DE60128264T2 - Verfahren und impstoffe für in ovo schutz gegen truthahn-rhinotracheitis - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung bezieht sich auf brauchbare Methoden zur Erzeugung eines in-ovo-Schutzes gegen Truthahn-Rhinotracheitis (TRT) und/oder Syndrom des geschwollenen Kopfes („Swollen Head Syndrome" – SHS) in Vogelwirten wie Truthähnen und Hühnern. Insbesondere erwiesen sich Impfstoffe gegen TRT als sicher und wirksam nach geeigneter in-ovo-Verabreichung bei Vogelwirten, wie hier beschrieben werden wird.
  • Hintergrund der Erfindung
  • TRT ist eine Infektion der oberen Atemwege bei Truthähnen, die durch ein Pneumovirus verursacht wird. Es ist eine hoch ansteckende akute Erkrankung, die Truthähne aller Alterstufen befällt. Die klinischen Symptome der TRT-Infektion bestehen in einem ausgeprägten, häufig schaumigen Nasenausfluss, Röcheln, Zucken, Niesen und Kopfschütteln. Augenausfluss oder geschwollene infraorbitale Nebenhöhlen können bei infizierten Truthähnen ebenfalls beobachtet werden.
  • Antikörper gegen das TRT-Virus (TRTV) wurden in einigen Hühnerscharen (sowohl Hähnchen als auch Hähnchen/Brütern), die das geschwollene Kopfsyndrom (SHS) aufwiesen, entdeckt. Man nimmt an, dass das TRTV in der Ätiologie des SHS und dem damit verbundenen Lungenversagen eine Rolle spielt.
  • Ricks C. et al., (1999) Advances in Veterinary Medicine [Fortschritte der Veterinärmedizin], Bd. 41, S. 495-515, legen eine in-ovo-Impftechnologie offen. Das Dokument WO 99/53950 legt einen TRT-Impfstoff offen, der Interferon enthält.
  • Kommerziell erhältliche Impfstoffe gegen TRT werden nicht in-ovo verabreicht. Sie werden vielmehr nach dem Schlupf in vielfältigen Formaten verabreicht. Typischerweise werden solche Impfstoffe durch arbeitsintensive Sprühmethoden verabreicht (z. B. mittels Handspray, Rucksackspray oder automatisierter Sprühvorrichtung) oder in Form von (Augen- oder Nasen-) Tropfen.
  • Wie nachstehend ausführlich erklärt werden wird, bieten die in-ovo-Verabreichungsmethoden, die für die in-ovo-Anwendung modifizierte TRT-Impfstoffe verwenden, charakteristische Vorteile gegenüber den gegenwärtig verfügbaren unpraktischen und zeitraubenden Verabreichungsrouten nach dem Schlupf.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Vorliegende Erfindung verwendet kommerziell erhältliche TRT-Impfstoffe, die für die in-ovo-Methoden der erfindungsgemäßen Verabreichung adaptiert worden sind. Experimentelle Resultate beweisen die Sicherheit und Wirksamkeit der in-ovo-Verabreichung dieser Impfstoffe bei Truthähnen und Hühnern unter Anwendung geeigneter Dosierungsparameter.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren können angewendet werden, um einen Vogelwirt gegen TRT und/oder mit TRT oder SHS verbundenes Lungenversagen durch In-ovo-Verabreichung solcher Impfstoffe zu schützen.
  • Ein Ziel dieser Erfindung besteht somit darin, ein Verfahren zum Schützen von Vogelwirten gegen TRT und/oder mit TRT oder SHS verbundenes Lungenversagen vorzuschlagen, unter Anwendung von in-ovo-Impfungstechniken, die bei großen Vogelpopulationen einfacher und kostengünstiger anzuwenden sind.
  • Ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht darin, eine solche in-ovo-Impfung vorzuschlagen, die Impfstoffe in Dosierungen anwendet, die eine geeignete immunologische Antwort bei geschlüpften Vogelwirten bewirken, ohne die Schlupfraten negativ zu beeinflussen.
  • Noch ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht darin, einen Schutz gegen das mit SHS verbundene Lungenversagen zu bieten unter Verwendung von für die in-ovo-Verabreichung adaptierten TRT-Impfstoffen.
  • Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zur Impfung von Vogelwirten gegen TRT und/oder das mit TRT oder SHS verbundene Lungenversagen anzubieten, das erhöhte Titer gegen das TRTV auslöst, verglichen mit auf herkömmliche Weise geimpftem Geflügel, unter Verwendung von geringeren Mengen des Impfstoffantigens, woraus sich eine Kostenersparnis ergibt.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Vorliegende Erfindung schlägt ein Verfahren zur Immunisierung in-ovo von Vogelwirten gegen das TRTV und dadurch Erzeugung eines Schutzes gegen TRT und/oder mit TRT und SHS verbundenes Lungenversagen vor. Die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Impfstoffe können vorteilhaft aus kommerziell erhältlichen TRT-Impfstoffen zubereitet werden. Besonders geeignet für die erfindungsgemäße Verwendung ist der kommerziell erhältliche Poulvac® TRT-Impfstoff von Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, Iowa oder Weesp, Niederlande. Die kommerzielle Formulierung des Poulvac® TRT enthält den attenuierten Stamm K des TRTV mit einem Titer von wenigstens 103.2 TCID50 pro Dosis und ist für die in-ovo-Verabreichung nicht zugelassen oder indiziert. In dieser gesamten Anmeldung bezieht sich „TCID50" auf eine 50% infektiöse Gewebekulturdosis.
  • Der Impfstoff wird in einem geeigneten Arzneistoffträger resuspendiert, um eine TCID50 im Bereich von 103.2 bis 104.5 zu erhalten, und wird in einer Menge von etwa 0,05 bis 0,1 ml pro Ei, je nach der zu immunisierenden Vogelart, verabreicht. Die Verabreichung kann von Hand erfolgen, wird aber auf typischere und ökonomischere Weise unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen Ei-Injektionsausrüstung wie der von Embrex, Inc., North Carolina, erhältlichen durchgeführt. Die exakte zu verabreichende Dosierung hängt von der Vogelart ab, bei der der Impfstoff appliziert werden soll, z. B. erfordern kleinere Vögel kleinere Dosen. Die Verabreichung des Impfstoffs erfolgt am oder vor dem Tag 24 der Inkubation (z. B. bei Truthähnen) oder am oder vor dem Tag 18 der Inkubation (z. B. bei Hühnern).
  • Vogelwirte, für die die Impfstoffe und Verfahren der vorliegenden Erfindung bestimmt sind, umfassen Hühner, Enten, Truthähne, Gänse, Bantamhühner, Wachteln und Tauben. Bevorzugte Vogelarten sind die kommerziell wichtigen Geflügelsorten wie Hühner, Enten und Truthähne.
  • Überraschenderweise wurde herausgefunden, dass nicht nur die in-ovo-Impfungsmethode sicher und leichter zu verabreichen ist, sondern dass auch bei Vogelwirten, die auf diese Weise immunisiert worden sind, höhere Titer gefunden werden.
  • Außerdem führen Impfstoff und Verabreichungsmethode im Wesentlichen zu keiner Senkung des Prozentsatzes von Eiern, die nach der in-ovo-Impfung schlüpfen, verglichen mit einer im Wesentlichen identischen (nicht geimpften) Kontrollgruppe. Vorzugsweise ist diese Senkung geringer als etwa 10%, und bevorzugter geringer als etwa 5% relativ zum Prozentsatz, der in der Kontrollgruppe schlüpft. Noch wünschenswerter ist eine Senkung von weniger als etwa 1 bis 2%. Bei manchen Ausführungen können Impfstoff und Methode der Erfindung tatsächlich den Prozentsatz von Eiern, die ausschlüpfen, steigern, manchmal um bis zu etwa 1 bis 2% oder sogar mehr. Somit ist der Impfstoff sowohl sicher als auch wirksam für die Verabreichung an Vogelarten wie Hühnern und Truthähnen.
  • Die folgenden Beispiele beschreiben im Detail die für die Erfindung beispielhaften Methoden und Techniken.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1-Sicherheitsstudie für die in-ovo-Verabreichung an Truthähnen. Fertile Truthahneier zum Ausschlüpfen wurden von Elterntruthahnscharen erhalten, von denen bekannt war, dass sie TRTV-frei und zuvor nicht gegen TRT geimpft waren. Diese Eier wurden beliebig 2 verschiedenen Gruppen zugeteilt.
  • Der ersten Gruppe von 76 fertilen Eiern wurde der Impfstoff in-ovo am Tag 24 der Inkubation verabreicht. Der erste Tag der Inkubation zählt als Tag 0. Die Eier waren etwa 2 bis 7 Tage vor der Inkubation gelegt worden. Poulvac® TRT (Charge TR015, Ablauftermin am 24. Juni 1997, einen Titer von 107.5 TCID50 enthaltend) wurde verwendet, um den in-ovo-Impfstoff zuzubereiten. Drei Glasfläschchen des kommerziellen Produkts wurden ein jedes in 10 ml steriler Salzlösung resuspendiert, um eine resultierende Suspension zu erhalten, die einen Titer von 105.5 TCID50 des Impfstoffs pro 0,1 ml aufwies. Diese Inhalte wurden gut vermischt und vereint. Die vermischten/vereinten Inhalte werden nachstehend in Beispiel 1 mit „IOV" neu bezeichnet.
  • Die in-ovo-Verabreichung verwendete 0,1 ml des IOV pro Ei, der einen Titer von 105.5 TCID50 enthielt und in das amniotische Fluid eines jeden der 76 fertilen Eier injiziert wurde. Danach wurden die Eier sofort in einen Inkubator platziert (ohne umzudrehen) und man ließ sie in dem Isolierungspferch, in den sie untergebracht wurden, ausschlüpfen. Diese Eier/Küken werden als die geimpften Vögel bezeichnet.
  • Eine zweite Gruppe von 66 fertilen Eiern wurde nicht geimpft und man ließ sie unter ähnlichen Bedingungen in einem zweiten Isolierungspferch ausschlüpfen. Diese Eier/Küken werden als die negativen Kontrollvögel bezeichnet.
  • Bei den geimpften und den negativen Kontrollvögeln wurde das Ausschlüpfen am Tag 27, 28 und 29 der Inkubation aufgezeichnet. Tabelle 1 stellt die experimentell beobachteten Prozentsätze der Schlupffähigkeit dar. In Bezug auf die Schlupffähigkeit führte die erfindungsgemäße in-ovo-Impfung zu ausgezeichneten Resultaten mit einer Ausschlupfrate von 93,4% der geimpften Eier gegenüber einer Ausschlupfrate von 92,4% der negativen Kontrolleier. Tabelle 1: Prozentsätze der Schlupffähigkeit
    Vögel Tag 27 Tag 28 Tag 29 Gesamt
    Geimpft 19,7 % 73,7 % 0 % 93,4 %
    Negative Kontrolle 28,8 % 63,6 % 0 % 92,4 %
  • Nach dem Ausschlüpfen wurden 25 Küken aus jeder Gruppe (d. h. der geimpften Vögel und der negativen Kontrollvögel) beliebig ausgewählt und auf den Boden eines jeden der jeweiligen Isolierungspferche auf Späne gesetzt.
  • Die verbleibenden Vögel aus jeder Gruppe wurden getötet.
  • Innerhalb jeder Gruppe wurde jeder Vogel täglich während eines Zeitraums von 21 Tagen auf klinische Zeichen hin untersucht. Das Vorliegen eines nasalen Exsudats wurde durch Pressen des Schnabels bestimmt. Die Schwere der klinischen Erkrankung wurde nach Tabelle 2 bewertet. Tabelle 2: Klinisches Bewertungssystem
    Bewertung Experimentell beobachtete Symptome
    0 Keine
    1 Klares Nasenexsudat
    2 Trübes Nasenexsudat
    3 Geschwollene infraorbitale Nebenhöhlen oder schaumige Augen und 1 oder 2
  • Die tägliche Gesamtbewertung einer Gruppe von Vögeln wurde errechnet durch Summieren der einzelnen Bewertungen eines jeden Vogels an diesem Tag. Tabelle 3 stellt die experimentell beobachteten klinischen Zeichen unter Anwendung des jeweiligen Bewertungssystems der Tabelle 2 dar. Tabelle 3: Klinische Untersuchungsergebnisse der geimpften Vögel
    Vogel # Alter in Tagen des untersuchten Vogels
    3 4 5 6 7 8 9 10 11
    76 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    77 0 0 1 1 0 0 0 0 0
    78 0 0 1 0 2 0 0 0 0
    79 0 0 0 2 0 0 0 0 0
    80 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    81 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    82 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    83 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    84 0 0 0 0 0 0 0 1 0
    85 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    86 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    87 0 0 0 2 1 2 0 0 0
    88 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    89 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    90 0 2 2 2 2 0 0 0 0
    91 0 0 0 1 2 2 2 0 0
    92 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    93 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    94 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    95 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    96 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    97 0 0 0 1 0 0 0 0 0
    98 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    99 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    100 0 0 0 0 0 0 2 0 0
    Gesamt 0 2 4 9 7 4 4 1 0
    Mittlere Bewertung/Vogel 0 0,08 0,16 0,36 0,28 0,16 0,16 0,04 0
    # Positiv 0 1 3 6 4 2 2 1 0
  • Die negativen Kontrollvögel wurden auf ähnliche Weise auf irgendwelche klinische Zeichen hin untersucht und es wurden keine Anomalien beobachtet, d. h. alle bekamen die Bewertung null.
  • Die Resultate oben erwähnter Beobachtungen beweisen die Sicherheit der erfindungsgemäßen in-ovo-Impfungsmethoden. Die höchste durchschnittliche Bewertung pro Vogel (d. h. 0,36) 6 Tage alter Vögel lieferte eine adäquate Sicherheitsmarge und wies auf lediglich leichte/milde TRT-Symptome hin.
  • Eine serologische Analyse wurde auch durch Blutentnahmen durchgeführt, indem von 10 Vögeln innerhalb der Elterntruthahnschar 6½ Wochen nach dem Ankunftstag der Eier Blut entnommen wurde. Blut wurde auch folgenden 4 Vogelgruppen entnommen: (a) im Alter von 1 Tag 20 negativen Kontrollvögeln; (b) im Alter von 21 Tagen 21 negativen Kontrollvögeln; (c) im Alter von 1 Tag 20 geimpften Vögeln und (d) im Alter von 21 Tagen 20 geimpften Vögeln.
