DE2265620C2

DE2265620C2 - Mittel zur passiven Immunisierung gegen die toxischen Effekte von Infektionen durch Elastase bildende Bakterien und Verfahren zur Herstellung desselben

Info

Publication number: DE2265620C2
Application number: DE19722265620
Authority: DE
Inventors: John William Malden Bridge N.Y. Fenton; Kent Devore Miami Fla. Miller; Thelma Ferryall Altamont N.Y. Muraschi; Victor Nathaniel Albany N.Y. Tompkins
Original assignee: Research Corp
Current assignee: Research Corp
Priority date: 1972-04-24
Filing date: 1972-04-24
Publication date: 1982-07-29

Description

Die Erfindung betrifft ein Mittel zur passiven Immunisierung gegen die toxischen Wirkungen von Infektionen durch Elastase bildende Bakterien und Verfahren zur Herstellung desselben.

Die Bedeutung von Elastase bildenden Bakterien als Pathogen bei einer Vielzahl von Infektionen ist im Laufe der Jahre erheblich gestiegen. Besondere Bedeutung hat das zunehmende Auftreten von Pseudomonas-Infektion bei Leukämie-Patienten oder im Anschluß an schwere Verletzungen oder Verbrennungen, wobei der natürliche Schutzmechanismus gegen bakterielle Infektion gestört ist Pseudomonas-Infektion ist in solchen Fällen eine schwere Komplikation, da sie einen durch ihre Elastase indzierten nekrotisierenden Effekt auf Gefäß- und Bindegewebe hat

Im Ganzen gesehen sind Antibiotika gegen manifeste Pseudomonas-Infektion unwirksam. Vaccine sind hergestellt worden, jedoch infolge ihrer Ableitung von somatischen Antigenen von geringem Wert gegen andere Stämme des gleichen Organismus. Außerdem enthalten solche Vaccine äußerliches Zellmaterial, welches allergenische Reaktionen induzieren kann, und Proteasen vom Organismus können die Abwehrmechanismen des Empfängers zerstören, falls sie nicht neutralisiert sind.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, verbesserte Immunseren zur passiven Immunisierung gegen die toxischen Wirkungen einer Infektion durch elastasebil dende Bakterien sowie Verfahren zu deren Herstellung zu schaffen.

Es wurde gefunden, daß die toxischen Wirkungen einer Infektion durch elastasebildende Bakterien, wie Pseudomonas, durch Immunisieren geeigneter Tiere gegen bakterielle Elastase unter Verwendung von bakterieller Elastase als Antigen auf ein Mindestmaß verringert werden können.

Die gestellte Aufgabe wird daher gelöst durch ein Mittel zur parenteralen passiven Immunisierung gegen die toxischen Wirkungen einer Infektion durch elastasebildende Bakterien, das erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet ist, daß es als eine Immunserumzubereitung Antikörper gegen Bakterienelastase gegebenenfalls mit einem Adiuvans, enthält

Ein Verfahren zur Herstellung desselben ist Gegenstand der Unteransprüche 2 und 3.

Das erfindungsgemäße Mittel wird hergestellt, indem man einem geeigneten Tier eine gereinigte Bakterienelastase als Antigen in einer genügenden Menge parenteral verabreicht, um im Tier Antikörperbildung hervorzurufen, und das diese Antikörper enthaltende Immunserum gewinnt

Zur passiven Immunisierung zur Verringerung der toxischen Wirkungen einer Infektion durch elastasebil dende Bakterien wird das erfindungsgemäße Mittel, nämlich Antikörper gegen Bakterienelastase enthaltendes Immunsenjm, parenteral den geeigneten tierischen Lebewesen verabreicht Die Erfindung wird erläutert durch die folgende Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen. Die Beschreibung bezieht sich besonders auf Pseudomonas-Organismen, jedoch dienen die erfindungsgemäßen Mittel auch zur Immunisierung geeigneter Tiere gegen die toxischen Wirkungen von Infektionen durch andere elastasebildende Organismen.

