DE3136430C2 - - Google Patents

Description

Die Anwendung betrifft den im Anspruch 1 angegebenen Orfvirus-Stamm D 1701. Die Ansprüche 2 bis 4 betreffen ein Verfahren zur Herstellung von Orfvirus-Lebendimpfstoff und der Anspruch 5 betrifft dessen Verwendung.

Orf-Infektionen (Ecthyma contagiosum, Postulardermatitis, Lippengrind) sind bei den Schafen schon lange bekannt. Sie sind unbiquitär in den Schafpopulationen verbreitet, führten bisher in der Regel aber nur vereinzelt zu klinischen Ausbrüchen. Erst durch den zunehmenden Trend zu intensiveren Haltungsmethoden in der Schafzucht, wie z. B. Lämmermast an der Lammbar, beobachtet man Seuchenausbrüche, die zu schweren wirtschaftlichen Verlusten führen. Für die Ziegen treffen die gleichen Kriterien zu. Da sie aber gegenüber der Schafhaltung wirtschaftlich unbedeutend sind, wird im folgenden nur von den Verhältnissen beim Schaf gesprochen. Der Erreger gehört zur Familie Poxviridae, Genus Parapaxvirus, Spezies Parapoxvirus ovis.

Die üblichen konservativen Behandlungsmethoden bleiben ohne durchschlagenden Erfolg, da sie das Infektionsgeschehen in den betroffenen Herden nicht verringern können. Auch die Schutzimpfung mit den bisher bekannten Lebendimpfstoffen befriedigte nicht. Hohe Restvirulenz des Impfvirus mit vermehrten Impfkomplikationen (Impferkrankungen), kutaner Applikationsmodus, zu später Impfstoffeinsatz, geringe Virusmenge pro Impfdosis, fehlende Revaccinationen u.a.m. sind Gründe für die schlechten Impfergebnisse.

Die Immunität gegen die Postulardermatitis, wie sie im Verlaufe einer natürlichen Infektion erworben wird, ist sehr labil und hält in der Regel nicht länger als 8 Monate. Sie beruht im wesentlichen auf zellulären Immunitätsmechanismen. Antikörper werden je nach Verlaufsform (klinisch inapparent, Lokalkrankheit, zyklischgeneralisierte Allgemeinkrankheit) sehr unterschiedlich gebildet. Häufig können im Verlaufe eines natürlichen Infektionsgeschehens bei sehr jungen Tieren weder neutralisierende noch komplementbindende oder präzipitierende Antikörper nachgewiesen werden. Bei erwachsenen Schafen findet man dagegen relativ häufig Antikörper, da sich die Tiere im Verlauf ihres Lebens immer wieder anstecken, was zu einem Booster mit entsprechender Antikörperbildung führt. Die Antikörper werden von der Mutter auf die Neugeborenen übertragen, schützen aber nicht immer.

Eine aktive Schutzimpfung gegen Ecthyma (Pustulardermatitis) muß die vorstehend genannten Gegebenheiten berücksichtigen. Die bisherigen Lebendimpfstoffe werden wegen ihrer Restvirulenz cutan bzw. percutan angewendet. Sie besitzen bezüglich Wirksamkeit den Nachteil, daß sie zwar zu einer guten zellulären, aber nur geringen humoralen Immunität führen. Rein technisch besteht zudem die Möglichkeit, daß nicht genügend Impfvirus über die Skarifikation bzw. percutane Impfung verabfolgt wird, was zu einer verminderten bzw. ausbleibenden Immunitätsbildung führt. Bezüglich Unschädlichkeit haben sie noch weit mehr Nachteile. Wegen ihrer Restvirulenz sind sie für neugeborene Lämmer und nicht-immune Kontakttiere durch Auslösung von Impferkrankungen gefährlich. Die cutane bzw. percutane Verabreichung führt zu lokalen Pustelbildungen, die in mehrerlei Hinsicht bedenklich sind. Die Impflinge können sich über die lokalen Impfreaktionen sekundär mit Bakterien und anderen Infektionserregern infizieren. Bei säugenden Mutterschafen kann es zu einer Infektion des Euters und damit zur Infektion der Lämmer kommen. Wird anstelle der Innenschenkel die Unterseite des Schwanzansatzes als Applikationsort verwendet, ist eine Selbstinfektion der Vulva möglich. Die größte Gefahr besteht jedoch für die Umgebung über die Verbreitung des Impfvirus durch Kontakt empfänglicher Schafe mit den Impfpusteln und abfallenden Impfborken und -krusten. Nicht geimpfte Schafe, besonders wenn sie sich gerade im Stadium einer Immunsuppression befinden, können dadurch schwer erkranken. Cutan geimpfte Tiere dürfen bis zum Abfall der Impfkrusten deshalb nicht in den Markt gebracht werden. Mutterschafe sind nur dann impffähig, wenn die Impfung spätestens 6 bis 8 Wochen vor der Lammzeit durchgeführt wird. Letztlich sind die cutanen Lebendimpfstoffe wegen ihrer Restvirulenz auch für den Menschen gefährlich. Aus all diesen Gründen sind die bisherigen Orfvirus-Cutan-Lebendimpfstoffe in der Regel nur als Notimpfung eingesetzt worden.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, einen attenuierten und durch Klonselektion gereinigten Orf-Virusstamm zu schaffen, der sich aufgrund seiner fehlenden Pathogenität und seiner guten Immunogenität zur Herstellung eines Lebendimpfstoffes eignet, der Schafen und Ziegen parenteral gegeben wird, dennoch keine Nebenwirkungen zeigt und zugleich eine signifikante Senkung der Mortalität bei Schafen und Lämmern induziert. Diese Aufgaben werden gemäß den Patentansprüchen gelöst.

