DE2167168C2

DE2167168C2 - Flüssiges, Leberverdauungsbrühe, -extrakt oder -infusion enthaltendes Nährmedium zum anaeroben Züchten von Fusiformis nodosus und Verfahren zum anaeroben Züchten von Fusiformis nodusus

Info

Publication number: DE2167168C2
Application number: DE2167168A
Authority: DE
Inventors: David Stewart Keston Kent Roberts
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1970-08-20
Filing date: 1971-08-20
Publication date: 1984-03-29
Also published as: AR195954A1; AU3252271A; FR2103402B1; IT1045527B; JPS5545192B1; DE2141901C3; IE35729L; DE2141901A1; BE771536A; NO141564C; DE2141901B2; NO141564B; AU451635B2; NL7111442A; FR2103402A1; NO141565B; US3843451A; IE35729B1; ZA715544B; NO141565C

Description

Diese Erfindung betrifft den in den Ansprüchen 1 und 2 angegebenen Gegenstand. Die Ansprüche 3 bis 14 beinhalten Ausgestaltungen der Maßnahmen des Anspruchs 2.

Die Klauenfäule bei Schafen ist eine we£ /erbreitete, ansteckende Erkrankung, welche die epidermen Gewebe des Fußes befällt und durch die synergistische Wirkung der beiden gramnegativen anaeroben Bakterien, Fusiformls nodosus und Fusiformis necruphurus, verursacht wird. Die Erkrankung tritt nur dann auf, wenn beide Organismen vorhanden sind.

F. necrophorus ist normalerweise im Verdauungstrakt zu finden und wird mit dem Kot ausgeschieden, so daß der Organismus gewöhnlich in unmittelbarer Nachbarschaft der Schafsklaue vorhanden ist. F. nodosus ist andererseits unter natürlichen Bedingungen nicht fähig, länger als einige Tage außerhalb der befallenen Klaue zu überleben, da die infizierte Klaue sein einziger natürlicher Lebensraum ist. Daher wird F. nodosus im allgemeinen als für die Erkrankung spezifisch kausal angesehen. Die Eliminierung von F. nodosus aus einer von Klauenfäule befallenen Schafherde würde daher diese Erkrankung beseitigen.

In den vergangenen Jahren wurde Klauenfäule dadurch bekämpft, daß man die Infizierten Tiere isoliert, sie danach durch kräftiges Schälen bzw. Abheben der betroffenen Teile der Klaue und durch äußeres Aufbringen von Desinfektionsmitteln oder Antibiotika, behandelt. Neuerdings wurden Versuche unternommen, der Erkrankung von Schafen durch Vakzination gegen F. nodosus und F. necrophorus Einhalt zu gebieten, aber es wurde bisher noch kein erfolgreiches Verfahren für eine wirtschaftliche Kultivierung von F. nodosus in technischem Umfang entwickelt, das eine Vakzinherstellung für eine allgemeine Anwendung ermöglicht.

An der Lösung des Problems, F. nodosus in Reinkultur zu Isolieren (H. Marsh et al.. The Cornell Veterinarian, 60, 309-17, April 1970) wird seit 1970 gearbeitet. Aus Eu¹I. Coun. sei. industr. Res. Aust., Nr. 140 sind die Ansprüche des Organismus an eine Kultur bekannt. Eine Züchtung In flüssigen Medien konnte jedoch nicht mit Erfolg durchgeführt werden. Der Organismus Ist ein streng anaerobes Bakterlum, dessen Züchtung durch eine Atmosphäre gefördert wird, die 5 bis 10% Kohlendioxid enthält. Sogar 80% dieses Gases inhibieren die Kultur nicht. Wenn man eine flüssige Verdauungsbrühe aus Rindermuskelflelsch und Leber verwendet, erhält man nur ein sehr geringes oder Ingesamt kein Wachstum, während man bei Zugabe von 10% Pferdeserum ein schwaches Wachstum erhält.

