DE2141901C3 - Steriler Impfstoff, der abgetötete Organismen des genus Fusiformis nodosus enthält - Google Patents

Description

Diese Erfindung betrifft einen sterilen Impfstoff, der abgetötete Organismen des genus Fusiformis nodosus enthält

Ovine KJauenfäuIe ist eine weit verbreitete, anstekktnde Erkrankung, die die epidermen Gewebe des Fußes befällt und durch die synergistische Wirkung der beiden gramnegativen anaeroben Bakterien, Fusiformis nodosus und Fusiformis necrophorus, verursacht wird. Die Erkrankung erfolgt nur, wenn diese beiden Organismen vorhanden sind.

F. necrophorus ist normalerweise im Verdauungstrakt zu finden und wird mit dem Kot ausgeschieden, so daß der Organismus sich gewöhnlich in unmittelbarer Nachbarschaft der Schafsklaue befindet um an der Infektion teilzunehmen. F. nodosus ist andererseits unfähig, unter natürlichen Bedingungen mehr als wenige Tage außerhalb des Klauenfäule-Befalls zu überleben. Die infizierte Klaue ist sein einziger natürlicher Lebensraum, und demgemäß wird häufig F. nodosus als für die Erkrankung spezifisch kausal beschrieben. Die Beseitigung von F. nodosus aus einer Schafherde, die durch Heilung der Klauenfäule oder durch spezifische Zerstörung des Organismus bewirkt werden könnte, würde diese Erkrankung beseitigen.

In den vergangenen Jahren wurde Klauenfäule dadurch bekämpft, daß man die infizierten Tiere isoliert, sie danach durch kräftiges Schälen bzw. Abheben der betroffenen Teile der Klaue und durch äußeres Aufbringen von Desinfektionsmitteln oder Antibiotika behandelt. Neuerdings wurden Versuche unternommen, der Erkrankung bei Schafen durch Impfung gegen F. nodosus und F. necrophorus Einhalt zu gebieten, aber es wurde bisher noch kein erfolgreiches Verfahren für eine wirtschaftliche Kultivierung von F. nodosus in technischem Umfang entwickelt, das ermöglicht, Impfstoff für eine allgemeine Anwendung herzustellen.

Seit 1970 wurde an den Problemen gearbeitet, F. nodosus in Reinkultur zu isolieren (H. Marsh und andere. The Cornell Veterinarian, 60, 309—17, April 1970). Aus Bull. Coun. sei. industr. Res. Aust., Nr. 140 sind die Kulturansprüche des Organismus bekannt. Der Organismus konnte jedoch kaum in flüssigen Medien gezüchtet werden. Der Organismus ist ein strikt anaerobes Bakterium. Die Kultur wird durch eine Atmosphäre gefördert, die 5 bis 10% Kohlendioxid enthält und sogar 80% dieses Gases inhibieren die Kultur nicht. Wenn man eine flüssige Verdauungsbrühe aus Rindermuskelfleisch und Leber verwendet, erhält man nur ein sehr geringes oder insgesamt kein Wachstum, während man bei Zugabc von 10% Pferdeserum ein schwaches Wachstum erhält

Größeren Erfolg hatte man bei Verwendung eines flüssigen Kulturmediums zum Isolieren und Unterkultivieren von F. nodosus bei Verwendung einer Nährlösung, die gemahlene Partikel von Schafsklauen und rohes Trypsin enthielt, wobei man eine Atmosphäre von 10% Kohlendioxid verwendete (J, H. Thomas, Aust vet J, 34, 411, 1958). Diese Möglichkeit wurde ausgedehnt, wobei sich erwies, daß eine Vermehrung mit einem

ίο flüssigen Medium erhalten wurde, das Trypsin oder ein Pancreasextrakt enthielt, dem man ein Hydrolysat aus Klaue oder Wolle, Kasein oder Proteo sepepton zugab. Es wurde hierbei eine Stickstoffatmosphäre zur Beibehaltung anaerober Bedingungen verwendet (J. H.

