DE2162013C3 - Tollwut-Lebendimpfstoff, Verfahren zu seiner Herstellung nd seine Verwendung bei der Bekämpfung von Tollwut - Google Patents

Description

Tollwut-Virus wurde bisher außerhalb lebender Tiere vorwiegend in Suspensionen von gemischten Nervengewebe, z. B. in Mäuseembryo- oder Kaninchenembryohirn, gezüchtet. Eine andere Möglichkeit zur Vermehrung von Tollwut-Virus besteht darin, das Virus an befruchtete Hühnereier zu adaptieren. Der sogenannte Flury-Stamm des Tollwut-Virus wird in großem Umfang zur Herstellung von Impfstoffen zur Immunisierung von Hunden gegen Tollwut eingesetzt. Der Flury-Stamm wird isoliert, indem man einen ursprünglichen Straßenvirus auf Küken passagiert. Nach intracerebraler, aufeinanderfolgender Passage in Küken wird er an befruchtete Hühnereier adaptiert. Dieses an befruchtete Hühnereier adaptierte Tollwut-Virus kann Hunden ohne Erzeugung der Tollwutsymptome intramuskulär injiziert werden. Es fördert die Bildung von Antikörpern gegen Tollwut im geimpften Tier. Es gibt den LEP Flury-Impfstoff und den HEP Flury-Impfstoff. LEP bedeutet niedrige Eipassage, HEP hohe Eipassage. Die LEP und HEP Flury-Impfstoffe vermitteln nur beim Hund bzw. Hund, Katze und Rind einen wirksamen Schutz, wenn sie prophylaktisch eingesetzt werden. Der HEP Flury-Impfstoff ist beim Wiesel und der langschwänzigen Waldmaus pathogen. Beim Fuchs führt er nicht zu einer belastungsfähigen Immunität.

Der ERA-Stamm des Tollwut-Virus ist ein fixierter Virusstamm, der ursprünglich aus einem tollwütigen Hund isoliert wurde und seitdem in Mäusehirn und Hamsternierengewebe (Fenje, Can. J. Microbiol., Bd. 6 [1960 S. 479], in befruchteten Hühnereiern und in Schweinenierengewebekulturen (Abelseth, Can. Vet.

Jour., Bd. 5 [1964], S. 84 und 279) gezüchtet wird. Das abgeschwächte Tollwut-Virus, das durch aufeinander folgende Passagen in Schweinenierengewebekulturen gezüchtet wurde, wurde als der ERA-Stamm bezeichnet und als Impfstoff für die verschiedensten Tierarten verwendet; vgl. Abelseth, Can. Vet Jour., Bd. 5 (1964), S. 279 und Bd. 8 (1967), S. 221. Handelsübliche Impfstoffe wurden mit dem ERA-Stamm unter Verwendung eines auf Schweinenierengewebekulturen passagierten Virus

ίο auf der 34. bis 36. Passage oder weiteren Passagen auf Schweinenierengewebekulturen z. B. bis zu einer Gesamtzahl von 83 oder 150 Passagen hergestellt Bei diesen Impfstoffen können keine Anzeichen einer signifikanten Änderung der Eigenschaften des ERA-Stammes festgestellt werden. Die Impfstoffe des ERA-Stammes erzeugen in den verschiedensten Tieren nur einen verhältnismäßig niedrigen Serumtiter von Tollwut-Antikörpern. Der Antikörper-Titer wird z. B. durch Serum-Virus-Neutralisationsversuche bestimmt.

Für diese Versuche werden Serumverdünnungen zusammen mit einem Standard-Infektionsvirus (CVS) inkubiert. Danach wird das Serum-Virus-Gemisch Mäusen intracerebral injiziert und die höchste Serumverdünnung bestimmt, bei der die Mäuse noch gegen das Infektionsvirus geschützt sind. Bei diesen Versuchen erzeugen zehn- und hundertfache Verdünnungen des ERA-Tollwut-Impfstoffs selten höhere Titer als 1 :25 in Hunden oder Rindern, die 1 bis 2 Monate vorher geimpft wurden. Dieser Impfstoff ist bei Katzen unwirksam.

