DE69928763T2

DE69928763T2 - Adjuvanzien zur Verwendung in Impfstoffen

Info

Publication number: DE69928763T2
Application number: DE69928763T
Authority: DE
Inventors: Don Alan Groton Dearwester; Leroy Allen Groton Swearingin; David Stewart Philidelphia Roberts
Original assignee: Pfizer Products Inc
Current assignee: Pfizer Products Inc
Priority date: 1999-01-29
Filing date: 1999-12-23
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2019-12-24
Also published as: NZ513202A; US6572861B1; DK1023904T3; JP2000219636A; BRPI0000126B1; CN1449825B; JP4785365B2; CA2296244C; DK1616573T3; ES2374628T3; CY1105684T1; ES2251164T3; PT1616573E; US20030175309A1; EP1616573B1; TW585777B; AU6537299A; US20050058667A1; ATE533504T1; BR0000126A

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf immunologische Adjuvanzien. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf Adjuvanzien, die eine Öl-in-Wasser-Emulsion und ein oberflächenaktives Mittel umfassen. Die erfindungsgemäßen Adjuvanzien sind in einer Vielzahl von Impfstofformulierungen, einschließlich Impfstoffen, die bakterielle oder virale Komponenten umfassen, nützlich.
Hintergrund der Erfindung
Die Erzeugung der Immunität gegen infektiöse Organismen ist ein starkes Hilfsmittel bei der Krankheitsbekämpfung. Diese Antigene, die die Immunität gegen Infektionen induzieren, sind als Immunogene bekannt. Der schützende Antikörper, den sie induzieren, kann mit anderen natürlichen Abwehrkomponenten zusammenarbeiten, um den Infektionsprozeß zu inhibieren, oder sie können schädliche Produkte des infektiösen Organismus wie Toxine neutralisieren.
Ein wirksames Mittel zur Verbesserung der Antikörperantwort ist die Verwendung eines Adjuvans. Daher ist ein Adjuvans in einem Impfstoff als Additiv oder Vehikel enthalten, um die Antwort des Antigens zu verbessern. Ein Adjuvans kann durch unterschiedliche Mechanismen fungieren, einschließlich (1) Einfangen des Antigens in dem Körper, um eine langsame Freisetzung zu verursachen, (2) Ziehen der Zellen des Immunsystems zu der Injektionsstelle, (3) Stimulieren der Zellen in dem Immunsystem zur Vermehrung und Aktivierung, und (4) Verbessern der Antigendispersion in dem Körper des Empfängers.
Eine Vielzahl von Mitteln mit verschiedenen chemischen Eigenschaften sind als Adjuvanzien verwendet worden, einschließlich Wasser-in-Öl- und Öl-in-Wasser-Emulsionen, Mineralsalze, Polynucleotide und natürliche Substanzen. Ein Adjuvans, bekannt unter dem Markennamen AMPHIGEN^TM, wird in US-Patent Nr. 5,084,269 beschrieben. Das AMPHIGEN^TM-Adjuvans besteht aus entöltem Lezithin, das in einem Öl gelöst ist, normalerweise Leichtpa raffin. In Impfstoffpräparaten wird AMPHIGEN^TM in einer wässerigen Lösung oder Suspension des immunisierten Antigens als eine Öl-in-Wasser-Emulsion dispergiert.
Probleme wurden beobachtet, wenn ein AMPHIGEN^TM-Adjuvans gemäß dem obigen US-Patent Nr. 5,084,269 verwendet wurde. Beispielsweise wird das Lezithin in dem AMPHIGEN^TM nicht genügen, um eine stabile Emulsion des Öls herzustellen, was zu einem Pool oder Depot an Öl in den injizierten Geweben führt. Mineralöl kann durch das Tier nicht verstoffwechselt oder entfernt werden. Infolgedessen wird das Öl eine Quelle für ernste chronische Entzündungen und Vernarbungen sein. Das direkte Emulgieren des AMPHIGEN^TM in dem Antigenpräparat trägt das Risiko der Schädigung des Antigens. Wenn sich ebenso die gewünschte Emulsion nicht bildet, muß das wertvolle Antigen verworfen werden.
Ein Adjuvans, das in Impfstoffen für Tiere, einschließlich Menschen, nützlich ist, das wirksam ist und die obigen Probleme löst, würde deshalb stark wünschenswert sein.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf ein Adjuvans, das zur Verbesserung der Immunantwort eines Tiers auf ein Antigen nützlich ist. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Adjuvans, das eine Öl-in-Wasser-Emulsion in einer Impfstoffzusammensetzung bilden kann. Die Erfindung bezieht sich ebenso auf ein Adjuvans, das, wenn es in einer Impfstofformulierung verwendet wird, minimale Entzündung und Vernarbung an der Impfstelle verursacht. Die Erfindung bezieht sich außerdem auf eine Impfstofformulierung, die ein erfindungsgemäßes Adjuvans enthält. Schließlich bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Verwendung eines erfindungsgemäßen Adjuvans bei einer Impfung.
In einer Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Adjuvans ein Lezithin, ein Öl und ein amphiphiles oberflächenaktives Mittel, das das Adjuvans emulgieren kann, beispielsweise ein oberflächenaktives Mittel wie Tween oder Span. In einem anderen Aspekt ist das oberflächenaktive Mittel Tween 80, Tween 85, Span 80 oder Span 85.
In einer anderen Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Adjuvans ein Lezithin, ein Öl und zwei amphiphile oberflächenaktive Mittel, die das Adjuvans oder eine Impfstoffzu sammensetzung, die das Adjuvans enthält, emulgieren können. In einem bevorzugten Aspekt wird eines der zwei oberflächenaktiven Mittel überwiegend in der wässerigen Phase gefunden, beispielsweise Tween 80, und das andere oberflächenaktive Mittel wird überwiegend in der Ölphase gefunden, beispielsweise Span 80.
Ein Lezithin ist ein Phosphatid. Rohe Präparate von Lezithin können Triglyceride umfassen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung umfaßt "Lezithin" sowohl gereinigte als auch ruhe Präparate. In einem bevorzugten Aspekt ist das Lezithin entölt.
Geeignete Öle umfassen ein Mineralöl, beispielsweise DRAKEOL^TM Leichtmineralöl.
In einer weiteren Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Adjuvans eine wässerige Trägerlösung, beispielsweise einen physiologisch akzeptablen Puffer, Wasser oder eine Kochsalzlösung.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Adjuvans ein Lezithin, ein Mineralöl, zwei amphiphile oberflächenaktive Mittel und eine wässerige Trägerlösung (beispielsweise physiologische Kochsalzlösung).
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt einen Graph dar, der die Verteilung der Tröpfchengrößen einer Emulsion, die wie oben beschrieben hergestellt wurde, angibt. Die Linien (a) und (b) geben an, daß etwa 94% der Tröpfchen einen Durchmesser von 1 μm oder weniger aufweisen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf ein Adjuvans, das zur Verbesserung der Immunantwort auf ein Antigen nützlich ist. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein öliges Adjuvans, das eine Impfstofformulierung emulgieren kann. Außerdem bezieht sich die Erfindung auf ein Adjuvans, daß, wenn es in einer Impfstofformulierung verwendet wird, im wesentlichen die Entzündung und Vernarbung an der Impfstelle vermeiden kann, typischerweise von Impfstoffen, die Mineralöl enthalten. Die erfindungsgemäßen Adjuvanzien umfassen ein Lezithin, ein Öl und ein amphiphiles oberflächenaktives Mittel zum Emulgieren des Adjuvans oder einer Impfstoffzusammensetzung, die das Adjuvans enthält.