Thomas, Aust vet U 39,434,1963).

Schließlich wurden Impfstoffe aus F. nodosus für einen Feldversuch über eine Organismenkultur auf festem Klauenagar, das gemahlenes Horn enthielt unter einer Atmosphäre von 10%igem Kohlendioxid in Wasserstoff und in einem zweiphasigen Medium von Klauenagar, über das eine Klauenbrühe gegossen wurde, unter anaeroben Bedingungen hergestellt (J. R. Egerton und andere, Aust. vet J, 46, 517, November 1970).

Die Verwendung fester Medien, z. B. Agarplatten, weist zusätzliche Nachteile auf, da mehr Medium erforderlich ist und sich Schwierigkeiten bei der Sterilisation und dem Bebrüten des Mediums sowie bei der Sammlung von der Kulturoberfläche ergeben.

in Ähnliche Probleme sind bei Verwendung eines zweiphasigen Feststoff/Flüssigkeitsmediums zu erwarten.

Die Verwendung von im Handel erhältlichen Huf- und Hornmehl inhibiert das Wachstum von F. nodosus. Bei der Verwendung von Klauenkeratin müßte dieses

π demnach von vielen Schafsklauen gesammelt werden und außerdem ist das Vermischen eines unlöslichen Pulvers mit einem flüssigen Medium schwierig. Wenn pulverisiertes Klauenmehl in ein geeignetes, festes Agarmedium eingemischt wird, bleibt das Wachstum

•to des Organismus sogar nach 5tägigem anaerobem Bebrüten schwach, und der Organismus, den man nach der Züchtung in einem flüssigen Medium, das vorausgehend mit Klauenpulver erhitzt wurde, abnimmt, war nicht für die nachfolgende Verwendung in einem

a > Impfstoff geeignet antigen.

Die Erfindung betrifft einen Impfstoff der ausgangs angegebenen Art, der dadurch gekennzeichnet ist, daß der verwendete genus Fusiformis nodosus auf einem flüssigen, gelöste Leberbestandteile enthaltenden Nähr-

vi medium gezüchtet worden ist, das in Lösung 0,5 bis 2 Gewichtsteile rohes Trypsin pro 100 Volumenteile Nährmedium oder 1,2 bis 3,6 Gewichtsteile selbstverdautes Pankreas, das nach bekannten Verfahren erhalten worden ist, berechnet als Pankreas-Feststoffe,

ν, pro 100 Volumenteile Nährmedium enthält und der pH-Wert des Nährmediums 7,0 bis 7,8 beträgt.

Die geeigneten Lebermaterialien für das Nährmedium sind übliche Präparate und übliche Leberverdauungsbrühen, -aufschlüsse oder -extrakte.

Wi Um maximale Ausbeuten an F. nodosus zu erhalten und aus Zweckmäßigkeitsgründen liegt die bevorzugte Konzentration des Lebermaterials in einem flüssigen Kulturmedium im Bereich von 0,5, I und 2% (Gewicht/Volumen), wobei sich das Gewicht auf das

h·. Trockengewicht der Feststoffe der Ausgangsleber bezieht. Die Wirkung wechselnder Leberkonzentrationen auf das Wachstum von F. nodosus ist der folgenden Tabelle zu entnehmen.

Tabelle

Medium	Pancreas	Optische Dichte	2	Mitte1
Leberpräparat	% (VoIVVoI.)	Stamm 183	0,063	0,062
% (GewVVol.)	O	I	0,33	0,33
0	20	0,060	0,39	0,395
0	20	0,33	0,43	0,435
1	30	0,395	0,395	0,395
1	20	0,435
2	0,39

Stamm 198	2	MUti
1	0,090	0,09
0,092	0,26	0,26
0,26	0,37	0,37
0,38	0,415	0,41
0,41	0,455	0,44
0,43