Die Madin-Darby-Rindernierenzellenlinie ist eine anerkannte Zellenlinie, die mehrere Jahre vermehrt wurde; vgl. Madin and Darby Jr., Proc. Soc. Exptl. Biol. and Med., Bd. 98 (1958), S. 574; Nelson-Rees, J. National Cancer Inst, Bd. 43 (1964), S. 347; Melson-Rees et al., Chromosoma Berlin, Bd. 18 (1966), S. 70, sowie Kata und Gillespie, The Cornell Veterinary Journal, Bd. 58 (1968), S. 217. Die Madin-Darby-Rindernierenzellenlinie kann längere Zeit gelagert werden, z. B. durch Einfrieren mit flüssigem Stickstoff. Zellen für die Viruszüchtung können nach bekannten Methoden vermehrt und gelagert und sie können in bekannten Erhaltungsmedien vermehrt werden, wie Eagle's Medium, Medium 199, Earle's Lactalbumin. Diese Erhaltungsmedien können durch Tierserum, wie fötales Rinderserum, ergänzt werden. Die Zellenlinie kann auch mit Antibiotica, wie Streptomycin, Aureomycin, Kanamycin, Polymyxin B oder Amphotericin B, oder mit anderen Substanzen behandelt werden, um ihre Verunreinigung mit Begleitstoffen zu verhindern; vgl. Johnson et al., Applied Microbiol., Bd. 15 (1967), S. 209; Gori et al.. Proc. Soc. Exptl. Biol. and Med., Bd. 117 (1964), S. 918; Polloch et al.; Proc. Soc. Exptl. Microbiol. and Med., Bd. 112 (1963), S. 176; Hayflick, Texas Reports Biol. and Med., Bd. 23 (1965), S. 285.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, aus dem über Schweinenierenzellen adaptierten Tollwutvirus des ERA-Stammes ein modifiziertes Virus zu schaffen, das in Form eines vermehrungsfähigen Impfstammes, verarbeitet zum Lebendimpfstoff, prophylaktisch an Hunde, Rinder und Katzen appliziert werden kann und einen voll wirksamen Impfschutz vermittelt. Diese Aufgaben werden gemäß den Patentansprüchen gelöst.

Die nicht-primären Rindernierenzellen aus der Madin-Darby-kontinuierlichen Rindernierenzellenlinie sind Zellen einer Zellenlinie, die ihrer Geschichte nach aus primären Rindernierengewebe stammen. Diese Zellenlinie wurde in vitro durch eine oder mehrere

aufeinanderfolgende Passagen vermehrt, so daß die verwendeten Zellen eine oder mehrere Passagen von den Primärzellen entfernt sind.

Es ist überraschend, daß beim Austausch von Schweinenierenzellen gegen Madin-Darby-Gewebekultür von nicht-primären Rindernierenzellen die Antigenität des ERA-Stammes erhöht wird. Der erfindungsgemäße Tollwut-Lebendimpfstoff hat eine hohe Antigenität bei Hunden, Rindern und sogar Katzen. Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, daß man nicht mit einer primären tierischen Gewebekultur arbeiten muß, sondern eine Gewebekultur einer kontinuierlichen Zellenlinie verwenden kann. Hierdurch werden die Gefahren vermieden, die bei Verwendung primärer Gewebekulturen auftreten können, nämlich daß äußere Verunreinigungen eingeschleppt werden. Der erfindungsgemäße Lebendimpfstoff ist praktisch frei von pathogenen Effekten.

In der Praxis wird das erfindungsgemäße Verfahren so durchgeführt, daß man Tollwutvirus des ERA-Stammes, das zum Wachsen in Schweinenierenzellengewebe adaptiert worden ist, in einer Gewebekultur von Rindernierenzellen einer kontinuierlichen Zellenlinie vermehrt. Der verwendete ERA-Stamm wurde durch Passagen in Mäusehirn, primären Hamsternierenzellen, befruchteten Hühnereiern und in primären Schweinenierenzellen abgeschwächt Vorzugsweise wird ein Inoculum des ERA-Stammes verwendet, der einer genügenden Anzahl von Passagen in primärem Schweinenierengewebe unterworfen wurde, um das Virus abzuschwächen, d. h. das Virus so zu modifizieren, daß eine gute Antikörperreaktion ohne nennenswerte Nebenreaktionen oder Erzeugen der Krankheit erreicht wird.

