DE69432665T3

DE69432665T3 - Multikomponentenimpfstoff aus clostridien, der saponin als adjuvans benutzt

Info

Publication number: DE69432665T3
Application number: DE69432665T
Authority: DE
Inventors: S. David ROBERTS
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1993-03-29
Filing date: 1994-03-29
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2014-03-30
Also published as: EP0692974A1; JP4129544B2; JPH08510206A; DE69432665T2; DK0692974T3; WO1994022476A1; EP0692974B2; CA2158651A1; ES2199227T5; AU689772B2; DK0692974T4; DE69432665D1; ATE240117T1; AU6493994A; EP0692974A4; CA2158651C; ES2199227T3; US6083512A; EP0692974B1; PT692974E

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Impfstoffzusammensetzungen und deren medizinische Anwendung. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung clostridiale Mehrkomponentenimpfstoffe, die ohne stabilisierende Träger oder Depotadjuvanzien, sondern mit einem leicht dispergierbaren, wasserlöslichen Adjuvans, einem Saponin, hergestellt werden.
Hintergrund der Erfindung
Die Gattung Clostridium besteht aus anaeroben, sporenbildenden, stabförmigen Bakterien. Der Organismus kommt in der Natur sowohl im Erdreich, als auch im Darmtrakt von Tieren, einschließlich Menschen, vor. Pathogene Stämme werden entweder durch Wundverunreinigungen oder durch Nahrungsaufnahme erworben. Die Mitglieder der Gattung sind für eine Vielzahl von Erkrankungen verantwortlich, die in Abwesenheit einer Impfung zu wesentlichen wirtschaftlichen Verlusten in der landwirtschaftlichen Industrie führen. Derartige Krankheiten schließen unter anderem bazilläre Hämoglobinurie (red water disease), C. sordellii-Erkrankung (big head), Klauensäuche, die Enterotoxämien, infektiöse nekrotische Hepatitis, maligne Ödeme, Botulismus und Tetanus ein.
Die antibiotische Behandlung von clostridialen Infektionen ist schwer vorhersagbar und häufig unwirksam. Dementsprechend werden derartige Infektionen im Allgemeinen prophylaktisch bekämpft, unter Verwendung von Impfstoffzusammensetzungen, die ein oder mehrere clostridiale Bakterine oder Toxoide enthalten. Siehe z.B. US-Patent Nr. 4 292 307; 4 264 588; 3 579 633; Webster, A.C. und Frank, C.L. (1985) Austral. Vet. J. 62: 112-114; Kerry, J.B. und Craig, G.R. (1979) The Veterinary Record 105, 551-554; Sterne et al. (1962) The Veterinary Record 74: 909-913. Clostridiale Toxoide sind lösliche Proteine mit verhältnismäßig geringer Antigenität und üblicherweise mangelhafter Stabilität. Somit ist es erforderlich, dass clostridiale Impfstoffe zur Erhöhung der antigenen Wirksamkeit und zur Steigerung der Stabilität Adjuvanzien enthalten. Üblicherweise werden insbesondere Aluminiumverbindungen verwendet, die sowohl clostridiale Toxoide adsorbieren und/oder ausfällen können, als auch die Toxoide an der Injektionsstelle zurückhalten können. Siehe z.B. Thomson, R.O. und Knight, P.A. (1976) Develop. Biol. Standard 32: 265-269, Thomson et al. (26. Juli 1969) The Veterinary Record S. 81-85. Andere derartige wirksame Depotadjuvanzien, wie Wasser-in-Öl-Emulsionen und Carbopol, sind ebenfalls in clostridialen Impfstoffen verwendet worden. Obwohl die vorstehend beschriebenen Adjuvanzien die Antigenität erhöhen, rufen sie, wenn sie subkutan oder intramuskulär injiziert werden, schwere persistierende lokale Reaktionen, wie Granulome, Abzesse und Verletzungen, hervor. Diese lokalen Reaktionen sind wiederum für die Verunstaltungen des Tierkörpers verantwortlich, die ausgedehntes Zurichten erfordern, diese Betrachtung ist von Bedeutung, wenn die Impfstoffe in Muskelgewebe injiziert worden sind, die als wertvolles Fleischstück vorgesehen waren.
Saponine sind natürliche glycosidische Pflanzenprodukte, die auf Grundlage mehrerer allgemeiner Eigenschaften in einer Gruppe zusammengefasst sind. Die Saponine sind oberflächenaktive Substanzen, so zeigen sie die Tendenz zur Schaumbildung, wenn sie geschüttelt werden, was ein charakteristisches Merkmal dafür ist. Saponine können rote Blutzellen lysieren, Komplexe mit Cholesterin bilden und sie sind für Fische toxisch. Saponine sind in einer Vielzahl von Impfstoffzusammensetzungen als Adjuvanzien verwendet worden, einschließlich unter anderem in Impfstoffen gegen Protozoen-Infektionen (US-Patent Nr. 4 767 622), in Impfstoffen gegen Hundestaupe (US-Patent Nr. 5 178 862); in Impfstoffen gegen Fuß- und Mundkrankheiten. Awad et al. (1986) Assiut. Vet. Med. J. 17: 201-204 vergleichen Schwarzbein-Einkomponentenimpfstoffe, die entweder Alaun, Aluminiumgel mit einem Saponin oder mit Öl-Adjuvanzien einschließen. Die Verwendung löslicher Adjuvanzien, die von der Injektionsstelle leicht dispergiert werden können, und die keine Depotwirkung, wie ein Saponin, mit einem clostridialen Mehrkomponentenimpfstoff aufweisen, sind jedoch bislang nicht beschrieben worden.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf dem überraschenden Auffinden, dass das wasserlösliche Adjuvans, ein Saponin, anstelle eines Depotadjuvants in clostridialen Mehrkomponentenimpfstoffen für Rinder verwendet werden kann. Die Impfstoffzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten ein Saponin als ihre einzige Adjuvanskomponente, sie sind sicher und nicht-toxisch.
Die vorliegende Erfindung ist auf eine clostridiale Mehrkomponentenimpfstoffzusammensetzung gerichtet, umfassend:

(a) clostridiale Bakterine oder Toxoide, jeweils abgeleitet von Clostridium chauvoei, Clostridium septicum, Clostridium novyi, Clostridium sordellii, Clostridium perfringens Typ C und Clostridium perfringens Typ D; und
(b) ein Saponin als einziger Adjuvans und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

Optional umfasst die Impfstoffzusammensetzung außerdem clostridiale Bakterine oder Toxoide, abgeleitet von Clostridium haemolyticum.
Optional umfasst die Impfstoffzusammensetzung der vorliegenden Erfindung Bakterine von Clostridium chauvoei und Toxoide von Clostridium septicum, Clostridium novyi, Clostridium sordellii, Clostridium perfringens Typ C, Clostridium perfringens Typ D, und optional Clostridium haemolyticum.
Optional umfasst der clostridiale Mehrkomponentenimpfstoff des weiteren ein Antigen, abgeleitet von ein oder mehreren Moraxella bovis, Haemophilius somnus oder Pasteurella haemolytica und/oder ein Antigen, abgeleitet von einem oder mehreren Atemwegsviren.
In einer noch weiteren Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf die Verwendung der vorstehend erwähnten Impfstoffzusammensetzungen zur Herstellung eines Medikaments zum Schutz vor oder zur Behandlung von clostridialen Infektionen bei einem Rind gerichtet.
Die Verabreichung kann intramuskulär oder subkutan erfolgen.
Beschreibung der Erfindung im Einzelnen
Zur Durchführung der vorliegenden Erfindung werden, wenn nicht anders ausgeführt, Standardverfahren angewendet, die auf dem Fachgebiet der clostridialen Mikrobiologie und Immunologie gut bekannt sind. Derartige Verfahren. sind z.B. in Sterne und Batty (1975) Pathogenic Clostridia (Butterworths, Boston); Joint OIE-1ABS "Symposium on Clostridial Products in Veterinary Medicine" in Developments in Biological Standardization, Bd. 32, S. Karger, Basel (1976) erklärt.
In dieser Beschreibung und den angefügten Ansprüchen schließen die Singularformen "ein", "eine" und "der"/"die"/ "das" die Pluralbezüge ein, solange der Inhalt es nicht ganz klar anders erkennen läßt.
A. Definitionen
Zur Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die nachfolgenden Begriffe verwendet und sie sind wie nachstehend aufgeführt definiert.
"Saponin" bedeutet jedes beliebige der Saponinglycoside, die in einer Vielzahl von Pflanzen nachgewiesen wurden, sowie Derivate davon, welche die Wirksamkeit eines Antigens erhöhen können, wenn sie mit diesem verabreicht werden. Die Saponineinheit ist im Allgemeinen ein Steroid, ein Triterpenoid oder ein Steroidalkaloid. Die Zuckereinheit kann stark variieren und sie kann z.B. unter anderem Glucose, Galactose, Pentose, Methylpentose sein.
Eine clostridiale "Mehrkomponenten"-Impfstoffzusammensetzung bezieht sich auf einen Impfstoff, abgeleitet von Kulturen aus zwei oder mehreren Serotypen der gleichen clostridialen Art und/oder von Kulturen, abgeleitet von verschiedenen clostridialen Arten.
Ein "Immunogen" bezieht sich auf eine Substanz, die dann, wenn sie in ein Tier eingeführt wird, die Immunreaktion, wie nachstehend definiert, stimuliert. Im Fall der vorliegenden Erfindung bezieht sich ein Immunogen auf einen Gesamtorganismus (lebend, getötet oder geschwächt), auf eine Präparation, die getrennt von dem Gesamtorganismus, mit dem sie in der Natur assoziiert ist, vorliegt und die sich von diesem unterscheidet (z.B. eine Toxoidpräparation, hergestellt durch Inaktivieren eines aus dem Organismus freigesetzten Toxoids oder ein Protein, enthalten in einem Zell-freien Extrakt, abgeleitet von dem Gesamtorganismus), oder auf ein Molekül, das ein oder mehre Epitope enthält, die eine Immunreaktion stimulieren.
Eine "Immunreaktion" gegenüber einer Zusammensetzung oder einem Impfstoff bedeutet die Entwicklung einer zellulären und/oder einer Antikörper-Immunreaktion in einem Wirt gegenüber der interessierenden Zusammensetzung oder dem Impfstoff, derart, dass die Symptome der Krankheit infolge der clostridialen Infektion entweder vermieden oder vermindert werden.
"Rind" bedeutet jede der verschiedenen Kuh- oder Ochsenspezies, sowohl weiblich als auch männlich. Der Begriff kennzeichnet kein besonderes Alter. Daher können damit sowohl ausgewachsene als auch neugeborenen Tiere bezeichnet werden.
B. Allgemeine Verfahren
Im Mittelpunkt der vorliegenden Erfindung steht das überraschende Auffinden, dass stabile, wirksame clostridiale Mehrkomponentenimpfstoffe ohne Verwendung von Depotadjuvanzien hergestellt werden können. Die vorliegende Erfindung liefert insbesondere Impfstoffe, die leicht dispergierbare, lösliche Adjuvanzien einschließen, das bedeutet, Adjuvanzien, die nicht über einen wesentlichen Zeitraum an der Injektionsstelle zurückgehalten werden, wodurch sie eine geringe Reaktivität gegenüber dem Gewebe aufweisen. Die Impfstoffe können intramuskulär und subkutan verabreicht werden, ohne dass schädliche Nebenwirkungen und chronische Entzündungsreaktionen, die Granulome und Abzesse hervorrufen, auftreten, wie es bei anderen clostridialen Impfstoffzusammensetzungen der Fall ist, wenn sie auf diesen Wegen verabreicht werden.