Die Wirkung des Vorhandenseins des Lebermaterials auf das Wachstum von F. nodosus in einem flüssigen Medium wird in der Tabelle aufgezeigt Zwei Kulturreihen, jede mit dem Stamm 183 und 198, wurden bei 37° C unter einer 5%igen COrin-Stickstoff-Atmosphäre in einem flüssiges Medium gezüchtet, wobei dieses zusätzlich zum Leberextrakt und selbstverdauten Pancreas noch 2% Gewicht/Volumen Pepton (aus Fleisch oder Casein hergestellt) und 03% Gewicht/Volumen Natriumchlorid enthält Die Organismen wurden über Nacht kultiviert und die optische Dichte des erhaltenen Mediums spektrometrisch bestimmt. Aus der Tabelle ist zu ersehen, daß das maximale Wachstum des Stamms 183 bei einem l%igen Leber- und 3O^u/oigen Pancreasgehalt und das maximale Wachstum des Stamms 198 bei einem 2%igen Leber- und 20%igen Pancreasgehalt erfolgt

Diese im Handel erhältlichen Leberpräparate können als feine Pulver, ggf. in destilliertem Wasser gelöst verwendet werden.

Das erfindungsgemäß verwendete uüssige Kulturmedium enthält vorzugsweise noch übliche Nährbestandteile wie Hefeextrakte, Peptone oder Verdauungsbrühen von Pferde- oder Rindermuskelfleisch, Natriumchlorid und L-Cysteinhydrochlorid.

Cystein ist wünschenswerterweise in einem flüssigen Kulturmedium in einer Konzentration von 0,005 bis 0,2% Gewicht/Volumen, jedoch vorzugsweise geringer als 0,1%, vorhanden, wobei die optimale Konzentration in umgekehrtem Verhältnis zum Kulturvolumen variiert, wobei beispielsweise 0,1% (Gewicht/Volumen) Cystein bei einem Volumen des Mediums von 5 ml und 0,02% (Gewicht/Volumen) Cystein bei einem Volumen von 500 ml verwendet werden.

Die Konzentrationen der oben angegebenen Bestandteile beziehen sich sowohl auf das flüssige Endkulturmedium zur Kultur des Organismus im flüssigen Zustand als auch auf das flüssige Medium, das zur Unterkultur und Herstellung des Inokulums für die Kultur in technischem Umfang verwendet wird. Mit Ausnahme des Cystein-Bestandteils können die gleichen Substanzen mit den angegebenen Konzentrationen in einem festen Medium, beispielsweise Agar, zum Zwecke der anfänglichen Isolierung des Organismus aus infektiösem Material verwendet werden.

Die flüssigen Kulturmedien werden am zweckmäßigsten durch Lösen der Bestandteile in destilliertem Wasser vor dem Sterilisieren hergestellt, und dann wird das gesamte oder ein Teil des Cysteins zugegeben, weil dieses Material instabil ist. Die Temperatur wird auf 35 bis 39^CC eingestellt. Das erhaltene Medium ist vorzugsweise eine homogene Lösung, die im wesentlichen frei von suspendierten, unlöslichen Materialien ist.

Für die Kultivierung des Organismus sind anaerobe Bedingungen zu schaffen. Allgemein wurde festgestellt, daß F. nodosus um so schneller wächst, je höher die Konzentration an Kohlendioxid über dem Medium ist.

Gutes Wachstum der Organismen wurde bei Verwendung von Konzentrationen von 60, 80, 90, 95 und 100% Kohlendioxid bei Standarddruck: erhalten, wobei der Rest der Atmosphäre im wesentlichen aus einem chemischen, inerten Gas, wie Stickstoff, Argon oder Helium, bestand.