Die Erfindung basiert teilweise auf der Entdeckung, daß das Zugeben von etwa 1,5 Vol.-% (d. h., 1,5% Volumen pro Volumenkonzentration, erhalten beispielsweise durch Mischen von 98,5 Volumen des Impfstoffes, umfassend das Adjuvans mit 1,5 Volumen des amphiphilen oberflächenaktiven Mittels) bis 3,5 Vol.-% eines amphiphilen oberflächenaktiven Mittels zu einem Impfstoff, der ein Adjuvans enthält, wie in US-Patent Nr. 5,084,269 beschrieben, wirksam ist, um eine Impfstoffzusammensetzung, die mit einem solchen Adjuvans formuliert ist, ausreichend zu emulgieren, und um die Reizung der Injektionsstelle des geimpften Tieres zu minimieren.
In einer Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Adjuvans ein Lezithin und ein Öl und ein amphiphiles oberflächenaktives Mittel. In einer Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Adjuvans ein Lezithin und ein Öl und ein amphiphiles oberflächenaktives Mittel, das eine Impfstoffzusammensetzung, die mit einem erfindungsgemäßen Adjuvans formuliert ist, emulgieren kann. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden zwei amphiphile oberflächenaktive Mittel in einem erfindungsgemäßen Adjuvans verwendet, beispielsweise ein oberflächenaktives Mittel wie Tween und Span.
Ein bevorzugtes Adjuvans, das hierin als „Adjuvans Nr. 1" bezeichnet wird, umfaßt etwa 2 Vol.-% Lezithin, etwa 18 Vol.-% Mineralöl und etwa 8 Vol.-% oberflächenaktives Mittel (beispielsweise etwa 5,6 Vol.-% Tween 80 und etwa 2,4 Vol.-% Span 80), wobei das übrige Volumen eine Kochsalzlösung ist. In einem bevorzugten Aspekt wird eine Impfstoffzusammensetzung formuliert, die ein Antigen bei einer Konzentration von etwa 75 Vol.-% und ein Adjuvans, vorzugsweise Adjuvans Nr. 1, bei einer Konzentration von etwa 25 Vol.-% der Impfstoffzusammensetzung umfaßt. Alle Konzentrationen, die hierin in Prozent bereitgestellt werden, werden in Volumen pro Volumen angegeben, wenn es der Zusammenhang nicht anders hergibt.
Oberflächenaktive Mittel, die in dem erfindungsgemäßen Adjuvans nützlich sind
Oberflächenaktive Mittel, die für das erfindungsgemäße Adjuvans nützlich sind, sind amphiphil und für die Tiermedizin oder medizinische Verwendung akzeptabel. Ob ein spezielles oberflächenaktives Mittel für die medizinische oder tiermedizinische Verwendung akzeptabel ist oder nicht kann durch den Fachmann bestimmt werden. Ein oberflächenaktives Mittel ist amphiphil, wenn ein Teil des oberflächenaktiven Moleküls hydrophob ist und ein Teil hydrophil ist. Siehe US-Patente Nr. 5,690,942; 5,376,369; 4,933,179 und 4,606,918, die oberflächenaktive Mittel beschreiben, die in dem erfindungsgemäßen Adjuvans verwendet werden können. Beispiele von oberflächenaktiven Mitteln, die in dem erfindungsgemäßen Adjuvans nützlich sind, umfassen ein oberflächenaktives Mittel wie Tween und ein oberflächenaktives Mittel wie Span sind aber nicht darauf beschränkt. Die oberflächenaktiven Mittel Tween und Span umfassen Monolaureat (Tween 20, Tween 21, Span 20), Monopalmitat (Tween 40, Span 40), Monostearat (Tween 60, Tween 61, Span 60), Tristearat (Tween 65, Span 65), Monooleat (Tween 80, Tween 81, Span 80) und Trioleat (Tween 85, Span 85), sind aber nicht darauf beschränkt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Tween 80, Tween 85, Span 80 oder Span 85 verwendet.
Es ist bevorzugt, daß ein oberflächenaktives Mittel, das in dem erfindungsgemäßen Adjuvans nützlich ist, amphiphil ist und einen Hydrophilen-lipophilen-Gleichgewichtswert („HLB") aufweist. der vorzugsweise mindestens etwa die Hälfte der Summe der HLB-Werte von allen anderen Komponenten des Adjuvans ist. Stärker bevorzugt weist das oberflächenaktive Mittel einen HLB-Wert auf der etwa die Hälfte bis etwa die doppelte Summe der HLB-Werte von allen anderen Komponenten des Adjuvans ist. Stärker bevorzugt weist das oberflächenaktive Mittel einen HLB-Wert auf, der etwa derselbe wie der HLB-Wert von allen anderen Komponenten des Adjuvans ist. Die HLB-Werte sind ohne weiteres für oberflächenaktive Mittel, Lezithine, Öle und Trägerlösungen erhältlich, oder können, wenn notwendig, durch Routineexperimente bestimmt werden. Siehe beispielsweise US-Patente Nr. 4,504,275 und 4,261,925 und den hierin bereitgestellten Referenzen.
Amphiphile oberflächenaktive Mittel, die in dem erfindungsgemäßen Adjuvans nützlich sind, weisen HLB-Werte von etwa 2 bis etwa 20, vorzugsweise etwa 3 bis etwa 17 auf. Verfahren zur Bestimmung des HLB-Wertes von speziellen oberflächenaktiven Mitteln sind in der Technik bekannt. Siehe beispielsweise US-Patente Nr. 5,603,951; 4,933,179 und 4,606,918, die die oberflächenaktiven Mittel mit speziellen HLB-Werten beschreiben.
Die Konzentration eines oberflächenaktiven Mittels in einer Impfstoffzusammensetzung, die mit dem erfindungsgemäßen Adjuvans formuliert wurde, beträgt etwa 1,5 bis 3,5 Vol.-%, stärker bevorzugt etwa 1,5 bis etwa 3 Vol.-%, stärker bevorzugt etwa 1,5 bis etwa 2,5 Vol.-%, und am stärksten bevorzugt etwa 2 Vol.-%. Wenn mehr als ein oberflächenaktives Mittel verwendet wird, beträgt die Summe der Konzentrationen von allen oberflächenaktiven Mitteln, die in einer Impfstoffzusammensetzung verwendet werden, die mit dem erfindungsgemäßen Adjuvans formuliert wurde, ebenso etwa 1,5 bis 3,5 Vol.-%, stärker bevorzugt etwa 1,5 bis etwa 3 Vol.-%, stärker bevorzugt etwa 1,5 bis etwa 2,5 Vol.-%, und am stärksten bevorzugt etwa 2 Vol.-%.
Die Konzentration eines oberflächenaktiven Mittels in dem erfindungsgemäßen Adjuvans hängt ebenso von der Konzentration ab, bei der das Adjuvans in einer Impfstoffzusammensetzung verwendet wird. Beispielsweise kann eine Impfstoffzusammensetzung mit dem erfindungsgemäßen Adjuvans formuliert werden, so daß etwa 25% des Volumens der Impfstoffzusammensetzung das Adjuvans ist („25-%-Adjuvans") und der Rest etwa 75% der anderen Komponenten, beispielsweise die Antigenzusammensetzung ausmacht. In einem Aspekt beträgt die Konzentration des oberflächenaktiven Mittels in einem 25-%-Adjuvans etwa 6 bis etwa 14 Vol.-%. Stärker bevorzugt beträgt die Konzentration des oberflächenaktiven Mittels in einem 25-%-Adjuvans etwa 6 bis etwa 12 Vol.-%, stärker bevorzugt etwa 6 bis etwa 10 Vol.-% und am stärksten bevorzugt etwa 8 Vol.-%.