Als Rindernierengewebekultur wird die Madir-Darby-Rindernierenzellenlinie verwendet. Die Madin-Darby-Rindernierenzellen werden nachstehend abgekürzt mit MDEK-Zellen bezeichnet. Die MDBK-Zellen werden durch Passagen aus der kontinuierlichen Zellenlinie erzeugt und sind zahlreiche Passagen von den primären Zellen entfernt. Für die Virus-Saatkulturen werden vorzugsweise MDBK-Zellen verwendet, die praktisch frei von äußeren Verunreinigungen sind, wie Mikroorganismen, Wildviren, begleitenden Eiweißstoffen und dergl,, wie sie normalerweise bei der Herstellung primärer Zellgewebekulturen angetroffen werden. Die MDBK-Zellen wurden von Verunreinigungen nach geeigneten Reinigungsverfahren befreit, die an vorhergehenden Gewebepassagen in der Geschichte der Zellenlinie durchgeführt wurden. Die Verwendung einer Zellenlinie anstelle primärer Zellen gestattet die Vermehrung von Tollwut-Virus in einer Gewebekultur von Zellen, die ihrer Geschichte nach frei von Verunreinigungen sind. Der Ausdruck »frei von Verunreinigungen« bezieht sich auf die Reinigung der Zelllenlinie nach üblichen Verfahren, wie Behandlung mit Antibiotica oder Antikörpern oder Klonen auf frühen Passagestufen der Geschichte der Zellenlinie, die vor der Herstellung der Gewebekulturen für die Impfstoffproduktion durchgetührt werden. Bei der Vermehrung von Tollwut-Virus in Gewebekulturen, die ihrer Geschichte nach frei von Verunreinigungen sind, ist die Gefahr des Einschleppens von Verunreinigungen mit der Zellenkultur wesentlich geringer als bei der Herstellung von primärem Gewebe. Der in derartigen Zellen erzeugte Tollwut-Impfstoff kann in Nährmedien gebildet werden, die nur geringe Mengen oder keine Antibiotica oder ähnliche Stoffe enthalten. Der nach diesem Verfahren hergestellte Impfstoff ist somit praktisch frei von äußeren Verunreinigungen. Die zur Züchtung von Tollwut-Virus verwendeten MDBK-Zellen müssen ihrer Geschichte nach nicht frei von Verunreinigungen sein. Während der Produktion des Impfstoffes können jedoch geeignete übliche Maßnahmen durchgeführt werden, um Verunreinigungen abzutrennen. Beispielsweise können Antibiotica enthaltende Nährmedien verwendet werden, um Mikroorganismen auszuschalten.