Es wurde festgestellt, daß das Gas/Flüssigkeits-Verhältnis die Wachstumsgeschwindigkeit des Organismus beeinflußt Im allgemeinen sollte das Kohlendioxidvolumen bei Standarddruck 30%, insbesondere 20—5% des

jo Volumens der flüssigen Kultur nicht überschreiten. Vorzugsweise liegt das Volumverhältnis des Kohlendioxids bei 10% des Volumens der Flüssigkeit

Die Einführung von Kohlendioxid in den Gasraum über dem flüssigen Medium wird natürlich zur Folge haben, daß ein Teil des Gases sich in dem Medium löst und dessen pH-Wert gegenüber dem anfangs verwendeten senkt

Wahlweise können anaerobe Bedingungen dadurch erhalten werden, daß man in dem Kulturgefäß für eine ausreichende Tiefe des flüssigen Kulturmediums sorgt, so daß die Organismen im Inneren des Mediums durch die Anwesenheit von Sauerstoff im Gasraum oberhalb des Mediums nicht berührt werden.

Es ist wünschenswert, daß die Endkultur von F.

5 nodosus-Organismen, die in einen Impfstoff überführt werden sollen, ein Maximum an lebenden, gesunden Organismen enthalten. Das erfordert, daß die Endkultur in einer möglichst minimalen Zeit aufwachsen sollte, was wiederum die Verwendung des möglichst großen

-,ο Inokulums erforderlich macht. Die Impforganismen für das Inokulum sollten einen hohen Anteil an lebensfähigen Organismen enthalten. Demzufolge ist es wünschenswert, die Anzahl der Organismen von dem Ausgsngsmaterial durch eine Reihe von Kulturen progressiv zu erhöhen.

Zu diesem Zweck kann der Organismus zunächst durch Kultivierung eines geeignet infektiösen Materials unter anaeroben Bedingungen auf einem festen Medium, das einen Leberaufschluß oder Leherextrakt enthält, isoliert werden. Die weitere Kultur aus dieser ersten Kultur wird zweckmäßigerweise so lange fortgesetzt, bis der Organismus als reine Kultur erhalten wird. Dies wird im allgemeinen durch eine oder zwei Unterkulturen auf einem festen Medium erreicht, wobei

_h-, Bedingungen und Materialien, nach Eignung, ähnlich denen verwednet werden, wie sie oben für die Kultivierung in flüssigem Medium beschrieben wurden. Das feste Medium besteht geeigneterweise aus

Agarplatten, die selbstverdautes Pancreas oder rohes Trypsin t :250, Pepton, Hefe-Extrakt, Natriumchlorid und Agar zusätzlich zu dem oben angegebenen Lebermaterial bei einem pH von 7,0 bis 7,8 enthalten. So kann beispielsweise eine Suspension von infektiösem Material aus den Schäden von Schafsklauenfäule in einer 0,1 bis 0,4 M Sucroselösung auf Agarplatten geimpft und die Platten bei einer Temperatur zwischen 35 und 39° C in einer Kohlendioxid- und Stickstoffatmosphäre mehrere Tage bebrütet werden.

Wenn eine reine F. nodosus-Kultur aus dem auf festem Medium gebildeten Wachstum erhalten wird, kann diese als Inokulum für eine anaerobe, flüssige Kultur des Organismus z. B. unter einer Kohlendioxidatmosphäre verwendet werden, wobei diese Kultur durch aufeinander folgende Unterkulturen fortgesetzt wird, bis ausreichend Organismen gebildet sind, um ein Endinokulum für einen Herstellungsansatz zu liefern, der aus wirtschaftlichen Gründen die Verwendung eines großen Volumens des flüssigen Mediums 51 bis 5001 beinhaltet

Die nachfolgenden Unterkuituren in flüssigen Medien werden vorzugsweise unter den nachfolgenden Bedingungen bei einer Ansatzherstellung in technischem Umfang und unter Verwendung von Medien gleicher Zusammensetzung durchgeführt

Das zuletzt gebildete Medium kann in der folgenden Weise zur Bildung großer Mengen des Organismus zur Vakzinherstellung verwendet werden. Das flüssige, die oben angegebenen Bestandteile enthaltende Medium wird in geeigneter Weise in große Glaskessel oder Behälter aus rostfreiem Stahl überführt. Zu dem Medium wird eine flüssige Kultur von F. nodosus (5 bis 10% des flüssigen Mediums) hineingegeben. Vorzugsweise wird die Luft über dem Medium vollständig durch steriles Kohlendioxid verdrängt und dann wird das Medium 12 bis 30Std. bebrütet, bis eine Dichte von ungefähr 10⁸ bis 10¹⁰ Organismen pro ml erreicht ist.

