DE3500744A1

DE3500744A1 - Verfahren zur herstellung eines impfstoffes gegen herpes-viren

Info

Publication number: DE3500744A1
Application number: DE19853500744
Authority: DE
Inventors: Volker Dr. 7400 Tübingen Ohlinger; Wilhelm Prof. Dr. Schwöbel; Otto Christian Prof. Dr. Straub
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: SCHWOEBEL, WILHELM, PROF. DR., 7400 TUEBINGEN, DE
Priority date: 1985-01-11
Filing date: 1985-01-11
Publication date: 1986-07-17

Description

Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs gegen
Herpes-Viren Die vorliegende Ez indung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen gegen Herpes-Viren, Impfstoffe die nach diesem Verfahren hergestellt worden sind, sowie neue apathogene, jedoch immunogene Mutanten von Herpes-Viren, die zur Herstellung dieser Impfstoffe dienen.
Zahlreiche Schadviren gehören zur Gruppe der Herpes-Viren. Wirtschaftlich besonders schwerwiegend sind z.B.
die Schäden, die durch das Aujeszky-Virus bei Schweinen und auch bei anderen Nutz- und Haustiere hervorgerufen werden.
Es gibt bereits Impfstoffe gegen die Aujeszkysche-Krankheit bei Schweinen auf der Basis inaktivierter Viren.
Diese Impfstoffe schützen jedoch nicht andere Tierarten wie Rinder, Hunde oder Katzen. Auch bei Schweinen befriedigen sie niwht voll. Wegen ihrer ungenügenden Schutzwirkung sind wiederholte Impfungen erforderlich.
Es gibt auch Impfstoffe gegen die Aujeszkysche-Krankheit auf der Basis apathogener Lebendviren. Es ist bekannt, daß Viren ihre Pathogenität bei wiederholten Passagen in Zellkulturen verlieren, ihre immunogenen Eigenschaften jedoch erhalten bleiben. Bei diesen Verfahren ist es nicht sicher, daß einheitliche Viruspopulationen erhalten werden, so daß nach diesen Verfahren hergestellte Impfstoffe mit einem gewissen Risiko behaftet sind.
Es ist gefunden worden, daß man eine avirulente immunogene Mutante des Aujeszky-Virus erhält, wenn man den virulenten Stamm in Gegenwart von 5-Jod-2'-deoxyuridin in Zellkulturen passiert. Bei diesem Verfahren wird jedoch nur eine sehr geringe Ausbeute an der gewünschten apathogenen immunogenen Mutante erzielt.
Das Verfahren ist außerdem nicht universell bei anderen Herpes-Viren einsetzbar.
Weiter ist gefunden worden, daß man Impfstoffe gegen Herpes simplex Viren des Typs 1 und Typs 2 erhält, indem man Herpes-Viren in Gegenwart von Phosphonoameisensäure in einem Mutationsschritt und in Gegenwart von 5-Ethyl-2'-deoxyuridin in einem weiteren Mutiationsschritt in eine Doppelmutation bringt, wobei die Pathogenität verloren geht, die Antigeneigenschaften aher erhalten bleiben (DE-OS 3 122 669 entspricht US-P 4 322 404).
Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs gegen Herpes-Viren gefunden, das dadurch gekenn- zeichnet ist, daß man pathogene Wildstämme von Herpes-Viren in Anwesenheit von Verbindungen der Formel I in welcher R für Wasserstoff oder einen Acyl- oder Silylrest, R1 für Wasserstoff, Alkyl oder Acyl steht und die Base mit der D-Ribose über eine ß-Glycosidbindung verbunden ist, solange kultiviert bis gegen die Verbindungen der Formel I resistente Mutanten auftreten, die in Anwesenheit der Verbindungen der Formel I weiter kloniert werden können.