Die Vermehrung des Tollwut-Virus in Rindernierengewebekulturen ist nicht von einer beobachtbaren cytopatischen Wirkung auf die Gewebezellen begleitet. Das Wachstum des Virus wird durch herkömmliche Methoden nachgewiesen, bei denen Reihenverdünnungen der Flüssigkeit aus den Gewebekulturen, die mit dem Virus bebrütet worden sind, Mäusen intracerebral injiziert werden. Der Identitätsnachweis des Virus als Tollwut-Virus wird ebenfalls nach herkömmlichen Methoden geführt, bei denen Reihenverdünnungen der Kulturflüssigkeit mit Tollwut-Antikörpern oder -Antiserum inkubiert wurden, die gegen einen bekannten Tollwut-Virus fixe Stamm hergestellt wurde. Die Gemische von Virus mit Antiserum oder Antikörpern werden Mäusen intracerebral injiziert. Die erfindungsgemäß verwendete MDBK-Gewebekultur wird vorzugsweise dadurch hergestellt, daß man MDBK-Zellen in einem Nähnnedium dispergiert und die erhaltene Dispersion auf eine bestimmte Konzentration verdünnt, z. B. auf einen Wert von 50 000 bis 100 000 oder mehr Zellen pro ml. Zum Verdünnen wird ebenfalls Nährmedium verwendet. Die verdünnte Zellendispersion wird hierauf steril in Glasflaschen oder Röhrchen abgefüllt und bei Temperaturen von etwa 30 bis 37° C solange bebrütet, bis sich ein zusammenfließender einschichtiger Zellrasen auf der Oberfläche des Behälters ausgebildet hat. Sobald dies der Fall ist, kann das Nährmedium dekantiert werden. Die Zellen werden hierauf mit dem Tollwut-Virus beimpft. Zur Vermehrung des Tollwut-Virus nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Nährmedium verwendet, welches das Wachstum der Rindernierenzellen fördert und die Vermehrung des Virus nicht hemmt. Das zum Wachstum der Zellen für die Saatkultur sowie zur Virusvermehrung verwendete Nährmedium kann ein Medium des chemisch definierten Typs sein, das essentielle Aminosäuren, Purine, Kohlenhydrate, Vitamine und anorganische Salze enthält. Es können als chemisch definierte Nährmedien z. B. Eagle's Basalmedium, Medium 199 (Morgan et al., Proc. Soc. Exptl. Biol. and Med., Bd. 73 [1950], S 1) oder Parker and Healy's Synthetic Medium No. 858, oder andere Nährmedien wie Earle's Lactalbumin-Hydrolysat — ergänzt mit 2 bis 10 Prozent tierischem Serum, wie fötalem Rinderserum oder fötalem Lämmerserum — verwendet werden. Außerdem kann das Nährmedium mit Salzpräparaten ergänzt sein, wie Hank's Salzen oder Earle's Salzen, oder mit kleinen Mengen Antibiotica, wie Penicillin, Streptomycin, Kanamycin oder Neomycin. Im allgemeinen wachsen die MDBK-Zellen innerhalb etwa 5 bis 7 Tagen nach dem Bebrüten zu einem zusammenfließenden einschichtigen Zellenrasen zusammen.

