DE3786304T2

DE3786304T2 - Immunostimulierende Arzneimittel.

Info

Publication number: DE3786304T2
Application number: DE87305911T
Authority: DE
Inventors: Iii Carl K Edwards Edwards Iii; Martin J Jacobs; Paula Myers-Keith
Original assignee: International Minerals and Chemical Corp
Current assignee: International Minerals and Chemical Corp
Priority date: 1986-07-03
Filing date: 1987-07-03
Publication date: 1993-10-21
Anticipated expiration: 2007-07-04
Also published as: EP0251813B1; ATE90872T1; EP0251813A3; US4842862A; DE3786304D1; ES2056822T3; EP0251813A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen immunstimulierende Agentien und insbesondere die Verwendung von Resorcylsäurelacton (RAL) -Derivaten als immunstimulierende Agentien.
Das Immunsystem von Vertebraten ist insofern einzigartig, als es ein verzweigtes Zell- und Gewebesystem umfaßt, und nicht auf ein einzelnes Organ konzentriert ist. Bei Menschen gibt es insgesamt etwa 1012 Zellen in dem System einschließlich der Milz-, Leber-, Thymus-, Knochenmark-, Lymphknoten- und den zirkulierenden Zellen von Blut und Lymphflüssigkeit. Zusammengenommen besitzen diese Zellen eine Masse von etwa 2 kg, was etwa dem Gewicht einer ausgewachsenen Leber entspricht.
Das Immunsystem schützt einen Organismus vor Erkrankungen, indem es über einen komplizierten Mechanismus auf die die Krankheit verursachenden Antigene reagiert, wobei der Mechanismus das Antigen erkennt, inaktiviert und zerstört. Voraussetzung für die Wirksamkeit ist, daß das Immunsystem zuerst zwischen potentiellen Antigenen in Form von Molekülen aus dem zu schützenden Organismus und den tatsächlichen, fremden, eindringenden Antigenen unterscheidet. Das Immunsystem hat die fremden Antigene zu lokalisieren und zu zerstören, wobei dieser Prozeß nicht nur Antikörper und Lymphozyten, sondern auch mehrere Plasmaproteine benötigt, welche zusammen einen Verteidigungsmechanismus mit der Bezeichnung Komplementsystem bilden.
Das Zusammenwirken von Fremdantigenen und Komponenten des Immun- und Komplementsystems stimuliert die Produktion von biologisch aktiven Substanzen, welche die immunologische Erkennung amplifizieren. Diese Substanzen vergrößern lokal die Gefäßpermeabilität und Gefäßstasis und ziehen chemotaktisch zirkulierende phagocytische Zellen an den Ort der Immunreaktionen an. Diese Prozesse bedingen eine lokalisierte Entzündung und die Antigene werden von den herangezogenen Zellen aufgenommen.
Das Immunsystem erlangt nach einer Wechselwirkung mit einem bestimmten Antigen Immunität gegenüber dem spezifischen Antigen. Ein späterer Kontakt mit dem gleichen Antigen führt zu einer schnellen Stimulierung des Immunsystems, welches das Antigen schnell zerstört, bevor der Organismus dadurch geschädigt werden kann. Diese Immunität gegenüber einem spezifischen Antigen kann durch zufälligen Kontakt mit einem Antigen hervorgerufen oder durch Exposition des Immunsystems mit einer nicht-letalen Dosis des Antigens, einer Komponente des Antigens oder biologisch inaktiven Antigenen induziert werden.
Die dem Immunsystem inhärente Einschränkung besteht jedoch in dessen Spezifität. Das Immunsystem behält Immunität lediglich für die spezifischen Antigene bei, mit denen es früher reagiert hatte. Trifft das Immunsystem erstmals auf ein anderes Antigen, so kann es nicht so schnell auf den neuen Eindringling antworten, wie auf ein Antigen, dem es bereits früher begegnet ist und gegenüber dem Immunität erworben wurde. Der Organismus bleibt der Krankheit und anderen schädigenden Effekten zugänglich, welche durch neue eindringende Antigene verursacht werden, obwohl das Immunsystem Immunität gegenüber tausenden anderen spezifischen Antigenen erworben hat. Aufgrund seiner Spezifität besitzt das Immunsystem keinen Mechanismus zur Erlangung einer allgemeinen Immunität gegenüber Antigenen. Es ist daher ein Verfahren erforderlich, welches das Immunsystem unspezifisch stimulieren kann, um eine wirksame Immunität gegenüber Antigenen im allgemeinen zu bewirken. Das Immunsystem könnte damit schnell jedes in den Organismus eindringende Antigen zerstören. Ein derartiges Verfahren würde die Fähigkeit des Immunsystems, Krankheiten zu bekämpfen verbessern und die allgemeine Wirksamkeit des Vertebraten-Immunsystems erhöhen.
Verfahren gemäß dem Stand der Technik zur Stimulation des Immunsystems sind: Die US-Patentschrift 4 420 481 von Okazaki et al beschreibt die Verwendung von Piperazinverbindungen als immunstimulierende Mittel zur Behandlung von Arthritis und anderen Immunsystemerkrankungen. Das US-Patent 4 281 120 von Herrling offenbart die Verwendung von Derivaten mit immunstimulierenden Eigenschaften zur Anti-Infektionstherapie bei Säugern, einschließlich dem Menschen. Das US-Patent 4 173 641 von Kraska offenbart Glycerinderivate, welche als unspezifische Stimulatoren der zellvermittelten Immunantwort dienen. Das US-Patent 4 444 767 von Torelli et al offenbart die Verwendung von 3-Amino-pregen-6-en-Derivaten als Stimulatoren des Säuger-Immunsystems. Das US-Patent 4 571 336 von Houck et al offenbart immunstimulierende Peptide, welche sich zur Behandlung von Säugern und Vögeln eignen, die durch Virus- oder Pilzinfektionen oder andere Traumata gefährdet sind.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen, immunstimulierenden PAL-Derivate Zearalenon, Zearalanon, Zearalen, Zearalan, Zearalenol, Zearalanol und Dideoxyzearalan ist in den US-Patenten mit den Nummern 3 196 019, 3 239 354, 3 239 341, 3 239 348, 3 239 345 und 3 453 467 offenbart. Einige dieser Verbindungen werden als Wachstumspromotoren bei Tieren verwendet.
