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Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gegen Brucellose Brucellose
ist eine ansteckende Krankheit von Rindern, Schweinen und Ziegen und wird durch
Bakterien der Brucella-Gruppe hervorgerufen. Sie offenbart ihre Gegenwart in Tieren
durch Herbeiführen von Frühaborten des Fötus, wodurch dem Viehzüchter wirtschaftliche
Verluste nicht nur durch den Verlust der Jungtiere, sondern im Fall der Milchkühe
auch durch stark verminderte Milchproduktion entstehen.
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Brucellose stellt eine ernsthafte Bedrohung des Menschen dar, weil
die Ansteckungsorganismen durch Kontakt mit dem Fleisch infizierter Tiere oder durch
den Genuß infizierter Milch auf den Menschen übertragen werden können. Die Erkrankung
beim Menschen wird ebenfalls Brucellose genannt; daneben wird noch die ältere Bezeichnung
»undulierendes Fieber«, abgeleitet von den typischen Symptomen der wellenartigen
Fieberanfälle, gebraucht. Brucellose beim Menschen und beim Rind wird auch als »Bangsche
Krankheit« bezeichnet, nach B ang, der im Jahre 1897 den Zusammenhang zwischen dem
ursächlichen Bazillus und Fehlgeburten bei Rindern entdeckte.
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Verschiedene Typen des Brucella-Bazillus sind nach ihren Hauptwirten
eingeteilt worden. Brucella abortus ist der Organismus, der hauptsächlich die Krankheit
bei Rindern hervorruft; brucella suis oder Schweine-Brucella ist der für die Krankheit
bei Schweinen verantwortliche Typ; brucella melitensis ist der Mikroorganismus der
Ziegen.
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Kreuzinfektionen zwischen diesen Arten kommen jedoch vor; alle drei
sind pathogen. Die pathogene Wirkung beim Menschen schwankt. Brucella melitensis
ist am gefährlichsten; die Krankheit endet häufig mit dem Tode. Der Ausdruck »Malta-Fieber«,
den ursprünglich Bruce auf eine Krankheit anwandte, die ihm auf der Insel Malta
beheimatet schien, wird heute nur für den speziell durch brucella melitensis hervorgerufenen
Krankheitstyp gebraucht.
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Brucella abortus, der Rindertyp, wird als am wenigsten pathogen angesehen
und endet selten tödlich.
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Man nimmt aber an, daß nicht erkannte Infektionen mit brucella abortus
für viele Entkräftungszustände im Menschen verantwortlich sind, die für andere ernstere
Krankheiten empfänglich machen, z. B.
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Rheumatismusund Herzhautentzündung. Gesundheitsabteilungen in vielen
Staaten halten den Genuß von brucellainfizierter Milch für so bedrohlich für die
Gesundheit der Allgemeinheit, daß in vielen Staaten nur von solchen Herden Milch
verkauft werden darf, die frei von brucellainfizierten Rindern sind.
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Die Erfindung bezweckt, einen an Antigenen
reichen Im stoff herzustellen,
der gegen Brucella-Bakterien immunisiert, frei von lebenden Bakterien ist und den
bei den Herdenuntersuchungen benutzten Agglutinationstest nicht störend beeinflußt.
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Im Augenblick gibt es zwei bekannte Methoden zur Bekämpfung von Brucella-Infektion
bei Rindern.
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Die eine besteht darin, die infizierten Tiere durch regelmäßige Prüfung
der Herden auf Tiere, die auf den Agglutinationstest positiv reagieren, auszumerzen.
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Tiere mit positivem Testergebnis werden Reaktoren genannt; diese Tiere
werden abgeschlachtet. Herden und selbst ganze Gebiete können wohl gelegentlich
frei von Reaktoren sein; dieser Zustand kann aber nie von Dauer werden, da jedes
Tier Brucellose-Organismen aus infiziertem Wasser, vom Erdboden, durch Berührung
mit infizierter Streu in Lastwagen, durch Vögel und streuende Hunde aufnehmen kann.
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Ein Nachteil des strengen Ausmerzens ist, daß die verbleibenden Tiere
keine natürliche Immunität entwickeln können. Wenn also eine Herde der Infektion
ausgesetzt wird, kann sich ein schwerer Ausbruch
der Krankheit mit
Fehlgeburten bei bis zu 706/o der Tiere ergeben.