  • Die serologische Analyse der einzelnen Blutproben zeigten Titer von Antikörpern gegen das TRTV an. Diese Analyse erfolgte mittels Enzym-Immun-Assay-Technik (ELISA), die ein A-Typ-Antigen verwendet und 2log-Titer ausdrückte.
  • Experimentell gemessene Titer von 2log-Titer ≥ 6,0 wurden als positiv angesehen. Das geometrische Mittel (GM) und die Standardabweichung (SA) für die experimentell gemessenen Titer wurden auch errechnet. Die Titeranalyse führte zu folgenden Resultaten. Die Elterntruthahnschar war TRTV-frei [siehe GM = 5,04 im Vergleich zum positiven Cut-off-Wert ≥ 6,0]. Von den 10 Vögeln hatte ein Vogel einen erhöhten Titer von 7,7. Ferner waren die GM-Titer der 1 Tage alten negativen Kontrollvögel und der geimpften Vögel fast identisch, d. h. jeweils 4,05 und 4,06. Jedoch hatten zwei Vögel unter den geimpften Vögeln positive Titer [siehe die Titerwerte von 7,1 und 8,1, also jeder ≥ 6,0]. Im Gegensatz dazu hatte kein Vogel der negativen Kontrollvögel Titer von ≥ 6,0. Die SA der negativen Kontrollvögel und geimpften Vögel betrug jeweils 0,82 und 1,46.
  • Die 21 Tage alten Blutprobentests bewiesen ebenfalls deutliche Unterschiede bei den experimentell gemessenen Titern. Bei den negativen Kontrollvögeln sank das GM auf 3,53 und die SA auf 0,46. In direktem Gegensatz dazu stieg bei den geimpften Vögeln das GM auf 10,53 und die SA auf 0,85 an. Dementsprechend wiesen die geimpften Vögel stark erhöhte Titer gegen das TRTV auf.
  • Bei den geimpften Vögeln war die serologische Antwort im Alter von 21 Tagen sehr hoch. Diese Antwort war sogar höher als diejenige, die typischerweise bei Anwendung derselben Dosis (mittels Augentropfenimpfung) bei 1 Tag alten Vögeln vorgefunden wird. TRTV-Antikörpertiter, die ein GM = 10,5 aufweisen, werden normalerweise nur nach einer Infizierung mit einem virulenten TRTV-Stamm beobachtet. Zum Vergleich ergaben zwei Versuche, die Augentropfenimpfungen mit 105.5 TCID50 Poulvac® TRT an empfänglichen Truthahnküken (im Alter von 1 Tag) anwendeten, durchschnittliche Antikörpertiter von jeweils 8,3 und 8,7 bei Blutproben, die im Alter von 21 Tagen entnommen wurden.
  • Tabelle 4 stellt die Daten dar, die dieses serologische Testen der Elterntruthahnschar, der negativen Kontrollvögel und der geimpften Vögel bestätigen. Tabelle 4: TRTV-Titer
    Elternschar Negative Kontrollvögel Geimpfte Vögel
    6½ Wochen 1 Tag alt 21 Tage alt 1 Tag alt 21 Tage alt
    3,7 3,0 3,8 5,6 11,4
    5,5 3,0 3,7 3,9 10,4
    4,7 4,5 3,8 4,9 9,5
    5,9 4,3 3,0 3,4 11,6
    7,7 3,0 3,0 4,0 9,3
    5,6 4,8 3,4 3,0 9,9
    5,4 4,2 3,6 3,0 11,8
    3,7 4,7 3,6 3,0 11,1
    5,2 3,9 4,2 3,0 11,0
    3,0 3,0 4,5 7,1 9,7
    4,7 4,3 5,2 11,1
    5,0 3,2 3,9 9,1
    3,0 3,9 4,4 11,3
    4,8 3,0 3,0 10,6
    3,3 3,8 8,1 11,5
    5,1 3,5 3,3 11,2
    4,5 3,0 3,0 10,5
    4,1 3,0 3,0 10,0
    5,1 3,5 3,0 9,9
    3,0 3,3 3,5 9,6
    3,0
    GM 5,04 4,05 3,53 4,06 10,53
    SA 1,35 0,82 0,46 1,46 0,85
  • So bietet die in-ovo-Verabreichung (am Tag 24 der Inkubation) mit einem erfindungsgemäßen IOV mit 105.5 TCID50 an fertile Truthahneier die erforderliche Sicherheit im Hinblick sowohl auf Schlupffähigkeit als auch auf klinische Zeichen, ebenso wie eine erhöhte Immunantwort gegenüber auf herkömmliche Weise verabreichter Impfstoffe.
  • Beispiel 2: Sicherheitsstudie für die in-ovo-Verabreichung bei Hühnern
  • Spezifische pathogenfreie (nachstehend „SPF" genannte) weiße Leghom-Eier wurden von einer kommerziellen Quelle bezogen (Broekman Instituut BV, Someren, Niederlande). 120 SPF-Eier wurden in einen Inkubator gelegt und nach 18 Tagen Inkubation wurden die Eier durchleuchtet. Dies ergab 5 nicht befruchtete Eier, die verworfen wurden, und 115 befruchtete Eier, die angenommen wurden. Von den 115 angenommenen Eiern wurden 100 beliebig für die in-ovo-Impfung ausgewählt. Diese 100 Eier wurden wie folgt in drei Gruppen aufgeteilt:
    Die Eier/Küken der Gruppe 1 wurden zur Identifikation mit einer orangefarbenen, mit einer Zahl versehenen Flügelmarke gekennzeichnet. Die Gruppe 1 bestand aus 30 Eiern, die wie unten beschrieben einen in-ovo-Impfstoff mit einer pro Ei errechneten Dosis mit einem Titer von 105.5 TCID50 erhielten.
  • Die Eier/Küken der Gruppe 2 wurden zur Identifikation mit einer grünen, mit einer Zahl versehenen Flügelmarke gekennzeichnet. Die Gruppe 2 bestand aus 40 Eiern, die wie unten beschrieben eine in-ovo-Salzlösung gleichen Volumens wie das des den Eiern der Gruppe 1 injizierten Impfstoffs erhielten.
  • Die Eier/Küken der Gruppe 3 wurden nicht gekennzeichnet. Die Gruppe 3 bestand aus 30 Eiern, die keine in-ovo-Verabreichung (weder des Impfstoffs noch der Salzlösung) erhielten.
  • Die Zahl auf den Flügelmarken wurde nur verwandt, wenn das Küken klinische Zeichen entweder von TRT oder SHS aufwies.
  • Die Hühner sowohl der Gruppe 1 als auch der Gruppe 2 wurden in demselben Tierraum untergebracht, in dem sie ausschlüpften. Geeignete Bedingungen (z. B. Futter, Trinkwasser, Holzspäne als Material zum Lagern, Temperaturen, relative Feuchtigkeiten usw.) wurden aufrechterhalten.
  • Der Zeitplan für dieses Experiment war Folgender: Der erste Tag der Inkubation der Eier der Gruppen 1, 2 und 3 wurde als der Tag 0 der Inkubation angesehen. Der Tag, an dem den Eiern der Gruppe 1 und Gruppe 2 jeweils ein Impfstoff und eine Salzlösung in-ovo verabreicht wurde, war der Tag 18 der Inkubation. Das errechnete Schlupfdatum entsprach dem Tag 21 der Inkubation. Die Studie wurde an dem Tag nach dem Schlupf abgeschlossen, der dem Tag 46 der Inkubation entsprach.
  • Um den Impfstoff für die in-ovo-Verabreichung zuzubereiten, wurde ein kommerziell erhältlicher Impfstoff verwendet, der Poulvac® TRT, der 2000 Dosen pro Glasfläschchen enthielt und von Fort Dodge Animal Health in Fort Dodge, Iowa oder Weesp, Niederlande, bezogen wurde. Pro Dosis wies dieser Impfstoff einen Titer von 104.2 TCID50 auf. Zwölf (12) Glasfläschchen dieses Impfstoffs wurden in phosphatgepufferter Salzlösung (nachstehend „PBS" genannt) unter Verwendung von 5 ml PBS pro Glasfläschchen des Impfstoffs resuspendiert. Die resultierenden Inhalte wurden gut vermischt und vereint. Das resuspendierte Material hatte einen errechneten Titer von 105.5 TCID50 und ein Gesamtvolumen von 60 ml. Dieser Impfstoff wird nachstehend „IOV" genannt.
  • Am Tag 18 der Inkubation wurde der IOV-Impfstoff mittels Injektion unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen Inovoject® Ei-Injektionsmaschine von Embrex, Inc., North Carolina, den Eiern der Gruppe 1 in-ovo verabreicht. Die Verabreichung des IOV durch Ei-Injektion wurde nach Standardverfahren durchgeführt. Auf ähnliche Weise wurde eine kommerziell erhältliche Salzlösung, CLEAR-FLEX® INFUSIEVLOESISTOF, von Bieffle Medital SpA, Italien, den Eiern der Gruppe 2 verabreicht.
  • Tabelle 5 zeigt die Behandlung der Eier innerhalb der Gruppen 1, 2 und 3. Tabelle 5: Behandlung der Eier
    Gruppe # # Eier/Gruppe errechnete Dose pro Ei
    1 30 105.5 TCID50 Impfstoff
    2 40 Nur Salzlösung
    3 50 Keine Behandlung
  • Die Prozentsätze der Schlupffähigkeit der Eier der Gruppen 1, 2 und 3 wurden experimentell beobachtet und errechnet. Kurz zusammen gefasst wurden folgende Ausnahmen festgestellt: Wegen Skelettanomalien einer Spina bifida (die nicht irgendeiner schädlichen Wirkung der in-ovo-Impfung zuzuschreiben war) wurden zwei Küken aus der Gruppe 1 aus der Studie direkt nach dem Ausschlüpfen und vor Kennzeichnung mit einer identifizierenden Flügelmarke entfernt. Diese beiden Küken wurden aus den errechneten Schlupffähigkeitsprozentsätzen der Gruppe 1 ausgeschlossen. Auch wurde ein Küken aus der Gruppe 1 an den Zehen verletzt und aus der Studie entfernt, nachdem es gekennzeichnet worden war. Die post-mortem Untersuchung dieses Kükens ergab keine Zeichen von TRT oder irgendeiner anderen Krankheit oder anderer Störungen. Dieses eine Küken wurde auf dieselbe Weise aus den errechneten Schlupffähigkeitsprozentsätzen der Gruppe 1 ausgeschlossen. Was die Eier/Küken der Gruppe 2 anbetraf, starb ein Küken, nachdem es ausgeschlüpft, aber bevor es mit einer identifizierenden Flügelmarke gekennzeichnet worden war. Dieses Küken wurde auf dieselbe Weise aus den errechneten Schlupffähigkeitsprozentsätzen der Gruppe 2 ausgeschlossen.
  • Wie geplant wurden die Küken beider Gruppen 1 und 2 während einer 25-tägigen Beobachtungsperiode studiert und untersucht. Während dieser Periode zeigte keines der Küken klinische Zeichen von TRT oder SHS. Alle 30 Eier der Gruppe 3 schlüpften aus. Am Tag des Schlüpfens wurden alle 30 Küken enthauptet zur Blutprobenentnahme und nachfolgenden Analyse, wie später beschrieben werden wird.
  • Tabelle 6 stellt die experimentell beobachteten Schlupffähigkeits- und Sterblichkeitsresultate für jede der Gruppen 1, 2 und 3 dar. Diese Resultate bewiesen, dass die erfindungsgemäße in-ovo-Impfung in Bezug sowohl auf die Schlupffähigkeit als auch auf die klinischen Zeichen von TRT und/oder SHS sicher ist. Tabelle 6: Schlupffähigkeits-/Sterblichkeitsresultate
    Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3
    (orangefarbene Flügelmarke) (grüne Flügelmarke) (ohne Flügelmarke)
    Impfstoff Salzlösung Keine Behandlung
    Inkubiert 30 40 30
    Geimpft 30 40 0
    Geschlüpft 28 40 30
    Prozentsatz der Eier:
    Geimpft 100 100 0
    Geschlüpft 93,3 100 100
  • Die Körpergewichte der Küken der Gruppe 1 (Impfstoff) und Gruppe 2 (Salzlösung) wurden am Tag 25 bestimmt. Das mittlere Körpergewicht der Küken der Gruppe 1 betrug 209 g mit einer Standardabweichung von 22,1. Bei den Küken der Gruppe 2 betrug das mittlere Körpergewicht 217 g mit einer Standardabweichung von 24,8. Die Körpergewichte in den Gruppen 1 und 2 unterschieden sich nicht auf signifikante Weise, was statistisch bestimmt wurde durch einen 2-seitigen T-Test mit P = 0,18). Diese Resultate bewiesen, dass die erfindungsgemäße in-ovo-Impfung das Körpergewicht, das am Tag 25 erreicht war (und kommerziell wichtig ist), nicht gefährdete im Vergleich zu dem mit einer in-ovo-Injektion einer physiologischen Salzlösung erreichten.
  • Um den TRT-freien Status der SPF-Eier, die in den Gruppen 1, 2 und 3 verwendet wurden, am Tag, als die Eier der Gruppe 3 ausschlüpften, zu bestätigen, wurden die Küken durch Enthauptung getötet und es wurden Blutproben entnommen und analysiert: Das ELISA Testen entdeckte keinen Antikörper gegen das TRTV, wodurch der TRT-freie Status der in dieser Studie verwendeten SPF-Eier bestätigt wurde.
  • Diese Studie bewies, dass die in-ovo-Impfung von SPF Hühnereiern sicher war im Hinblick sowohl auf Schlupffähigkeit, Sterblichkeit, klinische Zeichen von TRT und/oder SHS, als auch auf das Körpergewicht am Tag 25.
  • Beispiel 3: Wirksamkeitsstudie für in-ovo-Impfstoffe für SPF-Hühner.
  • Das Ziel dieser Studie bestand darin, sicher zu stellen, ob die in-ovo-Impfung von 18 Tage alten Hühnerembryos zur Verhütung einer TRT- und/oder SHS-Erkrankung nach virulenter Infizierung im Alter von 3 oder 6 Wochen wirksam ist. Wie nachstehend bewiesen wird, ist die in-ovo-Impfung von empfänglichen 18 Tage alten fertilen SPF-Hühnereiern mit der Dosis von 104.2 TCID50 sicher, während die Dosis von 103.2 TCID50 gegen klinische Erkrankung wirksam ist.
  • Fertile Eier zum Ausschlüpfen wurden aus einer Schar von SPF weißen Leghorn-Eltern erhalten, die von den Whickham Laborstories, Großbritannien, gekauft wurden.