So werden z. B. in der GB-A 2 050 374 bestimmte Allyl- und Propylderivate von RAL-Verbindungen beschrieben, welche sich als tierische Wachstumspromotoren eignen.
Die östrogenische Aktivität von Zearalan, Zearalenon und bestimmten anderen RAL-Derivaten wird von Brooks et al in Proc. Soc. Exp. Biol. Med. (1971), 137(1), 101-4 und Schoental in ACS Monogr., (1984), 182, 1137-69 diskutiert.
Die Eigenschaften und biologischen Aktivitäten der RAL- Derivate Zearalenon, Zearalanon, Zearalenol und Zearalanol wird von Hidy et al in Adv. Appl. Microbiol., (1977), 22, 59-82 zusammengefaßt. Es gibt keinerlei Hinweis auf irgendeine immunologische Aktivität.
Die GB-A-1 152 680 schlägt vor, bestimmte RAL-Derivate wie Zearalenon, Zearalanon, Zearalanol und Zearalan bei der Behandlung von Entzündungen zu verwenden.
Kelly beschreibt in Am.J.Vet.Res. (1984), 45, 2617-21 die Wirkungen von Zearalanol bei der Modifikation der Kontaktreaktion von der Kälte ausgesetzten Kälbern. Diese Effekte erscheinen durch die Wirkung von Zearalanol auf den Plasmahormonspiegel bewirkt zu werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, ein Medikament zur unspezifischen Stimulierung des Vertebraten-Immunsystems bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Medikament zur Verstärkung der Vertebraten-Resistenz gegenüber Antigenen, wie krankheitsverursachenden Organismen und Pathogenen, bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Medikament zur Impfung eines Vertebratens gegen krankheitsverursache Pathogene bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Adjuvans bereitzustellen, welches in Kombination mit herkömmlichen Impfstoffen verwendet werden kann.
Diese Aufgaben werden gelöst, indem man immunstimulierende Mengen der RAL-Derivate Zearalenon, Zearalanon, Zearalen, Zearalan, Zearalenol, Zearalanol und Dideoxyzeralan an Vertebraten verabreicht.
Gemäß einem Gegenstand der vorliegenden Erfindung wird daher ein Resorcylsäurelacton (RAL)-Derivat bereitgestellt, ausgewählt unter Zearalenon, Zearalanon, Zearalen, Zearalan, Zearalenol, Zearalanol, Dideoxyzearalan und den pharmazeutisch verträglichen Salzen davon zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung bei der unspezifischen Stimulierung der Immunantwort eines Vertebraten auf eine Krankheit, Infektion, Operation oder Verletzung. Vorzugsweise werden die Verbindung alleine oder in Kombination in Dosen von 1 bis 20 mg/kg Körpergewicht vor einer voraussichtlichen Infektion oder einem Trauma verabreicht, um das Auftreten der klinischen Symptome der resultierenden Krankheit zu verhindern oder zu lindern. Die Verbindungen können auch verabreicht werden, nachdem die klinischen Symptome auftreten, um das Immunsystem bei der Bekämpfung der Krankheit zu unterstützen. Die erfindungsgemäßen RAL-Derivate verkürzen die Zeit bis zur und erhöhen das Ausmaß der Antwort gegenüber den eindringenden Antigenen, wodurch eine effektive "Immunität" gegenüber neuen, in den Organismus eindringenden Antigenen ermöglicht wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform verabreicht man Zearalan einem Vertebraten in Dosen von 1 bis 20 mg/kg Körpergewicht, um das Immunsystem zu stimulieren und um den Vertebraten gegenüber Antigen-induzierten Infektionen, Erkrankungen oder anderen Traumata resistenter zu machen. Vorzugsweise injiziert man Zearalan vor der vermuteten Infektion oder dem Trauma, um die resultierende Erkrankung zu vermeiden. Die Verbindung kann aber auch verabreicht werden, nachdem die Krankheit auftritt, um das Immunsystem bei der Bekämpfung der Erkrankung zu unterstützen.
Andere Aufgaben, Vorteile und neuartige Eigenschaften der Erfindung ergeben sich aus der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung.
Der Ausdruck "Vakzin" (Impfstoff), der hierin verwendet wird, steht für jedes antigene Präparat in Dosisform, die mit der Aufgabe verabreicht wird, die spezifischen immunologischen Verteidigungsmechanismen der Empfänger auf bestimmte Pathogene oder toxische Agentien zu stimulieren. Im allgemeinen enthalten Vaccindosen (a) inaktivierte Antigene, wie z. B. bei der Typhus- und Choleraimpfung, (b) lebende attenuierte Antigene, wie z. B. bei der Gelbfieber- und Tuberkuloseimpfung, (c) Antigenextrakte von spezifischen Antigenen und (d) Toxoide. Der Ausdruck "Adjuvans", der hierin verwendet wird, steht für jegliche Substanz, die bei Verabreichung in Kombination mit einem Antigen die Immunantwort auf das Antigen erhöht oder qualitativ beeinflußt. Adjuvantien werden üblicherweise mit dem Ziel verabreicht, die Immunogenität eines Antigens zu erhöhen, um eine höhere Antikörperbildungsgeschwindigkeit für eine schnellere zellvermittelte Immunantwort auf das Antigen anzuregen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in einem Impfstoff für die Impfung von Vertebraten enthalten sein. Man verabreicht in Kombination eine zur Immunisierung eines Vertebraten gegenüber einer herkömmlichen Erkrankung ausreichende Impfstoffdosis und eine Adjuvansdosis, welche die erfindungsgemäßen RAL-Derivate enthält. Das Adjuvans verabreicht man unabhängig vom Impfstoff vor, gleichzeitig oder im Anschluß an die Impfstoffverabreichung. Die RAL-Derivat-Adjuvantien können aber auch mit der Impfstoffdosis vermischt sein und eine Einzeldosis bilden, welche die Impfstoffdosis und die Adjuvansdosis enthält.
