5 gange, med 3-4 dages mellemrum og blev aflivet 4 dage efter den sid-35 ste tilføring. Mesenterial -lymfeknudecel ler (LNC) og miltceller blev høstet og injiceret intraperi tonealt enten øjeblikkeligt eller efter aktivering med concanava1 in-A (Con-A), 1,5

I DK 175666 B1 I

I I

pg/ml, i proliferation smed i er i 48 timer. Antallet af injice- I

H rede celler til adoptive overføringseksperimenter var som I

følger: 120xl06 for hel LNC-populat ion, enten aktiverede I

H eller ikke-akti verede; 60xl06 for CD3-udtyndede eller -udtømte I

H 5 INC; 80xl06 for CD4-udtyndet eller -udtømte population; og I

H 95xl06 for CD8-udtyndede eller -udtømte LNC. Modtagende Lewis- I

H rotter blev immuniseret med MBP/CFA 4 timer senere til frem- I

H kaldelse af EAE. Evnen til at overføre modstandsdygtighed ell- I

H er -udtømte for udvikling af EAE fra tilførte donorrotter til I

H 10 ikke forud testede syngeniske modtagende rotter er vist i ta- I

bel VII. LNC optaget fra ikke-1i 1førte rotter eller fra bovin- I

serumalbumin (BSA)-tiIførte donorrotter mislykkedes med hensyn I

til overføring af beskyttelse imod EAE. Både miltceller eller I

mesenterial (MES)-lymfeknudeceller, som blev opnået fra MBP- I

15 tilførte donorer, var imidlertid i stand til at overføre rela- I

tiv beskyttelse imod EAE induceret i de modtagende dyr, udvi- I

sende henholdsvis 50% og 57% undertrykkelse af sygdom. Den ge- I

nnemsnitlige maksimale alvorlighed af sygdom blev også reduce- I

ret markant i de dyr, som modtog enten miltceller eller mesen- I

20 teriallymfeknudeceller, som var opnået fra MBP-tilførte donor- I

rotter. Oisse resultater viser, at den orale tolerans for I

EAE-fremkaldelse er af cellulær oprindelse,' og at de celler, I

som er ansvarlige for beskyttelse, viser sig at være koncen- I

treret både i mesenteriallymfeknuder og i milten.

25 I 1

35 I

Tabel VII

25 DK 175666 B1

Adoptiv overføring af beskyttelse imod EAE under anvendelse af LNC opnået fra enten tilførte eller ubehandlede donorrotter.

5

Rotter Donorer EAE hos modtagende dyr ti 1 ført Kilde til LNC Forekomst Gennems. maks. alvorlighed Intet SPC 6/7 2,5±0.3

Mes.LNC 5/5 2,6±0,4 8SA SPC 4/4 2,4±0,2 10 Mes.LNC 5/5 2,6t0,3 MBP SPC 4/8* 1,6±0,2*

Mes.LNC 4/7* 1,7±0,2*

Lewis-rotter blev tilført enten MBP eller BSA fem gange, 1 mg pr. tilføring med 3 dages intervaller, eller forblev ubehand-15 lede. Rotterne blev derefter aflivet, og deres milte og mesen-ter i allymfeknuder blev fjernet. LNC blev høstet og aktiveret i 48 timer i nærværelse af Con-A. Lymfoblasterne blev opsamlet, vasket tre gange og injiceret intraper i tonealt i ikke forud testede syngeniske rotter. De modtagende rotter blev udfordret 20 fire timer senere med MBP/CFA til fremkaldelse af EAE. Sygdommen blev bedømt dagligt fra dag 10 (*resultater er statistisk signifikante p<0,05).

' Eksempel 11 25

Identifikation af lymfeknudecellesubpopulationen som formidler modstandsdygtighed over for ÉAE

Con-A-aktiverede miltceller (SPC) opnået fra MBP-tilførte do-30 norrotter blev overført til ikke forud testede syngeniske rotter enten før eller efter udtynding eller udtømning af enten T-celler, hjælper-T-lymfocytter (CD4) eller suppressor/-cy-totoksiske T-lymfocytter (CD8). Til udtynding eller udtømning af CD3-, CD4- og C08-popu1 at ioner fra miltceller anvendtes ne-35 gativ udvælgelse. Petriskåle blev dækket natten over ved 4eC med 10 ml 1/1000 gede-anti-muse-IgG + IgM-anti stoffer (Tago) i PBS/BSA.' Pladerne blev derefter vasket og dækket med 3% fetal

