AT234902B - Verfahren zur Herstellung einer Vaccine gegen Staupe - Google Patents
Verfahren zur Herstellung einer Vaccine gegen StaupeInfo
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Description
<Desc/Clms Page number 1> Verfahren zur Herstellung einer Vaccine gegen Staupe Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer Vaccine gegen Staupe, die lebendes, abgeschwächtes apathogenes Staupevirus enthält, welches nach Injektion bei Tieren der Familie der Caniden und Musteliden immunisierende Antikörper erzeugt, die mit den von virulenten Staupeviren erzeugten Antikörpern, identisch sind. Die Methode, welche jetzt allgemein für die Produktion einer abgeschwächten Lebendvaccine benutzt wird, beruht auf der Kultivierung des Staupevirus in embryonierten Hühnereiem, wie es z. B. in den USA-Patentschriften Nr. 2, 136. 131, Nr. 2, 271, 819 und Nr. 2, 391, 540 beschrieben ist. Eine in dieser Weise hergestellte Vaccine besitzt aber gewöhnlich einen verhältnismässig niederen Titer, der in der Grössenordnung von 103 - 104/mlliegt. Ferner ist dieses Verfahren kompliziert, langwierig und kostspielig. Es wurde nun gefunden, dass man eine Vaccine gegen tierpathogene Viren durch mindestens 50 aufeinanderfolgende Passagen des Virus in Gewebekultur in vitro unter physiologischen Bedingungen mit anschliessender, in üblicher Weise erfolgender Aufarbeitung der virushaitigen Kulturflüssigkeit in der Weise herstellen kann, dass man Staupeviren diesen Passagen unterwirft, und dass als Gewebezellen solche aus Organen von Caniden und Musteliden, insbesondere Nierenzellen von 6 bis 8 Wochen alten Welpen ver- EMI1.1 einen pH-Wert zwischen 7, 0 und 8, 0, vorzugsweise 7, 6, aufweisen, in Frage. Die Einstellung des optimalen pH-Wertes wird zweckmässig mit Natriumbicarbonat vorgenommen. Die Züchtung des Staupevirus wird zweckmässig bei einer Temperatur zwischen 30 und 37 C, vorzugsweise 35 - 370C, durchgeführt. Es war zwar bekannt, dass man Hcc - Viren auf Gewebekulturen aus Hundenieren, Hundetestikeln und Hundeuterus, d. h. Organen, zu denen das Hcc-Virus eine natürliche Affinität besitzt, züchten kann, wobei das Virus jedoch nur reversibel modifiziert wird. Es war jedoch nicht zu erwarten, dass nach dem erfindungsgemässen Verfahren Staupeviren erhalten werden, die irreversibel modifiziert und apathogen sind. Die Erfindung stellt eine verbesserte Methode zur Herstellung einer Staupe-Vaccine dar, die unter leicht zu kontrollierenden Bedingungen durchgeführt werden kann. Das Verfahren gemäss der Erfindung beruht darauf, dass die Züchtung des Staupevirus in einer Gewebekultur charakteristische Gewebever- änderungen hervorruft, die mikroskopisch leicht festgestellt werden können. Während der Kultivierung wird das Virus in die Kulturflüssigkeit ausgeschieden. Die das Virus enthaltende Kulturflüssigkeit wird dann auf neue Gewebekulturen übertragen und die Züchtung wiederholt. Diese Passagen werden in genügender Anzahl wiederholt, bis das Virus abgeschwächt ist. Wenige Passagen des Virus geben keine befriedigenden Ergebnisse hinsichtlich der erwünschten Apathogenität, und es wurde deshalb vermutet, dass es nicht möglich sein würde, eine aktive Vaccine mit der nötigen Apathogenität und der verlangten hohen Antigenität zu erzeugen. Es zeigte sich jedoch überraschenderweise, dass es durch eine grosse Anzahl von Passagen, z. B. etwa 50 Passagen oder mehr, möglich ist. ein Virus <Desc/Clms Page number 2> EMI2.1 <Desc/Clms Page number 3> EMI3.1 <Desc/Clms Page number 4> vollemBeispiel 2 : Das nach der unter A beschriebenen Arbeitsweise hergestellte, modifizierte, apathogene Staupevirus wurde auch in Hundeversuchen auf Verträglichkeit, Unschädlichkeit und Wirksamkeit geprüft. Acht gegen das Staupevirus nicht immune, 3 Monate alte Welpen (Bastarde) wurden in