Zum Beimpfen der MDBK-Zellen mit dem ERA-Stamm zur Vermehrung des Virus wird der erhaltene Zellenrasen von der Oberfläche des Kulturgefäßes nach üblichen Methoden abgelöst, z. B. durch Behandlung mit einem Enzym, wie Trypsin, oder durch Behandlung mit einem Komplexbildner, wie Äthylendiamintetraessig-

säure. Die erhaltenen dispergierten Saatzellen werden dann mit einem Nährmedium auf eine bestimmte Konzentration verdünnt, vorzugsweise auf 50 000 bis 100 000 oder mehr Zellen pro ml. Die Zellen werden in einem Wachstumsmedium, z.B. der vorstehend beschriebenen Art, bebrütet und bei Temperaturen von etwa 32 bis 37° C wachsen gelassen, bis sich ein zusammenfließender einschichtiger Zellenrasen ausgebildet hat. Danach wird die Nährflüssigkeit von den Zellen dekantiert, und der Zellenrasen wird mit dem Tollwui-Virus beimpft Hierauf werden die Zellen zur Vermehrung des Virus bebrütet

Zum Beimpfen der Zellen mit dem Virus wird der Zellenrasen mit einer Suspension des ERA-Stammes in einem Nährmedium überschichtet Bei diesem Verfahren kann der Zellenrasen mit Suspension des Saatvirus angefeuchtet und in stationärer Stellung eine genügende Zeit gehalten werden, um die Absorption des Virus durch die Zellen zu fördern, bevor ein synthetisches Erhaltungsmedium zugegeben wird, das gegebenenfalls zusätzlich Serum enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Zellenrasen zunächst mit einem synthetischen Nährmedium, wie Eagle's Medium oder Medium 199, gegebenenfalls mit etwa 1 bis 2 Prozent Rinderserum ergänzt, bedeckt. Hierauf wird das Saatvirus in die Kulturbehälter in Form einer wäßrigen Suspension gegeben. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform zum Beimpfen der Gewebekultur mit dem Saatvirus wird eine Suspension des ERA-Stammes in die MDBK-Gewebekulturen gegeben, bevor diese einen Zellenrasen ausgebildet haben. Bei diesem Verfahren kann die Suspension des Saatvirus mit dem Zellwachstumsmedium vermischt werden, oder eine geringe Menge einer Suspension des Saatvirus kann in die Kulturgefäße gegeben werden, unmittelbar nachdem die Gefäße mit MDBK-Saatzellen versetzt wurden. Bei diesem Verfahren werden die Kulturbehälter dann bei Temperaturen von etwa 32 bis 37° C so lange bebrütet, bis sich der Zellrasen in Gegenwart des Virus ausgebildet hat. Zur Gewinnung des Virus und des Impfstoffes kann das durch Passage auf MDBK-Rindernierengewebekulturen vermehrte Virus nach üblichen Methoden geerntet werden. Dies ist im allgemeinen etwa 3 bis etwa 14 Tage nach der Einsaat des Virus möglich. Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird das Nährmedium, das einen Teil des erzeugten Virus enthält, etwa 3 bis 7 Tage nach dem Beimpfen der Gewebekultur mit dem Virus von der Gewebekultur dekantiert. Das Nährmedium kann hierauf durch frisches Nährmedium ersetzt und eine weitere Bebrütung kann eine kurze Zeit durchgeführt werden. Schließlich wird das Virus aus der MDBK-Gewebekultur etwa 7 bis 14 Tage, vorzugsweise etwa 7 bis 11 Tage, nach dem Beimpfen mit dem Virus durch ein übliches Einfrier-Auftau-Verfahren geerntet. Bei dissem Ernteverfahren wird der Inhalt der Kulturgefäße eingefroren und anschließend aufgetaut. Hierdurch reißen die Zellwände, und das Virus wird in Freiheit gesetzt. Die erhaltene Flüssigkeit kann mit anderen Ernteflüssigkeiten vereinigt und anschließend zentrifugiert oder filtriert werden, um die Zelltrümmer abzutrennen. Der erhaltene Tollwut-Lebendimpfstoff kann mit üblichen Stabilisatoren, wie Caseinhydrolysaten, Aminosäure-Zucker-Gemischen oder gepufferten Zuckerlosungen versetzt werden. Zur Bestimmung der Aktivität kann der Impfstoff titriert und zur Bestimmung der Reinheit üblichen serologischen Verfahren unterworfen werden. Gegebenenfalls kann man den Impfstoff bei niedrigen Temperaturen lagern. Er '.vird beispielsweise eingefroren oder gefriergetrocknet und in verschlossenen Behältern aufbewahrt Gegebenenfalls wird der erfindungsgemäße Lebendimpfstoff mit einem Stabilisator versetzt, um einen Abfall des Virustiters bei der Gefriertrocknung und der Lagerung zu verhindern. Danach wird das Gemisch gefriergetrocknet Man erhält ein festes Impfstoff-Präparat, das besser aufbewahrt werden kann als eine gefrorene Flüssigkeit und

ίο das vor der Verwendung wieder mit sterilem destilliertem Wasser oder einer anderen geeigneten Flüssigkeit angemacht werden kann. Der erfindungsgemäße Impfstoff kann natürlich auch als Saatvirus für weitere MDBK-Gewebakultur-Passagen verwendet werden. Im allgemeinen erhält man im erfindungsgemäßen Verfahren einen ausgezeichneten Tollwut-Lebendimpfstoff bereits nach einer einzigen Passage des ERA-Stammes in MDBK-Rindernierengewebekulturen. Weitere Passagen des Virus in dieser Gewebekultur können ebenfalls durchgeführt werden, z. B. bis zu 10, 50 oder 100 oder mehr.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

