DE3504221A1

DE3504221A1 - Verfahren zur passiven immunisierung von saeugern unter verwendung von antikoerpern von gefluegel und/oder boviden und antikoerpergemische

Info

Publication number: DE3504221A1
Application number: DE19853504221
Authority: DE
Inventors: Lee R. Dr. Birmingham Ala. Beck; Ralph J. Oregonia Ohio Stolle
Original assignee: Stolle Research and Development Corp
Current assignee: Stolle Research and Development Corp
Priority date: 1984-02-07
Filing date: 1985-02-07
Publication date: 1985-12-19
Anticipated expiration: 2005-02-08
Also published as: EP0395120A2; DK227190A; JP2690476B2; JPH08231425A; JPH04352729A; US4748018A; DK227190D0; JP2548115B2; DE3504221C2; NZ211030A; JPH08231427A; JP2698779B2; IL74155A0; EP0395120B1; JPH08231424A; AU583808B2; ATE135016T1; GR850323B; JPS60248628A; HK1000183A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur passiven Immunisierung eines Säugers mit einem aus immunisierten Geflügel- und/oder Bovidenarten gewonnenen heterologen Antikörper.

Aus der Immunologie ist allgemein bekannt, daß aus verschiedenen Antikörpertypen wie IgA, IgM und IgG bestehende Serumglobulinfraktxonen zur Bekämpfung der entsprechenden Antigene verwendet werden können, wodurch deren schädliche Wirkungen neutralisiert werden. Die verschiedenen Antigene umfassen karzinogene Antigene, Bakterien- und Virenarten, bioregulatorxsche Faktoren pflanzlicher und tierischer Herkunft sowie Toxine und Gifte.

Normalerweise neutralisiert das Immunsystem eines Tiers nach Einwirkung eines fremden Antigens die bioregulatorischen und/oder schädlichen Wirkungen dieses Antigens,

20 Die Einwirkung fremder Antigene auf das Immunsystem

eines Säugers kann entweder natürlich erfolgen oder das Antigen kann auf den Säuger dadurch einwirken, daß es diesem absichtlich in Form eines Impfstoffes verabreicht wird. Wird ein Tier mit einer Antigensubstanz geimpft, kommt es zu einer Immunreaktion, bei der das Tier Immunkörper erzeugt. Dieser Vorgang wird allgemein als aktive Immunisierung des der Wirkung des Antigens ausgesetzten Säugers bezeichnet. Die durch die aktive Immunisierung von einer Tierart erzeugten Antikörper sind in bezug

auf diese homologe Antikörper.

Es ist bekannt, daß ein in einer Art erzeugter Antikörper zur Neutralisierung der Wirkungen des entsprechenden Antigens in anderen Arten verwendet werden kann. Die passive Immunisierung erfolgt, wenn ein Individuum von einer Art einen Immunschutz von Antikörpern empfängt, die in einem Individuum einer anderen Art erzeugt wurden. Dies erfordert den Transfer von Antikörpern von einem Spender auf einen Empfänger. Sind der Spender und der Empfänger von derselben Art, sind die Antikörper homolog, gehören jedoch der Spender und der Empfänger verschiedenen Arten an, sind die Antikörper als heterolog zu bezeichnen.

Obwohl bekannt ist, daß die passive Immunisierung eine wirksame Methode zur Verhinderung und Behandlung von Krankheiten gewährleistet, ist ihr Einsatz in der Humanmedizin jedoch beschränkt, da homologe menschliche Antikörperformulierungen nicht allgemein zugänglich sind. Andererseits kann die passive Immunisierung von Menschen mit heterologen Antikörpern,.die in einer Tierart als Spender erzeugt wurden, nur in Notfällen eingesetzt werden, da die Verwendung von heterologen Antikörpern gefährlich sein kann. Beispiele für Fälle, in denen heterologe Antikörper zur Behandlung von Mensehen verwendet werden können, ist der Einsatz von in Pferden erzeugten Schlangen- und Bienengiftimmunsera. Diese Antikörper neutralisieren die Schlangen- und Bienentoxine unter Beseitigung und/oder Verminderung ihrer schädlichen Wirkungen.

Die passive Immunisierung des Menschen mit heterologen Antikörpern ist nicht sicher, da Antikörper nichtmensch-

licher Herkunft für das menschliche Immunsystem fremd sind. Die Behandlung des Empfängerimmunsystems mit dem Fremdspenderantikörperprotein verursacht im Empfänger eine Immunreaktion gegen den Fremdantikörper. Die Immunreaktion verursacht die Serumkrankheit, die zum anaphylaktischen Schock und zum Tod führen kann. Trotz der bekannten günstigen Verwendung heterologer Antikörper kann daher diese Behandlungsmethode aus Sicherheitsgründen nicht allgemein angewandt werden.

Es ist bekannt, daß Geflügelarten wie Hühner, Truthühner und Enten im Blut und in den Eiern gegen Faktoren, die Vogelerkrankungen hervorrufen, sowie gegen andere Antigene Antikörper erzeugen. So z.B. haben LeBacq-Verheyden, et al., Immunology, 27:683 (1974) und Nestle, G.A., et al., J. Med., 130:1337 (1969) Hühnerimmunoglobuline quantitativ analysiert. Poison, Α., et. al., Immunological Communications, 9:495-514 (1980) immunisierten Hennen gegen verschiedene Proteine und natürliche Proteingemische und stellten im Dotter der Eier IgY-Antikörper fest. Fertel, R., et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 102: 1028-1033 (1981 immunisierten Hennen gegen Prostaglandine und entdeckten Antikörper im Eidotter. Jencenius, et al., Journal of Immunological Methods, 46:363-68

(1981) beschrieben ein Verfahren zur Isolierung von Eidotter-IgG zum Einsatz in der Immunodiagnostik. Poison, Α., et al., Immunological Communications, 9: 475-493 (1980) beschreiben Antikörper, die aus dem Dotter von Hennen isoliert wurden, die gegen eine Reihe

30 von Pflanzenviren immunisiert worden waren.

Alle diese Druckschriften betreffen jedoch nur Untersuchungen über Geflügelimmunoglobulinen, die vom Immunsystem als Reaktion auf verschiedene Antigene er-

zeugt werden, von denen nicht alle in spezifischer Weise Krankheiten bei Säugern hervorrufen. Wie bereits ausgeführt schlagen Poison (siehe die beiden Druckschriften aus dem Jahre 1980) bzw. Jencenius (ibidem)die

• 5 Verwendung von Geflügelantikörpern anstelle von Säugerantikörpern als Mittel für die Diagnostik vor. Poison, Immunological Communications, 475-493 (1980) gibt auf Seite 491 an, daß es möglich sein könnte, frisch ausgebrütete Küken passiv gegen Erkrankungen zu schützen, denen ihre Mütter nicht ausgesetzt waren, und zwar indem man die Küken mit Dotter-IgY aus Hennen injiziert, die gegen diese Krankheiten hyperimmunisiert worden waren. Abgesehen davon, daß diese Annahme rein spekulativ ist, betrifft sie lediglich die homolöge passive Immunisierung einer Art mit von derselben Art, wenngleich auch aus einem anderen Individuum, erhaltenen Antikörpern.

Jencenius, et al., Journal of Immunological Methods: 46, ibidem, stellen sogar auf Seite 67 fest, daß man sogar vermuten könne, daß mit großen Mengen an raffiniert verpackten Antikörpern ausgestattete Eier aus entsprechend immunisierten Hühnern eine wirksame und ungefährliche Therapie für bestimmte Darminfektionen sein könnten, wenn Maßnahmen zur Reduzierung des Antikörperabbaus durch proteolytische Darmenzyme getroffen werden könnten. Die Autoren verfahren dabei in Analogie zur Idee von der Behandlung von Infektionen mit Milch aus immunisierten Tieren und zitieren die Arbeit von Campbell, et al., Journal of Immune Milk, 1:3 (1964). Die Vermutung von Jencenius et al.

ist, wie die Autoren selbst einräumen, rein spekulativ. Außerdem wird zusammen mit der Vermutung die Warnung ausgesprochen, daß die Antikörper durch proteolytische

Darmenzyme abgebaut werden könnten.

