DE2425997A1

DE2425997A1 - Verfahren zur herstellung von abgeschwaechtem katzenfiebervakzin

Info

Publication number: DE2425997A1
Application number: DE19742425997
Authority: DE
Inventors: William Marshall Acree; Robert Wayne Simons
Original assignee: Rohm and Haas Co
Current assignee: Whitmoyer Laboratories Inc Myerstown Pa Us
Priority date: 1973-06-04
Filing date: 1974-05-30
Publication date: 1975-01-02
Also published as: GB1467503A; US3892627A; FR2231368B1; FR2231368A1; NL7407234A; BE815871A

Description

Die Erfindung betrifft die Abschwächung oder Virulenzverminderung virulenter Stämme von Kätzenfiebefvirert auf Marder- bzw. irettehengewebe und die Herstellung von Katzenkrankhextsvakzin (Katzenfiebervakzin) auf Marder^- bzw. E*rettchengewebe.

In den letzten wenigen Jahren wurde eine Reihe von Techniken fjir die Äbschwächung oder Virulenzverminderung virulenter
Stämme von Katzenfieberviren und die anschließende Produktion eines geeigneten Vakzins entwickelt. Meistens litten diese
Verfahren an dem Nachteil, daß ernsthafte Probleme einer Ver-

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unreinigtmg mit anderen, nicht leicht entdeckbaren Viren existiereni Dies ist übertrieben, da die herkömmliche Methode einer Abschwächung und anschließenden Vakzinproduktion die Reihenkuituf eines virulenten Stammes von Katzenfieberviren auf Kätzengewebe (gewöhnlich Jungkatzengewebe) einschließt. Es ist nicht unüblich, 2Ö, 30 oder mehr Reihendürehgänge durchzuführen, um die erforderliche Äbsdhwächung des virulenten Virus zu erhalten und so einen Keimvirus zu produzieren. Da jeder Reihendurchgang die Verwendung von frischem Gewebe erfordert, ist das V#ffättr'öH eiitireni anfällig für die' Verunreinigung mit anderen Viren, die in dem Kätze*ögewebe vorhanden sein können* Die gleiche Mogliehköit eiriöif Verunreinigung liegt auch während der Stufe der Väkziftvei-'niehrung öde*r Vakzinproduktiön vor* In jüngörer Zeit gab es'Anzeichen, daß auf Katzengewebe produziertes Kätzeftfiebäfväklin aüöh einen Leükämievirus enthalten kann, der nicht von dgffi Kätzeiifieberväkzin äbgetreftnt werden kann,

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Vermin-* derung der Möglichkeit einer Verunreinigung von Katzenfieber^- viren während der Abschwächüngs- öder Virulenzverminderungsstüfe und der ähSGhligßeftden Väkziiibilduhgsstufe zu bekommen.. Andere Ziele und Vorteile ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung*

Es wurde nun gefunden^ daß es möglich ist, einen wesentlichen Teil der Abschwächüng von Kätzenfiebervirus auf Marder- öder Frettchengewebe (Müstelägewebe) durchzuführen und danach das Vakzin in der Prödüktiönsstufe auf Marder- oder Frettchengewebe zu produzieren. Del: Austausch eines Teils des Katzehgewebes

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oder des gesamten Katzengewebes hat den Vorteil, daß es möglich ist, abgeschwächten Virus und Vakzin ohne Verunreinigung von anderen Viren, die normalerweise im Katzengewebe vorhanden sind, zu produzieren. Die Möglichkeit, Marder- oder Frettchengewebe zu verwenden, ist überraschend aus der Sicht, daß verschiedene Fachleute auf diesem Gebiet die Auffassung vertraten, daß es nicht möglich sein würde, Katzenfiebervirus auf Marderbzw. Frettchengewebe zu züchten.

Kurz gesagt besteht das vorliegende Verfahren einer Abschwächung oder Virulenzverminderung von Katzenfieber- bzw. Katzenpestvirus darin, daß. man in Reihe 1. den Virus auf Katzengewebe für ein Wachstum in vitro akklimatiert und anschließend 2. weiter auf Mustelagewebe abschwächt. Es ist wesentlich, das der akklimatisierte Virus in Berührung mit einer Suspension der Marder- oder Frettchengewebezellen gebracht wird. Bringt man den Virus nicht in Berührung mit suspendierten Mustelazellen, bekommt man keine Virusvervielfältigung. Der resultierende " abgeschwächte Virus kann dann benutzt werden, um Mustelagewebe-Produktionsansätze zu impfen. Bei der bevorzugten Betriebsweise wird der Titer oder Gehalt des auf Mustelagewebe abgeschwächten Keimvirus gesteigert, indem man Katzengewebe mit dem Mustela-Keimvirus impft und gewinnt, um so einen Mustela-Katzenkeimvirus für die Mustelagewebe-Produktionsansätze zu erhalten.

