DE69732407T3 - Verfahren für die Replikation von Influenza in Zellkultur und die bei diesem Verfahren hergestellten Influenza-Viren - Google Patents

Verfahren für die Replikation von Influenza in Zellkultur und die bei diesem Verfahren hergestellten Influenza-Viren Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Replikation von Influenza-Viren in Zellkultur bei herabgesetzten Temperaturen und die Influenza-Viren, welche durch das beschriebene Verfahren gewonnen werden können, und Impfstoffe, welche Viren dieser Art oder ihre Bestandteile enthalten.
  • Alle Influenza-Impfstoffe, welche als zugelassene Impfstoffe zur Behandlung von Menschen und Tieren seit den 40er Jahren bis heute verwendet wurden, bestehen aus einem oder mehreren Virus-Stämmen, welche in Embryos enthaltenden Hühnereiern vervielfältigt wurden. Diese Viren werden aus der Allantois-Flüssigkeit von infizierten Hühnereiern gewonnen und ihre Antigene werden entweder als intakte Viruspartikel oder als durch Detergentien und/oder Lösungsmittel aufgelöste Viruspartikel, sogenannte Spaltimpfstoffe, oder als isolierte und definierte Virusproteine, sogenannte Untereinheitenimpfstoffe, als Impfstoff verwendet. Bei allen zugelassenen Impfstoffen werden die Viren durch dem Fachmann bekannte Verfahren inaktiviert. Selbst die Replikation von lebenden, abgeschwächten Viren, welche in experimentellen Impfstoffen geprüft werden, wird in Embryonen enthaltenden Hühnereiern durchgeführt.
  • Die Verwendung von Embryonen enthaltenden Hühnereiern zur Herstellung von Impfstoffen ist zeit-, arbeits- und kostenintensiv. Die Eier aus von Tierärzten überwachten, gesunden Hühnerbeständen müssen vor der Infektion für gewöhnlich 12 Tage inkubiert werden. Vor der Infektion müssen die Eier auf lebende Embryonen hin ausgewählt werden, da nur diese Eier für eine Virus-Replikation geeignet sind. Nach der Infektion werden die Eier für gewöhnlich wieder 2 bis 3 Tage inkubiert. Die zu dieser Zeit noch lebende Embryonen werden durch Kälte getötet und die Allantois-Flüssigkeit wird dann durch Aspiration aus den einzelnen Eiern gewonnen. Mittels arbeitsintensiver Aufreinigungsverfahren werden Substanzen aus dem Hühnerei, welche zu unerwünschten Nebenwirkungen des Impfstoffes führen, von den Viren abgetrennt und die Viren werden konzentriert. Da Eier nicht steril (pathogenfrei) sind, ist es zudem notwendig Pyrogene und alle Pathogene zu entfernen und/oder zu inaktivieren, welche möglicherweise enthalten sind. Um die Virus-Ausbeute zu verbessern, wird die Replikation von Influenza-Viren in Hühnereiern in der Regel bei herabgesetzten Temperaturen durchgeführt (etwa 34°C). Selbst Viren, welche Atemwegserkrankungen verursachen, können in Zellkultur vervielfältigt werden. Auch hier werden in einigen Fällen herabgesetzte Temperaturen verwendet (etwa 33°C), welche jedoch keine Auswirkung auf die Qualität des Impfstoffes, der gewonnen werden kann, haben, sondern nur die Replikation begünstigen.
  • Viren anderer Impfstoffe wie zum Beispiel Tollwut-Viren, Mumps-, Masern- und Röteln-Viren, Polio-Viren und FSME-Viren können in Zellkulturen vervielfältigt werden. Da Zellkulturen, welche aus getesteten Zellbanken stammen, pathogenfrei sind und im Gegensatz zu Hühnereiern ein definiertes Virus-Replikationssystem sind, welches (theoretisch) in fast unbegrenzten Mengen zur Verfügung steht, ermöglichen sie unter bestimmten Bedingungen die ökonomische Vervielfältigung von Viren, sogar im Fall von Influenza-Viren. Eine ökonomische Impfstoffherstellung wird möglicherweise auch dadurch erreicht, dass sich die Virus-Gewinnung und -Aufreinigung aus einem definierten und sterilen Zellkultur-Medium einfacher darstellt, als aus der viel Protein enthaltenden Allantois-Flüssigkeit.