Der phylogenetische Abstand zwischen Vögeln und Säugern hat jedoch die Wahl von Hühnern und anderen Geflügelarten für die Erzeugung von Antikörpern gegen Säugerkrankheiten als unsinnig erscheinen lassen. Für die Erzeugung von Antikörpern für immuntherapeutische Produkte zur Behandlung von Säugern kommt offensichtlich nur ein anderer Säuger mit enger biogenetischer Verwandtschaft in Frage. So z.B. wäre es nicht sinnvoll, Menschen mit einer parenteral zu verabreichenden Dosierungsform von Hühnerantikörpern zu behandeln, da das Hühnerprotein dem menschlichen Immunsystem fremd ist und bei wiederholter Verwendung allergische Reaktionen hervorrufen würde. In der Tat gibt es in der Fachliteratur keine Anhaltspunkte dafür, daß aus Vogel eiern stammende Antikörper zur Verhinderung oder Behandlung von Säugerkrankheiten verwendet worden wären.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verabreichung einer heterologen schwach antigenen Proteinformulierung an einen Säuger unter Bedingungen, welche die Serumkrankheit oder den anaphylaktischen Schock vermeiden. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Verabreichung einer heterologen, schwach antigenen IgG-Formulierung, erhalten aus den Sera und/oder den als Nahrungsmittel dienenden Produkten einer immunisierten Geflügelart, an einen Sauger unter Bedingungen, welche die Serumkrankheit oder den anaphylaktischen Schock

vermeiden.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur heterogen passiven Immunisierung eines Säugers gegen eine durch ein Antigen verursachte Erkrankung, das dadurch

gekennzeichnet ist, daß man dem Säuger eine immunologisch wirksame Menge eines Antikörpers verabreicht, der aus einer Geflügelart gewonnen wurde, die gegen dieses Antigen immunisiert worden war, wobei der Sauger gegenüber dem Antikörper dadurch .tolerant gemacht wird, daß er eine bestimmte Zeit lang als Nahrung aus dem Ei der betreffenden Geflügelart stammende Stoffe zu sich nimmt.

Ein älterer Vorschlag beschreibt ein Verfahren zur passiven Immunisierung eines Säugers, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man aus der Milch eines domestizierten Boviden, der gegen einen Antigenstoff immunisiert worden war, einen gereinigten heterologen Antikörper parenteral injiziert, wobei der Säuger eine Zeit lang mit der Milch dieses Boviden gefüttert wurde. In diesem Vorschlag wird auch ein Verfahren zur passiven Immunisierung eines Säugers beschrieben, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man aus den Eiern einer Geflügelart, die gegen einen Antigenstoff immunisiert worden war, einen gereinigten heterologen Antikörper parenteral injiziert, wobei der Säuger eine Zeit lang mit den Eiern dieser Geflügelart gefüttert wurde.

Die Erfindung umfaßt diesen Vorschlag und erweitert ihn dahingehend, daß die Verabreichung des Eiantikörpers auf jede geeignete Weise erfolgen kann und nicht nur parenteral.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur heterologen passiven Immunisierung eines Säugers gegen eine durch ein Antigen verursachte Erkrankung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

a) den Sauger mit einem Stoff füttert, der einen erhöhten Antikörpertiter gegen das Antigen aufweist, erhalten aus dem Ei einer gegen das Antigen immunisierten Geflügelart, bis der Sauger eine erhebliche Toleranz mit den Antikörpern entwickelt, und

b) dem Sauger eine immunologisch wirksame Menge eines Antikörpers verabreicht, der aus einer gegen das Antigen immunisierten Geflügelart erhalten wurde.

Gemäß dieser Ausführungsform wird demnach der Sauger vor der Verabreichung der aus einer Geflügelart erhaltenen Antikörper mit einem aus Eiern einer gegen das Antigen immunisierten Geflügelart stammenden Stoff gefüttert.

Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur heterologen passiven Immunisierung eines Säugers gegen eine durch ein Antigen verursachte Erkrankung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

a) den Sauger mit einem Stoff füttert, der einen erhöhten Antikörpertiter gegen das Antigen aufweist, erhalten aus der Milch eines gegen dieses Antigen immunisierten Boviden, bis der Säuger eine starke Ver-

5 träglichkeit mit dem Antikörper entwickelt, und

b) dem Sauger durch parenterale Injektion eine immunologisch wirksame Menge eines Antikörpers verabreicht, der aus einem domestizierten, gegen das Antigen immu-

10 nisierten Boviden erhalten wurde.

Die Erfindung betrifft auch verschiedene Verabreichungsverfahren, verschiedene Bedingungen sovie verschiedene dafür geeignete Stoffzusammensetzungen.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Gemisch, enthaltend

a) einen Stoff mit einem erhöhten Antikörpertiter gegen ein bestimmtes Säugerantigen, erhalten aus dem Ei einer gegen dieses Antigen immunisierten Geflügelart, zusammen mit

b) einem Stoff mit einem erhöhten Antikörpertiter gegen das Antigen, erhalten aus der Milch eines gegen dieses Antigen immunisierten domestizierten Boviden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Gemisch, enthaltend:

a) einen aus dem Ei einer gegen das jeweilige Säugerantigen immunisierten Geflügelart gewonnenen gereinigten Antikörper zusammen mit

b) einem aus der Milch eines gegen das Antigen immunisierten Boviden gewonnenen gereinigten Antikörper.

Die Erfindung betrifft außerdem ein Gemisch, enthaltend:

a) einen parenteralen Träger und

b) einen aus dem Ei einer gegen ein Antigen immunisierten Geflügelart gewonnenen gereinigten Antikörper, wobei dieser Antikörper nicht zur Serumkrankheit oder zum anaphylaktischen Schock bei dem Sauger, dem der Antikörper verabreicht wurde, führt.

Die Erfindung betrifft ferner ein Gemisch, enthaltend: a) einen parenteralen Träger und

b) einen Antikörper, erhalten aus dem Serum oder dem als Nahrungsmittel dienenden Produkt eines gegen eine Antigensubstanz immunisierten Boviden, wobei der Antikörper nicht zur Serumkrankheit oder zum anaphylaktischen Schock bei dem Säuger, dem der Antikörper

20 verabreicht wurde, führt.

Das Unvermögen des Immunsystemes eines Tieres, auf Fremdprotein zu reagieren, ist eine Krankheit, die als Immuntoleranz bekannt ist. Außerdem ist dem Immunologen bekannt, daß Säuger einer bestimmten Art keine Toleranz mit Antikörpern von verschiedenen Tierarten,

andere Säugerarten eingeschlossen,, aufweisen. Es ist daher offensichtlich, daß artfremde heterologe Antikörper nicht mit Sicherheit zur Behandlung von Säugern verwendet werden können. Der erfindungsgemäße Vorschlag stellt nun bezüglich dieser allgemein anerkannten Ansicht der heterologen Immunologie eine Ausnahme dar. Es wurde nämlich gefunden, daß das Immunsystem eines Säugers für die in Serum- oder Eiprodukten von Geflügel gefundenen heterologen Antikörper Toleranz erlangen kann. Diese stellt sich bei Säugern ein, die zuvor mit einem Futter ernährt worden waren, das Antikörper aus der heterologen Geflügelart enthielt. Individuen, die nicht mit einem Futter ernährt worden waren, das Antikörper aus heterologem Geflügel enthielt, zeigten keine Toleranz mit dem nachfolgend verabreichten Geflügelantikörper .

Ein Hauptmerkmal der Erfindung ist somit, daß der heterologe Antikörper, der aus den Serum- oder Eiprodukten von Geflügel gewonnen wird, das spezifisch gegen verschiedene Antigene immunisiert worden war, passiv einer Säugerart oral, intraperitoneal oder parenteral (d.h. intravenös oder intramuskulär) verabreicht werden kann, ohne Serumkrankheit oder anaphylaktische Reaktio-

25 nen hervorzurufen.

Ein weiteres Hauptmerkmal der Erfindung besteht darin, daß der heterologe Antikörper, der aus den Serum- oder als Nahrungsmittel dienenden Produkten von domestizierten Boviden erhalten wurde, die spezifisch gegen verschiedene Antigene immunisiert worden waren, passiv parenteral einer Säugerart verabreicht werden kann, ohne eine Serumkrankheit oder anaphylaktische Reaktionen her-

vorzurufen.