Die immunstimulierenden RAL-Derivate gemäß vorliegender Erfindung sind Zearalenon, Zearalanon, Zearalen, Zearalan, Zearalenol, Zearalanol und Dideoxyzearalan.
Zearalenon stellt man her, indem man den Organismus Gibberella zeae (Gordon) kultiviert, der bei der Northern Utilization Research and Deleopment Division of the United States Department of Agriculture unter der Nummer NRRL-2830 hinterlegt ist. Hierbei wendet man das in dem US-Patent 3 196 019 offenbarte Verfahren an.
Zearalanon stellt man her, indem man die Doppelbindung des makrocyclischen Rings von Zearalenon gemäß dem in dem US-Patent 3 239 354 beschriebenen Verfahren reduziert.
Zearalen und Zearalan stellt man her, indem man (1) die Ring-Ketogruppe von Zearalenon entfernt und (2) die Ring-Doppelbindung von Zearalen gemäß dem in dem US-Patent 3 239 341 beschriebenen Verfahren reduziert.
Zearalenol stellt man her, indem man die Ketogruppe des Zearalenon-Rings reduziert, wobei man gemäß dem in dem US-Patent 3 239 348 beschriebenen Verfahren einen Alkohol erhält.
Zearalanol stellt man her, indem man die Doppelbindung des Zearalenol-Rings gemäß dem in dem US-Patent 3 239 345 beschriebenen Verfahren reduziert.
Dideoxyzearalan stellt man hier, indem man die Hydroxylgruppen von Zearalan gemäß dem in dem US-Patent 3 453 367 beschriebenen Verfahren entfernt.
Die erfindungsgemäßen RAL-Derivate verabreicht man Vertebraten mit schlecht funktionierendem Immunsystem, was typischerweise durch schlechte Ernährung, Trauma, Infektion oder Erkrankungen verursacht wird. Vorzugsweise verabreicht man die Verbindungen jedoch gesünderen Vertebraten, um das Immunsystem zu stimulieren und die Resistenz gegenüber Infektion und Erkrankung zu erhöhen und um die Genesungszeit bei Verletzung oder anderen Traumata zu verkürzen. Die erfindungsgemäßen RAL- Derivate stimulieren die Proliferation von Makrophagen im Immunsystem und erhöhen die Menge an O&sub2;&supmin;, das von den Makrophagen produziert wird. Die erfindungsgemäßen RAL-Derivate stimulieren außerdem das Immunsystem und erhöhen die Überlebensfähigkeit von Test-Vertebraten, welche mit letalen Bakterien infiziert wurden.
Typische Vertreter von Vertebraten, mit Immunsystemen, welche durch die erfindungsgemäßen RAL-Derivate stimuliert werden, sind Menschen, Geflügel und Vieh, wie z. B. Rinder, Pferde, Schafe, Schweine, Hühner, Truthähne, Enten, Gänse, Fasane und Wachteln.
Die Menge des verabreichten erfindungsgemäßen RAL-Derivats variiert in Abhängigkeit von dem jeweiligen Vertebraten-Typus, der Reife des Vertebraten und der Größe des Vertebraten. Im allgemeinen verabreicht man die erfindungsgemäßen RAL-Derivate an den Vertebraten in Dosen von 1 bis 20 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise 5 bis 15 mg/kg Körpergewicht, und am meisten bevorzugt 9 bis 12 mg/kg Körpergewicht.
Die erfindungsgemäßen RAL-Derivate können in Form der Verbindung selbst oder als pharmazeutisch verträgliches Salz der Verbindung alleine, in Kombination oder in Kombination mit pharmazeutisch verträglichen Trägern, Verdünnungsmitteln und Vehikeln verabreicht werden. Als Träger können ein Antibiotikum oder ein anderes immunstimulierendes Mittel, ein inerter Träger oder dergleichen verwendet werden. Am meisten bevorzugt ist ein Vermischen der erfindungsgemäßen RAL-Derivate mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger unter Bildung einer Zusammensetzung, die leicht zu dosieren ist.
Die erfindungsgemäßen RAL-Derivate können dem Vertebraten in unterschiedlicher Weise, wie z. B. oral, durch Injektion, unter Verwendung eines Implantates und dergleichen, verabreicht werden. Orales Verabreichen umfaßt die Verabreichung der erfindungsgemäßen RAL-Derivate in Form von Tabletten,
Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Kapseln,
Pulver, Sirups, wäßrige Zusammensetzungen, Futterzusammensetzungen und dergleichen. Injektionen und Implantate sind bevorzugt, da sie eine präzise Kontrolle des zeitlichen Verlaufs und der Dosis der Verabreichung ermöglichen. Am meisten bevorzugt sind Injektionen. Die erfindungsgemäßen RAL-Derivate werden vorzugsweise parenteral verabreicht. Solch eine Verabreichung kann als intravenöse oder intramuskuläre Injektion, intraperitoneale Injektion oder als subkutanes Implantat erfolgen.
Bei Verabreichung durch Injektion können die erfindungsgemäßen RAL-Derivate den Vertebraten zusammen mit einem biokompatiblen und RAL-Derivat-kompatiblen Träger, wie z. B. verschiedenen Vehikeln, Adjuvantien, Additiven und Verdünnungsmitteln verabreicht werden, um eine als Dosisform anwendbare Zusammensetzung zu erhalten. Die RAL-Derivate gemäß vorliegender Erfindung gibt man zu dem Träger in ausreichender Menge, um den Vertebraten bei Injektion mit 1 bis 20 mg/kg Körpergewicht zu versorgen. Vorzugsweise gibt man die erfindungsgemäße RAL-Derivate zu einem öligen Vehikel in einer Menge hinzu, die ausreicht, um 9 bis 12 mg/kg Körpergewicht bereitzustellen.
Wäßrige Vehikel, wie Wasser ohne nichtflüchtige Pyrogene, steriles Wasser und bakteriostatisches Wasser eignen sich ebenfalls für injizierbare RAL-Derivatzusammensetzungen. Zusätzlich zu diesen wäßrigen Formen können mehrere andere wäßrige Vehikel angewendet werden. Diese umfassen isotonische Injektionszusammensetzungen, welche sterilisierbar sind, wie z. B. Natriumchlorid, Ringer-Lösung, Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid und Ringer-Lactat-Lösung. Die Zugabe von wassermischbaren Lösungsmitteln, wie z. B. Methanol, Ethanol oder Propylenglykol, erhöht im allgemeinen die Löslichkeit und Stabilität der RAL-Derivate in diesen Vehikeln.