  • Die Gewinnung und Replikation von Influenza-Viren in Eiern führt zu einer Selektion auf bestimmte Phänotypen, von denen sich die Mehrheit vom klinischen Isolat unterscheidet. Im Gegensatz dazu steht die Gewinnung und Replikation von Viren in Zellkultur, bei welcher keine Passage-abhängige Selektion auftritt (Oxford, J. S. et al., J. Gen. Virology 72 (1991), 185–189; Robertson, J. S. et al., J. Gen. Virology 74 (1993) 2047–2051). Für einen effektiven Impfstoff ist deshalb aufgrund dieses Aspektes die Virusreplikation in Zellkultur gegenüber der in Eiern zu bevorzugen. Es ist bekannt, dass Influenza-Viren in Zellkulturen vervielfältigt werden können. Neben Hühnerembryo-Zellen und Hamster-Zellen (BHK21-F und HKCC) wurden MDBK-Zellen und insbesondere MDCK-Zellen als geeignete Zellen zur in vitro Replikation von Influenza-Viren beschrieben (Kilbourne, E. D., in: Influenza (1987), Seiten 89–110, Plenum Medical Book Company – New York und London). Eine Voraussetzung für eine erfolgreiche Infektion ist das Hinzugeben von Proteasen zum Infektions-Medium, bevorzugt Trypsin oder ähnliche Serin-Proteasen, da diese Proteasen das Vorläufer-Protein des Hämagglutinins [HA0] extrazellulär in aktives Hämagglutinin [HA1 und HA2] spalten. Nur gespaltenes Hämagglutinin führt zu einer Adsorption der Influenza-Viren auf Zellen mit anschließender Aufnahme der Viren in die Zelle (Tobita, K. et al., Med. Microbiol. Immunol., 162 (1975), 9–14; Lazarowitz, S. G. & Choppin, P. W., Virology, 68 (1975), 440–454; Klenk, H. -D. et al., Virology 68 (1975) 426–439) und so zu einem weiteren Replikationszyklus des Virus in der Zellkultur.
  • Das Patent US 4 500 513 beschreibt die Replikation von Influenza-Viren in Zellkulturen von adhärent wachsenden Zellen. Nach der Vermehrung der Zellen wird das Nährmedium entfernt und frisches Nährmedium wird den Zellen hinzugefügt, wobei die Infektion der Zellen mit Influenza-Viren gleichzeitig oder kurz danach stattfindet. Zu einer gegebenen Zeit nach der Infektion wird eine Protease (zum Beispiel Trypsin) hinzugefügt, um eine optimale Virusreplikation zu erhalten. Die Viren werden geerntet, aufgereinigt und verarbeitet, um einen inaktivierten oder abgeschwächten Impfstoff zu ergeben. Eine ökonomische Replikation der Influenza-Viren als Voraussetzung zur Impfstoffherstellung kann jedoch unter Verwendung der im erwähnten Patent beschriebenen Verfahrensweisen nicht bewerkstelligt werden, da der Wechsel des Mediums, die anschließende Infektion sowie die Zugabe von Trypsin, welche später durchgeführt wird, eine mehrmalige Öffnung der einzelnen Zellkulturgefäße notwendig machen und somit sehr arbeitsintensiv ist. Weiterhin erhöht sich die Gefahr einer Kontamination der Zellkultur durch unerwünschte Mikroorganismen und Viren mit jeder Manipulation der Kulturgefäße. Eine stärker kosteneffektivere Alternative ist die Vermehrung von Zellen in Fermentersystemen, die dem Fachmann bekannt ist, wobei die Zellen adhärent auf Microträgern wachsen. Das Serum (für gewöhnlich fötales Kälberserum), welches für das Wachstum der Zellen auf den Microträgern notwendig ist, enthält jedoch Trypsin-Inhibitoren, so dass sogar bei diesem Produktionsverfahren ein Wechsel des Mediums zu serumfreiem Medium notwendig ist, um die Spaltung des Influenza-Hämagglutinins durch Trypsin und somit eine angemessen große Virusreplikation zu erreichen. Somit erfordert diese Verfahrensweise ebenfalls ein mehrmaliges Öffnen der Kulturgefäße und bringt so die erhöhte Gefahr der Kontamination mit sich. Im Patent US 4500513 wird die virale Replikation bei 34–37°C durchgeführt. Ähnlich beschreiben Mancini & Yano [Rev Farm Bioquim Univ S. Paulo 29 (1993), 89–95] ein Influenza-Zellkulturverfahren, bei dem der Virus bei 35°C vervielfältigt wird. Diese Autoren verwendeten MDCK-Zellen, welche in mit fötalem Kälberserum und Neomycin supplementierten Eagle-Medium gezüchtet wurden. Nach der Infektion mit dem Influenza-Virus wurde den gezüchteten Zellen Trypsin hinzugegeben.
