DE1492255A1 - Immunisierungszubereitung - Google Patents

Description

DIS. iüll * If ΙΟ DIPi^-IMO. STAFf

PATENTANWXtTf Df. iufr, Dr. lfi. WpI-Jm. **#. *

Be/Be Anwaltg-Akte 13

4INCNf N %

MtMHTMSSI »

Umwt

The Wellcome Foundation Limited

Londeii S.W. 1 /

Diese Erfindung 1»·trifft Mm* Vakzine, die antlganes Material in einer Waae#X-in-i)l-Saulaicu enthalten.

Es ist bereit*»it aeiur»r·» Jg}ir«n bekannt, daß eine ausgezeichnet« IWglieiikelt der Twgrößeruiig der antigene^ Siricaamköit darin besteht d»» antigen· Material in einer Wa33er-in-Ol-Änil»ioa einj|i»v«rl«i»«n. Si« als die besten bekannten #aaaer-ln^l-ttüutlne verwenden rreund-iiilfeait-

tarafflnöl (Befrei f <ft&*r Drake öl üo,6 E), n mit »ine» Annjrdro&exLtol-«aoiiaoleat (Arlacel A) el«

27$ ·#··4Ι/1Ι14

_ßAD

14922δδ

Emulgiermittel und ebenso abgetötete Myeobakterien in dsm vollständigen Freund-Hilfsmittel, umfaßt. Es werden jedoch ebenso andere CIe und Emulgiermittel verwendet. Ein typisches ,/asser-in-ül-Vakizin, wie es beispielsweise verwendet wurde bei klinischen Versuchen mit Influenza-Vakzin, umfaßt eine -wässrige antigenherstellung, gemischt mit einem gleichen Volumen laraffinöl (beispielsweise Drakeol Ho. 6 Xi) selD3t iiiit einem Gehalt von 1C> Emulgiermittel (Arlaoel A).

!Trotz ihrer sehr hohen antigenen Wirksamkeit sind Wasserin-ül-Yakzine ^säoeh bisher nicht in weitem Bereieh vervven— dst v/ordan, v/egen uiierwan3chter ffewebereaktionen, die bei der In;jektion33telle auftreten. Diese üeatiomen wurdeaa, sov;ohl dem liohlenwasserstoff-ül als auch dem Emulgiermittel zugeschrieben und soweit das letztere in Betracht kommt^ seheint es* dais ümulgiernittel,, die geringe oder keine reaktion ergeben, ebenso sehr schwache antigeae Takzine erbringen,

Hs wurde nunmehr gefunden, daß die KoBzentration, sowohl der wässrigen Phase als auch des lmulgiermliitels in. einem Wasser-in-öi-Yakziii in wesentli^er f^ise %&i.uzi&x% uad die Ölmejags en1?ipr#©li^ELl. vergröieir-fe wertem -fet», «©towsii eine

maßes d#r
jedosh #jbxie dia

!Ü4S / 1114 ßAD ORIGINAL

ciiitr 3_;ϋϋ_Λ«χΐ -.anje daü antigenen lx.t-3rials ermöglicht »vird. -j±e 7i.skejiti.Vb -let; VuJczina wix'd ebauso, im Vergleic :'it OsT ui±-i\.viiscnt hohen Viskosität du¹ lisrlcömialiohen

..•.oh air iriluaiLJi ist in eineia Vaksin, v.elolies aas aiitijeu'5 ; utix'ial in einer ...;o3er-in-cl-jLiiiulsion uaifaßt_f die l.oiii: on tr ation dor ^i'.asrlisea ihase geringer als 2C/i und ciü -.ui.::3nti'ution des Änul^iermittelB stringer ala die .-ülfte, absr ./enitratcjiis ein Zehntel der wässrigen Ihase. /crau ^.;eiu3 ibt die konzentration der v/r-osrigen tliaae 1ü,j oder v/eiii^.üx', -ubei" wenigstens 1>. Die Lonzentx'ation des ]iaul{.,iei*iaittelß iet ungefähr ein Dx'ittel der wässrigen iL-iSe.