  • Ein kommerziell erhältlicher TRT-Impfstoff, Poulvac® TRT, wurde von Fort Dodge Animal Health in Fort Dodge, Iowa oder Weesp, Niederlande, bezogen. Die erfindungsgemäßen in-ovo-Impfstoffe werden aus diesem Poulvac® TRT wie folgt zubereitet. Drei (3) Glasfläschchen des kommerziellen Impfstoffs, die einen Titer von 107.5 TCID50 enthielten, wurden ein jedes in 4 ml sterilen Wassers resuspendiert und gut vermischt und vereint. Dann wurden 0,4 ml entnommen und zu 19,6 ml steriler PBS hinzugefügt, um eine Endverdünnung, die 200 ml pro Glasfläschchen äquivalent war, und eine resultierende Suspension, die einen Titer von 104.2 TCID50 des Impfstoffs pro 0,1 ml enthielt, zu erhalten. Dieser Impfstoff wurde weiter verdünnt durch Entnahme von 2 ml und deren Zugabe zu 18 ml steriler PBS, um eine resultierende Suspension von 103.2 TCID50 des Impfstoffs pro 0,1 ml zu erhalten.
  • Das Belastungsvirus wurde wie folgt zubereitet. TRTV vom UK-Stamm BUT 8544, isoliert durch Dr. R. C. Jones an der Liverpool Universität (Großbritannien), wurde 23 mal in Trachea-Organkultur (nachstehend „TOC" genannt), einmal in Junghühner inkubiert, wieder isoliert und noch einmal in TOC inkubiert. Der Titer dieses Belastungsvirus war 104.5 TCID50 pro ml.
  • Nach 18 Tagen der Inkubation wurde ein erster Satz von 70 fertilen Eiern (nachstehend „Satz 1" genannt) in-ovo mit 0,1 ml des rekonstituierten TRT-Impfstoffs, der wie oben beschrieben 103.2 TCID50 enthielt, inokuliert. Ein zweiter Satz von 70 Eiern (nachstehend „Satz 2" genannt) wurde auf die gleiche Weise mit 0,1 ml des rekonstituierten TRT-Impfstoffs, der wie oben beschrieben 104.2 TCID50 enthielt, inokuliert. Die Eier wurden sofort in einen Inkubator gelegt (ohne umzudrehen) und man ließ sie in dem Pferch, in dem sie untergebracht waren, ausschlüpfen. Die Eier der Sätze 1 und 2 wurden getrennt in ähnlichen Isolierungspferchen untergebracht. Ein dritter Satz von 70 fertilen Eiern erhielt keinerlei in-ovo-Verabreichungen (nachstehend „Satz 3" genannt). Satz 3 wird im Folgenden als die negativen Kontrollvögel bezeichnet. Diese Eier wurden in einem dritten Isolierungspferch untergebracht.
  • Das Ausschlüpfen wurde an den Tagen 20, 21, 22 und 23 nach der Inkubation aufgezeichnet (wobei Tag null der erste Tag nach der Inkubation war). Nach dem Schlupf wurden überzählige ein Tag alte Vögel getötet, um fünfzig Vögel pro Satz übrig zu lassen. Für die Sätze 1, 2 und 3 betrugen die experimentell aufgezeichneten Prozentsätze der Schlupffähigkeit jeweils 91%, 94% und 92%. Dies beweist, dass die in-ovo-Impfung mit Titern von 103.2 TCID50 und 104.2 TCID50 im Hinblick auf die Schlupffähigkeit sicher war.
  • Im Alter von drei Wochen bekamen zehn Vögel aus jeder geimpften Gruppe (d.h. aus den Sätzen 1 und 2) und von den negativen Kontrollvögeln (d. h. Satz 3) Flügelmarken und wurden in einen vierten Isolierungspferch umgesetzt. Jedem Vogel wurde dann der zuvor beschriebene Belastungsvirus mittels eines Augentropfens verabreicht, der eine Dosis von 103.5 TCID50 des (virulenten) TRTV in 0,1 ml enthielt. Im Alter von 6 Wochen wurden weitere 10 Vögel auf die gleiche Weise infiziert mit einem virulenten Stamm des TRTV. Jedoch wurde wegen des höheren Alters dieser Vögel die Belastungsdosis auf 103.8 TCID50 des (virulenten) TRTV in 0,2 ml pro Vogel erhöht.
  • Die infizierten Vögel wurden während 14 Tage experimentell überwacht, wonach man sie ausbluten ließ und tötete. Die beobachteten Zeichen wurden unter Verwendung des klinischen Bewertungssystems der Tabelle 2 in Beispiel 1 aufgezeichnet. Die tägliche Gesamtbewertung einer Gruppe von Vögeln wurde durch Summieren der einzelnen Bewertungen eines jeden Vogels an diesem Tag errechnet. Die kumulative Bewertung stellt die Summe der durchschnittlichen täglichen Bewertungen an den Tagen 3 bis 8 dar. Der X2- Test wurde angewandt, um die Daten zu analysieren. Die gesamten klinischen Zeichen, die bei den beiden geimpften Gruppen (Sätzen 1 und 2) an den Tagen 3 bis 8 beobachtet wurden, wurden mit denen, die bei den positiven Kontrollen (Satz 3) an den gleichen Tagen sowohl an den 3 Wochen als auch 6 Wochen alten infizierten Tieren beobachtet wurden, verglichen. Diese Überwachung bewies die folgenden Resultate.
  • Hinsichtlich der 3-wöchigen Belastung mit dem virulenten TRTV-Stamm mit einem Titer von 103.5 TCID50 wiesen 90% der ungeimpften Kontrollvögel des Satzes 3 klinische Zeichen auf. Im direkten Gegensatz dazu wiesen kleinere Prozentsätze der geimpften Vögel der Sätze 1 und 2 klinische Zeichen auf. Bei Satz 1 (geimpft mit einem Titer von 103.2 TCID50 pro Ei) zeigten nur 50% der Vögel klinische Zeichen. Bei Satz 2 (geimpft mit einem Titer von 104.2 TCID50 pro Ei) zeigten nur 30% der Vögel klinische Zeichen. In Satz 3 blieb nur ein Vogel komplett frei von klinischen Zeichen. Im Gegensatz dazu blieben fünf Vögel aus dem Satz 1 und sieben Vögel aus dem Satz 2 komplett frei von klinischen Zeichen.
  • Hinsichtlich der 6-wöchigen Belastung mit dem virulenten TRTV Stamm mit einem Titer von 103.8 TCID50 zeigten 80% der ungeimpften Kontrollvögel des Satzes 3 klinische Zeichen. In direktem Kontrast dazu zeigten kleinere Prozentsätze der geimpften Vögel der Sätze 1 und 2 klinische Zeichen. Beim Satz 1 (geimpft mit einem Titer von 103.2 TCID50 pro Ei) zeigten nur 20% der Vögel klinische Zeichen. Beim Satz 2 (geimpft mit einem Titer von 104.2 TCID50 pro Ei) zeigten nur 10% der Vögel klinische Zeichen.
  • Die statistische X2 Analyse bewies bei einer 6-wöchigen Belastung, dass die in beiden geimpften Gruppen von Vögeln (Sätzen 1 und 2) experimentell beobachteten Zeichen signifikant weniger schwer waren als die bei den ungeimpften negativen Kontrollvögeln des Satzes 3 aufgezeichneten (siehe P < 0,01).
  • Die Tabellen 7, 8 und 9 stellen diese Resultate jeweils für die 3-wöchige Belastung, die 6-wöchige Belastung und die statistische chi2-Analyse wie oben erörtert dar. Tabelle 7: Klinische Zeichen nach 3-wöchiger Belastung
    # Tage nach Belastung mit virulentem TRTV-Stamm in Augentropfen mit einer Dose von 103.5 TCID50 TRTV in 0,1 ml pro Vogel
    3 4 5 6 7 8 9 10
    Vogel # für Satz 1 (geimpft mit 103.2 TCID50)
    104 0 2 2 2 0 0 0 0
    106 0 0 2 0 0 0 0 0
    107 0 0 0 0 0 0 0 0
    111 0 2 0 0 0 0 0 0
    113 0 0 0 0 0 0 0 0
    117 0 0 0 0 0 0 0 0
    118 0 1 2 2 0 0 0 0
    124 0 0 0 0 0 0 0 0
    127 0 0 0 0 0 0 0 0
    139 0 0 1 2 0 0 0 0
    Gesamte tägliche Bewertung 0 5 7 6 0 0 0 0
    Mittlere tägliche Bewertung 0 0,5 0,7 0,6 0 0 0 0
    Satz 1 kumulative Bewertung pro Vogel = 1,8
    Vogel # für Satz 2 (geimpft mit 1041 TCID50)
    3 0 0 0 0 0 0 0 0
    6 0 0 0 0 0 0 0 0
    11 1 0 0 0 0 0 0 0
    12 0 1 2 0 0 1 0 0
    17 0 0 0 0 0 0 0 0
    20 0 0 0 0 0 0 0 0
    21 0 0 0 0 0 0 0 0
    29 0 0 0 0 0 0 0 0
    36 2 1 2 2 0 0 0 0
    37 0 0 0 0 0 0 0 0
    Gesamte tägliche Bewertung 3 2 4 2 0 1 0 0
    Mittlere tägliche Bewertung 0,3 0,2 0,4 0,2 0 0,1 0 0
    Satz 2 kumulative Bewertung pro Vogel = 1,2
    Vogel # für Satz 3 (nicht geimpft)
    301 0 0 0 2 1 0 0 0
    311 0 0 0 2 0 0 0 0
    313 0 0 0 0 0 0 0 0
    314 0 0 2 3 1 0 0 0
    316 0 0 2 1 0 0 0 0
    321 0 2 2 0 0 0 0 0
    322 0 2 2 2 0 0 0 0
    327 0 0 2 3 0 0 0 0
    331 0 2 2 1 0 0 0 0
    334 0 2 2 1 1 0 0 0
    Gesamte tägliche Bewertung 0 8 14 15 3 0 0 0
    Mittlere tägliche Bewertung 0 0,8 1,4 1,5 0,3 0 0 0
    Satz 3 kumulative Bewertung pro Vogel = 4,0
    Tabelle 8: Klinische Zeichen nach 6-wöchiger Belastung
    # Tage nach Belastung mit virulentem TRTV-Stamm in Augentropfen mit einer Dose von 103.8 TCID50 TRTV in 0,2 ml pro Vogel
    3 4 5 6 7 8 9 10
    Vogel # für Satz 1 (geimpft mit 103.2 TCID50)
    108 0 0 0 2 0 0 0 0
    110 0 0 0 0 0 0 0 0
    114 0 0 0 0 0 0 0 0
    115 0 0 0 0 0 0 0 0
    119 0 0 0 0 0 0 0 0
    120 0 0 0 0 0 0 0 0
    130 0 0 0 0 0 0 0 0
    131 0 0 2 0 0 0 0 0
    134 0 0 0 0 0 0 0 0
    135 0 0 0 0 0 0 0 0
    Gesamte tägliche Bewertung 0 0 2 2 0 0 0 0
    Mittlere tägliche Bewertung 0 0 0,2 0,2 0 0 0 0
    Satz 1 kumulative Bewertung pro Vogel = 0,4
    Vogel # für Satz 2 (geimpft mit 104.2 TCID50)
    2 0 0 0 0 0 0 0 0
    4 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    8 0 0 0 0 0 0 0
    13 0 0 0 0 0 0 0 0
    18 0 0 2 2 0 0 0 0
    25 0 0 0 0 0 0 0 0
    27 0 0 0 0 0 0 0 0
    32 0 0 0 0 0 0 0 0
    38 0 0 0 0 0 0 0 0
    39 0 0 0 0 0 0 0 0
    Gesamte tägliche Bewertung 0 0 2 2 0 0 0 0
    Mittlere tägliche Bewertung 0 0 0,2 0,2 0 0 0 0
    Satz 2 kumulative Bewertung pro Vogel = 0,4
    Vogel # für Satz 3 (nicht geimpft)
    302 0 1 0 0 0 0 0 0
    306 0 0 0 3 0 0 0 0
    307 0 0 0 0 0 0 0 0
    312 0 0 0 0 2 0 0 0
    315 0 0 0 0 0 0 0 0
    318 0 0 3 3 0 0 0 0
    319 0 0 1 2 2 2 0 0
    329 0 0 1 0 0 0 0 0
    330 0 2 2 2 2 0 0 0
    332 0 0 0 0 2 0 0 0
    Gesamte tägliche Bewertung 0 3 7 10 8 2 0 0
    Mittlere tägliche Bewertung 0 0,3 0,7 1,0 0,8 0,2 0 0
    Satz 3 kumulative Bewertung pro Vogel = 3,0
    Tabelle 9: Chi2-Analyse
    X2 – Analyse der klinischen Bewertungen: Vergleich von 2 geimpften Gruppen (Sätze 1 und 2) mit 1 negativen Kontrollgruppe (Satz 3)
    Gruppe X2 Grad der Freiheit Wahrscheinlichkeit
    Satz 1 (3- wöchige Belastung) 7,27 3 0,1 > P > 0,05
    Satz 2 (3- wöchige Belastung) 10,133 3 0,02 > P > 0,05
    Satz 1 (6- wöchige Belastung) 12,09 3 P < 0,01
    Satz 2 (6- wöchige Belastung) 12,09 3 P < 0,01
  • Zusätzlich zur Überwachung der Vögel der Sätze 1, 2 und 3 auf klinische Zeichen des TRT hin wurden die Vögel auch der serologischen Analyse unterzogen, wobei die Antikörper gegen das TRTV in individuellen Blutproben durch ELISA-Techniken unter Verwendung eines A-Typ-Antigens bestimmt und als 2log Titer ausgedrückt wurden. Antikörpertiter von 2log-Titer > 6,0 wurden als positiv angesehen. Die Resultate wurden statistisch analysiert unter Verwendung eines T-Tests für unpaarige Daten. Die Tabellen 10 und 11 stellen die serologischen Resultate dar, die mit den infizierten Vögeln der Sätze 1, 2 und 3 jeweils bei 3-wöchiger Belastung und 6-wöchiger Belastung erhalten wurden. In den Tabellen 10 und 11 bedeutet „NB" nach Belastung, „GM" geometrisches Mittel und „SA" Standardabweichung. Kurz zusammen gefasst zeigten alle Gruppen (d.h. die Sätze 1, 2 und 3) einen signifikanten Anstieg der Antikörpertiter am 7. NB-Tag und einen zusätzlichen Anstieg der Antikörpertiter am 14. NB-Tag. Tabelle 10: TRTV-Antikörpertiter (3-wöchige Belastung)
    2log Antikörpertiter nach Belastung mit virulentem TRTV in Augentropfen mit einer Dose von 103.5 in 0,1 ml pro Vogel
