DE2045160B2 - Verfahren zur Herstellung einer Lebendvaccine gegen die infektiöse Bursitis der Hühner - Google Patents

Verfahren zur Herstellung einer Lebendvaccine gegen die infektiöse Bursitis der Hühner

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Description

Das Infektiöse Bursitis-Virus wird zweckmäßig aus
der Bursa fabricii bursitiskranker Hühner isoliert, 55 B e i s ρ i e I 1
indem man die Bursa homogenisiert und das Homo-
genat zentrifugiert. Die daraus gewonnene virushaltige Aus der Bursa fabricii bursitisspezifisch erkrankter
Suspension wird Babymäusen int'aperitoneal injiziert, Hühner wurde ein Homogenat hergestellt und embryo-Es können auch eine oder mehrere Eipassagen da- nierte Hühnereier damit inokuliert. Ein Hühnerei, zwischengeschaltet werden. Die 1 bis 3 Tage alten 60 dessen Embryo am 4. Tag nach der Infektion gestorben Babymäuse erhalten jeweils eine Applikationsdosis von war, wurde geöffnet und der Embryo mit der ihn umetwa 0,05 ml der Virussuspension, deren Virus- gebenden Allantoamnionflüssigkeit entnommen, homokonzentration mindestens 102 Ei-ID50/ml beträgt. Eine genisiert und mit physiologischer Kochsalzlösung Ei-ID60 ist dabei definiert als diejenige Viruskonzen- extrahiert. Der Extrakt wurde 1 Stunde mit 10 Volumtration, die 50 % der infizierten Hühnerembryonen zum 65 prozent Chloroform geschüttelt und anschließend Absterben bringt oder virusspezifisch verändert. Eine 5 Minuten bei 3000 U/min zentrifugiert. Der virus-Mäuse-ID50 wird entsprechend definiert. haltige Extraktionsüberstand wurde in Dosen von
Nach der Infizierung erhalten die Babymäuse ein 0,05 ml intraperitoneal auf 2 Tage alte Babymäuse
3 4
verimpft (1. Babymauspassage). Der Virusgehali pro Schutzindex ist der Quotient aus Virustiter der Ver-
0,05 ml betrug 102·5 Ei-IDsp. Nach der Virusinfektion suchskontroJle und Virustiter des Virus-Antisemm-
erhielten die Babymäuse je 100 γ Prednisolonhemi- gemisches, z. B.
succinat (Na-SaIz) subcutan injiziert. 8 Tage nach der
Infektion der Tiere traten erste deutliche Lähmungs- 5
Symptome sowie Gleichgewichtsstörungen auf. Die Serum Schutzindex = 10~*'5/0'05 m l - ipä.i
Babymäuse wurden draufhin für die 2. Babymaus- 10-4·4/0,05 ml
passage getötet und mit physiologischer Kochsalzlösung zu einem 10%igen Extrakt homogenisiert.
Der Extrakt wurde 1 Stunde mit 10 Volumprozent io Bis zur 8. Woche nach der Impfung stieg der Serum-Chloroform geschüttelt und 5 Minuten bei 3000 U/min Schutzindex auf 103·s an und fiel dann bis zur 16. Woche zentrifugiert. Für die zweite Babymauspassage wurden nach der Impfung wieder auf 102·0 ab. Da SPF-Küken 1 Tag alte Babymäuse verwendet, die nach der vor einer Impfung einen Serum-Schutzindex gegen Infektion ebenfalls subcutan mit je 100 γ Piednisolon- Bursiiis von nahezu 10° haben, war für mindestens hemisuccinat (Na-SaIz) behandelt w urden. Nach dem 15 16 Wochen nach der .Impfung eine hohe Antikörper-Auftreten deutlicher Lähmungserscheinungen wurden entwicklung nachweisbar, die einen guten Infektionsdie Babymäuse abermals getötet und das Virus schutz anzeigte.