Der erfindungsgemäße Orfvirus-Lebendimpfstoff besitzt die oben genannten Nachteile nicht. Die parenterale Verabreichung gewährleistet, daß jeder Impfling die für eine Immunisierung notwendige Impfdosis tatsächlich erhält. Großflächige Hautläsionen mit Gefahr einer bakteriellen Kontamination entstehen ebenso wenig wie Kontaktinfektionen neugeborener Lämmer oder Selbstinfektionen der Vulva. Eine über abfallende Pusteln und Krusten mögliche Verbreitung des Impfvirus mit Gefährdung empfänglicher Tiere und Menschen unterbleibt. Der Impfvorgang ist durch die parenterale Applikation gegenüber der kutanen einfach und nicht zeitaufwendig.

Neben diesen Gegebenheiten ist der dem Orfvirus-Lebendimpfstoff zugrunde liegende Impfstamm avirulent und ohne Kontagiosität. Neugeborene, empfängliche Lämmer erkrankten auch bei überhöhter Impfdosis nicht und stecken gleichaltrige Tiere per Kontakt nicht an. Trächtige Tiere überstehen die Impfung komplikationslos, die Neugeborenen bleiben reaktionsfrei. Aus all diesen Gründen eignet sich der Orfvirus-Lebendimpfstoff der Erfindung nicht nur zur Notimpfung, er kann auch gefahrlos prophylaktisch sowohl zum Schutz empfänglicher, gefährdeter Herden wie bei Lämmern an der Lammbar eingesetzt werden.

Bezüglich Wirksamkeit ist dieser Orfvirus-Lebendimpfstoff den bisherigen Orfvirus-Cutan-Impfstoffen ebenfalls überlegen. Er induziert eine systemische Immunität, die sowohl zellulär wie humoral ausgebildet wird. Eine Boosterimpfung ist in kurzem Abstand möglich und erhöht die Wirksamkeit, besonders bezüglich Ausbildung humoraler Immunitätsmechanismen. Ein weiterer Vorteil des Lebendimpfstoffes liegt darin, daß bereits 2 bis 3 Tage alte Lämmer aktiv durch eine zweimalige Impfung im Abstand von 10 bis 14 Tagen immunisiert werden können. Bei Impflingen mit einer natürlich erworbenen aktiven Immunität wirkt die Schutzimpfung als Booster. Bei Lämmern mit einer passiv erworbenen, maternalen Immunität ist sie indifferent.

Besonders charakterisiert ist der neue Orfvirus-Lebendimpfstoff durch die Eigenschaften des Orfvirus-Impfstammes D 1701. Er unterscheidet sich von den bisher bekannten, in Orf-Lebendimpfstoffen enthaltenen Impfviren.

• 1. durch die Art seiner Gewinnung als Virusausgangsmaterial über eine Selektion in Zellkulturen aus Organen oder Geweben von Wiederkäuerembryonen, vorzugsweise in sekundären Nierenkulturen von Schafembryonen, aus dem Pustelmaterial eines an generalisierter Pustulardermatitis erkrankten Lammes, das gleichzeitig mit Adenovirus mischinfiziert war;
• 2. durch die Art seiner Attenuierung in Zellkulturen aus Organen oder Geweben von Wiederkäuerembryonen, vorzugsweise in sekundären Nierenkulturen aus Schafembryonen mittels kontinuierlicher Passagen (Endverdünnungsmethode), die zu einem Virulenzverlust des Orfvirus für Lämmer und Schafe unter Erhalt der immunisierenden Eigenschaften führte;
• 3. durch die Fähigkeit, sich auch in heterologen Zellkulturen, vorzugsweise in sekundären Zellkulturen aus Ringerembryolungen (heterologes Zellsystem) zu vermehren, wodurch für die Impfstoffherstellung ein heterologes Zellsystem verwendet werden kann, das eine endogene Kontamination des Impfstoffes bei der Produktion mit Schafviren und Chlamydien des Schafes verhindert;
• 4. durch seine hohe Vermehrungsintensität in sekundären fötalen Ringerlungenkulturen mit Titern bis 10^8,0 KID₅₀/ml, die eine wirtschaftliche Produktion des Impfstoffes ermöglicht;
• 5. durch seine Stabilität während und nach der Lyophilisierung bei Temperaturen unter +4°C über 3 Jahre;
• 6. durch seine guten immunisierenden Eigenschaften nach parenteraler Applikation bei Lämmern und Schafen;
• 7. durch seine Unschädlichkeit für neugeborene Lämmer und trächtige Schafe nach parenteraler Applikation;
• 8. durch seine fehlende Kontagiosität.