Die meisten, wenn nicht alle virulenten Stämme von Pseudomonas aeruginosa bilden eine Protease, die elastolytische Aktivität zeigt Das als Elastase bezeichnete Enzym ist spezifisch und von Stamm zu Stamm

so sehr wenig verschieden. Zwar treten geringere Species-Unterschiede bei der Elastase auf, jedoch findet sich im Genus Kreuz-Antigenität als gemeinsames Band.

Die meisten Bakterienvaccine, einschließlich polyvalenter Vaccine, sind von somatischen Antigenen abgeleitet und daher von geringem Wert gegen Stämme des Organismus, die nicht in die Vaccinherstellung eingeschlossen wurden. Im Gegensatz zu den bisher üblichen Vaccinen ist das beim erfindungsgemäßen Verfahren erzeugte Antigen von stamm- und species spezifischen somatischen Antigenen frei und unabhän gig. Durch Anwendung der erfindungsgemäßen Mittel können also darauf ansprechende Tiere nicht nur gegen bestimmte elastasebildende Bakterien sondern gegen die toxischen Wirkungen der Elastase eis solche immunisiert werden. P. aeruginosa-Elastase kann nach der Methode von Morihara u. a. Journal of Biological Chemistry, Band 240, Seite 3295 (1965) hergestellt und gereinigt werden. Wie von Johnson u. a. in Canadian

Journal of Microbiology, Band 13, Seite 711 (1967) berichtet, werden bessere Ausbeuten an Elastase erhalten, wenn der Orgunismus auf einem Agarmedium kultiviert und die Elastase aus dem Agar extrahiert wird. Es kann nicht stark genug betont werden, daß die für Zwecke der Erfindung benutzte Elastase sorgfältig gereinigt sein muß.

Nach Prüfung zahlreicher Abwandlungen ist die beste erfindungsgemäße Methode zur Isolation und Reinigung von Elastase die Folgende: Impfkulturen von bekannten Elastase erzeugenden Stämmen von Pseudomonas aeruginosa werden 12 Stunden in Rindei bouillon oder einem anderen flüssigen Nährmedium gezüchtet, und diese Kulturen werden zum Impfen von fester Tryptase (Trypticase) benutzt Nach 18 bis 24 Stunden Brüten bei 30⁰C werden die an der Oberfläche gewachsenen Zellen geerntet, in 0,15M KCl suspendiert, mit Glasperlen geschüttelt, und die Zellreste werden abzentrifugiert Die rohe Elastase wirü durch Zugabe von vier Volumen kaltem Ethanol gefällt Nach 12 Stunden Aufbewahrung unter Kühlung auf 5⁰C wird das gefällte Material durch Zentrifugieren bei hoher Geschwindigkeit abgetrennt und in einem Volumen Wasser gleich einem Zehntel des ursprünglichen Zellextrakvolumens gelöst. Das lösliche Material wird gegen 0,002 M Phosphatpuffer von pH 7,5 dialysiert und dann auf zuvor mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gesetzte Säulen von Diethylaminoethylcellulose aufgebracht. Die Säulen werden bei 5° C mit linearen Salzgradienten entwickelt, die aus dem obigen Gleichgewichtspuffer und einem gleichen Volumnen von 0,03 M Phosphatpuffer ebenfalls von pH 7,5 hergestellt sind. Die unter Verwendung dieses Ionenaustausch-Chromatografieverfahrsns erhaltene Elastase erfüllt gewöhnlich die immunochemischen und physiochemischen Reinheitsbedingungen. Das Verfahren kann wiederholt werden, falls erforderlich.