Jie erfindmi^sgeuiiißen Vakzine können in ähnliohsr </eise hergestellt v/erden au hex'köiomliciieii ifasser-in-Ll-Vakzinen durch Iiisolien einer wäasrigen Intigenhex'st ellung mit einer Dispersion von limulgiermittel in ül» unter Verwendung von Bestandteilen in den neuen Anteilen. Wahlweise kann ein Wasser-in-ul-Vakzin des herkömmlichen Typus mit ül vex-dttnnt werden, wenn der Gehalt an antigenem Material des Vakzins nach Verdünnung ausreichend bleibt zur Siohersteilung adäquater Immunität. Bs wird vorgezogen die wässrige Phase der Ülphase langsam unter Buhreit₉ zur Verringerung irgendeiner Heigung der Bildung einer ül-in-Waaser-Ifimulsion, auzugeben» Eine feigere Dispersion der wässrigen

- 4 -909845/1 $14 BAD OBIGINA!.

Phase kann durch Homogenisieren oder Vermählen in einer Colloidinühle erhalten werden, und dies kann fortgesetzt werden bis keine weitere Abnahme in der Partikelgröße erfolgt. Me Umkehrung der Emulsion zu einer Ol-in-tfasserjiaulsion oder das Zusammen Brechen der iämulsion kann stattfinden, wenn das Rühren verlängert wird oder zu heftig ist.

Das antigene Material zur Einverleibung in das Vakzin kann irgendein Antigen oder Gemisch von Antigenen, die zur Immunisierung von Wirblern erwünscht sind, seinj es kann beispielsweise im Ursprung nach von Bakterien, Yiren oder Fungi sein oder von protozdischen oder metazoischen Parasiten, oder es kann eine Herstellung von Pollen oder anderen Allergenen sein. Me Herstellung eines geeigneten antigenen.Materials ist eingehend in der Literatur beschrieben und besonders in solchen Monographien wie der Britischen Pharmacopoeia, der Pharmacopoeia der United States of America, dem Britischen Veterinary Codex und dem Dispensatory der United States of America.

Es wurde gefunden, daß die Erfindung die brauchbarste Anwendung findet bei Vakzinen zur Bekämpfung von histotoxischen clostridium-Erkrankungen, welche erwachsene Hinder, Schafe, Lämmer in vielen Teilen der Welt anfallen. Das antigene Material kann hierfür von einem oder mehreren Bakterien herrühren, welche verursachende OrgaJ-smen dieser Erkrankungen sind und Clostridium perfringena Type B,

909845/1514 _ß._n ■·■ - 5 -

BAD ORIGIN

Cl* perfringens Iyp O, Cl. ρ er fr ing ens 2yp D, Cl.ehauvoei, Ol»septioum, Öl.oedematiena und Cl.tetani einschließen. Das aus diesen Organismen erhaltene antigene Material wird oftmals kombiniert zur Bildung von Mehr-Komponeuten-Yakzinen zur Behandlung von mehr als einer Erkrankung, und die Erfindung kann ebenso für diese Mehr-Komponent-Vakzine verwendet werden, beispielsweise einem Vakzin zur Behandlung von Braxy und Blackleg mit dem Gehalt von antigenem Material, welches von Cl.septicum und Cl.chauvoei herrührt, einem Yakzin zur Behandlung von Braxy, Blackleg und Black Disease, herrührend von Cl.septicum, Cl.chauvoei und Cl.oedematiens und einem Yakzin zur Behai^lung von Braxy, Blackleg, Pulpy Kidney und letanus-Erkrankungen, herrührend von Ol.septicum, Cl.chauvoei, Cl.perfringens Typ D und Ol.tetani. Die Erfindung kann ebenso zur Herstellung von Br«abortus-Yakzinen verwendet werden, wie zu einem abgetöteten Br.abortus 45/20 Stamm-Yakzin.

Natürlich müssen die Emulgiermittel zum Binschluß in die Yakzine nach der Erfindung nicht-toxisch und mit den antigenen Bestandteilen des Yakzins verträglich sein. Lipophile Emulgiermittel sind am meisten geeignet und können nichtionische Oberflächenwirkstoffe sein, welche ein niederes hydrophiles-lipophiles G-leichgewicht von ungefähr zwischen 8 und 2 haben* Zfilliam C.Griffin, »Calculation of HLB