daraus — wie bei der ersten Babymauspassage In einem zweiten Versuch wurden 80 SPF-Küken beschrieben — füi die dritte Babymauspassage extra- im Alter von 12 Tagen mit je 105·8 Babymaus-IDso hiert. Die Passagen wurden fortgesetzt bis zur 12. Baby- ao Bursitis-Virus der 25. Babymauspassage über das mauspassage. Die 13. Babymauspassage wurde erst- Trinkwasser immunisiert. Klinische Impf reaktionen mais ohne nachfolgende Corticosteroid-Injektion auf traten auch bei diesen Impflingen nicht auf. Der 1 Tag alten Babymäusen durchgeführt. Die ersten Serum-Schutzindex der geimpften Küken (1:10 verspezifischen Krankheitserscheinungen traten hierbei dünntes Serum) betrug 2 Wochen nach der Immuniam 4. Tag nach der Infektion auf. Die Aufbereitung »5 sierung im Mittel 103·4, 4 Wochen nach der Impfung der getöteten Babymäuse, die Virusextraktion und lag der Wert bei 102·8. Beide Serum-Schutzindexdie Weiterführung der Mäusepassagen erfolgten in Bestimmungen wiesen auf eine gute Antikörperder beschriebenen Weise. entwicklung und somit auf einen ausreichenden Infek-
Zehn 2 Tage alte Babymäuse wurden mit je 0,05 ml tionsschutz hin.
der 20. Babymauspassage des Infektiösen Bursitis-Virus 30 Die beiden Untersuchungen zeigen, daß die er-
intraperitoneal infiziert, nach 5 Tagen, auf dem Höhe- findungsgemäß hergestellten Vaccinen wirksam und
punkt der Lähmungsphase, getötet und mit physiolo- unschädlich sind,
gischer Kochsalzlösung zu einem 20%igen Extrakt
homogenisiert. Der Extrakt wurde 1 Stunde mit Versuch 2
10 Volumprozent Chloroform geschüttelt und nach 35
18stündig<:r Lagerung bei 4-40C 3 Minuten lang bei Ausgehend von der 63. Eipassage eines nach her-3000 U/min zentrifugiert. 100 ml des virushaltigen kömmlichen Verfahren erhaltenen Infektiösen Bursitis-Überstandies wurden mit 50 ml der gemäß der deut- Virus wurde der Virusgehalt der 67. bis 73. Eipassage sehen Patentschrift 1118 792 hergestellten, einGelatine- mit dem Virusgehalt der 16. bis 22. Babymauspassage präparat enthaltenden Infusionslösung, gemischt, in 40 verglichen. Die Eipassagen wurden durch Beimpfung Portionen zu 5 ml abgefüllt und lyophilisiert. Der der Allantoishöhle von 6 Tage vorbebrütctcn Hühner-Virusgehalt der Trockenvaccine betrug nach Resus- eiern durchgeführt. Die am 3. bis 6. Tag nach Bepension und Verdünnung auf das Originalvolumen impfung abgestorbenen Embryonen wurden mit der 10'· * Babymaus-IDjo/ml. sie umgebenden Allantoisflüssigkeit homogenisiert.
45 Der Embryonalextrakt wurde 5 Minuten bei 3000 U/
Versuch 1 min zentrifugiert, der virushaltige Extraktionsüberstand diente jeweils als Infektionsmaterial für die
Die Unschädlichkeit und Wirksamkeit der er- folgende Passage. Der Virusgehalt wurde durch Verfindungsgcmäß durch Babymäusepassagen gewonnenen dünnung des Extraktionsüberstandes in Zehner-Infektiösen Bursitis-Vaccine wurde in zwei Versuchen 50 potenzen und Beimpfung von 6 Tage vorbebrüteten mit 8 und 12 Tage alten Küken nachgewiesen. Die Hühnereiern bestimmt. Die Beimpfungsdosis pro Ei Küken waren frei von spezifischen hühnerpathogenen betrug 0,1 ml. Die zwischen dem 2. und dem 12. Tag Erregern sowie deren Antikörper (SPF-Küken). nach der Infektion abgestorbenen sowie alle über-
Im ersten Versuch wurden 75 SPF-Küken im Alter lebenden, aber virusspezifische Veränderungen auf-
von 8 Tagen mit je 10Β·β Babymaus-ID50 Bursitis-Virus 55 weisenden Embryonen wurden nach einem statistischen
der 20. Babymauspassage über das Trinkwasser immu- Berechnungsverfahren für die Bestimmung des Virus-
nisiert. Klinisch erkennbare Impfreaktionen traten titers ausgewertet.
nicht in Erscheinung. 2 Wochen nach der Immuni- Die Babymauspassagen wurden nach der im Bei-
sierung betrug der durch Virusneutralisationsteste spiel 1 erläuterten Methode ohne Verwendung eines
ermittelte mittlere Schutzindex im 1:10 verdünnten 60 Corticosteroids ausgeführt. Für die Virustitrationen
Impflingsserum 102·1. wurden die Virusverdünnungen 1 bis 2 Tage alten
Bei dem Virusneutralisationstest wird die Anti- Babymäusen intraperitonal injiziert. Die innerhalb
körperkonzentration im Serum bestimmt, indem die von 21 Tagen nach der Infektion unter Lähmungs-Antikörper im Serum mit fallenden Viruskonzen- erscheinungen erkrankten Jungmäuse wurden als virusirationen neutralisiert werden und danach auf nicht- 65 infiziert gewertet.