Die Konzentration des oberflächenaktiven Mittels in dem erfindungsgemäßen Adjuvans hängt von verschiedenen Faktoren ab. Je höher beispielsweise die Konzentration an Öl in dem Adjuvans ist, desto mehr oberflächenaktives Mittel ist erforderlich, um eine Impfstoffzusammensetzung, die mit dem erfindungsgemäßen Adjuvans formuliert wurde, zu emulgieren. Ein anderer Faktor, der zur Bestimmung der Konzentration eines oberflächenaktiven Mittels nützlich ist, ist die Konzentration eines Lezithins. Je höher die Konzentration eines Lezithins in dem Adjuvans, desto weniger oberflächenaktives Mittel kann für die Emulgierung erforderlich sein.
Wenn das erfindungsgemäße Adjuvans in einer Impfstoffzusammensetzung bei einer Konzentration von weniger als 25 Vol.-% verwendet wird, muß die Konzentration der Adjuvanskomponenten in dem Adjuvans folglich erhöht werden. Der wässerige Träger ist eine Ausnahme, da der Träger immer das Volumen umfaßt, das durch alle anderen Komponenten unbesetzt bleibt; wenn sich daher die Konzentration von allen Komponenten bis auf den Trä ger erhöht, wird sich die Konzentration des Trägers in dem Adjuvans verringern und umgekehrt. Wenn beispielsweise das Adjuvans bei einer Konzentration von etwa 12,5 Vol.-% in einer Impfstoffzusammensetzung verwendet wird, beträgt die Konzentration der Komponenten in dem Adjuvans etwa die doppelte Konzentration der Komponenten in einem 25-%-Adjuvans. Wenn ebenso das erfindungsgemäße Adjuvans in einer Impfstoffzusammensetzung bei einer Konzentration verwendet wird, die über 25 Vol.-% liegt, muß die Konzentration der Komponenten in dem Adjuvans folglich verringert werden. Wenn beispielsweise das Adjuvans bei einer Konzentration von etwa 50 Vol.-% in einer Impfstoffzusammensetzung verwendet wird, beträgt die Konzentration der Komponenten in dem Adjuvans etwa die Hälfte der Konzentration der Komponenten in einem 25-%-Adjvuans.
In einer Ausführungsform können zwei amphiphile oberflächenaktive Mittel in dem erfindungsgemäßen Adjuvans verwendet werden. Vorzugsweise würden die zwei oberflächenaktiven Mittel ein oberflächenaktives Mittel umfassen, das in einer wässerigen Phase mehr konzentriert werden würde als in einer Ölphase des Adjuvans („hydrophiles oberflächenaktives Mittel"), und ein oberflächenaktives Mittel, das in einer Ölphase des Adjuvans mehr konzentriert werden würde („liphophiles oberflächenaktives Mittel"). Beispielsweise würde sich Tween 80 mehr in einer wässerigen Phase konzentrieren, und Span 80 würde sich mehr in einer Ölphase konzentrieren. Ein bevorzugtes hydrophiles oberflächenaktives Mittel weist einen HLB-Wert von etwa 9 bis etwa 20 auf, und ein bevorzugtes lipophiles oberflächenaktives Mittel weist einen HLB-Wert von etwa 2 bis etwa 9 auf. Siehe US-Patente Nr. 5,603,951; 4,933,179 und 4,606,918, die oberflächenaktive Mittel mit HLB-Werten in beiden Bereichen, die für das erfindungsgemäße Adjuvans nützlich sind, beschreiben.
Wenn zwei oberflächenaktive Mittel in dem erfindungsgemäßen Adjuvans verwendet werden, beträgt die Gesamtkonzentration beider oberflächenaktiver Mittel, die in einer Impfstoffzusammensetzung vereinigt sind, die mit dem erfindungsgemäßen Adjuvans formuliert wurde, etwa 1,5 bis 3,5 Vol.-%, stärker bevorzugt etwa 1,5 bis etwa 3 Vol.-%, stärker bevorzugt etwa 1,5 bis etwa 2,5 Vol.-% und am stärksten bevorzugt etwa 2 Vol.-%. Die Konzentration von jedem der zwei oberflächenaktiven Mittel, die in dem erfindungsgemäßen Adjuvans verwendet werden, kann sich voneinander unterscheiden. Wenn beispielsweise ein hydrophiles oberflächenaktives Mittel und ein lipophiles oberflächenaktives Mittel verwendet werden, beispielsweise Tween 80 und Span 80, kann die Konzentration von Tween 80 etwa 1,2X bis etwa 5X, stärker bevorzugt etwa 1,5X bis etwa 4X, stärker bevorzugt etwa 1,8X bis etwa 3X. stärker bevorzugt etwa 2X bis etwa 2,5X und stärker bevorzugt etwa 2,3X so hoch wie die Konzentration von Span 80 betragen, vorzugsweise wenn es in einem Adjuvans mit einer Lezithin- und einer Ölkonzentration wie in Adjuvans Nr. 1 verwendet wird.
Die Konzentration des hydrophilen oberflächenaktiven Mittels, das in dem erfindungsgemäßen Adjuvans verwendet wird, hängt teilweise von der Größe der wässerigen Phase ab, und die Konzentration des lipophilen oberflächenaktiven Mittels hängt teilweise von der Größe der Ölphase ab. In einer Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Adjuvans, das aus einer wässerigen Phase bei 80 Vol.-% und einer Ölphase bei 20 Vol.-% besteht, ein hydrophiles oberflächenaktives Mittel bei einer Konzentration von bis zu etwa dem 4fachen (d. h. 80/20) der Konzentration eines lipophilen oberflächenaktiven Mittels oder beispielsweise bis zu etwa dem 2fachen enthalten.
Nicht-oberflächenaktive Komponenten des erfindungsgemäßen Adjuvans
Zusätzlich zu einem amphiphilen oberflächenaktiven Mittel kann das erfindungsgemäße Adjuvans ein Lezithin und ein Öl enthalten. In einem anderen Aspekt enthält das erfindungsgemäße Adjuvans eine wässerige Trägerlösung.
Irgendein in der Technik bekanntes Lezithin ist für das erfindungsgemäße Adjuvans nützlich. Lezithin bezieht sich auf ein Gemisch aus Phosphatiden. Wenn es als ein Rohextrakt bereitgestellt wird, kann Lezithin ebenso Triglyceride enthalten. Lezithine können pflanzlichen oder tierischen Ursprungs sein. Außerdem können Lezithine synthetisch abgeleitet werden. Beispiele von Lezithinen werden in den US-Patenten Nr. 5,690,942; 5,597,602 und 5,084,269 beschrieben. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Gehalt an Triglyceriden in einem Lezithin, das in dem erfindungsgemäßen Adjuvans verwendet wird, im Vergleich zu seiner natürlichen Quelle verringert, d. h. das Lezithin wird entölt. Eine Vielzahl von Wegen sind in der Technik bekannt, um ein Lezithin zu entölen, beispielsweise wie in US-Patent Nr. 5,597,602 beschrieben.
Die Konzentration eines Lezithins in einer Impfstoffzusammensetzung, die mit dem erfindungsgemäßen Adjuvans formuliert wurde, beträgt etwa 0,25 bis etwa 12,5 Vol.-%, stärker bevorzugt etwa 0,5 bis etwa 10 Vol.-%, stärker bevorzugt 0,5 bis etwa 7,5 Vol.-%, stärker bevorzugt etwa 0,5 bis etwa 5 Vol.-%, stärker bevorzugt etwa 0,5 bis etwa 2,5 Vol.-%, und am stärksten bevorzugt etwa 0,5 bis etwa 1,25 Vol.-%.