Nichtwäßrige Vehikel, wie z. B. Baumwollsamenöl, Sesamöl, Erdnußöl und Ester, wie z. B. Isopropylmyristat, können ebenfalls als Lösungsmittelsystem für die RAL-Derivatzusammensetzungen verwendet werden. Zusätzlich können unterschiedliche Additive zugesetzt werden zur Verbesserung der Stabilität, Sterilität und Isotonizität der Zusammensetzung, wie z. B. antimikrobielle Konservierungsstoffe, Antioxidantien, chelatbildende Mittel und Puffer. Jedes verwendete Vehikel, Verdünnungsmittel oder Additiv muß jedoch mit den erfindungsgemäßen RAL-Derivaten kompatibel sein. Vorzugsweise verabreicht man das RAL-Derivat mit einem Sesamöl-Vehikel.
Die erfindungsgemäßen RAL-Derivate können dem Vertebraten in Form eines subkutanen, langsam-freisetzenden Implantates verabreicht werden, das im Bereich der Haut des Vertebraten, Obei großen Tieren vorzugsweise im Ohr, implantiert wird. Das Implantat kann die Form eines Pellets besitzen, welches sich langsam auflöst, nachdem es in den Vertebraten implantiert wurde oder in Form eines biokompatiblen und RAL-Derivat-kompatiblen Abgabemoduls vorliegen, was dem Fachmann bekannt ist. Solche bekannten Dosierungsformen sind so ausgelegt, daß die aktiven Inhaltsstoffe langsam innerhalb eines Zeitraums von mehreren Tagen bis mehreren Wochen freigesetzt werden. Das Implantat ist so ausgelegt, daß es l bis 20 mg/kg Körpergewicht/Tag, vorzugsweise 5 bis 15 mg/kg Körpergewicht/Tag und am meisten bevorzugt 9 bis 12 mg/kg Körpergewicht/Tag an den Vertebraten abgibt.
Die erfindungsgemäßen RAL-Derivate können dem Vertebrate oral verabreicht werden. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen RAL-Derivate mit üblichen Futterzusammensetzungen vermischt oder dem Trinkwasser in Mengen zusetzt werden, die ausreichen, um das Immunsystem des Vertebraten zu stimulieren. Wenn die erfindungsgemäßen RAL-Derivate im Futter verabreicht werden sollen, so kann ein Vertebraten-Futter hergestellt werden, das das übliche ernährungsmäßig ausgewogene Futter, enthaltend Kohlehydrate, Proteine, Vitamine und Mineralien, zusammen mit den erfindungsgemäßen RAL-Derivaten enthält. Einige der üblicherweise in Futterzusammensetzungen für Vertebraten enthaltenen diätetischen Elemente sind Getreide, wie gemahlenes Getreide und Getreidenebenprodukte, tierische Proteinsubstanzen, wie z. B. aus Fischmehl und Fleischresten, pflanzliche Proteine, wie Mehl aus Sojabohnenöl und Mehl aus Erdnußöl; Vitamine und vitaminhaltige Mineralien, wie z. B. Vitamin A- und D- Mischungen, Ribovlavin-Zusätze und andere Stoffe des Vitamin-B- Komplexes; sowie Knochenmehl und Kalkstein zur Versorgung mit Mineralien. Ein Typus eines üblichen Futtermaterials für Rinder enthält Alfalfa-Heu und gemahlene Maiskolben zusammen mit Vitaminzusätzen und gewünschtenfalls vitaminhaltigen Substanzen. Die erfindungsgemäßen RAL-Derivate werden mit dem Futter vermischt, und zwar in Mengen, um den Vertebraten mit 1 bis 20 g/kg Körpergewicht, typischerweise 15 bis 120 g/t Futter, zu versorgen.
Die erfindungsgemäßen RAL-Derivate eignen sich zur Stimulierung des Immunsystems von Vertebraten, insbesondere von Vieh und Geflügel, welche gegenüber verschiedenen Infektionen und Erkrankungen, wie z. B. Fleckfieber, Influenza, Maul- und Klauensäuche und dergleichen, anfällig sind oder daran erkrankt sind. Zusätzlich eignen sich die RAL-Derivate zur Stimulierung des Immunsystems von Vertebraten, welche sich von einer Operation, einer Verletzung, einer Infektion oder anderen Traumen erholen. Die Stimulierung des Immunsystems verbessert die Überlebenschance und Genesungszeit und erhöht die Widerstandskraft gegenüber Infektionen und Erkrankungen.
Die RAL-Derivate eignen sich auch zur Verwendung als injizierbare Vakzinadjuvantien, wenn diese in Verbindung Vakzinen, wie z. B. für Influenza, Maul- und Klauensäuche, Heptatits, Tollwut, Staupe, Meningitis, Cholera, Enteritits, Diphtherie, Masern, Mumps und dergleichen, verwendet werden. Die Verbindungen können in der Vakzindosis in einer Menge von l bis 20 mg pro Vakzindosis, vorzugsweise mit einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel oder Träger, wie z. B. einer Fett- oder Lipidemulsion oder Glycerin, enthalten sein. Den Vertebraten impft man durch Verabreichung der Vakzin-Adjuvansdosis an dem Vertebraten in der für das jeweilige Vakzin üblichen Weise, im allgemeinen als Einzeldosis, die subkutan oder intramuskulär verabreicht wird. Den Vertebraten kann man aber auch dadurch impfen, daß man die RAL-Derivate unabhängig von dem Vakzin, vorher, gleichzeitig mit oder im Anschluß an die Vakzinverabreichung, vorzugsweise 8 bis 24 h vor der Verabreichung des Vakzins, verabreicht. Die RAL-Derivate stimulieren das Immunsystem und verbessern dadurch die Antwort auf das Vakzin. Typischerweise sind die aus dem Stand der Technik bekannten Vakzine Antigenformulierungen, welche das Immunsystem des Vertebraten stimulieren. Typischerweise handelt es sich hierbei um Formulierungen von attenuierten Viren, inaktivierten Viren, abgetöteten Bakterien oder um kleine Dosen lebender Bakterien, Viren oder um andere Pathogene.
Nachdem die Erfindung bisher allgemein beschrieben wurde, stellen die folgenden Beispiele besondere Ausführungsformen der Erfindung dar, um Praxis und Vorteile der Erfindung zu demonstrieren.