A) Als Saatvirus wird Lebendvirus des ERA-Stammes verwendet Dieses Virus wurde aus dem ursprünglich isolierten Virus durch eine genügende Anzahl aufeinanderfolgender Passagen in Mäusehirn, primärem Hamsternierengewebe, befruchteten Hühnereiern und primärem Schweinenierengewebe modifiziert, bis dieser ERA-Stamm Hunde gegen Tollwut immunisieren kann, ohne pathologische Effekte in größerem Ausmaß zu erzeugen. Der Saatvirus erzeugt einen Infektionstiter an Mäusen von etwa 10~³·⁴ pro 0,03 ml, wenn er nach dem Verfahren von Abelseth, Can. Vet Jour., Bd. 5 (1964), S. 279, in primärem Schweinenierengewebe vermehrt worden ist. Jeweils 1 ml einer Suspension von MDBK-Zellen in Eagle's Medium, das mit 10 Prozent fötalem Kälberserum ergänzt ist, wird steril in Gewebekulturröhrchen abgefüllt Die Suspension enthält etwa 100 000 Zellen pro ml. Die MDBK-Zellen sind ihrer Geschichte nach frei von Verunreinigungen und werden der 203. Passage der MDBK-Zellenmedien entnommen. Die Gewebekulturröhrchen werden mit 0,2 ml des auf Schweinenierengewebe vermehrten ERA-Stammes mit einem Titer von etwa 10 -³·⁴ pro 0,03 ml unmittelbar nach der Einsaat der Zellensuspension beimpft. Die Kulturröhrchen werden in stationärer Stellung drei Tage bei 35⁰C bebrütet, bis sich ein zusammenfließender einschichtiger Zellenrasen ausgebildet hat. Dann wird das Nährmedium dekantiert und durch ein Erhaltungsmedium ersetzt, das aus Eagle's Basalmedium mit 2 Prozent fötalem Kälberserum besteht. Die Kulturröhrchen werden hierauf in einer Rollertrommel langsam weitere vier Tage bei 35° C gerollt. Am siebten Tage nach der Beimpfung der Gewebekultur mit dem Virus wird die Kulturbrühe eingefroren und auftauen gelassen. Hierdurch werden die Zellwände zerstört und das intrazelluläre Virus in Freiheit gesetzt. Das erhaltene Gemisch wird von den Zelltrümmern durch Zentrifugieren befreit. Ein Teil des Überstands des zentrifugierten Gemisches wird als Inoculum für weitere frische Kulturröhrchen mit MDBK-Zellen verwendet. Ein weiterer Teil der überstehenden Flüssigkeit wird titriert, indem man ihn Mäusen intracerebral injiziert. Der Titer ist größer als ΙΟ"⁴·⁵pro0,03 ml.
b) Das Verfahren von A wird für eine Reihe von

aufeinanderfolgenden Passagen in der MDBK-Gewebekultur unter Verwendung von 0,2 ml der geernteten flüssigen Virussuspension der vorhergehenden Passagen als Inoculum für die nachfolgende Passage wiederholt. In jeder dieser Passagen läßt man die MDBK-Zellen wachsen, bis sie einen zusammenfließenden einschichtigen Zellenrasen gebildet haben, bevor sie mit dem Saatvirus infiziert werden. Bei diesem Verfahren wird das Nährmedium dekantiert, sobald sich der Zellrasen gebildet hat, und jedem Kulturröhrchen ι ο werden etwa 2 ml des Erhaltungsmediums aus Eagle's Basalmedium, ergänzt mit 2 Prozent fötalem Kälberserum, unmittelbar vor der Zugabe von 0,2 ml des Virusinoculums zugegeben. Die beimpften Röhrchen werden hierauf in der Rollertrommel bei 35° C bebrütet. in Zeitabständen von 7 bis 11 Tagen nach der Beimpfung wird das Virus geerntet. Bei diesem Verfahren werden Virustiter von mehr als ΙΟ-⁴·⁵ pro 0,03 ml bei jeder Passage erhalten. Nach drei derartigen zusätzlichen MDBK-Gewebepassagen hat die geerntete Flüssigkeit einen Titer von mehr als ΙΟ-⁶·⁴. Sie besitzt einen Neutralisationsindex von 6300, bestimmt durch intracerebrale Injektion in Mäuse unter Verwendung von Tollwut-Antiserum vom Kaninchen, das gegen den Stamm 980 des fixierten Tollwut-Virus hergestellt wurde. Nach sechs weiteren derartigen Passagen oder insgesamt sieben Passagen in MDBK-Gewebekulturen hat die überstehende Flüssigkeit der Kulturbrühe nach dem Einfrieren und Auftauen und Abtrennen der Zelltrümmer einen Titer von 10-⁵·⁴ pro 0,03 ml. Diese Passagezahl stellt einen Verdünnungsfaktor von 10-¹²·⁴ des ursprünglich eingesetzten ERA-Stammes dar.

Beispiel 2

Der ERA-Stamm des Tollwut-Virus wird auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise in MDBK-Zellgewebekultur insgesamt vier aufeinanderfolgende Passagen unterworfen. Die Kulturflüssigkeit aus der vierten Passage mit einem Virustiter von ΙΟ*⁶·⁴ wird als Saatvirus zur Herstellung eines Impfstoffes verwendet Für dieses Verfahren werden als Saatzellen MDBK-Zellen verwendet, die ihrer Geschichte nach frei von Verunreinigungen sind und der 210. Passage der MDBK-Zellenlinie entstammen. Die MD3K-Zellen werden gemäß Beispiel 1 eingesät Die Zellen werden in