Die Konzentration eines Lezithins in einem 25-%-Adjuvans beträgt mindestens etwa 1 Vol.-%, vorzugsweise mindestens etwa 2 Vol.-%. In einem anderen Aspekt beträgt die Lezithinkonzentration in einem 25-%-Adjuvans etwa 1 bis etwa 50 Vol.-%. stärker bevorzugt etwa 2 bis etwa 40 Vol.-%. stärker bevorzugt etwa 2 bis etwa 30 Vol.-%, stärker bevorzugt etwa 2 bis etwa 20 Vol.-%, stärker bevorzugt etwa 2 bis etwa 10 Vol.-% und am stärksten bevorzugt etwa 2 bis etwa 5 Vol.-%. Die Konzentration eines Lezithins in dem erfindungsgemäßen Adjuvans mit einer höheren oder niedrigeren Konzentration wird, wie oben veranschaulicht, bestimmt.
Das erfindungsgemäße Adjuvans enthält ein Öl, beispielsweise ein Öl, das in den US-Patenten Nr. 5,814,321; 5,084,269 beschrieben wird. In einem bevorzugten Aspekt enthält das erfindungsgemäße Adjuvans ein Mineralöl, beispielsweise DRAKEOL^TM. In einem anderen Aspekt wird ein Gemisch aus Ölen verwendet. Das Öl kann zur Herstellung des erfindungsgemäßen Adjuvans als reines Öl oder als ein Gemisch, das das Öl und eine andere Komponente beispielsweise das Lezithin enthält, bereitgestellt werden.
Die Konzentration eines Öls in einer Impfstoffzusammensetzung, die mit dem erfindungsgemäßen Adjuvans formuliert wurde, beträgt etwa 1 bis etwa 23 Vol.-%, stärker bevorzugt etwa 1,5 bis etwa 20 Vol.-%, stärker bevorzugt etwa 2,5 bis etwa 15 Vol.-%, stärker bevorzugt etwa 3,5 bis etwa 10 Vol.-%, stärker bevorzugt etwa 3,5 bis etwa 7,5 Vol.-%, stärker bevorzugt 4 bis etwa 6 Vol.-%, und am stärksten bevorzugt etwa 4,5 Vol.-%.
Die Konzentration eines Öls in einem 25-%-Adjuvans beträgt mindestens etwa 5 Vol.-%, vorzugsweise mindestens etwa 8 Vol.-% und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 12 Vol.-%. In einem anderen Aspekt beträgt die Ölkonzentration in einem 25-%-Adjuvans etwa 4 bis etwa 92 Vol.-%, stärker bevorzugt etwa 6 bis etwa 80 Vol.-%, stärker bevorzugt etwa 10 bis etwa 60 Vol.-%, stärker bevorzugt etwa 14 bis etwa 40 Vol.-%, stärker bevorzugt etwa 14 bis etwa 30 Vol.-%, stärker bevorzugt etwa 16 bis etwa 24 Vol.-% und am stärksten bevorzugt etwa 18 Vol.-%. Die Konzentration eines Öls in dem erfindungsgemäßen Adjuvans mit einer höheren oder niedrigeren Konzentration wird, wie oben veranschaulicht, bestimmt.
In einer anderen Ausführungsform wird ein wässeriger Träger in dem erfindungsgemäßen Adjuvans verwendet, beispielsweise physiologische Kochsalzlösung (beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung), Tris-HCl, Zitrat-phosphatpuffer, Hepes-Puffer, andere pharmazeutisch akzeptable Puffer, die in der Technik bekannt sind, oder Wasser. Der pH des Trägers ist vorzugsweise physiologisch akzeptabel, beispielsweise zwischen 6 und 8, am stärksten bevorzugt rund 7. Der wässerige Träger, der in dem erfindungsgemäßen Adjuvans verwendet wird, nimmt vorzugsweise das Volumen ein, das für irgendeine der anderen Komponenten nicht benötigt wird.
Das erfindungsgemäße Adjuvans wird vorzugsweise bei einer Konzentration bereitgestellt, die etwa 2X bis etwa 10X der Konzentration nach der Formulierung des Adjuvans in einer Impfstoffzusammensetzung, stärker bevorzugt etwa 2X bis etwa 8X, stärker bevorzugt etwa 3X bis etwa 6X und am stärksten bevorzugt etwa 4X beträgt.
Verwendungen von erfindungsgemäßen Adjuvanzien
Die erfindungsgemäßen Adjuvanzien können verwendet werden, um die Immunantwort auf ein Antigen einer Impfstofformulierung zu verstäken. Die erfindungsgemäßen Adjuvanzien können mit Antigenen verwendet werden, die aus irgendeinem Bakterium oder aus irgendeinem Virus abgeleitet sind, vorausgesetzt, daß das Antigen nicht zerstört oder denaturiert wird. Beispiele von Antigenen sind Erysipelothrix rhusinpathiae-Antigene, Bordetella bronchiseptica-Antigene, Antigene von toxigenen Stämmen von Pasteurella multocida, Antigene von Eschericia coli-Stämmen, die bei Neugeborenen Durchfall verursachen. Actinobacillus pleuropneumoniae-Antigene, Pasteurella haemolytica-Antigene oder irgendeine Kombinationen der obigen, sind aber nicht darauf beschränkt. Die erfindungsgemäßen Adjuvanzien sind ebenso in den Impfstoffzusammensetzungen, die ein Antigen enthalten, nützlich, wie in den US-Patenten Nr. 5,616,328 und 5,084,269 beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Adjuvans in einer Impfstofformulierung verwendet, die ein Antigen enthält, das aus der flüssigen Phase einer Erysipelothrix rhusiopathiae („E. rhusiopathiae")-Kultur erhalten wurde. In einem bevorzugten Aspekt wird eine Kultur von E. rhusiopathiae durch Zugeben von Formalin (etwa 0,5 Vol.-% Endkonzentration) inaktiviert, und nach der Inkubation für 24 Stunden bei 37°C wurden die Zellen entfernt, beispielsweise durch Zentrifugation oder Filtration. Der Kulturüberstand wird in einer bevorzugten Ausführungsform etwa 10fach konzentriert. und Aluminiumhydroxidgel (vorzugsweise REHYDRAGEL^TM) wird zu dem konzentrierten Überstand bei einer Endkonzentration von etwa 30 Vol.-% zugegeben, um das Antigen zu stabilisieren. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden Thimerosal (etwa 0,01 Vol.-% Endkonzentration) (Dimportex. Spain, importiert durch Flavine Inc., Klosters, New Jersey) mit EDTA (etwa 0,07 Vol.-% Endkonzentration) zu den Antigenen als Konservierungsmittel zugegeben. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird eine Impfstoffzusammensetzung formuliert, die das Antigen und das erfindungsgemäße Adjuvans (beispielsweise Adjuvans Nr. 1) umfaßt, wobei das Adjuvans beispielsweise etwa 25 Vol.-% der Impfstoffzusammensetzung umfaßt.
Impfstoffzusammensetzungen, umfassend erfindungsgemäße Adjuvanzien und ihre Verabreichung
Das erfindungsgemäße Adjuvans kann in einer Impfstofformulierung verwendet werden, um ein Tier zu immunisieren. In einer Ausführungsform enthält die Impfstofformulierung das erfindungsgemäße Adjuvans und ein Antigen. Die optimalen Verhältnisse von jeder Komponente in der Impfstofformulierung können durch Techniken, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, bestimmt werden.