    Vor der Belastung 7 Tage NB 14 Tage NB
    Vogel # für Satz 1 (geimpft mit 103.2 TCID50)
    104 4,4 9,9
    106 3,6 9 9,9
    107 6,2 7 9,5
    111 6,6 10,4 11,2
    113 3,4 9,4
    117 3,5 8,8
    118 3,6 6,4 9,5
    124 3,2 6,8 9,7
    127 10,1 10,9
    139 3,4 10,2
    GM 4,8 7,92 9,9
    SA 2,22 1,71 0,72
    Vogel # für Satz 2 geimpft mit 104.2 TCID50)
    3 4,4 9 9,9
    6 9,7 10,6
    11 4,6 10,3 10,9
    12 4,3 7,5 10
    17 8,4 10,6 11,1
    20 9,1
    21 4,5 10
    29 4,4 10
    36 3,6 9,6 10
    37 4,8 10,1
    GM 5,78 9,4 10,29
    SA 2,31 1,23 0,45
    Vogel # für Satz 3 (nicht geimpft)
    301 3,3 9,2
    311 3,4 9,1 9,9
    313 3 9 9,7
    314 3,7 9,9 10,3
    316 3,7 10,2
    321 4,2 9,5 9,8
    322 3,9 7,7 10
    327 3,4 10
    331 3,5 10,5
    334 3,5 10,3
    GM 3,56 9,04 9,99
    SA 0,28 0,83 0,37
    Tabelle 11: TRTV-Antikörpertiter (6-wöchige Belastung)
    2log Antikörpertiter nach Belastung mit virulentem TRTV in Augentropfen mit einer Dose von 103.8 TCID50 in 0,2 ml pro Vogel
    Vor der Belastung 7 Tage NB 14 Tage NB
    Vogel # für Satz 1 (geimpft mit 103.2 TCID50)
    108 4 10,2
    110 5,9 10,1
    114 4,7 9,8
    115 4 6 9,9
    119 4,1 6,5 10,7
    120 4 10,4
    130 3,9 9,8
    131 3,5 7 9,9
    134 3,9 6,4 9,6
    135 4 5,5 10
    GM 4,2 6,28 10,04
    SA 0,67 0,56 0,32
    Vogel # für Satz 2 geimpft mit 104.2 TCID50)
    2 5,8 10
    4 7,1 9,3
    8 6,4 10,3 10,4
    13 5,2 10,2
    18 8,6 10,2 11,2
    25 10,4 10,7 10,9
    27 10,2 10,5 11,4
    32 10,3
    38 10,8 10,9 11,1
    39 6,8 9,5
    GM 8,16 10,52 10,47
    SA 2,14 0,29 0,72
    Vogel # für Satz 3 (nicht geimpft)
    302 3,8 7,1 10,4
    306 4,4 8,1 10,1
    307 4,1 10,1
    312 3,8 6,3 9,9
    315 4,1 6 9,9
    318 3,9 10
    319 4,2 9,9
    329 3,8 9,9
    330 4,3 7,7 9,7
    332 3,4 9,9
    GM 3,98 7,04 9,98
    SA 0,30 0,89 0,19
  • Eine ähnliche serologische Analyse wurde auch durchgeführt hinsichtlich aller drei Gruppen (d. h. der Sätze 1, 2 und 3), die nicht mit einem virulenten 5 Stamm des TRTV infiziert wurden. Die mittleren Antikörperfiter der Kontrollvögel (Satz 3) und der 2 Gruppen geimpfter Vögel (Sätze 1 und 2) von 1 Tag alten bis 8½ Wochen alten Vögeln wurden bestimmt. Wie erwartet blieben die Antikörperfiter der Kontrollvögel während der gesamten Studie niedrig. Die Titer der Kontrollvögel wurden statistisch verglichen mit denen der geimpften Vögel desselben Alters. Tabelle 12 stellt die bestimmten mittleren post-in-ovo-Antikörpertiter dar. Die einzelnen Resultate waren verfügbar (Daten nicht angegeben), um die in Tabelle 12 dargestellten experimentellen Resultate zu untermauern. In Tabelle 12 bedeutet „n" die Anzahl der Vögel und „SA" die Standardabweichung. Tabelle 12: Mittlere post-in-ovo-Antikörpertiter
    N SA Mittlere Antikörpertiter
    Alter für Satz 1 (geimpft mit 103.2 TCID50)
    1 Tag alt 10 0,87 4,95
    1 Woche 5 0,51 4,06
    2 Wochen 5 1,54 3,88
    3 Wochen 20 1,71 4,06
    4 Wochen 5 0,22 4,28
    5 Wochen 10 0,67 4,55
    6 Wochen 10 0,67 4,2
    8½ Wochen 10 2,04 5,83
    Alter für Satz 2 geimpft mit 104.2 TCID50)
    1 Tag alt 11 0,56 4,3
    1 Woche 5 0,45 4,26
    2 Wochen 5 2,82 4,76
    3 Wochen 20 2,42 5,98
    4 Wochen 5 2,98 7,16
    5 Wochen 10 2,38 7,03
    6 Wochen 10 2,12 8,14
    8½ Wochen 9 2,56 8,13
    Alter für Satz 3 (nicht geimpft)
    1 Tag alt 10 0,73 3,88
    1 Woche 5 0,96 4,72
    2 Wochen 5 0,26 3,8
    3 Wochen 18 0,27 3,49
    4 Wochen 5 0,17 4,4
    5 Wochen 11 0,55 3,61
    6 Wochen 11 0,35 3,92
    8½ Wochen 9 0,86 3,98
  • Eine Analyse der Resultate des Beispiels 3 einschließlich der experimentell erhaltenen Messungen, Ergebnisse und entsprechenden statistischen Analyse, weisen darauf hin, dass die niedrigere Dosis des Impfstoffs (TRTV mit 103.2 TCID50, verabreicht in-ovo an empfängliche 18 Tage alte fertile SPF-Hühnereier) insoweit wirksam war, als sie einen signifikanten Schutz gegen eine Infizierung mit einem virulenten Stamm des TRTV im Alter von 6 Wochen verlieh. Im Alter von 3 Wochen wurde der Schutz ebenfalls beobachtet; jedoch unter Berücksichtigung der Anzahl der Vögel fielen die experimentell beobachteten Unterschiede des erreichten Schutzes genau unter den Grad der Signifikanz. Bei erhöhter Impfdosis des TRTV mit 104.2 TCID50 pro Ei (eine Erhöhung von etwa 1log10) wurde sowohl bei den 3 Wochen alten als auch bei den 6 Wochen alten infizierten Vögeln ein signifikanter Schutz gegen die Exposition gegenüber eines virulenten Stammes des TRTV beobachtet.
  • Die in-ovo-Verabreichung des vom Poulvac® TRT abgeleiteten Impfstoffs war eindeutig assoziiert mit der Produktion von TRTV-spezifischen Antikörpern bei den geimpften/inokulierten Vögeln. Diese Assoziation erwies sich als dosisabhängig. Die höhere Dosis des in-ovo-Impfstoffs verursachte einen erhöhten mittleren Antikörpertiter im Alter von drei Wochen mit dem Ergebnis von Spiegeln, die signifikant höher waren als die der negativen Kontrollvögel und nahe unterhalb des Cut-off-Wertes von 6,0 lagen. Es erwies sich, dass die Antikörperantwort im Blutkreislauf auf die in-ovo-Impfung mit der höheren Dosis von 104.2 TCID50 pro Ei im Laufe der Zeit anstieg; ein Maximum wurde im Alter von sechs Wochen erreicht und danach blieben die Titer gleichbleibend bis zum Alter von 8% Wochen.
  • Im Gegensatz zu den oben erörterten Resultaten der hohen Impfdosis erwies sich, dass die Vögel, denen die niedrigere Dosis von 103.2 TCID50 pro Ei verabreicht wurde, eine verzögerte Antikörperantwort auf die Impfung zeigten. Die Titer fingen erst im Alter von 8½ Wochen an zu steigen – und erreichten dann signifikant höhere Spiegel als die der Kontrollvögel. Zu diesem Zeitpunkt (d. h. im Alter von 8½ Wochen) wiesen die Titer der mit der niedrigen Impfstoffdosis behandelten Vögel (Satz 1) ähnliche Spiegel auf wie die mit der hohen Impfstoffdosis behandelten Vögel (Satz 2) im Alter von 3 Wochen. Es erschien wahrscheinlich, dass mit dem Ablauf von noch zusätzlicher Zeit über die 8½ Wochen hinaus die Antikörpertiter auf Spiegel höher als 6,0 angestiegen wären.
  • Es zeigte sich eine Wechselbeziehung zwischen den Antikörpertitern und der Reduzierung der klinischen Zeichen von TRT. In jeder Gruppierung von Vögeln, in der die Antikörpertiter signifikant höher als die der Kontrollvögel waren, aber dennoch unter dem positiven Cut-off-Wert von 6,0 lagen, war die beobachtete Reduzierung der klinischen Zeichen von TRT statistisch signifikant.
  • Die in-ovo-Impfung empfänglicher 18 Tage alter fertiler SPF-Hühnereier mit Dosen im ungefähren Bereich von mindestens 103.2 TCID50 pro Ei bis mindestens 104.2 TCID50 pro Ei und insbesondere mit Dosen von etwa 104.2 TCID50 pro Ei erwies sich als sicher und wirksam gegen eine klinische Erkrankung, die normalerweise nach einer Infizierung mit einem virulenten Stamm von TRTV zu erwarten wäre.
  • Beispiel 4: Wirksamkeitsstudie kommerzieller in-ovo-Hühnerimpfstoffe Das Ziel dieser Studie bestand darin zu bestimmen, ob die in-ovo-Impfung von 18 Tage alten inkubierten fertilen Hühnereiern von einer Elternschar kommerzieller Hähnchen wirksam ist in der Verhütung der TRT- und/oder SHS-Erkrankung nach virulenter Infizierung im Alter von 4 oder 6 Wochen. Wie nachstehend bewiesen wird, ist die in-ovo-Impfung empfänglicher 18 Tage alter fertiler Eier von TRTV-Antikörper-positiven Eltern mit 103.2 TCID50 pro Ei eines von Poulvac® TRT abgeleiteten Impfstoffs wirksam gegen die klinische Erkrankung an Rhinotracheitis.
  • Fertile Eier zum Ausschlüpfen wurden von einer Schar 37 Wochen alter kommerzieller Hühnereltern erhalten, die zuvor mit lebendem TRT-Impfstoff im Alter von 10 Wochen und mit getötetem TRT-Impfstoff im Alter von 18 Wochen geimpft worden waren. Diese Eier wurden von der Mossbank Zuchtschar, Marshall Agriculture, Whitburn, Schottland, bezogen.
  • Ein von Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, Iowa oder Weesp, Niederlande, kommerziell erhältlicher TRT-Impfstoff, Poulvac® TRT, wurde dazu verwendet, um die erfindungsgemäßen in-ovo-Impfstoffe zuzubereiten. Drei Glasfläschchen dieses kommerziellen Impfstoffs, die einen Titer von 107.5 TCID50 enthielten, wurden ein jedes in 5 ml sterilen Wassers resuspendiert und die Inhalte gut vermischt und vereint. Der Impfstoff wurde weiter in steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) verdünnt, um eine resultierende Suspension von 103.2 TCID50 des Impfstoffs pro 0,1 ml zu erhalten.
  • Das Infizierungsvirus wurde wie folgt zubereitet. TRTV vom UK-Stamm BUT 8544 (siehe Seite 12) wurde 23 mal in Trachea-Organkultur (nachstehend „TOC" genannt), einmal in Junghühnern inkubiert, wieder isoliert und noch einmal in TOC inkubiert. Der Titer dieses Infizierungsvirus war 104.5 TCID50 pro ml.
  • Nach 18 Tagen der Inkubation wurden 57 fertile Eier in-ovo mit 0,1 ml des rekonstituierten TRT-Impfstoffs, der wie oben beschrieben 103.2 TCID50 enthielt, inokuliert. Die Eier wurden sofort in einen Inkubator platziert (ohne umzudrehen) und man ließ sie in dem Isolierungspferch, in dem sie untergebracht waren, ausschlüpfen. Nach dem Ausschlüpfen wurden 40 Vögel aus dem Inkubator entfernt und auf den Boden auf Späne gesetzt.
  • Eine Anzahl (110) von fertilen Eiern wurden nicht geimpft/inokuliert und man ließ sie getrennt ausschlüpfen. Einen Tag nach dem Ausschlüpfen wurden 40 Vögel in einen zweiten Isolierungspferch als negative Kontrollvögel gesetzt. Die infizierten Kontrollvögel wurden positive Kontrollvögel genannt.
  • Das Ausschlüpfen wurde an den Tagen 20, 21, 22 und 23 aufgezeichnet (Inokulationstag = null). Nach dem Schlupf wurden überzählige Vögel auf humane Weise getötet oder zur Blutentnahme verwendet. Die Prozentsätze der Schlupffähigkeit der nicht geimpften und geimpften Eier betrugen jeweils 89% und 91%. Dies beweist, dass die Impfung mit Titern von 103.2 TCID50 im Hinblick auf die Schlupffähigkeit sicher war.
  • Im Alter von 4 Wochen bekamen zehn Vögel aus der geimpften Gruppe und zehn Vögel aus den negativen Kontrollen Flügelmarken und wurden in einen dritten Isolierungspferch umgesetzt. Jedem Vogel wurde dann der zuvor beschriebene Belastungsvirus mittels eines Augentropfens verabreicht, der eine Dosis von 103.5 TCID50 des (virulenten) TRTV in 0,1 ml enthielt. Im Alter von 6 Wochen wurden weitere 14 Vögel auf gleiche Weise mit einem virulenten Stamm des TRTV infiziert. Jedoch wurde wegen des höheren Alters dieser Vögel die Belastungsdosis auf 103.8 TCID50 des (virulenten) TRTV in 0,2 ml pro Vogel erhöht.