Größeren Erfolg hatte man bei Verwendung einer flüssigen Nährlösung als Kulturmedium zum Isolieren und Sekunclärkultlvleren von F. nodosus, die gemahlene Partikel von Schafsklauen und rohes Trypsin enthielt, wobei man mit einer Atmosphäre von 10% Kohlendloxid arbeitete (J. H. Thomas, Aust. vet. J.. 34. 411, 1958). Bei wei-

teren Untersuchungen wurde festgestellt, daß eine Vermehrung In einem flüssigen Medium erhalten wurde, welches Trypsin oder einen Pankreasextrakt enthielt, dem man ein Hydrolysat aus Klaue oder Wolle, Casein oder Proteosepepton zugab. Es wurde hierbei eine Stickstoffatmosphäre zur Beibehaltung anaerober Bedingungen verwendet (J. H. Thomas, Aust. vet. J., 39, 434, 1963).

Schließlich wurden Vakzinen aus F. nodosus für einen Feldversuch über eine Organismenkultur auf festem Klauenagar, das gemahlenes Horn enthielt, unter einer Atmosphäre von 10%igem Kohlendioxid in Wasserstoff, und in einem zweiphasigen Medium von Klauenagar, über das eine Klauenbrühe gegossen wurde, unter anaeroben Bedingungen hergestellt (J. R. Egerton et al., Aust. vet. J., 46, 517, November 1970).

Die Verwendung fester Medien, z. B. von Agarplatten, bringt zusätzliche Nachteile mit sich, da mehr Medium erforderlich ist und Schwierigkeiten bei der Sterilisation und dem Bebrüten des Mediums, sowie bei der Sammlung von der KüUuroberfiäche auftreten. Ähnliche Probleme sind bei Verwendung eines zweiphasigen Feststoff/Flüssigkeitsmediums zu erwarten.

Die Verwendung von im Handel erhältlichen Huf- und Hornmehl inhibiert das Wachstum von F. nodosus. Bei der Verwendung von Klauenkeratin rnOßte dieses demnach von vielen Schafsklauen gesammelt werden und außerdem ist das Vermischen eines unlöslichen Pulvers mit einem flüssigen Medium schwierig. Wenn pulverisiertes Klauenmehl in ein geeignetes, festes Agarmedium eingemischt wird, ble'K das Wachstum des Organismus sogar nach 5tägigem anaerobem Bebrüten schwach, und der Organismus, den man nach der Züchtung in einem flüssigen Medium, das vorher mit Klauenpulver erhitzt wurde, erhält, war für die nachfolgende . erwendung in einer Vakzine nicht geeignet.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand daher darin, ein flüssiges, Leberverdauungsbrühe, -extrakt oder -infusion enthaltendes Nährmedium zum anaeroben Züchten von Fuslformis nodosus zu schaffen, das eine Kultivierung von F. nodosus ohne die vorstehend geschilderten Schwierigkeiten ermöglicht und einen Organismus liefert, der In ausreichendem Maße antigen ist und sich für eine Vakzinherstellung eignet.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist darin zu sehen, Tabelle

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⁴³ ein Verfahren zum anaeroben Züchten von Fusiformls nodosus in einem flüssigen, gelöste Leberbestandteile enthaltenden Nährmedium zur Verfügung zu stellen.

Diese Aufgabe wurde durch ein Nährmedium gelöst, das in Lösung 0,5 bis 2 Gewichtstelle rohes Trypsin pro 100 Volumteile Nährmedium oder 1,2 bis 3,6 Gewichtsteile selbstverdautes Pankreas, das nach bekannten Verfahren erhalten worden 1st, berechnet als Pankreas-Feststoffe, pro 100 Volumteile NShrmedium enthält und^iessen pH-Wert 7,0 bis 7,8 beträgt.

Das Verfahren gemäß der Erfindung besteht darin, daß man den Organismus in einem Gefäß kultiviert, welches das Nährmedium nach Anspruch 1 enthält und einen Gasraum über dem Medium aufweist, wobei der Gasraum im wesentlichen Kohlendioxid oder ein Gemisch von Kohlendioxid und Stickstoff, Argon oder Helium, das wenigstens 60 Vol.-% Kohlendloxid enthält, aufweist und das Kohlendioxid in dem Gasraum 30 Vol.-S? des flüssigen Mediums nicht überschreitet.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird eine wesentliche Erhöhung von sowohl der Wuchsgeschwindigkeit als auch der Ausbeute an F. nodosus unter anaeroben Bedingungen erzielt. Darüber hinaus sind die so gebildeten Organismen für Vakzinationszwecke zufrieeinstellend antigen.