neutralisiertes Virus an der Babymaus geprüft wird. In der folgenden Tabelle sind die Virustiter pro ml
Der 50-%-Endpunkt wird nach herkömmlichen stati- desunverdünntenEmbryonalextraktesunddes20%igen
stischen Berechnungsverfahren ermittelt. Der Serum- Babymaus-Extraktes einander gegenübergestellt:
V;rustiter/ml Mäuse- Virustiter/ra'
unverdünnter pac5age 20%iger
tipassage Embryonal- Babymaus-
Extrakt 16. Extrakt
67. 10-i.o 17. ίο-«.*
68. !0-4.5 18. 10-5.8
69. 10-4.8 19. 10-6.1
70. !0-5.0 20. 10-«.5
71. !0-S.3 21. ίο-7·1
72. ΙΟ-«.« 22. 10-e.s
73. 10-5.3 10-7.5
Diese Zahlen zeigen, daß die auf 20% verdünnten Babymausextrakte ein bis zwei Zehnerpotenzen mehr Virus enthalten als die unverdünnten Hühnerembryonalextrakte.
Beispiel 2
ao
Eine Probe der gemäß Beispiel 1 erhaltenen 12. Babymauspassage des Infektiösen Bursitis-Virus wurde gemäß Beispiel 1 zu einem 10%igen Extrakt aufgearbeitet und mit 10 Volumprozent Chloroform behandelt. Der so gewonnene virushaltige Babymausextrakt wurde sechs 2 Tage alten Mastomys natalensis in einer Dosis von je 0,05 ml intraperitoneal injiziert. Am 7. Tag nach der Infektion war ein Jungtier verendet, die übrigen fünf Jungtiere zeigten unterschiedlich ausgeprägte Lähmungserscheinungen. Nach Totung der gelähmten Tiere wurde von allen 6 Mastomys natalensis in der beschriebenen Weise ein 10%iger, mit Chloroform behandelter Extrakt hergestellt, der wiederum einem Wurf von fünf 2 Tage alten Mastomys natalensis in gleicher Weise appliziert wurde. Diesmal erkrankten die Jungtiere bereits am 6. Tag nach der Infektion. Im Verlauf der folgenden 5 Passagen in Mastomys natalensis-Babys verkürzte sich die Passagedauer auf durchschnittlich 5 Tage. Die stets auf die beschriebene Weise hergestellten 10%igen Extrakte der 1., 3., 5. und 7. Masiomys natalensis-Passage erbrachten folgende Virustiter, die aus Vergleichsgründen — wie im Beispiel 1 erläutert — an 1 bis 2 Tage alten Babymäusen ermittelt wurden:
1. Mastomys-Passage = 10-63ZmI,
3. Mastomys-Passage = 10~β·4/ΐη1,
5. Mastomys-Passage = ΙΟ"6·8, /ml
7. Mastomys-Passage = 10-e-e/ml.
Die Virustiter zeigen, daß die Babys von Mastomys natalensis in gleicher Wiese wie 3ibymäuse zur Gewinnung stark bursitisvirushaltiger Extrakte geeignet sind.
Versuch 3
55
Für die Prüfung auf Unschädlichkeit und Wirksamkeit der erfindungsgemäß durch Passagen in Babys von Mastomys natalensis gewonnenen Infektiösen Bursitis-Vaccine wurden 20 einwöchige SPF- So Küken mit je 105·5 Babymaus-ID50 der im Beispiel 2 genannten 7. Mastomys-Passage über das Trinkwasser geimpft. Zehn gleichaltrige Küken blieben als Kontrolltiere unbehandelt und wurden von den geimpften Tieren getrennt gehalten. Klinisch erkennbare Impfreaktionen oder Unverträglichkeitserscheinungen traten zu keinem Zeitpunkt nach der Impfung in Erscheinung. 3 Wochen nach der Impfung wurden die 20 geimpften sowie die 10 unbehandelten Küken entblutet. Die Einzelseren der Tiere wurden, entsprechend ihrer Gruppenzugehörigkeit., anteiigleich zu 2 Mischseren vereinigt. Beide Mischseren wurden nach einer 1:10-Verdünnung im Virusneutralisationstest, wie im Versuch 2 des Beispiels 1 beschrieben, auf Antikörper gegen Infektiöses Bursitis-Virus untersucht. Während das Impflings-Mischserum einen Schutzindex von 102·3 zeigte, betrug der Schutzindex der nicht geimpften Kontrollgruppe lediglich 10°·3.
