DE3856566T2

DE3856566T2 - Behandlung von Autoimmun-Erkrankungen durch orale Verabreichung von Autoantigenen

Info

Publication number: DE3856566T2
Application number: DE3856566T
Authority: DE
Inventors: Howard Weiner; David A. Hafler
Original assignee: Brigham and Womens Hospital Inc
Current assignee: Brigham and Womens Hospital Inc
Priority date: 1987-06-24
Filing date: 1988-06-24
Publication date: 2004-06-24
Anticipated expiration: 2008-06-25
Also published as: DK651689A; AU632991B2; CA1336954C; EP0359783B1; DK175666B1; DE3856566D1; EP0359783A4; JP2512796B2; ATE130762T1; DE3854741D1; EP0666080B1; EP0666080A1; JPH02503919A; ATE258065T1; AU2079788A; EP0359783B2; EP0359783A1; DE3854741T2; WO1988010120A1; DE3854741T3

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines für eine Autoimmunerkrankung eines Menschen spezifischen Autoantigens bei der Herstellung eines Medikamentes für eine orale oder enterale Verabreichung zum Hervorrufen von Suppressor-T-Zellen, welche das Autoantigen erkennen.
Kurze Beschreibung des Hintergrundwissens
Autoimmunerkrankungen werden durch eine anomale Immunantwort verursacht, die entweder gegen normale Gewebe gerichtete Zellen oder Antikörper involviert. Zur Suppression von Autoimmunerkrankungen ist eine Anzahl von Strategien entwickelt worden, vor allem Wirkstoffe, die die Immunantwort unspezifisch supprimieren. Ein Verfahren zum Induzieren einer immunologischen Toleranz durch die orale Verabreichung eines Antigenes, um Autoimmunantworten zu verhindern, wurde zuerst von Wells 1911 gezeigt. Wells, H., J. Infect. Dis. 9: 147 (1911). Die orale Induktion einer Nicht-Reaktivität ist auch für verschiedene T-Zell-abhängige Antigene gezeigt worden. Ngan, J., et al., J. Immunol. 120. 861 (1978), Gautam, S., et al., J. Immunol. 135: 2975 (1985), Titus, R., et al., Int. Arch. Allergy. Appl. Immun. 65: 323 (1981). Weiterhin beschreibt eine neuere Publikation die orale Verabreichung von Collagen zur Suppression Collageninduzierter Arthritis in einem Mausmodell. Nagler-Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83: 7443–7446 (1986).
Außerdem sind in verschiedenen Tiermodellen von Wissenschaftlern Wege, der Suppression von Autoimmunerkrankungen untersucht worden. Die experimentelle allergische Encephalomyelitis (EAE) ist eine T-Zell-vermittelte Autoimmunerkrankung, die gegen das basische Myelinprotein (myelin basic protein – MBP) gerichtet ist und als Modell für Multiple Sklerose in verschiedenen Säugetierarten untersucht worden ist. Siehe Alvord, E., et al., Experimental Allergic Encephalomyelitis – A Useful Model For Multiple Sclerosi (Allan R. Liss, New York, 1984). Es ist bekannt, daß die Immunregulation der EAE mindestens teilweise von T-Suppressorzellen (Ts) abhängig ist. Es ist gezeigt worden, daß Ts in Ratten vorhanden sind, die sich von EAE erholt haben. Swierkosz, J., et al., J. Immunol. 119: 1501 (1977). Weiterhin ist gezeigt worden, daß T-Suppressorzellen für die Unempfänglichkeit für EAE verantwortlich sind, die von einigen Mausstämmen gezeigt wird. Lando, Z., et al., Nature 287: 551 (1980).
Zur Induktion der Antigen-spezifischen Suppression der EAE sind verschiedene Verfahren verwendet worden, die die Immunisierung mit in unvollständigem Freund'schen Adjuvanz emulgierten MBP umfassen, wie von Lando, Z., et al., J. Immunol. 126: 1526 (1981), gezeigt, und die intravenöse Injektion von MBP-konjugierten lymphoiden Zellen, wie von Sriram, S., et al., Cell. Immunol. 75: 378 (1983), gezeigt.
Die orale Verabreichung von MBP zum Verhüten oder Supprimieren von EAE im Mausmodell ist in Higgins et al., Program and Abstracts, American Neurological Association, P154: 161, 1986; Whiteacre et al., Abstract 3.62.21, Abstracts of the 6^th International Congress of Immunology, Toronto, 468, 1986; Bitar, PhD Thesis, veröffentlicht von UMI, 1986 beschrieben. Bitar merkt jedoch an, dass die erhaltenen Ergebnisse nicht mit einem Suppressorzellmechanismus übereinstimmen. Keine dieser Publikationen gibt irgendeinen Hinweis darauf, dass die orale Verabreichung von Autoantigenen eine wirksame Behandlung oder Verhütung einer menschlichen Autoimmunerkrankung darstellen könnte.
In den Annals of Neurology, Band 6, auf den Seiten 461–468, 468–473 bzw. 474–482 (1979) sind drei Publikationen von Alvord et al. enthalten. Die erste und zweite dieser Publikationen offenbaren die Suppression von EAE in Affen durch parenterale Verabreichung von MBP ausschließlich in Verbindung mit einem unspezifischen Hilfsfaktor, zum Beispiel einem Antibiotikum oder Steroid. Die dritte Publikation offenbart das Vorhandensein von verschiedenen Proteasen, die MBP zu antigenisch aktiven Peptidfragmenten degradieren, in der Cerebrospinalflüssigkeit von Patienten mit Multipler Sklerose.
Publikationen von Traugott et al., J. Neurological Sciences 56: 65–73 (1982), und Raine et al., Lab. Investigation 48: 275–84 (1983), offenbaren, daß die Behandlung eines Meerschweinchenstammes, der an chronisch rezidivierender EAE leidet, durch parenterale Verabreichung von MBP allein oder in unvollständigem Freund'schen Adjuvanz (IFA) oder in Kombination mit einem Lipidhapten von Myelin, nämlich Galactocerebrosid, die klinischen Symptome von EAE supprimierte.
Weiterhin offenbaren McKenna et al., Cell. Immun. 81: 391–402 (1983), daß in Ratten die vorherige Injektion von an syngenische Milzleukozyten oder syngenische rote Blutzellen gekoppeltem Meerschweinchen-MBP die anschließende Induktion von EAE unter Verwendung von Meerschweinchen-MBP in Freund'schem vollständigen Adjuvanz supprimierte. Das Ausmaß der Suppression korrelierte positiv mit der Menge von verabreichtem MBP.
Ein Bericht von Strejan et al., Cell. Immun. 84: 171–184 (1984), offenbart, daß in Ratten die vorherige Injektion von Meerschweinchen-MBP, das in Phosphatidylserinliposomen eingekapselt war, die klinischen Anzeichen und Symptome von EAE supprimierte, die in Ratten auftreten, denen Meerschweinchen-MBP in vollständigem Freund'schen Adjuvanz injiziert wird.
Eine weitere Publikation von McKenna et al., Cell. Immun. 88: 251–259 (1984), offenbart, daß die suppressiven Wirkungen von injizierten Meerschweinchen-MBP-Leukozytenkomplexen, die in ihrem Bericht aus dem Jahr 1983 offenbart worden waren, beseitigt wurden, wenn die Tiere mit Cyclophosphamid vorbehandelt wurden, einem Wirkstoff, der die Erzeugung von Suppressor-T-Lymphozyten inhibiert.
Ein Bericht von Krasner et al., Neurology 36: 92–94 (1986), offenbart, daß synthetisches C-Copolymer-I, das als Behandlung für Multiple Sklerose getestet wird, da es Tiere vor EAE schützt, keine immunologische Kreuzreaktivität mit MBP aufweist.
Zusätzlich offenbart (entsprechend einer englischen Zusammenfassung) ein Bericht aus der Sowjetunion, Belik et al., Vopr. Med. Khim. 24: 372–377 (1978), die parenterale Verabreichung von "alkalischem Myelinproteinfragment" und "synthetischem encaphelitogenem Peptid" an Meerschweinchen mit EAE. Die Tiere erholten sich nach der Verabreichung von "alkalischem Myelinproteinfragment" an diese Tiere, die durch "alkalisches Myelinproteinfragment" aus Rindern oder durch "synthetisches encephalitogenes Peptid" sensibilisiert worden waren.
Ein Bericht von Braley-Mullen et al., Cell. Immun. 51: 408 (1980), und der Bericht von Nagler-Anderson et al., der oben erwähnt ist, offenbaren beide die Suppression von Symptomen zweier weiterer experimenteller Autoimmunerkrankungen, die durch Injizieren von Autoantigen-Lymphozytenkonjugaten in Tiere induziert worden waren. Der Bericht von Braley-Mullen et al. offenbart die Suppression von experimenteller Thyreoiditis in Meerschweinchen, indem diesen Tieren Thyroglobulinantigen in unvollständigem Freund'schen Adjuvanz injiziert wird. Der Bericht von Nagler-Anderson et al. offenbart die Suppression von T-Typ-II-Collagen-induzierter Arthritis in der Maus durch intragastrale Verabreichung von löslichem, aber nicht denaturiertem, T-Typ-II-Collagen vor der Immunisierung des Tieres mit T-Typ-II-Collagen in Adjuvanz.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung lehrt die Verwendung eines für eine Autoimmunerkrankung spezifischen Autoantigens bei der Herstellung eines Medikamentes für eine orale oder enterale Verabreichung zum Behandeln einer T-Zellvermittelten oder T-Zell-abhängigen Autoimmunerkrankung eines Menschen.