Eine Impfstofformulierung kann einem Patienten per se oder in Form einer pharmazeutischen oder therapeutischen Zusammensetzung verabreicht werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die das erfindungsgemäße Adjuvans und ein Antigen umfassen, können durch konventionelle Misch-, Lösungs-, Granulier-, Drageeherstellungs-, Zerreibungs-, Emulgierungs-, Einkapselungs-, Einschließungs- oder Lyophilisierungsverfahren hergestellt werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen können in konventioneller Weise unter Verwendung von einem oder mehreren physiologisch akzeptablen Trägern, Verdünnungsmitteln, Trägerstoffen oder Hilfsmitteln formuliert werden, die das Verarbeiten der Antigene der Erfindung zu Präparaten, die pharmazeutisch verwendet werden können, erleichtern. Die richtige Formulierung hängt von dem ausgewählten Verabreichungsweg ab. Für die Zwecke dieser Anmeldung umfassen „physiologisch akzeptable Träger" Träger, die zur menschlichen oder tierischen Verwendung ohne relativ schädliche Nebenwirkungen akzeptabel sind (in bezug auf den zu behandelnden Zustand), sowie Verdünnungsmittel, Trägerstoffe oder Hilfsmittel, die ebenso akzeptabel sind.
Systematische Formulierungen umfassen die, die zur Verabreichung durch Injektion, beispielsweise subkutane, intradermale, intramuskuläre oder intraperitoneale Injektion, konstruiert sind.
Zur Injektion können die Impfstoffpräparate in wässerigen Lösungen, vorzugsweise in physiologisch verträglichen Puffern, wie Hank-Lösung, Ringer-Lösung, Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung oder irgendein anderer physiologischer Kochsalzlösungspuffer formuliert werden. Die Lösung kann Formulierungsmittel, wie Suspendier-, Stabilisier- und/oder Dispergiermittel enthalten. Alternativ können die Proteine in Pulverform zur Konstitution mit einem geeigneten Vehikel, beispielsweise sterilem Pyrogen-freiem Wasser, vor der Verwendung vorliegen.
Die Bestimmung einer wirksamen Menge der Impfstofformulierung zur Verabreichung liegt innerhalb der Fähigkeiten des Fachmanns, insbesondere im Lichte der hierin bereitgestellten ausführlichen Offenbarung.
Eine wirksame Dosierung kann anfangs aus in vitro-Assays bestimmt werden. Beispielsweise kann eine Dosis in Tiermodellen formuliert werden, um eine Induktion einer Immunantwort unter Verwendung von Techniken, die im Stand der Technik allgemein bekannt sind. zu erreichen. Ein Fachmann könnte ohne weiteres die Verabreichung an alle Tierspezies, basierend auf den hierin beschriebenen Ergebnissen, optimieren. Die Dosierungsmenge und das Intervall können einzeln eingestellt werden. Wenn sie beispielsweise als ein Impfstoff verwendet werden. können die erfindungsgemäßen Impfstofformulierungen in etwa 1 bis 3 Dosierungen für einen Zeitraum von 1 bis 36 Wochen verabreicht werden. Vorzugsweise werden 1 oder 2 Dosierungen bei Intervallen von etwa 3 Wochen bis etwa 4 Monaten verabreicht, und Auffrischungsimpfungen können danach regelmäßig verabreicht werden. Alternative Protokolle können für einzelne Tiere geeignet sein. Eine geeignete Dosierung ist eine Menge der Impfstofformulierung, die, wenn sie wie oben beschrieben verabreicht wird, die Immunantwort in einem immunisierten Tier ausreichend erhöhen kann, um das Tier vor einer Infektion für mindestens 4 bis 12 Monate zu schützen. Im allgemeinen liegt die Menge des Antigens, das in einer Dosierung vorliegt, zwischen etwa 1 pg und etwa 100 mg pro kg Wirt, typischerweise etwa 10 pg bis etwa 1 mg, und vorzugsweise etwa 100 pg und etwa 1 μg. Der geeignete Dosierungsbereich wird mit der Injektionsweise und der Größe des Patienten variieren, aber wird typischerweise etwa 0,1 ml bis etwa 5 ml betragen.
Die Erfindung ist beschrieben worden, die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung ohne Einschränkung angegeben.
Beispiel 1. Die Verwendung eines Adjuvans, das Öl und Lezithin enthält.
Das folgende Beispiel beschreibt die Verwendung eines Adjuvans, das entöltes Lezithin enthält, das in einem Öl gelöst ist („Öl-Lezithin-Adjuvans"), normalerweise Mineralöl (Leichtparaffin) bei Tierimpfstoffen. Siehe US-Patent Nr. 5,084,269, das ein Öl-Lezithin-Adjuvans beschreibt. Ein Impfstoffpräparat unter Verwendung eines Öl-Lezithin-Adjuvans ist eine Öl-in-Wasser-Emulsion.
Alle prozentualen Konzentrationen hierin werden in Volumen pro Volumen bereitgestellt, wenn nicht anders angegeben. Die Prozentwerte, wenn nicht anders angegeben. eines Öl-Lezithin-Adjuvans beziehen sich auf die Konzentration eines Gemisches aus Lezithin (10% des Gemisches) und einem Trägeröl (DRAKEOL^TM) (90% des Gemisches) in einem wässerigen Träger (kontinuierliche Phase). Beispielsweise enthält ein 20%iges Öl-Lezithin-Adjuvans 2 Vol.-% Lezithin (Central Soya, Fort Wayne, Indiana), 18 Vol.-% DRAKEOL^TM 5 (Penreco, Karns City, Pennsylvania) und 80 Vol.-% Kochsalzlösung (wobei der Salzgehalt verringert wird, wenn andere Komponenten, beispielsweise oberflächenaktive Mittel zugegeben werden). Die Prozentwerte eines Öl-Lezithin-Adjuvans in einer Impfstoffzusammensetzung, d. h. die folgende Verdünnung der Adjuvanslösung mit der Antigenlösung, beziehen sich auf die Konzentration eines Gemisches aus Lezithin (10% Gemisch) und einem Trägeröl (DRAKEOL^TM) (90% Gemisch) in dem Impfstoffpräparat, das das Adjuvans und eine Lösung, die ein Antigen enthält, umfaßt, wenn nicht anders angegeben. In allen Fällen, wo ein oberflächenaktives Mittel zu einer Adjuvanszusammensetzung zugegeben wurde, beziehen sich die Prozentwerte für ein oberflächenaktives Mittel auf die Gesamtkonzentration von allen zugegebenen oberflächenaktiven Mitteln in dem Adjuvans oder dem Impfstoffpräparat, wenn nicht anders angegeben.
Wenn ein Öl-Lezithin-Adjuvans als ein Adjuvans in Impfstofformulierungen verwendet wurde, wurde festgestellt, daß es die wässerigen Präparate ohne Zugabe von extra oberflächenaktiven Mitteln nicht emulgiert, da das Lezithin in dem Öl-Lezithin-Adjuvans zur Emulgierung nicht ausreicht. Deshalb bildeten die Impfstoffe, die unter Verwendung des mangelhaft dispergierten Öl-Lezithin-Adjuvans hergestellt wurden, einen Pool oder Depot meistens von Mineralöl in den Geweben an der Injektionsstelle. Dieses Öl kann durch das injizierte Tier nicht verstoffwechselt oder entfernt werden, und verbleibt so als eine Quelle von schwerer chronischer Entzündung und Vernarbung.
Es wurde ebenso bestimmt, daß die Zugabe von oberflächenaktiven Mitteln zu einer Impfstofformulierung, umfassend ein Öl-Lezithin-Adjuvans und ein Antigen, um die Formulierung zu emulgieren, keine ausreichende Lösung war. Die Probleme, die auftreten, wenn Öl und oberflächenaktive Mittel zu der Impfstofformulierung vor dem Emulgieren zugegeben werden, waren, daß das Antigen beschädigt werden könnte, und wenn eine geeignete Emulsion nicht erreicht wurde, daß die Formulierung, einschließlich dem wertvollen Antigen verworfen werden müßte.