Wie bereits oben erläutert, kommt die Toleranz des Immunsystems, welche die notwendige Voraussetzung für die Verabreichung heterologer Antikörper ist, unter natürlichen Bedingungen nicht vor und muß erst in einem Säuger über eine gewisse Zeit durch Füttern mit einem Geflügelantikörper enthaltendem Stoff erzeugt werden.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann jeder beliebige Säuger behandelt werden. Dazu zählen domestizierte Säuger wie Kaninchen, Kühe, Pferde, Ziegen, Schafe und andere in der Landwirtschaft verwendete Tierarten. Nicht domestizierte Säuger wie Affen können ebenfalls auf diese Weise behandelt werden. Schließlich ist die Erfindung auch auf die passive heterologe Immunisierung

15 des Menschen anwendbar.

Es kann jedes Antigen oder Antigengemisch verwendet werden. Das Antigen kann ein Bakterien-, Virusantigen, ein zelluläres Antigen oder ein anderer Stoff sein, auf den das Immunsystem einer Geflügelart oder einer domestizierten Bovidenart reagiert und das in diesen einen Zustand der Immunsensibilität induziert. Die Antigene sind vorzugsweise solche, die verschiedene Säugerkrankheiten hervorrufen, wie durch Mikroorganismen oder Viren ausgelöste Infektionen, toxische Erkrankungen und andere. Geeignete Beispiele für Bakterienantigene sind Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas maltophiia, Streptococcus equisimili, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus bovis, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, Moraxella bovis, Actinobacillus lignieresi, Corynebacterium rena-Ie, Fusobacterium necrophorum, Bacillus cerus, Salmo-

nella dublin, Salmonella heidelberg, Salmonella paratyphi, Yersinia enterocolitica, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Aerobacter aerogenes, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium, Haemophilus influenzae, Streptococcus viridans, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Streptococcus Gruppe B, Diploccoccus pneumoniae, Streptococcus mutans, Corynebacterium, Acne, Typ 1 und 3, u.a., Neisseria

10 gonorrhea, Mycobacterium tuberculosis, Haemophilus

vaginalis, Gruppe b , Streptococcus ecoli, Microplasma hominis, Hemophilus dycreyi, Granuloma inguinale, Lymphopathia venereum, Treponema pallidum, Brucella abortus, Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella canis, Campylobacter fetus, Campylobacter fetus intestinalis, Leptospira pomona, Listeria monocytogenes, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Actinobacillus equuli, Salmonella abortus ovis, Salmonella abortus equi, Corynebacterium equi, Corynebacterium pyogenes, Actinobacci-

20 lus seminis, Mycoplasma bovigenitalium, Clostridium tetani u.a.

Geeignete Virusantigene sind Equine herpes virus, Equine arteritis virus, IBR-IBP virus, BVD-MD virus, Herpes virus (humonis-Typ 1 und 2) u.a.

Typische Polypeptide sind Proteine, die Sauger affizieren, bei denen eine passive Immunisierung angezeigt ist. Sie umfassen bioregulatorische Faktoren, Hormone, Enzyme, Schlangen-, Bienengifte, Toxine und andere Insekten- und Reptiliengifte.

30 Zur Entwicklung einer Toleranz für Geflügel- oder

Bovidenantikörperproteine in einem Sauger wird dieser

mit einem Stoff gefüttert, der eine erhebliche Toleranz induzierende Menge an Antikörpertiter gegen das Antigen aufweist, erhalten aus dem als Nahrungsmittel dienenden Produkt einer gegen das Antigen immunisierten Geflügel-oder domestizierten Bovidenart, bis der Sauger eine hohe Antikörpertoleranz entwickelt hat. Normalerweise erfolgt dies durch Verabreichung eines Futters bzw. einer Diät, die Eimaterial oder Milch enthält und periodisch wenigsten während ca. zwei Wochen bis zu mehreren Monaten aufgenommen werden muß. Bei jüngeren Tieren oder Menschen beträgt die Minimaldauer lediglich 10 bis 14 Tage. Bei älteren Menschen und Tieren kann die minimale Verabreichungsdauer zur Erzielung der erforderlichen Verträglichkeit bis zu mehreren Monaten betragen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Antikörpertiter im Material durch vorgängige Immunisierung der Geflügelart über das normale Niveau angehoben.

Die Toleranz des Immunsystems eines Säugers für einen fremden Antikörper läßt sich einfach dadurch nachweisen, daß sich bei diesem Sauger, der mit Eimaterial oder Milch gefüttert wurde, bei wiederholter intravenöser oder intramuskulärer Injektion von gereinigtem Geflügeloder Bovidenantikörper es nicht zu einer induzierten Serumkrankheit oder zu einem anaphylaktischen Schock kommt. Daß es zum Aufbau der Toleranz gekommen ist, läßt sich mit Sicherheit durch langsame Steigerung der Dosis des Geflügel- oder Bovidenantikörpers nachweisen. Fehlende Toleranz geht nämlich Hand in Hand mit Immunreaktionen im Säuger an der Injektionsstelle. Ist dies der Fall, muß die Behandlung unterbrochen bzw. abgebrochen werden. Erfolgt die Verabreichung oral, verursacht die fehlende Toleranz gastrointestinale Beschwerden.

Das an den Sauger verfütterte bzw. verabreichte Geflügelmaterial sollte normale Eier darstellen bzw. kann einen erhöhten Titer gegenüber dem jeweiligen Antigen aufweisen. Das Material kann entweder ganze Eier oder Fraktionen davon darstellen, wie Eidotter, in dem sich gewöhnlich der Hauptanteil der Geflügelantikörper konzentriert. Außerdem sollte das Material unter Bedingungen verfüttert bzw. verabreicht werden, unter denen der im Material enthaltene Geflügelantikörper seine immunogene Wirkung nicht verliert und insbesondere nicht denaturiert wird. Wenn somit Eier dem Sauger verfüttert bzw. ihm verabreicht werden, sollten sich diese in einem Zustand befinden, in dem das Protein nicht denaturiert ist.

Es ist bekannt, daß die meisten Geflügeleier gegen einen Wirt von natürlich vorkommenden, Geflügel affizierenden Antigenen Antikörper enthalten. Erfindungsgemäß können derartige Eier an den Sauger zur Induzierung der Toleranz verfüttert werden. Andererseits kann der Antikörpertiter in den an den Sauger verfütterten Eiern über dem von normalerweise in Geflügeleiern vorkommenden Antikörpern liegen. In einem solchen Falle sind die Antikörper in den meisten Fällen immunologisch reaktionsfähig in bezug auf die Antigene, welche Krankheiten hervorrufen, die für den Sauger spezifisch sind, nicht jedoch für die betreffende Geflügelart. Obwohl die im Dotter von nichtimmunisierten Geflügelarten natürlich vorkommenden Antikörper keine spezifische Wirkung gegen Antigene ausüben, welche bei Säugern Krankheiten hervorrufen, dienen sie dennoch zur Induzierung der Immuntoleranz.

Das an den Sauger zu verfütternde Bovidenmaterial sollte normale Milch sein bzw. kann einen erhöhten Titer ge-

genüber dem jeweiligen Antigen aufweisen. Die Milch sollte unter Bedingungen verfüttert werden, unter denen der im Material enthaltene Bovidenantikörper seine immunogene Wirkung nicht verliert und insbesondere nicht denaturiert wird. Wird somit an den Säuger Milch verfüttert, sollte diese sich nicht in einem Zustand befinden, in dem das Protein denaturiert vorliegt.

Erfindungsgemäß versteht man unter "erhöhtem Titer" gegen Antigene wirkende Geflügelantikörpertiter, die wenigstens um 100 % über dem normalen Background-Niveau an Geflügelantikörpertitern gegen dasselbe Antigen liegen.

Die Geflügelarten, die erfindungsgemäß für die Bereitstellung von Eiern in Frage kommen, umfassen Hühner, Truthühner, Enten, Gänse und dergleichen, insbesondere jedoch Hühner.

Die für die Bereitstellung von Antikörpern wünschenswerten Boviden sind insbesondere solche der Gattung

Bos, vorzugsweise Kühe, Schafe und Ziegen, insbesondere jedoch Kühe.