Es wurde ferner ein Impfstoff gegen Herpes-Viren gefunden, der dadurch hergestellt wird, daß man Wildstämme von Herpes-Viren in Anwesenheit von Verbindungen der Formel I solange kultiviert, bis gegen die Verbindungen der Formel I resistente Mutanten auftreten, die in Anwesenheit der Verbindungen der Formel I nach der Plaque-Methode kloniert und anschließend in Ublicher Weise formuliert werden können.
Es wurde ferner die neue Mutante SL des Aujeszky-Virus gefunden. Diese wurde am 20. Dezember 1984 unter der CNCM Nr. i-406 bei Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (Institut Pasteur), 25. rue du Docteur Roux, Paris hinterlegt.
Es wurde ferner ein Verfahren zur Herstellung der Mutante des Aujeszky-Virus mit der CNCM Nr. i-406 gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Wildstamm des Aujeszky-Virus in Anwesenheit von Verbindungen der Formel I kultiviert, die Mutante, deren Vermehrung nicht gehemmt wird, isoliert und in Anwesenheit von Verbindungen der Formel I nach der Plaque-Technik in Zellkulturen kloniert.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Impfstoffe gegen Herpes-Viren bietet den Vorteil, daß rasch und ohne großen Aufwand ein wirkungsvoller Impfstoff erzellgt werden kann, der universell einsetzbar ist. So kann z.B. ein aus Wildstämmen des Aujeszky-Virus nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnener Impfstoff nicht nur bei Schweinen, sondern auch bei Rindern, Schafen, Ziegen, Hunden und Katzen eingesetzt werden.
Gegenüber dem aus US-P 4 322 404 bekannten Verfahren bietet das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, daß es nicht erforderlich ist, eine Doppelmutation in Gegenwart von Phosphonoameisensäure und 5-Ethyl-2'-deoxyuridin durchzuführen, sondern daß die einfache Behandlung mit 5-Ethyl-2'-deoxyuridin ausreicht, um den gewünschten Impfstoff herzustellen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird zur Herstellung von Impfstoffen gegen folgende Herpes-Viren eingesetzt: Equine Herpesviren Typen 1, 2, 3, Bovine Herpesviren Typen 1 bis 6, Porcines Herpesvirus Typ 1, Ziegenherpesviren, Canine Herpesviren, Feline Herpesviren und Aviäre Herpesviren.
Mit den erfindungsgemäßen Impfstoffen können Virus infektionen bei Nutz- und Hobbytieren bekämpft werden. Zu den Nutztieren zählen Rind, Schwein, Pferd, Schaf, Ziege und Geflügel, wie z.B. Huhn, Puter, Gans, Ente.
Zu den Hobbytieren zählen z.B. Hund, Katze, Ziervögel.
Besonders bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt zur Herstellung von Impfstoffen z.B. gegen die Aujezkysche Erkrankung bei Rind, Schwein, Hund und Katze, gegen die BHV l-Infektionen beim Rind, gegen die Mamilitis des Rindes, gegen die Marecksche-Erkrankung bei Huhn und Pute und gegen die Rhinopneumonitis beim Pferd.
Die beim erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Verbindungen der Formel I sind bekannt oder lassen sich analog zu bekannten Methoden darstellen (vgl.
DE-OS 1 620 185).
In Formel I steht R für Wasserstoff, Acyl oder Silyl.
Zu den Acylresten zählen C1-4-Alkylcarbonyl, insbesondere Acetyl, Benzoyl, das gegebenenfalls substituiert ist, Sulfonyl oder Phosphonyl. Zu den Silylresten zählen Trimethylsilyl, aber auch sterisch gehinderte Reste, wie Isoamldimethylsilyl oder t-Butyldimethylsilyl. Bevorzugt steht R in Formel I für Wasserstoff, C1 44-Alkylcarbonyl. Besonders bevorzugt steht R für Wasserstoff.
In Formel I steht R1 für Wasserstoff, Alkyl oder Acyl.
Zu den Acylresten zählen C1 4-Alkylcarbonyl, insbesondere Acetyl, Benzoy, das gegebenenfalls substuiert ist.