In Vivo Experimente

Die immunstimulierenden Verbindungen und Kontrollen verabreicht man durch intraperitoneale Injektion in normale Swiss Webster (S/W)-Mäuse an den Tagen -3, -2, und -1 vor der intraperitonealen Stimulierung mit 2-5·10&sup5; lebensfähigen Salmonella typhimurium. Typischerweise verwendet man 10 bis 20 Mäuse pro Gruppe und zusätzlich 10 Mäuse für Aktivierungsstudien für Makrophagen (Mφ). Man bestimmt die prozentuale Überlebensrate in Abhängigkeit von der Zeit und verwendet diese zur Bestimmung der Wirksamkeit der immunstimulierenden Verbindungen.

Beispiel 1

Zearalan und Dideoxyzearalan in einem Sesamöl-Vehikel testet man aufimmunstimulierende Aktivität, indem man unter Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens die anti-infektive Aktivität bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt und zeigen, daß Zearalan im Vergleich zu den Kontrollen Mortalität und Morbidität verzögert und die Überlebensrate erhöht.

Beispiel 2

Zearalan und Dideoxyzearalan in einem Sesamöl-Vehikel testet man aufimmunstimulierende Aktivität, indem man unter Verwendung zusätzlicher Kontrollen, Kochsalzlösung und Tetracyclin, die antiinfektive Aktivität bestimmt. Die in Tabelle 2 gezeigten Ergebnisse weisen im Vergleich zu den Kontrollen auf eine verringerte Mortalität und Morbidität und eine erhöhte Überlebensrate hin. Zusätzlich zeigt Tabelle 2, daß die positiven Effekte nicht allein auf dem Sesamöl-Vehikel, der Kochsalzlösung oder Tetracyclin beruhen.

Beispiel 3

Man testet Zearalan in einem Sesamöl-Vehikel unter Anwendung des obigen Verfahrens bei verschiedenen Dosen. Die in Tabelle 3 gezeigten Ergebnisse weisen darauf hin, daß Zearalan im Vergleich zu den Kontrollen einen positiven Effekt auf die Überlebensfähigkeit sogar bei niedrigen Dosen, wie 0,3 mg/kg, bewirkt.

Beispie1 4

Man vergleicht Zearalan und Zearalanol mit verschiedenen Östrogenverbindungen, insbesondere Estradiol und Diethylstilbesterol, um deren immunstimulierende Eigenschaften zu bestimmen. Die in Tabelle 4 gezeigten Ergebnisse weisen darauf hin, daß die RAL-Derivate Zearalan und Zearalanol immunstimulierende Eigenschaften besitzen, während die Kontrollen DES und Estradiol keine immunstimulierenden Eigenschaften aufweisen. Zearalan in einem wäßrigen Vehikel (Hanks-Puffer) ist bei Verabreichung in einem wäßrigen Puffer in vivo besonders aktiv.

In Vitro Experimente

Chemikalien und Reagentien

Die Stammlösung von Phorbolmyristatacetat (PMA) (Consolidated Midland Corp., Brewster, NY) stellt man in Dimethylsulfoxid (DM50) her und gibt Portionen davon direkt in das Reaktionsgemisch, um die Freisetzung von O&sub2;&supmin; zu testen. Die im Testgemisch vorliegende DM50-Konzentration war kleiner als l% und zeigte keinen nachweisbaren Einfluß der Reaktion von Mφ. Superoxid Dismutase (SOD) aus Rindererythrocyten wurde von Diagnostic Data Inc., Montain View, CA bezogen. Ferricytochrom C (Pferdeherz, Typ III) ist bei Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, erhältlich.

Makrophagen-Isolierung und Monolayer-Kultur

Residente peritoneale Mφ werden aus der Peritonealhöhle von Mäusen in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Phenolrot aspiriert. Damit werden 35 mm Petrischalen (2·106 Mφ/Schale) enthaltend DMEM-Medium (M.A. Bioproducts) supplementiert mit 5% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (Hyclone), 2mM L-Glutamin (Flow) und 100 U/ml Penicillin und 100 u/ml Streptomycin angeimpft. Nach 2-stündiger Inkubation in 5% CO&sub2; bei 37ºC wäscht man nicht anhaftende Zellen aus und inkubiert die Monolayer 24 h in frischem Medium. Während dieser Zeit wird der O&sub2;&supmin; -Test durchgeführt. Die Population anhaftender Zellen ist größer als 98%. Ein positiver α-Naphtylesterase- Test zeigt an, daß die Mφ's erfolgreich geerntet wurden. Die Mφ-Lebensfähigkeit (95 bis 98%) wurde mit Hilfe des Trypanblau- Ausschlußtests bestimmt. In vivo-aktivierte, peritoneale Mφ wurden aus Mäusen isoliert, welche drei Tage vorher mit RAL- Derivaten behandelt wurden.

Superoxid-Anion-Test

Man bestimmt das Superoxid-Anion (O&sub2;&supmin;) spektrophotometrisch durch Bestimmung der SOD-inhibierbaren Reduktion von Cytochrom C. Man wäscht die Mφ-Monolayer zweimal mit HBSS ohne Phenolrot und behandelt mit einem 2 ml-Testgemisch, enthaltend 0,08 mM-Cytochrom C in HBSS ohne Phenolrot und mit entweder 0,5 ug/ml PMA, 0,1 ml Suspensionen der Salmonella typhimurium-Kulturen (10% Transmission bei 600 nm), oder mit 100 ul opsonisiertem Zymosan (Packard). Unter diesen Bedingungen erhält man mit den unterschiedlichen untersuchten Stämmen von S. typhimurium oder opsonisiertem Zymosan sehr ähnliche phagocytische Indizes. Bei jeder Bestimmung enthält ein entsprechendes Testgemisch zusätzlich SOD in einer Endkonzentration von 50 ug/ml. Man reinkubiert die Schalen bei 37ºC in 5 % CO&sub2; über unterschiedliche Zeiträume bis zu 5 h. Man sterilisiert die Testgemische mittels eines Filters (0,2 um Membranfilter; Millipore Corp. Bedford, MA) und bestimmt die Extinktion bei 550 nm in einem Cary 219-Spektrophotometer mit einer spektralen Bandbreite von 1 nm. Die Extinktion der SOD enthaltenden Probe zieht man von derjenigen der Probe ohne SOD ab und berechnet die Differenz in der Cytochrom C-Reduktion, die der Menge an freigesetztem O&sub2;&supmin;- entspricht, wobei man &epsi;&sub5;&sub5;&sub0;= 21 000 M&supmin;¹cm&supmin;¹ verwendet. Nach Entfernung des Testgemisches wäscht man die Kultur 2 x mit HBSS und bestimmt den Proteingehalt nach der Methode von Lowry mit Rinderserumalbumin als Standard.