values of non-ionic surfactans", Journal of the Society S09845/15U

of Cosmetic Chemists (1954), Jand 5, Jeiten 249 Ό is ^V256; Üsipow, "Surface Chemistry, ^.CS Monograph 153", Jeiten 2^ bis'314, iieinhold, 19627· Mes itft die äußere 'Frenze des Bereichs der HuB-'./erte der geeigneten "jkaul^ieriaittel, und eine bevorzugte Grenze von IILB-./erten liegt von 2 bis δ mit einem optimalen Usreicli ν,οη i bia 5. Unter den geeigneten lipophilen Emulgiermitteln sind zu ermähnen di- und tri-Bster von mehrwertigen Alkoholen und Fettsäuren, oxydierte Fettüle und Teilester von gewöhnlichen Fettsäuren, zum Beispiel palmitin-, iiaurin-, Stearin- und Oleinsäuren mit von Sorbitol oder Llannitol herrührenden Hexitol-Aniiydriden. .Beispiele spezifischer Emulgiermittel 3ind Uaniiid monoole/b'at (Arlacel A, II13 4,3), Sorbitan-monooleat (arla cel 80, HLB 4,3)» Sorbitan-monoatearat (Arlacel 60, HiB 4,7) und Sorbitan-sesquioleat (Arlacel G, HLB 3,7).

Es kann irgendein nioht-toxiaohea ul, pflanzlicher oder mineralischer Herkunft, das mit dem antigeneu Ilaterial verträglich ist, in den Vakzinen dieser Erfindung verv/endet werden, und dies kann "beispielsweise sein Paraffinöl (Bayol F oder Drakeol Ho.6 R), Baumwolls^atcl, Erdnußöl, Leichtgewichtmineralöl (Marcol GrZ), .Leichtöl (höher als Kerosin 3ied. Petroleum-Fraktion)(mineral seal oil) oder Siliconöl (G.E.).

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

909845/15U _ 7

BAD

^ 14922b5

Beispiel 1 - ιτ,Ιρ;^ IJLdney Yakzin.

ώίη toxi^ensr otaaa von Clostridium perfringens Typ D v/urde in eine^i flüssigen Lledium, miter Bedingungen zur Sicherβteilung adäquater Herstellung von Bpsilon-ioxin und/odar Irototonin gezüchtet. Die HuItür wurde mit Form aldehyd uahandelt aur Umwandlung des Epsilon-Toxins und 1-rototorins in iüpsilon-toxoid_f um das Produkt nicht-to- :ciacli ^e^enüber Mäusen au machen. Die Bakterien wurden entfernt, uud das i'iltrat viurde dann verdünnt zur Bildung von vier \?£ssrigeu antigenen Herstellungen, deren Konzen trationen von Clostridium perfringens Bpsilon-toxoid im Yerhältnie von 1:3:9s27 waren. Diese Herstellungen erxüllten die Erfordernisse des British Veterinary Godex im Linl)liok auf Sicherheit, Sterilität und Freisein von Xoxidität.

Jede der wässrigen ^ntigenhers teilung en (30 leile) v/urde in eine Hasser-in-ül-lDmulsion des lierkömalichen lyps verarbeitet durch tlisohen mit einem 3-e.j.sch von "j5ayol F" liiiieralcl (5915 !'eile) und "Arlacel A" Hannid-monooleat (10,5 ϊ-eile). Die drei konzentrierteren Emulsionen, deren Anti^engehalte im Verhältnis von 3:9:27 waren, v/urden dann 3-fach, beziehungsweise 9- und 27-fach mit "Bayöl F" ilineralb'l, unter Bildung von Vakzinen nach der vorliegenden Erfindung, verdünnt, wobei alle den gleichen Antigengeu.alt, ;i!>3r unterschiedliche Anteile an wässriger Phase,

90984S/15U _{; T}'?'-

Ol und Emulgiermittel hatten. Diese Takeln· wartn dor her» ktJmml ionen Emulsion, im Hinbliok auf Gewebereaktion an der 'In^ektionasteile, weit überlegen} diese Reaktion nahm mit Zunehmender Verdünnung der wässrigen Phase und Emulgiermittel mit 01 ab. Ihre antigene Potent blieb andererseits unbeeinträohtigt. Dies wurde durch Untersuchungen der antigenen Wirksamkeit bei «wei Gruppen von 10 Mäusen erläutert, wobei jede derselben «wei 0,5 ml subkutaue Injektionen, vier Woohen auseinander, von einer Emulsion erhielten und die umlauf enden Antikörper H lage später, nach Zuae*eaengießen dee Blutes Ton jeder Gruppe, gemessen wurden. Die drei verdünnten Smuleionen wurden dann mit der zuletet konzentrierten unrerdünnten, herkömmlichen Emulsion verglichen. Sie Srgebnisee sind in der nachfolgenden Tabelle enthalten, in welcher der Titer wenigstens so groß ist wie der angegebene Wert, aber geringer als das Zweifache dieses Wertes.