Bevorzugt steht R1 für Wasserstoff, C1 4-Alkyl, c14 Alkylcarbonyl. Besonders bevorzugt steht R1 für Wasserstoff.
Zu den Verbindungen der Formel I zählen 5-Ethyl-2'-deoxyuridin, 3,6'-Diacetyl-5-ethyl-2'-deoxyuridin.
Besonders bevorzugt ist 5-Ethyl-2'-deoxyuridin im folgenden abgekürzt (EtUdR).
Die als Ausgangsmaterial eingesetzten Wildstämme von Herpesviren sind bekannt und können aus Material erkrankter Organismen in bekannter Weise entweder unter "in vivo" Bedingungen" oder "in vitro" Bezeichnungen angezüchtet oder angereichert werden. (Siehe A.Mayr et al. Virologische Arbeitsmethoden Band 1, Fischer Verlag Stuttgart 1974. Seiten 231-277, 363-496, 511-605) Z.B. kann als Wildstamm der Stamm Phylaxia mit der CNCM Nr. i-405 (hinterlegt bei Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (Institut Pasteur) 25. rue du Docteur Roux, Paris) eingesetzt werden.
Dieser, wie auch andere Wildtyp-Stämme des Aujeszky-Virus sind frei zugängig.
Sie können beliebig von infizierten Tieren in bekannter Weise gewonnen werden.
Es macht dabei keinen Unterschied, in welchem Land oder welchem Erdteil ein Wildstamm gewonnen wird.
Alle bisher geprüften Isolate lieferten mit gleicher Häufigkeit gegen Verbindungen der Formel I Mutanten.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Viruswildstämme in Ublicher Weise in Gegenwart von Verbindungen der Formel I in Zellkulturen kultiviert.
Die Kultivierung erfolgt dabei in Zellarten, in denen sich die einzelnen Herpesviren vermehren. Hierfür geeignete Zellkulturen sind z.B. beschrieben in A.Mayr et al Virologische Arbeitsmethoden, Band 1 "Zellkulturen-Bebrütete Hühnereier-Versuchstiere", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1974.
Bevorzugt seien folgende Zellarten genannt: Mäuse-Embryo-Zellen, BHK-21-Zellkulturen, Kälberhoden-Zellen, Kälbernieren-Zellen (z.B. MDBK, EBK), Schweinenieren-Zellen (z.B. PK 15).
Es werden für die Kultivierunj handelsübliche Nährlösungen eincesetzt, die für die jeweilige Zellart optimal sind.
Die folgende Tabelle gibt einen Überblick über die zur Virus züchtung bevorzugten Zellkulturen sowie die dazu verwendeten Kulturmedien.
Virus Zelle Medium Aujeszky Primary rhesus kidney BME oder Hanks LH Primary vervet monky kidney BME oder Hanks LH Human embryonic lung diploid cell line 199 He La MEM Primary calf, dog, rabbit, cat, pig kidney BME oder Hanks LH Primary chick, mouse embryo BME oder Hanks LH RK 13 (rabbit kidney cell line) MEM LIC-RK 1 ( " ) 199 L (mouse fibroblast cell line) MEM BHK 21 GMEM PK 15 MEM Rhinopneumonitis prim. Schweine-, Schaf-, Pferde-, BME oder Hanks LH Kaninche- und Hamsternieren BME oder Hanks LH prim. Pferdehoden BME oder Hanks LH He La MEM RK 13 MEM BHV 1 prim. Kälber-, Schweine-, Schaf-, Ziegen-, BME oder Hanks LH Pferde-, Kaninchennieren BME oder Hanks LH prim. Kälberboden BME oder Hanks LH Primary vervet monkey kidney BME oder Hanks LH Human embryonic lung diploid cell line 199 RK3 MEM CMEM MDBK MEM NBL 13 (Gehirn v. embry. Schaf) MEM EBTr (embry. Rindertrachea) MEM Marek prim. Kükennieren BME oder Hanks LH embryonale Fibroblasten von Enten, Hühnern, BME oder Hanks LH Gänsen, Puten, BME oder Hanks LH Wachteln, Fasanen BME oder Hanks LH Erläuterung der Abkürzungen: Medien BME : Basal Medium Eagle Hanks LH : Hanks-Salzlösung mit Lactalbumin-Hydrolys at MEM : Minimal Essential Medium (Eagle) GMEM : Glasgow-Modification von MEM 199 : Medium 199 (Parker) Zell-Linien BHK 21 : Nierenzellen vom Goldhamster.