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Die zweite Methode, Brucellose unter Kontrolle zu bringen, ist eine
systematische Impfung der Kälber. Dieses Programm beruht auf der Erkenntnis, daß
das geschlechtlich unreife Kalb eine natürliche Immunität gegen Brucellose hat.
Durch Impfung der Kälber im Alter von 4 bis 8 Monaten wird diesen ein Schutz gegen
Infektion gegeben, weil ihr Immunitätsmechanismus durch die lebenden Brucella-Bakterien
angereizt wird; jedoch sind im Zuchtalter die Bakterien selbst nicht mehr vorhanden.
Ein besonderer Stamm des Brucella abortus, der vom US.-Landwirtschaftsministerium
entwickelt und als Stamm 19 bezeichnet wurde, wird in diesem Kälber-Impfprogramm
benutzt. Stamm 19 hat sehr niedrige Ansteckungskraft, ist jedoch hochantigen. Je
näher am Einsetzen der Geschlechtsreife, desto wirkungsvoller ist die Immunität,
aber desto größer ist auch die Gefahr, daß das Kalb die lebenden Bakterien nicht
abstößt und statt dessen ein Träger wird. Das unmittelbar vor der Geschlechtsreife
geimpfte Kalb behält außerdem einen hohen Immunstofftiter, der für das zur Zeit
angewandte Testprogramm irreführend ist.
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Ursprünglich wurde ein Titer von 1 : 50 in einem als Kalb geimpften
Tier auf bei der Impfung erzeugte Immunstoffe zurückgeführt; solche Tiere wurden
als nicht infiziert betrachtet. Bei einem ungeimpften Tier würde dieser Titer es
als verdächtig ausweisen. Das Vorkommen eines Titers von 1 : 100 bei geimpften Tieren
war so häufig, daß dieser Titer seit 1955 bei geimpften Tieren auf hochgradige Immunität
und nicht auf Infektion zurückgeführt wird. Die Richtigkeit dieser Annahme wird
von vielen Fachleuten bestritten, besonders angesichts der Tatsache, daß ein Titer
von 1 : 100 oft bei ungeimpften fehlgebärenden Kühen gefunden wird.
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Der wesentliche Nachteil des Kälber-Impfungsprogramms besteht darin,
daß die dem jungen Kalb durch Impfung vermittelte Immunität nicht sein ganzes produktives
Leben hindurch anhält. Nach drei- oder viermaliger Trächtigkeit ist die Infektionsrate
selbst bei geimpften Tieren recht hoch; sie erreicht manchmal 20 bis 406/0 in einer
Herde.
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Nachimpfung ausgewachsener Kühe, die ihre Immunität verloren haben,
mit dem Stamm-19-Impfstoff würde die Zahl der Fehlgeburten in einer Herde erheblich
herabsetzen, aber einige der geimpften Tiere würden Bakterienträger und infiziert
werden, selbst wenn sie nicht verwerfen würden. Solche Kühe würden Brucella-Organismen
in ihrer Milch abgeben und daher eine ernste gesundheitliche Bedrohung darstellen.
Es sind Anzeichen vorhanden, daß mit einem Wirtswechsel die ursprünglich niedere
Virulenz und Pathogenität vom Stamm 19 bei Rindern auf eine höchst virulente Form
beim Menschen zurückfällt.
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Kälberimpfung mit Stamm 19 ist im Augenblick trotz der großen Nachteile
das einzige amtlich anerkannte und zugelassene Vorgehen. Ihr größter Nachteil ist,
daß sie trotz sorgfältiger Handhabung zu einer ständigen Verbreitung lebender Brucella-Organismen
beiträgt.
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Seit einiger Zeit hat man erkannt, daß die Erhaltung der natürlichen
Abwehrkräfte die ideale Methode wäre, Brucellose unter Kontrolle zu bekommen. Dieses
Abwehrsystem ist das immunogene System des Körpers. Seine Vorgänge sind im ein-
zelnen
nicht bekannt; doch weiß man, daß ein Zustand der Immunität geschaffen wird, wenn
der Körper einer Infektion mit gewissen Bakterien ausgesetzt wird. Die so geschaffene
Immunität kann auf zweierlei Weise wirken. Sie kann gegen Infektion durch die Organismen
und ihr ständiges Vorhandensein im Körper (antiinfektiöse Wirkung) Schutz bieten,
oder sie kann nur den Körper gegen den unmittelbaren Schaden schützen, der durch
vorhandene Bakterien verursacht wird (antitoxische Wirkung).