Sowohl die klinischen als auch die histologischen Wirkungen solcher Erkrankungen werden auf eine dosisabhängige Weise supprimiert. Weiterhin tritt die Suppression unabhängig davon auf, ob die orale oder enterale Verabrei chung vor oder nach Ausbruch der Autoimmunerkrankung stattfindet. Die Erkrankung wird außerdem durch die orale oder enterale Verabreichung von die Erkrankung nicht induzierenden oder die Erkrankung induzierenden Fragmenten des Autoantigens supprimiert. Die orale oder enterale Verabreichung von Autoantigenen stellt daher ein wirksames, einfaches Verfahren dar, mittels dessen eine Autoimmunerkrankung natürlich immunreguliert werden kann.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist eine graphische Darstellung, die die Antigenspezifität der oral induzierten Suppression der proliferativen Antwort in Lewis-Ratten demonstriert. Den Tieren wurden an den Tagen –7, –5 und –2 500 μg MBP oder BSA verfüttert, dann wurden sie mit 100 μg MBP in CFA (vollständigem Freund'schem Adjuvanz) am Tag 0 immunisiert. 9 Tage nach der Immunisierung wurden Lymphknoten entfernt und die proliferative Antwort auf MBP, BSA und PPD (alle mit 50 μg/ml) wie in Beispiel 3 beschrieben bestimmt. Stimulationsindex = experimentelle cpm/Kontroll-cpm.
2 ist eine graphische Darstellung, die die oral induzierte Suppression von Adjuvanz-Arthritis zeigt, gemessen als Gelenkschwellung.
3 ist eine zeichnerische Darstellung des Protokolls zur Induktion rezidivierender Maus-EAE.
4 ist eine Säulengraphik, die die oral induzierte Suppression der Proliferation lymphoider Zellen in SJL-Mäusen darstellt. Den Tieren wurden 400 μg MBP 7 Mal über einen Zeitraum von 2 Wochen verfüttert und sie wurden mit 400 μg MBP in CFA (0,6 mg/ml M. tuberculosis) immunisiert. Der Stimulationsindex ist die MBP-induzierte Proliferation, geteilt durch den Hintergrund.
5 ist eine graphische Darstellung, die die Antigenspezifische Suppression der Antworten von poplitealen ableitenden Lymphknotenzellen (PLNC) durch Milz- und mesenteriale Lymphknotenzellen (LNC) darstellt, die aus Ratten erhalten wurden, denen basisches Myelinprotein (MBP) verfüttert worden war.
Die Ergebnisse werden als Prozent Suppression von PLNC gegen MBP (Kreise) sowie gegen Mycobacterium tuberculosis (Quadrate) ausgedrückt. Geschlossene Kreise oder geschlossene Quadrate stellen die Antwort von Milzzellen dar. Offene Kreise oder offene Quadrate stellen die Antwort von mesenterialen Lymphknotenzellen dar.
6 ist eine graphische Darstellung, die die spezifische Suppression der IgG-Antworten auf MBP nach oraler Verfütterung von MBP zeigt. Den Ratten wurde in bestimmten Intervallen Blut entnommen und die Seren auf anti-OVA (6A, offene Kreise) oder anti-MBP (6B, offene Quadrate) Antikörper unter sucht. Diese Seren wurden dann mit Seren verglichen, die aus Tieren erhalten worden waren, denen nichts verfüttert wurde und die nicht behandelt worden waren (geschlossene Symbole). Die Ergebnisse werden als ELISA-O.D.492-Werte ± Standardabweichung ausgedrückt.
Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von für Autoimmunerkrankungen spezifischen Autoantigenen bei der Herstellung von Medikamenten für eine orale oder enterale Verabreichung für die Behandlung T-Zell-vermittelter oder T-Zell-abhängiger Autoimmunerkrankungen eines Menschen. Der Ausdruck "Behandlung" ist so gemeint, daß er sowohl die prophylaktischen Maßnahmen zur Prävention solcher Autoimmunerkrankungen sowie die Suppression oder Abschwächung von Symptomen nach dem Ausbruch solcher Autoimmunerkrankungen umfaßt.
Eine Autoimmunerkrankung ist eine Funktionsstörung des Immunsystemes eines Tieres, einschließlich eines Menschen, bei der das Immunsystem nicht zwischen fremden Substanzen innerhalb des Tieres und den verschiedenen Substanzen, aus denen das Tier selbst zusammengesetzt ist, unterscheiden kann. Der Ausdruck "Tier" umfaßt alle Lebensformen, die ein immunregulatorisches System haben und daher für Autoimmunerkrankungen empfänglich sind.
Ein "Autoantigen" ist jede Substanz, die normalerweise innerhalb eines Tieres gefunden wird, die von den Lymphozyten oder Antikörpern dieses Tieres in einer anomalen Situation nicht länger als Teil des Tieres selbst erkannt wird und daher durch das immunregulatorische System angegriffen wird, als ob es eine fremde Substanz wäre. Der Ausdruck "biologisch aktive(s) Fragment(e)" eines solchen Autoantigens umfaßt jede Aminosäureteilsequenz davon, die die gleiche biologische Antwort induziert, d.h. die Fähigkeit zur Suppression oder Elimination einer T-Zell-vermittelten oder T-Zell-abhängigen Autoimmunantwort nach oraler oder enteraler Einführung. Der Ausdruck "Analog(e)" eines solchen Autoantigens umfaßt Verbindungen, die strukturell so mit diesen Autoantigenen verwandt sind, daß sie die gleiche biologische Aktivität haben, d.h. die Fähigkeit zur Elimination oder Suppression einer T-Zell-vermittelten oder T-Zell-abhängigen Autoimmunantwort nach oraler oder enteraler Einführung. Als solcher umfaßt der Ausdruck Aminosäuresequenzen, die von der Aminosäuresequenz des Autoantigenes in einer oder mehreren Aminosäuren abweichen (während sie dennoch eine im wesentlichen äquivalente biologische Aktivität beibehalten) sowie chemische Verbindungen, die die biologische Aktivität dieser Autoantigene hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Suppression oder Abschwächung der Symptome der Erkrankung nachahmen. Solche Verbindungen können aus Gewebe aus einem Zielorgan bestehen, das die Angriffsstelle bei einer Autoimmunerkrankung bildet.
Die primäre Verwendung der Erfindung ist die Behandlung einer großen Kategorie von Erkrankungen, die kollektiv T-Zell-vermittelte oder T-Zell-abhängige Autoimmunerkrankungen genannt werden, einschließlich Multipler Sklerose, Myasthenia gravis, rheumatoider Arthritis, Diabetes mellitus, systemischem Lupus erythematosus, Autoimmunthyroiditis, hämolytischer Autoimmunanämie und von Kontaktempfindlichkeitserkrankungen, die beispielsweise durch Pflanzenmaterial, beispielsweise kletterndem Giftsumach, verursacht werden; die Erfindung ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Die experimentelle allergische Encephalomyelitis (EAE) ist eine T-Zell-vermittelte Autoimmunerkrankung, die gegen basisches Myelinprotein (MBP) gerichtet ist und als Modell für Multiple Sklerose in verschiedenen Säugetierarten untersucht worden ist. Es ist bekannt, daß die Immunregulation von EAE zumindest teilweise von Suppressor-T-Zellen (Ts) abhängig ist. Es ist gezeigt worden, daß Ts in Ratten vorhanden sind, die sich von EAE erholt haben, und daß Ts für die mangelnde Reaktion auf diese Erkrankung in einigen Mausstämmen verantwortlich sind.
Adjuvanzarthritis (AA) ist ein Autoimmuntiermodell für rheumatoide Arthritis, das durch Injektion von Mycobacterium tuberculosis in die Schwanzbasis von Lewis-Ratten induziert wird. 10 bis 15 Tage nach der Injektion entwickeln die Tiere eine schwere progressive Arthritis.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung und Bestätigung, daß die orale oder enterale Verabreichung von MBP ein wirksames Mittel zur Suppression akuter monophasischer EAE ist und daß die orale oder enterale Verabreichung von Mycobacterium tuberculosis ein wirksamer Weg der Suppression von Adjuvanzarthritis ist. Die oral oder enteral induzierte Toleranz ist dosisabhängig und sowohl die klinischen als auch die histologischen Symptome der Erkrankung sind weniger schwerwiegend. Weil ein irrelevantes Antigen, beispielsweise Rinderserumalbumin (BSA), oral oder enteral keine Wirkung auf die Empfänglichkeit für EAE hat, kann gesagt werden, daß die oral oder enteral induzierte Toleranz für EAE spezifisch für MBP ist, also für das Antigen, gegen das die T-Zellen, die die Erkrankung vermitteln, sensibilisiert sind.
Weiterhin induziert die orale oder enterale Verabreichung von MBP an Ratten die Suppression von Immunantworten gegen MBP. Beispielsweise sind sowohl die Proliferation lymphoider Zellen als auch die Erzeugung von anti-MBP-Antikörpern verringert. Die Zellen, die sowohl für die Suppression der Erkrankung als auch für die Suppression Antigen-spezifischer zellulärer Antworten in vitro verantwortlich sind, stammen von T-Zellen ab und sind cytotoxische Suppressor-CD8+-T-Lymphozyten.