Beispiel 5

Zehn Mäuse einer jeden behandelten Gruppe gemäß Beispiel 1 testet man unter Anwendung des obigen Verfahrens auf in vivo Mφ- aktivierende Aktivität. Die Ergebnisse in Tabelle 5 weisen darauf hin, daß Zearalan eine in vivo wirksame aktivierende Substanz auf peritoneale Makrophagen in Mäusen ist, insbesondere bei einem Vergleich mit dem negativen, Sesamöl-enthaltenden Kontrollansatz. Die hohe Aktivität von freigesetztem 02 in mit Zearalan behandelten Mäusen entspricht dem Maß an erhöhter Schutzwirkung, die man in Mäusen beobachtet, welche mit S. typhimurium drei Tage (3) stimuliert wurden.

Beispiel 6

Zehn Mäuse einer jeden behandelten Gruppe gemäß Beispiel 2 testet man unter Anwendung des obigen Verfahrens auf in vivo M< p-aktivierende Aktivität. Die in Tabelle 6 gezeigten Ergebnisse weisen darauf hin, daß mit Zeralan behandelte Mäuse große Mengen O&sub2;&supmin; als Antwort auf eine PMA (löslich) oder lebende S. typhimurium (partikelförmige) Stimulation in vitro freisetzen. Die hohen O&sub2;&supmin;-Mengen weisen auf eine beträchtliche in vivo-Aktivierung peritonealer M< p in Mäusen nach Verabreichung an drei (3) aufeinanderfolgenden Tagen hin.

Beispiel 7

Zehn Mäuse einer jeden behandelten Gruppe gemäß Beispiel 3 testet man mit Hilfe des obigen Verfahrens auf in vivo Mφ-aktivierende Aktivität. Die in Tabelle 7 gezeigten Ergebnisse weisen darauf hin, daß Zearalan peritoneale Mφ von Mäusen in vivo in dosisabhängiger Weise nach Stimulation mit opsonisiertem Zymosan aktivieren kann.

Beispiel 8

Zehn Mäuse einer jeden behandelten Gruppe gemäß Beispiel 4 testet man unter Verwendung des obigen Verfahrens auf in vivo Mφ-aktivierende Aktivität. Die in Tabelle 8 gezeigten Ergebnisse weisen darauf hin, daß Zearalan nach Verabreichung entweder in einem öligen oder wäßrigen Vehikel peritoneale Mφ von Mäusen aktivieren kann, indem erhöhte Mengen an O&sub2;&supmin; durch Stimulation mit opsonisiertem Zymosan freigesetzt werden. Die Estrogenverbindungen Estradiol und Diethylstilbestrol zeigten nur geringe Mφ-aktivierende Wirkungen in vivo bei der gleichen Dosis, mit der die RAL-Derivate getestet wurden.

Beispiel 9

Man testet Zearalan und Dideoxyzearalan bei verschiedenen Dosen, um zu bestimmen, welche Menge zur Aktivierung peritonealer Mφ von Mäusen in vitro erforderlich ist. Die in Tabelle 9 gezeigten Ergebnisse weisen darauf hin, daß Zearalan Mφ in vitro optimal bei einer Konzentration von 500 ng/ml sowohl nach löslichem (PMA) als auch nach partikelförmigem (opsonisiertem Zymosan) Stimulus aktivieren kann. Dideoxyzearalan kann peritoneale Maus-Mφ bei ähnlichen Konzentrationen aktivieren, jedoch in viel kleinerem Umfang (bei Stimulus mit opsonisiertem Zymosan).