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Im Fall der Brucellose würde letzteres auf das Vorkommen von Fehlgeburten
selbst zutreffen und ersteres auf die Entwicklung des Tieres zum Bakterienträger.
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Versuche zur Entwickung eines bekannten lebenden Impfstoffes gehen
auf die Zeit zurück, als Bang seine ursprüngliche Entdeckung machte. Die Verwendung
von Bakterienimpfstoffen aus abgetöteten Bakterien ist keineswegs neu; bei vielen
Krankheiten sind diese Stoffe wirksam, obgleich sie keinen lang anhaltenden Schutz
gewähren. Bei der Rinder-Brucellose ist die Impfung mit abgetöteten Bakterien nicht
erfolgreich gewesen. Im Lichte der gegenwärtigen Erkenntnisse scheint es möglich,
daß in den frühen Versuchen die Bakterien zu kräftig behandelt wurden. Wenn Brucella-Bakterien
durch Hitze oder gewisse Chemikalien abgetötet wurden, wurden die antigen aktiven
Systeme in den Bakterien in solchem Maße geändert, daß die speziellen an der Schutzerzeugung
gegen Brucellose beteiligten Antigene zerstört wurden. Das übliche Vorgehen bestand
aus Kochen oder sogar Autoklavieren oder Suspendieren in Phenol in Konzentrationen
über 0,5 0,5e/o oder in Formalin von 0,25 ovo oder höher. Gewöhnlich wurde die ursprüngliche
Bakteriensuspension zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit weggeschüttet, und
die resuspendierten Bakterien wurden für die Herstellung von Bakterienimpfstoffen
benutzt. Brucellose-Bakterien sind durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht, mit
Äther und durch Schallzerstörung abgetötet worden.
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Es wurde nun ein Verfahren zur Isolierung von antigener Substanz
aus dem Brucellose-Organismus entwickelt, mit dem die antiinfektiösen antitoxischen
Immunisierungssysteme empfindlicher gemacht werden können. In dieser Hinsicht ahmt
die antigene Substanz gemäß der Erfindung den Zustand nach, der besteht, wenn die
Rinder einer geringgradigen natürlichen Infektion ausgesetzt werden, die sie überwinden
können, ohne dauernd infiziert zu werden. Der Impfstoff gemäß der Erfindung kann
in jährlichen Abständen verabfolgt werden; das geimpfte Tier ist leicht von einem
infizierten Tier zu unterscheiden, da der Agglutinationstest an einem geimpften
Tier sich merklich in unten beschriebener Weise unterscheidet.
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Es wurde festgestellt, daß eine Extraktion von Brucella mit einer
wässrigen alkalischen Lösung mit einem p,-Wert größer als 7 und kleiner als 11 und
einer Ionenstärke (vgl. Lewis und Randall, Thermodynamics and the Free Energy of
Chemical Substances, New York, 1923, S. 373) unter etwa 0,3 eine an Antigenen reiche
Bakteriensuspension liefert.
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Die so erhaltene Suspension kann filtriert werden, um alle Bakterien
zu entfernen. Die Antigene jedoch passieren das Filter und sind im Filtrat vorhanden.
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Eine wäßrige Natriumcarbonatlösung mit einem Gehalt von etwa 0,5 bis
etwa 1 Gewichtsprozent Natriumcarbonat
(p=10 10 bis 11) ist bei
der Extraktion von Antigenen aus Brucella besonders wirksam. Der Extrakt kann gesammelt,
24 Stunden bei 50 C aufbewahrt und dann gefroren werden. Nach dem Auftauen werden
die Bakterien abzentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wird durch ein Sterilisationsfilter
abfiltriert. Konservierungsmittel werden nicht benötigt; das in diesem Verfahren
gewonnene Filtrat ist steril.
