DE2613943A1 - Verfahren zur herstellung von vaccinen auf ribonucleinsaeurebasis - Google Patents

Verfahren zur herstellung von vaccinen auf ribonucleinsaeurebasis

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Description

PATENTANWÄLTE
Dr-Ing. Wolff H.Bartels
Dipl.-Chem. Dr Brandes Dr.-lng.Held Dipl.-Phys. Wolff
Reg. Nr. 124 960
PIERRE FABRE S.A. Paris, Frankreich
8 München 22,ThierschstraBe 8
Tel.(089)293297 Telex 0523325 (patwo d) Telegrammadresse: wolffpatent, münchen Postscheckkonto Stuttgart 7211 (BLZ 60010070) Deutsche Bank AG114/286 (BLZ 60070070) Bürozeit: 8-12 Uhr, 13-16.30 Uhr außer samstags
30. März 1976 R/dö
Verfahren zur Herstellung von Vaccinen auf Ribonuol einsäur e-
basis
609842/0941
ORIGINAL INSPECTED
Verfahren zur Herstellung von Vaccinen auf Ribonucleinsäure-
basis
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von acellulären Vaccinen auf der Basis von Ribonucleinsäure (RNS), die mit aus Bakterien extrahierten Lipopolysacchariden und Membranpolysacchariden kombiniert werden.
Die bekannten Vaccine sind zwar wirksam, besitzen jedoch eine Antigenaktivität, die variiert je nach verwendeten Mikroorganismen und Typ der Zubereitung, nämlich mit abgetöteten, abgeschwächten oder gelösten, als Krankheitserreger wirkenden Mikroorganismen. In jedem Falle ist die Antigenaktivität dieser bekannten Vaccine eindeutig geringer als diejenige von lebenden Mikroorganismen.
Aufgabe der Erfindung ist es, die aufgezeigten Nachteile zu beheben und Vaccine zu schaffen, die im Laufe ihrer Herstellung keinen Verlust an Antigenaktivität erleiden.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß die Antigenaktivität bestimmter Mikroorganismen in der RNS lokalisiert ist und daß es möglich ist, acelluläre Vaccine auf der Basis von RNS herzustellen (vgl. insbesondere "Infect, and Immunity", 1, 574-82, 1970). Ein Hauptproblem dieses Vaccintyps ist jedoch die vergleichsweise labile Natur der RNS, weshalb es wichtig erschien, die RNS mit einem Huf smittel zu kombinieren, das die Stabilisierung der RNS sicherstellt und die Aufrechterhai tung einer Antigenwirkung bewirkt, die derjenigen von lebenden Zellen vergleichbar ist.
Erfindungsgemäß wird daher ein acelluläres Vaccin geschaffen, das die Ribonucleinsäuren von dem Vaccin entsprechenden Mikroorganismen enthält in Kombination mit Lipopolysacchariden und
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26139 A3
Polysacchariden der Membran, die aus den gleichen Mikroorganismen oder aus anderen Bakterien extrahiert sind, insbesondere aus Bakterien der Gattung Klebsiella, Serratia und
Corynebacterium.