Besonders reine Kulturen von F. nodosus werden durch wiederholte Unterkultur eines festen Agarmediums erreicht Man kann den Organismus auch von einem festen Kulturmedium, das in Sucroselösung suspendiert, gefriergetrocknet und unter Vakuum verschlossen ist, entnehmen. Wenn erforderlich, kann der getrocknete Organismus in irgendeiner Nährlösung rekonstituiert und unter anaeroben Bedingungen in einem festen Medium, das einen Leberaufschluß oder -extrakt enthält, erneut unter Kultur nehmen. Auf diese Weise ist es möglich, für jeden Zweck einen Vorrat an F. nodosus-Organismen zu bilden.

Die vorausgehend geschilderten Kulturbedingungen sind insbesondere zur Züchtung der Stämme 183 und 198 von F. nodosus (Mc Master Laboratorium der Commonwealth Scientific Industrial Research Organization, Sydney, Australien) geeignet

Der Produktionsansatz des obigen Organismus kann in üblicher Weise als Impfstoff formuliert werden, wozu der Organismus abgetötet wird, beispielsweise durch Verwendung von 0,2 — 1 °/oigem Formalin (Volumen/Volumen). Der abgetötete Organismus kann dann mit einem Adjuvans zur Erhöhung der Immunitätsbildung kombiniert werden. Geeignete Adjuvanzien sind in der G-B-PS 11 43 545 beschrieben. Vorteilhafterweise wird die Kultur mit einem nicht ionischen, hydrophilen Emulgiermittel, beispielsweise Polyoxyäthylensorbitanmonooleat, gemischt und dann in einem Mineralöl, das ein nicht ionisches, lipophiles Emulgiermittel, wie Manniclmonooleat ^nιhält, emulgiert und dann unter Bildung einer Wasser-in-öl-EmuIsion des in der wäßrigen Phase dispergierten Organismus steril gemacht,
Zur Erhöhung der Jmmunitätsbildung des Antigens

-, kann ein Aluminiumsalz z. B. Kaliumalaun verwendet werden. Der Impfstoff kann auch ein übliches Bakteriostat und 0,01% (Gewicht/Volumen) Natriumäthylmercurithiosalicylat enthalten.

Die erfindungsgemäßen Impfstoffe werden den

in Tieren durch subkutane oder intramuskuläre Injektionen verabfolgt Es wird jedoch angenommen, daß es vorteilhafter ist, einen mit Aluminiumadjuvans versehenen Impfstoff subkutan und einen mit Emulsionsadjuvans versehenen Impfstoff entweder intraperitor. al oder an einer anderen Stelle zu verabfolgea Ein besonders bevorzugter Dosierungsbereich für ein mit Emulsionsadju.ans versehenen Impfstoff liegt bei 10⁸ bis 10¹⁰, insbesondere 5 χ 10⁸ bis 5 χ 10⁹ abgetöteten Organismen pro Dosis, während für einen mit Aluminiumadjuvans

2» versehenen Impfstoff bei 5x10* bis ! χ 10", insbesondere 1 χ 10⁹ bis 5 χ 10¹⁰ getöteter .Organismen pro Dosis liegt Die Dosis ist die Gesamtmenge an antigenem Material, die einem Tier, z. B. einem Schaf, in einem geeigneten Flüssigkeitsvolumen, z. B. 1 bis 2 ml für ein