  • Die belasteten Vögel wurden während 14 Tagen experimentell überwacht, danach ließ man sie ausbluten und tötete sie. Die beobachteten Zeichen wurden aufgezeichnet unter Verwendung des revidierten klinischen Bewertungssystems der Tabelle 13. Das System der Tabelle 13 war ähnlich aber nicht identisch mit dem System der Tabelle 2, das oben in Beispiel 1 beschrieben wurde. Tabelle 13: Revidiertes klinisches Bewertungssystem
    Bewertung Experimentell beobachtete Symptome
    0 Keine Zeichen
    1 Klares Nasenexsudat
    1 Schaumige Augen, aber kein Nasenexsudat (F)
    2 Trübes Nasenexsudat
    3 Geschwollene infraorbitale Nebenhöhlen oder schaumige Augen und 1 oder 2
  • Die tägliche Gesamtbewertung einer Gruppe von Vögeln wurde errechnet durch Summieren der einzelnen Bewertungen eines jeden Vogels an diesem Tag. Die kumulative Bewertung stellt die Summe der durchschnittlichen täglichen Bewertungen dar. Der X2-Test wurde verwendet, um die Daten zu analysieren. Die gesamten bei der geimpften Gruppe des Satzes 1 beobachteten klinischen Zeichen wurden mit denen, die bei den positiven Kontrollen des Satzes 2 an den gleichen Tagen sowohl an den 4 Wochen als auch 6 Wochen alten infizierten Vögeln beobachtet wurden, verglichen. Diese Überwachung bewies die folgenden Resultate.
  • Hinsichtlich der 4-wöchigen Belastung mit dem virulenten TRTV-Stamm mit einem Titer von 103.5 TCID50 wurden klinische Zeichen nur an den Tagen 6 und 7 beobachtet, das Maximum an Zeichen wurde am Tag 6 in beiden Gruppen (d. h. in den Sätzen 1 und 2) beobachtet. In der geimpften Gruppe (Satz 1) wiesen nur 30% der Vögel klinische Zeichen nach der Belastung auf und die kumulative mittlere Bewertung pro Vogel betrug 0,6. In Satz 1 blieben sieben von zehn Vögeln komplett frei von klinischen Zeichen. Die gesamten bei den geimpften Vögeln festgestellten klinischen Zeichen wurden mit denen der positiven Kontrollvögel statistisch verglichen. Obwohl die geimpften Vögel weniger schwere klinische Zeichen als die positiven Kontrollvögel aufwiesen, waren diese Resultate statistisch nicht signifikant (0,2 < P < 0,3).
  • Hinsichtlich der 6-wöchigen Belastung mit dem virulenten TRTV Stamm mit einem Titer von 103.8 TCID50 wurden klinische Zeichen bei den positiven Kontrollvögeln während längerer Zeiträume beobachtet als nach der 4-wöchigen Belastung mit der niedrigeren Dosis. Jedoch wurden bei den geimpften Vögeln klinische Zeichen nur während eines Tages beobachtet. Von den positiven Kontrollvögeln zeigten 57% klinische Zeichen und die kumulative Bewertung pro Vogel betrug 1,35. Von den 14 Vögeln dieser Gruppe blieben 6 komplett frei von klinischen Zeichen. Ein Vogel zeigte schwere klinische Zeichen an den Tagen 5 und 6 der Beobachtungsperiode und starb danach neun Tage nach der Infizierung. Die post-mortem Untersuchung dieses Vogels ergab einen dilatierten rechten Ventrikel, kongestive Herzvenen, Lungenkongestion, exzessive Schleimhaut in der Trachea und ein fibrinöses Exsudat auf der Leber. Die wahrscheinliche Todesursache war ein Rechtsherzversagen und mögliche Hepatitis. Im Gegensatz dazu wiesen nur 14% der geimpften Gruppe von Vögeln klinische Zeichen nach der Infizierung auf und die kumulative Bewertung pro Vogel betrug 0,14. Von den 14 Vögeln in dieser Gruppe blieben 12 komplett frei von klinischen Zeichen. Die gesamten klinischen Zeichen in der geimpften Gruppe (Satz 1) wurden statistisch verglichen mittels einer X2-Analyse mit denen, die bei den positiven Kontrollvögeln (Satz 2) beobachtet wurden. Diese Analyse bewies, dass die bei der geimpften Gruppe beobachteten klinischen Zeichen signifikant weniger schwer waren als die der positiven Kontrollvögel (0,02 < P < 0,05).
  • Die Tabellen 14, 15 und 16 stellen diese Resultate jeweils für die 4-wöchige Belastung, 6-wöchige Belastung und die statistische X2-Analyse wie oben erörtert dar. Tabelle 14: Klinische Zeichen nach 4-wöchiger Belastung
    # Tage nach Belastung mit virulentem TRTV-Stamm in Augentropfen mit einer Dose von 103.5 TRTV TCID50 in 0,1 ml pro Vogel
    3 4 5 6 7 8 9 10
    Vogel # für Satz 1 (geimpft mit 103.2 TCID50)
    41 0 0 0 0 F 0 0 0
    42 0 0 0 0 0 0 0 0
    43 0 0 0 2 0 0 0 0
    44 0 0 0 0 0 0 0 0
    45 0 0 0 0 0 0 0 0
    46 0 0 0 0 0 0 0 0
    47 0 0 0 0 0 0 0 0
    48 0 0 0 2 F 0 0 0
    49 0 0 0 0 0 0 0 0
    50 0 0 0 0 0 0 0 0
    Gesamte tägliche Bewertung 0 0 0 4 2 0 0 0
    Mittlere tägliche Bewertung 0 0 0 0,4 0,2 0 0 0
    Satz 1 kumulative Bewertung pro Vogel = 0,6
    Vogel # für Satz 2 (nicht geimpft)
    391 0 0 0 3 0 0 0 0
    392 0 0 0 0 0 0 0 0
    393 0 0 0 0 0 0 0 0
    394 0 0 0 2 0 0 0 0
    395 0 0 0 3 F 0 0 0
    396 0 0 0 0 F 0 0 0
    397 0 0 0 0 0 0 0 0
    398 0 0 0 1 F 0 0 0
    399 0 0 0 1 0 0 0 0
    400 0 0 0 0 0 0 0 0
    Gesamte tägliche Bewertung 0 0 0 10 3 0 0 0
    Mittlere tägliche Bewertung 0 0 0 1 0,3 0 0 0
    Satz 2 kumulative Bewertung pro Vogel = 1,3
    Tabelle 15: Klinische Zeichen nach 6-wöchiger Belastung
    # Tage nach Belastung mit virulentem TRTV-Stamm in Augentropfen mit einer Dose von 103.8 TRTV TCID50 in 0,2 ml pro Vogel
    3 4 5 6 7 8 9 10
    Vogel # für Satz 1 (geimpft mit 103.2 TCID50)
    1 0 0 0 0 0 0 0 0
    2 0 0 0 0 0 0 0 0
    3 0 0 0 0 0 0 0 0
    52 0 0 0 0 0 0 0 0
    53 0 0 0 0 0 0 0 0
    54 0 0 0 0 0 0 0 0
    55 0 0 0 0 0 0 0 0
    56 0 0 0 0 0 0 0 0
    57 0 0 0 0 0 0 0 0
    59 0 0 0 F 0 0 0 0
    60 0 0 0 0 0 0 0 0
    62 0 0 0 F 0 0 0 0
    65 0 0 0 0 0 0 0 0
    69 0 0 0 0 0 0 0 0
    Gesamte tägliche Bewertung 0 0 0 2 0 0 0 0
    Mittlere tägliche Bewertung 0 0 0 0,14 0 0 0 0
    Satz 1 kumulative Bewertung pro Vogel = 0,14
    Vogel # für Satz 2 (nicht geimpft)
    381 0 0 0 0 0 0 0 0
    383 0 0 0 0 0 0 0 0
    387 0 0 0 0 0 0 0 0
    388 0 F 0 0 0 0 0 0
    389 0 0 0 0 0 1 0 0
    390 0 0 F 0 0 0 0 0
    463 0 0 2 F 0 1 0 0
    464 0 0 0 0 0 0 0 0
    465 0 0 0 2 0 0 0 0
    469 0 0 0 0 0 1 0 0
    474 0 0 0 0 0 0 0 0
    476 0 0 3 3 0 0 Tot 0
    477 0 0 0 0 0 0 0 0
    478 0 0 2 F 0 0 0 0
    Gesamte tägliche Bewertung 0 1 8 7 0 3 0 0
    Mittlere tägliche Bewertung 0 0,07 0,57 0,5 0 0,21 0 0
    Satz 2 kumulative Bewertung pro Vogel = 1,35
    Tabelle 16: Chi2-Analyse der klinischen Bewertungsdaten
    X2 – Analyse der klinischen Bewertungen: Vergleich einer geimpften Gruppe (Satz 1) mit einer positiven Kontrollgruppe (Satz 2)
    Gruppe X2 Grad der Freiheit Wahrscheinlichkeit
    Satz 1 (4-wöchige Belastung) 3,95 3 0,2 < P < 0,3
    Satz 1 (6-wöchige Belastung) 8,43 3 0,02 < P < 0,05
  • Zusätzlich zur Überwachung der Vögel der Sätze 1 und 2 auf klinische Zeichen von TRT hin wurden die Vögel auch der serologischen Analyse unterzogen, wobei Antikörper gegen das TRTV in individuellen Blutproben mittels von Leahurst, Liverpool, (Großbritannien), entwickelter ELISA-Techniken unter Verwendung eines A-Typ-Antigens bestimmt und als 2log-Titer ausgedrückt wurden. Antikörpertiter mit einem 2log-Titer > 6,0 wurden als positiv angesehen. Die Resultate wurden statistisch analysiert mittels eines T-Tests für unpaarige Daten. Die Tabellen 17 und 18 stellen die serologischen Resultate dar, die mit den infizierten Vögeln der Sätze 1 und 2 jeweils nach 4-wöchiger und 6-wöchiger Belastung erhalten wurden. In den Tabellen 17 und 18 bedeutet "NB" nach Belastung. Tabelle 17: TRTV-Antikörpertiter (4-wöchige Belastung)
    2log Antikörpertiter nach Belqastung mit virulentem TRTV in Augentropfen mit einer Dose von 103.5 TCID50 in 0,1 ml pro Vogel
    Vor der Belastung 14 Tage NB
    Vogel # für Satz 1 (geimpft mit 103.2 TCID50)
    41 3,0 9,4
    42 3,0 9,2
    43 3,0 10,1
    44 3,0 9,5
    45 6,9 10,8
    46 5,4 11,2
    47 3,0 10,2
    48 3,0 10,6
    49 8,2 9,9
    50 9,2 11,0
    Mittlere 4,77 10,19
    Standardabweichung 2,48 0,70
    Vogel # für Satz 2 (nicht geimpft)
    391 3,3 9,5
    392 3,5 10,3
    393 3,0 9,7
    394 3,1 9,1
    395 3,6 8,9
    396 3,6 9,7
    397 3,1 9,8
    398 3,4 9,3
    399 3,0 9,7
    400 3,4 9,9
    Mittlere 3,3 9,6
    Standardabweichung 0,24 0,41
    Tabelle 18: TRTV-Antikörpertiter (6-wöchige Belastung)
    2log Antikörperfiter nach Belastung mit virulentem TRTV in Augentropfen mit einer Dose von 103.8 TCID50 in 0,2 ml pro Vogel
    Vor der Belastung 14 Tage NB
    Vogel # für Satz 1 (geimpft mit 103.2 TCID50)
    1 6,3 11,6
    2 4,3 10,4
    3 4,2 10,1
    52 3,6 10,6
    53 4,1 10,6
    54 3,7 10,7
    55 4,8 9,7
    56 3,6 9,9
    57 8,1 10,1
    59 3,4 10,2
    60 3,6 9,8
    62 9,3
    65 5,3 10,0
    69 4,9 10,1
    Mittlere 4,61 10,22
    Standardabweichung 1,34 0,55
    Vogel # für Satz 2 (nicht geimpft)
    381 4,2 9,8
    383 5,2 9,2
    387 3,0 9,9
    388 3,4 9,6
    389 3,8 9,0
    390 5,4 8,8
    463 4,0 10,0
    464 3,0 9,7
    465 3,7 8,7
    469 3,0 9,6
    474 3,9 9,9
    476 4,7
    477 4,8 9,9
    478 5,0 9,6
    Mittlere 4,08 9,52
    Standardabweichung 0,83 0,44
  • Eine ähnliche serologische Analyse wurde ebenfalls bezüglich solcher Vögel, die nicht mit einem virulenten Stamm von TRTV infiziert wurden, durchgeführt, wobei zehn Serumproben von Vögeln aus einem jeden von 5 verschiedenen Freiluftbereichen der Mossbank Elternzuchtschar (Marshalls Agriculture) im Alter von 25 und 41 Wochen entnommen wurden. Tabelle 19 stellt die mittleren Antikörpertiter dieser Vögel aus der Elternzuchtschar dar. Tabelle 19: Mittlere Antikörpertiter der Elternzuchtschar
    25 Wochen alt (n = 10) 41 Wochen alt (n = 10)
    Haus Mittelwert SA Mittelwert SA
    4A 7,60 2,57 7,39 1,72
    5A 7,51 0,81 8,27 0,87
    3B 7,44 2,55 7,29 1,50
    4B 8,16 0,67 6,64 1,46
    5B 7,34 1,81 7,17 0,98
  • Sowohl bei den nicht infizierten geimpften als auch bei den nicht infizierten negativen Kontrollvögeln wurde Blut entnommen im Alter von 1 Tag und 4, 6 und 8 Wochen. Tabelle 20 stellt diese mittleren Antikörpertiter der nicht infizierten Vögel dar. Tabelle 20: Mittlere Antikörpertiter nicht infizierter Vögel
    Nicht geimpfte negative Kontrollvögel Geimpfte Vögel
    Alter Mittelwert SA n Mittelwert SA n
    1 Tag 7,23 1,32 10 6,46 0,99 10
    4 Wochen 3,52 0,54 38 4,38 1,86 39
    6 Wochen 3,93 0,72 28 4,72 1,62 27
    8 Wochen 3,54 0,75 14 5,09 1,68 14
  • Sowohl bei den infizierten geimpften als auch bei den infizierten positiven Kontrollvögeln wurde Blut entnommen 14 Tage nach der Infizierung von jeder Gruppe der 4 Wochen alten und 6 Wochen alten infizierten Vögel. Tabelle 21 stellt diese mittleren Antikörpertiter der infizierten Vögel in diesen beiden Gruppen dar. Tabelle 21: Titer der infizierten Vögel 14 Tage nach Belastung
    4-wöchige Belastung 6-wöchige Belastung
    Gruppe Mittelwert SA (P) N Mittelwert SA (P) n
    Positive Kontrollvögel 9,6 0,41 (–) 10 9,52 0,44 (–) 13
    geimpfte Vögel 10,19 0,70 (0,031) 10 10,22 0,55 (0,001) 14
  • Individuelle Resultate konnten die in den Tabellen 14 bis 21 oben dargestellten Daten untermauern. Basierend auf den oben ausgeführten serologischen Analysen werden folgende Schlussfolgerungen gezogen. Sowohl die geimpften Vögel als auch die negativen Kontrollvögel besaßen im Alter von 1 Tag maternale Antikörper (MA) gegen das TRTV. Im Alter von 4 Wochen waren die Antikörperspiegel der negativen Kontrollvögel bis in den negativen Bereich gefallen und blieben niedrig während der verbleibenden Dauer des Experiments. Nach in-ovo-Verabreichung mit einem Titer von 103.2 TCID50 eines vom Poulvac® TRT abgeleiteten Impfstoffs blieben die mittleren Antikörpertiter im negativen Bereich (d. h. unter dem positiven Cut-off-Wert von 6,0), erhöhte sich aber mit dem Alter. Im Alter von 4, 6 und 8 Wochen besaßen die geimpften Vögel mittlere Antikörpertiterspiegel, die statistisch signifikant höher als die der negativen Kontrollvögel waren. Von den 4 Wochen alten Vögeln besaßen 20% bis 22% der geimpften Vögel positive Titer. Hinsichtlich der infizierten Vögel zeigten alle Vögel eine Serokonversion 14 Tage nach Belastung. Bei den Studien sowohl der 4 Wochen alten als auch der 6 Wochen alten infizierten Vögel waren die mittleren Titer der geimpften Gruppe höher als die der positiven Kontrollvögel und dieser Unterschied war statistisch signifikant (P < 0,05).