Unterschiedliche Adjuvanszusammensetzungen wurden getestet, umfassend ein Öl-Lezithin-Adjuvans zusammen mit oberflächenaktiven Mitteln zur Emulgierung der Impfstofformulierungen.
Beispiel 2. Die Verwendung eines Adjuvans enthaltend ein oberflächenaktives Mittel bei niedriger Konzentration
Das folgende Beispiel beschreibt die Verwendung einer Emulsion, enthaltend 40% Öl-Lezithin und 2% synthetische oberflächenaktive Mittel, d. h. Tween 80 und Span 80 (Van Water & Rogers, Omaha, Nebraska) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung. Dieses Adjuvans wurde aseptisch und separat von dem Antigen hergestellt. Die Emulsion wurde zu dem Antigenpräparat ohne weitere Emulgierung zugegeben. Die synthetischen oberflächenaktiven Mittel unterstützten die Dispersion des Öl-Lezithin-Adjuvans als eine grobe, relativ stabile Emulsion. Die Adjuvansemulsion wurde zu dem wässerigen Antigenpräparat bei der Rate von einer von acht zugegeben, was den Öl-Lezithin-Adjuvans-Gehalt von 40% auf 5% und die oberflächenaktiven Mittel von insgesamt 2% auf 0,25% verringerte.
Das Adjuvans wurde in mehreren Impfstoffen verwendet. Es wurde festgestellt, daß, da die Emulsion grob und nicht sehr stabil ist, die Öltröpfchen wahrscheinlich als ein dauerhaftes, reizendes Depot an Öl in injizierten Geweben koaleszieren und sich trennen. Ein anderes Problem, das mit diesem Adjuvans beobachtet wurde, war, daß es mit Al-Gel aggregiert. Eine Vielzahl von Impfstoffen enthält Al-Gel für eine Vielzahl von Zwecken, wie beispielsweise als ein Adjuvans oder zur Stabilisierung eines Antigens oder zum Binden von Endotoxin. Das Öl-Lezithin-Adjuvans trägt eine negative Ladung, die verursacht, daß es an dem positiv geladenen Al-Gel unter Bildung von groben Aggregaten bindet. Diese Aggregate sind unansehnlich, strömen schwer durch eine Injektionsnadel und sind für die injizierten Gewebe sehr reizend.
Beispiel 3. Die Verwendung eines Adjuvans, enthaltend ein oberflächenaktives Mittel bei hoher Konzentration
Ein Öl-Lezithin-Adjuvans (5 Vol.-%) wurde in dem Antigenpräparat mit Hilfe der oberflächenaktiven Mittel Tween 80 und Span 80, wie oben, aber bei einer oberflächenaktiven Gesamtkonzentration von 8% in der Impfstoffzusammensetzung emulgiert. Die Emulsion war sehr fein und stabil. Sie wies beinahe die Klarheit einer Lösung auf, und sie wurde beim Stehenlassen nicht cremig. Unter dem Mikroskop waren mit der maximalen Vergrößerung (Auflösung 0,2 μm) die meisten Tröpfchen zu klein, um sichtbar zu sein. Daher war es eine Mikroemulsion. Es wurde festgestellt, daß dieses Adjuvans, wenn es in einer Impfstofformulierung verwendet wurde, so gut wie frei von Injektionsstellenreaktivität war, und wenn Al-Gel zugegeben wurde, gab es keine detektierbare Aggregation von Öl und Gel. Infolge ihres hohen Gehalts an oberflächenaktiven Mittel ist dieses Adjuvans leicht zu emulgieren, attraktiv im Aussehen, stabil, nicht mit Al-Gel reaktiv und so gut wie frei von reizenden Wirkungen an der Impfstelle. Trotz dieser Vorteile dies diese Emulsion jedoch leicht niedrigere Adjuvanswirksamkeit im Vergleich zu der groben Version, die aus oberflächenaktiven Mitteln bei niedriger Konzentration hergestellt wurde, auf.
Beispiel 4. Die Verwendung eines Adjuvans, enthaltend ein oberflächenaktives Mittel bei mittlerer Konzentration
Ein Versuch wurde durchgeführt, um eine Adjuvansemulsion herauszufinden, die akzeptabel glatt und als Adjuvans vollständig wirksam ist. Ein 20-%-Öl-Lezithin-Adjuvans wurde bei diesen Experimenten verwendet, da herausgefunden wurde, daß eine 20-%-Öl-Lezithin- Adjuvansemulsion leichter herzustellen ist als eine 40-%-Öl-Lezithin-Adjuvansemulsion. Seine Zugabe zu Impfstoffen bei einer Rate von eins in vier, um eine Endölkonzentration von 5% herzustellen, würde 75% des Dosisvolumens für Antigene hinterlassen. Vorherige Experimente zeigten, daß eine glatte Submikronemulsion (meisten Tröpfchen wiesen einen Durchmesser von weniger als ein Mikrometer auf, siehe 1) mit 20% Öl und 16% der oberflächenaktiven Mittel Tween 80 und Span 80 hergestellt werden könnte.
Zwei Emulsionen wurden für die Assays hergestellt. Eine enthielt ein 20-%-Öl-Lezithin-Adjuvans und 16% der oberflächenaktiven Mittel Tween 80 und Span 80. Das Verdünnen von eins in vier führte zu einer Emulsion, die 5% Öl-Lezithin-Adjuvans und 4% oberflächenaktive Mittel in dem Impfstoffpräparat umfaßt. Die andere Emulsion wurde mit einem 40-%-Öl-Lezithin-Adjuvans und 2% des oberflächenaktive Mittels Tween 80 und Span 80 hergestellt. Das Verdünnen von eins in acht ergab eine Emulsion mit 5% Öl-Lezithin-Adjuvans und 0,25% oberflächenaktive Mittel.
Al-Gel (REHYDRAGEL^TM, erhalten von Reheis, Berkeley Heights, New Jersey) wurde auf eine Konzentration von 10% zu den Proben jeder Emulsion zugegeben. In der Emulsion mit 0,25% oberflächenaktiven Mitteln aggregierten und trennten sich das Öl und Al-Gel, wodurch eine dicke Schicht auf der Spitze der Flüssigkeitssäule gebildet wurde (Emulsionsverdichtung). In der Emulsion mit 4% oberflächenaktiven Mitteln gab es im Gegensatz dazu keine Aggregation und Emulsionsverdichtung. Mit 4% oberflächenaktiven Mitteln setzte sich das Al-Gel am Boden des Röhrchens ab, was die Öltröpfchen in der überstehenden Flüssigkeit dispergiert ließ.
Beispiel 5. Anschwellen der Injektionsstellen, wenn ein Adjuvans, enthaltend ein oberflächenaktives Mittel bei mittlerer Konzentration, verwendet wird
Die Impfstoffpräparate wurden in Schweinen getestet, um zu bestimmen, ob das Anschwellen der Injektionsstelle auftrat, wenn ein Adjuvans mit mittlerer Konzentration an oberflächenaktiven Mitteln verwendet wurde. Impfstoffpräparate, die ein 5-%-Öl-Lezithin-Adjuvans und entweder 0,25% oder 4% oberflächenaktive Mittel enthalten, verursachten kein Anschwellen an der Injektionsstelle bei Schweinen. Wenn das Al-Gel zu dem Impfstoffpräparat bei einer Konzentration von 10% zugegeben wurde, verursachte die Herstellung mit 0,25% oberflä chenaktiven Mittel schwere Injektionsstellenschwellungen, während die mit 4% oberflächenaktiven Mitteln zu beinahe keiner Schwellung führten.