Die Gewinnung des neuen Orfvirus-Impfstammes unterteilt sich in 3 Stufen, wobei in der 1. Stufe die Abtrennung von evtl. vorhandenen anderen Virusarten erfolgt. In der 2. Stufe erfolgt die Vermehrung des neu gewonnenen Virusmaterials und dessen erste Klonselektion zur Gewinnung eines genetisch einheitlichen Virusmaterials. In der 3. Stufe wird dieses genetisch einheitliche Virusmaterial einer weiteren Attenuierung und einer nachfolgenden 2. Klonselektion unterzogen.

Der neue Orfvirus-Impfstamm kann in der Praxis unter folgenden Bedingungen gewonnen werden:

1. Stufe:
Als Ausgangsmaterial dient Gewebematerial, z. B. Pustelmaterial aus dem Maulbereich eines neugeborenen oder einige Wochen, vorzugsweise 2 Wochen alten Lammes, das an einer schweren, generalisierten Pustulardermatitis erkrankt oder gestorben ist. Das Gewebematerial wird in an sich bekannter Weise zur Gewinnung einer detritusfreien Suspension aufgearbeitet (Zerkleinern durch verschiedene Methoden, Aufnehmen in Antibiotika-haltiger, gepufferter Salzlösung, Abzentrifugieren, Verwendung des Überstandes). Die erhaltene zellfreie Suspension wird auf Zellkulturen aus Organen oder Geweben von Wiederkäuerembryonen, vorzugsweise sekundären Nierenkulturen von Lammembryonen verimpft. Durch mindestens 4, vorzugsweise 7 Passagen in derartigen Zellkulturen, werden gleichzeitig vorhandene Adenoviren oder andere Virusarten entfernt. Die Passagen werden bei 33° bis 39°C, vorzugsweise 37°C, durchgeführt.

2. Stufe:
In der Vermehrungsstufe werden ebenfalls Passagen in Zellkulturen von Organen oder Geweben aus Wiederkäuerembryonen, vorzugsweise in sekundären Nierenkulturen von Lammembryonen bei 33° bis 39°C, vorzugsweise 37°C, durchgeführt. Das Virusmaterial der 16. Passage wird in an sich bekannter Weise über 3 Plaque-Passagen einer Klonsektion unterzogen. Das dabei gewonnene, genetisch einheitliche Orfvirus- Material wird für die 3. Stufe verwendet.

3. Stufe:
In der Attenuierungsstufe wird das nunmehr genetisch einheitliche Virusmaterial durch mindestens weitere 80, vorzugsweise mindestens 120 Passagen bei 33° bis 39°C, vorzugsweise 37°C, in den in Stufe 2 genannten Zellkulturen attenuiert. Dabei werden nach jeder Passage lichtmikroskopische und elektronenoptische Untersuchungen der Virusernten eingeschaltet. Außerdem wird nach jeder Passage der Infektiositätstiter in Zellkulturen geprüft. Untaugliches Passagematerial wird vernichtet.

Für den Nachweis der Wirksamkeit und Unschädlichkeit werden jeweils 2 Lämmer im Alter von 1 bis 2 Tagen aus einer Orfvirusfreien Zucht (serologisch negativ) subcutan mit 1 ml vermehrungsfähigem Orfvirus der betreffenden Passage (2 × 10⁷ KID₅₀/ml) geimpft und 21 Tage mit gleichalten, nicht geimpften Lämmern gleicher Abstammung gehalten. Erkranken die Tiere in diesem Zeitraum nicht, werden sie anschließend für den cutanen Wirksamkeitstest verwendet. Hierfür werden die Lämmer mit 10⁶KID₅₀/ml virulentem Orfvirus der 16. Passage percutan nach der Skarifikationsmethode nach Herzberg (vgl. A. Mayr, P.A. Bachmann, B. Bibrack und G. Wittmann: Virologische Arbeitsmethoden, Gustav Fischer Verlag, 1974, Band 1, Seite 599) an der Schenkelinnenfläche testinfiziert. Ein belastbarer Immunschutz besteht dann, wenn es innerhalb von 21 Tagen nach der Testinfektion an den Skarifikationsstellen weder zu einer infiltrativen, länger anhaltenden Rötung mit Quaddelbildung, noch zu einer Papel- oder Pustelbildung kommt. Die Tiere dürfen auch keine Störung des Allgemeinbefindens zeigen. Als Kontrollen werden jeweils einige gleichalte, nicht geimpfte Lämmer, testinfiziert.

Die Prüfung der Wirksamkeit und Unschädlichkeit des Passagematerials wird in regelmäßigen Abständen, d. h. nach jeweils 20 bis 30 Passagen, durchgeführt.

Aufgrund der Ergebnisse der Kontrolluntersuchungen der 120. Zellkulturpassage in embryonalen Lammnierenkulturen werden noch weitere 15 Passagen zur Sicherheit durchgeführt. Die Virusernte der 135. Passage wird zur Herstellung des Orf- Impfvirusstammes verwendet. Hierfür wird die Virusernte in an sich bekannter Weise über 3 Klonisierungs-Passagen mittels Plaquetechnik genetisch gereinigt und anschließend in embryonalen Lammnierenkulturen vermehrt. Für die Verwendung zur Impfstoffherstellung wird dieses genetisch einheitliche Virusmaterial über mindestens einer, vorzugsweise 1 bis 2 Passagen, auf embryonale Ringerlungenkulturen adaptiert.