  • Eine Analyse des gesamten Beispiels 4, einschließlich der experimentell erhaltenen Messungen, Resultate und entsprechenden statistischen Analyse, weist darauf hin, dass die in-ovo-Impfung von kommerziellen Hühnereiern, die maternale Antikörper besaßen (MA+), 18 Tage nach der Inkubation mit einem vom Poulvac® TRT abgeleiteten Impfstoff mit einem Dosierungstiter von 103.2 TCID50 pro Ei die Schlupffähigkeit nicht negativ beeinflusste und eine zuverlässige, effiziente und wirksame Methode der Impfstoffverabreichung lieferte. Diese Impfung verlieh auch einen signifikanten Schutz gegen die Belastung durch einen virulenten Stamm des TRTV im Alter von 6 Wochen, zu welchem Zeitpunkt die klinischen Zeichen signifikant reduziert waren. Es bestand ein gewisser Schutzgrad im Alter von 4 Wochen, jedoch waren selbst in der Gruppe der ungeimpften positiven Kontrollvögel die zu diesem Zeitpunkt beobachteten klinischen Zeichen nicht sehr schwer. Dementsprechend war der Schutz gegen eine Infizierung, obwohl er vorhanden war, im Alter von 4 Wochen statistisch nicht signifikant.
  • Die in diesem Beispiel 4 dargestellten Daten in Verbindung mit denen der Beispiele 1 bis 3 oben bewiesen, dass Hühner viel weniger empfänglich für TRT-Impfstoffe sind. Positive mittlere Antikörpertiter (oben angegebener positiver Cut-off-Wert von 6,0) wurden nicht beobachtet nach in-ovo-Impfung. Jedoch waren die Spiegel der geimpften Gruppe signifikant höher als die der negativen Kontrollen. Annähernd ein Fünftel der geimpften Vögel hatte positive Titer im Alter von 4 Wochen. Daher mag zum Zeitpunkt der Infizierung die gesamte Serokonversion zu ELISA-Spiegel von über 6,0 kein guter Indikator des Schutzes sein, der tatsächlich durch die in-ovo-Impfung erzeugt wird. Eine lokale Immunität kann eine Rolle bei der Wechselwirkung zwischen dem induzierten Schutz und der experimentell bestimmten Titer spielen.
  • Vor der Analyse der Experimente 1 bis 4 oben war gefordert worden, dass die Gegenwart maternaler Antikörper die Wirksamkeit der Impfstoffe negativ beeinflussen würde. Beispiel 4 beweist indessen und auf überraschende Weise, dass die in-ovo-Verabreichung eines TRT-Impfstoffs mit einem Titer von 103.2 TCID50 pro Ei die klinische TRT-Erkrankung bei Hühnern, die MA+ sind, wirksam reduzierte. Beispiel 4 erhärtet und erweitert die in Beispiel 3 oben erzielten Schlussfolgerungen, dass nämlich bei SPF-(MA-) Hühnern, die in-ovo geimpft wurden, gleichermaßen eine klinische Erkrankung reduziert war.
  • Beispiel 5: Studie des TRT-Impfstoffs in Kombination mit anderen Geflügelimpfstoffen
  • Folgende Abkürzungen werden in dieser Studie verwendet:
    • AHS:
    Animal Health Service, Deventer, Niederlande
    BC:
    Biochek, Gouda, Niederlande
    CVL:
    Central Veterinary Laborstory, Wegbridge, Großbritannien
    EID50:
    50% Ei-Infektionsdosis
    ELISA:
    Enzym-Immunassay
    FAT:
    Fluoreszenz-Antikörpertest
    HI:
    Hämagglutinationshemmung
    IB:
    infektiöse Bronchitis
    IBD:
    infektiöse Bursitis
    i.m.:
    intramuskulär
    MD:
    Marek-Krankheit
    ND:
    Newcastle-Konjunktivitis
    P:
    Wahrscheinlichkeit
    TCID50:
    50% Gewebekulturinfektionsdosis
    TRT:
    Truthahn-Rhinotracheitis
  • Die folgenden Impfstoffmaterialien wurden für diese Studie verwendet:
  • Poulvac® TRT, Chargen TR02100 und TR02200, enthaltend jeweils 104.1 und 104.1 TCID50-TRT-Virus pro Dosis
  • Poulvac® Ovoline ND, Charge BB010, enthaltend 103.9 EID50 ND-Virus pro Glasfläschchen (5000 Dosen pro Glasfläschchen) Bursamune IN OVO, Charge 61640, enthaltend 5000 Dosen pro Glasfläschchen
  • Poulvac® Marek HVT lyo, Charge 350129, enthaltend das MD-Virus, Stamm FC126 (1000 Dosen pro Glasfläschchen)
  • Poulvac® NDW, Chargen BL03200 und BL04302
  • Poulvac® IB Primer, Charge CX02301, enthaltend 105.0 EID50 IB-Virus, Serotypen M41 und D207 (D274 Klon) pro Dosis (1000 Dosen pro Glasfläschchen)
  • Poulvac® Bursa Plus, Charge 62481, enthaltend 103.2 EID50 IBD-Virus, Stamm V877, pro Glasfläschchen (2000 Dosen pro Glasfläschchen)
  • Alle Impfstoffe mit Ausnahme des Bursamune IN OVO wurden von Fort Dodge Animal Health Benelux, Weesp, Niederlande, geliefert. Bursamune IN OVO wurde von Fort Dodge Animal Health, Australien, bezogen.
  • Die Impfstoffchargen wurden vor Licht geschützt bei 0 bis 8°C bis zum Tag der Verwendung gelagert und nach den Anweisungen des Herstellers verwendet. Nach der Rekonstitution wurden die Impfstoffe innerhalb von zwei Stunden verwendet. Folgende Impfstoffverdünnungen wurden zubereitet.
  • Für die Impfstoffverdünnung für die in-ovo-Impfungsgruppe 1 wurden Poulvac® TRT, Charge TR02100, Poulvac® Ovoline ND und Bursamune IN OVO rekonstituiert und weiter verdünnt in Poulvac® Marek-Verdünnungsmittel, Charge C8109. Die Endverdünnung enthielt eine kommerzielle Dosis von jedem Impfstoff in 0,05 ml.
  • Für die Impfstoffverdünnung für die intramuskulären (i.m.) Impfungsgruppen 1 und 2 gegen MD wurde Poulvac® Marek HVT lyo rekonstituiert und weiter verdünnt in Poulvac® Marek Verdünnungsmittel, Charge C8109. Die Verdünnung enthielt eine kommerzielle Dosis pro 0,5 ml.
  • Für die Impfstoffverdünnung für die Grobspray-Impfungsgruppe 1 wurde Poulvac® IB Primer rekonstituiert und weiter verdünnt in 2,2 l entmineralisierten Wassers. Die Verdünnung enthielt eine kommerzielle Dosis pro 0,5 ml.
  • Für die Impfstoffverdünnung für die Grobspray-Impfungsgruppe 2 wurden Poulvac® NDW, Charge BL04302, Poulvac® IB Primer und Poulvac® TRT, Charge TR02200, rekonstituiert und weiter verdünnt in 3 l entmineralisierten Wassers. Die Endverdünnung enthielt eine kommerzielle Dosis pro 0,5 ml.
  • Für die Impfstoffverdünnung für die Impfungsgruppe 2 gegen IBD im Trinkwasser wurden drei Glasfläschchen Poulvac® Bursa Plus rekonstituiert und weiter verdünnt in Leitungswasser.
  • Für die Impfstoffverdünnung für die Impfungsgruppen 1 und 2 gegen ND durch Atomist-Spray wurde Poulvac® NDW, Charge BL03200, rekonstituiert und weiter verdünnt in entmineralisiertem Wasser, bis die Endverdünnung eine kommerzielle Dosis pro 0,5 ml enthielt.
  • 14895 kommerzielle Eier der Cobb-Zucht für die Hähnchenproduktion von Pronk, Meppel, Niederlande, wurden in einen Inkubator platziert, der sich in MUK-5/6 in der Testfarm Von Fort Dodge AHH, Muiden, Niederlande, befindet.
  • Alle Eier wurden nach 17 Tagen der Inkubation durchleuchtet. Die nicht befruchteten Eier oder Eier mit toten Embryos wurden entfernt.
  • 6001 der Gruppe 1 zugewiesene Eier wurden inokuliert mit 0,05 ml einer Verdünnung, die 1 Dosis von Poulvac® TRT, Poulvac® Ovoline ND und Bursamune IN OVO pro Ei enthielt, nach 18 Tagen Inkubation unter Verwendung einer Embrex Inovoject Ei-Injektionsmaschine nach den Anweisungen des Herstellers. 6028 der Gruppe 2 zugewiesene Eier wurden nicht inokuliert belassen.
  • Die inokulierten Eier (Gruppe 1) und nicht inokulierten Eier (Gruppe 2) wurden weiter inkubiert (ohne umzudrehen) bis zum Ausschlüpfen jeweils in den Inkubatoren 1 und 4, die sich in der Testfarm von Fort Dodge AHH, Muiden, Niederlande, befinden. Nach dem Schlupf wurden 4452 Küken (inokulierte, Gruppe 1) und 5248 (nicht inokulierte, Gruppe 2) jeweils in die Studie aufgenommen. Die Küken wurden in Gruppen auf Holzspänen in Tiervorrichtungen untergebracht, die sich in demselben Schuppen in der Testfarm von Fort Dodge AHH, Muiden, Niederlande, befinden. Die Küken der Gruppe 1 wurden in MUL-L und die Küken der Gruppe 2 in MUL-R untergebracht. Alle Küken wurden mit kommerziellem Hähnchenpellet ad libitum gefüttert und hatten freien Zugang zu Trinkwasser, das aus Kelchtrinkgefäßen gespendet wurde.
  • Der Impfungsplan ist in Tabelle 22 dargestellt. Im Alter von einem Tag wurden die Küken der Gruppe 1 mit Poulvac® IB Primer geimpft. Eine kommerzielle Dose in 0,5 ml pro Küken wurde durch grobtropfiges Sprühen unter Verwendung eines Gartensprühers (Gardena) verabreicht. Im Alter von einem Tag wurden die Küken der Gruppe 2 mit Poulvac® TRT, Poulvac® NDW und Poulvac® IB Primer geimpft. Eine kommerzielle Dose von jedem Impfstoff wurde durch grobtropfiges Sprühen mit einem Volumen von 0,5 ml pro Küken, wie in Gruppe 1, verabreicht. Vor der Impfung durch grobtropfiges Sprühen wurden die Küken in Hühnerboxen gesetzt und darin belassen bis 3 Stunden nach der Impfung.
  • Alle Küken wurden mit Poulvac® Marek HVT lyo mit einer kommerziellen Dose pro Küken im Alter von einem Tag geimpft. Der Impfstoff wurde i.m. in den Oberschenkel unter Verwendung einer Pullet Injektionspistole (Veterinary Supplies, Mijdrecht, Niederlande) mit einem vorbereiteten Volumen von 0,5 ml appliziert.
  • Die Küken der Gruppe 2 wurden mit Poulvac® Bursa Plus mit einer kommerziellen Dose pro Küken im Trinkwasser im Alter von zwei Wochen geimpft. Der Impfstoff wurde in einer Menge von Wasser verteilt, die innerhalb von 2 Stunden konsumiert wurde. Den Küken war während 2 Stunden vor Verabreichung des Impfstoffs Trinkwasser vorenthalten worden.
  • Alle Küken wurden mit Poulvac® NDW im Alter von 4 Wochen geimpft. Eine kommerzielle Dose in 0,5 ml pro Küken wurde durch Zerstäuber verabreicht. Tabelle 22. Impfungsplan.
    Gruppe Alter bei Impfung Impfstoff Applikationsmethode
    1 Eier 18 Tage nach Inkubation Poulvac TRT) Poulvac Ovoline ND) Bursamune IN OVO) Injektionsmaschine
    1 Küken 1 Tag alt Poulvac IB Primer) Poulvac Marek HVT lyo Grobtropfiges Sprühen in Hühnerbox i.m.
    2 Küken 1 Tag alt Poulvac TRT) Poulvac NDW) Poulvac IB Primer) Poulvac Marek HVT lyo Grobtropfiges Sprühen in Hühnerbox i.m.