Typische Bakterien, deren Lipopolysaccharide und Polysaccharide in besonders vorteilhafter Weise verwendbar sind, sind z. B. insbesondere die folgenden:
Klebsiella: Klebsiella pneumoniae
Klebsiella rhinoscleromatis
Serratia: Serratia corallina
Serratia indica
Serratia keilensis
Serratia kiliensis
Serratia marsescens Serratia plymuthica
Corynebacterium: Corynebacterium
Corynebacterium Corynebacterium Corynebacterium Corynebacterium Corynebacterium Corynebacterium Corynebacterium Corynebacterium Corynebacterium Corynebacterium Corynebacterium Corynebacterium Corynebacterium Corynebacterium Corynebacterium avidum bovis enzymicum
fascians f1ac cumfaci ens flavidum fusi forme granulosum helvolum hyp e rt rophi c ans insidiosum liquefaciens parvum parvum infectiosum ρ aur ome__t abolum
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Corynebacterium pyogenes
Corynebacterium tumescens Corynebacterium xerosis
Erfindungsgemäß sind in besonders vorteilhafter Weise die folgenden Vaccine herstellbar:
ein Broncho ORL-Vaccin der Zusammensetzung
Ribosomen-RNS von Klebsiella Pneumoniae Ribosomen-RNS von Hemophilus Influenzae Ribosomen-RNS von Streptococcus k,^ Ribosomen-RNS von Pneumococcus Typ II und Membranlipopolysaccharide von Klebsiella;
ein antipyorrhoetisches Vaccin der folgenden Zusammensetzung:
Ribosomen-RNS von Rothia Dentocariousus Ribosomen-RNS von Streptococcusmutante
Salivarius
Ribosomen-RNS von Lactobacillus Casei und Membranlipopolysaccharide von Serratia
Marsescens;
ein Intestinal-Vacein der folgenden Zusammensetzung:
Ribosomen-RNS von Bacterium coli Ribosomen—RNS von Salmonella Paratyphi A Ribosomen-RNS von Salmonella Paratyphi B RiboBomen-RNS von Shigella dysentariae Ribosomen-RNS von Enterococcus und Membranlipopolysaccharide von Serratia
Marsescens.
Diese Vaccine enthalten vorzugsweise 100 bis 200 Gew.-Teile Membranlipopolysaccharide pro 100 Gew.-Teile Gesamt-Ribosomen-RNS.
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In den vorstehend angegebenen Vaccinen sind zwar die Membranlipopolysaccharide aus einem einzigen Bakterientyp extrahiert , doch ist es auch möglich, Membranlipopolysaccharide zu verwenden, die aus mehreren Typen von Bakterien extrahiert sind.
Mit der Formulierung "Mikroorganismen, die den Vaccinen entsprechen11 soll zum Ausdruck gebracht werden, daß die gleichen Mikroorganismen wie zur Herstellung in einem Vaccin aus abgetöteten, abgeschwächten oder gelösten Mikroorganismen des Standes der Technik verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von acellulären Vaccinen auf RNS-Basis ist somit dadurch charakterisiert, daß man die Ribonucleinsäuren des oder der den Vaccinen entsprechenden Mikroorganismen mit den Lipopolysacchariden und den Polysacchariden, die aus Membranen der gleichen Mikroorganismen oder anderer Bakterien extrahiert sind, vermischt.
Dieses Verfahren ist insbesondere zur Herstellung der angegebenen acellulären Vaccine bestimmt, und insbesondere zur Herstellung der oben aufgeführten Broncho ORL-, Antipyorrhoe- und Intestinalvaccine.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Membranlipopolysaccharide und -polysaccharide aus einer die Membranen enthaltenden, wäßrigen Suspension extrahiert durch Behandlung der wäßrigen Suspension mit Phenol, wobei diese Operation mehrere Male wiederholt werden kann, bevor die dabei erhaltene wäßrige Lösung, welche die Membranlipopolysaccharide und -polysaccharide enthält, isoliert wird. Die letzten Spuren von Phenol werden aus der wäßrigen Phase vorzugsweise durch Dialyse der wäßrigen Lösung gegen fließendes Wasser entfernt. Die Extraktion wird vorzugsweise in der Wärme bei einer Temperatur zwischen etwa 40 und 80 0C, in besonders vorteilhafter Weise bei 65 0C, mit einer 90 #igen Phenollösung durchgeführt.
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Die Membransuspension wird vorzugsweise aus einem homogenen Brei von Mikroorganismen dadurch gewonnen, daß eine erste Zentrifugation bei einer solchen Beschleunigung durchgeführt wird, daß die intakten Zellen und Zellbruchstücke sedimentieren, worauf eine zweite Zentrifugation unter einer Beschleunigung durchgeführt wird, die die Sedimentation von Membranen, nicht jedoch von Ribosomen sicherstellt, wobei in vorteilhafter Weise die erste Sedimentation bei einer Beschleunigung in der Größenordnung von 5OOO bis 10 000 g und die zweite Sedimentation bei einer Beschleunigung von 30 000 bis 50 000 g erfolgt.