Die Immunogene können in Abhängigkeit von der Krankheit oder den zu bekämpfenden Krankheiten, von allen beliebigen clostridialen Arten und ihren Serotypen abgeleitet sein, wie von C. perfringens; C. septicum; C. tetani; C. chauvoei; C. novyi; C. sordellii; C. haemolyticum; C. botulinum; und von Serotypen dieser Spezies, sie sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Von besonderem Interesse sind Mehrkomponentenimpfstoffzusammensetzungen, die von Bakterinen von C. chauvoei und von Toxoiden von C. haemolyticum, C. chauvoei, C. septicum, C. novyi, C. sordellii und C. perfringes Typ C und D abgeleitet sind. Eine derartige Mehrkomponentenimpfstoffzusammensetzung wird hier als ein „8-Wege"-Impfstoff bezeichnet, da er nicht nur Immunität gegen den identifizierten spezifischen Organismus verleiht, sondern auch gegen C. perfringens Typ B. Ein anderer besonders bevorzugter Impfstoff enthält die gleichen Anteile wie vorstehend, mit Ausnahme von C. haemolyticum, und er wird somit als ein „7-Wege"-Impfstoff bezeichnet.
Den Impfstoffen können nicht-clostridiale Antigene zugesetzt werden, wodurch sie Schutz gegen ein breites Krank heitsspektrum bieten. Den clostridialen Mehrkomponentenimpfstoffen der vorliegenden Erfindung können beispielsweise für die Verwendung in Rindern Antigene zugesetzt werden, die sich von Moraxella bovis, Haemophilus somnus, Pasteurella hemolytica, verschiedenen Atemwegsviren als auch von anderen ableiten.
Die clostridialen Immunogene werden im Allgemeinen als Toxoide (inaktivierte Toxine) und/oder als Bakterine (getötete, inaktivierte Gesamtkulturen) bereitgestellt und sie können mittels auf dem Fachgebiet bekannter Standardverfahren hergestellt werden. Der interessierende Organismus wird beispielsweise in einem geeigneten Medium unter anaeroben Bedingungen und unter kontrollierten Temperatur- und pH-Wert-Bedingungen usw. kultiviert, die von einem Fachmann leicht ermittelt werden können. Geeignete Medien sind im Allgemeinen wässrige Lösungen aus Peptonen, üblicherweise in Konzentrationen von 1 bis 4% (w/v), die mit Extrakten aus Hefe oder derartigen Organen, wie Muskel, Leber und Pankreas, oder mit Vitaminen und anderen Wachstumsfaktoren verstärkt sein können. Ein Zucker, wie Glucose, wird als eine Kohlenstoff- und Energiequelle zugesetzt. Reduktionsmittel, wie Cystein-HCl, können ebenfalls in geringen Konzentrationen zugesetzt werden, z.B. 0,01 bis 0,05% (w/v). Die Organismen werden im Allgemeinen in Abhängigkeit von dem Wachstum oder der Toxinproduktion der jeweiligen Kultur 4 bis 72 Stunden oder länger inkubiert. Die Kultur wird anschließend wie folgt bearbeitet.
Die Kulturen werden zunächst unter Verwendung von Formalin (Formaldehydlösung, USP) in einer geeigneten Konzentration und bei einer geeigneten Temperatur und einem geeigneten pH-Wert über einen Zeitraum von 1 bis 5 Tagen, in Abhängigkeit von der jeweiligen Kultur, inaktiviert. Es ist bevorzugt, die Kulturen so wenig wie möglich dem Formaldehyd auszusetzen. Die Inaktivierung tötet die Bakterien und wandelt die Toxine in unschädliche, jedoch wirksame antigene Toxoide um. Die Verfahren zur Inaktivierung von Bakterienkulturen sind dem Fachmann gut bekannt oder sie können von ihm leicht ermittelt werden.
Sind Bakterine erwünscht, dann können die inaktivierten Kulturen anschließend als Ganzes belassen werden oder die abgetöteten Bakterien können von dem Medium mittels Zentrifugieren und/oder Filtration abgetrennt werden. Die Zellen können mittels derartiger herkömmlicher Mittel, wie durch zusätzliche Zentrifugation und/oder Dialyse, weiter aufgereinigt werden.
Sollen in den Impfstoffzusammensetzungen Toxoide verwendet werden, können die inaktivierten Kulturen konzentriert werden und die Toxoide durch Aussalzen aus dem Filtrat unter Verwendung von Ammoniumsulfat oder durch Molekularfiltration mit oder ohne Diafiltration teilweise gereinigt werden. Die Toxoide können durch Dialyse oder Zentrifugation zur Entfernung der Salze weiter gereinigt werden. Jegliche Reste des inaktivierenden Mittels können teilweise oder vollständig unter Verwendung derartiger Neutralisationsmittel wie Natriumbisulfitlösung, die in Konzentrationen zwischen etwa 0,1 bis 0,25% v/v zugesetzt wird, entfernt werden. Für die Verfahren zur Herstellung der clostridialen Toxoide siehe z.B. US-Patent Nr. 3 579 633; 4 264 588 und 4 292 307; als auch Lozano, E.A. (1981) Am. J. Vet. Res. 42: 1641-1644.