In etwas größeren Einzelheiten werden Katzengewebekulturen,. die mit einem virulenten Stamm von Katzenfiebervirus infiziert sind, 2 bis 15 Tage bei 30 bis 40° C inkubiert, je nach der

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optimalen Wachstumsgeschwindigkeit der Zellen. Die mit Virus beladenen Flüssigkeiten werden isoliert und für die nachfolgenden Durchgänge in katzenfiebervirusfreien Katzengewebekulturen und Marder- oder Frettchengewebekulturen verwendet. Zum Zwecke aller Passagen des Virus erhielt man das frische Gewebe von krankheitsfreien Tieren. Typischerweise ist es, wenn ein ICK-33-Katzenkrankheitsvirusstamm, der von D.L. Croghan beim 33. Durchgang durch Katzen erhalten wurde, als Quelle für den virulenten Stamm verwendet wird, erwünscht, den Virus serienmäßig durch etwa 6 bis 12 Passagen von Katzengewebe zu schicken. Beispielsweise kann man die Akklimatisierung für ein Wachstum in vivo erreichen, indem man den Virus durch 6 Katzenlungengewebekulturen und anschließend durch 2 Katzenembryozellkulturen und 2 Katzennierenzellkultüren schickt. Die letzten beiden Katzennierengewebedurchgänge sind erwünscht, um den Virustiter zu erhöhen. Bei diesem Durchgang produziert der Virus ein mäßiges Fieber und mäßige Katzenpest, die Katzenkrankheit in den empfänglichen Jungkatzen anzeigen. Der Virus ist jedoch ausreichend .akklimatisiert, so daß er durch Marder- oder Frettchenembryogewebekulturen geschickt und weiter in der Virulenz abgeschwächt werden kann. Typischerweise sind 3 Durchgänge oder Passagen auf Marder- oder Frettchengewebe ausreichend, um die Abschwächung zu vervollständigen und einen Keimvirus zu produzieren. Es ist jedoch gewöhnlich bevorzugt, den Virustiter in dieser Stufe zu steigern, indem man den Virus durch eine Katzennierengewebekultur schickt. In dieser Stufe ist der Virus in der Virulenz abgeschwächt, antigen und immunogen. Dieser Keimvirus kann verwendet werden, um unter Verwendung von Mar-

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dergewebe abgeschwächtes, antigenes und immunogenes Katzenfieber- bzw« Katzenpestvakzin zu produzieren.

Das Züchtungsmedium, in dem die Zellen gezüchtet werden können, ist beispielsweise Parkers Medium 199, Eagles Medium, Earles Medium usw. entweder mit oder ohne zusätzliche Verwendung von Antibiotika, wie Penicillin, Streptomycin usw. Die Zellen und Viren sind typischerweise bei einer Temperatur von etwa 30 bis 45° C, vorzugsweise bei 37 +2⁰C inkubiert. Das Kulturmedium kann am Ende von etwa 24 bis 240 Stunden von dem Zeitpunkt* an dem die Zellen und Viren vereinigt wurde, ausgetauscht werden. Typischerweise wird der pH-Wert im Bereich von etwa 6,8 bis 7,6, vorzugsweise bei etwa 7,2 gehalten.

Nachdem die den. Virus enthaltende Flüssigkeit von der Kultur der ersten Stufe isoliert wurde, wird sie weiter durch gewebehaltige Kulturmedium geschickt (Katzen— und Mardergewebe während der Virusäbschwächungsstufe und Mardergewebe in der Produkt ionsstufe) . In der ersten Passage ist der Virus in dem Wachstumsmedium der gleichen Zusammensetzung, wie vorher angegeben,, enthalten, jedoch mit der Ausnahme, daß das Katzengewebe durch andere Gewebe (Mustelagewebe) ersetzt wird, wobei diese Stufe während etwa 24 bis 240 Stunden bei einer Temperatur von 30 bis 45^ C, vorzugsweise bei 37 _+ 2 C abläuft.