Der Bodensatz der zweiten Zentrifugation, der die Membranen enthält, wird sodann in einem wäßrigen Lösungsmittel suspendiert, z. B. in destilliertem Wasser, unter Erzielung der Suspension, die wie angegeben mit Phenol extrahiert wird.
Vorzugsweise wird die Lösung vor der zweiten Zentrifugation mit Desoxyribonuclease behandelt durch 30 Minuten lange Inkubation bei 15 °0·
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird die RNS hergestellt aus einem homogenen wäßrigen Brei von Mikroorganismen, aus dem man durch eine oder mehrere Zentrifugationen die intakten Zellen, die Zellbruchstücke und die Membranen extrahiert, die in der erhaltenen Lösung enthaltenen Ribosomen werden sodann durch Polyäthylenglycol ausgefällt und der erhaltene Niederschlag wird in einer wäßrigen Lösung suspendiert, vorzugsweise in einem 0,01 M-Phosphatpuffer von pH 7,1 bei 4 0O, worauf die Suspension ein oder mehrere Male mit Phenol behandelt und jedes Mal die wäßrige Phase gesammelt und die organische Phase verworfen wird, wobei die wäßrige Phase die RNS enthält. Gemäß einer Abwandlung dieses Verfahrens enthält die organische Extraktionsphase Phenol, Natriumdodecylsulfat und EDTA in Form des Dinatriumsalzes, und vorzugsweise enthält diese Phase 80 $> Phenol, das im Gleichge-
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T-
wicht steht mit dem gleichen Phosphatpuffer, wie er für die Suspension verwendet wird, ferner 0,5 # Natriumdodecylsulfat •und 0,001 M-EDTA.
Die Extraktion wird vorzugsweise in der Wärme bei einer Temperatur zwischen etwa 40 und 70 0C, in besonders vorteilhafter Weise bei etwa 65 0G durchgeführt, und das Abheben der Phasen erfolgt vorzugsweise bei 4 0O. Das restliche Phenol wird aus der wäßrigen Phase mit Hilfe bekannter Techniken entfernt, z. B. durch Extraktion mit Äther. Die RNS wird aus der wäßrigen Lösung durch Ausfällen gewonnen, z. B. mit Hilfe von Äthanol, und im Bedarfsfall wird der restliche Äther zuvor aus der wäßrigen Lösung entfernt, z. B. durch Einleiten eines Inertgases, wie z. B. Stickstoff. Selbstverständlich kann die HNS auch mit Hilfe eines anderen Verfahrens aus den Mikroorganismen extrahiert werden, z. B. nach dem in der angegebenen Druckschrift "Infect, and Immunity", 1, 574-82, 1970, beschriebenen Verfahren. Durch Kombination der auf diese Weise erhaltenen Ribosomen-RNS mit Membranlipopolysacchariden und -polysacchariden, die wie angegeben gewonnen sind, wird ein Vaccin gemäß der Erfindung erhalten.
Werden die Membranlip©polysaccharide und -polysaccharide aus den gleichen Mikroorganismen extrahiert, die auch zur Herstellung der RIiS dienen, wird die Extraktion von Ribosomen-RNS aus dem Mikroorganismenbrei in zwei Stufen durchgeführt, nämlich einer ersten Zentrifugation, die die Sedimentation der intakten Zellen und der Zellbruchstücke ermöglicht, und einer zweiten Zentrifugation, die die Sedimentation der Membranen unter in Lösunglassen der Ribosomen-Ribonucleinsäuren ermöglicht. Gehören die behandelten Mikroorganismen mehreren Typen an, so können sie entweder gemeinsam oder separat behandelt ' werden.
Der homogene Brei aus Mikroorganismen wird ebenso für die Extraktion der RNS als auch der Lipopolysaccharide und der PoIy-
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-ί-
saccharide hergestellt, vorzugsweise aus einer Bakterienkultur, die in einem 0,01 M-Phosphatpuffer von pH 7,1 gewaschen und anschließend in dem gleichen Phosphatpuffer, der 10 IT-MgCl9
λ wird
und 3 x 10 ^ Polyvinylsulfat enthält, aufgenommen^ um die Aktivität endogener Ribonucleasen zu vermindern.