    2 Küken 2 Wochen alt Poulvac Bursa Plus Trinkwasser
    1 und 2 Küken 4 Wochen alt Poulvac NDW Zerstäuber
  • Blutproben wurden von 30 Küken einer jeden Gruppe nach Enthauptung im Alter von 1 Tag entnommen. Die Proben von 10 Küken einer jeden Gruppe wurden zu serologischen Tests im AHS verwendet. Die Proben von 10 anderen Küken einer jeder Gruppe wurden zu serologischen Tests im Central Veterinary Laborstory, Wegbridge, Großbritannien (CVL), verwendet. Die verbleibenden 10 Proben wurden zu serologischen Tests im BC verwendet. Blutproben wurden aus der Flügelvene bis zu einer Höchstzahl von 24 Küken pro Gruppe im Alter von 2, 3, 4, 5 und 6 Wochen entnommen.
  • Die Antikörpertiter gegen ND-, IB M41- und IB D274-Antigene wurden mittels HI-Tests bestimmt. Die Detektionsgrenze der HI-Tests entspricht dem Wert von 2log HI-Titer = 1,0 für das ND-Antigen und von 2log HI-Titer = 3,0 für IB-Antigene. Das geometrische Mittel der HI-Titer wurde errechnet. Die Antikörpertiter gegen das TRT- und IBD-Virus wurden mittels der ELISA-Methode (IDEXX) nach den Anweisungen des Herstellers gemessen und die mittleren Titer wurden errechnet. Diese Tests wurden am AHS durchgeführt.
  • Die Antikörper-Titrationen gegen das ND-, IB-, TRT- und IBD-Virus wurden mittels ELISA Methoden durch BC durchgeführt. ELISA-Antikörpertiter von jeweils 1159 und 834 oder darüber gegen das ND- und ZB-Virus werden als positiv angesehen. Antikörpertiter gegen das ND- (als positiv angesehen werden 396 oder darüber) und IB-Virus wurden ebenfalls mittels der IDEXX-Testausrüstungen ermittelt. Die mittleren Titer wurden mit Hilfe der BC99-Software errechnet.
  • Die im AHS und CVL erhaltenen Resultate wurden statistisch analysiert. Die beiden Gruppen wurden im Hinblick auf Antikörpertiter mit Hilfe des zweiseitigen T-Tests verglichen. ELISA-Antikörpertiter gegen IBD, TRT und MD wurden vor der Analyse log-transformiert (log[x + 1]). Die MD-Messungen ≥ 1600 und negative wurden in den Berechnungen jeweils durch 1600 und 25 ersetzt. Eine Wahrscheinlichkeit von P ≤ 0,05 wurde als statistisch signifikanter Unterschied angesehen.
  • Resultate: Die mittleren Antikörpertiter gegen die ND-, IB-, IBD- und TRT-Antigene, bestimmt durch AHS und BC, sind in den Tabellen 23 und 24 dargestellt. Tabelle 23. Mittlere Antikörperfiter gegen ND, IB M41, IB D274, IBD und TRT, bestimmt durch AHS.
    Mittlere 2log HI Antikörpertiter Mittlere ELISA Antikörpertiter
    Alter Gruppe ND IB M41 IB D274 IBD TRT
    Ein 1 5,4 8,0 7,9 2377 4896
    Tag 2 (n=10) (n=10) (n=10) (n=10) (n=10)
    5,8 8,1 7,9 3084 1628
    (n=10) (n=10) (n=10) (n=10) (n=10)*
    2 Wochen, Impfung mit Poulvac Bursa Plus (Gruppe 2)
    1 2,3 6,2 6,5 94 (n=24) 509 (n=24)
    2 (n=24) (n=24) (n=24) 109 371
    2,2 5,8 6,3 (n=24) (n=24)*
    (n=24) (n=24) (n=24)
    3 Wochen
    1 2,5 5,4 5,6 51 (n=24) 203 (n=24)
    2 (n=24) (n=24) (n=24) 45 (n=24) 90 (n=24)*
    1,2 5,4 5,4
    (n=23)* (n=20) (n=23)
    4 Wochen, Impfung mit Poulvac NDW (Gruppen 1 und 2)
    1 1,8 3,8 4,1 951 76 (n=23)
    2 (n=24) (n=23) (n=24) (n=24) 7 (n=24)
    1,3 3,7 4,0 1196
    (n=24) (n=24) (n=24) (n=24)
    5 Wochen
    1 3,6 4,6 4,9 1392 426 (n=24)
    2 (n=24) (n=21) (n=21) (n=24) 41 (n=24)*
    1,8 4,0 4,2 1210
    (n=24)* (n=22) (n=22) (n=24)
    6 Wochen
    1 2,3 4,3 4,6 1907 215 (n=24)
    2 (n=24) (n=24) (n=24) (n=24) 72 (n=24)
    3,3 3,7 3,8 1857
    (n=24)* (n=24)* (n=24)* (n=24)
    • * statistisch signifikanter Unterschied zu Gruppe 1 (P ≤ 0,05).
    Tabelle 24. Mittlere Antikörpertiter gegen ND, IB, IBD und TRT, bestimmt durch BC.
    Mittlere ELISA Antikörpertiter
    Alter Gruppe ND IB IBD TRT
    Ein 1 7309 (n=10) 6316 (n=10) 4643 n=10) 11144 (n=10)
    Tag 2 7087 (n=10) 6148 (n=10) 4601 (n=10) 2594 (n=10)
    2 Wochen, Impfang mit Poulvac Bursa Plus (Gruppe 2)
    1 1279 (n=24) 497 (n=24) 399 (n=24) 804 (n=24)
    2 1088 (n=24) 649 (n=24) 400 (n=24) 610 (n=24)
    3 Wochen
    1 1934 (n=24) 687 (n=24) 440 (n=24) 316 (n=24)
    2 763 (n=24) 718 (n=24) 854 (n=24) 258 (n=24)
    4 Wochen, Impfung mit Poulvac NDW (Gruppen 1 und 2)
    1 924 (n=24) 1100 (n=24) 5448 (n=24) 298(n=24)
    2 530 (n=24) 680 (n=24) 6291 (n=24) 451 (n=24)
    5 Wochen
    1 2918 (n=24) 1041 (n=24) 6142 (n=24) 483 (n=24)
    2 1604 (n=24) 752 (n=24) 5948 (n=24) 279 (n=24)
    6 Wochen
    1 3074 (n=24) 1435 (n=24) 6322 (n=24) 456 (n=24)
    2 2536 (n=24) 2662 (n=24) 6801 (n=24) 681 (n=24)
  • Mittlere FAT-Titer gegen das MD-Virus, die die mittlere, die spezifische Fluoreszenz aufweisende Serumverdünnung darstellen, sind in Tabelle 25 aufgeführt. Statistisch signifikante höhere FAT-Titer wurden in der Gruppe 2 im Alter von 2, 3 und 4 Wochen beobachtet, was auf eine höhere immunologische Antwort in jüngerem Alter der Vögel hinweist. Tabelle 25. Mittlere FAT-Titer gegen das MD-Virus.
    Alter Gruppe Anzahl der Proben Mittlere FAT-Titer gegen das MD-Virus
    Ein Tag 1 10 880
    2 10 940
    2 Wochen 1 24 66
    2 24 175*
    3 Wochen 1 24 172
    2 24 612*
    4 Wochen 1 24 369
    2 24 823*
    5 Wochen 1 24 950
    2 24 877
    6 Wochen 1 24 1129
    2 24 1267
    • *statistisch signifikanter Unterschied zu Gruppe 1 (P ≤ 0,05).
  • Beispiel 5 – Erörterung
  • Die Küken in beiden Gruppen hatten MA gegen das ND-, IB-, IBD-, TRT- und MD-Virus. Eine Serumantwort gegen ND und IB wurde nach Impfung im Alter von einem Tag beobachtet. Die Entwicklung von Titern gegen diese Antigene geschah innerhalb normaler Bereiche in beiden Gruppen. Die zweite Impfung mit Poulvac® NDW induzierte eine Serumantwort in beiden Gruppen. Beide Gruppen entwickelten Antikörperfiter gegen das IBD-, TRT- und MD-Virus.
  • Bei einer Anzahl von Fällen wurden gewisse Unterschiede der Antikörpertiter zwischen den Gruppen beobachtet. Die Antikörperfiter gegen ND waren höher in Gruppe 1 (aus inokulierten Eiern geschlüpfte Küken) in allen Fällen außer im Alter von 6 Wochen. Die Antikörpertiter gegen TRT waren auch höher in Gruppe 1 in allen Fällen und diese Unterschiede waren statistisch signifikant, abgesehen vom Unterschied im Alter von 6 Wochen. Die Serumantwort gegen MD war etwas langsamer in Gruppe 1, erreichte aber denselben Spiegel wie in Gruppe 2 im Alter von 5 Wochen. Bei den mittleren Antikörpertitern gegen die IB- und IBD-Antigene wurden keine deutlichen Unterschiede zwischen den Gruppen festgestellt.
  • In den meisten Fällen folgten die Resultate der durch BC durchgeführten Titrierungen demselben Muster wie die vom AHS mit höheren Werten der ELISA-Titer gegen IBD und TRT. Eine Serumantwort gegen IBD wurde durch den BC-Test im Alter von 3 Wochen nachgewiesen, also eine Woche früher, als sie im IDEXX-Test nachgewiesen wurde. Der BC-ELISA-Test scheint sensitiver zu sein, um Antikörpertiter gegen ND zu messen, als die HI-Methode. Der BC-ELISA-Test zeigte eine ausgeprägtere Antwort gegen das ZB-Virus als die HI-Methode vom Alter von 3 Wochen an aufwärts.
  • Die in-ovo-Impfung von kommerziellen Eiern für die Hähnchenproduktion mit einer kommerziellen Dose von Poulvac® TRT, Poulvac® Ovoline ND und Bursamune IN OVO nach 18 Tagen der Inkubation gefolgt von der Impfung mit Poulvac IB Primer und Poulvac® HVT im Alter von einem Tag ist im Hinblick auf die Wirksamkeit mit der Impfung der geschlüpften Küken mit kommerziellen Dosierungen von Poulvac TRT, Poulvac® NDW, Poulvac® IB Primer und Poulvac® Marek HVT lyo am ersten Lebenstag und mit der Impfung mit Poulvac® Bursa Plus im Alter von 2 Wochen kompatibel.
  • Die BC-ELISA-Testausrüstungen scheinen für die Messung der Antikörpertiterspiegel auf ND-, IB-, IBD- und TRT-virale Antigene hin günstig zu sein, verglichen mit den HI-Tests auf ND, IB M41 und IB D274 hin oder den IDEXX-Testausrüstungen auf IBD oder TRT hin.
  • Die Tabellen 26 bis 35 liefern zusätzliche Antikörpertiterresultate. Tabelle 26. HI-Antikörpertiter gegen das ND-Virus, bestimmt durch AHS.
    Anzahl der Küken mit angegebenem 2log HI-Titer gegen das ND-Virus Unzureichend
    Alter Ein Tag Gruppe 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Serum
    1 1 5 3 1
    2 2 2 2 4
    2 Wochen
    1 6 12 3 1 1 1
    2 2 16 6
    3 Wochen
    1 7 7 6 1 2 1
    2 2 0 2 1 1
    4 Wochen
    1 1 5 4 2 1 1 1
    2 1 9 3 1 1
    5 Wochen
    1 4 3 6 4 7
    2 1 2 7 4 1
    6 Wochen
    1 7 7 6 3 1
    2 4 4 4 6 4 2
    Tabelle 27. HI-Antikörpertiter gegen das IB M41-Antigen, bestimmt durch AHS.
    Anzahl der Küken mit angegebenem 2log HI-Titer gegen das IB M41-Antigen Unzureichend
    Alter ein Tag Gruppe 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Serum
    1 3 2 4 1
    2 3 5 1 1
    2 Wochen
    1 1 3 3 5 8 4
    2 1 7 11 5
    3 Wochen
    1 2 2 7 10 3
    2 2 3 3 9 3 4
    4 Wochen
    1 2 10 14 9 5 3 4 1 1
    5 Wochen
    1 7 3 6 3 1 1 3
    2 11 3 6 2 2
    6 Wochen
    1 6 10 4 4
    2 11 10 2 1
    Tabelle 28. HI-Antikörpertiter gegen das IB D274-Antigen, bestimmt durch AHS.
    Anzahl der Küken mit angegebenem 2log HI-Titer gegen das IB D274-Antigen Unzureichend
    Alter Ein Tag Gruppe 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Serum
    1 1 4 2 2 1
    2 1 2 2 3 1 1
    2 Wochen
    1 2 3 5 9 5
    2 2 12 10
    3 Wochen
    1 4 5 12 2 1
    2 1 4 6 8 4
    4 Wochen
    1 2 8 10 8 8 6 3 2 2 1
    5 Wochen
    1 7 2 3 6 1 2 3
    2 7 6 6 3 2
    6 Wochen
    1 5 6 9 1 3
    2 12 6 5 1
    Tabelle 29. Individuelle ELISA-Antikörpertiter gegen das IBP-Virus, bestimmt durch AHS.
    ELISA Antikörpertiter gegen das IBD-Virus pro Gruppe in unterschiedlichen Altersstufen
    1 Tag 2 Wochen 3 Wochen 4 Wochen 5 Wochen 6 Wochen
    Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2
    1124 531 0 0 0 0 38 33 567 342 564 644
    1547 1927 0 2 0 0 174 57 648 368 826 809
    1799 2076 2 25 0 0 299 299 648 653 1038 1004
    2388 2584 8 38 0 0 570 325 954 907 1132 1012
    2421 2989 8 38 0 0 577 564 1005 986 1279 1462
    2453 3355 8 51 0 0 637 660 1024 1119 1314 1497
    2529 3466 13 57 0 0 721 690 1084 1167 1418 1524
    2704 4096 13 57 0 0 729 744 1114 1339 1550 1533
    3199 4550 19 64 0 0 751 886 1128 1339 1683 1674
    3600 5262 25 64 0 0 805 919 1152 1378 1701 1728
    32 77 0 0 867 984 1183 1388 1719 1844
    44 77 3 0 883 1031 1243 1456 1871 1853
    44 111 15 3 929 1084 1247 1460 1888 1897
    51 118 19 3 953 1141 1257 1577 1969 1987
    57 118 57 8 968 1185 1538 1577 1987 1906
    105 125 65 15 976 1261 1716 1972 2078 1996
    118 125 80 15 984 1269 1762 1987 2195 2014
    147 161 104 28 1000 1430 1767 448 2250 2123
    161 168 137 28 1078 1690 1873 613 2387 2214
    175 182 137 28 1567 1808 1875 1179 2432 2250
    234 197 137 113 1681 2009 1903 1217 2885 2314
    271 212 146 182 1772 2326 1993 1281 2968 2497
    278 234 154 214 1862 2362 2062 1308 3033 3005
    446 316 162 434 2011 3951 2654 1981 3616 3787
    Tabelle 30. Individuelle ELISA-Antikörpertiter gegen das TRT-Virus, bestimmt durch AHS.