Hat man beim Sauger einmal die erforderliche Verträglichkeit erreicht, so ist dieser bereit für die Verabreichung von Geflügel- oder Bovidenantikörpern, die gegenüber dem jeweiligen Antigen immunreaktiv sind. Die Verabreichung der Geflügelantikörper kann auf verschiedene Weise erfolgen, vorzugsweise jedoch oral oder durch parenterale, wie intravenöse, intraperitoneale oder intramuskuläre Injektion. Die orale Verabreichung der Antikörper kann wirksam zur Behandlung von Erkrankungen des Mundes und des Gastrointestinaltrakts eingesetzt werden. Die bevorzugte Methode zur Immunisierung mit

Bovidenantikörpern erfolgt durch intramuskuläre oder intravenöse Injektion während einer für die Erzielung einer wirksamen Behandlung für die jeweilige Erkrankung ausreichenden Zeitdauer. Die Antikörper werden direkt oder im Gemisch mit einem üblichen pharmazeutisch verträglichen flüssigen oder festen Träger verabreicht. In der Regel werden die heterologen Antikörper durch parenterale Injektion in Form einer flüssigen Formulierung verabreicht.

10 Die vorgängig im Säuger aufgebaute Immuntoleranz

als Ergebnis der Verfütterung von Eimaterial bewirkt eine sichere und wirksame passive Immunisierung unter Verwendung von Geflügel- oder Bovidenantikörpern. Die Antikörper werden vorzugsweise nach bekannten Methoden gereinigt, wie z.B. durch Ausfällung, Extraktion, Chromatographie, Fraktionierung und dergleichen. Unter "gereinigt" versteht man jede Art von Geflügel- oder Bovidenantikörpern, die im wesentlichen frei ist von anderen möglicherweise immunogenen Protein- oder Nichtproteinkomponenten aus Geflügel oder Boviden. Derartige Komponenten können, ohne darauf beschränkt zu sein, andere Proteine, wie z.B. Antikörper, Zellen, Zellfragmente, Membranfragmente, Lipide, Nucleinsäuren, Organellen und dergleichen umfassen.

Die dem Säuger nach Aufbau der Toleranz zu verabreireichenden Geflügelantikörper können aus Geflügelserum oder vorzugsweise aus Geflügeleiern gewonnen werden. Sie werden unmittelbar als solche oder im Gemisch mit einem üblichen pharmazeutisch verträglichen flüssigen oder festen Träger verabreicht. In der Regel erfolgt jedoch die Verabreichung durch parenterale Injektion in Form einer flüssigen Formulierung. Die Antikörper können auch in feinverteilter Form in einem organischen

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Matrixmaterial bereitet und dann unmittelbar dem Sauger injiziert werden.

Die Verabreichung der Antikörper hat in einer Menge zu erfolgen, die für die jeweilige Erkrankung des Säugers immunologisch wirksam ist. So z.B. kann der Fachmann leicht die Menge an Geflügelantikörpern ermitteln, die dem Sauger passiv verabreicht wurde, der von einer bestimmten Erkrankung affiziert wurde, wie z.B. von einem Schlangenbiß oder einem Bienenstich oder anderen Insektenstichen oder Reptilienbissen. Typische passive Immunisierungen dieses Typs bewegen sich innerhalb eines Bereiches von 0,25 mg/kg bis 1,00 mg/kg pro Verabreichung. Dauer und Intensität der Behandlung hängen von der jeweiligen Krankheit bzw. dem Zustand des Säugers ab. Diese Bedingungen umfassen nicht nur Palliativbehandlungen wie die Behandlung der jeweiligen Infektion, Krankheit oder des jeweiligen Vergiftungszustandes, sondern auch Präventivmaßnahmen wie Kariesbekämpfung. Für die Präventivbehandlung von Infektionserkrankungen werden ca. 0,25 mg/kg bis 1,00 mg/kg, vorzugsweise 0,5 mg/kg bis 0,75 mg/kg verabreicht.

Die Geflügelart, von der das dem Säuger verfütterte Eimaterial stammt, kann dasselbe Geflügelindividuum sein (oder auch nicht), von dem die Antikörper (vorzugsweise in gereinigter Form) erhalten wurden, die dem (jetzt tolerant gemachten) Sauger verabreicht werden.

Es folgt ein Beispiel für das Vorgehen bei der Immunisierung von Geflügel oder Boviden:

1. Antigenselektion.

2. Sensibilisierung der Geflügelart bzw. des Boviden durch primäre Immunisierung.

3. Testen des Geflügelserums bzw. der Geflügeleier oder des Bovidenserums zum Nachweis der Induzierung der Sensibilität.

4. Verabreichung von Boostern in geeigneter Dosierung zur Induzierung und Aufrechterhaltung eines Antikörper produzierenden Zustandes.

5. Testen der Antikörpermenge im Eidotter bzw. in der Milch.

6. Sammeln der Eier vom Geflügel bzw. der Milch des Boviden während seines immunisierten Zustandes.

Nachfolgend wird auf die einzelnen Stufen näher eingegangen.

In Stufe 1 kann jedes Antigen oder jedes Antigengemisch verwendet werden. Die Antigene können ein Bakterien-, Virusantigen, ein zelluläres Antigen oder ein anderer Stoff sein, auf den das Immunsystem einer Geflügelart oder eines Boviden reagiert. Kritisch an der Stufe 1 ist, daß das Antigen im Tier einen Zustand der Immunsensibilität zu induzieren vermag. Das Antigen kann nach jedem beliebigen Verfahren verabreicht werden, das Sensibilisierung auslöst. Vorzugsweise werden polyvalente Antigene verwendet.

In Stufe 2 ist die bevorzugte Immunisierungsmethode die intramuskuläre Injektion. Es kommen jedoch auch andere Methoden in Frage wie intravenöse Injektion, intraperitoneale Injektion, orale Verabreichung, Rectalsuppositorien u.a., unter der Bedingung, daß die Behandlungsweise für die Induzierung der Sensibilität ausreichend

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ist. Eine bevorzugte Immunisierungsmethode besteht darin, daß man eine Antigensubstanz in ein in feinverteilter Form vorliegendes biologisch abbaubares und verträgliches Matrixmaterial einarbeitet und intramuskulär der Geflügelart oder dem Boviden injiziert. Die Dosierung

fi * 20 beträgt normalerweise 1x10 bis 1x10 Zellen, vorzugs-

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weise 10 bis 10 Zellen, insbesondere 2x10 Zellen.

Stufe 3 dient zur Feststellung, ob die Geflügel- oder Bovidenart für das jeweilige Antigen sensibilisiert worden ist. Für den Sensibilitätstest steht eine Reihe von in der Immunologie bekannten Methoden zur Verfügung (s. Methods in Immunology and Immunochemistry, William CA., WM Academic Press, London (Vol. 1-5) (1977)). Beispiele dafür sind Hautsensibilitäts- und Serumtests auf Anwesenheit von Antikörpern bezüglich der stimulierenden Antigene und Tests zur Ermittlung der Fähigkeit von Immunzellen des Säugers auf das Antigen zu reagieren. Der jeweils zu verwendende Testtyp hängt weitgehend von der Art des verwendeten Antigens ab. Die bevorzugte Methode besteht in der Verwendung eines polyvalenten Impfstoffes aus einem Mehrfachmaterial als Antigen und im Test auf Anwesenheit von agglutinierenden Antikörpern im Geflügel- oder Bovidenserum vor und nach dem Immunitätstest mit dem Impfstoff. Das Auftreten von Ei- oder Milchantikörpern nach der Immunisierung mit einem Impfstoff zeigt die Sensibilität an.

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Ist dieser Punkt erreicht, kann mit Stufe 4 fortgesetzt werden. Die für die Induzierung der Sensibilität erforderliche minimale Antigendosis hängt vom verwendeten Antigen ab.

Stufe 4 umfaßt die Induzierung und Aufrechterhaltung des Antikörper produzierenden Zustandes. Ist die Geflügel- oder Bovidenart einmal sensibilisiert, so wird dieser Zustand durch wiederholte Boosterverabreichung bei entsprechender Dosierung innerhalb eines bestimmten Zeitintervalls wiederholt. Die Zeitintervalle für die Verabreichung hängen von der Art des Antigens ab. Ein 2-Wochen-Intervall für die Booster-Verabreichung ist optimal für polyvalente Antigene. Die Booster-Verabreichungen dürfen nicht einen Zustand der Immuntoleranz induzieren. Dies wür'de die Geflügel- oder Bovidenart dazu veranlassen, vom Antikörper produzierenden Zustand in den Zustand der Immuntoleranz für das Antigen überzugehen. In diesem Fall würde das Tier aufhören, Antikörper zu produzieren. ^:

Es ist zum Beispiel auch möglich, eine Kombination verschie- !

dener Immunisierungsverfahren einzusetzen, wie zum Beispiel i

intermuskuläre Injektion für die primäre Immunisierung und j intravenöse Injektion für die Boosterinjektionen usw.