Die auf diese Weise erhaltene Bakteriensuspension wird sodann mit Hilfe einer sogenannten Manton-Gaulin-Vorrichtung unter einem Druck in der Größenordnung von 630 kg/cm zerkleinert oder auch durch Behandlung mit Ultraschall.
Die folgenden Versuche zeigen die Aktivität von erfindungsgemäß erhaltenen Vaccinen und insbesondere der folgenden Vaccine:
Broncho OBL-Vaccin
Ribosomen-RNS von Klebsiella Pneumoniae 35
Ribosomen-RNS von Hemophilus Influenzae 5
Ribosomen-RNS von Streptococcus A12 30
Ribosomen-RNS von Pneumococcus Typ II 30
Membranlipopolysaccharide von Klebsiella 150
Antipyorrhoe-Vaccin
Ribosomen-RNS von Rothia Dentocariosus 33
Ribosomen-RNS von Streptococcenmutante Salivarius 33
Ribosomen-RNS von Lactobacillus Gasei 33
Membran-Lipopolysaccharide von Serratio Marsescens 150
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5-
Intestinal-Vacein
Ribosomen-RNS von Bacterium CoIi. 30
Ribosomen-RNS von Salmonella Paratyphi A 20
Ribesomen-RNS von Salmonella Paratyphi B 20
Ribosomen-RNS von Shigella dysentariae 10
Ribosomen-RNS von Enterococcus 20
Membran-Lipopolysaccharide von Serratia Marsescens 150
Das Versuchstier, Maus oder Kaninchen, wurde mit Hilfe eines der vorstehend angegebenen, erfindungsgemäß erhaltenen Vaccine immunisiert. Die Immunisierung erfolgte bei der Maus durch subcutane Verabreichung einer Injektion von 2, 12 bzw. 24 y Vacein alle zwei Tage.
Wach 45 Tage langer Immunisierung wurden die Injektionen 15>>Ta-r , ge lang eingestellt und es wurde eine erneute Injektion/48 Stunden vor der intracardialen Punktion des Versuchstiers, wobei das Blut entnommen und das Serum untersucht wurde nach der Ouchterlony-Methode und der Immunoelektrodiffusion auf Gesamt-Bakterienantigen, aus dem das Ribosomenantigen extrahiert worden war.
Es wurden 5 Gruppen von jeweils 10 Mäusen verwendet,davon
- eine Vergleichsgruppe von Versuchstieren, die nicht behandelt worden waren,
- eine Gruppe von Versuchstieren, die mit dem Gesamt-Bakterienantigen immunisiert worden waren,
- eine Gruppe von Versuchstieren, die mit dem erfindungsgemäß erhaltenen Vaccin in Dosierungen von 2 ^- immunisiert worden waren,
- eine Gruppe von Versuchstieren, die mit dem erfindungsgemäß erhaltenen Vaccin in Dosierungen von ^2 f immunisiert worden waren, und
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- eine Gruppe von Versuchstieren, die mit dem erfindungsgemäß erhaltenen Vaccin in Dosierungen von 24 Jf immunisiert worden waren.
Nach Ouchterlony enthielten die Seren der Vers^hstiere, die mit Hilfe des erfindungsgemäß erhaltenen Vaccins immunisiert worden waren, alle Antigenfraktionen des Bakteriums unabhängig von der injizierten Dosis, mit der die Tiere das gesamte Antigen erhalten haben.
Nach der Immunoelektrodiffusion war ersichtlich, daß bei den Mäusen, welche mit Hilfe des erfindungsgemäß erhaltenen Vaccins immunisiert worden waren, die Antikörper sehr viel schneller und in höheren Konzentrationen auftraten.
Die VaccinaktMtät dieser Vaccine ist somit höher als diejenige der Bakterien, aus denen sie extrahiert wurden und der Zeitraum bis zum Auftreten von Antikörpern ist kürzer.