Besonders geeignete Lebermaterialien sind z. B. die Präparate Panmede Liver Digest, Liver Infusion, Liver Digest L 27, jedoch können auch andere äquivalente, im Handel erhältliche Präparate von Leberverdauungsbrühen oder Leberextrakten eingesetzt werden.

Zur Erzielung von maximalen Ausbeuten an F. nodosus und Im Hinblick auf die Züchtungsgeschwindigkeit arbeitet man nach bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung so, daß der Leberbestandteil von 0,5 bis 2 Gew.-%, besonders bevorzugt 1 bis 2 Gewichtsprozent des Volumens des Mediums ausmacht, wobei das Gewicht auf der Basis des festen Leberbestandteils berechnet ist.

Es können zwar auch höhere Konzentrationen bis zu ungefähr 3 Gew.-% des Volumens des Mediums verwendet werden, jedoch besteht dann die Tendenz einer Ausbeuteabnahme.

Die Wirkung wechselnder Leberkonzentrationen auf das Wachstum von F. nodosus ist der nachfolgenden Tabelle zu entnehmen.

Vi Medium	Pankreas	Optische	Dichte	Mittel	Stamm B	2	Mittel
i.'.. Leberpräparat	% (Vol./Vol.)	Stamm A		0,062	1	0,090	0,09
ä %(Gew./Vol.)	0	1	2	0,33	0,092	0,26	0,26
% O	20	0,060	0,063	0,395	0,26	0,37	0,37
':-, O	20	0,33	0,33	0,435	0,38	0,415	0,41
vl ι	30	0,395	0,39	0,395	0,41	0,455	0,44
^; 1	20	0,435	0,43		0,43
;;; 2	0,39	0,395

Zwei Kulturreihen, jede mit dem Stamm A und B, wurden bei 37° C unter einer 5%igen COHn-Stickstoff-Atmosphäre In einem flüssigen Medium gezüchtet, wobei dieses zusätzlich zum Leberextrakt und selbstverdautem Pankreas noch 2% Gewicht/Volumen Proteose- ^6ä pepton und 0,3% Gewicht/Volume;* Natriumchlorid enthielt. Die Organismen wurden über Nacht kultiviert und die optischen Dichte des erhaltenen Mediums spektrometriseh bestimmt. Aus deF Tabelle Ist zu ersehen, daß das maximale Wachstum des Stamms A bei einem l%lgen Leber- und 30%igen Pankreasgehalt und das maximale Wachstum des Stamms B bei einem 2%lgen Leber- und 20%lgen Pankreasgehalt erfolgt.

Die im Handel erhältlichen Leberpräparate können als feine Pulver verwendet werden, die man In destilliertem Wasser auflöst und die Lösung dann dem flüssigen

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Nährmedium in der gewünschten Konzentration zusetzt. Da nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens in dem flüssigen Medium im wesentlichen irgendein partikelförmiger Bestandteil außer den Organismen Fusiformis nodosus vermieden wird, sollte eine solche Lösung vor dar Zugabe zur Entfernung von partikelförmigem Material, beispielsweise durch Filtrieren, geklärt werden.

Um in den erfindungsgemäßen Verfahren hohe Ausbeuten zu ermöglichen, enthält das flüssige Nährmedium in Lösung zusätzlich Natriumchlorid, Proteosepepton, Hefeextrakt, Cystein und/oder Säugermuskelautodigestion.

Weiterhin wird es bevorzugt, daß man in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung selbstverciautes Pankreas verwendet, das von Rinder- oder Schafpankreas stammt. Das selbstverdaute Pankreasmaterial wird nach bekannten Verfahren hergestellt.

Das Pankreasmaterial in dem flüssigen Nährmedium kann durc¹· rohe Trypsinpräparate (z. B. »Difco« 1 : 250-Trypsin) jrset/t werden.

Cystein ist in dem flüssigen Nährmf-Jium gemäß Erfindung wünschenswerterweise in einer Konzentration von 0,005 bis 0,2 Gew.-Sj/Volumen, vorzugsweise in einer Konzentralion von weniger als 0.1 Gew.-V Volumen vorhanden. Die optimale Konzentration variiert in umgekehrtem Verhältnis zum Volumen des Nährmediums, so daß beispielsweise 0,1 Gew.-Wolumen Cystein bei einem Volumen des Nährmediums von 5 ml und 0,02 Gew.-%/Volumen Cystein bei einem Volumen von 500 ml eingesetzt werden.