Zur Sensibilisierung und Induzierung des Antikörper produ- j

zierenden Zustandes können vom Fachmann verschiedene Kombi- |

nationen von Immunisierungsmethoden verwendet werden. J

Stufe 5 betrifft das Testen von Proben des als Nahrungsmittel dienenden Produkts aus dem immunisierten Tier, während ^; sich dieses im Antikörper produzierenden Zustand befindet, zur Ermittlung der Antikörpermenge im genannten Produkt. Die Antikörpermenge kann durch die bekannten Techniken oder Ra- i

dioimmun- und Enzymanalyse festgestellt werden. j

Stufe 6 betrifft das Sammeln der Eier und der Milch aus dem immunisierten Tier. Die Eier können in der erfindungsgemäßen Fütterungsstufe oder zur Gewinnung von gereinigten Antikörpern in der erfindungsgemäßen Verabreichungsstufe verwendet

werden.

Wenn der in der Verabreichungsphase zu verabreichende Antikörper aus Geflügel- oder Bovidenserum gewonnen wird, können bekannte Isolierungs- und Reinigungstechniken verwendet werden.

Nach der Sterilisierung des Antikörpers durch Filtration werden dem Säuger nach den oben beschriebenen Methoden während einer Zeitdauer Antikörper verabreicht, die eine wirksame Behandlung der betreffenden Krankheit gewährleistet. Die Injektionsstelle sollte nicht anschwellen oder andere Anzeichen für eine Immunreaktion gegen den injizierten Antikörper zeigen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Stufen der Fütterung und/oder Verabreichung mit einem Stoffgemisch durchgeführt. Verfüttert werden kann zum Beispiel ein Stoff oder ein Stoffgemisch mit einem erhöhten Antikörpertiter gegen das jeweilige Antigen sein, erhalten aus dem Ei einer gegen das Antigen immunisierten Geflügelart, zusammen mit einem Stoff mit erhöhtem Antikörpertiter gegen das Antigen, erhalten aus der Milch eines gegen das Antigen immunisierten Boviden. Bezüglich der Herstellung von erhöhte Antikörpertitermengen enthaltender Immunmilch sei z.B. auf Heinbach, US-PS 3 128 230 und Peterson, US-PS 3 376 198 verwiesen. Gemische, die derartige Stoffe enthalten, wie sie hier beschrieben werden, werden ebenfalls von

25 der Erfindung umfaßt.

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird dem Säuger ein Gemisch aus gereinigten Antikörpern verabreicht, wobei die eine Komponente dieses Gemisches ein Antikörper ist, der aus einer gegen das jeweilige Antigen immunisierten Geflügelart gewonnen wurde, und die andere Komponente ein Antikörper ist, der aus einem gegen das jeweilige Antigen immunisierten Boviden gewonnen wurde.

Besonders bevorzugt enthält ein Gemisch eine immunologisch wirksame Menge eines Gemisches aus Antikörpern, von denen ein erster Antikörper aus dem Ei einer gegen das jeweilige Antigen immunisierten Geflügelart gewonnen und gegebenenfalls stark gereinigt wurde, und ein zweiter Antikörper aus der Milch eines gegen dieses Antigen immunisierten domestizierten Boviden gewonnen und gegebenenfalls stark gereinigt wurde.

Die beschriebenen Gemische können therapeutisch oder in Form von Premix-FuttermitteIn verwendet werden. Gemäß einer Ausführungsform können dehydratisierte Immunmilch und dehydratisierte Immuneierstoffe miteinander gemischt und. entweder auf der Fütterungsstufe oder, falls die Antikörper gereinigt vorliegen, auf der Verabreichungsstufe verwendet werden. ■

I Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Beispielen näher j beschrieben.

j Beispiel 1

Die zur Immunisierung von Hühnern zwecks Erzeugung von Antikörpern in den Eiern eingesetzten Methoden ähneln denen, die zur Immunisierung von Säugern verwendet werden und sind dem Fachmann allgemein bekannt. Das allgemein verwendete Verfahren besteht in der Verabreichung eines Impfstoffes durch Injizieren in den Brustmuskel. Eine bevorzugte Methode besteht in der Verabreichung von 1 bis 5 mg Antigen in 1 ecm physiologische Kochsalzlösung. Die Injektion wird einmal pro Woche im Verlaufe von 4 Wochen wiederholt. Die maximalen Antikörpertiter treten nach der vierten Injektion auf. Die Antikörpertiter können durch Verabreichung von Booster-Injektionen des Antigens in ein- bis zweiwöchigen Intervallen aufrechterhalten werden.

Aus den in Tabelle 1 aufgeführten Bakterienstämmen wurde ein Impfstoff bereitet:

	Strep.	- 33 · TABELLE I
1 .	η	mutans
2.	Il	Il
3.	Il	Il
4.	Il	Il
5.	Il	Il
6.	Il

ATCC NO.

27351 27352 27607 27947 31341 31377

1. Die Bakterienkultur wurde mit 15 ml Medium wiederhergestellt und über Nacht bei 37⁰C inkubiert.

War ein gutes Wachstum erreicht, wurde ca. die Hälfte der Bakteriensuspension zur Beimpfung von 11 Bouillon verwendet, die bei 37⁰C inkubiert wurde. Der restliche Anteil der Suspension wurde in sterile Glycerinröhrchen gegossen und bei -20⁰C bis zu 6 Monate gelagert.

3. Nachdem sich in der Literkultur ein gut sichtbares Wachstum eingestellt hatte, wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugieren der Suspension während 20 Minuten bei

2
140.000 m/sec (14.000 χ g) zur Entfernung des Mediums abgeerntet. Das erhaltene Pellet wurde in steriler physiologischer Kochsalzlösung erneut suspendiert und 3 mal zur Auswaschung des Mediums aus den Zellen zentrifugiert. Nach der dritten Zentrifugierung in physiologischer Kochsalzlösung wurde das Pellet erneut in einer geringen Menge doppelt destilliertem Wasser suspendiert.

Zur Abtötung durch Hitze wurde die medienfreie Bakteriensuspension in einem Glaskolben in einem Wasserbad von 80⁰C über Nacht behandelt. Zur Ermittlung der Lebensfähigkeit der Bakterien wurde eine kleine Menge der durch Hitze abgetöteten Bakterien auf eine Bouillonkultur überimpft. Die Bakterien müssen für die Verwendung im Impfstoff abgetötet sein.

5. Die durch Hitze abgetöteten Bakterien wurden lyophilisiert und in sterilen Ampullen bei -20⁰C gelagert.

6. Das Bakterienstammgemisch wurde zur Immunisierung von 10 erwachsenen Hennen verwendet. Die Immunisierung wurde wie folgt durchgeführt: 350 mg der trockenen Bakterien wurden mit 11 steriler physiologischer Kochsalzlösung bis zu einer Konzentration von 2,2 χ 10 Bakterienzellen /ml Kochsalzlösung (optische Dichte 1,0 bei 660 nm) gemischt. 1 ml dieses Gemischs wurde 14rtr.gig in die Brust der Hühner injiziert.

Die von den immunisierten Hühnern stammenden Eier wurden gesammelt und zur Antikörpergewinnung aus den Eidottern der nachfolgenden Stufenbehandlung unterzogen:

1. Der Eidotter wurde vom Eiweiß abgetrennt und die Dottermembran aufgeschnitten und entfernt. Danach wurden 200 ml Dotter mit 800 ml Tris-Buffered Saline (TBS) verdünnt. TBS: Tris-Hydroxymethylaminomethan - gepufferte physiologische Kochsalzlösung: 0,14 NaCl, 0,01M Tris-HCl, pH7,4, 0,1 % NaN₃.

2. Die Lösung wurde bei Zimmertemperatur 20 Minuten langsam gerührt (der gesamte Vorgang wurde bei Zimmertemperatur durchgeführt). .

3. Dottersuspension wurde bei 140.000 m/sec (14.000 χ σ)

bei 20 C 30 Minuten lang zentrifugiert. Das Präcipitat wurde verworfen.

4. Dem Überstand wurden 100 ml Dextransulfat 10% (Gew./VoI) (Sigma) in TBS zugesetzt, wonach 5 Minuten langsam gerührt wurde.

5. Danach wurden 250 ml 1M CaCl₂ zugesetzt, wonach die Lö-

sung 30 Minuten lang zur Induzierung der Ausfällung des überschüssigen Dextransulfats inkubiert wurde.