Die Untersuchungen zeigen, daß auch die erfindungsgemäß von Babys der Mastomys natalensis gewonnene Vaccine für Küken unschädlich und wirksam ist.
Beispiel 3
Eine Probe des gemäß Beispiel 1 hergestellten Bursitisvirus enthaltenden Extraktionsüberstandes
wurde in Mengen von 0,05 ml intraperitoneal an 3 Tage alte Babys von Mastomys natalensis verimpft. Nach der Virusinfektion erhielten die Babys 10y 6-Mercaptopur in subcutan injiziert. 9 Tage nach der Infektion der Tiere traten erste Lähmungserscheinungen und Gleichgewichtsstörungen auf. Die Babys wurden daraufhin für die 2. Passage getötet und mit physiologischer Kochsalzlösung zu einem 10%igen Extrakt homogenisiert. Der Extrakt wurde — wie im Beispiel 1 angegeben — 1 Stunde mit 10 Volumprozent Chloroform geschüttelt und 5 Minuten bei 3000 U/min zentrifugiert. Für die 2. Passage wurden 3 Tage alte Babys von Mastomys natalensis verwendet, die nach der Infektion ebenfalls subcutan mit 1Oy 6-Mercaptopurin behandelt wurden. Nach dem Auftreten deutlicher Lähmungserscheinungen am 7. Tag nach der Infektion wurden die Tiere getötet und das Virus daraus für die 3. Passage extrahiert. Die Attenuierung wurde bis zur 14. Passage fortgesetzt. Die 15. bis 18. Passage wurde ohne Immunsupressivum vorgenommen. Durch Infektion von fünf 3 Tage alten Mastomys natalensis mit je 0,05 ml der 18. Passage wurde ein 20%iger Extrakt gewonnen, der 1 Stunde mit 10 Volumprozent Chloroform geschüttelt und nach 18stündiger Lagerung bei 40C 5 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert wurde. Der virushaltige Überstand wurde mit der Hälfte eines Volumens mit einer gemäß der deutschen Patentschrift 1118 792 hergestellten, ein Gelatinepräparat enthaltenden Infusionslösung vermischt, 112 gleichen Portionen abgefüllt und lyophil getrocknet. Der Virusgehalt betrug nach Resuspension und Verdünnung auf das Originalvolumen 10β·β Babymaus ID50/ml.
Wie dieses Beispiel zeigt, ist auch die Mastomys natalensis geeignet, nach Adaption das Bursitisvirus zu attenuieren.
Die Unschädlichkeit und Wirksamkeit der gemäß Beispiel 2 gewonnenen Bursitisvaccine wurde an 8 und 12 Tage alten Küken nachgewiesen.

Claims (12)

  1. Immunsuppressivum subcutan injiziert. Dadurch wer-
  2. Patentanspruch: den die Abwehrkraft der Tiere erniedrigt und die
  3. klinischen Erscheinungen der Infektion begünstigt.
  4. Verfahren zur Herstellung einer Lebendvaccine Geeignete Immunsuppressiva sind z. B. Corticosteroide gegen die Infektiöse Bursitis der Hühner, da- 5 wie Cortison, Hydrocortison, Prednison, Prednisolon, durch gekennzeichnet, daß man das 6-Methylprednisolon, Dexamethason und Parametha-Infektiöse Bursitis-Virus unter Verwendung von son sowie deren therapeutisch verwendete Ester ferner Immunsuppressiva durch Serienpassagen an Baby- Antinretaboliten wie 6-Mercaptopurin, alkylierende mause oder 1 bis 3 Tage alte Babys von Mastomys Agenzien wie Cyclophosphamid und schließlich Antinatalensis adaptiert und gleichzeitig attenuiert, das io lymphozytenserum und Antilymphozytenglobuhn. Die attenuierte Virus daraus extrahiert und auf be- Dosierung beträgt je nach der verwendeten Substanz kannte Weise zu einer Vaccine aufarbeitet. 50 bis 500 γ pro Babymaus; bei Corticosteroiden ver
  5. wendet man z. B. 100 bis 200y/Maus an.