Beispiel 10

Zearalan und Dideoxyzearalan testet man bei einer Dosis von 500 ng/ml, um zu sehen, ob alveolare Maus-Mφ in vitro aktiviert werden können. Die in Tabelle 10 gezeigten Ergebnisse weisen darauf hin, daß Zearalan die Freisetzung großer Mengen an O&sub2;&supmin; in einer Zellpopulation stimulieren kann, die sich nicht in der Peritonealhülle von Mäusen befinden. Tabelle 1 Anti-infektive Aktivität von Zearalan in Mäusen Behandlungsgruppe Dosis (ug/a Maus/Tag) Gesamtdosis %-Überlebende Versuche 1 und 2 Tag 1 Tag 2 Tag 3 Zearalan Dideoxyzaralan Sesamöl-Vehikel (Negative Kontrolle) a Die Testverbindungen werden durch intraperitoneale Injektion am Tag -3, -2 und -1 verabreicht, bevor die intraperitoneale Stimulierung mit Salmonella typhimurium erfolgt. b Stimulierungsdosis = 4·10&sup5; Zellen/Maus Stimulierungsdosis = 1·10&sup5; Zellen/Maus Tabelle 2 Anti-infektive Aktivität von Zearalan und Dideoxyzearalan in Mäusen Behandlungsgruppe Dosis (ug/Maus/Tag a Gesamtdosis Zahl überlebender Tiere/20 Mäuse Tage nach Stimulierung Zearalan Dideoxyzearalan Saline-Vehikel (Negative Kontrolle) Sesamöl-Vehikel (Negative Kontrolle) Tetracyclin in Saline (positive antibiotische Kontrolle) a) Die Restverbindungen verabreicht man durch intraperitoneale Injektion am Tag -3, -2 und -1 vor der intraperitonealen Stimulierung mit 3·10&sup5; Zellen Salmonella typhimurium Tabelle 3 Dosistitration von Zearalan in Mäusen Behandlungsgruppe Dosis (ug/Maus/Tag) Gesamtdosis Zahl überlebender Tiere/10 Mäuse Tage nach Stimulierung Zearalan Sesamöl-Vehikel (Negative Kontrolle) Saline-Vehikel Tabelle 4 Immunstimulanz-Screening Behandlungsgruppe Dosis (ug/Maus/Tag)a Gesamtdosis Zahl übrlebender Tiere/10 Mäuse Tage nach Stimulierung Diethyl-Stilbesterol (in Sesamöl) Estradiol Zearalanol Zearalan Dideoxyzearalan Sesamöl-Vehikel Zearalan in HBSS HBSS (Negative Kontrolle) a Die Testverbindungen verabreicht man durch intraperitoneale Injektion am Tag -3, -2 und -1 vor intraperitonealer Stimulierung mit Salmonella typhimurium bei einer Dosis von 2-3·10&sup5;-Zellen/Maus b Stimulierungsdosis=1,5·10&sup5; Zellen/Maus c HBSS steht für Hanks Balanced Salt Solution Tabelle 5 Freisetzung des Superoxidanions (O&sub2;&supmin;) von peritonealem Mausmakrophagen (MΦ) aktiviert in vivo mit RAL-Derivaten Behandlungsgruppe Dosis (ug/Maus/Tag)a Gesamtdosis freigesetztes O&sub2;&supmin; (nmol/h/mg Protein)b Zearalan Dideoxyzearalan Sesamöl-Vehikel (Negative Kontrolle) a Die Testverbindungen verabreicht man durch intraperitoneale Injektionen an drei aufeinanderfolgenden Tagen vor intraperitonealer Stimulierung mit 4·10&sup5; lebensfähigen Zellen von Salmonella typhimurium ATCC 82-4728. MΦ erntet man am Tag 0 der Injektion b Opsonisiertes Zymosan verwendet man als Stimulus. 2,0·10&spplus;&sup6; Zellen/35 mm Schale plattiert man in 5% CO&sub2; und 100% Feuchtigkeit aus. MΦ von infizierten Tieren setzen 60±18 nMol O&sub2;&supmin;/h/mg Protein als Reaktion auf opsonisiertes Zymosan (n=4) frei. Für jede Bestimmung verwendet man ein entsprechendes Reaktionsgemisch, enthaltend Superoxid Dismutase (SOD) bei einer Endkonzentration von 50 ug/ml. c Werte für 5 Einzelexperimente, Mittelwert±S.E. (n=8-12) Tabelle 6 Freisetzung von Superoxidanion (O&sub2;&supmin;) von peritonealen Maus-Makrophagen (MΦ) aktiviert in vivo mit RAL-Derivaten Behandlungsgruppe Dosis a (ug/Maus/Tag) Gesamtdosis O&sub2;&supmin; Freisetzung (nmol/h/mg Protein b) Stimulus lebende S. typhimurium Zearalan Dideoxyzearalan Saline-Vehikel (Negative Kontrolle) Sesam-Vehikel Tetracyclin in Saline a Die Testverbindungen verabreicht man durch intraperitoneale Injektion an drei aufeinanderfolgenden Tagen vor intrraperitoneler Stimulierung mit 3·10&sup5; lebenden Zellen von Salmonella typhimurium ATCC 82-4728. Die MΦ erntet man am Tag 0 der Infektion b Man verwendet zwei Stimuli: Phorbol-Myristat-Acetat (PMA; 0,5 ug/ml) und lebende Salmonella typhimurium (opsoniert). 2,0·10&sup6; Zellen/35 mm Schale plattiert man in 5% CO&sub2; bei 37ºC und 100% Feuchtigkeit aus. Die MΦ-Zellen von unbehandelten Kontrollmäusen, welche mit PMA oder Salmonella typhimurium stimuliert wurden, setzten < 50 nmol/h/mg frei. Für jede Bestimmung verwendet man ein entsprechendes Testgemisch , enthaltend Superoxid-Dismutase (SOD) in einer Endkonzentration von 50 ug/ml. c Daten für zwei Einzelexperimente, Mittelwerte ±S.E. (n=4-8). Tabelle 7 Dosis-abhängige Aktivierung von peritonealen Makrophagen (MΦ) der Maus aktiviert von vivo mit RAL Zearalan Behandlungsgruppe Dosis (ug/Maus/Tag) Gesamtdosis O&sub2;&supmin; Freisetzung (nmol/h/mg Protein b) Zearalan Sesamöl-Vehikel (Negative Kontrolle) Saline a Die Testverbindungen verabreicht man durch intraperitoneale Injektion an drei aufeinanderfolgenden Tagen vor intraperitonealer Stimulierung mit 3·10&sup5; lebensfähigen Zellen von Salmonella typhimurium ATCC 82-4728. Die MΦ-Zellen erntet man am Tag 0 der Infektion. b Opsoniertes Zymosan verwendet man als Stimulus. MΦ plattiert man mit 2,0·10&sup6; Zellen/35 mm Schale in 5% CO&sub2; und 100% Feuchtigkeit aus. Für jede Bestimmung verwendet man ein entsprechendes Testgemisch, enthaltend Superoxid-Dismutase (SOD) in einer Endkonzentration von 50 ug/ml. c Daten für zwei Einzelexperimente, Mittelwert ±S.E. (n=3-6) Tabelle 8 Superoxidanion (O&sub2;&supmin;) Freisetzung durch peritoneale Maus-Makrophagen (MΦ) aktiviert in vivo mit RAL-Derivaten Behandlungsgruppe Dosis a (ug/Maus/Tag) Gesamtdosis O&sub2;&supmin; Freisetzung (nmol/h/mg Protein b) Diethyl-Stilbesterol (in Sesamöl) Estradiol Zearalanöl Dideoxyzearalan Zearalane Zearalane in HBSS Sesamöl-Vehikel (Negative Kontrolle) HBSS-Vehikel a Die Testverbindungen verabreicht man durch intraperitoneale Injektion an drei aufeinanderfolgenden Tagen vor intraperitonealer Stimulierung mit 4·10&spplus;&sup5; lebensfähigen Zellen von Salmonella typhimurium ATCC 82-4728. Die MΦ-Zellen erntet man am Tag 0 der Infektion. b Man verwendet opsoniertes Zymosan als Stimulus. MΦ plattiert man mit 2,0·10&spplus;&sup6; Zellen/35 mm Schale in 5% CO&sub2; und 100% Feuchtigkeit aus. MΦ von Kontrolltieren (unbehandelt) setzen 60±18 nmol O&sub2;&supmin;/h/mg Protein als Antwort auf opsonisiertes Zymosan (n=4) frei. Für jede Bestimmung wird ein entsprechendes Testgemisch, enthaltend Superoxid-Dismutase (SOD) in einer Endkonzentration von 50 ug/ml, verwendet. c Daten für zwei Einzelexperimente, Mittelwert ±S.E. (n=3-6) Tabelle 9 Dosisabhängige Aktivierung von peritonealen Maus-Makrophagen (MΦ) aktiviert in vitro mit RAL-Derivaten RAL-Konzentration Superoxid-Anion (O&sub2;&supmin; Freisetzung (nmol/h/mg Protein)a RAK Stimulus Zearalan Opsonisiertes Zymosan PMA Dideoxy-Zearalan a MΦ plattiert man mit 2,0·10&sup6; Zellen/35 mm Schale in 5% CO&sub2; und 100% Feuchtigkeit aus. Für jede Bestimmung verwendet man ein entsprechendes Testgemisch, enthaltend Superoxid-Dismutase (SOD) bei einer Endkonzentration von 50 ug/ml. Daten für 1-4 getrennte Experimente, Mittelwert ±S.E. (n=3-8). Tabelle 9 (Fortsetzung) Dosisabhängige Aktivierung von peritonealen Maus-Makrophagen (MΦ) aktiviert in vitro mit RAL-Derivaten RAL-Konzentration Superoxid-Anion (O&sub2;&supmin; Freisetzung (nmol/h/mg Protein)a RAK Stimulus Zearalan Opsonisiertes Zymosan PMA Dideoxy-Zearalan a MΦ plattiert man mit 2,0·10&sup6; Zellen/35 mm Schale in 5% CO&sub2; und 100% Feuchtigkeit aus. Für jede Bestimmung verwendet man ein entsprechendes Testgemisch, enthaltend Superoxid-Dismutase (SOD) in einer Endkonzentration von 50 ug/ml. Daten für 1-4 getrennte Experimente, Mittelwert ±S.E. (n=3-8). Tabelle 10 Superoxid-Anion (O&sub2;&supmin;) Freisetzung durch alveolare Maus-Makrophagen (MΦ) aktiviert in vitro mit RAL-Derivaten RAL Derivat Dosis (O&sub2;&supmin; Freisetzung a (nmol/h/mg Protein) Kontrolle (unstimuliert) Zearalan Dideoxy-Zearalan a Opsonisiertes Zymosan verwendet man als Stimulus. Man plattiert von MΦ 2,0·10&sup6; Zellen/35 mm Schale in 5% CO&sub2; und 100% Feuchtigkeit aus. Für jede Bestimmung verwendet man ein entsprechendes Testgemisch, enthaltend Superoxid-Dismutase (SOD) in einer Endkonzentration von 50 ug/ml. Daten fürzwei Experimente, Mittelwert ±S.E. (n=4-6).