Mustela- oder Marder- bzw. Frettchengewebe, das in diesem Verfahren verwendet wird, kann von Embryos, Lunge oder Niere abgenommen werden. Allgemein wird Marderembryogewebe.sowohl bei der Abschwächung bzw. Virulenzverminderung als auch bei der Produktion verwendet.

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Obwohl diese Erfindung primär auf die Abschwächung von Katzenfiebervirus auf Mustelagewebe und die Vermehrung von Katzenfiebervakzin auf Mustelagewebe gerichtet ist, kann die Erfindung auch angewendet werden _r um einen oder mehrere Ansätze von Katzenfiebervakzin auf Mustelagewebe zu produzieren, wo der Katzenfieber-Keimvirus nach irgendeiner bekannten Methode abgeschwächt wurde, wie gemäß den USA-Patentschriften 3 52O 972 oder 3 293 130, gemäß denen Katzengewebe zur Abschwächung verwendet wird. Der Inhalt der USA-Patentschriften 3 52O 972 und 3 293 13O wird in die Offenbarung dieser Anmeldung einbezogen. Es ist jedoch wesentlich, daß die Mustelazellen in einem suspendierten Zustand (nicht in einer monomulekularen Schicht) mit dem Katzenfiebervirus vorliegen, bevor Zellenwachstum erfolgt. Wenn man nicht in dieser Weise arbeitet, bekommt man im wesentlichen kein Viruswachstum.

Beispiel t

1 ml ICK-33-Katzenfiebervirusstamm, der von Dr. D.L. Croghan bei der 33. Passage durch Katzen erhalten worden war, wurde

2 in einen Gewebekulturkolben mit 12Ο cm Oberfläche zusammen mit etwa 2 χ TO Katzenlungenzellen und 25 ml "Basal Medium Eagles", das das zweifache der normalen Mengen an Vitaminen und Aminosäuren enthält, 10 % Fötusrinderserum, 1OO Einheiten Penicillin und tOO mg Streptomycin je Milliliter gegeben. Nach 5 Tagen bei 37° C wurden die Virusflüssigkeiten isoliert. Die vorausgehenden Schritte werden als Passage 1 angesehen_;Passagen 2 bis 6 wurden unter identischen Bedingungen durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, daß die aus der vorausgehenden Stufe isolier-

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te Virusflüssigkeit in der nachfolgenden Stufe verwendet wurde und die Wachstumsperiode gemäß der nachfolgenden Tabelle variiert wurde.

Tabelle

Passage Nr.	ml Virus	Aus Passage Nr.	Tage
2	0,25	1	5
3	0,25	2	3-5
4 .	. °'⁴	3	3-5
5	0,4	4	5
6	1,0	5	5

Die Virusflüssigkeiten aus der Passage 6 wurden durch Erhitzen auf 70 C während 30 Minuten gereinigt, um andere Viren als den Katzenfiebervirus zu inaktivieren.

Die 7. und 8. Passage der Reihe wurden in gleicher Weise wie die Passage 1 durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, daß 2x10 Katzenembryozellen anstelle der Katzenlungenzellen verwendet wurden, und die 7. Passage wurde 5 Tage auf 37 C gehalten, und die 8. Passage wurde 5 Tage auf 37 C gehalten. Nach der 7. Passage wurde, der Virus durch Filtrieren durch ein Membranfilter von 50 m,u gereinigt und 3 1/2 Stunden auf 75° C erhitzt. Nach der 8. Reihenpassage wurde der Virus durch Zentrifugieren geklärt, durch ein 0,45,u-Membranfilter filtriert und mit Carbowax 20m konzentriert. Der konzentrierte Virus wurde dann unter Verwendung eines Caesiumchloridgradienten ultrazentrifugiert. Der 115. 1/2 ml-Gradient außerhalb von 130 Gradienten wurde für die weitere Reihenpassage wegen seiner

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relativ nohen Potenz und Reinheit im Vergleich mit den anderen Gradienten ausgewählt.