1 Liter fassende Glasflaschen eingesät und fünf Tage bei 35°C bebrütet Dann hat sich ein zusammenfließender einschichtiger Zellenrasen gebildet Das Erhaltungsmedium wird dekantiert und die Saatvirusflüssigkeit zehnfach mit dem Erhaltungsmedium verdünnt und auf den Zellenrasen in einer Menge von 10 ml pro Flasche gegeben. Bei diesem Beimpfungsverfahren wird die Saatvirusverdünnung über den Zellenrasen gegossen, und die Kulturflasche wird in stationärer Stellung etwa 1 bis 2 Stunden bei einer Temperatur von 32 bis 37° C gehalten, damit das Inoculum den Zellrasen bedeckt Nach Beendigung dieser Adsorptionsperiode wird jede Flasche mit 90 ml Eagle's Basalmedium versetzt das mit

2 Prozent fötalem Kälberserum ergänzt ist Die Flaschen werden bei 35° C bebrütet Während dieser Zeit werden die Flaschen stationär so gehalten, so daß das Nährmedium den Zellenrasen bedeckt

Am zehnten Tag nach der Bebrütung wird die Kulturbrühe eingefroren und auftauen gelassen. Zelltrümmer werden abzentrifugiert Die überstehende Kulturflüssigkeit wird vereinigt und mit einem Lactose-Glutamat-Stabilisator versetzt Der Stabilisator enthält 10 Gewichtsteile Lactose und 1 Gewichtsteil Monokaliumglutamat in 100 Gewichtsteilen Phosphatpuffer. Die Ernteflüssigkeit und der Stabilisator werden in einem Volumenverhältnis von 5 Volumteilen Stabilisator zu 95 Volumteilen Ernteflüssigkeit vereinigt. Der erhaltene Impfstoff wird durch intracerebrale Injektion in Mäuse titriert. Der Titer beträgt etwa IO-⁵·³ pro 0,03 ml. Getrennte Anteile des erhaltenen Impfstoffes werden auf Temperaturen von —70° C oder darunter eingefroren. Andere Anteile werden gefriergetrocknet und in sterilen Behältern aufbewahrt. Weitere Anteile werden unmittelbar als Impfstoff verwendet.

Die folgenden Beispiele erläutern die Verwendung des erfindungsgemäßen Lebendimpfstoffes bei der prophylaktischen Bekämpfung von Tollwut.

Beispiel 3

Der gemäß Beispiel 2 hergestellte Impfstoff wird einer Gruppe von Katzen verabfolgt, die vor dem Impfen durch herkömmliche serologische Methoden sich als frei von Tollwut-Antikörpern erweisen haben. Bei der Impfung wird das Produkt von Beispiel 2 in einer Dosis von 1 ml jeder Katze intramuskulär injiziert Zwei Wochen nach der Impfung haben die Katzen einen Tollwut-Antikörpertiter entwickelt, der wesentlich größer ist als die Titer, von denen es bekannt ist, daß sie die Tiere gegen eine Infektion des Straßenvirus schützen. Der geometrische Mittelwert des Antikörpertiters, der bei den Katzen zwei Wochen nach der Impfung beobachtet wird, ist größer als 1 :121. Ähnlich hohe Antikörperspiegel sind noch fünf Monate nach der Impfung vorhanden. Dies zeigt eine ausgezeichnete Konversionsrate. Die Konversionsrate bedeutet den Prozentsatz der Tiere, die aufgrund der Impfung Antikörper gebildet haben.