I DK 175666 B1 I

I 26 i

bovinserum i PBS i 30 min. ved 20°C og atter vasket. Lewis-LNC I

H blev plettet med muse-antirotte-monoklonale antistoffer I

(Serotec/Bioproducts) mod C03 (MRC, OX/38), C04 (W3/25) eller I

I CD8 (OX/8) fortyndet 1/100 i PBS. Cellerne blev plettet i 30 I

5 min. på is, vasket og podet på de forudbelagte petriskåle, 15 I

H millioner celler/5 ml PBS/plade ved 4°C. Supernatanten inde- I

H holdende ikke-fastklæbende celler blev opsuget forsigtigt 60 . I

min. senere og centrifugeret to gange før celleundersøgelse og I

-tælling. Denne protokol giver cellepopulationer på ca. 85-95% I

H 10 renhed, som undersøgt i f1uorescens-aktiveret-cel1esorterap- I

parat ved undersøgelse af membranimmunof1uorescens. Resulta- I

terne er vist i tabel VIII. Resultaterne viser, at SPC er i I

stand til at overføre beskyttelse imod EAE (50% forekomst), I

hvorimod T-celleudtømt eller -udtyndet SPC har tabt deres evne I

15 til at beskytte modtagende rotter (gruppe 2). Det forekommer I

således, at miltcellerne, som er i stand til at overføre bes- I

kyttelse, er T-lymfocytter. Udtømning eller udtynding af I

CD8-celler (gruppe 4) resulterer imidlertid i mislykket over- I

føring af beskyttelse, hvorimod (CD4+)-udtømt eller udtyndet I

I 20 SPC viste en betydelig evne til at beskytte rotter imod EAE. I

Det er sålédes tegn på, at de antigenspecifikke T-lymfocytter, I

som dannes efter oral administrering af MBP, og som formidler I

I modstandsdygtighed mod sygdomsinduktion, er af suppressor/cy- I

I totoksisk delmængde. I

I 25 I

I Tabel VIII I

Adoptiv overføring af beskyttelse imod EAE under anvendelse af I

I udtyndet population af SPC. I

I 30 I

I Gruppe SPC fjernet fra EAE i modtagende rotter

I MBP-t i 1 førte Gennemsni 11iq I

I donorer Forekomst maks. alvorlighed I

I 1 Hel population 2/4 1,7*0,2* I

2 CD3-udtyndet eller 6/6 2,6±0,4* I 35 -udtømt

I 3 CD4-udtyndet eller 2/6* 1,2*0,2* I

I -udtømt

I 4 CD8-udtyndet eller 6/7 2,2±0,3 I

I -udtømt I

DK 175666 B1 27

Donorrotter blev tilført MBP og behandlet som angivet i teksten til tabel 1. Con-A-aktiveret SPC blev injiceret i i kke- forud testede modtagende rotter enten før (gruppe 1) eller efter udtynding eller udtømning af en bestemt subpopulation 5 (gruppe 2-4). Udtynding eller udtømning af CD3-, CD4- eller CD8-lymfocytter blev foretaget ved kobling af monoklonale IgG-antistoffer mod SPC og udvaskning. Modtagende rotter blev immuniseret med MBP/CFA, og EAE blev optegnet fra dag 10 (♦resultater er statistisk signifikante, p<0,05).

10

Eksempel 12

In vitro undertrykke!se af anti-MBP T-celleresponser ved tilsætning af 1 vmfeknudeceller fra MBP-tilførte rotter 15

Rotter blev immuniseret med MBP/CFA, og deres primede poplite-aldrænerende lymfeknuder (PLNC) blev høstet ni dage senere. En enkelt cellesuspension blev fremstillet ved at presse lymfeknuderne gennem en sigte af rustfrit stål. Et totalt antal på 20 10$ LNC blev dyrket med det anførte antal af enten bestrålede (2000 Rads) eller intakte LNC hidrørende fra tilførte rotter i fire eksemplarer i rundbundet 96-brøndplade (Costar). MBP og Mycobacterium tuberculosis, 50 pg/ml, blev sat til kulturen i et volumen på 20 μΐ. Kulturerne blev dyrket i 80 timer og blev 25 pulseret med lpCi [3HJ TdR/brønd i mindst 16 timer af dyrkning. Kulturerne blev høstet på et automatisk ce11ehøstnings-apparat og aflæst på en standard væskescintillationstæller.