2"> mit Emulsionsadjuvans versehener Impfstoff und 4 ml für· ein mit Aluminiumadjuvans versehener Impfstoff verabfolgt wird. Die Dosis kann einem Tier als eine Einheit oder als eine Vielzahl von Unter-Dosisgaben verabfolgt werden, wobei die letzteren über einen

jo Zeitraum oder durch gleichzeitige Injektionen der Unterdosen an unterschiedlichen Stellen verabfolgt werden können. Ein geeignetes Immunisierungsschema für ein mit Emulsionsadjuvans versehener Impfstoff wäre eine einzige Injektion der Dosis, eine Injektion

ji einer Unterdosis mit nachfolgender zweiter Injektion einer Unterdosis nach 14 Tagen, oder zwei Injektionen, wobei jede eine Unterdosis ist, gleichzeitig an verschiedenen Stellen des Tieres. Das optimale Dosierungsschema sollte natürlich entsprechend den als Impfstoffbasis ausgewählten Stämmen des Organismus, der Gesamtanzahl der verwendeten Organismen, der ausgewählten Art des Adjuvans und dem Verabfolgungsweg variieren. Es wurde als praktisch festgestellt, einen Aluminiumadjuvans-Impfsioff, das 2£ χ 10⁹ Organismen/ml in einer einzigen 4-ml-Dosis enthält subkutan zu verabfolgen und danach das gleiche Volumen in der gleichen Weise mindestens 6 Wochen zu verabfolgen. Wenn ein längerer Schutz gewünscht wird, sollten zusätzliche Dosen in 6monatlichen Zeitabständen verabfolgt werden. Das End-Impfstoff-Präparat kann z.B. 2,5x10⁷ bis 2,5XlO⁹ abgetötete Organismen pro ml Präparat enthalten.

Der erfindungsgpmäße Impfstoff kann auch mit dem anfigenen Material anderer Bakterien z. B. F. necrophorus oder clostridia, kombiniert werden.

Der erfindutigsgemäße Impfstoff ist z-tr Vorbeugung und Behandlung von Klauenfäule bei Schafen geeignet

Beispiel 1 a) Isolierung der Organismen

Infektiöses Material wurde von den Affektionen von Schafklauenfäuif isoliert, in einer 0,25 M wäßrigen Sucroselösung suspendiert und sofort auf Agarplatten der nachfolgenden Zusammensetzung aufgebracht:

10% (Vol./Vol.)") sclbstverdauu-s Rinderpancreas
1% (Gew./Vol.) aus Fleisch oder Casein hergestelltes Pepton

1% (Gew./Vol.) Rmderleherauischluß
0.5% (Gew./Vol.) Natriumchlorid
1.5% (Gew./Vol.) Agar

") Diese Menge entspricht ungefähr 1.2"-'" |(in^;Viil.| gelöster Feststoffe, clic aus der Pancreas stammen.

Der pH-Wert des festen Nährmediums betrug 7,4. Die Platten wurden bei 37X in einer 5% Kohlcndioxid-in-Stickstoff-Atmosphäre 4 Tage bebrütet.

Nach Inkubation zeigten die Agarplatten kleine, flache, für F. nodosus typische, ausgedehnte Kolonien. Von den Kolonien wurden Abstriche gemacht und diese mikroskopisch geprüft, wobei ein gramnegativer Bazillus mit der charakteristischen Hantelform des F. nodosus festgestellt wurde.