Die Original-Plaque nach der 3. Klonselektion der 135. Passage, d. h. der Orf-Impfvirusstamm, wird mit D 1701 bezeichnet. Eine Probe dieses Stammes ist bei der Bayerischen Landesimpfanstalt, Am Neudeck 1, 8000 München 95, unter der Nummer D 1701 am 2. September 1981 hinterlegt worden.

Der neue Orfvirus-Lebendimpfstoff kann nach den üblichen Methoden aus dem Original-Plaque D 1701, d. h. dem Orf-Impfvirusstamm, hergestellt werden, z. B. in primären oder sekundären Zellkulturen oder in permanenten Zellinien aus Warmblütergeweben, unter Einschaltung der üblichen Kontrollen auf bakterielle, virale oder Pilz-Kontaminationen und unter Beachtung der bekannten Grundsätze und Anforderungen für die Herstellung von Impfstoffen.

Der erfindungsgemäße neue Impfstoff kann durch Vermehrung des Orf-Impfvirusstammes D 1701 in Zellkulturen von Vögeln oder Säugern, die empfänglich für das Orfvirus sind, vorzugsweise in primären, sekundären oder permanenten Zellkulturen aus Organen oder Geweben von Wiederkäuerembryonen, insbesondere in sekundären Nierenkulturen von Lammembryonen, durch Bebrütung bei 33° bis 39°C, vorzugsweise bei 37°C, hergestellt werden. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden zur Impfvirusvermehrung sekundäre Lungenzellkulturen aus Ringerembryonen verwendet, da diese leichter zu beschaffen sind und zusätzlich eine höhere Zellausbeute garantieren. Auch die Verwendung dieser Zellkulturen als Suspensionskulturen oder Microcarrier-Kulturen ist möglich.

In der besonders bevorzugten Ausführungsform werden für die Herstellung des Orfvirus-Lebendimpfstoffes sekundäre Zellkulturen aus Lungen von Rinderembryonen benutzt. Deren Herstellung erfolgt nach der üblichen Trypsininisierungstechnik in Industrieflaschen bei stationärer Bebrütung. Das Zellsediment der Anzuchtpassage wird bakteriologisch und mykologisch nach den internationalen Vorschriften auf Kontaminationen untersucht. Die Beobachtungszeit der flüssigen und festen Nährböden (aerob und anaerob) beträgt 14 Tage bei +37°C und Raumtemperatur (20° bis 24°C). Das Anzuchtmedium besteht vorzugsweise aus Eagle-Earle′scher Lösung + 10% Lactalbumin + 10% fötales Rinderserum + Antibiotika; beim Erhaltungsmedium beträgt der prozentuale Anteil des Lactalbumin 5% und des fötalen Rinderserums 2%.

Für die Animpfung der sekundären fötalen Rinderlungenkulturen wird jeweils frisches Saatvirus des Orfvirus-Stammes D 1701 (d. h. plaquegereinigtes Virus) verwendet, das zwecks Adaptierung zuvor jeweils 1 bis 2 Passagen in sekundären Lungenkulturen aus Rinderembryonen durchläuft. Die Animpfdosis beträgt 4 × 10^7,5 KID₅₀.

Die virusinfizierten Zellen werden 3 bis 10 Tage, vorzugsweise 4 Tage, bis zur Ausbildung eines optimalen cytopathischen Effektes, bei 33° bis 39°C, vorzugsweise bei 37°C, bebrütet. Anschließend werden die Zellkulturen in toto bei -20° bis -70°C oder bei tieferen Temperaturen eingefroren. Bis zum Abschluß der bakteriologischen, virologischen und mykologischen Untersuchungen und der Kontrollen der nicht beimpften Zellkulturen verbleiben die Virusernten bei dieser Temperatur. Wenn alle Kontrollen den Sicherheitsvorschriften entsprechen, werden die Virusernten aufgetaut. Dadurch werden noch intakte Zellen zerstört und damit zellgebundenes Virus freigesetzt, wodurch sich der Virustiter erhöht. Unter sterilen Bedingungen werden danach die Zellen und der Zelldetritus mittels Filtration oder Zentrifugation, bevorzugt durch Zentrifugieren mit 300 g entfernt. Dem Filtrat bzw. dem Überstand werden Stabilisatoren, vorzugsweise je 2,5% Molico (Magermilchpulver) und 2,5% Pepton zugefügt.

Es können natürlich auch andere Methoden zum Aufschluß der Zellen, z. B. Ultraschall, sowie andere, für das Orfvirus geeignete Stabilisatoren, verwendet werden.