Die gereinigte Elastase wird in physiologischer oder gepufferter Salzlösung in einer Konzentration von etwa 1 mg Elastase pro ml Salzlösung suspendiert Die Suspension hat eine spektrophotometrische optische Dichte von 2,8 bei 420 mu. Die Vorratslösung wid dann in einer Verdünnungsreihe auf die gewünschten Testkonzentrationen verdünnt

Ein Milliliter der verdünnten Suspension, welche Freund's vollständige Adjuvans enthält, wird intraperitoneal in einer Dosis oder wiederholten Dosen Laboratoriumsmäusen, die etwa 13 bis 15 g wiegen, verabreicht 11 oder 12 Tage später werden die dann etwa 22 bis 25 g wiegenden Mäuse durch intraperitonea-Ie Verabreichung einer einen virulenten Stamm von P. aeruginosa enthaltenden Suspension infiziert (challenged), der durch Züchten des Organismus in einer RinderbouiJJon-Nährlösung während etwa 4 bis 5 Stunden und Verdünnen in einer Verdünnungsreihe mit 4% Magenschleim (gastric mucin) hergestellt wurde. Wenn der Ύοή eintritt, ist das gewöhnlich innerhalb 48 Stunden nach der Infektion der Fall, und es wird gezeigt, daß er durch die Infektion mit dem infizierenden Organismus verursacht ist.

Wie zu erwarten wird die Immunität durch Verabreichung wiederholter Dosen der Antigen enthaltenden Suspension erhöht. Die Ergebnisse, die bei Tests des Schutzes von Mäusen durch aktive Immunisierung am 4. Tag nach der Infektion erhalten wurden, sind in der folgenden Tabelle angegeben.

Tag der	Tag der	Verdün	Überlebensrate bei Injektion	10"'	ΙΟ"⁷	Überlebensraten nicht i	mmunisierter	ΙΟ"⁷	ΙΟ"⁸	ΙΟ"⁹
Immuni	Infektion	nung des	von Kulturverdünnungen	8/10	7/10	Kontrolltiere bei Injektion von	5/10	3/10	7/10
sierung		Immuno		7/10	9/10	Kulturverdünnungen
		gens	ΙΟ"⁵	7/10	10/10	10"'
1	11	io~²	6/10	10/10	10/10	0/10
		10"⁴	5/10	10/10	10/10		3/10	3/10	1/10
		10"'	6/10	9/10	8/9
		10"⁸	9/10	10/10	9/10
1&8	18	io-²	10/10	10/10	10/10	1/10
		10"⁴	8/10	6/10	9/10		0/10	0/10	0/10
		IO"⁶	7/10	8/10	8/10
		io-^s	9/10	6/10	7/10
1&8	20	10-³	8/9	6/10	6/10	0/10
		10"'	4/10	9/10	8/10		2/10	7/10	7/10
		ΙΟ"»	7/10	6/10	4/10
		10"¹²	2/10	9/10	7/10
1	11	10"'	6/9	9/10	10/10	2/10	3/10	0/10	6/10
		10-³	2/10	8/10	9/10
		10-⁵	6/10	8/10	10/10
1&8	12	IO"⁶	9/10	10/10	10/10	1/10
		10~⁸	8/9
		_lo-io	6/10
		IO¹²	7/10

	5	22 65	620	10"*	1	10"⁷	6
				5/10		7/10
Fortsetzung	Verdün			8/10	7/10	Uberlebensralen nicht immunisierter
Tag der Tag der	nung des	Überlebensrate bei Injektion	2/10	8/10	Konlrolltiere bei Injektion von
lmmuni- Infektion	Immunn-	von Kulturverdünnunger	5/9	6/10	Kulturverdünnungen
sierung	gens		6/10	10/10	10"'' \|{Γ⁷ Hl"⁸ ίο"
	ίο-³	10"⁵	10/10	9/9	0/9 0/9 0/10 3/10
1&8 10	ίο-*	6/9	10/10	10/10
	ΙΟ"⁹	5/9	9/9	10/10
	ΙΟ"¹²	2/9
	10"³	2/10	0/10 5/10 0/10 4/10
1&7 11	10"⁶	7/10
	ΙΟ"⁹	6/10
	ΙΟ"¹²	7/10
		8/10

In allen Versuchsreihen, außer der zuletzt aufgeführten, war die Ekstase erhalten von P. aeruginosa Hab's-Typ 0 :6-Stamm 332—1369. In der letzten Reihe war die Elastase erhalten von Hab's-Typ 0 :10-Stamm B 319. Der Infektionsorganismus war in der ersten, zweiten, dritten und letzten Reihe der homologe Stamm 332, in der vierten und fünften Reihe war der Infektionsorganismus Hab's Typ 0 :10-Stamm 319, in der vorletzten Reihe war der Infektionsorganismus Hab's-Typ 0 :2-Stamm 112. Die beiden letzten Stämme sind besonders virulente Stämme, die kürzlich von schwerkranken Patienten isoliert wurden.