Das auf den Agarplatten gezüchtete Material wurde auf weitere Agarplatten der gleichen Zusammensetzung überführt, die dann den gleichen Bedingungen 3 Tage bebrütet wurden. Das Aussehen der Kolonien, der Organismen bei nach Gram gefärbten Abstrichen und der Geruch, ähnlich dem von Säugersamen, waren tür F. nodosus charakteristisch. Die Identität von F. nodosus wurde durch dessen Unfähigkeit, auf Agar unter aeroben Bedingungen oder auf einem gewöhnlichen Nähragar zu wachsen und dessen Fähigkeit, auf einen Agarboden, der 5 bis 10% Pferdeblut, aber kein Schafsblut, enthält, zu wachsen bestätigt. Der Organismus erzeugt Klauenfäule, wenn man ihn auf die interdigitale Haut von Schafen aufbringt, deren Füße aufgeweicht und Kotverunreinigung mit F. necrophorus ausgesetzt wurden. Der Organismus wurde mittels einer wiederholten Unterkultur wie oben beschrieben gehalten.

Die Organismen aus der zweiten Unterkultur wurden von dem Agar entfernt, in 0.25 M wäßriger Sucroselösung suspendiert und dann gefriergetrocknet und unter Vakuum verschlossen. Das Impfmaterial wurde gelagert, bis es zur Impfstoffherstellung verwendet wurde.

b) Unterkultur des Organismus und
Herstellung des Inokulums in flüssigen Medien

Die Kultivierung von F. nodosus zur Impfstoffherstellung wurde dadurch eingeleitet, daß man in 0,25 M wäßriger Sucroselösung den wie vorausgehend hergestellten, getrockneten Organismus wieder aufbaut und ihn auf Agar ausbringt und dann diese Züchtung in ein wäßriges, flüssiges Medium der folgenden Zusammensetzung überführt.

1% (GewVVol.) Rinderleberaufschluß
10% (VoL/Vol.)*) selbstverdautes Rinderpancreas

1% (GewVVol.) aus Fleisch oder Casein hergestelltes Pepton

03% (Gew/Vol.) Natriumchlorid

0.05% (Gew/Vol.) L-Cysteinhydrochlorid (zugeführt als sterile 10%ige Lösung nach Autoklavenbehandlung des Mediums); destilliertes Wasser bis zum gewünschten Volumen;

*) Entspricht ungefähr 1.2% GewVVoI. gelöster Feststoffe, die aus der Pancreas stammen.

Der pH-Wert des Mediums betrug vor der Autoklavenbehandlung 7.4. Die Organismen wurden in einem geniigen Volumen des Mediums bei i? C 24 Stunde!! bebrütet. Die erhaltene Kultur wurde dann in fin größeres Volumen des flüssigen Mediums. /. Ii. 500 ml gegeben, jedoch mit der Änderung, daß die Cystcinkon-

. /entration 0,2% (Gew./Vnl.) und die Konzentration an sclbstverdiiiitcm Pancreas 20% (Vol./Vol.), d.h. ungefähr 2.4% (Gew./Vol.) gelöster Feststoffe aus d-r Pancreas betrug. Die weitere ßebrütung wurde unter ähnlichen Bedingungen durchgeführt, wobei Kohlendi-

Ii oxid in den Luftraum über das Medium eingeführt wurde, bis der größte Teil der Luft verdrängt war. Hei einem Kolben von 0,57 1 wurde ca. 15 Sek. Kohlendioxidgase eingeführt. Die Reinheit der Kultur wurde mikroskopisch geprüft.

c) Kultur des Organismus in technischem Umfang

Der Inhalt eines 0,571-Kolbens wurde dann in 12.5 I flüssiges Medium der gleichen Zusammensetzung (ausgenommen, daß die Cysteinkonzentration 0,01%

■■ι [Gew./Vol.] und die Konzentration an selbstverdautem Pancreas wiederum 2.4% [Gew./Vol.] d. h. 20% [VoL/Vol.] betrug), eingeführt. Die Luft im Gefäß wurde durch CO: ersetzt und dann wurde bei 37⁰C 20 Std. bebrütet, wonach die Kultur ca. 2 χ 10" Organismen/ml

·. enthielt. Die Reinheit der Kultur wurde mikroskopisch überprüft.

d) Herstellung eines F. nodosus-Impfstoffs

Eine flüssige Kultur von F. nodosus wurde nach dem

in unter c) beschriebenen Verfahren im technischen Umfang hergestellt. Die antigene Eigenschaft der Zellen wurde dadurch geprüft, daß man auf ein Objektglas einen Tropfen der Kultur mit einem Tropfen Antiserum zu F. nodosus, in einem Kaninchen gezüchtet, mischt.