Abschließend werden die Virussuspensionen auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt, portioniert, z. B. in Mengen von 4 ml, und lyophilisiert. Der lyophilisierte Orf-Lebendimpfstoff ist bei einer Lagerung bei +4°C oder niedrigeren Temperaturen mindestens 3 Jahre stabil. Der Infektionstiter des Lyophilisates bleibt unter diesen Bedingungen in einem Zeitraum von 3 Jahren unverändert.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Als Ausgangsmaterial dient Pustelmaterial aus dem Maulbereich eines etwa zwei Wochen alten Lammes, das an einer schweren, generalisierten Pustulardermatitis (Ecthyma) erkrankt war. Das Pustelmaterial wird nach entsprechender Aufarbeitung (Aufschluß, Gewinnung des detritusfreien Überstandes) elektronenoptisch (Abklatschpräparat) untersucht und gleichzeitig auf Sekundärkulturen (übliche Trypsinierungstechnik) verschiedener Organe und Gewebe von Lammembryonen, vorzugsweise auf Sekundärkulturen aus Haut, Niere und Hoden von Schafembryonen verimpft. Das Anzuchtmedium für alle drei Zellkulturarten besteht aus Earle′scher Lösung mit 10% Lactalbumin (LA), 10% fötalem Rinderserum (FRS) und einem üblichen Antibiotikazusatz. Beim Erhaltungsmedium (Virusmedium) wird der prozentuale Anteil des Lactalbumins auf 5% und des fötalen Rinderserums auf 2% gesenkt.

Nach Auftreten eines klaren cytopathischen Effektes (cpE) bzw. nach 3 bis 5 Tagen werden die beimpften Kulturen für die Virusernte bei -20°C eingefroren, wieder aufgetaut und auf neue Zellkulturen der gleichen Art verimpft (0,1 ml pro Röhrchen). Jede Virusernte wird außerdem bakteriologisch sowie virologisch, lichtmikroskopisch und elektronenoptisch auf das Vorhandensein von Plasmaeinschlüssen bzw. typischen Viruspartikeln untersucht.

Von jeder Passage wird außerdem der Infektiositätstiter in der Zellkultur, die für die Passage verwendet wurde, festgestellt. In der 16. Passage beträgt der Infektiositätstiter 10^6,75 KID₅₀/ml gegenüber einem Titer von 10^4,5 KID₅₀/ml in der 2. Passage. Wenn zu diesem Zeitpunkt auch eine gleichzeitig bei der Anzucht vorhanden gewesene, andere Virusart nicht mehr nachweisbar ist, wird mit der Virusernte der 16. Passage eine Klonselektion über 3 Plaque-Passagen durchgeführt.

Für die Plaquereinigung können Schälchen-(Animpfung) und Röhrchenkulturen (Vermehrung des Plaquevirus) verwendet werden.

Die Plaqueschälchen werden nach der bekannten Methode mit Nierenzellen aus Schafembryonen (1. Subkultur) angelegt. Verimpft werden Virusverdünnungen (10^-4 bis 10^-6) auf jeweils 3 Schälchen (0,2 ml pro Schälchen). Die Adsorptionszeit beträgt 2 Stunden. Danach wird mit 3 ml 2prozentigem Difco-Agar + doppeltem Eagle-Earle mit 10% fötalem Rinderserum (Mischungsverhältnis 1 : 1) überschichtet. Aus den Verdünnungen 10^-4, 10^-5 und 10^-6 werden nach einer Bebrütungszeit von 4 bis 5 Tagen bei 37°C im CO₂-Brutschrank Plaques gestochen und auf Röhrchen-Kulturen überimpft (2. Subkultur mit Anzuchtmedium Earle′scher Lösung +2% FRS +5% LA). Dies ergibt die 1. Plaquereinigungspassage. In gleicher Weise wird eine 2. und 3. Plaquereinigung vorgenommen, wobei das in den Röhrchen angezüchtete Virus jeweils wieder auf Plaqueschälchen ausgesät wird.

Das Virusmaterial der 3. Plaquereinigung wird dann in sekundären Nierenzellkulturen aus Schafembryonen vermehrt, gereinigt und bakteriologisch sowie virologisch (Elektronenmikroskop, Serologie) nochmals überprüft.

Anschließend wird das so gewonnene Virusmaterial auf Unschädlichkeit und Immunogenität im Tierversuch an 2 seronegativen, 1 bis 2 Tage alten Lämmern geprüft. Sie werden subcutan mit 1 ml Virusmaterial (2 × 10^7,0 KID₅₀/ml) geimpft und 21 Tage zusammen mit 2 gleichalten, nicht geimpften Lämmern gleicher Abstammung beobachtet.

Die Impfungen erfolgen an der haarlosen Stelle hinter dem Ellbogen oder kaudal des Schulterblattes. Täglich werden Temperatur, Blutbild, Futteraufnahme und Gewichtszunahme kontrolliert. Außerdem werden die Tiere hinsichtlich lokaler Reaktionen und des Allgemeinbefindens (Freßlust, Allergie usw.) beobachtet.

Die testinfizierten Lämmer sowie nach einigen Tagen Verzögerung auch die Kontrolltiere erkranken an einer typischen Orfinfektion. Dieser Befund zeigt, daß das Orfvirusmaterial durch die vorangegangenen Passagen und Reinigungsstufen noch nichts an seiner Pathogenität eingebüßt hat. Das genetisch einheitliche Virusmaterial dient deshalb als Ausgangsmaterial für alle weiteren Manipulationen.