Zubereitung von Pulpy Antikörper ^dVk^ liter [Μ

Bayöl Arlaoel wässrige Gruppe Gruppe I A Phase 1 2

59,5*	10	2	»5*	30,0*	10	20
86,5*		,5*	10,0*	20	20
95,5*	1	.2*	3,3*	20	40
98,5^	0	,4*	1,1*	10	10
BeisDiel		Blaok Diseaee-Vakzin

Bin tozigener Stamm von Clostridium oedematiens Typ B wurde in einem flüssigen Medium gezüchtet· IiIe Kultur wurde dann 9098A5/15U _

^? BAD ORIGINAL

- 9 - /;-:·.■■/■ : ■■"·"■

mit Formaldehyd Dehandelt bia dae Produkt steril und niohttoiiaoh «ar. £1» Bakterien wurden durch filtrieren entfernt, und das 111trat wurde duroh Ausfällen mit Ammonium- · sulfat konjtntrlert, nobel dl« Ausfällung in Wasser dispergiert und zur Entfernung von Aamoniua-sulfat dialyslsrt wurde. Das sieh ergebende Konssntrat wurde dann verdünnt unter Bildung von dr·! wässrigen Antitfenherefcellungen, deren Konsentrationen von Clostridium oedeoatiena alpha-Toxoid In dsm Verhältnis 1O»9 wartn. Diese Hera tellungen genügten den Erfordernissen des British Veterinary Oodsz im HinblioJt auf Sloherhtlt, Sterilität und Preiaein von abnormaler Soxidltät.

DIs am meisten verdünnte, vtäesrig* Antlgsnherstsllung (jO Tei-le) wurde in eins Wasssr-in-ül-Smulaion des htrkömmliohsn Typus des llieohena mit eine» Semisoh von "Bayöl f" Mineralöl (3915 Seile) und "Afflaoel Δ" llannid-monoolsat (10,5 Seils) hergestellt und wurde dann 3~faoh mit "Bayol tⁿ Uinerslöl, unter Bildung eines Yaksins naoh der vorlisgenden Erfindung, verdünnt. Ander· Vakalne naoh der vorliegenden Erfindung, wobei alls den gleichen Antigengshalt, aber unteraoliiedliohs Anteile wäaarigs Jhaee, Ol und Stulglermittel hatten, wurden duroh liulgiersn der drei wä^arlgen Antigenherstellungen (deren Antigsngehalte im Verhältnis von 1 j3*9 waren) hergestellt duroh Hisohen ^ron 1ü Seilen, "3,3 feilen und 1,1 Seiisn, jeweils beziohu^_tla,voiae, mit Os-Uilochen von "üayol £'" Hineralöi (36,5 Teile, 95,5 Teile und

909845/1514 - to

- ίο -

98,5 Teile, jeweils beziehungsweise) und "Arlaoel A^M Mannid-monooleut (3,5 Teile, 1,2 !Heile und 0,4 Seile, je-weile beuieLLim^B.velae). Diese Vakzine waren einer herkömmlichen Emulsion, im uinbliok uuf Jewabereaktion an der Injektionnsteile, .-/eaentlioh Überlegen; iieaa Reaktion nahm ab bei Zunehm3u der Verdünnung in der «Rurigen Phase und des Einulgieruiibtele mit 01. Ihre antigene lotenz verblieb andererseits unbeeinträchtigt· In der n&ohfol&enden Tubelle werden beispielsweise die Ergebnisse von antigenen firkaa-keit junteruaohongen bei Gruppen van 10 lUiusen angegeben, wobex jede Gruppe zwei 0,5 ml subkutane Injektionen vier loohen auseinander von einer der ÜtnuluIonen (eile hatten den gleiohen nnti^engehalt) erhielten, wobei die zirkulierenden Antlkürpur 14 Sage sptiter, üuroh Zusaueengieflen doa Bluts von jed'jr Gruppe, tjemeauen wurden. Bei diesen Ergebnissen iut dar liter wenigstens 00 troß i.la der angegebene Wert, aber geringer als das Zweifaohe dieses Wertes.