Claims

1. Verwendung eines Resorcylsäurelacton (RAL)-Derivats, ausgewählt unter Zearalenon, Zearalanon, Zearalen, Zearalan, Zearalenol, Zearalanol, Dideoxyzearalan und den pharmazeutisch verträglichen Salzen davon, zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung bei der unspezifischen Stimulierung der Immunantwort eines Vertebraten auf eine Erkrankung, Infektion, Operation oder Verletzung.

2. Verwendung von Zearalan gemäß Anspruch 1.

3. Verwendung nach Anspruch 1, worin das RAL-Derivat in einer Menge verwendet wird, die ausreicht, um den Vertebraten mit 1 bis 20 mg RAL-Derivat/kg Körpergewicht zu versorgen.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung einer injizierbaren Zusammensetzung, worin die immunstimulierende Menge des RAL-Derivats vermischt ist mit einem biokompatiblen und RAL-Derivat-kompatiblen Vehikel.

5. Verwendung nach Anspruch 4, worin das Vehikel ein öliges Vehikel ist.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung einer Futterzusammensetzung, worin eine immunstimulierende Menge des RAL-Derivats vermischt ist mit einem ernährungsmäßig ausgewogenen Futter für den Vertebraten.

7. Verwendung nach Anspruch 6, worin das RAL-Derivat in einer Menge von 15 bis 120 g/t Futter verwendet wird.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung einer Implantations-Zusammensetzung.

9. Verwendung nach Anspruch 8 zur Herstellung eines Implantates, das an den Vertebraten 1 bis 20 mg RAL-Derivat/kg Körpergewicht/Tag abgeben kann.

10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, die zusätzlich eine wirksame Menge eines Impfstoffes, der in dem Vertrebraten eine spezifische Immunantwort auf ein Antigen stimulieren kann, umfaßt.

11. Verwendung nach Anspruch 10 zur Herstellung einer Zusammensetzung in Einheitsdosisform, enthaltend 1 bis 20 mg des RAL-Derivats als Adjuvans pro Impfstoff-Dosis.

12. Verwendung einer Verbindung, ausgewählt unter Zearalenon, Zearalanon, Zearalen, Zearalan, Zearalenol, Zearalanol, Dideoxyzearalan und den pharmazeutisch verträglichen Salzen davon gemäß Anspruch 1, wobei man diese Verbindung mit einem inerten, pharmazeutischen Träger kombiniert.

13. Resorcylsäurelacton (RAL)-Derivat, ausgewählt unter Zearalen und Dideoxyzearalan und den pharmazeutisch verträglichen Salzen davon zur Verwendung bei der unspezifischen Stimulierung der Immunantwort eines Vertrebraten auf eine Erkrankung, Infektion, Operation oder Verletzung.

14. Zusammensetzung zur Verwendung bei der unspezifischen Stimulierung der Immunantwort eines Vertebraten auf eine Erkrankung, Infektion, Operation oder Verletzung, umfassend

a) als aktiven Bestandteil, welcher das Immunsystem unspezifisch stimulieren kann, wenigstens eine Verbindung, ausgewählt unter Zearalen und Dideoxyzearalan und den pharmazeutisch verträglichen Salzen davon, und

b) einen inerten pharmazeutischen Träger.