Isoliert 1961 von Macphesson u.
Stoker.
EBTr : Embyryonale Rinder-Tracheazellen.
Isoliert 1964 von Kiniazeff et al.
Hela : Menschliche Cerwix-Careinomzellen.
Isoliert 1951 von Gey et al.
L : Mäuse-Fibroblasten.
Isoliert 1948 von Sanford, Earle u. Likely.
MDBK : Rinder-Nierenzellen (Mit BVD /Bovine diarrhea virus7persistent infiziert.) Isoliert 1957 von Madin u. Darby.
PK 15 : Schweine-Nierenzellen.
Isoliert 1955 von Slice.
Eine typische Basis-Nährlösung zur Züchtung tierischer Zellen ist z.B. MEM (Minimal essential medium) Eagle, H., in, Science, 130 (1959) S. 432 beschrieben. Weitere Nährlösungen sind z.B. in A.Mayer Virologische Arbeitsmethoden Band 1, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart 1974, S. 314-320 beschrieben.
Zur Komplettierung können den bekannten Nährlösungen weitere Komponenten zugesetzt werden, wie Seren, Antibiotika, viskositätserhöhende Stoffe zur Plaque-Bildung nach Virusinfektion.
Die Verbindungen der Formel I sind in der Nährlösung der Kulturmedien in einer Konzentration von 50-600 ppm, bevorzugt 200-600 ppm, besonders bevorzugt 450-550 ppm enthalten.
Die optimale Konzentration hängt dabei vor allem von der Art der verwendeten Zell-Linien und der Zusammensetzung der Kulturmedien ab.
Bei den oben angegebenen bevorzugten Zellarten ist eine Konzentration der Verbindungen der Formel I in der Nährlösung von etwa 500 ppm besonders bevorzugt.
Die Kultivierung erfolgt unter den üblichen für die verwendeten Zellarten optimalen Bedingungen.
Bevorzugt ist der Temperaturbereich von 34-390C.
Besonders bevorzugt sind etwa 370C. Günstig ist dabei in einer Atmosphäre von Luft mit ca. 5 Vol.-% CO2 zu arbeiten.
Die Kultivation der Zellen und die anschließende Virus züchtung kann grundsätzlich in allen Kulturgefäßen und nach allen Züchtungstechniken geschehen, die für derartige Zwecke üblicherweise Anwendung finden.
Als bevorzugte Methode zur Isolierung und Klonierung eines gegen Verbindungen der Formel I resistenten Virusstammes, sei die Plaque-Technik genannt.
Dazu wurden in geeigneten Kühlungsgefäßen mit flachem Boden Zellkulturen angezüchtet und nach Dichtwerden mit einem Virus-Wildstamm infiziert.
Anschließend werden sie mit einem Medium über schichtet, in dem Verbindungen der Formel I enthalten sind.
In infizierten Zellkulturen, die mit Nährlösungen ohne Zusatz von Verbindungen der Formel I gehalten werden, kommt es zu einer ungestörten Virusvermehrung.
Dies zeigt sich an dem ungehemmten Wachstum der Plaques, die von einer einzelnen infizierten Zelle ausgehend durch eine konzentrische Virusausbreitung entstehen, die meist von einer Zerstörung der befallenen Zellen begleitet ist.