Beispiel 2

Pustelmaterial von akut an Orf erkrankten, neugeborenen Lämmern wird in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise angezüchtet, über 16 Passagen in embryonalen Lammnierenkulturen vermehrt und über Klonselektion gereinigt. Das Virusmaterial der 3. Plaqueeinrichtung wird als Ausgangsmaterial für weitere 80 Kulturpassagen in embryonalen Lammnierenkulturen verwendet. Dabei werden die in Beispiel 1 beschriebenen Kontrolluntersuchungen bezüglich Reinheit, Unschädlichkeit und Wirksamkeit durchgeführt.

Die 96. Passage in embryonalen Lammnierenzellkulturen besitzt einen Infektiositätstiter von 10^7,5KID₅₀/ml.

Die in der in Beispiel 1 beschriebene Weise mit dem Virusmaterial der 96. Passage infizierten Lämmer erkranken typisch an einer Orfinfektion. Die klinischen Symptome treten allerdings 1 bis 2 Tage später auf und sind nur noch abortiv.

Beispiel 3

Das Virusmaterial aus Beispiel 2 (96. Kulturpassage) wird über weitere 24 Passagen in embryonalen Lammnierenzellen vermehrt. Bei der routinemäßigen Überprüfung der Virusernte der 120. Kulturpassage wird im Tierversuch festgestellt, daß die infizierten Lämmer sowie die Kontaktlämmer nicht erkranken. Daraufhin werden weitere 15 Passagen als zusätzliche Sicherheit durchgeführt.

Die Virusernte der 135. Passage wird in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise 3mal mittels Plaquetechnik nach der Endverdünnungsmethode gereinigt, um ein genetisch einheitliches Virusmaterial zu erhalten.

Das Virusmaterial aus der 3. Plaquereinigung wird dann in sekundären Nierenzellkulturen aus Schafembryonen vermehrt, gereinigt und bakteriologisch und virologisch (Elektronenmikroskop, Serologie) nochmals überprüft. Insgesamt werden auf diese Weise 2 Liter Saatvirusmaterial hergestellt, die nach Abschluß der Kontrollen portioniert (à 4 ml), ohne Zusatz lyophilisiert und bei 80°C gelagert werden. Dieses Material dient als Saatvirus für die Herstellung des Orfvirus-Lebendimpfstoffes. Vor der Lyophilisierung hat das Saatvirus einen Virustiter von 10^8,5 KID₅₀/ml und nach der Lyophilisierung einen solchen von 10^7,5 KID₅₀/ml.

Für die Herstellung des Orfvirus-Lebendimpfstoffes aus dem durch Plaquereinigung erhaltenen Orfvirus-Impfstamm können sekundäre Zellkulturen aus Lungen von Rinderembryonen benutzt werden, deren Herstellung nach den üblichen Methoden erfolgt. Das Zellsediment der Anzuchtpassagen wird dabei jeweils bakteriologisch und mykologisch nach den internationalen Vorschriften auf Kontaminationen untersucht. Das Anzuchtmedium der Zellkulturen besteht aus Eagle-Earle′scher Lösung +10% Lactalbumin + 10% fötales Rinderserum sowie der üblichen Antibiotikazugabe. Beim Erhaltungsmedium ist der prozentuale Anteil des Lactalbumin auf 5% und der des fötalen Rinderserums auf 2% gesenkt. Die Zellkulturen werden in Industrieflaschen stationär bebrütet. Für die Animpfung der sekundären fötalen Rinderlungenkulturen wird jeweils frisches Saatvirus des Orfstammes D 1701 (plaquegereinigtes Virus) verwendet, das zuvor über 1 bis 2 Passagen in sekundären Ringerlungenzellkulturen adaptiert worden ist. Die Animpfdosis beträgt etwa 4 × 10^7,5 KID₅₀/ml in 4 ml.

Die infizierten Zellkulturen werden 4 Tage, d. h. bis zur Ausbildung eines optimalen cpE, bei 37°C bebrütet. Anschließend werden die Zellkulturen in toto bei -20°C eingefroren, wieder aufgetaut, gepoolt und für die erforderlichen Kontrolluntersuchungen Proben entnommen. Danach lagert das Virusmaterial bis zum Abschluß der Kontrolluntersuchungen bzw. bis zur Weiterverarbeitung bei -70°C. Entsprechen alle Kontrollen den Sicherheitsvorschriften, wird die Virusernte aufgetaut und unter sterilen Bedingungen noch vorhandene Zellen und der Zelldetritus niedertourig abzentrifugiert. Dem Überstand wird 2,5% Molico (Magermilchpulver) und 2,5% Pepton zugefügt und der pH-Wert auf 7,4 eingestellt.

Der so verbreitete Impfstoff wird portioniert und lyophilisiert. Der Virustiter eines derartigen lyophilisierten Impfstoffes kann je nach Charge zwischen 10^6,5 bis 10^8,5 KID₅₀/ml schwanken. Für die Impfungen wird das Lyophilisat mit sterilem Aqua dest. aufgelöst. Die Impfdosis pro Tier beträgt 1 ml subcutan.