  • Die vorliegende Erfindung basiert somit auf dem Ziel Verfahren bereit zu stellen, welche eine einfache und ökonomische Replikation von Influenza-Viren in Zellkultur möglich machen und zu einem in hohem Maße wirksamen Impfstoff führen.
  • Dieses Ziel wird durch Bereitstellung der in den Patentansprüchen aufgezeigten Ausführungsformen erreicht.
  • Die Erfindung betrifft somit ein wie in den Ansprüchen definiertes Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs in Zellkultur, bei dem MDCK 33016 Zellen, welche durch Influenza-Viren infiziert werden können, in Zellkultur in Suspension in serumfreien Medium gezüchtet werden, die Zellen mit Influenza-Viren infiziert werden und nach der Infektion zur Virusreplikation bei Temperaturen im Bereich von 30 bis 36°C gezüchtet werden. Vor oder während der Infektion durch Influenza-Virus wird der Zellkultur eine Protease hinzugefügt. Weitere Einzelheiten der Protease-Behandlung werden nachstehend angegeben.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Züchtung der infizierten Zellen zur Virusreplikation bei 32 bis 34°C und besonders bevorzugt bei 33°C durchgeführt.
  • Es wurde überraschenderweise herausgefunden, dass durch die Replikation der Influenza-Viren in infizierten Zellen bei herabgesetzten Temperaturen Viren gewonnen werden, welche eine nennenswert höhere Wirksamkeit als Impfstoff haben als die Viren, welche durch Replikation bei 37°C gewonnen werden. Replikation bei 37°C, die für gewöhnlich zur Influenza-Replikation in Zellkultur verwendete Temperatur, führt anerkanntermaßen zu vergleichsweise hohen Virus-Ausbeuten in kurzer Zeit. Viren, die so hergestellt wurden, haben jedoch eine geringe Wirksamkeit als Impfstoff im Vergleich mit Viren, welche durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt werden.
  • Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung wurde eine Zelllinie aus der Nieren-Zelllinie MDCK etabliert, wobei diese Zelllinie an das Wachstum in Suspension in serumfreien Medium angepasst ist und dadurch besonders einfache und effiziente Züchtung und Virusreplikation ermöglicht. Diese Zelllinie, MDCK 33016, wird im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet. Sie wurde unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC 2219 am 7. Juni 1995 entsprechend den Anforderungen der Budapester Konvention über die Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck der Patentierung, bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig (Bundesrepublik Deutschland), welche als die internationale Hinterlegungsstelle anerkannt ist, hinterlegt.
  • Zur Züchtung der Zellen im erfindungsgemäßen Verfahren können die üblichen dem Fachmann bekannten Verfahren für die Zellkultur verwendet werden, insbesondere jene, welche bereits für die Replikation von Influenza-Viren in Zellkultur bekannt sind. Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung von Zellen, die in Suspension in Serum-freien Medium wachsen, ermöglicht eine besonders einfache und effiziente Virusreplikation. Die Züchtung von Zellen in Suspension kann in diesem Fall sowohl in einem Batch-Verfahren als auch in einem Perfusionssystem, zum Beispiel in einem gerührten Gefäßfermenter, unter Verwendung der dem Fachmann bekannten Zell-Rückhaltesysteme wie zum Beispiel Zentrifugation, Filtration, Spin-Filter und so weiter durchgeführt werden.
  • Die Züchtung der Zellen wird in der Regel bei einem regulierten pH-Wert durchgeführt, welcher bevorzugt im Bereich von pH 6,6 bis pH 7,8, insbesondere im Bereich von pH 6,8 bis pH 7,3 liegt.
  • Weiterhin kann der pO2-Wert vorteilhaft reguliert werden und liegt dann in der Regel zwischen 25% und 95%, insbesondere zwischen 35% und 60% (basierend auf der Luftsättigung).
  • Die Infektion der in Suspension gezüchteten Zellen wird bevorzugt dann durchgeführt, wenn die Zellen eine Zelldichte von etwa 8 bis 25 × 105 Zellen/ml im Batch-Verfahren oder etwa 5 bis 20 × 106 Zellen/ml im Perfusions-System erreicht haben.