Es wurden Experimente durchgeführt, um den Bereich der Konzentrationen an oberflächenaktiven Mitteln zu bestimmen, die zur Vorbeugung von Aggregation mit Al-Gel und Schwellen der Injektionsstelle wirksam sind. Wenn eine Konzentration von 1,5% an oberflächenaktivem Mittel in dem Impfstoff verwendet wird, wurde leichte Aggregation des Öls und des Al-Gels beobachtet. Die Aggregation war bei niedrigeren Konzentrationen an oberflächenaktiven Mitteln viel schwerer. Bei Konzentrationen von 2% und 4% an oberflächenaktiven Mitteln gab es keine Aggregation. Das Anschwellen, das bei Schweinen durch Impfstoffpräparate induziert wurde, die 0,5% oder weniger oberflächenaktive Mittel enthalten, war größer bei 2 und 4 Wochen nach der Impfung als das, das durch die Präparate mit 1% oder mehr oberflächenaktiven Mitteln induziert wurde, 6 Wochen nach der Impfung war es offensichtlich, daß 1,5% oberflächenaktive Mittel das Minimum war, das benötigt wird, um die chronischen Schwellungen zu vermeiden.
Beispiel 6. Adjuvanzien mit nützlichen In-Vitro- und In-Vivo-Eigenschaften
Die Assays wurden durchgeführt, um ein Adjuvans zu finden, das nicht mit Al-Gel reagiert und nicht zur Reaktivität in dem Tier nach der Impfung führt. Ein 20-%-Öl-Lezithin-Adjuvans, das 8% oberflächenaktive Mittel enthält, was zu einem Impfstoffpräparat mit 5% Öl-Lezithin-Adjuvans und 2% oberflächenaktiven Mitteln führt, wurde ausreichend bestimmt, um sowohl die in-vitro-Reaktivität mit Al-Gel als auch die Reizung des Gewebes an der Impfstelle zu vermeiden. Der Nachweis einer Beziehung zwischen Konzentration an oberflächenaktiven Mitteln und Adjuvanspulver war weniger deutlich. Es gab gelegentlich Anzeichen, daß 4% oberflächenaktive Mittel in dem Impfstoff übermäßig waren, beispielsweise bei der Induktion von Agglutinin zu E. coli K99 und Neutralisierung von Antitoxin zu Toxin von P. multocida Typ D.
Daher wurde bestimmt, daß die optimale Konzentration an oberflächenaktiven Mitteln 8% in einem 20-%-Öl-Lezithin-Adjuvans betrug, was zu 2% oberflächenaktiven Mitteln in der Impfstoffzusammensetzung führte. Dies stellte die ziemlich leichte Emulgierung und gute Stabilität bei der Kaltlagerung bereit. In Impfstoffen mit 5% Öl-Lezithin-Adjuvans waren 2% oberflächenaktive Mittel ideal für sowohl das Adjuvanspulver als auch dafür, daß keine Reizung der injizierten Gewebe erfolgte.
Die Tröpfchengröße in der Submikronemulsion einem 20-%-Öl-Lezithin-Adjuvans mit 8% oberflächenaktiven Mitteln wurde bestimmt. Die 8% oberflächenaktives Mitte1 bestanden aus 5,6% Tween 80 in der wässerigen Phase und 2,4% Span 80 in der Ölphase. Etwa 94% aller Tröpfchen waren weniger als 1 Mikronmeter im Durchmesser. siehe 1.
Ein Ausgangsmaterial aus 1 000 ml einer 20-%-Öl-Lezithin-Adjuvans mit 8% oberflächenaktiven Mitteln wurde aus 200 ml Filter-sterilisierter Lezithin-Öl-Lösung (10% Lezithin in DRAKEOL^TM Mineralöl), autoklaviertem Tween 80 (56 ml) und Span 80 (24 ml), und Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (720 ml) (Dulbecco PBS) hergestellt. Die Lezithin-Öl-Lösung und Span 80 wurden vereinigt und in einem sterilen Behälter für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur gemischt, bis die Emulgierung vollständig war. Die Kochsalzlösung und Tween 80 wurden vereinigt und in einem sterilen Behälter für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur gemischt. Das Ölgemisch wurde in dem wässerigen Gemisch unter Verwendung eines Emulgators emulgiert. Die Emulgierung wurde durch Rezirkulation fortgesetzt, bis das gesamte Adjuvans in die Kochsalzlösung gegeben wurde. Die Emulsion wurde dann zweimal durch einen Homogenisator bei Raumtemperatur geleitet. Das Adjuvans wurde bei 2 bis 8°C gelagert.
Beispiel 7. Rhinitis-atrophicans-Impfstoff unter Verwendung eines Adjuvans, enthaltend ein oberflächenaktives Mittel bei mittlerer Konzentration
Das in Beispiel 4 beschriebene Adjuvans mit mittlerer Konzentration an oberflächenaktiven Mitteln wurde in einem Rhinitis-atrophicans-Impfstoff verwendet, der Antigene von Bordetella bronchiseptica und toxigene Pasteurella multocida enthielt. Ein Bordetella bronchiseptica-Pasteurella multocida-Bakterintoxoid-Impfstoff wurde aus B. bronchiseptica-Zellen und dem Toxoid von P. multocida hergestellt.
B. bronchiseptica-Zellen, Stamm 2–9 NADL, wurden hergestellt, wie in den US-Patenten Nr. 5,019,388 und 4,888,169 beschrieben, außer daß am Ende des Wachstumszyklus die Kulturen kontinuierlich gemischt wurden, und Formalinlösung zu einer Endkonzentration von 0,6% zugegeben wurde. Innerhalb 20 Minuten nach der Zugabe von Formalin wurde eine 25%ige Glutaraldehydlösung zu einer Endkonzentration von 0,6% zugegeben. Die Kultur wurde für 24 bis 48 Stunden bei 37 ± 2°C gerührt, um die Inaktivierung und Entgiftung zu beenden. (Siehe Tabelle 1). Dann wurden die Kulturflüssigkeiten auf 15°C oder weniger zur Verarbeitung abgekühlt. Die inaktivierten Kulturen, die nicht sofort verarbeitet wurden, wurden bei 2 bis 8°C für bis zu 14 Tage gelagert. Nach der Inaktivierung wurden die Bakterien von der Kulturflüssigkeit durch Zentrifugation getrennt. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen wurden in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung bei ungefähr einem Zehntel des ursprünglichen Volumens resuspendiert. Die konzentrierte Suspension wurde bei 2 bis 8°C gelagert. Die Behandlung von B. bronchiseptica mit zwei Aldehyden inaktiviert sowohl das Endotoxin als auch das Exotoxin, wobei sich andere Behandlungen zur Sicherheit erübrigen.
Das Toxoid von P. multocida wurde in zwei unterschiedlichen Formen hergestellt, wie in den US-Patenten Nr. 5,536,496 und 5,695,769 beschrieben. In einer Form wird das Toxin innerhalb der Bakterienzellen durch die Zugabe von Formaldehyd zu der Kultur entgiftet; das Toxoid bleibt innerhalb der Zellen. Bei der anderen Form werden die Lebendzellen mechanisch gespalten und das Toxin extrahiert. Das Toxin wird durch das Aussetzen eines hohen pH-Wertes entgiftet, wie in US-Patent 5,536,496 beschrieben. Beide Formen des Toxoids werden mit Al-Gel behandelt, um das freie Endotoxin durch ein patentiertes Verfahren zu kontrollieren, wie in US-Patent 5,616,328 beschrieben. (Siehe Tabelle 1). Eine Synergie zwischen den zwei Formen von Pasteurella-Toxoid führte zu Antitoxinantworten, was die Summe von Reaktionen für jede Form weit überschreitet, wenn es allein verwendet wird, wie in US-Patent 5,695,769 beschrieben.