>. Der Organismus agglutinierte sofort. Er war somit ausreichend antigen. Nachdem man Formalin (0,6% Vol./Vol.) zu der Gesamtkultur zugegeben hatte, ließ dann die Kultur bei Raumwärme 3 Tage stehen und gab dann Thiomersal (0,01% Gew./Vol.) hinzu. Das inakti-

Im -ierte Material wurde dann zu einem Impfstoff verarbeitet; Sorbitanmonooleat wurde in der Kultur mit einer Konzentration von 5% (VoIVVoI.) gelöst und j vut.-ι cue uci el iiaiiciicn ouspcimun huiucii im 7 Teilen eines ölgemischs emulgiert, das aus 10% ι, (VolyVol.) Mannidmonooleat in leicht flüssigem Paraffinöl bestand. Der Impfstoff wurde unter sterilen Bedingungen in geeignete Behälter gegeben und die Behälter versiegelt. Das Produkt wurde bis zur Verwendung gelagert.

,Ii Die Wirksamkeit des so hergestellten Impfstoffs wurde durch Injizieren von zwei 1-ml-Doser des unverdünnten Impfstoffs in 4 Kaninchen in Abständen von 2 Wochen geprüft. Den Kaninchen wurde zwei Wochen nach der zweiten Dosis das Blut entnommen -, und ihre Seren bei Verdünnungen von 2500,5000,10 000 bis zu 320 000 geprüft. Jede Probe des Serums wurde einem Agglutinationstest mit einer Suspension von F. nodosus in 0.85%iger (Gew/Vol.) Natriumchloridlösung bei einer Dichte unterworfen, die äquivalent der Röhre 1 der Brown'schen Trübungsskala entspricht. Der Impfstoff induzierte einen mittleren Agglutinintiter von 48 000 und war ausreichend wirksam für eine nachfolgende Impfung von Schafen.

Beispiel 2

F. nodosus-Stemm !83 und 198-Or°^kanisrnsn wurden in der in Beispiel 1 c) beschriebenen Weise kultiviert und mit Formalin, wie in Beispiel 1 beschrieben, inaktiviert.

C»leiche Volumen der Anakultur von jedem Stamm wurden zusammen gemischt, und wäßrige Lösungen von Kaliumaluminiumsulfat und Thiomersal wurden zugegeben, um Konzentrationen von 2% Gcw./Vol. und 0.01 Ciew./Vol. /u erhalten. Der erhaltene Impfstoff wurde sterilisiert und in Ampullen gefüllt, wobei jede

Ampulle 4 ml Impfstoff mit 2,¹JxI(V¹ Orgamsmen/ml enthielt. D'.'r Impfstoff war zur Immunisierung von Schafen entsprechend einem Dosicrungssehema bei einer einzigen subkutanen Injektion von 4 ml unter nachfolgender Verabfolgung der gleichen Dosis 4 bis S Wochen später subkutan geeignet.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Steriler Impfstoff, der abgetötete Organismen des genus Fusiformis nodosus enthält, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete genus Fusiformis nodosus auf einem flüssigen, gelöste Leberbestandteile enthaltenden Nährmedium gezüchtet worden ist das in Lösung 0,5 bis 2 Gewichtsteile rohes Trypsin pro 100 Volumenteile Nährmedium oder 1,2 bis 3,6 Gewichtsteile selbstverdautes Pankreas, das nach bekannten Verfahren erhalten worden ist berechnet als Pankreas-Feststoffe, pro 100 Volumenieile Nährmedium enthält und der pH-Wert des Nährmediums 7,0 bis 7,8 beträgt