  • Die Infektion der Zellen mit Influenza-Viren wird bevorzugt bei einer MOI (Multiplizität der Infektion) von etwa 0,0001 bis 10, bevorzugt von 0,002 bis 0,5 durchgeführt.
  • Die Zugabe einer Protease, welche die Spaltung des Vorläufer-Proteins des Hämagglutinins [HA0] und damit die Adsorption der Viren an die Zellen bewirkt, kann erfindungsgemäß kurz vor oder gleichzeitig mit der Infektion der Zellen mit den Influenza-Viren durchgeführt werden. Wenn die Zugabe gleichzeitig mit der Infektion durchgeführt wird, kann die Protease entweder direkt der zu infizierenden Zellkultur oder zum Beispiel als Konzentrat zusammen mit dem Virus-Inokulum hinzugefügt werden. Die Protease ist bevorzugt eine Serin-Protease und besonders bevorzugt Trypsin.
  • Wenn Trypsin verwendet wird, ist die Endkonzentration im Kulturmedium vorteilhafterweise 1 bis 200 μg/ml, bevorzugt 5 bis 50 μg/ml und besonders bevorzugt 5 bis 30 μg/ml.
  • Nach der Infektion wird die infizierte Zellkultur weiter gezüchtet, um die Viren zu vervielfältigen, insbesondere bis ein maximaler cytopathischer Effekt oder eine maximale Menge des Virus-Antigens nachgewiesen werden kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird das Ernten und die Gewinnung der vervielfältigten Influenza-Viren 2 bis 10, bevorzugt 3 bis 7 Tage nach der Infektion durchgeführt. Um dies zu tun, werden zum Beispiel die Zellen oder Zellreste unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren, zum Beispiel durch Separatoren oder Filter, vom Kulturmedium getrennt. Anschließend wird die Konzentration der im Kulturmedium vorliegenden Influenza-Viren durch dem Fachmann bekannte Verfahren wie zum Beispiel Gradientenzentrifugation, Filtration, Präzipitation und ähnliches durchgeführt.
  • Die Influenza-Virensind durch bekannte Verfahren formuliert, um einen Impfstoff zur Verabreichung an Menschen oder Tiere zu ergeben. Wie bereits vorstehend erläutert, haben Influenza-Viren dieser Art eine größere Wirksamkeit als Impfstoff als Influenza-Viren, welche durch Replikation bei 37°C in Zellkultur gewonnen werden.
  • Die Immunogenität oder Wirksamkeit der als Impfstoff gewonnenen Influenza-Viren kann durch dem Fachmann bekannte Verfahren, zum Beispiel durch den gewährten Schutz in einem Expositions-Experiment oder als Antikörpertiter von Virus neutralisierenden Antikörpern, bestimmt werden.
  • Die Bestimmung der Menge des produzierten Virus oder Antigens kann zum Beispiel durch Bestimmung der Menge des Hämagglutinins durch dem Fachmann bekannte Verfahren durchgeführt werden. Es ist zum Beispiel bekannt, dass gespaltenes Hämagglutinin an Erythrocyten verschiedener Spezies, zum Beispiel Hühner-Erythrocyten, bindet. Dies ermöglicht eine einfache und schnelle Quantifizierung der produzierten Viren oder des gebildeten Antigens durch entsprechende Nachweisverfahren.
  • Durch vergleichende Experimente in Tiermodellen wurde gezeigt, dass erfindungsgemäße Influenza-Viren einen nennenswert höheren Titer von neutralisierenden Antikörpern erzeugen als bei 37°C vervielfältigte Viren und dadurch einen nennenswert besseren Schutz gegen eine Influenza-Virus-Infektion gewähren. In Experimenten mit Mäusen als Tiermodell war zum Beispiel der Titer von neutralisierenden Antikörpern nach der Impfung mindestens um einen Faktor von 42 Wochen höher als der Titer von neutralisierenden Antikörpern nach Inokulation mit Influenza-Viren, welche bei 37°C vervielfältigt wurden. 4 Wochen nach der Inokulation war der Titer von neutralisierenden Antikörpern mindestens um den Faktor 17 höher und in einigen Fällen bis zu 27 Mal höher. Wenn eine erneute Impfung durchgeführt wurde, konnte der Titer von neutralisierenden Antikörpern um einen Faktor von über 60 höher sein, wenn erfindungsgemäße Influenza-Viren im Vergleich zu Influenza-Viren, welche bei 37°C vervielfältigt wurden, verwendet wurden. Dementsprechend kann die Überlebensrate von Tieren in einem Expositionsexperiment bei Verwendung einer Gabe von 1000 LD50 (50% tödliche Dosis) von 1/10 auf mindestens 8/10, bevorzugt 9/10 und besonders bevorzugt 10/10 (100%) gesteigert werden.