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Kontrolltests vor dem Zentrifugieren zeigen, daß die Bakterien in
diesem Stadium nicht tot sind; sie sterben jedoch allmählich ab, wenn sie mehrere
Tage lang mit der Natriumcarbonatlösung in Berührung bleiben. Das obenerwähnte Gefrieren
ist von einigem Nutzen beim Zerstören der Bakterien, ist jedoch nicht unbedingt
nötig, da die Antigene mit der Natriumcarbonatlösung extrahiert werden können, selbst
wenn das Gefrieren weggelassen wird.
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Nach einem bekannten Verfahren zur Darstellung von wirksamen Impfstoffen
aus säurefesten Bazillen werden derartige Bazillen zunächst bei Temperaturen bis
zu 40 C mit Alkalilauge zllr Quellung und darauf durch Wasserzusatz zu der gallertartigen
Reaktionsmasse bei Temperaturen unterhalb 60 C in Lösung gebracht. Als Alkalilauge
wird bei diesem Verfahren z. B. 10 0/obige Natronlauge verwendet, die einen p-Wert
von etwa 14 aufweist. Durch eine Lösung von so hohem Alkalitätsgrad würden Brucella-Bakterien
überwiegend zerstört und das antigene Material denaturiert werden. Das gleiche gilt
für ein anderes bekanntes Verfahren zur Herstellung von Lösungen oder Extrakten
aus Bakterien, wonach diese mit einer wäßrigen, das Natriumsalz eines Kondensationsproduktes
von höheren Fettsäuren und Aminoalkylsulfonsäuren und Natriumhydroxyd enthaltenden
Lösung behandelt werden. Auch die nach diesem Verfahren verwendeten Lösungen sind
zu stark alkalisch für die Zwecke der vorliegenden Erfindung. Abgesehen davon werden
nach beiden bekannten Verfahren die Bakterien nicht von der Lösung getrennt, so
daß der danach gewonnene Impfstoff Bakterien enthält.
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Nach einem bekannten Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen aus
einer lebenden Kultur von Brucella werden diese Bakterien durch mehrfaches Züchten
von Unterkulturen in einem Medium, welches d-Aminosäuren, wie d-Valin, enthält,
derart modifiziert, daß die virulenten Stämme abgetötet werden. Zum Unterschied
von dem erfindungsgemäßen Verfahren ist dieses Verfahren in Anbetracht der Notwendigkeit
der mehrfachen Anlegung von Unterkulturen sehr kostspielig. Außerdem enthält der
dabei gewonnene Impfstoff lebende Bakterien.
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Das bevorzugte Herstellungsverfahren für einem Impfstoff nach der
Erfindung wird in den folgenden Beispielen beschrieben.
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Beispiel 1 49 g dehydratisiertes Kartoffelinfusionsagar (Hersteller:
Difco Laboratories, Detroit/Michigan) wurden in 1000 ml destilliertes Wasser, welches
20/0 Glycerin enthielt, eingetragen. Das Gemisch wurde unter Rühren zum Kochen gebracht,
um den Agar aufzulösen.
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Rund 200 ccm Lösung wurden in einzelne Kulturflaschen von 0,951 eingebracht.
Die Flaschen wurden mit Baumwollstopfen verschlossen und 15 Minuten bei 15elf Überdruck
(1210 C) sterilisiert. Jede das Agarmedium enthaltende Flasche wurde mit etwa
5 ccm
einer Suspension lebender Brucella abortus (S-Form) beimpft, verschlossen und 3
Tage bei 37,50 C bebrütet.
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Das Bakterienwachstum wurde von der Agaroberfläche mit etwa 100 ccm
einer 10/obigen wässrigen Natriumcarbonatlösung abgewaschen und in eine Zentrifugenfiasche
übergefüllt. Danach wurde die Flasche bei Zimmertemperatur 24 bis 48 Stunden gelagert;
in dieser Zeit gingen die mit dem Brucella abortus verbundenen Antigene in Lösung.
Nach 48 Stunden wurde die extrakthaltige Flasche zentrifugiert und die überstehende
Flüssigkeit von den Bakterien abgegossen. Der Extrakt wurde durch ein Seitz-Sterilisationsfilter
unter geringem Druck filtriert.
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Das Filterelement des Seitz-Filters hat maximal eine Porengröße von
etwa 0,1 Mikron. Zweckdienliche Filter werden von Hercules unter der Bezeichnung
ST-Filter und ST-3-Filter hergestellt. Diese Filter halten alle Brucella-Bakterien
zurück. Da das ganze Filter vor Verwendung autoklaviert wurde, ist das Filtrat steril.