Diese Vaccine sind zur Behandlung der selben Infektionskrankheiten "verwendbar, wie die Vaccine anderer entsprechender Typen, die aus den gleichen, abgetöteten, abgeschwächten oder gelösten Mikroorganismen gewonnen wurden.
Zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird im folgenden eine bevorzugte Ausführungsform beschrieben.
Herstellung der Ribosomen-RNS
Die verwendeten Bakterienstämme wurden aus pathologischen Abstrichen isoliert. Diese Mikroorganismen wurden durch Passage durch Laboratoriumstiere, ggf. Mäuse, reaktiviert und in geeigneten Kultivierungsmedien konserviert. Aus den auf diese Weise erhaltenen Stämmen wurden Inokulate hergestellt durch Einimpfen jedes Mikroorganismus in ein flüssiges Nährmedium, das 24 Stunden lang bei 35 0C inkubiert wurde. Dieser Impfstoff
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41-
wurde zum Beimpfen einer Batterie von Permentern verwendet, die zur Vaccinherstellung bestimmt waren. Nach 24 Stunden Kultivierung unter Rühren wurden die Bakterienzellen isoliert durch Durchleiten des Nährmediums durch eine Klärvorrichtung vom Typ Sharpless. Die Zellen wurden sodann mit einem 0,01 M-Phosphatpuffer von pH 7,1 gewaschen, danach in einem 0,01 M-Phosphatpuffer von pH 7,1, der 10"2N-MgGl2 und 3 χ 10~4 <f» Polyvinylsulfat enthielt, aufgenommen. Die Bakteriensuspension wurde sodann zerkleinert durch Durchleiten durch eine Manton-Gaulin-Vorrichtung bei 630 kg/cm (3 Passagen) und 4 0C Diese Zerkleinerung kann auch durch Behandeln der Suspension mit Ultraschall bewirkt werden.
Das auf diese V/eise erhaltene zerkleinerte Zellmaterial oder der Zellbrei wurde 15 Minuten lang bei 2500 UpM bei 4 0C zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 5 /ug/ml Desoxyribonuclease versetzt und 30 Minuten lang bei 15 0C inkubiert. Die Membranen wurden sodann sedimentiert durch 30 Minuten langes Zentrifugieren bei einer Beschleunigung in der Größenordnung von 30 bis 40 000 g bei 4 0C* Die im Überstand enthaltenen Ribosomen wurden ausgefällt durch Zugabe von 100 g/l PoIyäthylenglycol 4000 bei 4 C während einer Zeitspanne von 30 Minuten. Die ausgefällten Ribosomen wurden durch 10 Minuten langes Zentrifugieren bei 10 000 g und 4 0C gesammelt.
Der Zentrifugationsbodensatz wurde suspendiert in 0,01M-Phosphatpuffer von pH 7,1 bei 4 0O. Die Suspension wurde sodann versetzt mit dem gleichen Volumen 80 #Lgem Phenol, das zuvor ins Gleichgewicht gebracht worden war im gleichen Puffer, der jedoch zusätzlich 0,5 $ Natriumdodecylsulfat und 0,001 M-Äthylendiamintetraessigsäure in Form des Dinatriumsalzes enthielt. Das erhaltene Gemisch wurde sodann 10 Minuten lang unter kräftigem Rühren auf 65 0C gebracht und anschließend auf 4 0C abgekühlt. Die wäßrige Phase wurde sodann abgehoben und erneut unter den gleichen Bedingungen mit Phenol extrahiert.
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-4t-
Die dabei erhaltenen beiden neuen Phasen wurden getrennt durch 5 Minuten langes Zentrifugieren bei 10 000 g bei 4 0O. 4/5 der wäßrigen Phase wurden vorsichtig abgehoben und drei Mal mit einem Volumen Äther 3 Minuten lang bei Raumtemperatur extrahiert, um das restliche Phenol zu entfernen.