Beispiel 4

Mehrere Gruppen von sechs Monate alten Kälbern, A, B, C und D, werden durch Serumneutralisationsverfahren auf die Anwesenheit von Antikörpern gegen Tollwut untersucht Sie besitzen keine erkennbaren Antikörper. Danach wird den Kälbern der Impfstoff von Beispiel 2 oder eine Verdünnung dieses Impfstoffes in einer einzigen Dosis von 2 ml intramuskulär injiziert Kälber der Gruppe A erhalten den unverdünnten Impfstoff, Kälber der Gruppe B eine zehnfache Verdünnung, der Gruppe C eine hundertfache Verdünnung und der Gruppe D eine tausendfache Verdünnung. Zwei Wochen nach der Impfung wird von den Kälbern Serum gewonnen und in Mäusen zur Bestimmung der Antikörpertiter titriert Die Kälber der Gruppe A, B und C haben Antikörper von mehr als 1 :200, 1 :140 bzw. 1 :170, während die Kälber der Gruppe D Antikörpertiter von 1 :67 aufweisen. Vier Wochen nach der Impfung wird nochmals Serum gewonnen. Zu dieser Zeit beträgt der geometrische mittlere Antikörpertiter jeder Gruppe mehr als 1 :120. Die Kälber der Gruppe C haben einen Antikörpertiter von mehr als 1 :230. Keines der Kälber zeigte unerwünschte Reaktionen nach der Impfung. Eine fortwährende Beobachtung über einen Zeitraum von vier Monaten zeigt daß bei allen Kälbern der Antikörperspiegel weit über dem Wert liegt der zum Schutz der Kälber gegen einen virulenten Straßenvirus notwendig ist Bei allen Kälbern traten keine ungünstigen Nebenwirkungen auf.

Beispiel 5

Weitere Versuche mit dem erfindungsgemäß hergestellten Impfstoff werden an Hunden durchgeführt Bei

diesen Versuchen werden vier Gruppen von Hunden A, B, C und D verwendet, bei denen durch Serumneutralisationsverfahren an Mäusen festgestellt wurde, daß sie keine erkennbaren Antikörper gegen Tollwut besitzen. Hierauf wird den Hunden intramuskulär 1 ml des Impfstoffs von Beispiel 2 oder eine Verdünnung dieses Impfstoffes gegeben. Die Hunde der Gruppe A erhalten den unverdünnten Impfstoff, der Gruppe B eine zehnfache Verdünnung, der Gruppe C eine hundertfache Verdünnung und der Gruppe D eine tausendfache Verdünnung. Zwei Wochen nach dem Impfen wird den Hunden Blut entnommen und der Antikörperspiegel im Serum bestimmt. Der bei jedem Hund beobachtete Antikörperspiegel ist vergleichbar oder größer als der Spiegel, der ausreicht, um Hunde gegen das Straßenvi-

rus zu schützen. Der geometrische mittlere Antikörpertiter in den Hunden der Gruppe A und in den Hunden der Gruppe D ist größer als 1 :200. Vier Wochen nach der Impfung wird erneut Serum gewonnen und auf seinen Antikörpertiter untersucht. Der geometrische mittlere Antikörpertiter bei sämtlichen Gruppen ist größer als 1 :160. Zu keiner Zeit werden ungünstige Nebenwirkungen beobachtet. Vier Monate nach der Impfung gewonnene Serumproben werden auf ihren Antikörpertiter gegen Tollwut untersucht. Der Titer ist ausreichend hoch, um die Tiere gegen das Straßenvirus zu schützen. Bei den Hunden der Gruppe A und D beträgt der geometrische mittlere Antikörpertiter 1 : 140 bzw. 1 : 151.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Tollwut-Lebendimpfstoff aus dem über Schweinenierenzellen adaptierten Tollwutvirus des ERA-Stammes, erhältlich durch

(a) Oberimpfen des adaptierten Virus in Madin-Darby-Gewebekultur von nicht-primären Rindernierenzellen, die einer kontinuierlichen Rindernierenzellenlinie entstammen,

(b) mehrmaliges Passagieren in dieser Gewebekultur in Gegenwart von Gewebekulturnährmedien und

(c) Aufarbeiten der aus der letzten Passage nach Einfrieren und Auftauen erhaltene intrazellulären Viren zu einem Impfstoff, gegebenenfalls in Gegenwart von Stabilisatoren und gegebenenfalls Gefriertrocknen.

2. Verfahren zum Herstellen des Tollwut-Lebendimpfstoffes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) über Schneinenierenzellen adaptiertes Tollwutvirus des ERA-Stammes in Madin-Darby-Gewebekultur von nicht-primären Rindernierenzellen, die einer kontinuierlichen Rindernierenzellenlinie entstammen, überimpft,

(b) darin in Gegenwart von Gewebekulturnährmedien mehrmals passagiert und

(c) die aus der letzten Passage nach Einfrieren und Auftauen erhaltenen intrazellulären Viren zu einem Impfstoff aufarbeitet, gegebenenfalls in Gegenwart von Stabilisatoren, und gegebenenfalls gefriergetrocknet.