Procentvis undertrykkelse af primet LNC (PLNC) proliferation 30 blev beregnet ved hjælp af den følgende formel: CPM (bestrålede LNC fra tilført ....... ... . rotte + PLNC + antigen) * undertrykkelse . 100 x 1 - ςρΐ"" (D^siråTede LNC fra uVehand- let rotte + PLNC antigen) PLNC blev dyrket sammen med bestrålede SPC eller mesenterial-LNC opnået fra enten ikke forud testede eller MBP-tilførte rotter i nærværelse af enten MBP eller Mycobacterium 35

I DK 175666 B1 I

I 28 I

tuberculosis. LNC opnået fra MBP-tiIførte donorrotter blev un- I

dersøgt på forskellige dage efter sidste tilføring. Resulta- I

terne er vist i fig. 5. Det ses, at inden for forsøgets tids- I

H ramme påvirkede LNC, som var opnået fra tilførte rotter, ikke I

H 5 PLNC-responserne på Mycobacterium tuberculosis. Både SPC og I

H mesenteri al-LNC opnået fra tilførte rotter var imidlertid i I

H stand til at undertrykke PLNC-proliferation på MBP. Antigen- I

specifik undertrykkelse af PLNC-responser var større under an- I

vendelse af SPC end mesenteri al-LNC. Undertrykkelse er tydelig I

10 fra dag 5 til dag 36 efter den sidste tilføring med MBP, I

hvilket indikerer, at fremkaldelse af undertrykkelse opnås I

H hurtigt efter tilføring, og den bibeholdes i et relativt langt I

H tidsrum. I

15 Det synes således, at LNC opnået fra rotter, der er gjort to- I

lerante over for EAE-fremkaldelse, er antigen-specifikke lym- I

focytter, som er i stand til at undertrykke cellulære immunre- I

sponser kun for det antigen, der anvendes til tilføring. I

I 20 Eksempel 13 I

Undertrykkelse af anti-MBP-responser af PLNC i I

I nærværelse af bestrålede SPC og subpopulationer heraf, I

I som er opnået fra en MBP-tilført rotte I

I 25 I

Til undersøgelse af subpopulationen af SPC, som er ansvarlig I

for undertrykkelse, blev SPC opnået fra MBP-tilført rotte 20 I

I dage efter sidste tilføring, udtyndet eller udtømt for visse I

I lymfocytpopulationer, bestrålet og blandet med PLNC, som var I

I 30 opnået fra MBP/CFA-immuniseret rotte, sammen med MBP. Popli - I

teal- og milt-LNC blev podet i en koncentration på 1Ό7 celler I

pr. ml petriskål enten alene eller bestrålet (2000 Rads) sam- I

I men med andre PLNC som angivet. Kulturerne blev holdt i proli- I

I ferationsroedier sammen med eller uden antigen (20 pg/nl) i 3 I

I 35 dage i en inkubator, hvorefter de blev høstet. De fortyndede I

supernatanter blev anvendt til undersøgelse af in vitro pro- - I

I duktion og udskillelse af IgG-antistof og blev målt for anti- I

DK 175666 B1 29 stofproduktion under anvendelse af en ELISA-prøve. Mikrotiter-plader blev inkuberet med 0,1 ml pr. brønd af 10 pg antigen/ml i dobbeltdesti 11eret vand. Plader blev inkuberet i 18 timer ved 25®C. Efter 3 vaske med PBS/Tween-20 (Bio-Rad), pH 7,5, 5 blev plader inkuberet med 3% BSA/PBS i 2 timer ved 37®C og vasket to gange, hvorefter 100 μΐ fortyndet serum blev sat i fire omgange. Pladerne blev inkuberet i 2 timer ved 37eC. Efter tre skylninger med PBS/Tween-20 blev plader inkuberet med 100 μΐ/brønd af peroxidase-konjugeret gede-antirotte-IgG-10 antistof (Tago, USA) fortyndet 1:1000 i 1% BSA/PBS i en time

ved 25eC. Farvereaktion blev opnået ved udsættelse for 0-phenylendiamin (0,4 mg/ml phosphatcitratpuffer, pH 5,0) indeholdende 30% H2O2. Reaktionen blev stoppet ved tilsætning af 0,4N H2SO4, og OD-værdien ved 492 nm blev aflæst på en ELISA-15 aflæser. Resultaterne vist i tabel IX repræsenterer den procentvise undertrykkelse af antigenproli feration af PLNC i nærværelse af SPC opnået fra MBP-tilførte rotter i sammenligning med deres responser på MBP i nærværelse af SPC opnået fra intakte rotter. Oet påvises, at SPC opnået fra MBP-tilførte 20 rotter (gruppe 1) undertrykker responserne af PLNC på MBP