Der Infektiositätstiter des erfindungsgemäßen, lyophilisierten Orf-Lebendimpfstoffes ist bei einer Lagerung bei +4°C oder bei niedrigeren Temperaturen über mindestens 3 Jahre stabil. Entsprechende Lagerungsversuche mit 4 verschiedenen Impfstoffchargen über 1, 2 bzw. 3 Jahre zeigten, daß der Infektiositätstiter bei geeigneter Lagerung bis zum 1020. Tag keinerlei Einbußen erleidet.

Beispiel 4

Um die Verwendungsmöglichkeit und die Wirksamkeit des vermehrungsfähigen Orf-Impfstoffes der Erfindung zu zeigen, sind einige Beispiele von prophylaktischen und postinfektionellen Impfversuchen im folgenden zusammengestellt:

A) Subcutane Impfung von 2 bis 4 Wochen alten, seronegativen Lämmern

Die Tiere werden mit 2 × 10⁷ KID₅₀/ml in 1 ml subcutan geimpft. Vor der Impfung sowie nach 2, 6 und 12 Wochen werden Blutproben entnommen. Die Antikörperbildung wird nach den bekannten Verfahren mittels Serumneutralisationstest in Röhrchen- Sekundär-Kulturen aus embryonalen Rinderlungen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle I

Von 9 seronegativen, 2 bis 4 Wochen alten Lämmern, hatten 2 Wochen nach der Schutzimpfung 5 Tiere Serum-Titer von 1 : 8 bis 1 : 128, nach 3 Monaten reagierten 8 Tiere positiv. Lamm Nr. 5 blieb immer negativ.

B) Cutane Belastungsinfektion (Challenge-Test) bei neugeborenen Lämmern

Von den 10 seronegativen zusammengestallten, neugeborenen Lämmern (1 bis 2 Tage alt) wurden 3 Tiere mit 2 × 10^7,0 KID₅₀/ml subcutan geimpft. 7 Tiere blieben als Kontrollen ungeimpft. 21 Tage später wurden Impflinge und Kontrollen mit 10⁶ KID₅₀ virulentem Orfvirus (16. Passage) percutan nach der Skarifikationsmethode Herzberg an der Schenkelinnenfläche (0,1 ml) testinfiziert.

Die 3 seronegativen, im Alter von 1 bis 2 Tagen schutzgeimpften Lämmer reagierten in dem nach 21 Tagen durchgeführten cutanen Challenge-Test lokal nicht. An den Skarifikationsstellen kam es weder zu einer infiltrativen, länger anhaltenden Rötung mit Quaddelbildung noch zu einer Papel- oder Pustelbildung. Das Allgemeinbefinden der Tiere war in einem Beobachtungszeitraum von 14 Tagen nicht gestört. Die 7 seronegativen Kontrolltiere aus dem gleichen Orfvirusfreien Bestand, die 21 Tage im gleichen Raum mit den 3 Impflingen gehalten wurden, reagierten auf die gleichzeitig mit den Impflingen durchgeführten cutanen Belastungsinfektionen durchwegs positiv. Nach 2 bis 3 Tagen kam es bei ihnen an den Skarifikationsstellen zu einer Rötung mit Quaddelbildung und nachfolgender Entwicklung von typischen Bläschen bzw. Pusteln. Während dieser Zeit war das Allgemeinbefinden der Tiere leicht gestört (verminderte Futteraufnahme, 1 bis 2 Tage geringgradige Temperaturerhöhung). Zu einer Allgemeinkrankheit kam es nicht. Die Bläschen und Pusteln trockneten nach 4 bis 5 Tagen ein und verschorften. Nach 10 bis 14 Tagen waren die Tiere wieder gesund.

C) Postinfektionelle Notimpfung von neugeborenen Lämmern an der Mutter

Die klinisch kontrollierbare Wirksamkeit ließ sich unter Praxisbedingungen bei den Notimpfungen untersuchen. Eine besondere Gruppe bildeten dabei die in den ersten Lebenstagen geimpften Lämmer an der Mutter. Bei diesen Impfungen wurden als Kriterium der Wirksamkeit die Morbiditäts- und Mortalitätsraten in einem vergleichsweisen Zeitraum vor und nach der Impfung ein und derselben Herde bzw. Mastperiode herangezogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt.

Tabelle II

In 4 Herden, für die vergleichbare Morbiditäts- und Mortalitätszahlen der vorangegangenen Perioden verfügbar waren, konnte die Wirksamkeit einer Notimpfung statistisch erfaßt werden. Es handelte sich insgesamt um 1106 Lämmer. In allen 4 Herden führte die Notimpfung zu einer drastischen Senkung sowohl der Morbidität als auch der Mortalität. Bei den Lämmern an der Mutter sank die Morbidität von vorher 50 bis 100% auf 0 bis 21% und die Mortalität von vorher 0 bis 20,5% auf 0-0,7%. Bei Lämmern, die trotz Impfung erkrankten, verlief die Krankheit mild bis abortiv. An Lippen und Maulschleimhaut entwickelten sich wenige Bläschen ohne Störung des Allgemeinbefindens. Die Bläschen trockneten rasch ein und die Futteraufnahme war nicht gestört.