Immunserum wurde hergestellt, indem man Kaninchen intramuskulär 1 ml einer Adjuvans enthaltenden 1/1280 Verdünnung von Ekstase von P. aeruginosa Hab's-Typ O:6-Stamm 332—1369 injizierte. Diese Dosis wurde 3 Wochen nach der ersten Impfung wiederholt, und Booster-Injektionen mit einer Verdünnung von 1/2560 wurden jede Woche danach gegeben. Es wurden Blutproben entnommen und Serum hergestellt und auf seine Wirkung bei der passiven Immunisierung von Mäusen gegen Infektion geprüft, wie oben beschrieben.

Bei 18 Stunden Infektion mit dem homologen Stamm schützen 0,5 ml des Kaninchenserums bei einer Verdünnung von 1/320 die infizierten Mäuse gegen 100 χ Minimum-Lethaldosis. Die gleiche Menge Serum mit einer Verdünnung von 1/80 schützte die infizierten Mäuse gegen 1000 χ Minimum-Lethaldosis. Bei Infektion mit einem Stamm von heterologem Serumtyp, schützten 0,5 ml des Kaninchenserums bei einer Verdünnung von 1/20 die infizierten Mäuse gegen eine 100 χ Minimum Lethaldosis. Die gleiche Menge von 1/40 verdünntem Serum bot Schutz gegen eine 10 χ Mindestiethaldosis des infizierenden Organismus.

Die Immunogen enthaltende Suspension muß dem als Quelle für Immunserum eingesetzten Tier parenteral verabreicht werden. Die Suspension enthält gewöhnlich ein übliches Adjuvans, wie Freund's vollständiges Adjuvans, um die Antikörperbildung zu fördern. Die Anwendung in der Praxis würde wahrscheinlich durch subkutane oder intramuskuläre Injektion erfolgen.

Claims

Patentansprüche:

1. Mittel zur parenteralen passiven Immunisierung von tierischen Lebewesen gegen die toxischen Wirkungen einer Infektion mit Elastase bildenden Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß es als eine Immunserumzubereitung Antikörper gegen Bakterienelastase gegebenenfalls mit einem Adjuvans, enthält

2. Verfahren zur Herstellung eines Mittels nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß einem tierischen Spender gereinigte Bakterienelastase parenteral verabreicht und das Immunserum vom Tier gewonnen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zum Herstellen der Bakterienelastase Impfkulturen von Elastase erzeugenden Stämmen von Pseudomonas 12 Stunden in einem flüssigen Nährmedium gezüchtet werden und mit diesen Kulturen feste Tryptase geimpft wird, nach 18 bis 24 Stunden Brüten bei 30⁰C die oberflächlich gewachsenen Zellen geerntet, in 0,15 M KCl suspendiert, mit Glasperlen geschüttelt und die Zellreste abzentrifugiert werden, rohe Elastase durch Zugabe des vierfachen Volumens von kaltem Ethanol ausgefällt wird, nach 12 Stunden Aufbewahren unter Kühlung auf 5° C das gefällte Material durch Zentrifugieren bei hoher Geschwindigkeit abgetrennt und in einem Volumen Wasser gleich einem Zehntel des ursprünglichen Zellextraktvolumens gelöst und diese Lösung gegen 0,002 M Phosphatpuffer von pH 7,5 dialysiert und dann auf zuvor mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gesetzte Diethylaminoethylcellulosesäulen aufgebracht wird und die Säulen bei 5° C mit linearen Salzgradienten, die aus dem erwähnten Gleichgewichtspuffer und einem gleichen Volumen von 0,03 M Phosphatpuffer von pH 7,5 hergestellt sind, entwickelt und die Elastase dadurch, gegebenenfalls nach Wiederholung des Reinigungsverfahrens, rein gewonnen wird.