Wie unten unter Verwendung des EAE-Tiermodells für Multiple Sklerose und des Tiermodells für AA gezeigt wird, ist daher das einfache Verfahren einer oralen oder enteralen Verabreichung von Autoantigenen, beispielsweise MBP, eine wirksame Maßnahme zur Suppression sowohl der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen als auch bestimmter Immunantworten auf diese Autoantigene durch Hervorbringen von T-Zellen, welche die Autoantigene erkennen. Entsprechend sieht die vorliegende Erfindung die Verwendung eines für eine Autoimmunerkrankung eines Menschen spezifischen Autoantigens bei der Herstellung eines Medikamentes für eine orale oder enterale Verabreichung zum Hervorbringen von T-Zellen, welche das Autoantigen erkennen, vor.
Mit den Ausdrücken "Einführen" oder "Verabreichen" ist beabsichtigt, daß das Autoantigen, seine biologisch aktiven Fragmente oder biologisch aktiven Analoge durch Füttern auf dem Weg über den Mund oder intragastral durch eine Magensonde, d.h. enteral, in den Magen eingeführt werden.
Im allgemeinen ist das Medikament für eine orale oder enterale Verabreichung in einer Menge von 1 bis 1000 mg pro Tag bestimmt, und kann in Form einer einfachen Dosis oder mehrfacher Dosen verabreicht werden. Bevorzugt ist das Medikament für eine Verabreichung in einer Menge von 25 bis 850 mg pro Tag bestimmt. Wie vom Fachmann verstanden wird, ist die genaue Dosis eine Funktion des Autoantigens, des Alters, Geschlechts und physischen Zustands des Patienten, sowie weiterer gleichzeitig verabreichter Behandlungen.
Wo das Medikament für eine orale Verabreichung bestimmt ist, kann es mit anderen Lebensmittelformen gemischt werden und in fester, halbfester, Suspensions- oder Emulsionsform konsumiert werden. Es kann mit pharmazeutisch verträglichen Trägern, Geschmacksverstärkern und ähnlichen gemischt werden.
Wo das Medikament für eine enterale Verabreichung bestimmt ist, kann es in fester, halbfester, Suspensions- oder Emulsionsform eingeführt werden und kann mit jedem beliebigen pharmazeutisch verträglichen Träger, einschließlich Wasser, Suspendierungsmitteln, Emulgierungsmitteln gemischt werden.
Experimenteller Teil
Tiere
Weibliche Lewis-Ratten mit einem Gewicht von 150 bis 220 g wurden vom Charles River Laboratory, Wilmington, MA, erhalten und in allen Experimenten verwendet.
Immunisierung der Tiere
Die Ratten wurden an beiden Hinterpfoten mit 50 μg Meerschweinchen-MBP, emulgiert in vollständigem Freund'schen Adjuvanz (CFA), immunisiert. In einigen Experimenten wurde den emulgierten Antigenen 50 μg Ovalbumin (OVA) (Sigma) zugefügt und auf gleiche Weise injiziert. EAE war durch eine Gliedmaßenparalyse gekennzeichnet und wurde wie folgt bewertet: 0) keine Erkrankung; 1) verringerte Aktivität, schwacher Schwanz; 2) schwache Paralyse, unsteter Gang; 3) mäßige Paraparese, Gliedmaßen abgespreizt; 4) Tetraplegie.
Induktion von oraler Toleranz
Den Ratten wurde 1 mg MBP oder Rinderserumalbumin (BSA) in 1 ml PBS 5 Mal in Intervallen von 3 Tagen unter Verwendung einer 23-gauge-Nadel, die mit einem Plastikröhrchen abgedeckt war, gefüttert.
Proliferationstest
Neun Tage nach der Immunisierung wurden die Ratten getötet und ihre poplitealen Lymphknoten entfernt. Eine Einzelzellsuspension wurde hergestellt, indem die Lymphknoten durch ein rostfreies Stahlsieb gedrückt wurden. Insgesamt 10⁵ Lymphknotenzellen (LNC) wurden mit der angegebenen Anzahl entweder bestrahlter (2000 Rad) oder intakter LNC von Ratten, die gefüttert worden waren, in Vierfachansätzen in Platten mit 96 Vertiefungen mit rundem Boden kultiviert. MBP und Mycobacterium tuberculosis (Mt), 50 μg/ml, wurden der Kultur in einem Volumen von 20 μl zugefügt. Die Kulturen wurden 80 Stunden inkubiert und mit 1 μCi [³H] TdR/Vertiefung während der letzten 16 Kulturstunden pulsmarkiert. Die Kulturen wurden dann auf einem automatischen Zellernter geerntet und mit einem üblichen Flüssigkeitsszintillationszähler gemessen.
Die Prozent Suppression der induzierten LNC(PLNC)-Proliferation wurden nach der folgenden Formel berechnet:
Proliferationsmedium
In allen Experimenten wurde RPMI (Gibco) verwendet. Das Medium wurde nach Zusatz von 2 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol, 1% Natriumpyruvat, 1% Penicillin und Streptomycin, 1% nicht-essentiellen Aminosäuren und 1% autologem Serum steril filtriert.
Reinigung verschiedener Zelluntergruppen
Für die Abreicherung von CD3-, CD4- und CD8-Populationen aus Milzzellen wurde eine negative Selektion verwendet. Die Petrischalen wurden über Nacht bei 4°C mit 10 ml 1/1000 Ziegen-anti-Maus-IgG + -IgM-Antikörpern (Tago) in PBS/BSA beschichtet. Die Platten wurden dann gewaschen und mit 3% fötalem Rinderserum in PBS 30 Minuten bei 20°C beschichtet und wiederum gewaschen. Lewis-LNC wurden mit monoklonalen Maus-anti-Ratten-Antikörpern (Serotec/Bioproducts) für CD3 (MRC, OX/38), CD4 (W 3/25) oder CD8 (OX/8), 1/100 in PBS verdünnt, angefärbt. Die Zellen wurden 30 Minuten auf Eis gefärbt, gewaschen und in die zuvor beschichteten Petrischalen ausgesät, 15 Millionen Zellen/5 ml PBS/Platte bei 4°C. Der Überstand, der nichtanheftende Zellen enthielt, wurde 60 Minuten später vorsichtig aspiriert und zweimal zentrifugiert, bevor die Zellen untersucht und gezählt wurden. Dieses Protokoll führt zu einer Zellpopulation von ungefähr 85 bis 95% Reinheit, wie in einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer durch Untersuchung der Membranimmunfluoreszenz festgestellt wurde.
Experimente zur adoptiven Übertragung
Den Donor-Ratten wurde in Abständen von 3 bis 4 Tagen entweder MBP oder BSA, 5 mal 1 mg, gefüttert und sie wurden 4 Tage nach der letzten Fütterung getötet. Mesenteriale LNC und Milzzellen wurden geerntet und entweder sofort oder nach 48 Stunden Aktivierung mit Concanava-lin-A (Con-A) 1,5 μg/ml, in Proliferationsmedium intraperitoneal injiziert. Die Anzahl der injizierten Zellen für die Experimente zur adoptiven Übertragung war wie folgt: 120 × 10⁶ für die gesamte LNC-Population, entweder aktiviert oder nicht, 60 × 10⁶ für CD3-abgereicherte LNC, 80 × 10⁶ für CD4-abgereicherte Populationen und 95 × 10⁶ für CD8-abgereicherte LNC. Die Lewis-Rezipientenratten wurden 4 Stunden später zur Induktion von EAE mit BP/CFA immunisiert.
Serumspiegel von Antikörpern
Ein enzymgebundener Festphasenimmunadsorptionstest (ELISA) wurde zur Bestimmung der Antikörpertiter gegen MBP und OVA verwendet. Die Mikrotiterplatten wurden mit 0,1 ml 10 μg Antigen/ml in doppelt destilliertem Wasser pro Vertiefung inkubiert. Die Platten wurden 18 Stunden bei 25°C inkubiert. Nach drei Waschschritten mit PBS/Tween –20 (Bio-Rad), pH 7,5, wurden die Platten mit 3% BSA/PBS 2 Stunden bei 37°C inkubiert, zweimal gewaschen und 100 μl verdünntes Serum wurde in Vierfachansätzen zugefügt. Die Platten wurden 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach dreimal Spülen mit PBS/Tween –20 wurden die Platten mit 100 μl/Vertiefung Peroxidase-konjugiertem Ziegen-anti-Ratten-IgG-Antikörper (Tago, USA), 1:1000 in 1% BSA/PBS verdünnt, eine Stunde bei 25°C inkubiert. Die Farbreaktion wurde durch Reaktion mit D-Phenylendiamin (0,4 mg/ml Phosphat-Citratpuffer, pH 5,0, enthaltend 30% H₂O₂) erhalten. Die Reaktion wurde durch Zufügen von 0,4 N H₂SO₄ beendet und die OD 492 nm wurde auf einem ELISA-Lesegerät abgelesen.
In-vitro-Messung der Antikörpererzeugung
Popliteal- und Milz-LNC wurden aus gefütterten, unbehandelten und behandelten Ratten erhalten und in einer Konzentration von 10⁷ Zellen pro ml Petrischale entweder allein oder bestrahlt (2000 Rad) zusammen mit anderen PLNC, wie angegeben, ausgesät. Die Kulturen wurden 3 Tage in einem Inkubator im Proliferationsmedium, mit oder ohne Antigen (20 μg/ml) aufbewahrt und dann geerntet. Die verdünnten Überstände wurden zur Untersuchung der In-vitro-Erzeugung und -Sekretion von IgG-Antikörper verwendet und die Antikörperproduktion wurde unter Verwendung eines ELISA-Tests gemessen, wie zuvor beschrieben.
Identifizierung verschiedener Bereiche des basischen Myelinproteinmoleküles die für die Suppression von EAE verantwortlich sind
Überlappende Fragmente des Bereiches 1 bis 37 des basischen Myelinproteines aus Meerschweinchen wurden unter Verwendung eines Festphasenpeptidverfahrens synthetisiert. Houghten R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131–5135 (1985). Diese Fragmente wurden dann in Konzentrationen, die mit 15 mg des basischen Gesamt-Myelinproteines äquimolar waren, oral verabreicht. Sie wurden an den Tagen –7, –5 und –2 vor der Immunisierung verabreicht. Die Tiere wurden dann mit basischem Protein in Freund'schem Adjuvanz entsprechend etablierten Verfahren behandelt und bewertet.