In infizierten Zellkulturen, die mit Nährlösung mit Zusatz der Verbindungen der Formel I gehalten werden, ist die Vermehrung und damit die Plaque-Bildung des Wildtyp-Virus gehemmt, und nur die Plaques des gegen Verbindungen der Formel I resistenten Virus zeigen ein ungestörtes Wachstum.
Bei starker Hemmung der Vermehrung des Wildtyp-Virus enthält der Überstand von Kulturen mit ungestört wachsenden Plaques 3 bis 4 Tage post Inf. nur von den Zellen dieser Plaques gebildetes Virus, das gegen Verbindungen der Formel I resistent ist.
Dieses Virus läßt sich aus dem Überstand gewinnen und am einfachsten nach der Plaque-Methode klonieren sowie anschließend zur Impfstoffherstellung beliebig vermehren.
Es kann entweder direkt als flüssiger Impfstoff verwendet werden oder nach Zusatz geeigneter Stabilisatoren in einer nach üblichen Verfahren gefriergetrockneten Form.
Gegebenenfalls können auch geeignete Adjuvantien beigemischt werden. Ebenso ist eine Kombination mit anderen Impf stoffen möglich.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Virussuspensionen können nach üblichen Methoden formuliert und als Lösung, Sirup, Emulsion, Spray, Salbe, Paste, Creme, Lotion, Aerosol, Tabletten usw. verabreicht werten. Bevorzugt wird der Impfstoff intranasal als Spray oder parenteral appliziert.
Die Formulierungen werden in an sich bekannter Weise hergestellt, z.B. durch Verdünnung der kultivierten Mutante mit geeigneten Lösungsmittel und/oder inerten, nichttoxischen, festen, halbfesten oder flüssigen Trägerstoffen, gegebenenfalls unter Verwendung von Emulgier- und/oder Dispergier-, Sprüh- und Treibmitteln und unter Verwendung von geeigneten Stabilisatoren.
Als solche Lösungsmittel, Trägerstoffe, Emulgier- bzw.
Dispergiermittel seien hier genannt: Wasser, nichttoxische organische Lösungsmittel bzw.
Verdünnungsmittel wie Paraffine (z.B. Erdölfraktionen), pflanzliche Öle (z.B. Erdnuß-/Sesam-Öl), Alkohole (z.B.
Ethylalkohol, Glyzerin), Glykole (z.B. Propylenglykol, Polyethylenglykol) und Wasser; feste Trägerstoffe, wie z.B. natürliche Gesteinsmehle (z.B. hochdisperse Kieselsäure, Silikate), Zucker (z.B. Rohr-, Milch- und Traubenzucker); Emulgiermittel, wie nichtionogene und anionische Emulgatoren (z.B. Polyoxyethylen-Fettsäure-Ester, Polyoxyethylen-Fett-lkohol-Ether, Alkylsulfonate und rylsulfonate), Dispergiermittel (z.B. Lignin, Sulfitablaugen, Methylcellulose, Stärke und Polyvinylpyrrolidon) und Gleitmittel (z.B. Magnesiumstearat, Talkum, Stearinsäure und Natriumlaurylsulfat).
Als Stabilisatoren seien aufgeführt: Aminosäuren, Zucker, Proteine, Polysaccharide, Polyalkylenglykole. Diese Stabilisatoren können sowohl in wäßriger Lösung als auch im lyophilisierten Zustande zugesetzt werden.
Experimenteller Teil Das folgende Beispiel wurde mit Aujeszky-Virus des Types Phylaxia mit der CNCM Nr. i-405 durchgeführt.
Kulturen von Mäuse-Embryozellen werden mit Zellkulturmedium MEM (Sewa, Heidelberg. Zusammensetzung s. Seite 9), das zusätzlich 10 % Kälberserum (Sewa, Heidelberg) sowie 100 ppm Streptomycin sowie 100 IE/ml Penicillin enthält, in kleinen Plastik-Petrischälchen von 6 cm Durchmesser angezüchtet.