Tabelle 1: Behandlung von Zellen während der Herstellung des Bordetella Bronchiseptica-Pasteurella Multocida-Bakterintoxoid-Impfstoffes
Das in Beispiel 4 beschriebene Adjuvans wurde zugeben, was zu Konzentrationen von 5% Öl-Lezithin-Adjuvans und 2% oberflächenaktiven Mitteln in der Impfstofformulierung führte.
Ein Versuch, die minimale Immunisierungsdosis des Rhinitis-atrophicans-Impfstoffes zu bestimmen, zeigte die Adjuvanseigenschaften des Öl-Lezithin-Adjuvans mit einer mittleren Konzentration an oberflächenaktiven Mitteln. Trächtige Schweine wurden mit zwei 2 ml Dosierungen bei einem Intervall von 4 Wochen 4 geimpft. Sie warfen ihre Ferkel etwa 2 Wochen nach der zweiten Dosierung. Mit einem Alter von 2 Monaten wurde ihre Schweine einer schweren Reizsetzung, bestehend aus virulenten B. Bronchiseptica- und P. Multocida-Kulturen, die nacheinander intranasal verabreicht wurden, unterzogen. Die Schweine, die von 7 Säuen geboren wurden, die nur mit einem Placebo geimpft wurden, entwickelten schwere Rhinitis atrophicans. Die Würfe von allen 7 Säuen, die Impfstoff erhielten, der eine komplette Dosis der Antigene enthielt, wurden stark durch den maternen Antikörper noch in der Zirkulation geschützt. Die Säue, die Impfstoffe erhielten, die ein 1/2 oder 1/8 Dosis von Antigenen enthielten, stellten ihren Würfen keinen zufriedenstellende Schutz bereit.
Beispiel 8. Erysipelas-Impfstoff unter Verwendung eines Adjuvans, enthaltend ein oberflächenaktives Mittel bei mittlerer Konzentration
Das in Beispiel 4 beschriebene Adjuvans mit mittlerer Konzentration an oberflächenakiven Mitteln wurde in einem Erysipelas-Impfstoff verwendet, der E. rhusiopathiae-Antigene ent hielt. Die Antigene zur Verwendung in einem Impfstoff wurden aus E. rhusiopathiae-Kulturen, die mit 0,5% Formalin für mindestens 24 Stunden inaktiviert wurden, hergestellt. Die inaktivierten Kulturen wurden durch Zentrifugieren geklärt, und durch Molekularfiltration ungefähr zehnfach konzentriert. Die Konzentrate wurden durch Zugeben von Al-Gel, d. h. REHYDRAGEL^TM, zu einer Konzentration von 30% stabilisiert. Die voradsorbierten Konzentrate wurden in den Impfstoff in einer Menge eingeschlossen, so daß jede 2 ml Dosierung mindestens 3,2 Trübungseinheiten (OU) enthielt, wie aus der optischen Dichte (OD) der Kultur bei Inaktivierung berechnet. (Die OD wird mit dem Endkonzentrationsfaktor multipliziert, um einen Wert in OU pro ml zu erhalten.)
Eine Erysipelas-Impfung wurde durchgeführt, um die Wirksamkeit eines Impfstoffes, der das Öl-Lezithin-Adjuvans mit mittlerer Konzentration an oberflächenaktiven Mitteln enthält, zu bestimmen. Das in Beispiel 4 beschriebene Adjuvans wurde bei einer Endkonzentration von 25 Vol.-% zugegeben, was eine endgültige Öl-Lezithin-Konzentration von 5% ergab. Thimerosal (0,01% Gewicht/Volumen) mit EDTA (0,07% Gewicht/Volumen) wurde als Konservierungsmittel zugegeben.
Die Impfstoffe, die gemäß dieser Formel hergestellt wurden, wurden zweimal hinsichlich ihrer Wirksamkeit bei Schweinen getestet. In jedem Fall wurden die Schweine mit zwei 2 ml Dosierungen geimpft, die intramuskulär (IM) eine Dosierung bei etwa 3 Wochen (Entwöhnen) und die zweite Dosis 3 Wochen später verabreicht wurde. Die Kontrollen erhielten Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung als Placebo. Die Immunität wurde durch die IM-Injektion von virulentem E. Rhusiopathiae bei einem Alter von etwa 9 Wochen in einer Studie und einem Alter von 6 Monaten in einer anderen provoziert. Wie in Tabelle 2 gezeigt, war der Schutz aufgrund der Impfung 100% bei 9 Wochen und 75% bei 6 Monaten (d. h. Schlachtalter). Diese Ergebnisse zeigten, daß der Impfstoff zufriedenstellenden Schutz gegen Erysipelas während des normalen Fütterungszeitraums bereitstellt.
Der Impfstoff, der in der Gruppe verwendet wurde. die bei 9 Wochen gereizt wurde, war bereits 12 Monate alt. Das Ergebnis bestätigt, daß das schützende Antigen erfolgreich stabilisiert wurde.
Tabelle 2: Schutz von Schweinen gegen Erysipelas
Anmerkung: In der geimpften Gruppe, gereizt bei 9 Wochen, wurde das 20. Schwein augeschlossen. Ein sehr störrisches Tier kämpfte so heftig, wenn es berührt wurde, daß seine Temperatur nicht in Ruhe bestimmt werden konnte. Nach der Reizsetzung blieb dieses Schwein vollkommen gesund.

Claims

Impfstoffzusammensetzung, umfassend etwa 0,25 bis etwa 12,5 Vol.-% Lezithin, etwa 1 bis etwa 23 Vol.-% Öl, etwa 1,5 bis 3,4 Vol.-% von zumindest einem amphiphilen oberflächenaktiven Mittel und ein Antigen.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Öl ein Mineralöl ist und wobei das Lezithin entölt ist.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, ferner umfassend einen wässerigen Träger.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Antigen aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Erysipelothrix rhusiopathiae-Antigenen, Borderella bronchiseptica-Antigenen, Pasteurella multocida-Antigenen, Antigenen von Eschericia coli-Stämmen, die bei Neugeborenen Durchfall verursachen, Actinobacillus pleuropneumoniae-Antigenen, Pasteurella haemolytica-Antigenen und Kombinationen davon.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei zwei amphiphile oberflächenaktive Mittel verwendet werden.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 5, wobei ein hydrophiles oberflächenaktives Mittel und ein lipophiles oberflächenaktives Mittel verwendet werden.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das Lezithin bei einer Konzentration von etwa 0,5 Vol.-% vorliegt wobei das Öl bei einer Konzentration von etwa 4,5 Vol.-% vorliegt und wobei die amphiphilen oberflächenaktiven Mittel bei einer Konzentration von etwa 2 Vol.-% vorliegen.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 5, ferner umfassend einem wässerigen Träger.
Adjuvanszusammensetzung, umfassend etwa 0,25 bis etwa 12,5 Vol.-% Lezithin, etwa 1 bis etwa 23 Vol.-% Öl und etwa 1,5 bis 3,5 Vol.-% von zumindest einem amphiphilen oberflächenaktiven Mittel, wenn das Adjuvans in einer Impfstoffzusammensetzung formuliert wird.
Verfahren zur Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung, umfassend die Zugabe einer Adjuvanszusammensetzung nach Anspruch 9 zu einer Antigenzusammensetzung.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Antigen aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Erysipelothrix rhusiopathiae-Antigenen, Bordetella bronchiseptica-Antigenen, Pasteurella multocida-Antigenen, Antigenen von Escherica coli-Stämmen, die bei Neugeborenen Durchfall verursachen, Actinobacillus pleuropneumoniae-Antigenen, Pasteurella haemolytica-Antigenen und Kombinationen davon.