6. Die Suspension wurde zentrifugiert und der Überstand zurückbehalten. Zur Extrahierung des mitgerissenen Proteins wurde das Sediment mit 2000 ml TBS gewaschen. Die beiden Überstände wurden dann miteinander

5 vereinigt.

7. Die überstände wurden zur Entfernung des Salzes intensensiv gegen deionisiertes Wasser dialysiert.

Die vor und nach der Immunisierung aus den Eiern erhaltenen Eiantikörper ließ man nach der Enzym-Immunanalyse auf dem Bakterienimpfstoff reagieren, um die Anwesenheit von Antikörpern in den Hühnereiern zu ermitteln, die -spezifisch auf S. mutans reagierten.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.

Tabelle 2

Hühner Präimmunisierung Postimmunisierung

Nr. S. mutans Stamm Nr. S. mutans Stamm Nr.

1234567 1234567

20 3 4

Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, daß die Hühner, die gegen Faktoren immunisiert worden waren, wie z.B. S. mutans, die bei Säugern Krankheiten hervorrufen. Eier erzeugen, die Antikörper enthalten, die spezifisch auf diese Faktoren reagieren, und die aus nichtimmunisierten Hühnern erhaltenen Eier diese Antikörper nicht aufweisen.

Die Antikörpertiter gegen S. mutans lagen wenigstens um 100 % über den Vergleichstitern aus den nichtimmunen Eiern.

Beispiel 2

Die aus dem Dotter der gegen die in Tabelle 1 aufgeführten Stämme immunisierten Eier von Hennen gewonnenen Antikörper wurden Kaninchen durch intramuskuläre Injektion verabreicht. 5 mg von Hennendotter-IgG, gelöst in 1 cm physiologischer Kochsalzlösung, wurden in die Hinterbeine von 5 Kaninchen injiziert. Eine zweite Injektion erfolgte 14 Tage später. Vor und nach der Behandlung wurden den Kaninchen Blutproben entnommen. Das Serum der Kaninchenproben ließ man auf Hennendotter-IgG unter Einsatz der Outcherlony-Geldiffusionsmethode zum Nachweis des Vorhandenseins von Kaninchenantikörpern auf Hennendotter-IgG reagieren. Die Anwesenheit von Kaninchenantikörpern gegen Hennendotter-IgG lieferte den immunologischen Beweis, daß die Behandlung eine immunologische Sensibilisierung des Immunsystems der Kaninchen gegen Hühner-IgG zur Folge hatte.

Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Das Symbol (+) bedeutet die Anwesenhext und das Symbol (0) die Abwesenheit von Antikörpern im Kaninchenserum gegen Hühner-IgG vor der Behänd-

lung (0 Wochen) und danach (1, 2, 3 Wochen)

	Tabelle 3	0	zweite Woche	dritte Woche
		0	+	+
Kaninchen Nr.	O-te Woche erste Woche	+	+	+
1	0	0	+	+
2	0	+	+	+
3	0		+	+
4	0
5	0

Keines der fünf Kaninchen wies vor der Behandlung in seinem Blut Antikörper gegen Hühner-IgG auf. Zwei Wochen nach der Behandlung wiesen fünf Kaninchen in ihrem Blut hohe Antikörpertiter gegen Hühner-IgG auf. Dieses Experiment zeigt, daß die Behandlung der Kaninchen mit Hühner-IgG, erhalten aus immunisierten Hühnern, eine Immunsensibilisierung der Kaninchen bewirkte. Die nachfolgende Behandlung der positive Titer aufweisenden fünf Kaninchen durch intravenöse Injektion von 5 mg Antikörper rief eine anaphylaktische Reaktion hervor und

20 führte zum Tod aller fünf Kaninchen.

Das Experiment bestätigte somit den derzeitigen Kenntnisstand, wonach aus Geflügel gewonnene Antikörper bei Verabreichung durch wiederholte Injektion bei Säugern allergische Reaktionen hervorrufen.

Die nächste Stufe im Experiment illustrierte die Grundlage der Erfindung. Es wurde an Kaninchen, wie oben beschrieben, ein identisches Experiment durchgeführt. Bei diesem Experiment wurden jedoch die fünf Kaninchen

während 30 aufeinanderfolgender Tage jeweils mit einem Ei gefüttert, das von immunisierten Hühnern erhalten worden war und in 50 cm Wasser gelöst wurde. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.

Das Symbol (+) bedeutet die Anwesenheit und das Symbol (0) die Abwesenheit von Antikörpern im Kaninchenserum gegen Ei-IgG vor der Behandlung (0 Wochen) und danach (1, 2, 3 Wochen).

10	Kaninchen	Tabelle	4	zweite	dritte
	Nr.			Woche	Woche
	1	0-te Woche	erste	0	0
	2		Woche	0	0
	3	0	0	0	0
	4	0	0	0	0
15	5	0	0	0	0
	0	0
	0	0

Keines der fünf Kaninchen wies in seinem Blut weder vor noch nach der Behandlung Antikörper gegen Hühnerdotterantikörper auf. Außerdem zeigten sich bei diesen Kaninchen bei Verabreichung von Hühnerantikörpern, erhalten aus immunisierten Hühnern, durch intravenöse Injektion, keinerlei Krankheitserscheinungen. Diese Experimente führten zu dem Schluß, daß die orale Aufnähme von immunen Hühnereiern durch Kaninchen diese für immunes Hühner-IgG tolerant macht.

Beispie 3

Mit diesem Versuch soll der Nachweis erbracht werden, daß die Behandlung eines Säugers mit Geflügelantikörpern in der Tat zweckmäßig sein kann. Zu diesem Zwecke wurde als Beispiel für einen Säuger die Ratte gewählt und das Huhn als Beispiel für einen Geflügelantikörperproduzenten. Beck et al., US-PS 4 324 782, verwendeten ein Rattenmodell, um die Nützlichkeit eines aus Säugern stammenden Antikörpers (Kuhmilch) zur Bekämpfung von Ratteninfektionen durch Streptococcus mutans nachzuweisen. Zweck des vorliegenden Experiments ist der Nachweis, daß Hühnereierantikörper bei der Behandlung dieser Erkrankungen denselben Zweck erfüllen wie Kuhantikörper.

Für diesen Versuch wurden ein Serotypenstamm von Streptococcus mutans und drei Gruppen von keimfreien Versuchsratten (10 Ratten pro Gruppe) verwendet. Gruppe 1 wurde mit regulärem kariogenem Futter Nr. 305 gefüttert, Gruppe 2 mit Futter Nr. 305 plus immunes Hühner-IgG, Gruppe 3 mit Futter Nr. 305 plus nichtimmunes Hühner-IgG. Bei diesem Versuch wurden frisch entwöhnte, 20 Tage alte Ratten in einen Versuchsisolator gebracht, mit virulentem S. mutans infiziert und dann mit einem beliebigen Futter versorgt. In einem Alter von 45 Tagen.. (Gesamt-

25 zeit 25 Tage) wurden die Tiere dann aus dem Versuch

herausgenommen. Am Ende des Versuchs wurden die Ratten aus dem Isolator entfernt und gewogen. Danach wurden die Mandibularmolaren entfernt und unter sterilen Bedingungen vom Zahnfleisch befreit. Unmittelbar darauf wurden diese in Reagenzgläser gegeben, die phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung (PBS) enthielten, beschallt, verdünnt und als Plattenkulturen in drei Verdünnungen in zweifacher Form sowohl auf Blut als auch

auf Mitis Salivarius ausgebracht (drei verschiedene Verdünnungen). Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 5 zusammengefaßt.

Tabelle 5

Durchschnittliche Karieskerbenbildung'

Euccal

Sulcal

Proximal

5 Gruppe*

Ds

Dm

Dx

Ds

Dm

Dx

Ds

Durchschnitt
liches
Körper
gewicht

S. rautans CFU

15,8 13,2 9,0 5,8 18,8 14,4 8,6 4,2 7,0 4,8 0,0 0,0

0,8 0,9 0,8 0,6 1,1 0,7 0,5 0,6 0,4 0,6 4

12,8 10,4 5,0 2,2 15,6 11,8 4,0 1,8 7,4 4,4 0,0 0,0

0,9 0,7 0,3 0,7 0,7 0,5 0,4 0,2 0,4 1,3 5

15,0 11,4 7,2 4,2 16,4 12,4 4,8 2,0 7,4 5,2 0,0 0,0

1,0 0,8 "0,5 "0,7 ~0,7 0,2 0,4 0,3 0,6 0,6 5

7,8 5,8 3,1 1,2 13,4 10,4 2,8 1,2 4,6 2,4 0,0 0,0

0,7 0,8 0,5 0,5 0,5 0,4 0,4 0,6 0,8 0,6 4

1,1 ^X7

6,2

10⁶ 8,6 10⁶ 1,4 10⁶

* i% Testmilch in Futter Nr. 305. Alle Ratten wurden mit S. mutans MT 8148 (Serotype c)

infiziert.