Die Konzentrationen der oben angegebenen Bestanuteile beziehen sich sowohl auf das flüssige Endnährmedium zur Kultur des Organismus im flüssigen Zustand als auch auf das flüssige Medium, das zur Sekundärkultür und Herstellung des Inokulums für die Kultur in technischem Umfang verwendet wird.

Mit Ausnahme des Cystein-Bestandteils können die gleichen Substanzen mit den angegebenen Konzentrationen in eir-im festen Medium, beispielsweise Agar, zum Zwecke der anfänglichen Isolierung des Organismus aus infektiösem Material verwendet werden.

Die flüssigen Nährmedien stellt man am zweckmäßigsten durch Lösen der Bestandteile in destilliertem Wasser vor dem Sterilisieren (beispielsweise durch Behändlung im Autoklav) her und fügt trst dann das gesamte, oder einen Teil des Cystelns zu, weil dieses Material instabil ist. Man arbeitet bei einer Temperatur von 35° bis 39° C. Vorzugsweise sollte zur Herstellung des sterilen, fertiggestellten Nährnindiums, das mit einer Vorkultur geimpft werden kann, das Leitermaterial während der Lösungs , Erhitzungs- ui.d Reinigungsverfahren, die der Autoklavbehandlung vorausgehen, von den anderen Bestandteilen getrennt gehalten werden, um das sterile Endmedium herzustellen.

Das erhaltene Nährmedium ist vorzugsweise eine homogene Lösung, die im wesentlichen frei von irgendeinem partikelförmlgen Bestandteil, außer den Organismen Fusiformis nodosus, ist.

Während der Kultivierung des Organismus 1st es erforderlich, anaerobe Bedingungen zu schaffen. Dies wird vortellhafterwelse dadurch erreicht, daß man eine Atmosphäre von 100% Kohlendloxid verwendet. Das Vorhandensein dieses Gases In der Atmosphäre über einem Nährmedium vor. F. nodosus Ist zur Beschleunigung der ^b5 Aufwuchsgeschwindigkeit bei wenigstens einigen Stäm men des Organismus ν m Wichtigkeit, wobei jedoch festgestellt wurde, daß die genaue Wirkung sich mit dem

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b0 verwendeten Stamm, dem Prozentsatz des verwendeten Kohlendloxids, der Kulturvergangenhett des Organismus und dem Volumverhäitnis von gasförmiger zu flüssiger Phase, ändert. Allgemein wurde gefunden, daß das Wachstum von F. nodosus umso schneller verläuft, je höher die Konzentration an Kohlendioxid ist. Ein gutes Wachstum der Organismen wurde bei Konzentrationen von 60, 80, 90, 95 und 100% Kohlendioxid bei Normaldruck erhalten, wobei der Rest der Atmosphäre gegebenenfalls im wesentlichen aus Stickstoff, Argon oder Helium bestand.

Es wurde festgestellt, daß das Gas/Flüssigkeits-Verhältnis die Wachstumsgeschwindigkeit des Organismus beeinflußt, sofern eine flüssige Kultur verwendet wird, und im allgemeinen sollte das Kohlendioxidvolumen bei Normaldruck 30%, insbesondere 20 bis 5%. des Volumens der flüssigen Kultur nicht überschreiten. Vorzugsweise liegt das Volumverhältnis des Kohlendioxids bei \0% des Volumens der Flüssigkeit.

Die Einführung von Kohlendioxid in den Gasraum Ober dem flüssigen Medium hat natürlich zur Folge, daß sich ein Teil des Gases in dem Näiirmedium löst und dessen pH-Wert gegenüber dem anfänglichen Wen senkt. Sie wird weiterhin ein Teilvakuum in einem von den angewandten Bedingungen abhängigen Ausmaß zur Folge haben. Das Kulturgefäß kann hermetisch verschlossen sein oder eine Stickstoff-, Argon- oder Helium-Quelle enthalten, um das gelöste Kohlendioxid zu ersetzen.