Demonstration daß der orale Verabreichungsweg eines Proteinantigenes bestimmt gegen welches Fragment es eine Immunantwort gibt
Den Tieren wurde gesamtes basisches Myelinprotein gegeben, entweder durch Immunisierung in die Pfoten mit Freund'schem Adjuvanz oder oral verabreicht. 7 bis 10 Tage später wurden die Milz- und Lymphknotenzellen entfernt und in vitro mit verschiedenen Fragmenten des basischen Myelinproteinmoleküles restimuliert.
Beispiele
Beispiel 1
Die Wirkung des Fütterns von MBP und seiner peptischen Fragmente auf die Empfänglichkeit für und die Schwere von akuter monophasischer EAE wurde in Lewis-Ratten untersucht. Die Ergebnisse zeigen, daß dieser natürliche Weg der Toleranzinduktion sowohl die Entwicklung der Erkrankung als auch Immunantworten auf MBP supprimiert.
Zur oralen Induktion der Suppression von EAE wurde den Lewis-Ratten MBP, das aus Meerschweinchengehirn gereinigt worden war (Diebler, G., et al., Prep. Biochem. 2: 139 (1972)) unter Verwendung einer Spritze, die mit einer 20G-Ballpunktnadel ausgerüstet war, gefüttert. Den Kontrolltieren wurden gleiche Mengen Rinderserumalbumin (BSA) oder Kochsalz alleine verfüttert. EAE wurde durch Immunisierung durch Injektion von 50 μg MBP, emulgiert in vollständigem Freund'schen Adjuvanz (CFA), das 200 μg Mycobacterium tuberculosis enthielt, in die Hinterpfoten induziert. Die Erkrankung war durch Paralyse der hinteren Gliedmaßen und Inkontinenz gewöhnlich zwischen den Tagen 12 und 15 nach der Immunisierung gekennzeichnet und in allen Fällen er holten sich die Ratten bis zum Tag 16. Die erste Reihe von Experimenten untersuchte die Wirkung der Anzahl der Fütterungen und der Dosis von MBP auf die Ausprägung der Erkrankung. Den Ratten wurden verschiedene Mengen MBP entweder einmal 7 Tage vor (Tag –7) dem Tag der Immunisierung (Tag 0) oder 3 mal an den Tagen –14, –7 und 0 gefüttert. Die Ergebnisse (Tabelle I) zeigen, daß das Verfüttern von MBP an Ratten EAE supprimiert und daß die oral induzierte Suppression dosisabhängig ist.
Mehrfache Fütterungen von 500 μg führten zu einer vollständigen Suppression der Erkrankung und waren wirksamer als eine einzelne Fütterung dieser Dosis. Zusätzlich zur klinischen Manifestation von EAE wurde der histologische Nachweis der Erkrankung in den Ratten untersucht. 16 Tage nach der Immunisierung wurden die Ratten getötet und die Gehirne entfernt und in Formalinlösung fixiert. Die Fixierlösung war eine Lösung von 100 ml 70%igem Ethanol, 10 ml 37%igem Formalin und 5 ml Eisessig. Von jeder Ratte wurden Scheiben von in Paraffin eingebettetem Gewebe hergestellt und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Auf den kodierten Objektträgern wurden perivaskuläre entzündliche Foci mittels etablierter Verfahren (Sobel, R., et al., Immunol. 132: 2393 (1984)) quantifiziert. Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, verursachte das Füttern von 500 μg MBP an den Tagen –14, –7 und 0 an die Ratten eine merkliche Abnahme der Anzahl entzündlicher Läsionen im Gehirn. Eine mäßige Abnahme wurde in Tieren gefunden, denen 100 μg verfüttert worden war, und keine signifikante Reduktion der Entzündung wurde in Ratten gefunden, denen 25 μg MBP verfüttert worden war.
Beispiel 2
Eine zweite Reihe von Experimenten untersuchte die Wirkung des Fütterns von MBP vor oder im Anschluß an eine Immunisierung mit MBP, um zu bestimmen, ob die Wirksamkeit der oral induzierten Suppression durch die vorherige Antigen-Exposition beeinträchtigt wird. Für diese Experimente wurden den Tieren 500 μg MBP dreimal entweder vor oder nach der aktiven Induktion der Erkrankung gefüttert (Immunisierung mit MBP). Die Ergebnisse (Tabelle II) zeigen, daß die klinische Ausprägung der Erkran kung unabhängig davon supprimiert wird, ob den Tieren MBP vor oder nach der Sensibilisierung gefüttert wurde, wobei die Wirkung vollständiger ist, wenn das Antigen vor der Immunisierung gefüttert wird. Die histologische Untersuchung zeigte jedoch eine dramatische Abnahme perivaskulärer Infiltrate in Ratten, denen MBP entweder vor oder nach der Sensibilisierung gegen MBP verfüttert wurde. Mehr als 60% Suppression der Erkrankung trat auch auf, wenn die Ratten dreimal gefüttert wurden, beginnend an den Tagen +5 oder +7 nach der Immunisierung (Daten nicht gezeigt).
Zusätzlich wurden Experimente durchgeführt, in denen den Ratten 100 μg MBP zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach der Immunisierung mit MBP verfüttert wurden. Wie in Tabelle III gezeigt, zeigt sich eine Suppression der Erkrankung mit einzelnen Fütterungen vor und nach der Immunisierung.
Beispiel 3
Die Wirkungen der oralen Verabreichung von MBP auf zelluläre und humorale Immunantworten gegen MPB wurden ebenfalls untersucht. Proliferative Antworten gegen MBP wurden untersucht, nachdem den Ratten verschiedene Dosen MBP verfüttert wurden und nach dem Füttern zu verschiedenen Zeitpunkten im Hinblick auf die Immunisierung. 10 Tage nach der Immunisierung wurden die Ratten getötet und Einzelzellsuspensionen ableitender (poplitealer) Lymphknoten hergestellt. Die Zellen wurden in Mikrotiterplattenvertiefungen 4 Tage kultiviert, wobei die letzten 24 Stunden ³H-Thymidin zugefügt wurde. Ein Volumen von 0,2 ml, enthaltend 4 × 10⁵ Zellen in RPMI 1640, enthaltend 2% Glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin, 5 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol und 5% fötales Kälberserum wurde jeder Mikrotiterplattenvertiefung zugefügt und MBP mit 50 μg/ml wurde ebenfalls zugefügt. Die Vertiefungen wurden mit 1 μCi tritiiertem Thymidin pulsmarkiert, auf Fiberglasfilter unter Verwendung eines Vielfachernters geerntet und unter Verwendung von üblichen Flüssigkeitsszintillationsverfahren gezählt.
Die Ergebnisse (Tabelle I und II) zeigen, daß das Füttern von MBP eine verstärkte (75 bis 92%) Abnahme der proliferativen Antworten gegen MBP verursacht. Die Suppression der Proliferation trat im Gegensatz zur Suppression der Erkrankung bei allen Dosen und Fütterungsschemen, die untersucht worden waren, auf, einschließlich der Fütterung nach der Immunisierung. Die oral induzierte Suppression der proliferativen Antwort gegen MBP ist Antigen-spezifisch, wie in 1 gezeigt. Insbesondere supprimiert das Füttern von MBP nicht die proliferative Antwort gegen gereinigtes Proteinderivat (PPD), ein Antigen, das von M. tuberculosis abgeleitet ist, das eine proliferative Antwort als Konsequenz einer Immunisierung mit CFA induziert. Das Füttern eines irrelevanten Antigenes, BSA, beeinträchtigt die proliferative Antwort auf PPD nicht und supprimiert die proliferative Antwort auf MBP nur leicht.
Beispiel 4
Die Wirkung des Fütterns von MBP auf die Erzeugung von Antikörpern gegen MBP wurde ebenfalls untersucht. Ratten, denen MBP gefüttert worden war, wurden immunisiert und das Blut durch Kardialpunktion 16 Tage nach der Immunisierung entfernt. Die Spiegel der anti-MBP-Antikörper in dem Serum wurden mittels ELISA gemessen. Ein Volumen von 0,1 ml der MBP-Lösung (0,05 mg/ml in PBS) wurde pro Mikrotiterplattenvertiefung zugefügt und 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit PBS, enthaltend 0,05% Tween (PBST), gewaschen und über Nacht bei 4°C mit 5% BSA in PBS, pH 9,0, blockiert. Nach dem Waschen der Vertiefungen mit PBST wurden verdünnte Rattenseren zugefügt und 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, und nach dem Waschen mit PBST wurde ein sekundärer Antikörper (Peroxidasekonjugierter Ziegen-anti-Ratten-Antikörper) eine Stunde bei Raumtemperatur zugefügt. Das Substrat wurde zugefügt und die Reaktion mit 0,1 M NaF beendet. Die Platten wurden bei 450 nm auf einem Titertech-Multiscan-Gerät abgelesen. Die Absorption bei 450 nm wurde auch für Serum aus Ratten bestimmt, die nur mit CFA immunisiert worden waren, und wurde von allen Werten als Hintergrund abgezogen.
Eine Inhibition der Antikörpererzeugung wurde festgestellt, wenn den Ratten die höchste untersuchte Dosis (500 μg) an den Tagen –14, –7 und 0 gefüttert wurde (66% Inhibition, Tabelle I), wobei ein niedriger Inhibitionsgrad in Ratten gefunden wurde, denen 500 μg MBP an den Tagen –7, –5 und –2 verfüttert wurde (Tabelle II). Die Inhibition der proliferativen Antwort auf MBP trat bei allen untersuchten Dosen auf (gezeigt in Tabelle I). Die Tage, an denen Ratten identische Dosen MBP gefüttert werden, beeinflussen die Antikörpererzeugung. TABELLE I Wirkung der Fütterungsdosis auf oral induzierte Suppression von EAE in Lewis-Ratten