  • Die Impfstoffe, die durch das erfindungsgemäße Verfahren gewonnen wurden können optional jene Zusätze enthalten, welche für Impfstoffe üblich sind, insbesondere Substanzen, welche die Immunantwort verstärken, das heißt sogenannte Adjuvantien, zum Beispiel Hydroxide verschiedener Metalle, Bestandteile bakterieller Zellwände, Öle oder Saponine und zudem übliche pharmazeutisch zulässige Excipienten.
  • Die Viren können in den Impfstoffen als intakte Viruspartikel, insbesondere als lebende, abgeschwächte Viren, vorliegen. Zu diesem Zweck werden Virus-Konzentrate auf den gewünschten Titer eingestellt und entweder lyophilisiert oder in flüssiger Form stabilisiert.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die Impfstoffe aufgelöste, das heißt inaktivierte, oder intakte, aber inaktivierte Viren enthalten. Zu diesem Zweck wird die Infektiosität der Viren durch die Verwendung von chemischen und/oder physikalischen Verfahren (zum Beispiel durch Detergentien oder Formaldehyde) zerstört. Der Impfstoff wird dann auf die gewünschte Menge von Antigen eingestellt und nach möglicher Beimischung von Adjuvantien oder nach möglicher Formulierung als Impfstoff, zum Beispiel als Liposomen, Mikrosphären oder Formulierung mit verzögerter Freisetzung, zubereitet.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann der Impfstoff schließlich als Untereinheitenimpfstoff vorliegen, das heißt, dass er definierte und isolierte Virusbestandteile, bevorzugt isolierte Proteine des Influenza-Virus, enthalten kann. Diese Bestandteile können durch dem Fachmann bekannte Verfahren aus den Influenza-Viren gewonnen werden.
  • Die Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
  • Beispiel 1 (Referenzbeispiel)
  • Replikation von Influenza-Viren in MDCK-Zellen bei 33°C MDCK-Zellen (ATCC CCL 34) wurden in Zellkulturflaschen (Eagle-MEM (EMEM) unter Verwendung von 2% FKS, Inkubation bei 37°C über 4 Tage) vermehrt. Der sich ergebende dichte Zellrasen wurde von der Gefäßwand unter Verwendung von Trypsin-Lösung abgelöst, die Zellen wurden gewonnen und das Zell-Konzentrat wurde in serumhaltigem Medium resuspendiert. Die Zellen wurden in einer Zelldichte von 5 × 105 Zellen/ml in Roller-Flaschen inokuliert (200 ml/Flasche) und bei 37°C und 4 UpM inkubiert. Nach 2 Tagen wurden die Zellen mit Influenza-Viren infiziert. Um dies zu tun, wurde das Medium über dem dichten Zellrasen entfernt und durch serumfreies EMEM ersetzt. Influenza-Virus A/PR/8/34 mit einer MOI (Multiplizität der Infektion) von 0,1 und Trypsin in einer Endkonzentration von 25 μg/ml wurden dem Medium hinzugefügt. In beiden Fällen wurden zwei Roller-Falschen bei 37°C oder bei 33°C inkubiert. Die Virusreplikation wurde als Menge des Antigens (gemessen als Hämagglutinin-Einheiten) und als Infektiosität (gemessen im CCID50-Versuch) bestimmt und ist in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
    Replikation von Influenza A/PR/8/34 in Rollerflaschen (MDCK-Zelllinie) nach Inkubation bei 37°C und 33°C, gemessen als Antigengehalt (HA-Einheiten und Infektiosität (CCID50))
    HA-Gehalt CCID50/ml [log10]
    2 dpi 3 dpi 4 dpi 4 dpi
    37°C 1:128 1:512 1:1024 6,4
    33°C 1:64 1:256 1:1024 5,7
    dpi = Tage nach der Infektion
  • Die angezeigten Verhältnisse bedeuten, dass eine 1:X-Verdünnung der Virusernte noch hämagglutinierende Eigenschaften hat. Die hämagglutinierenden Eigenschaften können zum Beispiel, wie in Mayer et al., Virologische Arbeitsmethoden, Band 1 (1974), Seiten 260–261 oder in Grist, Diagnostic Methods in Clinical Virology, Seiten 72–75 beschrieben, bestimmt werden.