Es ist erwünscht, daß die Endkultur von F. nodosus-Organismen, die in eine Vakzine überführt werden sollen, ein Maximum an lebenden, gesunden Organismen enthält. Dazu ist es erforderlich, daß die Endkultur in einer möglichst minimalen Zeit aufwächst, was wiederum die Verwendung eines möglichst großen Inokulums erforderlich macht. Die Impforganismen für das Inokulum sollten einen hohen Anteil an lebensfähigen Organismen enthalten. Demzufolge ist es wünschenswert, die Anzahl der Organismen von dem Ausgangsmaterial durch eine Reihe von Kulturen progressiv zu erhöhen.

Zu diesem Zweck kann der Organismus zunächst durch Kultivierung eines geeignet infektiösen Materials unter anaeroben Bedingungen auf einem feiten Medium, das einen Leberaufschluß oder Leberemakt enthält, isoliert werden. Die weitere Kultur aus dieser ersten Kultur vird zweckmäßigerweise so lange fortgesetzt, bis der Organismus als reine Kultur erhalten wird. Dies wird im allgemeinen durch eine oder zwei Sekundärkulturen auf einem festen Medium erreicht, wobei ähnliche Bedingungen und Materialien verwendet werden, wie sie oben für die Kultivierung In flussigem Medium beschrieben wurden.

Uas feste Medium besteht geeigneterweise aus Agarplatten, die selbstverdautes Pankreas oder rohes Trypsin 1 : 250, Proteosepepton, Hefeextrakt, Natriumchlorid und Agar zusätzlich zu dem oben angegebenen Lebermateria! bei einem pH-Wert von 7,0 bis 7.8 enthalten. So kann beispielsweise e'ne Suspension von infektiösem Material aus den Klauen von Schafen, die von Schafsklauenfäule befallen sind. In einer 0.1- bis 0.4molaren Saccharoselösung auf Agarplatten geimpft und die Platten bei einer Temperatur zwischen 35° und 39" C in einer Kohlendioxid- und Stickstoffatmosphäre mehrere Tage bebrütet werden.

Wenn eine reine F. nodosus-Kultur aus dem auf festem Medium gebildeten Wachstum erhalten wird, kann diese als Inokulum für eine anaerobe, flüssige KuI-

tür des Organismus unter einer Kohlendioxidatmosphäre verwendet werden, wobei diese Kultur durch aufeinanderfolgende Sekundärkulturen fortgesetzt wird, bis ausreichend Organismen gebildet sind, um ein lindinokulum für einen Herstellungsansatz zu liefern

Aus wirtschaftlichen Gründen wird nach einer bevorzugten Ausführungsform des crfindiingsgemaßen Verfahrens so gearbeitet, daß das Volumen des flüssigen Mediums mehr als 5 Liter bis 500 Liter betrügt

Die nachfolgenden Sekundärkukuren in flüssigen Medien werden vorzugsweise unier ilen η ichlolgenden Bedingungen bei eiiiei Ansatzherstellung in it-viiiiischcri Umlang und unter Verwendung von Medien gleicher Zusammensetzung durchgeführt

Das zuletzt gebildete Medium kann in der folgenden Weise zur Bildung großer Mengen des Organismus /ur Vakzinherstellung verwendet werden. Das flüssige, ilic oben angegebenen Bestandteile enthaltende Nährmediutn wird in geeigneter Weise In große Cilaskessel oder Behälter aus rostfreiem Stahl überführt, tin Inokulum (vorzugsweise eine flüssige Kultur von F-'. nodosus. die ui;. oben beschrieber, hergestellt wurde) mit einem Volumen von 5 bis 10'i des flüssigen Nührmcdlums wird in dieses eingebracht. Die über dem Medium befindliche Luft wird vollständig durch steriles Kohlendioxid verdrängt und das verschlossene Gefäß dann 12 bis 30 Stunden Brutbedingungen unterworfen, wonach ein ausreichend dichtes Wachstum für die Vakzinherstellung erreicht ist. Lino Dichte von ungefähr 10' bis 10'" Organismen pro ml is: am vorteilhaftesten Be: \ er .'-endung optimaler Bedingungen für das Wachstur.i kann innerhalb von \2 Stunden eine zufriedenstellende Züchtuni' -.Thalien werden, wobei sich natürlich die optimale Zeitdauer mit den'; gezüchteten Stamm und den verwendeten ßedingunger ändern kann. Die Kultur wird hinsichtlich ihrer Reinhell durch ihr mikroskopisches Aussehen und hinsichtlich ihrer KuiiüfcigcfiiCnäucn. wie nachfolgend in Beispiel 1 beschrieben, geprüft.