(a) Den Ratten wurden verschiedene Dosen MBP an den angegebenen Tagen gefüttert und sie wurden mit 50 μg MBP in CFA (200 μg M. tuberculosis) am Tag 0 immunisiert. Gezeigt ist die An zahl erkrankter Ratten von der gesamten Anzahl immunisierter Ratten. Den immunisierten Kontrollen wurde BSA oder Kochsalzlösung alleine verfüttert.
(b) Die Ratten wurden am Tag 16 nach der Immunisierung getötet und die Gehirne entfernt und fixiert. Gezeigt ist die durchschnittliche Anzahl perivaskulärer entzündlicher Foci pro Tier ± Standardabweichung. nb = nicht bestimmt.
(c) Die proliferative Antwort auf MBP wurde an ableitenden Lymphknotenzellen 10 Tage nach Immunisierung der Ratten gemessen. Ein Volumen von 0,2 ml, enthaltend 4 × 10⁵ Zellen in RPMI 1640, enthaltend 2% Glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin, 5 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol und 5% fötales Kälberserum, wurde jeder Mikrotiterplattenvertiefung zugefügt und 50 μg/ml MBP zugesetzt. Die Vertiefungen wurden mit 1 μCi tritiiertem Thymidin pulsmarkiert, auf Fiberglasfilter unter Verwendung eines Multiharvesters geerntet und unter Verwendung üblicher Flüssigkeitsszintillationsverfahren gezählt. Gezeigt ist der Prozentsatz Inhibition der proliferativen Antwort auf MBP im Hinblick auf die immunisierte Kontrollgruppe. Ein durchschnittlicher Stimulationsindex der immunisierten Kontrollen (MBP-stimulierte CPM/Hintergrund-CPM) betrug 6,0 (29888 CPM/4960 CPM).
(d) Die Ratten wurden am Tag 16 getötet und das Blut durch Kardialpunktion entfernt. Die Seren wurden 1/15625 in PBS verdünnt und anti-MBP-Antikörperspiegel wurden mittels ELISA bestimmt. Ein Volumen von 0,1 ml MBP-Lösung (0,05 mg/ml in PBS) wurde pro Mikrotiterplattenvertiefung zugesetzt und 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Vertiefung wurde mit PBS, enthaltend 0,05% Tween (PBST) gewaschen und über Nacht bei 4°C mit 5% BSA in PBS, pH 9,0, blockiert. Nach dem Waschen der Vertiefungen mit PBST wurde verdünntes Rattenserum zugefügt und 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und nach dem Waschen mit PBST wurde sekundärer Antikörper (Peroxidase-konjugierter Ziegen-anti-Ratten-Antikörper) eine Stunde bei Raumtemperatur zugefügt. Das Substrat wurde zugefügt und die Reaktion mit 0,1 M NaF beendet. Die Platten wurden bei 450 nm auf einem Titertek-Multiscan-Lesegerät abgelesen. Die Absorption bei 450 nm wurde auch für das Serum von Ratten bestimmt, die nur mit CFA immunisiert worden waren, und wurde von allen Werten als Hintergrund abgezogen. Gezeigt ist der Prozentsatz Abnahme der Antikörperspiegel, wie gemessen durch Absorption von Peroxidasesubstrat bei 450 nm, mit Hinblick auf immunisierte Kontrollen (die mittlere Absorption bei 450 nm der immunisierten Kontrollen mit Hintergrundabzug betrug 0,148).
(e) Die Gruppen wurden mittels der Chi-Quadrat-Analyse mit einem Freiheitsgrad verglichen: * p < 0,05, ** p < 0,1, *** p < 0,001.