Das Filtrat beläuft sich auf etwa 80 ml und kann auf Kulturplatten auf Sterilität
getestet werden. Das Filtrat ist stark antigen aktiv und kann ohne Konzentrationsänderung
unmittelbar als Schutzimpfstofi gegen Brucellose benutzt werden. Der Impfstoff ist
bei Temperaturen oberhalb von 5° C mehrere Jahre lagerbeständig. Der impfstoff enthält
Katalase und proteinasehaltige Substanz, deren Beweglichkeit bei der Elektrophorese
- 5,9 10-5 bis - 1,0 10-5 cm/sec/Volt/cm beim Testen mit einem 0,05molaren Veronalpuffer
beträgt.
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Der gemäß Beispiel 1 hergestellte Impfstoff wurde in Mengen von 5
bis 40 ccm subcutan in den Nacken von Kühen injiziert, die beim Agglutinationstest
negativ reagierten. Alle entwickelten Titer von 1:100 in 7 bis 10 Tagen.
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Die geimpften Tiere können von den nichtgeimpften infizierten Tieren
durch feine Unterschiede im Agglutinationstest differenziert werden. Blutserum eines
infizierten Tieres verursacht in der Regel Koagulieren oder Zusammenballen zugesetzter
toter Bakterien. Blutserum einer schutzgeimpften (nichtinfizierten) Kuh gibt einen
Niederschlag, dessen Teilchen unverkennbar kleiner sind. Wenn der Agglutinationstest
in üblicher Weise durchgeführt wird, indem man etwas Serum auf eine Glasplatte überträgt,
wandern die feinverteilten Teilchen an den Rand des Serumfleckens, dessen mittlerer
Teil klar bleibt. Die größeren Niederschlagteilchen, das Ergebnis eines positiven
Testes eines infizierten Tieres, wandern nicht, sondern bleiben über die ganze Serummasse
gleichmäßig verteilt.
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Alle Kühe wurden in einer Gruppe gehalten und hatten die gleichen
Entwicklungsmöglichkeiten.
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Innerhalb eines Monats fiel der Titer auf 1 : 50 cder darunter mit
Ausnahme der Tiere, welche mit 40 ccm injiziert waren. In einigen Fällen traten
kurzdauernde Verhärtungen an der Injektionsstelle auf; in keinem Fall wurde eine
Abszeßbildung beobachtet. Nur eine Kuh zeigte eine allgemeine systemische Reaktion,
die einige Tage dauerte. Der Impfstoff kann zusammen mit Polyvinylpyrrolidon oder
Polyvinylmethyläther oder anderen Hilfsstoffen verabfolgt werden, die eine Depotwirkung
ergeben.
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Die Wirkung der Schutzimpfung mit dem Impfstoff gemäß Beispiel 1
ist aus Tabelle 1 ersichtlich. In Tabelle II sind die Ergebnisse der Kontrollherde
zusammengestellt.