Die vorstehend beschriebenen Bakterine und Toxoide werden in Impfstoffzusammensetzungen verabreicht, die ein leicht dispergierbares (d.h. ohne Depotwirkung), lösliches Adjuvans einschließen, wodurch chronische Reizungen an der Injektionsstelle vermieden werden.
Dispergierbare Adjuvanzien ohne Depotwirkung zur Verwendung mit den vorliegenden Impfstoffzusammensetzungen sind Saponine. Saponine sind kommerziell erhältlich, z.B. von Berghausen Corporation (Cincinatti, OH), Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), Aldrich (Milwaukee, WI), Alfa (Ward Hill, MA). Alternativ können Saponine aus beliebig vielen Pflanzenarten isoliert werden, wie unter anderem aus Gypsophilia sp., Saponaria sp., Quillaja saponaria, Quillaja molina, Galenika wie: Akebia quinata, Fatsia japonica, Caulophyllum robustum, Hedera rhombea, Clematis chinensis, Pulsatilla cernua, Sapindus muku rossi, Panax japonicum, Glycyrrhiza glabra, Glycyrrhiza uralensis, Polygala senega, Platycodon grandiflorum, Polygala tenuifolia, Achyranthes fauriei, Achyranthes bidentata, Cyclamen europaeum, Primula officinalis, Bupleurum falcatum, Panax ginseng, Panax notoginseng, Panax quinquefolium. Verfahren zur Extraktion von Saponinen aus diesen Quellen sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z.B. US-Patent Nr. 5 057 540 und 4 501 734, als auch WO88/09336.
Die Impfstoffzusammensetzungen werden im Allgemeinen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Exzipienten formuliert. Geeignete Träger sind beispielsweise Wasser, Salzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder ähnliche und Kombinationen davon. Zudem können die Träger, falls erwünscht, geringe Mengen an derartigen Hilfsmitteln, wie Feuchtigkeits- oder Emulsionsmittel und pH-Wert puffernde Mittel, enthalten. Obwohl die zur Herstellung der Toxoide verwendeten inaktivierenden Mittel auch als Konservierungsmittel dienen können, können den Impfstoffformulierungen zusätzliche Konservierungsmittel zugesetzt werden. Derartige Konservierungsmittel sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und sie schließen sowohl Thimerosal, Phenol und phenolische Verbindungen als auch Antibiotika ein. Geeignete Impfstoffträger und -zusätze sind dem Fachmann gut bekannt oder erschließen sich ihm. Siehe z.B. Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18. Ausgabe, 1990. Besonders bevorzugte Zusammensetzungen sind aus einer wässrigen Suspension oder Lösung zusammengesetzt, die clostridiale Bestandteile enthält, und sie weisen vorzugsweise einen pH-Wert von annähernd 7 auf.
Injizierbare Impfstoffformulierungen werden beispielsweise hergestellt, indem wirksame Mengen aus zwei oder mehreren der vorstehend beschriebenen Bakterine und/oder Toxoide in Anteilen kombiniert werden, die sich aus ihrem ermittelten Antigengehalt ergeben, die genaue Menge kann der Fachmann leicht bestimmen. In der vorliegenden Erfindung entspricht eine „wirksame Menge" eines clostridialen Bestandteils der Menge, die eine Menge an zirkulierendem Antikörper erzeugt, welche ausreichend ist, um Schutz vor den durch Clostridium hervorgerufenen Krankheitssymptomen zu bieten oder diese zu vermindern. Solche Mengen können in Einheiten ausgedrückt werden. Wirksame Mengen an clostridialen Bakterinen werden z.B. üblicherweise als Opazitäts- oder Absorptionseinheiten ausgedrückt (OU bzw. AU). Diese Einheiten basieren auf der optischen Dichte (OD) der Kultur, die bei einer geeigneten Wellenlänge, wie bei 625 nm, gemessen wird. Der OD-Wert wird anschließend mit dem Volumen der Kultur in einer Impfstoffdosis multipliziert. Eine Antigendosis von drei OU würde beispielsweise durch 0,5 ml einer Kultur bereitgestellt werden, die eine OD von sechs aufweist. Wirksame Mengen an Toxoiden können in Form von L+-Werten ausgedrückt werden. Eine L+-Einheit an einem Toxoid entspricht einer Einheit an Standardantitoxin, die mittels der Toxin-Antitoxin-Titration in Mäusen bestimmt wird. (B.C. Jansen in Developments in Biological Standardization, Bd. 32, S. 91, S. Karger, Basel (1976)). Wirksame Mengen können ebenfalls in Mäusen anhand der minimalen letalen Dosis (MLD) ermittelt werden, die der Dosis entspricht, die für mindestens 80% der getesteten Mäuse letal ist. Wirksame Mengen können auch im Hinblick auf die Gesamtkombinationskraft (TCP)-Einheiten ausgedrückt werden, die unter Verwendung von Immunabsorbentassays bestimmt werden, indem die Fähigkeit des Toxoids gemessen wird, in einer Kultur die Kombinationsstellen eines Antitoxinmoleküls eines standardisierten Antiserums abzudecken und zu neutralisieren.
Wirksame Mengen an typischen clostridialen Bestandteilen sind wie folgt:

C.chauvoei – etwa 1,5-4 OU, vorzugsweise etwa 2-2,5 OU und optimal etwa 2,28 OU;
C.septicum – etwa 500-2000 MLD, vorzugsweise etwa 800-1200 MLD und optimal etwa 900 MLD vor der Inaktivierung;
C. novyi – etwa 5000-30000 MLD, vorzugsweise etwa 10000-20000 MLD und optimal etwa 15 000 MLD vor der Inaktivierung;
C. sordellii – etwa 25-100 L+, vorzugsweise etwa 40-60 L+ und optimal etwa 50 L+ vor der Inaktivierung;
C. perfringens, Typ C – etwa 200-500 L+, vorzugsweise etwa 300-400 L+ und optimal etwa 375 L+ vor der Inaktivierung;
C. perfringens, Typ D – etwa 50-200 L+, vorzugsweise etwa 80-120 L+ und optimal etwa 100 L+ vor der Inaktivierung; und wahlweise
C. haemolyticum – etwa 150-500 L+, vorzugsweise etwa 250-300 L+ und optimal etwa 270 L+ vor der Inaktivierung. Ganze C. haemolyticum-Zellen können gleichfalls in einer Menge von etwa 2-8 OU, bevorzugter von etwa 4-5 OU und optimal von etwa 4,5 OU zugesetzt werden. Zusätzliche wirksame Mengen dieser und anderer clostridialer Antigene können von dem Fachmann anhand der Standard-Dosis-Reaktions-Kurven leicht ermittelt werden.