TABELLE II Wirkung des Verfütterns von MBP an Ratten vor oder nach Immunisierung auf die Entwicklung von EAE

(a) Den Ratten wurden 500 μg MBP an den angegebenen Tagen gefüttert und sie wurden mit 50 μg MBP in CFA am Tag 0 immunisiert. Immunisierten Kontrollen wurde BSA oder Kochsalzlösung gefüttert.
(b) Siehe Tabelle I.
(c) Siehe Tabelle I. Der durchschnittliche Stimulationsindex immunisierter Kontrollen betrug 9,4 (82247 CPM/8718 CPM).
(d) Siehe Tabelle I. Die mittlere Absorption bei A₄₅₀ der immunisierten Kontrollen nach Abzug des Hintergrundes betrug 0,403.
(e) Siehe Tabelle I. TABELLE III Oral induzierte Suppression von EAE in Lewis-Ratten

Fütterungsschema # kranke Ratten/Gesamtanzahl Ratten

nichts 11/16

–14, –7, 0, +7 0/13

–14 1/5

–7 0/5

0 1/5

+7 1/5

Den Ratten wurden 100 μg MBP an den angegebenen Tagen gefüttert (mit Hinblick auf den Tag der Immunisierung = 0), und sie wurden mit 50 μg MBP mit CFA (0,5 mg/ml M. tuberculosis) immunisiert.
Beispiel 5
Weitere Experimente wurden durchgeführt, um die Persistenz oral induzierten Schutzes gegen EAE zu bestimmen. Nach dem Füttern von 500 μg MBP an den Tagen –7, –5 und –2 wurden die Ratten zu verschiedenen Zeitpunkten nach der letzten Fütterung immunisiert. EAE wurde in Ratten bis zu 4 Wochen nach dem Füttern vollständig supprimiert, und nach 8 Wochen waren 50% der Ratten, denen MBP verfüttert worden war, wieder für die Krankheit empfänglich. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV gezeigt, die angibt, daß die Toleranz gegen die Erkrankung mindestens 4 Wochen nach der letzten Fütterung aufrechterhalten wird, wobei die Empfänglichkeit für die Induktion der Erkrankung 8 Wochen nach dem Füttern offensichtlich wird. TABELLE IV Persistenz einer oral induzierten Toleranz von Lewis-Ratten

# kranker Ratten/Gesamtanzahl Ratten

Kontrolle

gefüttert 9/14

immunisiert am Tag 0 0/4

Tag +7 0/4

Tag +14 0/4

Tag +28 0/3

Tag +56 4/8
Den Ratten wurden 500 μg MBP an den Tagen –7, –5 und –2 gefüttert und sie wurden an den angegebenen Tagen mit 50 μg MBP in CFA immunisiert. Die Kontrollratten (denen BSA gefüttert worden war) wurden auf gleiche Weise immunisiert.
Beispiel 6

Es ist bekannt, daß der encephalitogene Bereich von Meerschweinchen-MBP in Ratten eine spezifische Dekapeptidsequenz ist, die bei den Resten 75 bis 84 angeordnet ist und selbst EAE induzieren kann, während andere Bereiche des Moleküles nicht encephalitogen sind (Hashim, G., Myelin: Chemistry and Biology, Alan R. Liss, N.Y. (1980)). Weiter ist von anderen Antigenen berichtet worden, daß bestimmte Suppressordeterminanten an Stellen existieren, die von immunogenen Determinanten unterschiedlich sind (Yowell, R., et al., Nature 279: 70 (1979)). Es wurde daher untersucht, ob sowohl encephalitogene als auch nicht encephalitogene Fragmente von MBP EAE bei oraler Verabreichung verhindern könnten. Durch limitierten Pepsinabbau wurden Fragmente von Meerschweinchen-MBP erzeugt und durch Säulenchromatographie getrennt (Whitaker, J., et al., J. Biol. Chem. 250: 9106 (1975)). Die drei verschiedenen Fragmente wurden an Ratten verfüttert, dann wurden die Tiere mit gesamten MBP immunisiert. Es wurde festgestellt, daß sowohl das krankheitsinduzierende Peptid (Fragment 44 bis 89) als auch die nicht encephalitogenen Peptide (Fragmente 1 bis 37 und 90 bis 170) EAE supprimierten, wenn sie an Ratten verfüttert werden, wobei die nicht encephalitogenen Fragmente bei der Suppression der Erkrankung wirksamer waren als das encephalitogene Fragment (Tabelle V). Ein Decapeptid (S79) wurde synthetisiert, das von der encephalitogenen Sequenz (den Resten 75 bis 84) durch eine einzelne Aminosäuresubstitution abweicht und von dem berichtet worden ist, daß es eine Suppression induziert, wenn es mit CFA in Ratten injiziert wird (Kardys, E., et al., J. Immunol. 127: 862 (1981)). Wenn S79 (Ala-Gln-Gly-His-Arg-Pro-Gln-Asp-Glu-Gly) an Tiere verfüttert wurde, wurde außerdem festgestellt, daß es EAE supprimierte (Tabelle V). Rinder-MBP, das sich von Meerschweinchen-MBP an verschiedenen Stellen einschließlich der encephalitogenen Sequenz unterscheidet und in Ratten in Dosen, die für Meerschweinchen-MBP encephalitogen sind, nicht encephalitogen ist (Holoshitz, J., et al., J. Immunol. 131: 2810 (1983)), supprimierte die Erkrankung ebenfalls, wenn es den Tieren vor der Immunisierung verfüttert wurde. TABELLE V Die Wirkung der Fütterung encephalitogener und nicht encephalitogener Fragmente auf die Entwicklung von EAE in Lewis-Ratten