  • Die Bestimmung der CCID50-Werte kann zum Beispiel gemäß dem Verfahren, welches in Paul, Zell- und Gewebekultur (1980) S. 395 beschrieben ist, durchgeführt werden.
  • Beispiel 2
  • Herstellung einer Zelllinie, welche an das Wachstum in Suspension angepasst ist und durch Influenza-Viren infiziert werden kann
  • Eine Zelllinie, welche geeignet ist in Suspensionskultur zu wachsen und durch Influenza-Viren infiziert werden kann, wurde ausgehend von MDCK-Zellen (ATCC CCL34 MDCK (NBL-2), welche mittels nur weniger Passagen oder über einige Monate im Labor vermehrt worden waren, selektioniert. Diese Selektionierung wurde durch Vermehrung der Zellen in Roller-Flaschen, welche mit 16 UpM (anstatt etwa 3 UpM, wie es für Roller-Flaschen mit adhärent wachsenden Zellen üblich ist) gedreht wurden, durchgeführt. Nach einigen Passagen der im Medium suspendiert vorliegenden Zellen, wurden Zellstämme gewonnen, die in Suspension wachsen. Diese Zellstämme wurden mit Influenza-Viren infiziert und jene Stämme wurden ausgewählt, welche den größten Virus-Ertrag herstellten. Eine Steigerung im Anteil der in Suspension wachsenden Zellen in den ersten Passagen bei 16 UpM wird über 1 bis 3 Passagen durch die Zugabe von dem Fachmann bekannten Selektionssystemen wie Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin oder Alanosin und Adenin, einzeln oder in Kombination, erreicht. Die Selektion von in Suspension wachsenden Zellen ist auch in anderen, dem Fachmann bekannten, bewegten Zellkultur-Systemen wie gerührten Flaschen möglich. Ein Beispiel für Zellen, welche an das Wachstum in Suspension angepasst sind und mit Influenza-Viren infiziert werden können, ist die Zelllinie MDCK 33016 (DSM ACC2219).
  • Beispiel 3
  • Replikation von Influenza-Viren in MDCK 33016-Zellen bei 33°C
  • Die in Suspension wachsende Zelllinie MDCK 33016 (DSM ACC2219) wurde bei 37°C in Iscove-Medium mit einer Teilungsrate von zweimal wöchentlich 1:8 bis 1:12 in einer Roller-Flasche, welche mit 16 UpM rotierte, vermehrt. 4 Tage nach dem Transfer wurde eine Zelldichte von annähernd 7,0 × 105 Zellen/ml erreicht. Gleichzeitig mit der Infektion der nun 4 Tage alten Zellkultur mit dem Influenza-Stamm A/PR/8/34 (MOI = 0,1) wurde die Zellkultur mit Trypsin behandelt (25 μg/ml Endkonzentration), weiter bei 37°C oder 33°C inkubiert und die Virusreplikation über 3 Tage bestimmt (Tab. II). Tabelle II
    Replikation von Influenza A/PR/8/34, gemessen als Antigengehalt (HA-Einheiten) in Roller-Flaschen (MDCK-Zelllinie MDCK 33016) nach Infektion einer Zellkultur ohne Wechsel des Mediums bei einer Inkubationstemperatur von 37°C oder 33°C
    HA-Gehalt nach Tagen nach der Infektion (dpi)
    1 dpi 2 dpi 3 dpi
    37°C 1:64 1:512 1:1024
    33°C 1:16 1:128 1:1024
  • Beispiel 4
  • Replikation verschiedener Influenza-Stämme in MDCK 33016-Zellen (DSM ACC 2219) bei 33°C
  • Die Zelllinie MDCK 33016 (DSM ACC 2219) wurde bei 37°C in Iscove-Medium mit einer Teilungsrate von zweimal wöchentlich 1:8 bis 1:12 in einer Roller-Flasche, welche mit 16 UpM rotierte, vermehrt. 4 Tage nach dem Transfer wurde eine Zelldichte von 7,0 × 105 bis 10 × 105 Zellen/ml erreicht.