Sobald auf dem Boder der Petrischalen ein lückenloser Zellrasen entstanden ist, wird er nach Abgießen des Anzuchtmediums infiziert und zwar mit 0,1 ml Virussuspension des Aujeszky-Virus-Stammes Phylaxia, der CNCM Nr. i-405.
Zweckmäßigerweise werden sofort mehrere Kulturen mit steigenden Verdünnungen der Virus suspens ion infiziert.
Anschließend wird der Zellrasen der Kulturen mit Plaque-Medium überschichtet, das aus Anzuchtmedium mit zusätzlich 2 % Sephadex G 200 (Pharmacia, Uppslala) sowie 500 ppm EtUdR besteht.
Nach 3 bis 4-tägiger Plaque-Entwicklungdauer bei 370C in einer Atmosphäre aus Luft mit 5 Vol.-% CO2 finden sich in dem Zellrasen der Kulturen neben sehr kleinen Plaques von etwa 0,5 mm Durchmesser vereinzelt große Plaques, deren Durchmesser etwa 3,0 mm beträgt.
Bezogen auf die Plaque-Zahl von in gleicher Weise infizierten Kontrollkulturen mit EtUdR-freiem Medium beträgt die Häufigkeit der großen Plaques etwa 0,3 %.
Der Überstand von Kulturen, in denen nur ein einzelner großer Plaque entstanden ist, enthält nur EtUdR-resistenten Virus, da die Vermehrung des Wildtyp-Virus durch das EtUdR stark gehemmt ist.
Mit dem Virus aus einer derartigen Kultur mit nur einem einzigen großen Plaque des EtVdR-resistenten Virus wurden nach der beschriebenen Plaque-Technik in Anwesenheit von 500 ppm EtUdR im Plaque-Medium Arei klonende Passagen durchgeführt.
Das geklonte EtUdR-resistente Virus erhielt die Bezeichnung "Stamm SL" (CNCMN Nr. i-406.).
Dieser Stamm wurde in verschiedenen Zellarten (Mäuse-Embryozellen, Kälber-Nierenzellen, Zellen der Linie BHK 21) weiterpassiert, wobei sich das Merkmal "EtUdR-Resistenz" während wenigstens 25 Passagen als stabil erwies.
Auch bei Passagen in Schafen erwies er sich als stabil.
Nach 6 derartigen Passagen, bei denen jeweils das von einem Schaf durch die Nase ausgeschiedene Virus zur Infektion eines neuen Tieres berührt wurde, erwies sich der Stamm SL als unverändert EtUdR-resistent und apathogen für Schafe.
Analog der Isolierung, Klonierung und Weiterzüchtung des Stammes SL lassen sich aus allen Wildtyp-Isolaten des Aujeszky-Virus-EtUdR-resistente Mutanten gewinnen.
Die Prüfung der gemäß Beispiel 1 gewonnenen Aujeszky-Virusmutante auf Pathogenität bei verschiedenen Tierarten lieferte folgendes Ergebnis: Beispiel A-1 Schwein Zur Prüfung der Pathogenität des Stammes SL CNCM Nr. i-406 für Schweine wurden 6 Ferkel mit einem Gewicht von 6 kg intranasal mit 10 KIND50 dieses Stammes infiziert. Sie erhielten dazu in jedes Nasenloch 0,5 ml Virussuspension eingetropft.
Alle 6 Ferkel zeigten am 3. und 8. Tag post inf.
Temperaturerhöhungen, die jeweils im Mittel 0,90C betrugen.
Das Allgemeinbefinden der Tiere war zu keiner Zeit erkennbar gestört und auch die Fresslust bleib unvermindert erhalten.
Beispiel B-1 Schaf Es wurden 5 ausgewachsene Schafe mit 105,0 KID50 des Stammes SL CNCM Nr. i-406 intranasal infiziert.
Sie überlebten die Infektion ohne Temperaturerhöhung oder klinische Symptome.