(70%). Udtynding eller udtømning af T-celler (gruppe 2) eller suppressor/cytotoksiske T-lymfocytter (gruppe 3) ophæver undertrykkelse. Udtynding eller udtømning af hjælper-T-lymfocytter (CD4, gruppe 4) forøger imidlertid inhibering af 25 anti-MBP-proliferationsrespons af PLNC. Fortynding af CD4-untyndet SPC resulterer i et fald af undertrykkelse fra 96% (i 1:1-forhold) til 18% (i 1:100-forhold af SPC:PLNC).

Disse resultater antyder, at cellerne, som er ansvarlige for 30 både sygdomsinhibering og antigen-specifikke cellulære responser in vitro, er af T-cel1eopri ndel se, og at de er suppressor/cytotoksiske T-1ymfocytter.

35

I DK 175666 B1 I

I I

I Tabel IX I

Undertrykkelse af anti-MBP-responser af PLNC i nærværelse af I

bestrålede SPC og subpopulationer heraf opnået fra MBP-til- I

5 førte rotter. I

SPC fjernet fra SPC:PLNC- % undertrykkelse af I

H Gruppe MBP-tilførte rotter forhold PLNC-responser på MBP I

1 Hel population 1:1 70 I

2 CD3-udtyndet eller 1:1 -13 I

-udtømt I

3 CD8-udtyndet eller 1:1 -30 I

H -udtømt I

4 CD4-udtyndet eller 1:1 96 I

-udtømt I

1:10 32 I

1:50 35 I

15 1:100 18 I

Milte blev fjernet fra MBP-tilførte Lewis-rotter, hvorefter I

cellerne blev høstet, bestrålet og podet sammen med responder- I

PLNC fjernet fra MBP/CFA-immuniserede syngeniske rotter. SPC I

2o blev anvendt som ubehandlede celler eller udtyndet eller ud- I

I tømt for CD3-, CD4- eller CD8-T-1ymfocytter under anvendelse I

af passende monoklonale antistoffer til kobling og derefter I

I udvaskning. Resultaterne er udtrykt som procentvi s undertryk- I

kelse af PLNC-responser på MBP og er relative i forhold til I

25 PLNC-responserne i nærværelse af bestrålede SPC, som er fjer- I

net fra ikke-tiIførte rotter. I

Eksempel 14 I

3 0 Humoral undertrykkelse af anti-MBP-IgG-produkti on I

induceret ved oral tolerans for MBP I

Lewis-rotter blev enten tilført MBP eller efterladt ubehand- I

lede og derefter udfordret med MBP blandet med ovalbumin I

35 (OVA), som var emulgeret i CFA. Rotterne blev derefter tappet I

for blod med forskellige mellemrum, og sera blev undersøgt for I

anti-OVA- eller anti-MBP-anti s toffer. Som vist i fig. 6a blev I

DK 175666 B1 I

IgG-serumniveauerne for OVA ikke påvirket i MBP-tilførte

rotter, hvorimod IgG-serumniveauer for MBP blev mindsket i I

MBP-tilførte rotter (6b). I

5 Eksempel 15 I

Bestemmelse af den celletype, som er ansvarlig I

for undertrykkelse af IqG-produktin in vitro I

10 Lewis-rotter blev tilført MBP eller forblev ikke-1i 1 førte, hvorefter de blev immuniseret med MBP + OVA/CFA. PLN blev fjernet 12 dage senere, og PLNC blev dyrket i 3 dage i nærværelse af enten MBP eller OVA, og supernatanterne blev opsamlet, fortyndet 1:20 og undersøgt for deres IgG-indhold. Som 15 vist i tabel X reagerede PLNC, som var opnået fra tilførte

Irotter (gruppe 2) og dyrket in vitro med MBP, mindre på MBP

med hensyn til IgG-produkt i on i sammeri 1 i gn i ng med PLNC opnået fra ikke-ti 1førte rottter (gruppe 1, 45% undertrykkelse). Produktionen af anti-OVA-IgG-produktion i PLNC fra de samme rot-20 ter var ikke påvirket (gruppe 4 i forhold til 5). Blanding af bestrålede PLNC opnået fra MBP-tilførte og immuniserede rotter med PLNC fra immuniserede rotter dyrket sammen med MBP mindskede endvidere antistofproduktion af den sidste (gruppe 3, 35% undertrykkelse), hvorimod antistoftiterne over for OVA 25 ikke blev påvirket (gruppe 6). Fjernelse af CD8+-celler ophævede endvidere undertrykkelse af anti-MBP-antistoffer, hvilket viser, at CD8 + -cellerne soro i adoptive overfør i ngsresponser og proliferative responser var ansvarlige for undertrykkelse.