	Klinische Inzidenz von EAE
Immunisierte Kontrollen	19/25
MBP-Fragment 1-37 (109 μg)	0/9a***
MBP-Fragment 44-89 (135 μg)	3/11**
MBP-Fragment 90-170 (235 μg)	0/4**
Peptid S79 (30 μg)	1/8***
Rinder-MBP (500 μg)	0/10***

Den Lewis-Ratten wurden die angegebenen Mengen der MBP-Fragmente oder -Peptide (äquimolar mit 500 μg Gesamt-Meerschweinchen-MBP) an den Tagen –7, –5 und –2 gefüttert und sie wurden am Tag 0 mit 50 μg Meerschweinchen-MBP mit CFA immunisiert. Gezeigt sind die Anzahlen erkrankter Ratten aus der immunisierten Gesamtanzahl. (a) Die Gruppen wurden mit den immunisierten Kontrollen mittels der Chi-Quadrat-Analyse verglichen:
** p < 0,01, *** p < 0,001.
Beispiel 7
Suppression von Adjuvanz-induzierter Arthritis durch Füttern von Mycobakterien
In weiblichen Lewis-Ratten wurde durch Immunisierung mit 0,1 ml von 10 mg/ml vollständigem Freund'schem Adjuvanz in die Schwanzbasis Adjuvanzarthritis induziert. Den Tieren wurden 2,0 mg Mycobacterium tuberculosis in phosphatgepufferter Kochsalzlösung an den Tagen –7, –5 und –2 vor der Immunisierung am Tag 0 verfüttert und anschließend an eine Immunisierung an den Tagen +7 und +14. Die Arthritis wurde durch Messen der Gelenkschwellung 3 Wochen nach der Immunisierung quantifiziert (Tabelle VI und 2).
TABELLE VI
Beispiel 8
Modell für adoptive Übertragung von EAE in der SJL-Maus
In der SJL-Maus wurde ein durchführbares, reproduzierbares Modell für rezidivierende EAE etabliert. Das Protokoll für dieses Modell wurde von Mokhtarian et al., Nature 309: 356 (1984), übernommen. Dieses Protokoll ist graphisch in 3 dargestellt. Kurz gesagt werden Donor-Tiere mit einer Emulsion, die 400 μg MBP und 30 μg M. tuberculosis in CFA enthält, immunisiert. 10 Tage danach werden die ableitenden Lymphknoten entfernt und mit 50 μg/ml MBP 4 Tage lang kultiviert, gründlich gewaschen und 4–6 × 10⁷ lebensfähige Zellen werden weiblichen Rezipiententieren intravenös injiziert. Die Tiere werden unter Verwendung üblicher Maßstäbe auf klinische EAE überwacht und pathologisch unter Verwendung der üblichen histologischen H&E-Analysen untersucht (Brown, A., et al., Lab Invest. 45: 278 (1981), Lublin, F., et al., J. Immunol. 126: 819 (1981) und Bernard, C., et al., Eur. J. Immunol. 16: 655 (1976)). Die Tiere werden mindestens 100 Tage nach der Übertragung beobachtet, so daß die Anzahl der Rezidive bestimmt werden kann.
Beispiel 9
Oral induzierte Suppression proliferativer Antworten in SJL-Mäusen
Das Füttern von 400 μg MBP an jedem zweiten Tag 2 Wochen lang (insgesamt 7 getrennte Fütterungen) vor der Immunisierung mit 400 μg MBP in CFA (0,6 mg/ml M. tuberculosis) supprimiert die Proliferation von Lymphknotenzellen als Antwort auf Immunisierung mit MBP. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt. Diese Figur zeigt die Kontrollergebnisse gegen die Fütterungsergebnisse als eine Funktion der MBP-induzierten Proliferation, geteilt durch den Hintergrund (Stimulationsindex).
Die Erfindung ist nicht auf solche Arten und Ausführungsformen dieser Anmeldung und Ausführungsformen, die oben beschrieben sind, beschränkt. Sie umfaßt alle Modifikationen, die zur Suppression von Autoimmunerkrankungen führen, wie das von der vorliegenden Erfindung gelehrt wird. Diese Äquivalente sind vom Schutzbereich, der durch die Ansprüche definiert wird, umfaßt.
Beispiel 10
Adoptive Übertragung protektiver Resistenz gegen EAE-Entwicklung von MBP-gefütterten Donor-Ratten an naive syngenische Rezipienten-Ratten
Die Donor-Ratten wurden mit entweder MBP oder BSA (1 mg) 5 × in Abständen von 3 bis 4 Tagen gefüttert und 4 Tage nach der letzten Fütterung getötet. Mesenteriale Lymphknotenzellen (LNC) und Milzzellen wurden geerntet und entweder sofort intraperitoneal oder nach 48 Stunden Aktivierung mit 1,5 μg/ml Concanavalin-A (Con-A) im Proliferationsmedium injiziert. Die Anzahl der für die adoptiven Übertragungsexperimente injizierten Zellen war wie folgt: 120 × 10⁶ für die gesamte LNC-Population, aktiviert oder nicht; 60 × 10⁶ für CD3-abgereicherte LNC, 80 × 10⁶ für CD4-abgereicherte Population, und 95 × 10⁶ für CD8-abgereicherte LNC. Die Lewis-Rezipienten-Ratten wurden mit MBP/CFA 4 Stunden später zur Induktion von EAE immunisiert. Die Fähigkeit zur Übertragung von Resistenz gegen die Entwicklung von EAE aus gefütterten Donor-Ratten an naive syngenische Rezipienten-Ratten ist in Tabelle VII gezeigt. Aus nicht gefütterten Ratten oder aus Ratten, denen Rinderserumalbumin (BSA) gefüttert worden war, erhaltene LNC übertrugen keinen Schutz gegen EAE. Jedoch konnten sowohl die Milzzellen als auch mesenteriale (MES) Lymphknotenzellen, die aus mit MBP gefütterten Donoren erhalten worden waren, einen relativen Schutz gegen EAE, das in den Rezipienten induziert wurde, übertragen, wobei sie 50 bzw. 57% Suppression der Erkrankung zeigten. Die mittlere maximale Schwere der Erkrankung war in den Rezipienten von Milzzellen oder mesenterialen Lymphknotenzellen, die aus mit MBP gefütterten Donor-Ratten erhalten worden waren, ebenfalls merklich reduziert. Diese Ergebnisse zeigen, daß die orale Toleranz gegen eine EAE-Induktion, zellulären Ursprungs ist und daß die für den Schutz verantwortlichen Zellen sowohl in mesenterialen Lymphknoten als auch in der Milz konzentriert vorliegen. TABELLE VII Adoptive Übertragung von Schutz gegen EAE unter Verwendung von LNC, die entweder aus gefütterten oder unbehandelten Donor-Ratten erhalten worden sind
Den Lewis-Ratten wurde 5 × 1 mg MBP oder BSA pro Fütterung in Abständen von 3 Tagen gefüttert oder sie blieben unbehandelt. Die Ratten wurden dann getötet und ihre Milzen und mesenterialen Lymphknoten wurden entfernt. Die LNC wurden geerntet und 48 Stunden in Gegenwart von Con-A aktiviert. Die Lymphoblasten wurden gesammelt, 3 × gewaschen und intraperitoneal in naive syngenische Ratten injiziert. Die Rezipienten-Ratten wurden 4 Stunden später mit MBP/CFA zur Induktion von EAE behandelt. Die Erkrankung wurde täglich von Tag 10 an beurteilt
(* Die Ergebnisse sind statistisch signifikant, p < 0,05).
Beispiel 11
Identifizierung der Lymphknotenzellsubpopulation, die Resistenz gegen EAE vermittelt
Con-A-aktivierte Milzzellen (SPC), die aus MBP-gefütterten Donor-Ratten erhalten worden waren, wurden naiven syngenischen Ratten entweder vor oder nach der Abreicherung von entweder T-Zellen, T-Helferlymphozyten (CD4) oder Suppressor-/cytotoxischen T-Lymphozyten (CD8) übertragen. Für die Abreicherung von CD3-, CD4- und CD8-Populationen aus den Milzzellen wurde eine negative Selektion verwendet. Petrischalen wurden über Nacht bei 4°C mit 10 ml 1/1000 Ziegen-anti-Maus-IgG und -IgM-Antikörpern (Tago) in PBS/BSA beschichtet. Die Platten wurden dann gewaschen und mit 3% fötalem Rinderserum in PBS 30 Minuten bei 20°C beschichtet und wiederum gewaschen. Lewis-LNC wurden mit monoklonalen Maus-anti-Ratten-Antikörpern (Serotec/Bioproducts) gegen CD3 (MRC, OX/38), CD4 (W3/25) oder CD8 (OX/8), 1/100 in PBS verdünnt, angefärbt. Die Zellen wurden 30 Minuten auf Eis gefärbt, gewaschen und in vorbeschichteten Petrischalen bei 4°C ausgesät, 15 Millionen Zellen/5 ml PBS/Platte. Der nicht anheftende Zellen enthaltende Überstand wurde 60 Minuten später vorsichtig abgezogen und zweimal zentrifugiert, bevor die Zellen untersucht und gezählt wurden. Dieses Protokoll führt zu Zellpopulationen von ungefähr 85 bis 95% Reinheit, wie im Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer durch Untersuchung der Membranfluoreszenz untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, daß SPC Schutz gegen EAE übertragen können (50% Inzidenz), während T-Zell-abgereicherte SPC ihre Fähigkeit zum Schutz von Rezipienten-Ratten verloren (Gruppe 2). Es scheint daher, daß die Milzzellen, die Schutz übertragen können, T-Lymphozyten sind. Die Abreicherung von CD8-Zellen (Gruppe 4) führt jedoch zu einem Versagen der Übertragung von Schutz, während CD4+ -abgereicherte SPC eine signifikante Fähigkeit zum Schutz der Ratten vor EAE zeigten. Das ist daher ein Beweis, daß die Antigen-spezifischen T-Lymphozyten, die nach der oralen Verabreichung von MBP erzeugt werden und Resistenz gegen die Induktion der Erkrankung vermitteln, aus der Untergruppe der Suppressor-/cytotoxischen Zellen stammen.
TABELLE VIII Adoptive Übertragung von Schutz gegen EAE unter Verwendung abgereicherter SPC-Populationen
Den Donor-Ratten wurde MBP gefüttert und sie wurden behandelt, wie in der Legende von Tabelle I angegeben. Die Con-A aktivierten SPC wurden in naive Rezipienten-Ratten entweder vor (Gruppe 1) oder nach Abreicherung bestimmter Subpopulationen (Gruppen 2-4) injiziert. Die Abreicherung von CD3-, CD4- oder CD8-Lymphozyten wurde durch Kopplung monoklonaler IgG-Antikörper an die SPC und Schwenken durchgeführt. Die Rezipienten-Ratten wurden mit MBP/CFA immunisiert und EAE wurde von Tag 10 an aufgezeichnet.
(* Die Ergebnisse sind statistisch signifikant, p < 0,05).
Beispiel 12
In-vitro-Suppression der anti-MBP-T-Zell-Antworten durch Zufügen von Lymphknotenzellen aus MBP-gefütterten Ratten
Ratten wurden mit MBP/CFA immunisiert und ihre sensibilisierten poplitealen ableitenden Lymphknoten (PLNC) 9 Tage später geerntet. Eine Suspension einzelner Zellen wurde hergestellt, indem die Lymphknoten durch ein rostfreies Stahlsieb gedrückt wurden. Insgesamt 10⁵ LNC wurden mit der angegebenen Anzahl entweder bestrahlter (2000 Rad) oder intakter LNC, die aus gefütterten Ratten stammten, in Vierfachansätzen in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit rundem Boden kultiviert (Costar). Der Kultur wurden in einem Volumen von 20 μl MBP und Mycobacterium tuberculosis, 50 g/ml, zugefügt. Die Kulturen wurden 80 Stunden inkubiert und wurden mit 1 μCi [³H] TdR/Vertiefung mindestens 16 Kulturstunden lang pulsmarkiert. Die Kulturen wurden auf einem automatischen Zellerntegerät geerntet und auf einem üblichen Flüssigkeitsszintillationszähler abgelesen.
Der Prozentsatz Suppression der Proliferation sensibilisierter LNC (PLNC) wurde mit der folgenden Formel berechnet:
Die PLNC wurden mit bestrahlten SPC oder mesenterialen LNC, die entweder aus naiven oder MBP-gefütterten Ratten erhalten worden waren, in Gegenwart entweder von MBP oder Mycobacterium tuberculosis kultiviert. Die aus MBP-gefütterten Donor-Ratten erhaltenen LNC wurden an verschiedenen Tagen nach dem letzten Füttern untersucht. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt. Es ist gezeigt, daß innerhalb des Zeitrahmens des Experimentes aus gefütterten Ratten erhaltene LNC die PLNC-Antworten auf Mycobacterium tuberculosis nicht beeinträchtigten. Jedoch waren sowohl SPC als auch mesenteriale LNC, die aus gefütterten Ratten erhalten worden waren, in der Lage, die PLNC-Proliferation auf MBP zu supprimieren. Die Antigen-spezifische Suppression der PLNC-Antworten war bei Verwendung von SPC größer als bei Verwendung von mesenterialen LNC. Die Suppression ist vom Tag 5 bis zum Tag 36 nach der letzten Fütterung mit MBP offensichtlich, was darauf hinweist, daß die Induktion der Suppression bald nach dem Füttern erzielt wird und für einen relativ langen Zeitraum aufrechterhalten wird.
Es scheint daher, daß LNC, die aus Ratten erhalten sind, die gegen eine EAE-Induktion tolerant sind, Antigen-spezifische Lymphozyten sind, die die zellulären Immunantworten nur gegen das zum Füttern verwendete Antigen supprimieren können.