  • Gleichzeitig mit der Infektion der nun 4 Tage alten Zellkultur mit verschiedenen Influenza-Stämmen (MOI 0,1), wurde die Zellkultur mit Trypsin (Endkonzentration 25 μg/ml) behandelt und weiter bei 33°C inkubiert und die Virusreplikation am 5 Tag nach der Infektion bestimmt (Tabelle III). Tabelle III
    Replikation von Influenza-Stämmen in Roller-Flaschen (Zelllinie MDCK 33016) nach Infektion einer Zellkultur ohne Wechsel des Mediums, gemessen als Antigengehalt (HA-Einheiten)
    Influenza-Stamm HA-Gehalt 5 Tage nach Infektion HA-Gehalt
    A/Singapore 1:1024
    A/Sichuan 1:256
    A/Shanghai 1:256
    A/Guizhou 1:128
    A/Beijing 1:512
    B/Beijing 1:256
    B/Yamagata 1:512
    A/PR/8/34 1:1024
    A/Equi 1/Prague 1:512
    A/Equi 2/Miami 1:256
    A/Equi 2 Fontainebleau 1:128
    A/Swine/Ghent 1:512
    A/Swine/Iowa 1:1024
    A/Swine/Arnsberg 1:512
  • Beispiel 5
  • Herstellung eines experimentellen Influenza-Impfstoffes
  • Nach Inokulation in Mäusen führen human-pathogene Influenza-Viren für gewöhnlich nicht zu deren Infektion mit pathologischen Vorgängen, so dass Schutz-Versuche mit Mäusen experimentell schwer aufzubauen sind. Der Influenza-Virusstamm A/PR/8/34 ist jedoch an Mäuse angepasst und verursacht nach intranasaler Verabreichung eine dosisabhängige Sterblichkeit in Mäusen.
  • Ein experimenteller Impfstoff wurde aus dem Influenza-Virus A/PR/8/34 aus Beispiel 3 (A/PR/8 vervielfältigt bei 37°C oder 33°C) hergestellt. Die Influenza-Viren im Zellkulturmedium wurden von den Zellen und Zellfragmenten durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (2000 g, 20 min, 4°C) abgetrennt und durch Zentrifugation in einem Saccharose-Gradienten (linearer Saccharose-Gradient von 10 bis 50% (Gewichtsanteil), 30000 g, 2 h, 4°C) aufgereinigt. Die das Influenza-Virus enthaltende Bande wurde gewonnen, 1:10 mit PBS pH 7,2 verdünnt und bei 20000 UpM sedimentiert und das Präzipitat wurde in PBS aufgenommen (Volumen: 50% des ursprünglichen Zellkulturmediums). Die Influenza-Viren wurden mit Formaldehyd inaktiviert (zweimalige Zugabe von 0,025% einer Formaldehydlösung von 35% Stärke in einem Abstand von 24 h, Inkubation bei 20°C mit Rühren).
  • 10 NMRI-Mäuse mit einem Gewicht von 18 bis 20 g wurden jeweils durch subkutane Injektion mit je 0,3 ml des inaktivierten, experimentellen Impfstoffes an Tag 0 und Tag 28 inokuliert. 2 und 4 Wochen nach der Inokulation und ebenfalls 1 und 2 Wochen nach der erneuten Impfung wurde den Tieren Blut abgenommen, um den Titer von neutralisierenden Antikörpern gegen A/PR/8/34 zu bestimmen. Um die Schutzrate zu bestimmen, wurden die Mäuse 2 Wochen nach der erneuten Impfung (6 Wochen nach dem Beginn des Versuchs) durch intranasale Verabreichung von 1000 LD50 (50% tödliche Dosis) exponiert. Die Ergebnisse des Versuchs sind in Tabelle IV zusammengestellt. Tabelle IV
    Wirksamkeit von experimentellen Impfstoffen: Für den Impfstoff A wurde der Influenza-Virus A/PR/8/34 bei 37°C vervielfältigt und für den Impfstoff B bei 33°C. Die Titer von neutralisierenden Antikörpern gegen A/PR/8 und auch die Schutzrate nach Exposition der Mäuse wurden untersucht.
    Titer von neutralisierenden Antikörpern/ml * Schutzrate Zahl lebend/gesamt
    2W pvacc 4W pvacc 1W prevacc 2W prevacc
    37°C < 28 56 676 1620 1/10
    33°C 112 1549 44670 112200 9/10
    * Wochen nach der Impfung (W pvacc) und Wochen nach der erneuten Impfung (W prevacc)
  • Die Experimente bestätigen, dass Influenza-Viren, welche bei 37°C in Zellkultur mit einer hohen Antigen-Ausbeute (HA-Titer) vervielfältigt worden sind, nur niedrige Titer von neutralisierenden Antikörpern in der Maus erzeugen und kaum Schutz verleihen, während Influenza-Viren, welche bei 33°C in Zellkultur mit einer ebenfalls hohen Antigen-Ausbeute (HA-Titer) vervielfältigt worden sind, sehr hohe Titer von neutralisierenden Antikörpern in der Maus erzeugten und zu einem sehr guten Schutz führten.