H DK 175666 B1 I

I

Tabel X I

IoG-mveauer i supernatanter I

H In vitro 0D492' % undertryk- I

5 Modulator- stimule- værdier kelse af IgG- I

Gruppe Svarcellér celler_rinq_tS.D. produktion I

1 Immuniseret -- MBP 0,56i0,06 -- I

2 MBP-tilført -- MBP 0,31±0,01 45 I

I

immuniseret I

3 Immuniseret MBP-til- MBP 0,36*0,04 35 I

H ført og I

H immuniseret I

4 Immuniseret MBP-til- MBP 0,55*0,04 0 I

ført og I

15 immuniseret I

CD8+- I

udtyndet eller I

-udtomt I

5 Immuniseret -- OVA 0,17*0,03 -- I

I 20 6 MBP-tilført -- OVA 0,18*0,02 0 I

I

H immuniseret I

H 7 Immuniseret MBP-til- OVA 0,21*0,04 O I

ført og I

immuniseret I

I 25 I

Rotter blev immuniseret med MBP+OVA og CFA (nogle 3 dage efter I

den femte tilføring af MBP). Tolv dage senere blev deres PLNC I

fjernet og dyrket sammen med MBP (gruppe 1-4) eller sammen med I

OVA (gruppe 5-7) i tre dage. I nogle grupper blev bestrålede I

I PLNC opnået fra MBP-tilførte og immuniserede rotter bestrålet I

I 30 I

og dyrket sammen med immuniserede PLNC i nærværelse af. MBP I

I (gruppe 3) eller i nærværelse af OVA (gruppe 7). Supernatan- I

I terne af disse stimuleringer blev opsamlet og fortyndet, og I

I IgG-niveauerblevbéstemtvedhjælpafELISA. I

1 35 I

DK 175666 B1 33

Eksempel 15

Identifikation af den MBP-reqion. som aktivt undertrykker EAE, under anvendelse af overlappende 5 syntetiske polypeptider af MBP

Overlappende fragmenter af aminosyre 1-37-fragment af basisk marsvinemyelinprotein blev syntetiseret under anvendelse af fastfase-peptidteknik. R. Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 10 82:5131-5135 (1985). Disse fragmenter blev derefter admini streret oralt i ækvimolære koncentrationer til 15 mg helt basisk myelinprotein. De blev administreret på dag -7,-5 og -2 forud for immunisering. Dyr blev derefter, udfordret med basisk protein i Freund's adjuvans ifølge etablerede procedurer og 15 bedømt.

Dyr blev bedømt for dødelighed, tilstedeværelse af sygdom og sygdommens alvorlighed. Som vist i tabel XI blev 6/6 kontroldyr syge med en dødelighed på 3/6. I dyr, som fik overlappende 20 peptidfragmenter, var der en mindsket dødelighed under anvendelse af alle fragmenter, bortset fra fragment 1-10. Ved betragtning med hensyn til sygdomsa 1 vor 1ighed viste regionen af molekylet mellem aminosyrer 5 og 20 den mest udtalte mindsken af sygdom. Disse resultater viser, at i aminosyreregionen 25 1-37 , som i sig selv er et suppressogent fragment, kan be stemte regioner af molekylet være mere eller mindre undertrykkende ved oral administrering. 1 35