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Ergebnisse für Schutzimpfungen von Kühen mit Impfstoff gemäß Beispiel
1 TabelleI
| Menge |
| Kühe an Ergebnisse |
| hnpfstoff |
| Extrahiert mit 10/obiger Natriumcarbonatlösung |
| 1 Red Poll 20 ccm geimpft; negativ 2 Jahren nach |
| 2Jahren |
| 2 Red Poll 20 ccm geimpft; negativ nach |
| 2Jahren |
| 3 Red Poll 40 ccm geimpft; tiefe intramusku- |
| läre Impfung, verwarf |
| 7 Monate und 17 Mo- |
| nate nach Impfung; |
| wurde nach drei weiteren |
| Monaten negativ |
| 4 Red Poll 40 ccm geimpft; negativ nach |
| 2Jahren |
| 5 Red Poll 20 ccm geimpft; negativ nach |
| 2Jahren |
| 6 Hereford 10 ccm geimpft; bis zur Entfer- |
| nung aus der Testherde |
| negativ |
| 11 Red Poll 5 ccm geimpft; negativ nach |
| 1Jahr |
| 13 Red Poll 5 ccm geimpft; negativ nach |
| 1 Jahr |
| 24 Red Poll 5 ccm geimpft; wurde verdächtig |
| nach 1 Jahr (nach Kal- |
| ben); wurde negativ nach |
| einem weiteren Monat |
| 25 Red Poll 5 ccm geimpft; negativ für |
| 1l/2 Jahre, dann noch- |
| mals geimpft |
| 30 Red Poll 5 ccm geimpft; negativ für |
| 11/2 Jahre, dann noch- |
| mals geimpft |
| 31 Red Poll 5 ccm geimpft; negativ für |
| 1l/2 Jahre, dann noch- |
| mals geimpft |
| 32 Red Poll 5 ccm geimpft; negativ für |
| 11/2 Jahre, dann noch- |
| mals geimpft |
| 29 Angus 5 ccm geimpft; negativ für 1 Jahr |
| 10 Monate, dann künst- |
| lich infiziert, kein An- |
| stieg des Titers |
| 16-6 Guernsey 10 com geimpft; künstlich infiziert |
| nach 5 Monaten; Reak- |
| tor nach 7Monaten; nega- |
| tiv nach 1 Jahr, kalbte |
| normal; blieb 2l/2 Jahre |
| negativ |
| 11 Holstein 10 ccm geimpft; künstlich infiziert |
| nach 1 Jahr 2 Monaten; |
| blieb 2l/2 Jahre negativ; |
| aus der Testherde ent- |
| fernt |
| Menge |
| Kühe an Ergebnisse |
| Impfstoff |
| 13 Holstein 10 ccm geimpft; künstlich infiziert |
| nach 1 Jahr 2 Monaten; |
| wurde verdächtig nach |
| zwei weiteren Wochen; |
| wieder negativ nach un- |
| gefähr 11/2 Monaten nach |
| künstlicher Infektion; aus |
| der Testherde nach |
| 2l/2 Jahren entfernt |
| 14 Holstein 10 ccm geimpft; künstlich infiziert |
| nach 1 Jahr 2 Monaten; |
| Reaktor nach zwei wei- |
| teren Wochen; 1l/2 Mo- |
| nate nach künstlicher In- |
| fektion negativ |
| 18 Holstein 10 ccm geimpft; künstlich infiziert |
| nach 4'/2 Monaten und |
| 5 5 Monaten; blieb negativ |
| 19 Kühe insgesamt Ein Reaktor = 5,2 0/o In- |
| fektionsrate |
Tabelle II
| Kühe Ergebnisse |
| Kontrollversuche - nicht geimpft |
| 21 Red Poll wurde in 2 Monaten Reaktor; ver- |
| worfen nach 11 Monaten |
| 29 Red Poll wurde in 5 Monaten Reaktor |
| 36 Red Poll wurde in 5 Monaten Reaktor und |
| verwarf |
| 37 Red Poll wurde in 4 Monaten Reaktor und |
| verwarf |
| 6 Red Poll wurde nach 10 Monaten Reaktor |
| 34 Angus blieb negativ |
| 9 Guernsey blieb negativ nach 1 Jahr |
| 7 Kühe |
| insgesamt Fünf Reaktoren = 71,4 0/o Infektions- |
| rate |
In der Herde wurden 50°/o der nicht behandelten Kontrolltiere (innerhalb von 10
Monaten) Reaktoren; einige verwarfen. Brucella wurde aus Uterus, Placenta und aus
der Milch gewonnen. Die Kühe, die mit dem Natriumcarbonatextrakt geimpft waren,
waren nach 2 Jahren völlig infektionsfrei; eine Kuh blieb 4 Jahre negativ.
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Beispiel 2 Beispiel 1 wurde mit der Abweichung wiederholt, daß die
Natriumcarbonatlösung des Beispiels 1 durch eine 0,4 e/oige wäßrige Natriumhydroxydlösung
ersetzt wurde. Die Existenz von Antigenen in der verdünnten ätzalkalischen Lösung
wurde durch Filtrieren der Brucella und Impfen von Kühen mit dem Filtrat erwiesen.
Die so geimpften Kühe ergaben einen positiven Bluttest (Agglutinationstest) innerhalb
von 10 Tagen. Der feinverteilte Niederschlag, der
bei diesem Test
beobachtet wurde, ist eher ein Anzeichen einer Schutzimpfung als einer aktiven Infektion.