Beispiel C-1 Rind Vier Kälber im Alter zwischen 3 und 5 1/2 Monaten wurden mit 108,0 KID50 des Stammes SL CNCM Nr. i-406 intranasal infiziert.
Sie überlebten die Infektion ohne Temperaturerhöhung.
Die gemäß Beispiel 1 gewonnene Virus Mutante SL wurde als weiteres auf ihre immunogenen Eigenschaften geprüft: Beispiel A-2 Die Ferkel des Beispiels A-1 wurden 31 Tage nach Infektion mit der Virus Mutante SL CNCM Nr. i-406 intranasal mit 106,0 KID50 pathogenem Wildtyp-Virus Phylaxia CNCM Nr. i-405 intranasal infiziert.
Die Testinfektion wurde von allen 6 Ferkeln reaktionslos überstanden.
3 Kontaktferkel, die 2 Tage post inf. zu den 6 mit der Virus-Mutante SL infizierten Ferkeln hinzugestellt worden waren, starben 6-13 Tage nach der Testinfektion.
Beispiel B-2 Die Schaf 3 des Beispiels B-1 wurden 68 Tage nach der Infektion mit der Virus Mutante SL CNCM Nr. 406 intranasal mit pathogenem Wildtyp-Virus Phylaxia CNCM Nr. i-405 infiziert. Die Testinfektion wurde von allen 5 Tieren reaktionslos überstanden.
Beispiel C-2 Zwei der Tiere des Beispiels C-1 wurden 31 Tage nach der ersten Infektion mit dem Virus Mutante SL CNCM Nr. i-406 erneut mit Virus der Mutante SL CNCM Nr.
406 infiziert. Auch diese Infektion wurde reaktionslos überstanden.
31 Tage nach der zweiten Infektion wurden diese Tiere mit pathogenem Wildtyp-Virus Phylaxia CNCM Nr. i-405 infiziert.
Die Testinfektion wurde von beiden Tieren reaktionslos überstanden.
Beispiel C-3 die zwei restlichen Tiere des Beispiels C-1 wurden 31 Tage nach der Infektion mit der Mutante SL CNCM Nr. i-406 intranasal mit Wildtyp-Virus Phylaxia CNCM Nr. i-405 infiziert.
Die Testinfektion wurde von beiden Tieren reaktionslos überstanden.

Claims

Patent ansprüche 1. Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen gegen Herpes-Viren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man pathogene Wildstämme von Herpes-Viren in Anwesenheit von Verbindungen der Formel I in welcher R für Wasserstoff oder einen Acyl- oder Silylrest R1 für Wasserstoff, Alkyl oder Acyl steht und die Base mit der D-Ribose über eine ß-Glycosidbindung verbunden ist, solange kultiviert werden, bis gegen die Verbindungen uer Formel I resistente Mutanten auftreten, die sich in Anwesenheit der Verbindungen der Formel 1 weiter klonieren lassen.
2. Impfstoff gegen Herpes-Viren, der dadurch hergestellt wird, daß man Wildstämme von Herpes-Viren in Anwesenheit von Verbindungen der Formel I so- lange kultiviert, bis gegen die Verbindungen der Formel I resistente Mutanten auftreten, die in Anwesenheit der Verbindungen der Formel I koniert und anschließend in üblicher Weise formuliert werden.
3. Mutante des Aujesky-Virus SL mit der CNCM Nr. i-406.
4. Verfahren zur Herstellung der Mutante SL des Aujeszky-Virus mit der CNCM Nr. i-406, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Wildstamm des Aujeszky-Virus vom Stamm Phylaxia CNCM Nr. i-405 in Anwesenheit von Verbindungen der Formel I kultiviert, die Mutante die im Wachstum nicht gehemmt wird, isoliert und in Anwesenheit von Verbindungen der Formel I kloniert.
5. Impfstoff gegen Aujeszky-Viren, dadurch gekennzeichnet, daß er die Mutante SL des Aujeszky-Virus mit der CNCM Nr. i-406 enthält.