Besonders reine Kulturen von F. nodosus werden. durch wiederholte Sekundärkultur eines festen Agarmedlums erhalten, well der Aufwuchs auf einem fester Medium langsamer ist. Man kann auch den Organlsmu;; von einem festen Nährmedium, das In Saccharoselösung suspendiert, gefriergetrocknet und unter Vakuum verschlossen ist. entnehmen. Wenn erforderlich, kann der getrocknete Organismus in Irgendeiner Nährlösung rekonstituiert und unter anaeroben Bedingungen in einem festen Medium, das einen LeberaufschluQ oder -extrakt enthält, erneut kultiviert werden. Auf diese Weise ist es möglich, für jeden Zweck einen Vorrat an F nodosus-Organismen tu bilden.

Der in der oben beschriebenen Weise hergestellte Ansatz des Organismus kann nach irgendeinem bekannten Verfahren vakziniert werden. Das zunächst erforderliche Abtöten des Organismus kann nach irgendeinem ' herkömmlichen Verfahren, wie beispielsweise durch Verwendung von Formalin [0.2 bis 1% iVolumen/V'olumen)] erfolgen. Der abgetötete Organismus kann dann zur Erhöhung des Immunitätsansprechens mit einem Adjuvans kombiniert werden. Zu diesem Zweck kann eine ' abgetötete Gesamtkultur oder der abgetötete, abgenommene Organismus das antigene Material für die Vakzine bilden. Geeignete Adjuvantien sind in der GB-PS 43 545 beschrieben. Vorteilhafterweise wird die Kultur mii einem nicht-ionischen, hydrophilen Emulgiermittel. ^h beispielsweise Polyoxyäthylensorbitanmonooleat. gemischt, anschließend in einem Mineralöl, das ein nichtionisches, lipophiles Emulgiermittel, wie Mannitmonooleat enthalt, emulglert und dann unter Bildung einer Wasser-In-Öl-Emulslon des In der wässerigen Phase dispergieren Organismus steril gemacht.

Es wird jedoch bevorzugt, zur Erhöhung der Immunitätsbildung des Antigens ein Alumlnlumadjuvans zu verwenden, wofür sich Kaliumalaun als besonders geeignet erwiesen hat. Die Vakzine enthält gegebenenfalls auch einen Bakteriostat und 0.01% (Gewicht/Volumen) Natrlumäthylmercurlthlosallcylat.

Die Vakzine kann den Tieren subkutan oder intramuskulär verabfolgt werden. Ein besonders bevorzugter Dosierungsbereich für eine mit Enuilslonsadjuvans versehene Vakzine liegt zwischen 10' und 10"' abgetöteten Organismen pro Dosis. Insbesondere zwischen 5 < Kl" und 5> 10' Organismen pro Dosis, während für eine mit .•\luminlumadjuvan> versehene Vakzine der am meisten bevorzugte Dosierungsbereich zwischen 5 χ 10" und 1 ν IM". Insbesondere zwischen 1 χ 10' und 5 '. 10"'. getöteten Organismen pro Dosis liegt, wobei die Dosis die Gesamtmenge an antlgenem Material ist, die einem Tier, wie einem Schal, in einem geeigneten Flüssigkeitsvolumen, ι B. 1 bis 2 ml für eine mit Emulsionsadjuvans versehene Vak/Ine und 4 ml für eine mit Aluminiumadiuvans versehene Vak/ine. verabfolgt wird Ls wurde als praktisch iesigestellt, eine Alutiiiiiiuiiiiidjuv.tns-Viik/ine, die 2,5 χ 10' Organismen'ml in einer einzigen 4 ml-üosis enthält, subkutan unü danach das gleiche Volumen In der gleichen Weise nach mindestens 6 Wochen zu verabfolgen. Wenn e!n längerer Schutz gewünscht wird, sollten zusätzliche Dosen in Zeitabständen von 6 Monaten verabfolgt werden.

Eine Vakzine kann auch zusätzlich antiuenes Material ■•on anderen Bakterien, z. B. F. necrophorus oder clostrl- >lia. enthalten.