    Nach einigen Tagen zeigen sich bei den infizierten
  6. 15 Tieren Lähmungen, in dieser Phase werden die Tiere
  7. getötet und mit physiologischer Kochsalzlösung zu einem 10- bis 20%igen Extrakt homogenisiert. Um
  8. Gegenstand der Anmeldung ist ein Verfahren zur Begleitproteine auszufällen, wird der Extrakt mit Herstellung einer Lebendvaccine gegen die Infektiöse einem geeigneten Fällungsmittel, beispielsweise HaIo-Bursitis der Hühner. ao genwasserstoffen, wie Chloroform etwa 1 Stunde lang
  9. Die Infektiöse Bursitis ist eine auf der ganzen Welt geschüttelt und etwa 18 bis 24 Stunden bei etwa +4C C verbreitete Hühnerkrankheit, die vor allem junge Tiere gelagert. Danach werden die gefällten Begleitproieine in der 2. bis 6. Lebenswoche befällt. Die tiere leiden durch Zentrifugation entfernt Der virushaltige Uberan Durchfällen, zeigen Blutungen in der Muskulatur stand wird für die folgende Mäusepassage verwendet, und blutignekrotisierende Entzündungen der Bursa as Die Zeit zwischen der Infizierung und dem Auftreten fabricii, eines Anhangorgans des Enddarmes. Sie gehen der Lähmungen verkürzt sich mit steigender Passagenentweder ein oder weisen verzögertes Wachstum und zahl von anfangs etwa 8 bis auf 4 bis 6 Tage. Wenn ungenügende Futterverwertung auf. Der wirtschaftliche eine weitere Verkürzung auch durch Fortsetzung der Schaden ist vor allem bei dem kurzlebigen Mast- Passagen nicht mehr erreicht werden kann, ist das geflügel groß. 30 Virus vollständig an Babymäuse adaptiert. Nach etwa
  10. Es ist schon versucht worden, eine Vaccine gegen 18 bis 25 Mäusepassagen ist das Infektiöse Bursitisdie Infektiöse Bursitis durch Passagen in embryonierten Virus für Hühner jeden Alters attenuiert.
    Hühnereiern herzustellen. Dies erwies sich jedoch als Das Immunsuppressivum-Präparat wird den Tieren
  11. schwierig, da das Bursitis-Virus häufig nach 3 bis bis etwa zur 10. bis
  12. 12. Mäusepassage injiziert. Danach 4 Passagen in der Eikultur nicht mehr vermehrt werden 35 ist eine Applikation von Immunsuppressiva nicht mehr kann. Gelingt in Einzelfällen die Passierung, so ist der notwendig.
    Virusgehalt niedrig und die Virussuspension für die Für die Herstellung der Vaccine wird der von
    Herstellung einer Vaccine schlecht geeignet. Begleitproteinen befreite Mäuseextrakt mit einem
    Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren Schutzkolloid versetzt, z. B. mit entrahmter Milch zur Herstellung einer Lebendvaccine gegen die Infek- 40 oder der im Handel unter dem geschützten Warentiöse Bursitis der Hühner, das dadurch gekennzeichnet zeichen Haemaccel«*) erhältlichen, gemäß deutscher ist, daß man das Infektiöse Bursitis-Virus unter Ver- Patentschrift 1 118 792 hergestellten Infusionslösung, wendung von Immunsuppressiva durch Serienpassagen die ein Gelatinederivat enthält. Die Konzentration an Babymäuse — oder 1 bis 3 Tage alte Babys von des Schutzkolloids ist je nach der verwendeten Substanz Mastomys natalensis — adaptiert und gleichzeitig 45 verschieden und ließt vorzugsweise bei 1,0 bis 5,0%. attenuiert, das attenuierte Virus daraus extrahiert Die das Schutzkolloid enthaltende Virussuspension und auf bekannte Weise zu einer Vaccine aufarbeitet. wird anschließend lyophilisiert. Die Trocken vaccine Die Zahl der Serienpassagen beträgt etwa 18 bis 25. enthält pro Impfdosis 103-5 bis 10e·5 Mäuse-ID^ Vorzugsweise verwendet man 1 bis 3 Tage alte Baby- Infektiöses Bursitis-Virus und wird für die Immunimäuse der weißen Maus oder der Mastomys natalensis 50 sierung der Hühner im Trinkwasser aufgelöst. Um eine und tötet die infizierten Tiere für die Extraktion in schnellere Trinkwasseraufnahme zu erreichen, läßt moribundem Zustand bzw. arbeitet sie unmittelbar man die Hühner vor der Vaccination zweckmäßigernach dem Verenden auf. weise 1 bis 2 Stunden dursten.
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