Das dispergierbare Adjuvans ohne Depotwirkung wird im Allgemeinen bis zu einer Endkonzentration zwischen etwa 0,01% w/v bis etwa 0,1% w/v, bevorzugter zwischen etwa 0,03% w/v bis etwa 0,08% w/v und optimal bis etwa 0,05% w/v zugesetzt. Nach dem Zusammenfügen kann steriles Wasser oder ein anderer geeigneter Träger bis zu dem erforderlichen Volumen zugesetzt werden. Anschließend wird der pH-Wert im Allgemeinen auf einen Wert zwischen 6,5 bis 7,5 eingestellt. Der Restgehalt an Formaldehyd kann in Form von Formalin bestimmt werden und falls erforderlich, auf einen Gehalt von nicht mehr als 0,3% (v/v), und bevorzugter von nicht mehr als 0,2% (v/v) eingestellt werden, um die destabilisierende Wirkung des Formaldehyds auf die nicht-adsorbierten clostridialen Toxoide während der langzeitigen Lagerung zu vermeiden. Am meisten bevorzugt beträgt der Formalingehalt während der Lagerung der Impfstoffzusammensetzungen 0,2% oder weniger.
Zur Immunisierung werden die Impfstoffzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung einem Rind im Allgemeinen parenteral, vorzugsweise durch intramuskuläre oder subkutane Injektion, verabreicht. Es sind jedoch andere Wege der Verabreichung wie intraperitoneale und intravenöse Injektion, annehmbar. Die zu verabreichende Menge ist abhängig von dem zu behandelnden Tier, von der Kapazität des Immunsystems des Tieres, Antikörper zu erzeugen, von dem Grad des erwünschten Schutzes und von der einzelnen, zu bekämpfenden clostridialen Infektion. Um beispielsweise ein Rind mit den vorstehend beschriebenen Impfstoffzusammensetzungen zu immunisieren, werden im Allgemeinen zwischen 0,5 ml bis 10 ml, bevorzugter 1 bis 5 ml, verabreicht. Andere wirksame Dosen können von einer auf diesem Gebiet arbeitenden Person durch Routineversuche leicht erstellt werden.
Das Subjekt wird mittels Verabreichung der Impfstoffformulierung immunisiert, wobei mindestens eine Dosis und bevorzugter zwei oder mehrere Dosen verabreicht werden. Dem Tier werden jedoch so viele Dosen verabreicht, wie es zur Aufrechterhaltung der Immunität gegen clostridiale Infektionen erforderlich ist. Es kann beispielsweise erwünscht sein in regelmäßigen Abständen, d.h. alle sechs Monate oder jährlich Auffrischungsinjektionen zu geben, um die Immunität auf einem wirksamen Spiegel zu halten.
Für optimale Ergebnisse können den Tieren die vorstehend erwähnten Impfstoffzusammensetzungen vor dem Entwöhnen verabreicht werden und eine zweite Dosis kann im Abstillalter gegeben werden. Trächtigen Tieren, die vorher nicht geimpft worden sind, können zwei Dosen verabreicht werden, oder sie können kurz vor dem Ende der Trächtigkeit geimpft werden. Tieren, die vorher geimpft wurden, kann vor dem Kalben eine einzelne Auffrischungsdosis verabreicht werden.
C. Experimenteller Teil
Nachstehend sind Beispiele für spezifische Ausführungsformen zur Durchführung der vorliegenden Erfindung aufgeführt. Die Beispiele dienen nur der Veranschaulichung und sie sollen den Umfang der vorliegenden Erfindung in keiner Weise einschränken.
Im Hinblick auf die verwendeten Zahlen (z.B. Mengen, Temperaturen usw.) wurde sich um Genauigkeit bemüht, einige experimentelle Fehler und Abweichungen sollten natürlich gestattet sein.
Beispiel 1
Herstellung eines clostridialen 8-Wege-Mehrkomponentenimpfstoffs, der ein Saponin als Adjuvans einschließt
Ein clostridialer 8-Wege-Impfstoff wurde unter Verwendung von C. chavoei, C. haemolyticum, C. septicum, C. novyi, C. sordellii, C. perfringens Typ C und C. perfringens Typ D wie folgt formuliert. (Der Impfstoff wird als 8-Wege-Impfstoff bezeichnet, da er nicht nur gegen die aufgeführten Organismen Schutz verleiht, sondern auch gegen C. perfringens Typ B).
Die vorstehend genannten clostridialen Arten wurden unter Anwendung von auf dem Fachgebiet gut bekannten Standardverfahren kultiviert. Die Kulturen wurden kontrolliert, indem die optische Dichte bei 625 nm gemessen wurde. Wenn die optische Dichte der Kulturen maximale Werte erreichte, dann wurde Formalin bis zu einer Endkonzentration von 0,7% (v/v) bis 0,8% (v/v) zugesetzt. Die Kulturen wurden anschließend über einen Zeitraum von annähernd 1 bis 3 Tagen inaktiviert.
Nach der Inaktivierung wurden die C. perfringens-Kulturen mittels Zentrifugation aseptisch geklärt und bei 4°C gelagert. Falls erforderlich, wurden die inaktivierten, geklärten Kulturen mittels Ultrazentrifugation konzentriert, um die Kultur auf das Volumen zu verringern, das für eine serien mäßige Zusammenstellung und zur Standardisierung des Produkts erforderlich ist.
Zur Vermeidung von Destabilisierungsvorgängen, die infolge höherer Formalinkonzentrationen in Abwesenheit von Aluminiumhydroxidgelen ablaufen können, wurde allen Kulturen nach Beendigung der Bearbeitung (d.h. nach der Konzentrierung und der Klärung) Natriumbisulfitlösung (37% (w/v)) in einem Überschuss von 0,2% zugesetzt, um das restliche freie Formalin zu neutralisieren.
Die Kulturen wurden zusammengefasst, sodass jede Impfstoffdosis eine Standardmenge an jeder Kulturfraktion enthält, die wie folgt ist: C. chauvoei – 2,28 OU, C. septicum – 900 MLD, C. novyi – 15 000 MLD, C. sordellii – 50 L+, C. perfringens Typ C – 375 L+, C. perfringens Typ D – 150 L+, C. haemolyticum – 270 L+ und 4,5 OU Bakterienzellen.
Das erforderliche Volumen für jede Kultur wurde bestimmt, indem die Menge an Antigen, die pro Dosis erforderlich ist, durch den Antigengehalt der verwendeten Kultur dividiert wurde und anschließend mit der Anzahl der erforderlichen Dosen multipliziert wurde.
Das Pre-Inaktivierungs-Toxin-Assay einer C. novyi-Kultur zeigte, das sie 80 000 MLD/ml enthält und die Kultur wurde standardisiert auf 15 000 MLD/Dosis eingestellt. Die Menge an Kultur, die für eine 1500 Liter-Serie von 300 000 Dosen erforderlich ist, betrug: (15 000/80 000) × 300 000 = 56,25 Liter.
Ein Beispiel für das serienmäßige Zusammenfügen wurde wie folgt durchgeführt:
Es wird angenommen, dass nach Beendigung der Bearbeitung Bestandteile der Kulturen verfügbar waren, welche die nachfolgenden berechneten Antigenwerte aufwiesen:

Aus den in Tabelle 1 dargestellten Bestandteilen wurde eine 1500 Liter-Serie zusammengefügt. Tabelle 1

Bestandteil	Volumen (l)
C. chauvoei	57
C. septicum	90
C. novyi	56,25
C. sordellii	214
C. perfringens Typ C	281,25
C. perfringens Typ D	375
C. haemolyticum	275
Gesamtkulturvolumen	1298,5 7,5 l Saponinlösung (10% w/v) 194 l steriles Wasser
Gesamtvolumen	1500 l

Das Adjuvans, ein Saponin, wies eine Endkonzentration von 0,05% (w/v) auf. Die Formalinkonzentration des Produkts wurde erneut getestet und auf 0,15-0,2% eingestellt. Formalin war das einzige Konservierungsmittel. Der pH-Wert der zusammengefügten Serie wurde auf 6,8-7,0 eingestellt.
Beispiel 2
Wirksamkeit des clostridialen Mehrkomponentenimpfstoffs
Ein, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellter 8-Wege-Impfstoff wurde der Testung bezüglich der Wirksamkeit in Kaninchen und Meerschweinchen unterzogen. Für jeden Organismus wurden USDA-Standardtests (9 CFR 113,106-,112) angewendet, mit Ausnahme von C. septicum, für den kein USDA-Test existiert.
Zusätzlich zu dem Standard-Meerschweinchen-Test wurde C. haemolyticum bezüglich der Antitoxin-Reaktion titriert.
Alle Antitoxin-Titrationen wurden mit Serum aus einem einzigen Ansatz durchgeführt, der von geimpften Kaninchen erhalten wurde. Mindestens acht Kaninchen mit einem Gewicht von vier bis acht Pfund wurde zweimal in Abständen von 20-23 Tagen subkutan eine Dosis verabreicht, die der Hälfte der Dosis für ein Rind entsprach. Die Kaninchen wurden 14 bis 17 Tage nach der Wiederimpfung ausbluten lassen. Das Serum von mindestens sieben Kaninchen wurde gepoolt und die verschiedenen Antitoxine wurden bestimmt.
Wie aus Tabelle 2 ersichtlich, entspricht das Produkt dem Wirkungsstandard oder übertrifft diesen. Der C. haemolyticum-Bestandteil verhielt sich sowohl in dem offiziellen Meerschweinchen-Wirkungstest als auch in dem inoffiziellen Antitoxin-Reaktionstest in Kaninchen sehr gut.
Tabelle 2 Labortier-Wirkungstests mit einem clostridialen 8-Wege-Impfstoff

* alle gesund
** Hausstandards

Beispiel 3
Herstellung eines clostridialen 7-Wege-Mehrkomponentenimpfstoffs, der ein Saponin als Adjuvans einschließt
Ein clostridialer 7-Wege-Mehrkomponentenimpfstoff wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt, mit der Ausnahme, dass der C. haemolyticum-Bestandteil in der Formulierung nicht eingeschlossen war. Dieser Impfstoff wurde in Untersuchungen bezüglich lokaler Reaktionen bei Rindern, der Antikörperreaktionen bei Rindern und bezüglich der Antikörperreaktionen und dem Schutz gegenüber Infektionen bei Meerschweinchen mit einem identischen Impfstoff verglichen, der kein Adjuvans enthielt, sowie mit dem kommerziell verfügbaren clostridialen Mehrkomponentenimpfstoff Ultrabac 7 (Smith Kline Beecham), der 25% Al(OH)₃-Gel als Adjuvans einschließt.
A. Sicherheit
Untersuchung 1 Zehn Rinder wurden zweimal in Abständen von 4 Wochen subkutan mit jeweils 5 ml der drei Impfstoffe an getrennten Stellen geimpft. Die Reaktionen an den Injektionsstellen der Rinder wurden vier und sechs Wochen nach der erneuten Impfung beurteilt. Die Ergebnisse sind in den nachfolgenden Tabellen dargestellt.
Tabelle 3 Reaktionen an den Injektionsstellen der Rinder, denen mehrere Impfungen von einem clostridialen 7-Wege-Impfstoff verabreicht wurden, der verschiedene Adjuvanzien enthält, 4 Wochen nach der erneuten Impfung

* Volumen = (π/24) × Tiefe (3 × Durchmesser² + 4 × Tiefe²) cc (Spitze der konstanten Kurve)

Tabelle 4 Reaktionen an den Injektionsstellen der Rinder, denen mehrere Impfungen von einem clostridialen 7-Wege-Impfstoff verabreicht wurden, der verschiedene Adjuvanzien enthält, 6 Wochen nach der erneuten Impfung