Die nachfolgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung

Beispiel
(a) Isolierung der Organismen

Es wurde infektiöses Material von den mit Schafklauenfäule befallenen Schafsklauen isoliert, in einer O.25molaren wässerigen Saccharoselösung suspendiert und sofort auf Agarplatten der nachfolgenden Zusammensetzung aufgebracht:

10 ",0(VoIVVoI.)*)
1 % (Gew./Vol.)
0.2°b (Gew./Vol.)
1 % (Gew./Vol)
0.5% (Gew./Vol.)
1.5% (Gew./Vol.)

Selbstverdautes Rinderpankreas

Proteosepepton

Flefeextrakt

RinderieberaufschluB

Natriumchlorid

Agar

"1 Diese Menge enlspricht ungefähr 1.2"Vb (Gew.-Vol.) gelöster Feststoffe, die aus dem Pankreas stammen.

Der pH-Wert des festen Nährmediums betrug 7,4. Die Platten wurden bei 37' C in einer 5%-Kohlendioxid-in-Stickstoff-Atmosphäre 4 Tage lang bebrütet.

Nach Inkubation zeigten die Agarplatten kleine, flache, für F. nodosus typische, ausgedehnte Kolonien. Von den Kolonien wurden Abstriche gemacht und diese mikroskopisch geprüft, wobei ein gramnegativer Bazillus mit der charakteristischen Hantelform des F. nodosus festgestellt wurde.

Das auf den Agarplatten gezüchtete Material wurde auf weitere Agarplatten der gleichen Zusammensetzung überführt, die dann unter sonst gleichen Bedingungen 3

Tage bebrütet wurden. Das Aussehen der Kolonien, der Organismen bei nach Gram gefärbten Abstrichen und der Geruch, ähnlich dem Säugersamen, waren für F. nodosus charakteristisch. Die Identität von F. nodosus wurde durch dessen Unfähigkeit, auf Agar unter aeroben Bedingungen, oder auf einem gewöhnlichen Nähragar zu wachsen und dessen Fähigkeit, auf einem Agarboden, der 5 bU, 10% Pferdebliit, aber kein Schafsblut, enthält, zu wachsen, bestätigt. Der Organismus erzeugt Klauenfäule, wenn man Ihn auf die Interdigitale Haut von Schafen aufbringt, deren Füße aufgeweicht und einer Kotverunreinigung mit F. necrophorus ausgesetzt wurden. Der Organismus wurde mittels einer wiederholten Sekundilrkultur.wie oben beschrieben, gehalten.

Die Organismen aus der zweiten Sekundärkullur wurden von dem Agar entfernt, in O,25molarer wässeriger Saccharoselösung suspendiert, gefriergetrocknet und unter Vakuum verschlossen.

(b) Sekundärkultur des Organismus und Herstellung des Inokulums In flüssigen Medien

Die Kultivierung von F. nodosus wurde dadurch eingeleitet, dall man In O,25molarer wässeriger Saccharoselösung den wie vorstehend hergestellten, getrockneten Organismus wieder aufbaut. Ihn auf Agar ausbringt und dann diese Züchtung In ein wässeriges, flüssiges Medium der folgenden Zusammensetzung überführt:

1 "v (Gew./Vol.) Rinderleberaufschluß

10 % (Vol./Vol.) *) Selbstverdautes Rinderpankreas

1 % (Gew./Vol.) Proteosepepton

0,2 % (Gew./Vol.) Hefeextrakt

0,5 % (Gew./Vol.) Natriumchlorid

0.05% (Gew./Vol.) L-Cysteinhydrochlorid

(zugeführt als 10%ige sterile

Lösung nach Behandlung des
Mediums im Autoklav);
destilliertes Wasser bis zum
gewünschten Volumen

*) Entspricht ungefähr 1,2¹Mi Gew./Vol. gelöster Feststoffe, die aus dem Pankreas stummen.

Der pH-Wert des Mediums hatte vor der Behandlung Im Autoklav einen Wert von 7,4. Die Organismen wurden in einem kleinen Volumen des Mediums bei 37° C 24 Stunden bebrütet. Die erhaltene Kultur wurde dann in ein grölleres Volumen des flüssigen Mediums, z. B. 500 ml. gegeben, jedoch mit der Änderung, daß die Cysteinkonzentration 0,02% (Gew./Vol.) und die Konzentration an selbstverdautem Pankreas 20% (Vol./Vol.), d. h. ungefähr 2.4% (Gew./Vol.) gelöster Feststoffe aus dem Pankreas, betrug. Die weitere Bebrütung wurde unter ilhnlichen Bedingungen durchgeführt, wobei in den Luftraum über dem Medium Kohlendioxid eingeführt wurde, bis der größte Teil der Luft verdrängt war. Bei einem Kolben von 0,57 Liter wurde ca. 15 Sekunden lang Kohlendioxidgas eingeführt. Die Reinheit der Kultur wurde mikroskopisch geprüft.