  • Beispiel 6 (Referenzbeispiel)
  • Replikation von Influenza-Viren in MDCK-Zellen bei 33°C und Wirksamkeit des gewonnenen Impfstoffes
  • Die Zelllinie MDCK (ATCC CL34) wurde bei 37°C in einer Zellkultur-Flasche in Eagle-MEM (EMEM) mit 2% FKS mit einer zweimal wöchentlichen Teilungsrate von 1:8 bis 1:12 vervielfältigt. 4 Tage nach der Transformation ergab sich ein dichter Zellrasen. Nach dem Wechsel des Mediums zu serumfreiem EMEM wurde die Zellkultur mit Influenza B/Beijing (MOI = 0,1) infiziert, Trypsin wurde dem Medium in einer Endkonzentration von 25 μg/ml hinzugefügt und die infizierten Zellkulturflaschen wurden entweder bei 37°C oder bei 33°C inkubiert. 4 Tage nach der Infektion war der HA-Gehalt in beiden experimentellen Chargen 256 HA-Einheiten. Nach Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit zur Entfernung der Zellen/Zellreste, wurden die Viren im Überstand mit Formaldehy inaktiviert (zweimalige Zugabe von 0,025% einer Formaldehydlösung von 35% Stärke in einem Abstand von 24 h, Inkubation bei 20°C mit Rühren). In jedem der experimentellen Abschnitte war das hinzugefügte Adjuvans Aluminium-Hydroxid (10% Endkonzentration einer Al(OH)3-Lösung mit einer Stärke von 2%). Unter Verwendung dieser experimentellen Impfstoffe wurden in jedem Fall 3 Meerschweinchen (400 bis 500 g) je experimentellem Abschnitt einer intraplantaren Impfung mit 0,2 ml und 4 Wochen danach einer erneuten Impfung mit dem selben Impfstoff unterzogen. Um die Wirksamkeit des Impfstoffes zu untersuchen, wurden Blutproben 2, 4 und 6 Wochen nach der Inokulation entnommen und im Hämagglutinations-Hemmtest und im Serum-Neutralisationstest untersucht (vgl. Tabelle V). Tabelle V
    Wirksamkeit von experimentellen Impfstoffen aus Influenza B/Beijing nach Replikation des Virus bei 37°C oder 33°C in Zellkultur: die serologischen Parameter Hämagglutinations-Hemmung und neutralisierende Antikörper wurden untersucht (Durchschnittswerte von 3 Meerschweinchen)
    Hämagglutinations-Hemmung Titer Neutralisierende Antikörper Titer
    2W pvacc* 4W pvacc* 6W pvacc 2W pvacc 4W pvacc 6W pvacc
    37°C 85 341 1024 851 1290 6760
    33°C 85 341 853 3890 22400 117490
    * W pvacc = Wochen nach der Inokulation (6 W pvacc = 2 Wochen nach der erneuten Impfung)

Claims (7)

  1. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs zur Verabreichung an Menschen oder Tiere, umfassend: a) Replikation von Influenza-Viren in Zellkultur, wobei MDCK 33016 Zellen (DSM ACC 2219) in Zellkultur in Suspension in Serum-freiem Medium gezüchtet werden, wobei die Zellen mit Influenza-Viren infiziert werden und nach Infektion bei einer Temperatur im Bereich von 30°C bis 36°C zur Virusreplikation gezüchtet werden, dadurch gekennzeichnet, dass eine Protease vor oder während der Infektion mit Influenza-Viren zu den gezüchteten Zellen hinzugefügt wird; b) Formulierung der replizierten Influenza-Viren, um den Impfstoff zu ergeben.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Zellen mit Influenza-Viren nach Infektion bei einer Temperatur im Bereich von 32°C bis 34°C zur Virusreplikation gezüchtet werden.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Zellen mit Influenza-Viren nach Infektion bei 33°C zur Virusreplikation gezüchtet werden.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Protease eine Serin-Protease ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Serin-Protease Trypsin ist.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem das Ernten und Gewinnen der Influenza-Viren 2 bis 10 Tage nach Infektion stattfindet.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das Ernten und Gewinnen der Influenza-Viren 2 bis 7 Tage nach Infektion stattfindet.
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