D) Postinfektionelle Impfung von Lämmern an der Lammbar

Die zur Mast an der Lammbar aufgestallten, einige Tage alten Lämmer, erkranken bei der enzootischen Verseuchung unserer Schafbestände mit Orfvirus in Problembetrieben fast regelmäßig an Pustulardermatitis mit relativ hohen Verlustquoten. Die Gründe hierfür sind vielfältig: Durchseuchte Mütter übertragen auf die Neugeborenen nur gelegentlich eine belastbare, passive Immunität, die Neugeborenen infizieren sich sofort, die Fähigkeit zu einer aktiven Immunitätsbildung ist bei ihnen noch nicht voll entwickelt und die Gegebenheiten der Lammbar führen zunächst zu einem starken Streß mit immunsuppressiven Folgen. Eine aktive Schutzimpfung der zur Lammbar aufgestallten Tiere gegen Ecthyma ist deshalb von Anfang an problematisch.

Die aktive Immunisierung wurde mit einer zweimaligen Impfung versucht:
1. Impfung bei der Aufstallung (2 bis 3 Tage alte Lämmer),
2. Impfung nach 10 bis 14 Tagen. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.

Tabelle III

Der Erfolg der Schutzimpfung war zwar überraschend, aber hinsichtlich der Morbidität nicht befriedigend, denn die Morbiditätsraten ließen sich nur geringgradig senken. Der Krankheitsverlauf war jedoch durchwegs milder und die Milchaufnahme wurde demzufolge nicht unterbrochen. Es kam zu keinen nennenswerten Gewichtsverlusten und der Entwicklungsrückstand war nur geringfügig. Die schweren Verlaufsformen mit Todesfolge konnten durch die Schutzimpfung dagegen drastisch reduziert werden. In dem Problembetrieb "A" sank die Mortalität von 7,7 auf 0 und in dem Problembetrieb "B" von 66% auf 3,2%.

Beispiel 5

Für den erfindungsgemäßen Orfvirus-Lebendimpfstoff werden folgende Impfprogramme empfohlen:

• 1. Prophylaktische Impfungen
  • a) Alle Tiere, die älter als 3 Monate sind, werden unabhängig vom Trächtigkeitsstadium einmal subcutan geimpft.
  • b) Schafe unter 3 Monaten werden zweimal im Abstand von 4 bis 6 Wochen subcutan geimpft.
  • c) Je nach Seuchenlage werden die Schutzimpfungen halbjährlich bis jährlich wiederholt.
• 2. Notimpfungen
  • a) Alle noch nicht erkrankten Tiere werden sofort wie bei den prophylaktischen Schutzimpfungen subcutan geimpft.
  • b) Neugeborene Lämmer werden am 1. oder 2. Lebenstag erstmals subcutan geimpft, nach 10 bis 14 Tagen und 3 Monaten werden sie revacciniert.

Die Impfdosis kann unabhängig vom Alter 1 ml, entsprechend 10^6,5 bis 10^7,5 KID₅₀ Orf-Lebendimpfstoff, betragen. Der Impfstoff wird subcutan verabreicht.

Für den Erfolg der Schutzimpfung, gleichgültig, ob es sich um die Prophylaxe oder Notimpfung handelt, ist wichtig, daß wirklich alle Tiere in das Impfprogramm einbezogen werden. Wird bei den prophylaktischen Schutzimpfungen die Impfimmunität der Herde durch jährliche Revaccinationen aufrechterhalten, so verstärkt sie sich. Hiervon profitieren vor allem die Neugeborenen, einmal über einen besseren Immuntransfer von der Mutter auf das Neugeborene und zum anderen durch den immer geringer werdenden Infektionsdruck. In gut immunisierten Herden kann sich das Feldvirus nicht mehr vermehren. Hierdurch werden auch die indirekten Schäden einer Orf-Infektion bei den Tieren vermieden (z. B. höhere Anfälligkeit für Mischinfektionen oder Moderhinke).

Claims (5)

1. Orfvirus-Stamm D 1701, hinterlegt bei der Bayerischen Landesimpfanstalt, München.

2. Verfahren zur Herstellung von Orfvirus-Lebendimpfstoff, dadurch gekennzeichnet, daß man den Orfvirus-Stamm D 1701 gemäß Anspruch 1, hinterlegt bei der Bayerischen Landesimpfanstalt, München, in Zellkulturen von Vögeln oder Säugern, die empfänglich für das Orfvirus sind, vermehrt und gegebenenfalls das erhaltene Virusmaterial gefriergetrocknet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Orfvirus-Stamm D 1701 zunächst durch mindestens eine Passage auf embryonalen Rinderlungenzellkulturen adaptiert.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Vermehrung in sekundären embryonalen Rinderlungenzellkulturen durchführt.

5. Verwendung des nach Anspruch 2 bis 4 hergestellten Lebendimpfstoffes zur parenteralen Schutzimpfung gegen die Orf-Infektion der Schafe und Ziegen.