I DK 175666 B1 I

I 34 I

I Tabel XI I

EAE formidlet ved MBP/CFA I

Forekomst Gennemsnitlig I

Fragment af sygdom max, bedømmelse Døde 1iqhed I

δ I

Kontrol (PBS) 6/6 3,8 3/6 I

1-10 5/5 3,8 4/5 I

5-15 4/5 2,1 1/5 I

11-20 4/5 2,0 0/5 I

16-25 4/5 2,6 0/5 I

21-30 5/5 3,0 1/5 I

10 26-36 4/6 2,6 1/6 I

31-37 5/6 3,3 0/6 I

H Overlappende fragmenter i 1-37 regionen af basisk marsvinemye- I

linprotein blev syntetiseret under anvendelse af fastfase- I

peptidteknik. Disse fragmenter blev derefter indgivet oralt i I

l·5 ækvimolær koncentration til 15 mg helt basisk myel inprotein. I

De blev indgivet på dag-7, -5 og -2 forud for immunisering. I

Dyr blev derefter udfordret med basisk protein i Freund's ad- I

juvans ifølge etablerede procedurer og bedømt. I

20 Eksempel 16 I

Påvisning af, at oral administrationsve i af I

et proteinantiqen bestemmer, til hvilket I

fragment, der er et immunrespons I

25 I

Dyr fik helt basisk myelinprotein, enten immuniseret i hæfte- I

skiven med Freund's adjuvans eller, administreret oralt. Syv I

til 10 dage efter blev milt- og lymfeknudeceller fjernet og I

genstimuleret in vitro med forskellige fragmenter af det ba- I

30 siske proteinmolekyle. I

Når basisk myelinprotein administreres perifert i Freund’s ad- I

juvans, er det primære respons, som vist i tabel XII, på 44-89 I

encephali togenregion som målt ved proliferation. Når det admi- I

35 nistreres oralt, er det primære respons, som vist i tabel I

XIII, imidlertid på fragment 1-37, den ikke-encepha1 i togene I

suppressordeterminant. I

Tabel XII

DK 175666 B1 35

Proliferation på MBP-fragmenter i Lewis-rotter, som er immuniseret med hel MBP.

5 Tællinger pr. minut St i mu 1 at i ons indeks Baggrund 3.292

Helt MBP 10.142 3,1 MBP-fragment 1-37 3.360 1,0 MBP-fragment 44-89 10.054 3,0 10

Dyr blev immuniseret i baghæfteskiver med 50 ug MBP i CFA. Ti dage senere blev lymfeknuder fjernet og stimuleret in vitro med 10 ug MBP eller ækvimolære mængder af MBP-fragmenter.

15 Tabel XIII

Proliferation på MBP-fragmenter i Lewis-rotter, som var tilført helt MBP oralt.

Kilde for LNC Helt MBP 1-37 44-89 20 SPC 5,10 ί1,6 5,0541,8 .'2,41*0,9

Mes. LNC 8,61±1,9 9,88*1,5 3,5340,8

Cervikale 4,58±1,3 6,42±0,9 2,51*0,6

Dyr blev tilført 1 mg helt MBP x3, hvorefter cellerne blev 25 fjernet fra forskellige organer 15 dage efter tilføring, og proliferation blev målt. Resultater udtrykkes som ændring i CPMxlO"3 i sammenligning med celler, som er dyrket alene. 1 35

Claims

1. Anvendelse af et autoantigen, som er specifikt for en autoimmun sygdom, til I 5 fremstilling af et lægemiddel til oral eller enteral administration til behandling af en T- I H cellemedieret eller T-celleafhængig autoimmun sygdom hos et menneske. ; I

2. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den autoimmune sygdom er I rheumatoid arthritis, diabetes mellitus, multipel sklerose eller autoimmun thyroiditis. I I I

3. Anvendelse ifølge ethvert af kravene 1 til 2, hvori formuleringen af lægemidlet I muliggør administration af 1-1000 mg/dag, fortrinsvis 25 til 850 mg/dag. I

4. Anvendelse ifølge ethvert af kravene 1 til 3, hvori behandlingen undertrykker de I Η 15 kliniske og histologiske symptomer på den autoimmune sygdom. I

5. Anvendelse ifølge krav 2, hvori den autoimmune sygdom er multipel sklerose og I autoantigenet er MBP. I I 20

6. Anvendelse af et fragment af et autoantigen, som er specifikt for en T- I cellemedieret eller T-celleafhængig autoimmun sygdom til fremstilling af et lægemid- I del til oral eller enteral administration til behandling af den autoimmune sygdom i et I I menneske. I I 25

7. Anvendelse af en analog af et autoantigen, som er specifikt for en T-cellemedieret I I eller en T-celleafhængig autoimmun sygdom til fremstilling af et lægemiddel til oral I I eller enteral administration til behandling af den autoimmune sygdom i et menneske. I

8. Anvendelse ifølge krav 6, hvori den autoimmune sygdom er multipel sklerose, og I I 30 fragmentet af et autoantigen er et MBP-fragment. I DK 175666 B1 37

9. Anvendelse ifølge krav 8, hvori fragmentet af et autoantigen er et -ikke-encephalitogent MBP-fragment.

10. Anvendelse ifølge krav 7, hvori den autoimmune sygdom er multipel sklerose, og 5 analogen af et autoantigen er en MBP-analog. i i i