Für die Reihenpassagen 9 und 10 wurden 4O.OOO Katzennierenzellen in "Minimum Essential Medium Eagles" mit nicht essenziellen Aminosäuren und Glutamin, 10 % Fötusrinderserum, 100 Einheiten Penicillin und 100 mg Streptomycin je Milliliter zusammen mit dem gereinigten Virus des 115. Gradienten, d.h. der 115. Stufe, unter Verwendung eines Verhältnisses von Virusteilchen (aus der vorausgehenden Passage) zu Zellen von 1 : 1 suspendiert. Diese wurden 4 bis 7 Tage auf 37 C gehalten, bevor sie isoliert wurden. Der aus der Passage 10 isolierte Virus wurde in Jungkatzen getestet, wobei man fand, daß er mildes Katzenfieber verursachte.

In dieser Stufe war der Virus ausreichend für eine Kultur in vitro akklimatisiert, so daß er auf Mardergewebe gezüchtet werden konnte. Die Reihenpassagen 11, 12 und 13 verwendeten ein Verhältnis von Virus zu Zellen von 1:1. Etwa 2 bis 5 ml Virus aus der vorausgehenden Passage und 30 Millionen Zellen von Marderembryogewebe in "Minimum Essential Medium Eagles" mit nicht essentiellen Aminosäuren und Glutamin, 10 % Fötusrinderserum, 100 Einheiten Penicillin und 100 mg Streptomycin je Milliliter wurden in Rollkulturflaschen suspendiert, die 8 Tage auf 37 C gehalten und gefroren und wieder aufgetaut wurden, indem man die Kulturen in ein Trockeneis-Acetonbad tauchte und anschließend bei 37° C wieder auftaute und auf diese Weise die Zellen zerstörte und die mit den Zellen verbundenen Viren in die Flüssigkeit freigab.

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Der Titer des Virus wurde dann in der Passage Nr. 14 erhöht, indem man Katzennierenzellen und Virus aus der Passage 13 verwendete. Nachdem die Rollflaschenkultur 8 Tage auf 37° C gehalten worden war, wurde die Kultur in der im vorausgehenden Absatz beschriebenen Weise gefroren und aufgetaut. Die resultierende Virusflüssigkeit war geeignet für die Verwendung als Keimmaterial.

Wenn Jungkatzen mit dem Virus aus dem Keimmaterial geimpft wurden, bekamen die Jungkatzen Immunität, die eine spätere Entwicklung von Katzenfieber verhinderte, wenn die Katzen mit einem bekannten virulenten Stamm infiziert wurden.

Beispiel 2

Dieses Beispiel erläutert die Produktion eines Katzenfiebervakzins unter Verwendung von Mardergewebe. 50 Millionen Zellen Marderembryogewebe und 50 Millionen FAID₅₀ von Virus, suspendiert in 2 1 "Minimum Essential Medium Eagles" mit nicht essentiellen Aminosäuren und Glutamin, 10 % Fötusrinderserum, 100 Einheiten Penicillin und 100 mg Streptomycin je Milliliter wurden in eine 9 1-Rollflasche gegeben. Nachdem die Kultur 8 Tage auf 37° C gehalten worden war, wurde das Vakzin unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Gefrier-Auftaumethode isoliert und ergab ein Vakzin, das in der Lage war, Katzen zu immunisieren.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von abgeschwächtem Katzenfiebervakzin, dadurch gekennzeichnet, daß man einen abgeschwächten Katzenfieber-Keimvirus auf einer Mustelagewebekultur züchtet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Katzenfieber-Keimvirus verwendet, der durch Züchtung eines virulenten Stammes von Katzenfiebervirus in einer Suspension von Mustelazellen erhalten wurde.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Katzenfieber-Keimvirus verwendet, der auf Katzengewebe unter Akklimatisierung abgeschwächt und dann in Reihenpassagen durch Mustelagewebe geführt wurde.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Katzenfieber-Keimvirus verwendet, der weiter Passagen auf Katzengewebe nach einer Reihenpassage durch Mustelagewebe unterzogen wurde.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Katzenfieber-Keimvirus verwendet, der durch Reihenpassagen durch Katzengewebe und Mustelagewebe abgeschwächt wurde, wobei der Virus aus einer Reihenpassage durch Katzengewebe einer Suspension von Mustelagewebe zugesetzt wurde.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Katzenfieber-Keimvirus verwendet, der einer einzelnen Passage durch Katzennierengewebe unterzogen wurde, nachdem der Virus durch Mustelagewebe abgeschwächt worden war.

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