Der restliche Äther wurde durch Einleiten von Stickstoff verjagt und die RNS wurde durch Zugabe von 2 Volumen 95 folgern Äthanol bei 20 0C während 4 Stunden ausgefällt, worauf die wäßrige Phase auf einen Gehalt von 0,1 M-NaCl eingestellt wurde·
Die erhaltene Suspension wurde 10 Minuten lang bei 10 000 g zentrifugiert und der Bodensatz an RNS wurde in einem 0,01 M-Phosphatpuffer von pH 7,1 bei 4 0C gelcfeb. Auf diese Weise wurde die Ribosomen-RNS erhalten, die zur erfindungsgemäßen Herstellung der Vaccine durch Kombination mit den Membranlipopolysacchariden und -polysacchariden verwendbar ist.
Herstellung der Membranlipopolysaccharide und -polysaccharide
Der zur Herstellung der Membranlipopolysaccharide und -polysaccharide bestimmte homogene Bakterienbrei wurde in gleicher Weise hergestellt wie derjenige, der, wie oben beschrieben, zur Herstellung der Ribosomen-RNS Verwendung findet. Der homogene Zellbrei wurde sodann so wie oben 15 Minuten lang bei 25OO UpM bei 4 0C zentrifugiert· Der Überstand wurde mit 5 /ug/ml Desoxyribonuclease versetzt und 30 Minuten lang bei 15 0O inkubiert. Die Membranen wurden sodann sedimentiert durch Zentrifugieren bei einer Beschleunigung in der Größenordnung von 30 bis 40 000 g bei 4 0C.
Der auf diese Weise erhaltene Bodensatz wurde in destilliertem Wasser von 65 0O suspendiert und danach bei der gleichen Temperatur mit einem gleichen Volumen einer 90 ^igen Phenollösung
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Al-
versetzt.
Es wurde 5 Minuten lang kräftig gerührt und anschließend rasch auf 4 0O abgekühlt. Die beiden Phasen wurden durch Zentrifugieren bei 3000 UpM während 30 Minuten getrennt.
Die wäßrige Phase wurde vorsichtig abgehoben und danach gegen fließendes Wasser bis zur Entfernung des Phenols dialysiert. Das innere Dialysat enthielt die Membranlipopolysaccharide und -polysaccharide, die im Gemisch mit den wie oben beschrieben hergestellten Ribosomen-Ribonucleinsäuren das Vaccin gemäß der Erfindung ergeben.
Die erfindungsgemäß erhaltenen Vaccine sind als Arzneimittel sowohl für die Human- als auch für die Veterinärmedizin verwendbar und können in jeder beliebigen üblichen bekannten Form für Vaccinzubereitungen vorliegen, insbesondere in Form von Trockenaerosolen, injizierbaren lyophilisierten Ampullen, Suppositorien, Tabletten oder gelüberzogenen Kapseln.
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Claims (17)

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von acellulären Vaccinen auf Ribonucleinsäurebasis, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ribonucleinsäure des oder der dem Vaccin entsprechenden Mikroorganismen und aus Bakterien extrahierte Membranlipopolysaccharide und -polysaccharide miteinander vermischt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zwischen 100 und 200 Gew.-Teile Lipopolysaccharide und Polysaccharide pro 100 Gew.-Teile Ribonucleinsäure vermischt.
3. Verfahren nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Lipopolysaccharide und Polysaccharide verwendet, die aus den Membranen von Bakterien extrahiert sind, welche mindestens einer der Gattungen Klebsiella, Serratia oder Corynebacterium angehören.
4· Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß man Lipopolysaccharide und/oder Polysaccharide verwendet, die extrahiert sind aus Membranen der Bakterien
Klebsiella pneumoniae
Klebsiella rhinoscleromatis
Serratia corallina
Serratia indica
Serratia keilensis
Serratia MLiensis
Serratia marsescens
Serratia plymuthica
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-AS-
Corynebacterium avidum
Corynebacterium bovis
Corynebacterium enzymicum
Corynebacterium equi
Corynebacterium fascians
Corynebacterium flaccumfaciens
Corynebacterium flavidum
Corynebacterium fusiforme
Corynebacterium granulosum
Corynebacterium helvolum
Corynebacterium hypertrophicans
Gorynebacterium insidiosum
Corynebacterium liquefaciens
Corynebacterium parvum
Corynebacterium parvum infectiosum Corynebacterium paurometabolum
Corynebacterium pyogenes
Corynebacterium tumescens oder
Corynebacterium xerosis.