    ELISA Antikörpertiter gegen das TRT-Virus pro Gruppe in verschiedenen Altersstufen
    1 Tag 2 Wochen 3 Wochen 4 Wochen 5 Wochen 6 Wochen
    Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2
    6167 1627 465 0 0 1134 85 46 316 0 0 0
    5889 2936 0 0 0 0 85 0 0 0 0 0
    6096 4819 371 602 0 0 0 0 0 0 19 0
    3542 1457 65 0 0 0 0 0 0 0 709 0
    1036 1853 0 1686 0 0 153 0 342 0 0 0
    3305 681 19 0 0 0 153 0 0 0 380 337
    1784 295 371 0 0 0 0 0 342 0 204 161
    7540 1332 2504 0 65 414 0 0 0 931 342 69
    3899 840 227 740 241 0 0 0 781 0 123 0
    9698 442 711 1612 346 0 383 0 19 0 0 0
    346 0 213 0 55 0 275 0 881 0
    565 0 0 376 0 0 709 0 0 69
    0 0 0 0 0 0 289 0 0 500
    1876 0 465 0 0 0 380 0 0 0
    0 0 0 0 0 126 106 0 0 0
    103 368 0 0 0 0 45 0 262 0
    0 1669 442 0 0 0 0 0 1669 0
    840 289 442 0 0 0 2620 0 0 0
    120 0 499 0 0 0 1289 0 0 0
    0 881 741 0 0 0 761 46 219 0
    499 1063 1008 89 169 0 852 0 204 365
    1161 0 227 0 282 0 781 0 0 89
    1547 0 103 144 454 0 204 0 0 144
    430 0 85 0 0 0 123 0 140 0
    Tabelle 31. Individuelle FAT-Titer gegen das MD-Virus, bestimmt durch CVL.
    FAT-Titer gegen das MD-Virus pro Gruppe in verschiedenen Altersstufen
    1 Tag alt 2 Wochen alt 3 Wochen alt 4 Wochen alt 5 Wochen alt 6 Wochen alt
    Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2
    800 ≥1600 100 200 100 400 100 ≥1600 800 200 800 800
    400 800 50 400 neg. 400 200 800 800 50 ≥1600 800
    ≥1600 800 50 200 100 200 100 200 400 ≥1600 800 800
    800 800 neg. 400 400 ≥1600 200 ≥1600 800 ≥1600 400 800
    400 200 100 400 50 400 100 400 200 400 800 800
    800 ≥1600 100 200 50 800 800 800 ≥1600 ≥1600 800 ≥1600
    400 400 100 100 50 800 200 ≥1600 800 400 800 ≥1600
    ≥1600 ≥1600 100 100 50 ≥1600 50 800 400 800 ≥1600 21600
    ≥1600 800 50 50 400 800 800 800 400 800 ≥1600 800
    400 800 50 200 400 400 100 800 ≥1600 800 800 800
    50 100 100 800 400 100 200 ≥1600 ≥1600 800
    100 200 200 200 50 400 ≥1600 400 ≥1600 ≥1600
    50 100 400 100 100 ≥1600 800 800 ≥1600 800
    50 200 200 ≥1600 800 800 ≥1600 800 ≥1600 800
    50 200 50 400 100 ≥1600 ≥1600 800 ≥1600 ≥1600
    100 200 400 200 100 200 400 ≥1600 400 ≥1600
    100 200 200 200 200 400 ≥1600 800 ≥1600 ≥1600
    50 200 100 200 800 ≥1600 800 ≥1600 400 ≥1600
    50 50 200 ≥1600 400 400 400 400 ≥1600 ≥1600
    100 100 100 400 ≥1600 800 800 800 100 ≥1600
    50 100 200 200 400 50 400 400 ≥1600 ≥1600
    neg. 100 200 200 400 400 ≥1600 ≥1600 200 ≥1600
    50 100 50 400 50 ≥1600 ≥1600 800 ≥1600 ≥1600
    neg. 100 100 800 800 400 ≥1600 400 ≥1600 ≥1600
    Tabelle 32. Individuelle ELISA-Antikörpertiter gegen das das ND-Virus,
    ELISA Antikörpertiter gegen das ND-Virus pro Gruppe in verschiedenen Altersstufen
    1 Tag 2 Wochen 3 Wochen 4 Wochen 5 Wochen 6 Wochen
    Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2
    6742 6546 901 1126 2507 258 1338 215 705 1563 3275 818
    9414 8225 454 550 490 175 500 175 1954 351 543 4924
    7434 6129 1689 576 245 175 179 2169 4934 6719 9252 377
    10709 10884 1123 384 6093 199 262 235 1172 596 434 1623
    5639 7348 1808 977 2278 2202 818 149 5709 1606 1427 1225
    1874 5096 864 1185 73 182 162 235 1964 1682 2010 9378
    9248 9033 1152 242 1957 1252 520 894 3457 2477 4477 1401
    6510 4179 1199 1652 5828 325 401 702 2119 285 4076 818
    7530 4997 735 801 215 225 5030 1960 3695 394 3623 3265
    7990 8434 460 2477 209 149 2179 242 1864 801 3858 2374
    1116 1010 5768 199 30 149 3176 242 2536 6990
    1427 1785 126 4503 1533 182 1334 3884 586 791
    1132 1652 2745 967 1063 1543 9305 1046 1136 884
    1921 669 245 626 901 818 6090 2308 1079 149
    752 775 215 225 871 50 222 4060 3192 139
    1457 1669 639 566 745 318 3146 623 3291 3146
    656 1099 1927 325 172 268 4222 1096 5205 3053
    1073 1709 113 199 1182 182 1179 977 4149 944
    3729 626 7477 242 1301 50 1079 437 8639 5305
    656 583 2070 132 66 450 616 1334 5679 937
    2715 917 447 242 179 460 6364 1470 2010 5424
    983 993 3997 318 371 182 2073 877 1589 2374
    2344 1093 430 325 96 126 3566 123 871 4467
    358 1553 321 4295 2285 977 86 3536 851 63
    bestimmt durch BC. Tabelle 33. Individuelle ELISA-Antikörpertiter gegen das ZB-Virus, bestimmt
    ELISA Antikörpertiter gegen das IB-Virus pro Gruppe in verschiedenen Altersstufen
    1 Tag 2 Wochen 3 Wochen 4 Wochen 5 Wochen 6 Wochen
    Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2
    3606 4019 609 700 671 504 496 354 1401 113 484 2230
    8858 7858 71 179 496 629 233 329 4331 1071 375 338
    8041 10238 671 629 671 434 596 434 1342 1784 442 538
    7254 7199 171 296 321 308 233 225 513 263 171 3152
    5386 6366 684 1105 221 1080 1296 179 825 338 4715 834
    8458 3231 321 388 271 271 2639 746 267 438 484 634
    4206 8296 896 504 521 700 196 1209 1863 1284 375 8075
    3177 2364 534 1059 784 354 1751 1034 592 475 7212 1547
    8267 6620 384 342 846 296 3039 1151 1384 163 117 3539
    5911 5290 158 688 721 1255 1034 571 429 488 1276 6257
    634 363 258 850 271 1601 742 1109 909 1372
    984 988 959 1000 971 271 1984 475 5603 7141
    521 667 521 2168 2526 988 1251 2943 1042 1684
    496 817 258 467 884 342 742 1346 934 288
    434 642 371 780 634 1255 975 1672 484 1109
    521 467 333 688 884 446 1793 1447 3460 1409
    384 780 1547 504 2289 780 346 200 1888 4786
    796 1392 1676 513 308 192 688 659 1984 1868
    183 1255 233 388 1184 1000 567 250 308 859
    1109 563 1184 296 671 805 333 350 1342 1034
    271 434 846 780 1713 133 525 450 158 5920
    296 342 221 513 584 513 1492 375 196 3139
    371 513 1009 1776 596 805 363 188 225 5619
    434 467 1559 667 1372 967 238 175 267 513
    durch BC Tabelle 34. Individuelle ELISA-Antikörpertiter gegen das IBD-Virus, bestimmt
    ELISA Antikörpertiter gegen das IBD-Virus pro Gruppe in verschiedenen Altersstufen
    1 Tag 2 Wochen 3 Wochen 4 Wochen 5 Wochen 6 Wochen
    Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2
    4992 3837 352 674 129 166 8581 184 5384 7522 8305 6358
    6396 3265 215 436 33 115 9353 7700 4798 6419 4698 7756
    5302 4215 129 352 76 2558 3938 9419 5133 12583 7539 7472
    8986 7267 730 45 26 29 1071 11617 4971 4881 7152 13687
    2112 5817 926 528 50 100 59 8172 6510 3848 4612 5131
    1829 5150 582 511 8044 174 121 4568 7488 7006 5047 5850
    7548 3613 687 192 76 2188 3574 4800 11164 5825 5373 7140
    1970 3624 644 769 186 158 2786 9591 4971 4383 7410 6833
    3898 2243 323 174 352 201 5652 4340 5762 6615 3090 5946
    3400 6978 76 1088 149 115 7776 6419 8829 333 7023 8192
    323 133 26 6777 7469 8866 3925 6225 8818 9620
    121 606 79 3455 9341 6336 5095 4822 7435 6261
    129 380 26 100 938 6992 6947 9934 3450 5789
    323 473 79 29 10310 5289 5825 5191 5398 2334
    50 462 94 45 551 5474 5436 6688 8424 3592
    404 316 102 108 4595 7435 4389 7533 7295 4868
    243 380 264 93 9600 5828 5248 6627 6156 5523
    344 325 18 38 8365 4090 5674 7006 8073 6128
    753 52 50 29 9069 6491 9992 5861 5185 10466
    215 209 205 68 5368 6444 6446 6103 6372 6297
    571 235 94 115 2714 11605 5839 3893 5811 8840
    139 425 79 2 5562 2047 5523 5047 6588 6945
    861 262 112 3703 5781 2755 5471 2953 6065 7104
    425 568 205 133 8177 4523 6599 3466 6421 5095
    durch BC Tabelle 35. Individuelle ELISA-Antikörpertiter gegen das TRT-Virus, bestimmt
    ELISA Antikörpertiter gegen das ND-Virus pro Gruppe in verschiedenen Altersstufen
    1 Tag 2 Wochen 3 Wochen 4 Wochen 5 Wochen 6 Wochen
    Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 1 Gruppe 2
    14811 1295 983 179 560 371 821 636 258 258 33 507
    18017 3530 99 66 195 46 225 248 344 354 215 583
    17444 6109 368 1334 99 401 238 513 460 497 517 1099
    6566 5815 298 103 427 103 268 136 248 172 536 2023
    19653 3338 99 2990 99 58 195 159 828 66 149 646
    2626 1854 99 169 722 103 17 103 397 76 53 583
    6285 288 146 219 56 136 99 401 560 291 129 411
    1325 1162 4086 248 338 656 166 2119 119 76 20 497
    7152 1467 447 626 540 169 318 626 86 225 387 119
    17563 1083 470 1844 288 46 530 921 225 732 440 1281
    480 209 166 483 407 533 685 593 1729 884
    417 788 56 798 983 705 1609 205 526 1099
    99 56 99 474 146 298 685 507 387 689
    4460 103 629 103 99 7 291 368 656 152
    99 103 99 7 579 228 106 195 106 646
    156 877 298 331 510 411 20 109 20 517
    447 228 540 106 407 169 387 109 1556 430
    1132 513 268 66 175 563 987 464 924 550
    348 381 136 533 288 411 1278 421 235 656
    96 1083 679 103 298 381 656 368 772 1023
    530 868 649 126 17 666 546 205 934 689
    1146 17 99 103 99 103 526 195 33 626
    2083 321 156 778 99 228 33 109 546 517
    712 1305 397 96 166 258 258 109 53 109
    durch BC.

Claims (11)

  1. Verwendung einer immunogen wirksamen Menge eines lebenden, attenuierten Stammes des Truthahn-Rhinotracheitis-Virus (TRT) bei der Herstellung eines In-ovo-Impfstoffs zum Schutz eines Vogelwirts gegen TRT und/oder TRT oder Syndrom des geschwollenen Kopfes (swollen head syndrome -SHS) verbunden mit Lungenversagen, wobei diese immungenetisch wirksame Menge den Bereich von 103.2 TCID50 bis 104.5 TCID50 pro Ei erreicht und dieser Impfstoff am oder vor dem Tag 24 der Inkubation verabreicht wird und wobei dieser Impfstoff aus einer gepufferten Lösung eines lebenden attenuierten Stammes des Truthahn-Rhinotracheitis-Virus in immungenetisch wirksamer Menge von 103.2 TCID50 bis 104.5 TCID50 pro Ei-Basis besteht.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei diese immunogen wirksame Menge in einem geeigneten Träger von 0,05 bis 0,1 ml pro Ei zubereitet ist.
  3. Verwendung nach entweder Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die immunogen wirksame Menge 103.2 TCID50 pro Ei beträgt.
  4. Verwendung nach entweder Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die immunogen wirksame Menge 104.2 TCID50 pro Ei beträgt.
  5. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Vogelwirt ein Truthahn- oder Hühnerembryo ist.
  6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei diese Verabreichung beim Truthahnembryo am Tag 24 der Inkubation erfolgt.
  7. Verwendung nach Anspruch 5, wobei diese Verabreichung beim Hühnerembryo am Tag 18 der Inkubation erfolgt.
  8. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die immunogen wirksame Menge gegen die nachfolgende Exposition des Truthahns und/oder Huhns nach dem Schlupf gegenüber dem virulenten Truthahn-Rhinotracheitis-Virus wirksam ist und keine Abnahme des Prozentsatzes der in-ovo geimpften Truthahn- und/oder Hühnereier, die nach Ablauf der Inkubationszeit ausschlüpfen, auslöst.
  9. Verwendung nach Anspruch 1, wobei dieser Impfstoff zusammen mit wenigstens einem anderen Impfstoff verabreicht wird, der aus der aus dem Newcastle Disease Impfstoff und infektiösen Bursitis Impfstoff bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  10. Verwendung nach Anspruch 1, wobei dieser Impfstoff mit einem post-in-ovo-Impfstoff verabreicht wird, der aus der aus dem infektiösen Bronchitis Impfstoff und dem Impfstoff der Marekschen Krankheit bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei dieser post-in-ovo-Impfstoff am 1. Lebenstag verabreicht wird.
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