^a Ermittelt nach der Methode von Keyes, P.J., Dental Research, Bd. 37, S. 1077 (1958). E = Email Ds = Dentin, schwach DM = Dentin, mäßig Dx = Dentin,-stark

CO Cn ' CD

ro

CFU = Plaque-Kerbenbildung

Das Hühner-IgG-Antikörper enthaltende Futter gegen S. mutans bewirkte eine Verminderung sowohl der Karieskerben- als auch der Plaque-Kerbenbildung (plaque scores (CFU)). Der aus normalen Hühnereieren gewonnene Geflügelantikörper (Hühner-IgG) zeigte eine geringere Wirkung auf Karies und/oder Plaquekerben. Dieser Versuch illustriert die Verwendung von Eiern von gegen Streptococcus mutans immunisierten Hühnern zur Verminderung von Zahnkaries und Plaquebildung im Rattenmodell.

Beispiel 4

Aus Kuhmilch und -serum nach üblichen biochemischen Methoden gewonnenes gereinigtes IgG wurde durch MilIipore-Filtration sterilisiert. Drei Personen, die längere Zeit hindurch Milch getrunken hatten, wurde 3 bis 4 Monate lang sterilisierter IgG-Antikörper bei einer Dosierung von 5 bis 100 mg IgG injiziert. Nach der Injektion zeigte keine der Injektionsstellen Anzeichen

20 für eine Schwellung oder andere Anzeichen für eine

Immunreaktion. Außerdem zeigten den behandelten Personen entnommene Serumproben keine Anzeichen von Serumkrankheit.

Beispiel 5

Zur Illustration des Aufbaus von Antikörpertoleranz in einem Säuger wurden vier Kaninchen 9 0 Tage lang mit Kuhmilch, Futter und Wasser ernährt. Weiteren vier Kaninchen wurden lediglich Futter und Wasser verabreicht, Jedes mit Milch ernährte Kaninchen bekam täglich 300 ml Wasser. Sämtlichen Kaninchen wurde 90 Tage nach Beginn des Versuchs eine 5 mg-Dosis gereinigtes Kuhmilch-IgG

durch intramuskuläre Injektion verabreicht. Eine, zwei und drei Wochen nach Injektion des Rinder-IgG wurden aus der Ohrvene jedes Kaninchens Blutproben entnommen. Die Immunreaktion der Kaninchen gegen den Rinder-IgG-Antikörper wurde nach der Ouchterlony-Gelinfusionstechnik getestet, mit der sich die Reaktion der Antikörper in den Kaninchensera auf das zur Immunisierung der Kaninchen verwendete Rinder-IgG-Antigen nachweisen läßt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefaßt. Die aus allen vier Kaninchen, die keine Milch erhalten hatten, gewonnenen Sera ergaben dabei eine positive Reaktion und zeigten Antikörper auf das Rinder-IgG. Umgekehrt waren die aus den vier mit Milch gefütterten Kaninchen erhaltenen Sera negativ.

Immunologischer Test (Ouchterlony-Geldiffusion) auf Antikörper gegen Rinder-IgG

Gruppe I: Die Kaninchen wurden 90 Tage vor der Immu- !

i nisierung mit Rinder-IgG mit Milch gefuttert. !

Gruppe II: Die Kaninchen erhielten vor der Immunisierung mit Rinder-IgG keine Milch.

- 44 -

Tabelle 6

	Kaninchen	6	Antikörper im Serum gegen Rinder-IgG
Gruppe Nr.	A		nein
I	B	nein
	C	nein
	D	Testergebnis nicht definitiv (Grenzfall)
	A	ja
II	B	ja
	C	ja
	D	ja

Beispiel

Dieses Beispiel illustriert eine andere Ausführungsform der Erfindung. Die Geflügelantikörperwirkung auf Säuger kann durch gleichzeitige Verabreichung von aus Säugern stammenden Antikörpern verbessert werden. So z.B. ist die Verwendung von Geflügelantikörpern im Gemisch mit Kuhmilchantikörper wirksamer bei der Behandlung von Infektionen bei Säugern als die alleinige Verwendung von Geflügelantikörpern.

Die normale Antikörperkonzentration in einem Liter Immunmilch beträgt 0,05 bis 1 g IgG. Durch die Zugabe eines Eies zu einem Liter Milch wird die Gesamtantikörperkonzentration auf 1 bis 2 g angehoben.

Der Versuch aus Beispiel 3 wurde wiederholt, nur daß Kuhmilchantikörper in äquivalenten Dosen mit Hühnereierantikörpern kombiniert wurden. Die Ergebnisse sind

in Tabelle 5, Gruppe 3, zusammgenfaßt.

Die Kombination von Hühner- und Kuhantikörpern zeitigte eine größere Wirkung als die getrennte Verwendung von Kuh- oder Eiantikörpern.

Claims

v.FÜNER EBBINGHAUS FlNCK PATENTANWÄLTE EUROPEAN PATENT ATTORNEYS MARIAHILFPLATZ 2 & 3, MÖNCHEN 9O 3504221 POSTADRESSE: POSTFACH 95 O1 6O, D-8OOO MÖNCHEN 95 STOLLE RESEARCH AND DEVELOPMENT 7. Februar 1985 CORPORATION DEAA-32486.7 VERFAHREN ZUR PASSIVEN IMMUNISIERUNG VON SÄUGERN UNTER VERWENDUNG VON ANTIKÖRPERN VON GEFLÜGEL UND/ODER BOVIDEN UND ANTIKÖRPERGEMISCHE Patentansprüche

1. Verfahren zur passiven Immunisierung eines Säugers gegen eine durch ein Antigen verursachte Erkrankung, dadurch gekennzeichnet , daß man dem Sauger immunisierende Mengen eines Antikörpers verabreicht, der von einer Geflügelart gewonnen wurde, die gegen dieses Antigen immunisiert worden war, wobei der Sauger aufgrund der Aufnahme von einem aus dem Ei einer Geflügelart stammenden, Antikörper enthaltenden Material gegenüber diesem Antikörper tolerant ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet ,' daß der verabreichte Antikörper ein IgG-, IgA- oder IgM-Antikörper ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der verabreichte Antikörper ein

aus dem Ei der Geflügelart gewonnener gereinigter IgG-Antikörper ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der Empfängersauger täglich
über einen Zeitraum von 10 bis 14 Tagen bis zu mehreren Monaten ein Produkt der Geflügelart als Nahrung zu sich

5 genommen hat.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Verabreichung oral oder
durch parenterale Injektion erfolgt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß der Empfänger ein Mensch ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Antigen S. mutans ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der zu verabreichende Antikörper weitgehend gereinigt ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß der Antikörper aus dem Ei der
Geflügelart erhalten wird.

10. Verfahren zur passiven Immunisierung eines Säugers gegen eine durch ein Antigen verursachte Erkrankung , dadurch gekennzeichnet , daß man

a) den Sauger mit einem Stoff füttert, der einen erhöhten Antikörpertiter gegen das Antigen aufweist, erhalten aus dem Ei einer gegen das Antigen immuni-

sierten Geflügelart, bis der Sauger eine erhebliche Toleranz gegenüber dem Antikörper entwickelt, und

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekenn zeichnet , daß auf der Stufe a) der Sauger mit ganzen Eiern gefüttert wird.

12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekenn zeichnet , daß auf der Stufe a) der Sauger mit Eidotter gefüttert wird.

13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch g e k e η η zeichnet , daß auf der Stufe b) die Verabreichung durch eine Injektion erfolgt.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 10, dadurch gekennzeichnet , daß die durch das Antigen verursachte Erkrankung Zahnkaries ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 10, dadurch gekennzeichnet , daß die durch das Antigen verursachte Erkrankung Zahnplaques ist.

16. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß auf der Stufe a) die Eier einen erhöhten Antikörpertiter gegen eine Vielzahl von dieses Antigen umfassenden Antigenen ist.

17. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß auf der Stufe b) die Geflügel-

art dasselbe Individuum wie auf Stufe a) ist.

18. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß auf Stufe b) die Geflügelart ein anderes Individuum ist als das auf Stufe a) verwendete.

19. Verfahren nach Anspruch 1 oder 10, dadurch gekennzeichnet , daß der Begriff "Säuger" den Menschen nicht umfaßt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet , daß der Säuger ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Kaninchen, Boviden, Pferden, Ziegen, Schafen und Affen.

21. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß der Säuger ein Mensch ist.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 10, dadurch gekennzeichnet , daß das Antigen eine Bakterienart, das Produkt einer Bakterienart oder die Kombination von Bakterienarten ist.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 10, dadurch gekennzeichnet , daß das Antigen eine Virenart, das Produkt einer Virenart oder die Kombination von Virenarten ist.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 10, dadurch gekennzeichnet , daß das Antigen eine bioregulatorische Substanz ist.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet , daß die bioregulatorische Substanz

ein Hormon, Enzym oder ein immunregulatorischer Faktor

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein Polypeptid ist.

27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet , daß das Polypeptid ein Schlangenoder Bienengifttoxin ist.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 10, dadurch gekennzeichnet , daß die passive Immunisierung präventiv ist.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 10, dadurch gekennzeichnet , daß die passive Immunisierung palliativ ist.

30. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß auf der Stufe a) an den Sauger der Stoff zusammen mit einem Stoff verfüttert wird, der gegen das Antigen einen erhöhten Antikörpertiter aufweist und aus der Milch eines gegen das Antigen immunisierten Boviden gewonnen wurde.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 oder 30, dadurch gekennzeichnet , daß auf der Stufe b) der Antikörper dem Sauger zusammen mit dem aus der Milch eines gegen das Antigen immunisierten Boviden gewonnenen und gereinigten Antikörper verabreicht wird, und die Kombination von Antikörpern in einer immunologisch wirksamen Menge verabreicht wird.

32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet , daß die Verabreichung durch Injektion erfolgt.

33. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Geflügelart auf den Stufen

a) und b) ein Huhn ist.

34. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß auf der Stufe b) der Antikörper in gereinigter Form aus dem Ei der Geflügelart gewonnen wird.

35. Gemisch zur passiven heterologen Immunisierung eines Säugers gegen eine durch ein Antigen verursachte Erkrankung, dadurch gekennzeichnet , daß es

a) einen Stoff mit einem erhöhten Antikörpertiter gegen das Antigen aufweist, erhalten aus dem Ei einer gegen das Antigen immunisierten Geflügelart, und

b) einen Stoff enthält, der einen erhöhten Antikörpertiter gegen das Antigen aufweist, erhalten aus der Milch eines gegen das Antigen immunisierten Boviden.

36. Gemisch nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß die Geflügelart ein Huhn und der Vertreter der Boviden eine Kuh ist.

37. Gemisch nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß es die Stoffe aus dem Ei und der

Milch in dehydratisierter Form enthält.

38. Gemisch zur heterologen passiven Immunisierung eines Säugers gegen eine durch ein Antigen verursachte Erkrankung, dadurch gekennzeichnet , daß es eine wirksame Menge

5 a) eines aus einer gegen das Antigen immunisierten

Geflügelart gewonnenen gereinigten Antikörpers und

b) eines aus einem gegen das Antigen immunisierten Vertreter der Boviden gewonnenen gereinigten Antikörpers enthält.

39. Gemisch nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet , daß die Geflügelart ein Huhn und der Vertreter der Boviden eine Kuh ist.

40. Gemisch nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet , daß der Geflügelantikörper durch Reinigung aus dem Ei der Geflügelart gewonnen wird und der Bovidenantikorper durch Reinigung aus der Milch des Boviden gewonnen wird.

41. Verfahren zur passiven Immunisierung des Menschen oder eines Säugers, dadurch gekennzeichnet, daß man ein gereinigtes heterologes Antikörperprotein von natürlichem hohem Molekulargewicht, gewonnen aus dem Serum oder einem als Nahrungsmittel dienenden Produkt eines Boviden, der gegen eine Antigensubstanz immunisiert worden war, einem als Empfänger dienenden Menschen oder Säuger nach einem bestimmten Zeitraum der Aufnahme des Produktes des Boviden parenteral injiziert.

42. Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikörperprotein ein IgG-, IgA- oder IgM-Antikörper ist.

43. Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet , daß der injizierte Antikörper der aus dem Serum oder der Milch eines Boviden gewonnene IgG-Antikörper ist.

44. Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet , daß der als Empfänger in Frage kommende Mensch oder das Tier während 10 bis 14 Tagen bis zu mehreren Monaten täglich ein als Nahrungsmittel dienendes Produkt des domestizierten Boviden zu sich genommen hat.

45. Verfahren zur passiven Immunisierung des Menschen oder eines Säugers mit heterologen Antikörpern, dadurch gekennzeichnet , daß man einen heterologen |-Globulin IgG-Antikörper mit natürlichem hohem Molekulargewicht,erhalten aus dem Serum oder der Milch eines Boviden, der gegen eine Antigensubstanz immunisiert worden war, einem als Empfänger dienenden Menschen oder Säuger nach einem gewissen Zeitraum der Aufnahme von Bovidenmilch als Nahrungsquelle parenteral injiziert.

46. Verfahren nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet , daß der Rinder-Z^-globulin-IgG-Antikörper von einer Kuh gewonnen wird.

47. Verfahren nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet , daß die Antigensubstanz ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Pseudomonas aerugi-

nosa, Pseudomonas maltophiia, Streptococcus equisimili, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis. Streptococcus bovis, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, Moraxella bovis, Actinobacillus lignieresei, Corynebacterium renale, Fusobacterium necrophorum, Bacillus cerus, Salmonella dublin, Salmonella heidelberg, Salmonella paratyphi, Yersinia enterocolitica, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Aerobacter aerogenes, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium, Haemophilus influenzae, Streptococcus viridans, Proteus vulgaris, Shigella Dysenteriae, Streptococcus Gruppe B, Diploccocdus pneumoniae, Streptococcus mutans, corynebacterium, Acne, Typ 1 und 3, u.a., Neisseria gonorrhea, Mycobacterium tuberculosis, Haemophilus vaginalis, Gruppe b, Streptococcus ecoli, Microplasma homonis, Hemophilus ducreyi, Granulomi inguinale, Lymphopathia venerum, Treponema pallidum, Brucella melitensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella canis, Campylolacter fetus, Campylobacter fetus intestinalis, Leptospira pomona, Listeria monocytogenes, Bruceila, ovis, Chlamydia psittaci, Escherichia coli, Actinobacillus equuli, Salmonella abortus ovis, Salmonella abortus equi, Corynebacterium equi, Corynebacterium pyogenes, Actinobacillus seminis, Mycoplasma bovigenitalium, Clostridium tetani.

48. Verfahren nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigensubstanz ein polyvalenter Impfstoff aus mindestens zwei der Bakterienantigene ist.

49. Verfahren nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet , daß der Empfänger ein Mensch ist.

- ίο - !

50. Verfahren nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet , daß der Rinder-IgG-Antikörper durch intramuskuläre oder Intravenöse Injektion verabreicht !

wird. '.

51. Proteinantikörpergemisch zur parenteralen Verabreichung, dadurch gekennzeichnet , daß es einen heterologen Proteinantikörper von hohem Molekulargewicht, erhalten aus dem Serum oder einem als Nahrungsmittel dienenden Produkt eines Boviden, der gegen eine Antigensubstanz immunisiert worden war, in einer parenteral injizierbaren Vehikelflüssigkeit enthält, wobei der Antikörper beim Menschen oder beim Säuger, dem dieser verabreicht wurde, nicht zur Serumkrankheit oder zum anaphylaktischen Schock führt.

52. Gemisch nach Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet , daß der Antikörper aus dem Serum oder der Milch eines immunisierten Boviden gewonnen wird.

53. Gemisch nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet , daß der Antikörper ein IgG-Antikörper ist.

54. Verwendung eines Antikörpers gegen ein Antigen, erhalten aus Geflügeleiern und/oder Bovidenmilch, die gegen das Antigen immunisiert worden sind, zur passiven Immunisierung von Säugern.