Wie aus den Tabellen 3 und 4 ersichtlich, induzierte Ultrabac 7, das 25% v/v Aluminiumhydroxidgel enthält, dann, wenn es Rindern subkutan injiziert wurde, lokale Reaktionen. Die Rinder wiesen nach der zweiten Injektion schlechte Reaktionen auf, wobei die erste Dosis die Tiere offensichtlich sensibilisiert hatte. Die Tabellen zeigen die Volumen der Schwellungen, die aus der zweiten Dosis resultieren, und die nach 4 und 6 Wochen gemessen wurden. In 6 von 10 Rindern waren die Reaktionen chronisch und noch nach 6 Wochen messbar. Die anderen beiden Impfstoffe, entweder nur mit einem Saponin als einziges Adjuvans oder ohne Adjuvans, induzierten für wenige Tage transiente Schwellungen. Bei keinem der Impfstoffe war an den Injektionsstellen nach 4 oder 6 Wochen irgend etwas nachweisbar. Keines der Rinder zeigte irgendwelche klinischen Symptome, weder lokale noch systemische.
Untersuchung 2 Vierzig Rinder (20 Fleisch- und 20 Milchtiere) wurden mit einem clostridialen 8-Wege-Impfstoff geimpft, der ein Saponin als Adjuvans enthielt, so wie er in Beispiel 2 hergestellt wurde. Die Tiere wurden zweimal in Abständen von 2 Wochen mit 5 ml tief in den Schenkel geimpft. Zehn Tiere, fünf von jeder Art, wurden 30 Tage nach der zweiten Dosis geschlachtet und die anderen fünf wurden 61 Tage nach der zweiten Dosis geschlachtet. Die Injektionsstellen wurden abgetrennt und die Proben wurden für die Histopatholgie einbehalten.
In jedem Fall wurde eine schmale Bande an fibrösem Narbengewebe gefunden, welche vertikal innerhalb des injizierten Muskels verlief. Die Länge der Bande betrug 5 bis 10 cm. Die Banden wiesen nach 4 bis 6 Wochen im Mittel eine Dicke von etwa 1 cm auf. Nach 9 bis 11 Wochen war das Narbengewebe verschwunden und durch normalen Muskel ersetzt worden. In diesem Stadium lag das Narbengewebe in Form eines flachen Bandes vor und es war schwierig, dieses zu entdecken und von den normalen fibrösen Geweben in den Fascien zwischen den Muskeln zu unterscheiden.
Die Histopathologie bestätigte die rein fibröse Natur der Reaktion und erbrachte keine Beweise für eine Eiter- oder Abzeßbildung. Es ist unwahrscheinlich, dass derartige leichte Vernarbungen zu entdecken sind oder in der Fleischerei zu einem Verlust infolge des Zurichtens führen.
Untersuchung 3 Um die Unterschiede in der Reaktivität auf die subkutane Injektion beweisen zu können, wurden die Rinder hinter die Schulter oberhalb des Rippenbogens injiziert, das zweite Mal nach einem Abstand von 21 Tagen. Die zweite Dosis wurde 15 bis 20 cm hinter die erste verabreicht. Fünf Tiere wurden mit 5 ml Ultrabac 8 geimpft und fünf mit dem 8-Wege-Impfstoff, der ein Saponin enthielt, so wie er in der Untersuchung 2 verwendet wurde. Während der ersten Woche induzierte das Produkt mit Saponin eine flache Schwellung, die geringer war als die durch Ultrabac 8 induzierte. Nach 2 bis 3 Wochen waren die Schwellungen, die durch das Produkt mit Saponin induziert worden waren, fast vollständig verschwunden. Die Schwellungen, die durch Ultrabac 8 induziert worden waren, wurden kompakter und umlaufender, wobei sie aussahen, als wäre ein Hühnerei unter die Haut implantiert. Diese Schwellungen zeigten nach 51/2 Wochen nur eine geringe Auflösung. Zu diesem Zeitpunkt waren die Injektionsstellen des Saponinprodukts vollständig unsichtbar.
Die in dieser Untersuchung verwendeten Rinder waren reinrassig oder eingekreuzte Aberdeen Angus- oder Herford-Rinder, wobei ein Kalb jedoch der Charolais-Rasse anzugehören schien. Dieses Kalb wurde mit Ultrabac 8 geimpft und es war das einzige Kalb in der Ultrabac 8-Gruppe, das nicht die beschriebene Reaktion aufwies.
B. Antikörperreaktion
Gruppen von 8 Tieren wurden subkutan mit dem Saponin enthaltenden 7-Wege-Impfstoff oder mit Ultrabac 7 geimpft oder sie wurden als Negativkontrolle ungeimpft belassen. 5 ml der Impfstoffe wurden zweimal in Abständen von 4 Wochen injiziert und den Tiere wurden nach 2 Wochen und erneut 3 Monate später Blut entnommen. Die Antikörperreaktionen sind in den Tabellen 5 und 6 dargestellt. Meerschweinchen wurden in ähnlicher Weise geimpft und die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt. Wie ersichtlich, unterstützen die Ergebnisse mit den Meerschweinchen die Ergebnisse, die bezüglich der Antikörperreaktionen bei den Rindern erhalten wurden. Diese Untersuchungen zeigen auch, dass ein Saponin bezüglich des Schutzes von Meerschweinchen gegenüber der virulenten Herausforderung für C. chauvoei bessere Werte hinsichtlich der USDA-Wirkungsstandards aufwies, als Al(OH)₃-Gel (Ultrabac 7).
Tabelle 5 Reaktionen der Rinder auf die clostridialen 7-Wege-Impfstoffe Antikörpertiter des Serumpools nach 2 Wochen (8/Gruppe)

* C. chauvoei stellt kein Toxin her und induziert kein Antitoxin
** Hausstandard

Tabelle 6 Reaktionen der Rinder auf die clostridialen 7-Wege-Impfstoffe Antikörpertiter des Serumpools nach 3 Monaten (8/Gruppe)

Tabelle 7 Reaktionen der Meerschweinchen auf die clostridialen 7-Wege-Versuchsimpfstoffe oder Ultrabac 7

* Reizung gegenüber Meerschweinchen, erstes und zweites Stadium

Somit werden neuartige clostridiale Impfstoffzusammensetzungen, die Saponine als Adjuvanzien verwenden und Verfahren zur Verabreichung derselben offenbart.

Claims

Clostridiale Mehrkomponentenimpfstoffzusammensetzung, umfassend clostridiale Bakterine oder Toxoide, jeweils abgeleitet von Clostridium chauvoei, Clostridium septicum, Clostridium novyi, Clostridium sordellii, Clostridium perfringens Typ C und Clostridium perfringens Typ D, einem Saponin als einzige Adjuvans-Komponente und einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, die weiterhin clostridiale Bakterine oder Toxoide, abgeleitet von Clostridium haemolyticum, umfasst.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Zusammensetzung Bakterine von Clostridium chauvoei und Toxoide von Clostridium septicum, Clostridium novyi, Clostridium sordellii, Clostridium perfringens der Typen C und D umfasst.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 3, worin die Zusammensetzung weiterhin Toxoide von Clostridium haemolyticum umfasst.
Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die weiterhin ein Antigen, abgeleitet von einem oder mehreren von Moraxella bovis, Haemophilus somnus oder Pasteurella haemolytica oder abgeleitet von einem oder mehreren Atemwegsviren, umfasst.
Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, die weiterhin ein Konservierungsmittel umfasst.
Verwendung der Impfstoffzusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Vorbeugung oder Behandlung von clostridialer Infektion bei einem Rind.