2ubereitung von Antikörper

Bluok plseaja-Takain !lter (a/ml) Bayöl t Arlaoal A wässr.ihaae Gruppe 1 Gruppe 2

Β6,5;ί 3,5;ί 10,0^ (α) 100 40

Bj,5;» 5|5,< 1O,Oi» (to) 40 40

95ι5,"ί 1»2>» 3»'Jf» (b) 40 20

¹JB,5j5 0,4;ί 1·1<ί (b) 20 · 20

( .) barges bellt duroh Verdi mian einer hsi'hümmliohen Kmul^ion lalt ül

o teilt dttroh iteiUgioreti der Bestandteile un—

niUtüloar.

^{909845/1514 1}

U922S5

ieiapiel 3 - Multiple«! Vakzin fiegen Cloatridla

ISin toxigener 3taJB& von Clootrldia perfrin^ens Xyp B wurde in- einam flüssigen Eediua gezüchtet zur Sioheratellung ad- ; 'iunter Eex*etelluil€ von Beta- und Epoilon-Toxinan und/oder I'rotctoxin. Die Kultur wurde mit Formaldehyd behandelt bia das lrodukt steril und nioht-toxiaoh gegenüber Lläuuen war. Die Bakterien wurden entfernt unter Bildung einer wässrigen Herstellung axt dem Gehalt Ton Clostridium perfrin-Beta- und Speilon-Toxoiden (Laaui-Dyaenterie-Vakzin).

üin tcxigener Stamm von Clostridium perfringene Typus 0 «vurdu in ein am flüusigen LIedium, zur Sichere teilung adäquater darstellung von 3eta-Toxin, gezüchtet. Die Kultur wurde mit Formaldehyd bellaadelt eis das produkt ateril und nichttoxisoh bei iiäusen war> Die Bakterien wurden, zur Bildung uiner v/äosrigen Herstellung mit dem Gehalt von Clostridium pöriringene Beta-Tokoid (struck Vaksin) entfernt.

Ein i3ueril3.5 FiItrat von einer Kultur von Clostridium tede^i Gehalt von Tetanua-üoxin, v/urde mit Formaldehyd b3i 37⁰O mehrere kochen behandelt und dann duroh Ultrafiltrieren UQ^ Ausfällung mit Ilaliuii-pLcsphat gereinigt lüitür Bildu , einer wliasrigen Herstellung von 2etanua-To-χυίά, das dtn Erfordernissen der Britiah Pharmcopoeiu entsprach .

Hin toxigener Stamm von Clostridium septicum v;urde in einen 90984S/15U -in -

ORIGINAL

flüssigen Medium, unter Bedingungen der Sioherstellung udäquater Herstellung von Toxin» gezüchtet. Die Kultur wurde dann mit Formaldehyd behandelt bis dae Produkt steril und gegenüber Musen nicht-toxieoh war. Die Bakterien wurden entfernt unter Bildung einer wässrigen Herstellung von Clostridium septioum-Toxoid (Eroxy Yakein).

Bin toxigener Stumm von Clostridium ohauvoei wurde in einem flüssigen Medium gezüchtet unter Bedingungen.but Sioher-■tellung adäquater lleroteilung von foxin. Die Kultur wurde dann mit Formaldehyd behandelt bis das Produkt steril und gegenüber Mäusen nicht-toxisoh war. Die Bakterien wurden entfernt unter Bildung einer wäearigen Herstellung mit dem Gehalt von Clostridium ohauvoei-Toxoid (Blaokleg-VskEin)

Wässrige Herstellungen mit den Gehalt von Beta- unt Ipsilon-Toxoiden von Clostridium perfringene (von Typ B, 0 und D) und den Toxoiden von Clostridium eepticuu und Olostridium oedematienSf Jede erhalten wie oben beschrieben oder in den Beispielen 1 und 2, und konzentriert, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden zussjweiigeiiisaht mit wässrigen Herstellungen von Setanus-foxoid und Clostridium chauvoei-Toxoid, «ie oben besehrieben,erhalten wurde. Dieses Gemisch

word» ^Ia wässrige Phase (30 Teile) gemischt Bit eines Gemisch Ton «Bayol P" Mineralöl (56 Teile), «irlaeel A" Mannid-monooleat (iO,5Teile) und Tals·" Absorptionsbase (3,5 üille) oder mit eine* GeMieoh m -Enrol F"