einem Isolieri zwinger untergebracht. Von diesen Hunden wurden fünf mit je 1 ml der vorstehenden (Frettchenversuch) staupevirushaltigen Gewebesuspension intramuskulär vacciniert. Die andern drei Hunde verblieben als unbehandelte Kontrollen. Das für die Immunisierung der Hunde verwendete Virusmaterial warde nach der EMI4.1 rend einer Beobachtungszeit von 44 Tagen gesund. Von sämtlichen Hunden wurden Serumproben vor Versuchsbeginn und am 10. und 20. : ag nach der Impfung und von den Kontrollhunden ausserdem'am 38. Tag entnommen und auf Serumant :- Mrpcr gegen Staupe untersucht, um festzustellen, ob durch die gemeinsame Unterbringung der vaccinierten und nicht vaccinierten Tiere eine Übertragung des Impfvirus auf die Kontrolltiere erfolgt. Es zeigte sich, dass im Serum der Kontrolltiere auch am 38. Tag keine Antikörper vorhanden waren. Neutralisierende Antikörper wurden mit einem signifikanten Titer bereits nach 10 Tagen in den Seren der vaccinierten Hunde nachgewiesen. Die Antikörperstudien wurden in Hundenierenepithelkulturen in gleicher Weise wie bei den Immunisierungsversuchen an Frettchen durchgeführt. Bei sämtlichen vaccinierten Hunden war das Serum in der Verdünnung 1 : 100 in der Lage, 300 TCID des Staupevirus vollkommen zu neutralisieren. Höhere Serumverdünnungen wurden nicht untersucht. Am 44. Tag post vaccinationem'wurden sämtliche Welpen mit einem hundepathogenen Snyder-HillStamm intramuskulär infiziert. Dieser Stamm soll bei intracerebraler Impfung am Hund zigue Encephalitis verursachen, bei ändern Impfmethoden in 25% der Fälle zu Staupe führen, aus der sich eine Encephalitis entwickelt. In dem vorliegenden Experiment blieben die fünf vorher mit Kulturvirus geimpften Tiere unbeeinflusst, während sämtliche Kontrolltiere nach 3 - 4 Tagen an typischer Staupe mit hohem Fieber und im übrigen ausgedehnten Symptomen erkrankten. Eines der Kontrolltiere starb nach 12 Tagen, nachdem es emste nervöse Symptome, Kaukrampf, Zuckungen in der Augen- und Ohrenmuskulatur zeigte. Bei der Obduktion zeigten sich encephalitische Veränderungen im Kleinhirn und für Staupe typische eosinophile, cytoplasmatische Einschlusskörper in den Epithelzellen derTrachealschleimhaut. Eines der beiden andern Kontrolltiere zeigten nervös bedingte Muskelkrämpfe im Rumpf und den Extremitäten, ataktische Bewegungen und hochgradige Apathie. Die Beobachtungszeit nach der Impfung mit dem Snyder-Hill-Stamm betrug 52 Tage. Die Ergebnisse sind in Tabelle I wiedergegeben. Ein weiterer Versuch zur Überprüfung der Eigenschaften des in der Gewebekultur modifizierten Staupevirus wurde an sechs 8 Wochen alten staupeempfänglichen Hundewelpen durchgeführt. Es wurden jeweils zwei Wurfgeschwister gemeinsam in Isolierstallungen untergebracht, und je eines mit 0, 5 ml einer Staupevirussuspension intramuskulär vacciniert. Zur Impfung wurde wieder lyophilisiertes Staupevirus des bei den beiden vorausgegangenen Versuchen verwendeten Impfvirus der 65. Passage verwendet. Am 4. Tag nach der Impfung zeigte einer von drei Hunden einen kurzen Temperaturanstieg auf 39, 80C ohne anderweitige klinische Symptome. Blutproben wurden am 10., 20., 30. und 40. Tag nach der Impfung von allen Hunden entnommen und das Serum im Virusneutralisationstest am embryonierten Hühnerei auf staupevirusneutralisierende Antikörper (G. A. Baker, H. R. Gorham, R. W. Leader : Amer. J. Vet. Res. 15 Lez S. 102) untersucht. Während die vaccinierten Hunde einen hohen Serumantikörperspiegel gegen Staupe entwickelten, bildeten die unbehandelten Kontrollhunde während eines Beobachtungszeitraumes von 40 Tagen keine Serumantikörper aus, wie aus Tabelle II ersichtlich ist. Diese Versuche zeigen, dass virulente Staupeviren nach rund 50 Passagen in der Gewebekultur unter Erhaltung der antigenen Kapazität bis zu einem solchen