(c) Kultur des Organismus in technischem Umfang

Der Inhalt eines 0,57 Liter-Kolbens wurde dann In 12,5 Liter flüssiges Medium der gleichen Zusammensetzung [ausgenommen, daß die Cysteinkonzentration 0,01% (Gew./Vol.) und die Konzentration an selbstverdaulem Pankreas wiederum 2.4% (Gew./Vol.). d. h. 20% (Vol./Vol.) betrug) eingeführt. Die Luft im Gefäß wurde durch COj ersetzt und anschließend wurde bei 37' C 20 Stunden lang bebrütet, wonach die Kultur ca. 2XlO¹* Organismen/ml enthielt. Die Reinheit der Kultur wurde mikroskopisch überprüft.

Claims

Patentansprüche:

1. Flüssiges, Leberverdauungsbrühe, -extrakt oder -infusion enthaltendes Nährmedium zum anaeroben Züchten von Fusiformls nodosus, dadurch gekennzeichnet, daß es In Lösung 0,5 bis 2 Gewichtsteile rohes Trypsin pro 100 Volutnteile Nährmedium oder 1,2 bis 3,6 Gewichtstelle selbstverdautes Pankreas, das nach bekannten Verfahren erhalten so worden 1st, berechnet als Pankreas-Feststoffe, pro 100 Volumteile Nährmedium enthält und der pH-Wert des Nährmediums 7,0 bis 7,8 beträgt.

2. Verfahren zum anaeroben Züchten von Fusiformis nodosus in einem flüssigen, gelöste Leberbestandteile enthaltenden Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man den Organismus in einem Gefäß kultiviert, welches das Nährmedium nach Anspruch 1 enthält und einen Gasraum über dem Medium aufweist, wobei der Gasraum im wesentlichen Kohlendioxid oder ein Gemisch von Kohlendioxid und Stickstoff, Argon oder Helium, das wenigstens 60 Vol.-% Kohlendioxid enthält, aufweist und das Kohlendioxid in dem Gasraum 30 VoI.-% des flüssigen Mediums nicht überschreitet.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Gasraum wenigstens 80 VoI.-% Kohlendioxid enthält, wobei der Rest des Gases, sofern vorhanden, im wesentlichen aus Stickstoff, Argon oder Helium besteht. so

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Gasraum wenigstens 95 Vol.-% Kohlendioxid enthält, wobei der Rest des Gases, sofern ein solches vorhanden ist, im wesentlichen aus Stickstoff, Argon oder Helium besteht.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Stickstoff verwendet.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Kohlendioxidvolu- -*o men zwischen 5 und 30 Vo!.-% des flüssigen Mediums ausmacht.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Kohlendloxidvolumen zwischen 10 und 20 Vol.-% des flüssigen Mediums ausmacht.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Volumen des flüssigen Mediums mehr als 5 Liter bis 500 Liter beträgt.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß In dem flüssigen Medium im wesentlichen Irgendein partikelförmlger Bestandteil außer den Organismen Fusiformls nodo-SUJ vermieden wird.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Leberbestandteil " von 0,5 bis 2 Gew.-% des Volumens des Mediums ausmacht, wobei das Gewicht auf der Basis des festen Leberbestandtelfs berechnet ist.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Leberbestandteil von 1 bis 2 ^b0 Gew.-% des Volumens des Mediums ausmacht, wobei das Gewicht auf der Basis der Leberfeststoffe bestimmt ist.

12. Verfahren gemäß Anspruch 2. dadurch gekennzeichnet, daß man selbstverdautes Pankreas verwen- ·" del, das von Rinder- oder Schafpankreas stammt.

13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das flüssige Medium in Lösung zusätzlich Natriumchlorid, Proteosepepton, Hefeextrakt, Cystein und/oder Säugermuskelautodigestion enthält.

14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei einer Temperatur von ungefähr 37° C durchgeführt wird.