909845/1SU - 13 ^

BAO ORJGiNAL

(59,5 Teile) und "Arlaoel Λ" Mannid-iuonooleat (10,5 Teile). ("Palba" ist ein Saulalonaatabillsator, welcher Bienenwuohs, Paraffinöle verschiedener Viskositäten und au· Xa- ' nolin extrahiert· Oxioholeaterine enthält.) Die ei oh ergebenden Emulsionen wurden dünn 4-faoh mit "Bayöl Ϊ" Mineralöl -verdünnt unter Bildung von erfindungsgemäßen Vakainen.

Diese Yakeine wurden, hinniehtlich dor antigeneu iotena, bei Koninohen, Meereohweinohen und ochaien untersucht, und es wurde gefunden, daJ sie Sohutz gegen die gesamten sieben !Erkrankungen, für dl· aie bestimmt waren (Laiim-Dysenterie, Struck, Pulpy Kidney, Tetanus, Braxy, Blaokleg und Black Disease) im überaohuß gegenüber den Brforderniaaen dee British Veterinary Oodex, gaben. Ihre Stabilität war in Untersuchungen, bei 2⁰U und 37°O zufriedenstellend· Sowohl Viskosität als auch Gewebwreaktion waren geringer als bei der niohtverdünnten Emulaion.

Beispiel 4

Zu einer Suspension (16 ml) von Äthanol abgetöteten Bruoella abortus 43/20 Stamm in destilliertem Wasser mit einer Trübung von 230 Internationalen Einheiten, wurde Arlaoel A (4 ml) augegeben und die sioh ergebende Suspension mit 100 ml Bayol 55 amulgiert. Yor der Verwendung wurde die hergestellte Baiulaion mit einem weiteren Volumen Bayöl 35 (Θ0 al) Tertünnt.

- 14 -909845/1514 BADOfUGiNAl

Dieses Vakzin wurde, hinsichtlich der anti^uueju. Potenz* Dei Meerschweinchen geprüft, und eo y/iunL« gefunden, daß ea 3ohutz gegen Befall durch einen virulenten Jtaium Brucelli* abortua No.54-I- verleiht. Bei sieben von neun uleereohweinohön wurde nachfolgend gefunden, du3 sie kuine 3ruoella ibortua in ihi'er LIiIz hatten. Eine nicLt^-jimpfte Lontrollgruppe, mit dem gleichen virulenten St.Lun bjfallen, zeigte β oh w ere Kolonie bildung bei d.jr IaIz uLler Ii ere mit einem !Iittel von 450 ι 10 Crganiaaen i>ro h.ila.

Die ütabilität des Yalczine war zufriedenstellend bei Jnterauohun^en bei 2⁰C und 37°C. auwohl Yiskoeitut als uuch Gewebereaktion waren geringer als bei eitnr unverdünnten Jmuleion (^a gieiohen Valczina.

BAD Qf^GlNAL 909845/1514

Claims (2)

-U922Ö5 a t e η t ι. η υ ρ r Ii ο h θ

1. Verfahren zur Uorateilung eines Wanser-in-ül Emulei-Yakuinc diu'oh Emulgieren eines CIb, eines Emulgiermittels und einuj wäasrijen Antigene dadurch gekennzeichnet, daw in dom Vakzin die ..onzentration der wässrigen !hase ^erin^er als 2C/r> und die konzentration dos Emulgiermittels geringer als die Hälfte, aber wenigstens ein Zehntel derjenigen der w::aari_oan jliaae, iat.

2. Verfuhren gejaaß Anapruoh 1 daduroh gekennzeichnet, daß das Emulgiermittel ein nicht-ionisches oberflUohenalctivea Mittel ist mit einem hydrophilen-lipophilen Gleiohgewioht von 3 bis 5 einschließlich, das Antigen ausgewählt ist aus der Klasse, bestehend aus Antigenen von 01οatridium und Bruoβlla, die Eonsentration der wässrigen Phase von 10,ό bis 1?t einschließlich von dem Vakzin und die Konzentration dee Emulgiermittels ungefähr ein Drittel derjenigen der wässrigen Phase ist.

BAD ORlG»NAU 909845/15U