Beispiel 13
Suppression von anti-MBP-Antworten von PLNC in Gegenwart bestrahlter SPC und deren Subpopulationen, erhalten aus MBP-gefütterten Ratten
Um die für die Suppression verantwortliche Subpopulation der SPC zu untersuchen, wurden aus MBP-gefütterten Ratten 20 Tage nach dem letzten Füttern SPC erhalten, in denen bestimmte Lymphozytenpopulationen abgereichert waren, bestrahlt und mit PLNC gemischt, die aus MBP/CFA immunisierten Ratten erhalten worden waren, zusammen mit MBP. Popliteal- und Milz-LNC wurden in einer Konzentration von 10⁷ Zellen pro ml Petrischale entweder allein oder bestrahlt (2000 Rad) zusammen mit anderen PLNC, wie angegeben, ausgesät. Die Kulturen wurden 3 Tage in einem Inkubator in Proliferationsmedium mit oder ohne Antigen (20 μg/nl) aufbewahrt und dann geerntet. Die verdünnten Überstände wurden verwendet, um die In-vitro-Produktion und -Sekretion von IgG-Antikörper zu untersuchen und die Antikörperproduktion wurde unter Verwendung eines ELISA-Tests gemessen. Mikrotiterplatten wurden mit 0,1 ml von 10 μg Antigen/ml in doppelt destilliertem Wasser pro Vertiefung inkubiert. Die Platten wurden 18 Stunden bei 25°C inkubiert. Nach 3 Waschschritten mit PBS/Tween 20 (Biorad), pH 7,5, wurden die Platten mit 3% BSA/PBS 2 Stunden bei 37°C inkubiert, zweimal gewaschen, und 100 μl verdünntes Serum wurde in Vierfachansätzen zugefügt. Die Platten wurden 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach 3 Waschschritten mit PBS/Tween 20 wurden die Platten mit 100 μl/Vertiefung Peroxidase-konjugiertem Ziegen-anti-Ratten-IgG-Antikörper (Tago, USA), 1:1000 in 1% BSA/PBS verdünnt, eine Stunde bei 25°C inkubiert. Die Farbreaktion wurde durch Reaktion mit D-Phenylendiamin (0,4 mg/ml Phosphatcitratpuffer, pH 5,0), enthaltend 30% H₂O₂ erhalten. Die Reaktion wurde durch Zufügen von 0,4 N H₂SO₄ beendet und die OD 492 nm auf einem ELISA-Lesegerät abgelesen. Die in Tabelle IX gezeigten Ergebnisse stellen den Prozentsatz Suppression der Antigen-Proliferation von PLNC in Gegenwart von SPC dar, die aus MBP-gefütterten Ratten erhalten sind, im Vergleich zu deren Antworten auf MBP in Gegenwart von SPC, erhalten aus intakten Ratten. Es wird gezeigt, daß aus MBP-gefütterten Ratten (Gruppe 1) erhaltene SPC die Antworten von PLNC gegen MBP supprimieren (70%). Die Abreicherung von T-Zellen (Gruppe 2) oder Suppressor-/cytotoxischen T-Lymphozyten (Gruppe 3) setzt die Suppression außer Kraft. Die Abreicherung von Helfer-T-Lymphozyten (CD4, Gruppe 4) steigert jedoch die Inhibition der anti-MBP-proliferativen Antwort der PLNC. Das Verdünnen der CD4-abgereicherten SPC führt zu einer Abnahme der Suppression von 96% (im Verhältnis 1:1) auf 18% (im Verhältnis 1:100 von SPC:PLNC).
Diese Ergebnisse legen nahe, daß die Zellen, die sowohl für die Inhibition der Erkrankung als auch für die Antigen-spezifischen zellulären Antworten in vitro verantwortlich sind, einen T-Zell-Ursprung haben und daß es sich dabei um Suppressor-/cytotoxische T-Lymphozyten handelt.
TABELLE IX Suppression von anti-MBP-Antworten von PLNC in Gegenwart von bestrahlten SPC und deren Subpopulationen, erhalten aus MBP-gefütterten Ratten
Die Milzen wurden aus MBP-gefütterten Lewis-Ratten entfernt, dann wurden die Zellen geerntet, bestrahlt und zusammen mit Responder-PLNC ausgesät, die aus MBP/CFA-immunisierten syngenischen Ratten entfernt worden waren. Die SPC wurden als unbehandelte Zellen verwendet oder CD3-, CD4- oder CD8-T-Lymphozytenabgereichert unter Verwendung des entsprechenden monoklonalen Antikörpers zum Koppeln und Schwenken. Die Ergebnisse werden als Prozent Suppression der PLNC-Antworten auf MBP ausgedrückt und stehen im Verhältnis zu den PLNC-Antworten in Gegenwart von bestrahlten SPC, die aus nicht gefütterten Ratten entfernt worden sind.
Beispiel 14
Humorale Suppression der anti-MBP-IgG-Produktion, induziert durch orale Toleranz gegen MBP
Lewis-Ratten wurden entweder mit MBP gefüttert oder unbehandelt gelassen und dann mit MBP, gemischt mit Ovalbumin (OVA), emulgiert in CFA, behandelt. Den Ratten wurde dann in verschiedenen Abständen Blut entnommen und die Seren wurden auf anti-OVA- oder anti-MBP-Antikörper untersucht. Wie in 6a gezeigt, waren die IgG-Serumspiegel gegen OVA in MBP-gefütterten Ratten nicht beeinträchtigt, während die IgG-Serumspiegel gegen MBP in MBP-gefütterten Ratten erniedrigt waren (6b).
Beispiel 15
Bestimmung des für die Suppression der IgG-Produktion in vitro verantwortlichen Zelltypes
Lewis-Ratten wurden mit MBP gefüttert oder blieben ungefüttert und wurden dann mit MBP + OVA/CFA immunisiert. 12 Tage später wurden die PLN entfernt und die PLNC wurden 3 Tage in Gegenwart entweder von MBP oder OVA kultiviert, die Überstände wurden gesammelt, 1:20 verdünnt und auf ihren IgG-Gehalt untersucht. Wie in Tabelle X gezeigt, reagierten PLNC, die aus gefütterten Ratten erhalten worden waren (Gruppe 2) und in vitro mit MBP kultiviert worden waren, als IgG-Produktion ausgedrückt weniger auf MBP im Vergleich zu PLNC, die aus ungefütterten Ratten erhalten worden waren (Gruppe 1, 45% Suppression). Die Erzeugung der anti-OVA-IgG-Produktion in PLNC aus den gleichen Ratten war nicht beeinträchtigt (Gruppe 4 vs. 5). Darüber hinaus erniedrigte das Mischen bestrahlter PLNC, erhalten aus MBP-gefütterten und immunisierten Ratten, mit PLNC aus immunisierten Ratten, die mit MBP kultiviert worden waren, die Antikörperproduktion der letztgenannten (Gruppe 3, 35% Suppression), während die Antikörpertiter gegen OVA nicht beeinträchtigt waren (Gruppe 6). Zusätzlich beseitigte die Entfernung von CD8+ -Zellen die Suppression von anti-MBP-Antikörpern, was zeigt, daß wie bei der adoptiven Übertragung und bei proliferativen Antworten, CD8-Zellen für die Suppression verantwortlich waren.
TABELLE X
Die Ratten wurden mit MBP + OVA und CFA immunisiert (ungefähr 3 Tage nach dem fünften Füttern von MBP). 12 Tage später wurden ihre PLNC entfernt und zusammen mit MBP (Gruppen 1–4) oder mit OVA (Gruppen 5–7) 3 Tage kultiviert. In einigen Gruppen wurden bestrahlte PLNC, die aus MBP-gefütterten und immunisierten Ratten erhalten worden waren, bestrahlt und zusammen mit immunisierten PLNC in Gegenwart von MBP (Gruppe 3) oder in Gegenwart von OVA (Gruppe 7) kultiviert. Die Überstände dieser Stimulationen wurden gesammelt, verdünnt und die IgG-Spiegel mit ELISA bestimmt.
Beispiel 15
Identifizierung des MBP-Bereiches, der EAE aktiv supprimiert, unter Verwendung überlappender synthetischer Polypeptide von MBP
sUnter Verwendung des Festphasenpeptidverfahrens wurden überlappende Fragmente aus dem Aminosäurefragment 1 bis 37 des basischen Myelinproteins aus Meerschweinchen synthetisiert. Houghten R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131–5135 (1985). Diese Fragmente wurden dann oral in äquimolaren Konzentrationen zu 15 mg gesamten basischen Myelinproteins verabreicht. Sie wurden an den Tagen –7, –5 und –2 vor der Immunisierung verabreicht. Die Tiere wurden dann mit basischem Protein und Freund'schem Adjuvanz nach etablierten Verfahren behandelt und beobachtet.
Die Tiere wurden auf Mortalität, Gegenwart der Krankheit und Krankheitsschwere beobachtet. Wie in Tabelle XI gezeigt ist, wurden 6/6 Kontrolltiere mit einer Mortalität von 3/6 krank. In Tieren, die überlappende Peptidfragmente erhielten, war die Mortalität unter Verwendung aller Fragmente mit Ausnahme des Fragmentes 1–10 erniedrigt. Im Hinblick auf die Krankheitsschwere zeigte der Bereich des Moleküles zwischen den Aminosäuren 5 und 20 die am stärksten ausgeprägte Abschwächung der Erkrankung. Diese Ergebnisse zeigten, daß im Aminosäurebereich 1–37, der selbst ein suppressogenes Fragment ist, bestimmte Bereiche des Moleküles mehr oder weniger suppressiv sein können, wenn sie oral verabreicht werden.
TABELLE XI
Überlappende Fragmente des Bereiches 1–37 des basischen Myelinproteins aus Meerschweinchen wurden unter Verwendung der Festphasenpeptidverfahren synthetisiert. Diese Fragmente wurden dann oral in Konzentrationen verabreicht, die 15 mg des gesamten basischen Myelinproteines äquimolar sind. Sie wurden an den Tagen –7, –5 und –2 vor der Immunisierung verabreicht. Die Tiere wurden dann mit basischem Protein und mit Freund'schem Adjuvanz gemäß etablierten Verfahren behandelt und beobachtet.
Beispiel 16
Demonstration, daß der orale Verabreichungsweg eines Protein-Antigenes bestimmt, gegen welches Fragment es eine Immunantwort gibt
Basisches Myelingesamtprotein wurde Tieren gegeben, entweder durch Immunisierung in die Pfoten mit Freund'schem Adjuvanz oder oral verabreicht. 7 bis 10 Tage später wurden Milz- und Lymphknotenzellen entfernt und in vitro mit verschiedenen Fragmenten des basischen Proteinmoleküles restimuliert.
Wie in Tabelle XII gezeigt, ist die primäre Antwort, gemessen durch Proliferation, gegen den encephalitogenen Bereich 44–89 gerichtet, wenn basisches Myelinprotein peripher in Freund'schem Adjuvanz verabreicht wird. Wie in Tabelle XIII gezeigt, ist die primäre Antwort jedoch gegen das Fragment 1–37, der nicht encephalitogenen Suppressordeterminante, gerichtet, wenn es oral verabreicht wird.
TABELLE XII
Proliferation auf MBP-Fragmente in Lewis-Ratten, die mit Gesamt-MBP immunisiert worden sind.
Die Tiere wurden an den hinteren Pfoten mit 50 μg MBP in CFA immunisiert. 10 Tage später wurden die Lymphknoten entfernt und in vitro mit 10 μg MBP oder äquimolaren Mengen von MBP-Fragmenten stimuliert.
TABELLE XIII
Proliferation auf MBP-Fragmente in Lewis-Ratten, denen gesamtes MBP oral gefüttert worden war.
Den Tieren wurde 1 mg gesamtes MBP × 3 gefüttert, dann wurden die Zellen aus verschiedenen Organen 15 Tage nach dem Füttern entfernt und die Proliferation gemessen. Die Ergebnisse sind als Veränderung der CPM × 10^–3 im Vergleich zu allein kultivierten Zellen ausgedrückt.

Claims

Verwendung eines für eine Autoimmunerkrankung eines Menschen spezifischen Autoantigens bei der Herstellung eines Medikamentes für eine orale oder enterale Verabreichung zum Hervorbringen von Suppressor-T-Zellen, welche das Autoantigen erkennen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament für eine orale Verabreichung bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament für eine enterale Verabreichung bestimmt ist.
Verwendung nach den Ansprüchen 1–3, wobei die Autoimmunerkrankung ausgewählt ist aus Multipler Sklerose, Myasthenia gravis, rheumatoider Arthritis, Diabetes mellitus, systemischem Lupus erythematosus, Autoimmunthyroiditis, hämolytischer Autoimmunanämie und Kontaktempfindlichkeitserkrankungen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–4, wobei das Medikament vor dem Ausbruch der Autoimmunerkrankung verabreicht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–4, wobei das Medikament nach dem Ausbruch der Autoimmunerkrankung verabreicht wird
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–6, wobei das Medikament zwischen 1 und 1000 mg Autoantigen umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–7, wobei das Medikament zwischen 25 und 850 mg Autoantigen umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–8, wobei das Medikament einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.