5. Verfahren nach. Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Lipopolysaccharide und/oder Polysaccharide verwendet, die aus Membranen von Mikroorganismen extrahiert sind, welche dem Vaccin entsprechen.
6. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß man Lipopolysaccharide und/oder Polysaccharide verwendet, die aus einer wäßrigen Membransuspension extrahiert sind durch Behandlung der Suspension mit Phenol und Abheben der die Lipopolysaccharide und/oder Polysaccharide enthaltenden wäßrigen Phase·
7· Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die wäßrige Suspension und das Phenol bei einer Temperatur zwischen 40 und '80 0C anwendet.
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8. Verfahren nach Ansprüchen 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die die Lipopolysaccharide und/oder Polysaccharide enthaltende wäßrige Phase duidi Dialyse reinigt.
9. Verfahren nach Ansprüchen 6 Ms 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die wäßrige Membransuspension gewinnt durch Zentrifugieren eines homogenen Mikroorganismusbreis bei einer die intakten Zellen und die Zellbruchstücke sedimentierenden Beschleunigung, Entfernung des Zentrifugationsbodensatzes, Zentrifugieren der überstehenden Phase bei einer die Membranen, nicht jedoch die Ribosomen sedimentierenden Beschleunigung und Aufnahme des die Membranen enthaltenden Zentrifugationsbodensatzes in einer wäßrigen Lösung.
10. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismus-Eibonucleinsäure gewinnt durch Extraktion einer wäßrigen Lösung von Ribosomen mit Hilfe einer Phenolphase und Abheben der die Ribonucleinsäure enthaltenden wäßrigen Phase nach der Extraktion.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Phenolphase verwendet, die Fatriumdodecylsulfat und ein Dinatriumsalz von Äthylendiamintetraessigsäure enthält. '
12. Verfahren nach Ansprüchen 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die die Ribonucleinsäure enthaltende wäßrige Phase mit Äthanol ausfällt und die ausgefällte Ribonucleinsäure isoliert.
13· Verfahren nach Ansprüchen 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die wäßrige Ribosomenlösung aus einem homogenen Mikroorganismusbrei gewinnt durch Zentrifugieren des Breis bei einer Beschleunigung zwischen 20 000 und 40 000 g, Entfernung des Zentrifugationskuchens, Ausfällung des Überstan-
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des mit Polyäthylenglycol, Isolierung des Niederschlags und Lösen des Niederschlags in einer wäßrigen Lösung.
14. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 13» dadurch gekennzeichnet, daß man den oder die homogenen Mikroorganismenbreie aus einer Mikroorganismuskultur gewinnt durch Einwirkung eines Phosphatpuffers, der Magnesiumchlorid und Polyvinylsulfat enthält, und Zerkleinerung durch Durchleiten durch eine Manton-G-aulin-Vorrichtung oder durch Behandlung mit Ultraschall.
15. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 14» dadurch gekennzeichnet, daß man die Ribonucleinsäuren aus Klebsiella Pleumoniae, Hemophilus Influenzae, Streptococcus A^p und Pneumococcus Typ II, und die Lipopolysaccharide und Polysaccharide aus Klebsiella extrahiert.
16. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ribonucleinsäuren aus Rothia Dentocariosus, Streptococcusmutante Salivarius und Lactobacillus Casei, und die Lipopolysaccharide und Polysacchsiide aus Serratia Marsescens extrahiert.
17. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 14» dadurch gekennzeichnet, daß man die Ribonucleinsäuren aus Bacterium CoIi, Salmonella Paratyphi A und B, Shigella Dysentariae und Enterococcus, und die Lipopolysaccharide und Polysaccharide aus Serratia Marsescens extrahiert.
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BE839893A (fr) 1976-09-22
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DE2613943C3 (de) 1980-03-06
FR2305990B1 (de) 1980-01-25
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