Grad apathogen sind, dass durch Impfung mit der erfindungsgemässen Vaccine eine zufriedenstellende Serumimmunität bei Caniden und Musteliden sowie auch eine Infektionsimmunität gegen hochpathogene Virusstämme erzielt wird, ohne dass eine Erkrankung der Impflinge auftritt. Eine Übertragung des Impfvirus von den geimpften auf die Kontrolltiere erfolgte auch dann nicht, wenn letztere während der ganzen Versuchszeit in intimem Kontakt mit den geimpften Tieren waren. <Desc/Clms Page number 5> Tabelle 1 EMI5.1 <tb> <tb> Status <SEP> Hund <SEP> Nr. <SEP> Serumantikörper <SEP> TCND <SEP> * <SEP> der <SEP> Serumantikörper <SEP> Testinfektion <SEP> mit <SEP> aktivem <tb> vor <SEP> der <SEP> Impfung <SEP> gegen <SEP> Staupe <SEP> nach <SEP> der <SEP> Impfung <SEP> Staupevirus <tb> am <SEP> 10. <SEP> Tage <SEP> am <SEP> 20. <SEP> Tage <SEP> <tb> Vaccin. <SEP> 1 <SEP> keine <SEP> über <SEP> 10-2, <SEP> 10-325 <SEP> blieb <SEP> gesund <tb> Vaccin. <SEP> 2 <SEP> keine <SEP> über <SEP> 10-2,0 <SEP> 10-3,5 <SEP> blieb <SEP> gesund <tb> Vaccin. <SEP> 3 <SEP> keine <SEP> über <SEP> 10-2, <SEP> 10-3,5 <SEP> blieb <SEP> gesund <tb> Vaccin. <SEP> 4 <SEP> keine <SEP> über <SEP> 10-2, <SEP> 10-3,2 <SEP> blieb <SEP> gesund <tb> Vaccin. <SEP> 5 <SEP> keine <SEP> über <SEP> 10-2,0 <SEP> über <SEP> 10-2,0 <SEP> blieb <SEP> gesund <tb> Kontrolle <SEP> 6 <SEP> keine <SEP> keine <SEP> keine <SEP> staupekrank <tb> Kontrolle <SEP> 7 <SEP> keine <SEP> keine <SEP> keine <SEP> staupekrank <tb> Kontrolle <SEP> 8 <SEP> keine <SEP> keine <SEP> keine <SEP> staupekrank <tb> * TCND = 50%ige neutralisierende Serum-Verdünnung <Desc/Clms Page number 6> Tabelle 2 EMI6.1 <tb> <tb> Status <SEP> Hunde <SEP> Nr. <SEP> Serumantikörper <SEP> Impfdosis <SEP> Klinischer <SEP> Verlauf <SEP> Nachweis <SEP> von <SEP> staupevirusneutralisierenden <SEP> Serumantikörpern <SEP> <tb> vor <SEP> der <SEP> Impfung <SEP> i. <SEP> m. <SEP> nach <SEP> der <SEP> Impfung <SEP> getestet <SEP> am <SEP> Hühnerei <SEP> am <tb> Fieber <SEP> sonst. <SEP> Symp. <SEP> 10. <SEP> Tg. <SEP> p. <SEP> v. <SEP> 20. <SEP> Tg. <SEP> p. <SEP> v. <SEP> 30. <SEP> Tg. <SEP> p. <SEP> v. <SEP> 40. <SEP> Tg. <SEP> p. <SEP> v. <tb> Vaccin. <SEP> 9955 <SEP> keine <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> ml <SEP> nein <SEP> nein <SEP> 84, <SEP> 495 <SEP> > 210, <SEP> 195 <SEP> > 210, <SEP> 195 <SEP> > 836, <SEP> 417 <tb> Vaccin. <SEP> 9958 <SEP> keine <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> ml <SEP> nein <SEP> nein <SEP> 353, <SEP> 700 <SEP> > 210, <SEP> 195 <SEP> > 210, <SEP> 195 <SEP> > 836, <SEP> 417 <SEP> <tb> Vaccin. <SEP> 9960 <SEP> keine <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> ml <SEP> *) <SEP> nein <SEP> 44, <SEP> 540 <SEP> 23, <SEP> 355 <SEP> > 210, <SEP> 195 <SEP> > 836, <SEP> 417 <tb> Kontrolle <SEP> 9956 <SEP> keine <SEP> nein <SEP> nein <SEP> keine <SEP> keine <SEP> keine <SEP> keine <tb> Kontrolle <SEP> 9959 <SEP> keine <SEP> nein <SEP> nein <SEP> keine <SEP> keine <SEP> keine <SEP> keine <tb> Kontrolle <SEP> 9961 <SEP> keine <SEP> nein <SEP> nein <SEP> keine <SEP> keine <SEP> keine <SEP> keine <tb> *) Am 4. Tag nach der Impfung Temperatur 39,8 C im übrigen Beobachtungszeitraum Temperatur normal.
Claims (1)
- PATENT ANSPRUCH : Verfahren zur Herstellung einer Vaccine gegen tierpathogene Viren durch mindestens 50 aufeinanderfolgende Passagen des Virus in Gewebekultur in vitro unter physiologischen Bedingungen mit nachfolgender Aufarbeitung der virushaitigen Kulturflüssigkeit ils üblicher Weise, dadurch gekennzeichnet, dass man Staupeviren diesen Passagen unterwirft, und dass als Gewebezellen solche aus Organen von Caniden und Musteliden, insbesondere Nierenzellen 6 - 8 Wochen alter Welpen verwendet werden.
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